Penelitian Bioteknologi dan Marka Molekuler untuk Meningkatkan Daya Saing dan Nilai Tambah Produk Hortikultura Rapat Kerja Puslitbang Hortikultura 16 – 18 April 2012
Hortikultura: Cabang ilmu pertanian yang mempelajari budidaya buah-buahan, sayuran dan tanaman hias
Peranan: • • • • •
memperbaiki gizi masyarakat memperbesar devisanegara memperluas kesempatan kerja meningkatkan pendapatan petani pemenuhan kebutuhan keindahan dan kelestarian lingkungan
Sifat hasil hortikultura: • • • •
tidak dapat disimpan lama perlu tempat lapang (voluminous) mudah rusak (perishable) dalam pengangkutan melimpah pada suatu musim dan langka pada musim yang lain • fluktuasi harganya tajam (Notodimedjo, 1997)
Isu tanaman hortikultura: • • • •
kualitas produksi kematangan senesen
Faktor lain untuk pertimbangan: • • • •
Perubahan iklim Preferensi konsumen Perhatian konsumen Regulasi
Sifat yang diinginkan: • Perbaikan rasa, tekstur dan warna…..preferensi konsumen • Lama penyimpanan/Delayed ripening…pematangan buah • Peningkatan nutrisi and manfaat kesehatan….preferensi konsumen • Better food processing…..mengurangi kehilangan hasil • Tanaman tahan OPT…kualitas
Bioteknologi untuk Hortikultura Tanaman dengan sifat yang diinginkan
Bioteknologi: Aplikasi teknologi pertanian yang menggunakan sistem biologi, makhluk hidup atau turunannya untuk membuat atau memodifikasi produk untuk penggunaan tertentu (Convention on Biological Diversity)
Aplikasi Bioteknologi: 1. Analisis diversitas 2. Identitas individu 3. Kultur jaringan a. Kultur antera b. Penyelamatan embrio (Embryo rescue) 4. Molecular breeding a. Marker-assisted breeding b. Transformasi genetik
Kultur Jaringan Untuk Pemuliaan Androgenesis (kultur anthera/serbuk sari)/ gynogenesis(kultur ovary/sel telur) Mendapatkan galur murni secara instan untuk seleksi pemuliaan Populasi haploid ganda untuk pemetaan kromosom
Penyelamatan embryo Persilangan Interspesies o Hambatan penyerbukan • Hambatan pra-fertilisasi • Hambatan pasca-fertilisasi penyelamatan embryo
Komoditas seperti anggrek berbiji banyak tidak sulit mendapatkan silangan interspesies Kebanyakan komoditas berbiji sedikit Transfer sifat ketahanan/toleransi biotik dan abiotik serta soluble solid o Ketahanan terhadap Antracnose dari C. baccatum ke C. annuum
Penyelamatan Embryo
Jeruk non-apomictic Aleza et al 2010
Hibrida antara apel and pear
Banno et al 2003
Aplikasi Lain Kultur Jaringan Tanaman • • • •
Penanaman planlet dalam kondisi steril Bebas pathogen Perbanyakan planlet dalam jumlah besar Penyeragaman tahap pertumbuhan dan keunggulan tanaman (sinkronisasi produksi)
Karakterisasi Evaluasi Seleksi
Pengembangan teknologi: • Pemetaan; • Design marka; • Kloning gen;
• Seleksi berbasis marka molekular; • Tanpa halangan genetis; • Tidak diregulasi
• Rekayasa genetik; • Melalui regulasi
Varietas Unggul Baru
Sumber Daya Genetik
Pemuliaan berbasis pendekatan molekular
>gi|297598437|ref|NC_008394.4| Oryza sativa Japonica Group DNA, chromosome 1, complete sequence, cultivar: Nipponbare CTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAACCCTAAACCC TAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACAGCTGACAGTACGATAGATCCACG CGAGAGGAACCGGAGAGACAACGGGATCCAGGCGCCAGCGACGGATCCGGGCGAGAGGGGAGTGGAGATC ATGGATCCGTGCGGGAGGGGAAGAAGTCGCCGAATCCGACCCTCCCATCGCCATCGACAGTAGGTCTGCG CGAGAGGGGCACCGGCGCTGGCTCTGAGCGAGATGCAACGCCGGCCGGCTTGGAGAGTAACTCAAGAGAG ACAGAATGGAAGATAGAGAACAAGAGAGTGAGAGGATAAGGATATAGACCAGACCACACAATTTTCTCTT CTTTTTAACTTTGTATTAAGATCTTTTATGGAACATCTTTTATTGTTGATATCAAAATAACTGAAACTTA TACTTTAATATTTTTTGAGACAAAAAGTAACAATCGTAAAAAAAAGTTCCACGAGAGTTACCCCACCACC CATGTCTCGAGCCGACCAGATCTGCCGCCCACGACCCGAGTCATCGTTGGATCCACCACCCACAACCCGC GACCGAGCTACGCCTCCTGTGGATTGATGCCACTGCCCTGAGCTTCACTGCCGGTACTGTCGCTCGCGAC CCGAGCTCCGCCGCTGGTACCGTCGCCCACAACTCAAGCTGTGTTGCCACTAGAGAAAAAGGAGGCGAGA GCGAGGGCAAAACGAGGCAAGGCGTGGCGTGACATGGTGTGACTGGTTGGTCAATTAGCCGACAATGGAT CCACCGCCCATGAACCGAGCCACCGTTGGATCCGCCACCCGCAGATTCGGCTGTCCCCTCTCCCTCAACT TATTCTTCCTCTCTTGATTCAACGGGAGGAGTGGCAACTGACGGCAACAGAGCTCGCCTCATGGGCGATG GAACCAGCGGCGAAGCTCGGGGCGGAGGGGTTGAGCCACATGAGGCGATGGCGACAATGAGGCGAGACAT GGCGTGGCTGGCTGTTACATTTTGTTTTGATGAAAAGCATAACCATGCGGATGATATTTTTATTATAGAC TAGAGATGATTATTGAATAGACATGCTCTTAACCATTTTTAACTCTAATTCCACCTACACTATGAATATT AGAAAAAAAATACAATGTATACTCTTAAGAAGTTTGCGCTATCATAGCCATCATACTCATTAAAACATTT TTCTTCACATGTTGCAACGCATGGGCATTTTGCTAGTTAGAGAATAAAAATAAATTTGTAGGTAAAACTT TTATATATGTGTTCTCGGTGACTTAAAAGCCAATGCTTAAAAATAAACTACGTTAAAAATATCTTAAAAT CAATATTAAAATTAAGTTTGAAAATTTAAATTTTGGCTTTTTCTTTGACTGAATAGGCCATCTGATGGAA GCTGAATAAGCCATCCGATGGGAGCTGTGACAGTGATGAAAAGGAGAGCAGTAAGAGAGCAGTAAGAGCA TCCCAGCAGCTCCTCTATCTAGGCATCCATCCGATATTTGGAGTATGGAGGAGAAAAACAGTGCTCCAGC AGAGTCTCCATCACATGCTTCATTTTTGGAGGTCCTCCAAATCTAGCCCTTCCCAAGCCAAATATGGAGG TTCTCTCTCCTCACTCCATCCTCAACTACCCACTTCCCAAGATTTTTTTTGAGTGGTGAAAGGTGAGAGG AATAGGAGTAAAAATGTGTGGTAGTTGAAAAATATTACTAAAATATAGGATGTTGGTATATGTAGGATGT AATATGAATGATCTGTTGGAGTGAAAAGTTATATAGAGTGGAAATCTTTTTAAATGGCCATCCAAATGAG AGTATGAAATTTAGATGAGCTGGTGGGGATGCTCTAAGAGAACGAGAGAAGCACAGAGCAGATAAACCAC ACCCACAGGCACCACCGTCCTTGTTGGTAATGAAGAAGACGAGACGACGACTTCCCCACTAGGAAACACG ACGGAGGCGGAGATGATCGACGGCGGAGAGAGCTACAGAAACATCGATGCCTCCTGTCCAATCCCCCCAT CCCATTCGGTAGTTGGATTGAAGACTACCGAATAAGAGAAGCAGGCAGGCAGACAAACCCTTGAACCAAG GAGTCCTCGCTGAGGAAGCTTTGGATCCACGACGCAGCTATGGCCTCCCCGCCCACCAGGCCGCCAGCCA CAACCAGCTGACTAGGTAGGCTTCCTAGGTAGGGATCCCATCCCTTCGATTCCCTACTCCCTCCCCCGAT TGATTTGATTTGATTTGATTTAATTCGATTGCCTGCTTTTCAGGTCGCATGCATCATCAGATTTCAATCT CCCTTCGTTCCCTGTCCCTAATCCAATACCAATAGGGAGCAATCAGCTGCTCCTCGACGGCGAGGGAGAT GTCGTCGGCCGCGGGCCAAGACAACGGAGATACCGCTGGGGACTACATCAAGTGGATGTGCGGCGCCGGT GGCCGTGCGGGCGGCGCCATGGCCAACCTCCAGCGCGGCGTTGGCTCCCTCGTCCGTGACATTGGCGACC CCTGCCTCAACCCATCCCCCGTTAAGGTTCGCCTACTCCTACTCTAGCTCCATATGGATATGGATTCGAT TAGCTGTCTACATTCTATGCCATCAATTTGTTTTCCATCACTTCTCATTATACATCTCCATTGCTCTCTA AATTAAGGCTTCTCTAGCTCTATCCTATATATATACTAGTACTCCGTATATGATTCTGCTTCATCACTTA TTTATTCATCATCATACCGTGAAGCTGTATAAGTCCTGTTATTTGTCATTTGGCATATGTTGTATAGATA ACACTTTCAGCCCAGGGACTTTCTATTGCCACTTTTATACATATACAATCAACATTTAGCATATGTATAT CCTGTACCGCTCAGTTGTACTGCTGCTTTGAAGATAATGTTTGCAAAACATATGAGCTCACACACGAGGC TAGATGCTGCATAGGCTGCACAATGGGGTAGCCATTTTGATACTTCTTAATGCTATTTATGCTGGTCCAA ATGTTCATTGGTAGCCTCAGGCAGAGAATTTTAGGGAGATATTATGTCAAACTCCCTGGATTCACTATGA TTATACAATATTACCCATTCAATCCATTCAAATAAATTTCCAGGTCAACTCACATATTGTACTGAAAGAA GACTAATTTGCACTAATCATATCCTTTTATCCACCAGAGTATATGAGATTGTCTTCTATATGCAATTTAC TTCATATCGACATTTTTCTGCAGAATTGCAAAACTGACGCCTTGTTTTCCATCTGGAATTGTGCAGGGGA GCAAAATGCTCAAACCGGAAAAATGGCACACATGTTTTGATAATGATGGAAAGGTCATAGGTTTCCGTAA AGCCCTAAAATTCATTGTCTTAGGGGTGAGTTAATTGTTTCTTTTGTGCTTCAAAAACTTGTTTTTTCAT GTATTTTAGCTGTTGAAGGGTGTGGATTTTTTTTTCAGTCTTAATACATTACCTTTTAGAGCATGATGCC CCACGCGCCATTTGTGAATGTGTAAAATAGGGAAGATCAAATAGAACGTGACAACTGTTTATTTTATTAC CATGATCATTGTTCTCTTTGAGAGTGTCTGCTTTGGAAATTTCAAAGAAATTAATGCATATGATTGCGTA
Sekuen Genom • Hanya terdiri atas ratusan juta huruf • Mengetahui sekuen genom saja tidak cukup untuk memulai program pemuliaan • Beberapa pertanyaan yang harus dijawab: – Bagian mana yang dapat membedakan satu galur dengan yang lain? – Bagian mana yang membawa sifat unggul?
Contoh Output Genome Sequencer + C@CFFFFFGHHHHJIJJCAAHFG
AD @HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:12596:7058 1:N:0: GTACAGTAAAAATGCGCGCCTTGTTTATTAAAGCCAAAATTTGCGATATGCAATATTTTCATTCTAAACTCTATAATTCCATCAATTCTGGAGATGAACT + @@@FFFEDHHHHFIIJ8@FFHIHEHGIJGIIIICGHGJEHJIGGHHG@BFGEAE@EECCEEHEFHHEDDDCEBC@ADDECEDC@@@ACDC@CBCDCC:>> @HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:13146:7087 1:N:0: ACTCACACTTCTTCCAGCGTTATTATCATTAATTGGTAAACGAATATTAAAAAAGAATCAAGTAGCACATACGCCAGCAAAGGCATGGCGTACATTTGC + CCCFFFFFHHHHDIGFGGIIIJJHIIIIJIJJIIIEFHFEBHIEGIIIBHHCF@C?39?AAACCCD? @HWI-ST429:142:817WRABXX:5:1101:17766:7104 1:N:0: CGAAAGTACCAGTATAATCCTCTAATTTATGAGAAGGTGTAGTTCCTTTAATTTGTTCTGGAATGGATTCAGTTGCTTCTTTTATCATTTCCTTCATTTTT
• Output di atas adalah data mentah 3 fragmen DNA ukuran 100 basa dari mesin HiSeq 2000 • Mesin HiSeq 2000 di BB Biogen kini menghasilkan 3 milyar fragmen seperti di atas setiap kali dijalankan • Milyaran fragmen ini kemudian harus disusun ulang menjadi genom utuh, berdasarkan overlap kesamaan urutan basa masing-masing fragmen
CONTOH OVERLAP FRAGMEN DNA Fragmen-fragmen 100 basa disusun berdasar kesamaan urutan DNA Zoom-in satu bagian kecil contig
Marka Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Hasil Akhir (Peta Kromosom dan Genom)
Peta genom yang dihasilkan biasanya tidak akan pernah 100% lengkap, karena genom berisikan banyak sekuen berulang yang tidak mungkin dipetakan menggunakan sequence overlap. Akibatnya peta akhir akan terdiri atas tiga bagian: Seluruh sekuen DNA dan ukuran besar fragmen ini diketahui Sekuen tidak diketahui seluruhnya tapi ukuran besarnya (jumlah basanya) diketahui Sekuen dan ukuran pastinya tidak diketahui, tapi ukurannya dapat diperkirakan berdasarkan peta genetik (dalam centiMorgan)
Langkah Selanjutnya Setelah Mendapatkan Sekuen Genom: Anotasi Genom
Kromosom Koordinat basa DNA Gen (sekuen pengkode protein)
Kembali ke Pertanyaan Semula... • Bagian mana yang dapat membedakan satu galur dengan yang lain? – Sekuensing ulang galur-galur yang ingin dipelajari untuk melihat perbedaan sekuensnya – Desain marka polimorfik yang dapat mencirikan/menjadi sidik jari galur-galur yang ada
• Bagian mana yang membawa sifat unggul? – Pemetaan mutasi untuk melihat perubahan sekuen DNA yang membawa manfaat – Analisis QTL untuk mencari fragmen kromosom pembawa sifat unggul – Association mapping untuk mencari marka/gen yang berkorelasi signifikan dengan sifat unggul
Data yang Dapat Dimanfaatkan Pemulia dari Sekuen Genom • Marka DNA yang terletak di fragmen kromosom mana pun yang diinginkan (genom manusia memiliki 1 marka SNP tiap 100-300 basa dalam kromosom, berarti minimal ada 11 juta marka SNP yang dapat digunakan) – Pola sidik jari DNA yang sangat detail dan komprehensif – Memudahkan desain marka yang langsung terletak di gen penyebab sifat yang diinginkan (marka fungsional) – Marka fungsional sangat akurat dan reliable untuk digunakan dalam pemuliaan
• Kemudahan mengidentifikasi dan mengkloning gen pembawa sifat unggul – Kloning gen unggul menjadi sangat mudah karena primer untuk menggandakan gen lebih mudah dibuat – Pemetaan fragmen kromosom pembawa sifat unggul akan lebih mudah mengidentifikasi gen yang mengkode sifat unggul tersebut
Teknologi Marka Molekuler • Keberhasilan pemanfaatan marka molekuler sangat tergantung pada: – – – –
Eratnya pautan antara marka dan sifat yang diinginkan Besarnya efek gen yang ditandai Biaya penggunaan marka Ada/tidaknya alel yang diinginkan pada populasi pemuliaan kita.
• Pemulia anggur yang menggunakan marka SSR VMC7F2 yang berpautan lemah dengan gen pengendali sifat seedless mendapatkan 4-6% false positive (berbiji disangka tidak berbiji) dan 11-16% false negative. • Pemetaan pautan yang lebih terperinci hingga ke sekuen DNA penyebab langsung karakter seedless menurunkan tingkat error hingga 0% (Mejia et al., 2011).
Marka Ketahanan Virus pada Kentang • Potato Virus Y (PVY) menimbulkan kerusakan pada umbi • Ketahanan dapat diperoleh dengan menyilangkan dengan kerabat liar • Telah diperoleh marka SCAR (RYSC3) untuk gen ketahanan terhadap PVY (Kasai et al., 2000) • Biaya operasional marka ini cukup murah dan dapat diketahui hasilnya dalam hitungan jam
Tahan (Felcher & Douches, Michigan State University)
• Galur yang tidak memiliki pita berukuran 321 bp tidak memiliki gen tahan, sehingga rentan terhadap PVY • Seleksi ketahanan terhadap virus (terutama melalui inokulasi) mengganggu evaluasi sifat unggul lain (misal daya hasil, serta penampilan dan kualitas umbi) • Identifikasi galur tahan dengan marka lebih efisien, karena mengurangi jumlah ulangan serta plot khusus yang harus disiapkan untuk uji ketahanan
Rekayasa Genetik: Dari Tidak Mungkin Menjadi Mungkin
Mawar biru: sering dipakai sebagai metafor sesuatu yang mustahil
Jalur Biosintesis Pigmen Bunga • Studi metabolisme pada mawar menjawab misteri mengapa tidak ada mawar biru • Mawar tidak memiliki enzim F3’5’H yang mensintesis delphinidin • Delphinidin menghasilkan warna biru pada bunga • Mawar hanya mampu mensintesis Pelargonidin (jingga) dan cyanidin (merah)
• Penambahan kembali gen enzim yang hilang dari bunga lain memungkinkan sintesis delphinidin pada mawar • Tingkat kebiruan bunga tergantung pada aktivitas enzim yang diintroduksikan dalam menghasilkan delphinidin • Sintesis warna jingga dan merah juga harus dimatikan •
(Katsumoto et al., 2007)
• Sekuntum mawar biru pernah dihargai sekitar US$ 48 di Jepang • Perlu diingat bahwa mawar bukanlah produk pangan • Produk pangan transgenik hingga kini masih menjadi isu yang kontroversial
Teknologi Transgenik Untuk Menghasilkan Produk Non Transgenik • Permasalahan utama pemuliaan buah adalah waktu regenerasi yang sangat lama • Diperlukan waktu 3-7 tahun bagi tanaman yang disemai dari biji untuk berbunga dan berbuah • Akibatnya pemuliaan melalui persilangan memerlukan sedikitnya 15-20 tahun untuk menghasilkan varietas baru • Bagaimana jika siklus berbuah dapat dipersingkat?
FasTrack Breeding di USDA • Transformasi tanaman plum dengan gen pembungaan dari poplar • Tanaman transgenik yang dihasilkan dapat berbunga 6-12 bulan setelah ditanam dari biji • Plum tersebut kini dapat dimuliakan seperti tanaman berumur pendek
• Sebelum tanaman dilepas, gen rekombinan pembungaan cepat dihilangkan melalui persilangan atau segregasi • Tanaman akhir yang dihasilkan sama sekali tidak membawa gen rekombinan, sehingga diklasifikasikan sebagai produk non transgenik • Pemuliaan dapat dipercepat dan tidak perlu melewati regulasi transgenik
(Scorza et al. – USDA-ARS Kearneysville)
Teknik-teknik penyisipan gen yang diinginkan ke komoditas yang dituju juga terus mengalami perkembangan pesat Nanoteknologi mulai berperan dalam pemuliaan
Langkah-Langkah Program Pemuliaan: • • • •
Penentuan komoditas Penentuan sifat yang diinginkan Membuat roadmap Identifikasi teknologi yang sesuai
Kesimpulan • Bioteknologi tanaman menawarkan potensi yang menjanjikan untuk pemuliaan komoditas perishable untuk budidaya, konsumsi, dan antisipasi perubahan iklim • Perlu perencanaan jangka panjang • Integrasi penelitian dan pengembangan • Infrastruktur, peneliti berkualitas, regulasi dan dukungan pendanaan
Terima kasih
