Přístrojové metody používané při rozborech mléka, jejich specifika a přesnost výsledků měření David Ledvina, Bentley Czech Větrný Jeníkov 20.3.2012
Metody pro rozbor mléka Metoda
Stanovení (angl.)
IR fotometrie
F, P, L, TS, SnF, U, C, FFA
Turbidimetrie
F
Kolorimetrie
U
FIA metoda
U
Kryoskopie
FPD
Luminometrie
MRL, HACCP
RIA metody
MRL
Denzitometrie
MRL
Cytometrie
SCC, IBC
Impedance
TBC
Přímé počítání
TBC
index (č.)
Referenční metody pro mléčné složky • • • • • •
tuk bílkovina laktóza sušina močovina bod mrznutí
Röse Gottlieb (Gerber) Kjeldahl HPLC, polarimetrie gravimetrie kolorimetrie kryoskopie T, B, L, S, M, BM
Chování záření ve vzorku (reflexe) odraz
(absorpce) pohlcení
(transmise) prostup
dopad
vzorek T, B, L, S, M
Fyzikální princip fotometrie Absorpce záření odpovídá rotačním a vibračním stavům molekul Lambertův-Beerův zákon
A = log (Φd/Φv) = a . l . c kde
A Φd
absorbance dopadající svět. tok
Φv
vystupující svět. tok
a l c
absorpční koeficient tlouštka vrstvy koncentrace T, B, L, S, M
Filtrová IR fotometrie zrcadlo
vzorek zdroj
zrcadlo detektor
filtry
kyveta
konduktometr
T, B, L, S, M, BM
Fourierova IR fotometrie 2
zrcadla: 1 – 4 pevná 5 polopropustné
IR zdroj 5
6 pohyblivé 6
vzorek
4 detektor
1
3
T, B, L, S, M, BM, VMK
T, B, L, S, M, BM, VMK
T, B, L, S, M, BM, VMK
Kolorimetrie & FIA Přesné stanovení močoviny •
kombinace enzymatické metody, FIA a kolorimetrie
1.
močovina rozštěpena ureázou na čpavek a oxid uhličitý přidáno barvivo a aktivátor kolorimetrické měření na 600 nm (transflektančně) diferenční porovnání původního a vzniklého čpavku
2. 3. 4.
M
M
M
Enz. reaktor & impedance Přesné stanovení močoviny •
kombinace enzymatické metody a měření impedance
1.
změna impedance je způsobována hromaděním produktů enzymové hydrolýzy močoviny míra rychlosti změny impedance je přímo úměrná koncentraci močoviny diferenční porovnání impedance trubice s aktivní a inaktivní ureázou
2. 3.
M
M
M
Kryoskopie Stanovení bodu mrznutí mléka (= rovnováha mezi pevnou a kapalnou fází)
• • • • •
1895 Beckman (D), 1920 Hortvet (USA) podchlazení na – 3 º C za míchání iniciace nárazem (nebo krystalem) odevzdání skupenské energie (= ohřev) měření teploty 3 různými módy (f, p, m) BM
Princip kryoskopie termistor míchadlo
Ωmetr
zkumavka chlazení
čerpadlo
rozlišení 0,0001 °C
BM
BM
Průtoková cytometrie • původní použití v humánní medicíně • 1991 uvedeno v oboru (Bentley Instruments Inc.) • DNA buněk obarveno fluorescenčním barvivem, buňky ozářeny zeleným světlem emitují červené záření – spočítáno a vytříděno podle velikosti (PHA – pulsně šířková analýza)
PSB, CPM
Princip cytometrie • stabilní průtok 4 ml/min (laminární proudění) • nízkovýkonný laser na pevné fázi • detekce fluorescence fotonásobičem
PSB, CPM
PSB
PSB
CPM
CPM
Přímé počítání kolonií
• • • • • •
vyšší rozlišení barevná kamera nastavení filtrů nastavení citlivosti přepočet na spirálu archivace snímků
CPM
CPM
Kontrola správnosti měření • kalibrace na sadě změřené referenčními hodnotami a následná kontrola sady • nulování, kontrola slepým vzorkem • kontrola/nastavení oficiálními standardy • kontrola pilotními vzorky (i vlastními) • kruhový test národní i mezinárodní • průběžné srovnávací měření mezi přístroji i mezi jednotlivými laboratořemi vše
Parametry přístrojů • • • • • • • • •
rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu pracovní faktor vše
Ilustrační příklad – • • • • • • • •
rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu
kryoskopie < 30 vz/h 0 až – 1,5 ºC 0,0001 ºC n/a n/a n/a ± 0,002 ºC neměřitelná BM
Ilustrační příklad – • • • • • • • •
rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu
mléčné složky 500 vz/h 2 až 15 % 0,01 % 0,01 % cv < 1 % cv < 0,5 % n/a <1% T, B, L, S, M
Ilustrační příklad – • • • • • • • •
rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu
počítač PSB 500 vz/h 0 až 10 M 1k n/a cv < 10 % (př.m.) cv < 4 % (< 500k) n/a <1% PSB
Ilustrační příklad – • • • • • • • •
rychlost / výkon měřicí rozsah rozlišení citlivost přesnost opakovatelnost reprodukovatelnost chyba z přenosu
počítač CPM < 50 vz/h 2 k až 10 M 1k <1k sy,x < 0,30 log sr < 0,03 log (˃ 300k) sR < 0,06 log (˃ 300k) <1% CPM
Vysvětlení statistických zkratek Tc chyba z přenosu variační koeficient cv Sy směrodatná odchylka referenčních hodnot Sx směrodatná odchylka měření Sr směrodatná odchylka opakovatelnosti SR směrodatná odchylka reprodukovatelnosti Sd směrodatná odchylka průměrné chyby predikce Sxy kovariance * ρx,y koeficient korelace Sy,x směrodatná reziduální chyba regrese * střední hodnota součinu odchylek veličin X,Y od jejich středních hodnot vše
Nejistoty měření • kombinovaná nejistota uc jako výsledek: • nejistoty typu A (z var. koeficientů měření) • nejistoty typu B (přístroj: z opakovatelnosti, chyby z přenosu; reference: z kalibrace atd.)
↓ • rozšířená nejistota uroz = 2 * uc (95% měření se nachází uvnitř uvedeného intervalu nejistoty měření)
vše
