Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid

Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Scheidingstechnieken

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Barbara DHOOP

Academiejaar 2009-2010

Promotor: prof. dr. P. Sandra Copromotor: dr. F. Lynen Begeleider: dr. B. Bicalho

Dankwoord Ik wil graag alle mensen bedanken die rechtstreeks of onrechtstreeks hebben meegeholpen aan het tot stand brengen van deze thesis.

Op de eerste plaats wil ik graag prof. dr. Sandra bedanken om mij de kans te geven mijn thesis uit te voeren in zijn onderzoeksgroep en wil ik hem daarbij ook danken voor het grondig nalezen van mij thesis. In het bijzonder wil ik dr. Bicalho bedanken voor alle steun en hulp die zij verleend heeft gedurende dit jaar.

Ook de mensen van het RIC in Kortrijk wil ik bedanken, voor het aanbieden van de instrumentatie die een gedetailleerde analyse mogelijk maakte, waarvan de resultaten in het addendum aanwezig zijn.

Daarnaast wil ik in dit dankwoord zowel Seppe als Peejay vermelden die tijdens dit thesisjaar steeds voor een vrolijke noot zorgden en steeds paraat stonden als ‘proefkonijn’. Ook alle andere personen van het PARC wil ik graag danken voor de aangename sfeer op het vierde verdiep in S4bis.

Alle vrienden: Annelies, Liselotte, Lin, Hanne, Jos, Maarten, Sander,... en familieleden wil graag bedanken voor de nodige steun en ontspanning.

Tot slot wil ik mijn ouders speciaal bedanken omdat ze mij de kans hebben gegeven te studeren wat ik graag wou.

En

als

allerlaatste

wil

ik

mijn

vriend

onvoorwaardelijke steun en vertrouwen.

Jan-Baptist

bedanken

voor

zijn

hulp,

Inhoudsopgave 1

Inleiding ................................................................................................................. 1

2

Geschiedenis van de chromatografie ..................................................................... 2

3

2.1

Beginselen van chromatografie....................................................................... 2

2.2

Verdelingschromatografie ............................................................................... 2

2.3

Papierchromatografie ..................................................................................... 3

2.4

Dunlaagchromatografie .................................................................................. 4

2.5

Vloeistofchromatografie (HPLC) ..................................................................... 4

Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie ...................................... 6 3.1

HPLC-modes .................................................................................................. 6

3.2

Theoretische aspecten van een HPLC-systeem ............................................. 7

3.3

Instrumentatie van een HPLC-systeem......................................................... 17

3.3.1

Mobiele fase .......................................................................................... 18

3.3.2

Injector................................................................................................... 19

3.3.3

Kolom .................................................................................................... 19

3.3.4

Detector ................................................................................................. 20

3.3.4.1 Corona-ontladingsdetector ................................................................. 20 3.3.4.2 Massaspectrometrie ........................................................................... 20 4

Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie .......................................... 21 4.1

5

6

LC-MS .......................................................................................................... 21

4.1.1

Electrospray ionisatie............................................................................. 21

4.1.2

Massaspectrometer: quadrupool............................................................ 23

4.1.3

Detector : elektronenmultiplicator........................................................... 24

4.2

MS-modes .................................................................................................... 24

4.3

Tandem massaspectrometrie (MS/MS) ......................................................... 25

4.4

MS/MS modes .............................................................................................. 25

Ceramiden ........................................................................................................... 27 5.1

Structuur en voorkomen in de huid ............................................................... 27

5.2

Overzicht van onderzoek van ceramiden in de huid ...................................... 28

Experimenteel gedeelte ....................................................................................... 32 6.1

Algemene aspecten ...................................................................................... 32

6.1.1

Chemicaliën ........................................................................................... 32

6.1.2

Instrumentatie ........................................................................................ 32

6.2

Ontwikkeling en optimalisatie van een NPLC-methode voor analyse van

ceramiden ............................................................................................................... 32 6.3

Karakterisatie van ceramiden door MS-analyse ............................................ 36

6.4

Monstervoorbereiding ................................................................................... 38

6.4.1

Tape stripping-techniek en tape-extractie .............................................. 38

6.4.2

Vaste fase extractie ............................................................................... 40

6.5

NPLC-analyse van ceramiden in de huid ...................................................... 48

6.6

Ontwikkeling van een RPLC-methode voor analyse van ceramiden ............. 48

6.7

RPLC-analyse van ceramiden in de huid ...................................................... 51

7

Conclusie ............................................................................................................. 55

8

Referenties .......................................................................................................... 56

Inleiding

1 Inleiding De hoornlaag van de menselijke huid (stratum corneum) zorgt voor bescherming van het lichaam tegen waterverlies en schadelijke stoffen uit de omgeving dankzij een unieke structuur, bestaande uit keratinocyten en intercelullaire lipide lamellen. De huidlipiden, voornamelijk bestaande uit vrije vetzuren, cholesterol en ceramiden, vormen samen als het ware het ‘cement’ die de ‘bakstenen’ (de keratinocyten) samenhouden (Elias 1983).

De ceramiden spelen een cruciale rol bij allerlei functies van de huid; een gewijzigde ceramide-samenstelling is reeds gelinkt aan bepaalde huidziektes zoals psoriasis en atopische dermatitis (eczeem) (Di Nardo, Wertz et al. 1998; Holleran, Takagi et al. 2006). In tegenstelling tot de ceramiden die te vinden zijn binnenin cellen, bezitten ceramiden in de hoornlaag een grote variabiliteit in structuur wat onderzoek en analyse van deze ceramiden een uitdaging maakt.

In dit werk wordt een methode ontwikkeld om ceramiden in de huid te analyseren, er wordt tevens gezocht naar een vaste fase extractie (SPE) om ceramiden aanwezig in de huid selectief te extraheren uit de complexe hoornlaagmatrix. Hierbij is het echter niet realiseerbaar alle interferenties te verwijderen, maar wordt gezocht naar een methode die de ceramiden van cruciale interferenties afzondert. De componenten worden gescheiden met behulp van hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) in de omkeerfase mode en in de normaalfase mode. Detectie van de componenten gebeurt door tandemmassaspectrometrie (MS/MS).

Daar de fractionatie van de hoornlaag ceramiden van de cholesterylesters en triglyceriden succesvol was, werden extracten onderzocht in samenwerking met Metablys, een afdeling van het Research Institute for Chromatography, Kortrijk, België met behulp van een recent ontwikkeld lipodomic platform bestaande uit HPLC bij hoge resolutie en een Q-TOFMS apparaat dat tevens hoge resolutie spectra oplevert (K.Sandra et al. 2010).

1

Geschiedenis van de chromatografie

2 Geschiedenis van de chromatografie 2.1 Beginselen van chromatografie Chromatografie vindt reeds in het begin van de 20e eeuw zijn oorsprong. Het was Mikhail Semyonovich Tswett (1872-1919) die een nieuwe categorie van adsorptieanalyses ontwikkelde en voor het eerst het begrip chromatografie gebruikte.

In 1903 wist Tswett plantpigmenten te scheiden met behulp van een calcium carbonaat– kolom. In zijn werk ‘ Adsorptionanalyse und Chromatographische Methode. Anwendungen auf die Chemie des Chlorophylls’ beschreef hij hoe eerst pigmenten op de kolom werden gebracht, solvent over de kolom gegoten werd en er zo verschillende zones ontstaan in de kolom. Pigmenten die minder sterk aangetrokken worden zullen zich makkelijker en dus verder in de kolom kunnen verplaatsen dan een sterk aangetrokken pigment. De kolom vertoonde hierdoor verschillende gescheiden en gekleurde zones: een gele zone werd toegekend aan de carotinoïden uit het extract en twee groene zones werden aan chlorofylen a en b toegeschreven. Uit deze observaties leidde hij de naam chromatografie af uit de twee griekse woorden ‘chroma’ en ‘graphien’, wat letterlijk vertaald kan worden als ‘in kleur schrijven’.

Willstätter, tevens actief in chlorofylonderzoek, concludeerde uit eigen onderzoek dat de twee verschillende chlorofyl-zones bij Tswett, toe te kennen waren aan decompositie van het chlorofyl en de chromatografische methode bijgevolg geen goed procedé kon zijn. Hoewel Tswett het bij het recht eind had, werd zijn theorie hierdoor voor een lange tijd uit het oog verloren. Het is pas rond 1930 dat chromatografie herondekt werd, verschillende organische chemisten gebruikten de methode toen voornamelijk bij onderzoek en opzuiveren van natuurproducten zoals bijvoorbeeld carotenen (Ettre 2000; Ardrey 2003; Engelhardt 2004).

2.2 Verdelingschromatografie De volgende mijlpaal in de geschiedenis van chromatografie volgde ongeveer 10 jaar later. De ontwikkeling van een nieuwe techniek door A. J. P. Martin en R. M. L. Synge kreeg

de

naam

verdelingschromatografie

(ook

vloeistof-vloeistof

chromatografie

genoemd). Hierbij werd getracht aminozuren te scheiden door twee vloeistoffen in tegengestelde richting te laten stromen. Deze methode bracht echter weinig resultaten op en werd aangepast: één van de twee vloeibare fasen werd stationair gemaakt door

2


silicagel als ondersteuning te gebruiken en de andere, mobiele fase werd door deze stilstaande fase heen gelopen. Hierna kon de keuze gemaakt worden ofwel de verschillende gescheiden zones te visualiseren door een geschikte indicator toe te voegen, ofwel een ‘flow through chromatogram’ (‘Durchflusschromatogramm’) te genereren waarbij de verschillende zones geëlueerd en apart gecollecteerd kunnen worden. Martin en Synge benadrukten dat de verdeling van een component over de twee fasen, de cruciale parameter is en dat deze techniek niet enkel toepasbaar is op aminozuren. Verder is ook naast een vloeibare mobiele fase ook een gas te gebruiken als mobiele fase. Deze vaststelling zal later ook de aanleiding blijken tot de ontwikkeling van gaschromatografie. Eén van de belangrijkste vaststellingen die bij verdelingschromatografie gemaakt werd, is dat het concept van theoretische schotels bij destillatieprocessen eveneens toepasbaar kon gemaakt worden voor chromatografische processen. Door opdelen van de kolom in denkbeeldige segmenten die de naam theoretische schotels kreeg, werd gepostuleerd dat net zoals bij een destillatieproces het mogelijk was in ieder segment een evenwicht te vormen tussen stationaire en mobiele fase. Deze hypothese gaf voornamelijk een idee over het scheidend vermogen van een kolom: hoe meer schotels een kolom bezit, hoe beter de scheiding. In het theoretische aspect van HPLC wordt dit model verder uitgewerkt.

Vloeistof-vloeistof chromatografie werd evenwel weinig in gebruik genomen door gebrek aan robuustheid. De stationaire fase werd namelijk gaandeweg door de mobiele fase weggespoeld waardoor resultaten niet reproduceerbaar waren (Ettre 2000; Engelhardt 2004).

2.3 Papierchromatografie Een techniek die aantrekkelijker en voornamelijk in de praktijk eenvoudiger bleek, werd eveneens door Martin ontwikkeld, namelijk papierchromatografie. Een monster werd gespot onderaan het filterpapier waarna het papier in een vat geplaatst werd. Het vat werd voorzien van een solvent, bijvoorbeeld water, dat door capillaire krachten door het filterpapier werd opgenomen. Met behulp van een kleurreactie konden de gescheiden componenten uit het monster gevisualiseerd worden op het filterpapier. Dit werd de eerste chromatografische methode op micro-analytischniveau. Hierbij werd de ‘retardation factor’ of RF-waarde gedefinieerd als de verhouding tussen de afgelegde afstand op het papier door een component gedeeld door de afstand afgelegd 3


door het solvent. Daarnaast gaf Martin ook aan dat het mogelijk was het scheidend vermogen te vergroten door een 2D-analyse uit te voeren, waarbij twee verschillende fase-systemen na elkaar worden gebruikt en het tweede eluent het filterpapier doorloopt 90° ten opzichte van de richting van het eerste eluent. De

opkomst

van

een

andere

planaire

chromatografische

methode,

namelijk

dunlaagchromatografie of ‘Thin Layer Chromatography ’ (TLC) zorgde ervoor dat ook op zijn beurt populariteit en gebruik van papierchromatografie afnam (Ettre 2000; Engelhardt 2004).

2.4 Dunlaagchromatografie Het principe van TLC is analoog aan dit van papierchromatografie: het monster wordt onderaan de plaat gespot en daarna in een vat met solvent geplaatst. In tegenstelling tot bij papierchromatografie, kon bij dunlaagchromatografie de stationaire fase aangepast worden. Daarnaast werd ook de snelheid van een analyse verhoogd doordat de stationaire fase nu een poreuze laag is, voornamelijk silicagel, in plaats van een celluloselaag bij papierchromatografie. Dankzij de eenvoud en snelheid van TLC wordt ze tot op de dag van vandaag nog steeds in gebruik genomen om bijvoorbeeld een chemische reactie op te volgen of als kwalitatieve of semi-kwantitatieve analyse (Ettre 2000; Engelhardt 2004).

2.5 Vloeistofchromatografie (HPLC) Eind jaren ’50 had vloeistofchromatografie reeds een aanzienlijke achterstand ten opzichte van gaschromatografie. Vloeistofchromatografie verliep nog steeds manueel terwijl bij gaschromatografie reeds vrij gesofisticeerde toestellen werden gebruikt. Door

de

kennis

verworven

voor

gaschromatografie

toe

te

passen

op

vloeistofchromatografie werd duidelijk dat vooral een trager diffusie-proces een nadeel is indien een vloeistof als mobiele fase gekozen wordt. Dit probleem kon deels omzeild worden door niet voor een open capillair te kiezen, maar de kolom te pakken met kleine deeltjes. Om de snelheid waarmee de mobiele fase de kolom doorloopt te optimaliseren dienden hoge drukken gebruikt te worden, vandaar werd de term ‘High Pressure Liquid Chromatography’ geïntroduceerd. Deze naam werd niet veel later gewijzigd in ‘High Performance Liquid Chromatography’. Kolommen die korter gemaakt werden en uitgerust met

uniforme

en

kleinere

deeltjes

zorgen

ervoor

dat

de

prestatie

van

vloeistofchromatografie aanzienelijk verhoogd werd.

4


Een geautomatiseerde aminozuur-analyzer, een toestel dat via ionuitwisselings chromatografie aminozuren kon analyseren en gelpermeatie chromatografie, die scheiding uitvoert van synthetische polymeren op basis van moleculair gewicht, zijn de voorlopers van een HPLC-systeem. Het eluaat loopt bij beide methodes onder hoge druk door een (herbruikbare) kolom die gepakt is met kleine deeltjes. Beiden precursorsystemen waren echter beperkt aangezien ze slechts één soort specimen kunnen scheiden en analyseren. Een HPLC-systeem geschikt om universele monsters te analyseren werd pas enkele jaren later, rond 1965, ontwikkeld door twee onafhankelijke onderzoeksgroepen in Europa en de Verenigde Staten (Ettre 2000; Engelhardt 2004; Dolan, Kirkland et al. 2010).

5

Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie

3 Fundamentele aspecten van de vloeistofchromatografie 3.1 HPLC-modes De analysemethode HPLC bestaat uit een aantal modes die gekarakteriseerd worden naargelang

de

eigenschappen

van

mobiele

en

stationaire

fase:

omkeerfase

vloestofchromatografie (Reverse Phase Liquid Chromatography: RPLC), normaalfase vloeistofchromatografie (Normal Phase Liquid Chromatography: NPLC), hydrofiele interactie

chromatografie

(Hydrophilic

Interaction

Chromatography:

HILIC),

ionpaarchromatografie (Ion-pair Chromatography: IPC), ionuitwisselings-chromatografie (Ion-exchange

Chromatography:

IEC),

size-exclusion

chromatografie

of

gelchromatografie (Size-exclusion Chromatography: SEC) en chirale chromatografie.

Bij omkeerfase wordt gebruik gemaakt van een apolaire kolom, bijvoorbeeld een C18stationaire fase en een mobiele fase die doorgaans een polair mengsel is van water en organisch solventen, zoals acetonitril of methanol. De scheiding bij RPLC gebeurt op basis van hydrofobiciteit van de componenten. RPLC is de meest gebruikte methode, voornamelijk gebruikt bij analyse van wateroplosbare monsters. De voorkeur om de RPLC-methode te gebruiken, is te verklaren via de vele voordelen tenopzichte van de overige methodes. Zowel robuustheid en veelzijdigheid van de techniek als meer reproduceerbare en efficiëntere analyses dragen bij tot de populariteit van deze methode. Bovendien zijn de gebruikte solventen minder ontvlambaar en toxisch in vergelijking met solventen gebruikt bij bijvoorbeeld normaalfase chromatografie. Bij normaalfase chromatografie wordt gebruik gemaakt van een polaire kolom, zoals nietgebonden silicagel of een diol stationaire fase en een apolaire mobiele fase bestaande uit organische solventen zoals hexaan en isopropanol. De scheiding bij een NPLC-analyse gebeurt op basis van polariteit van de componenten: een polaire component zal een langere retentie ervaren dan een minder polaire component. Ook bijdrage van sterische hinder zal invloed hebben op de retentie, hierdoor is het mogelijk met een NPLC-analyse structurele isomeren te scheiden. HILIC is een methode afgeleid van NPLC. De mobiele fase bestaat uit een mengsel van water en organisch solvent en de kolom is meer polair in vergelijking tot kolommen gebruikt bij NPLC. Ionpaarchromatografie is een aangepaste vorm van RPLC. Door toevoegen van een reagens die ionparing veroorzaakt, kunnen ionaire componenten (zoals zure of basische componenten) in het monster met dit reagens interageren. Bij deze mode is het mogelijk

6


de retentie van ionaire componenten te wijzigen, zonder de pH van de mobiele fase te veranderen. Gebruik van extreme pH-waarden kan hierdoor vermeden worden. Ionuitwisselingschromatografie maakt gebruik van een kolom voorzien van geioniseerde of ioniseerbare functionele groepen die ionen in het monster met een tegenovergestelde lading binden. De mobiele fase bestaat meestal uit een bufferoplossing. Size-exclusion chromatografie is een scheidingsmethode gebaseerd op moleculaire massa’s van de componenten, voornamelijk gebruikt bij synthetische polymeren of grote biomoleculen. De stationaire fase bestaat uit een inerte kolom gepakt met deeltjes met specifieke poriën. De mobiele fase kan zowel een waterige als organische oplossing zijn. Chirale chromatografie zorgt voor een scheiding van enantiomere componenten. De stationaire fase zal hierbij chirale knooppunten bevatten zodat interacties en dus retentietijden van enantiomeren verschillen (Dolan, Kirkland et al. 2010).

3.2 Theoretische aspecten van een HPLC-systeem Een HPLC-kolom is gepakt met poreuze deeltjes met een grootteorde van enkele µm, gemaakt uit silicagel of een polymeer en bij voorkeur sferisch. Het oppervlak van de deeltjes wordt door ‘endcapping’ voorzien van een gewenste functionele groep die zo de stationaire fase vormt. Vermits de deeltjes klein en poreus zijn, beschikt elk deeltje over een groot oppervlak in verhouding tot zijn volume. Analytmolecules, die door de mobiele fase door de poriën worden gestuurd, kunnen interactie ondergaan met de aanwezige functionele groep. De voorkeur van een component om in de stationaire of mobiele fase te verblijven wordt bepaald door interacties, zijnde specifieke adsorptie veroorzaakt door dipool-dipool of dipool-geïnduceerde dipool interacties en niet-specifieke adsorptie op de stationaire fase, veroorzaakt door van der Waals-krachten.

Figuur 1 geeft een voorbeeld weer van elutie van een monster die drie verschillende analyten/componenten bevat. Molecules afkomstig van analyt X worden voorgesteld door symbool ●, van analyt Y door □, van analyt Z door ▲en molecules afkomstig van solvent waarin het monster is opgelost, worden voorgesteld door +. Iedere component die in het systeem wordt geïntroduceerd zal zowel een tijd in de mobiele fase als in de stationaire fase verblijven, enkel de solventmolecules (+) ondergaan weinig tot geen interactie met de stationaire fase en elueren dus meteen uit de kolom. Tijdens de elutie zullen alle andere componenten onder invloed van een continu dynamisch proces zich een aantal maal verplaatsten van mobiele fase naar stationaire fase en vice versa. De totale tijd is de som 7


van een aantal verblijftijden in iedere fase en zal voor elke component verschillend zijn, aangezien elke component andere interacties ondergaat. Omdat enkel de mobiele fase zich verplaatst zullen componenten slechts in beweging zijn indien ze in mobiele fase vertoeven. Door dit proces kan scheiding van componenten plaatsvinden. Naarmate de molecules in de kolom diffunderen zullen ze zich meer en meer spreiden ten opzichte van elkaar en dus ook een groter volume innemen dan bij aanvang, zoals met een pijl is aangeduid voor component X in figuur 1. Dit bezette volume door analyt X wordt ook aangeduid als een band met een zekere breedte. Bij verlaten van de kolom zal deze band door het detectiesysteem worden geregistreerd en een signaal weergegeven worden verspreid over een welbepaalde tijdsduur in het chromatogram.

Figuur 1. Illustratie van een scheidingsproces (boven) en het bijhorende chromatogram van het scheidingsproces (onder) (Dolan, Kirkland et al. 2010).

De hoogte of oppervlak van een piek is recht evenredig met de analytconcentratie, met andere woorden hoe meer molecules van analyt X aanwezig in een monster, hoe groter het signaal in het chromatogram. Solventmolecules waarin het monster opgelost werd, zullen zoals reeds vermeld niet weerhouden worden door de kolom. Elutie van dit solvent wordt dus enkel bepaald door 8


de snelheid waarmee de mobiele fase door de kolom loopt en door de lengte en interne diameter van de kolom. De eerste component die de kolom verlaat, is steeds het monstersolvent, de tijd die nodig is om de kolom te doorlopen en gedetecteerd te worden, wordt de dode tijd t0 genoemd. Algemeen gezien wordt de tijd verlopen na injectie van een component tot en met de elutie ervan de retentietijd tR genoemd. Dit is dus de som van de tijd doorgebracht in de mobiele fase (t0) en de tijd doorgebracht in de stationaire fase (tR’). (1)

Interacties van een component met de stationaire en mobiele fasen, snelheid van mobiele fase, lengte van de kolom en temperatuur spelen elk een rol bij scheiding van de componenten. De snelheid u van de mobiele fase in de kolom wordt berekend door de lengte van de kolom L te delen door de dode tijd t0. (2)

Een andere manier om elke component te karakteriseren dan de retentietijd is via de retentiefactor. Dit is de verhouding van de hoeveelheid component in de stationaire fase tegenover de hoeveelheid component in de mobiele fase.

(3)

Aangezien

(4)

waarbij c de concentratie van de component is en V het ingenomen volume in de fase is, volgt hieruit dat:

(5)

9


De distributie tussen twee fasen wordt bepaald door het continu dynamisch evenwicht tussen de fasen. Dit evenwicht is onder invloed van onder andere de moleculaire structuur van de componenten, van de chemische eigenschappen van mobiele en stationaire fase, van de temperatuur en van de druk waarmee de mobiele fase door de kolom wordt gepompt. Dit evenwicht tussen stationaire en mobiele fase kan beschreven worden aan de hand van de verdelingscoëfficiënt K

(6)

Daarenboven wordt de fase-ratio β gedefinieerd als de verhouding van het volume stationaire fase over het volume mobiele fase in de kolom aanwezig.

(7)

Deze twee parameters vertegenwoordigen dus de retentiefactor:

(8)

De retentiefactor kan ook als verhouding van de verblijftijden van de component in de stationaire en mobiele fase geschreven worden.

(9)

De verblijftijd in de mobiele fase stemt overeen met de dode tijd. Het verschil tussen de retentietijd tR en de dode tijd t0 stelt de verblijftijd in de stationaire fase voor. Zowel de retentietijd als de retentiefactor kunnen gebruikt worden om de retentie van een component te beschrijven. Het voordeel bij gebruik van de retentiefactor is dat deze waarde dimensieloos is en dus onafhankelijk is van de kolomlengte en van de snelheid van de mobiele fase.

De verhouding van retentiefactoren van twee componenten, eveneens te schrijven als de verhouding van retentietijden van de componenten aangezien de dode tijd een constante is, drukt de selectiviteitefficiëntie uit en wordt gedefinieerd als scheidings- of selectiviteitsfactor α . 10


(10)

k2 is steeds groter dan k1, anders geformuleerd zal component 1 eerder elueren dan component 2 waardoor deze waarde altijd groter of gelijk is aan 1. Indien α = 1 geeft dit aan dat deze twee componenten niet gescheiden kunnen worden met de gegeven methode. Een groter verschil in retentietijd en dus grotere selectiviteit zal steeds een betere scheiding geven. De selectiviteitsfactor is afhankelijk van de eigenschappen van de componenten, pH, temperatuur, kolomdimensies en -eigenschappen en het type stationare en mobiele fase.

Iedere component zal na scheiding door een piek weergegeven worden (figuur 1, onder). Een perfecte chromatografische scheiding zou oneindig smalle pieken genereren zodat geen overlapping van pieken mogelijk zou zijn. Dit zal echter nooit het geval zijn, aangezien processen zoals onder andere moleculaire diffusie de piek steeds een zekere breedte geven.

Een chromatografische piek kan het best beschreven worden als een Gaussiaanse curve, ook normaal verdeling genoemd, die in algemene vorm geschreven wordt als

(11)

De verwachtingswaarde µ en standaardafwijking σ karakteriseren deze functie. Toegepast op een chromatografische piek wordt de retentietijd tR gelijk aan de verwachtigswaarde µ en kan de standaardafwijking σ vervangen worden door breedte w, die ofwel gemeten kan worden aan de basis van de piek wb ofwel op de helft van de maximale piekhoogte wh (figuur 2). Een piek zal echter niet steeds een ideale Gaussiaanse vorm hebben. Dit niet-ideaal gedrag wordt ook soms staartvorming (tailing) genoemd. Dit fenomeen kan uitgedrukt worden aan de hand van de symmetrie- of staartfactor (tailingfactor).

11


Figuur 2. Een ideale Gaussiaanse piek.

Een cruciaal aspect bij de verbreding van een piek is dat de ruimtelijke variantie rechtevenredig is met de migratie-afstand z.

(12)

De evenredigheidsfactor H wordt de schotelhoogte (hoogte-equivalent van een theoretische schotel, Height Equivalent of a Theoretical Plate: HETP) genoemd en heeft de dimensies van een lengte. Deze kan ook geschreven worden als:

(13)

waarin Dax : u:

axiale dispersiecöeffiënt snelheid van de mobiele fase

Analoog met de distillatietheorie kan de HETP vergeleken worden met de schotels in een distillatiekolom waarbij het aantal theoretische schotels N en de schotelhoogte H gerelateerd zijn aan de kolomlengte via:

(14)

met L de lengte van de kolom. Dit betekent dat de scheiding efficiënter gebeurt indien een langere kolom gebruikt wordt vanwege het groter aantal schotels.

12


Het schotelgetal N staat in functie van tR en σ (en dus ook w) en kan experimenteel uit het chromatogram afgeleid worden:

(15)

Een criterium dat wordt gehanteerd om een scheiding in het chromatogram van twee naast elkaar liggende pieken te bepalen is de resolutie Rs. Dit is het verschil in retentietijden gedeeld door de gemiddelde breedte van de pieken, gemeten aan de basis van de piek.

(16)

Een hogere resolutie door een groter verschil in retentietijd en/of smalle pieken manifesteert zich in een betere scheiding van de twee componenten. Indien meerdere componenten aanwezig zijn in een mengsel of monster zullen de twee minst gescheiden componenten in het chromatogram het zogenaamde kritische paar vormen waarvan de resolutie bepaalt of het scheidend vermogen van de kolom voldoende is. Een resolutie Rs = 2 zal twee pieken voor 99.99% gescheiden van elkaar geven.

Selectiviteit, retentie, performantie en resolutie zijn samen te brengen in één vergelijking die de basisvergelijking van de chromatografie wordt genoemd. Rs wordt uitgedrukt in functie van α, k en N waarbij wordt aangenomen dat de breedte van de twee aangrenzende pieken gelijk is.

(17)

waarbij Rs

: de resolutie

N

: het schotelgetal

α

: de scheidingsfactor

k

: de retentiefactor

De invloed van de verschillende parameters op Rs wordt geïllustreerd in figuur 3.

13


Figuur 3. Invloed van parameters N, k en α op de resolutie (Poole C. F. 1991).

Met behulp van de resolutievergelijking kan de invloed van elke parameter op een scheiding verklaard worden. De vergelijking is essentieel bij optimalisatie van een methode. Een scheiding tot aan de basislijn is mogelijk indien de retentiefactor hoog genoeg is, met andere woorden de stationaire fase moet de analyten voldoende weerhouden. Daarnaast moet ook het verschil in retentiefactoren voldoende groot zijn zodat de selectiviteitsfactor α hoog is. Ook de performantie uitgedrukt door N is bij voorkeur zo hoog mogelijk. De factoren die op de scheidingsefficiëntie inwerken zijn onder andere kolomlengte, grootte van de deeltjes in de kolom, kwaliteit van de kolompakking, lineaire snelheid van de mobiele fase, dode tijd van het HPLC-instrument en de retentiefactor (Poole C. F. 1991; Sandra 2007; Dolan, Kirkland et al. 2010). Bijdragen van deze factoren kunnen worden uitgedrukt in een vergelijking die de correlatie tussen schotelhoogte H en snelheid van de mobiele fase u weergeeft, namelijk de van Deemter-vergelijking. In deze vergelijking worden drie parameters gegeven die tot bandverbreding leiden en samen de HETP-waarde bepalen. (18)

met

A : Eddydiffusieterm B : longitudinale diffusie C : transportweerstand

14


u : gemiddelde lineaire snelheid van de mobiele fase

De Eddydiffusieterm houdt rekening met het feit dat niet elke analytmolecule dezelfde weg zal afleggen in een kolom aangezien niet alle deeltjes in de kolom evengroot of gelijkvormig zullen zijn en de pakking van de kolom niet uniform zal zijn. Omdat elke analytmolecule dus een verschillende weg zal afleggen, zal er een zekere spreiding zijn op de afgelegde weg van de molecules. Daaruit volgende zal dit verschillen in retentie meebrengen. De Eddydiffusieterm is onafhankelijk van de snelheid waarmee de mobiele fase de kolom doorloopt. Enkel parameters zoals vorm en grootte van de deeltjes en van de poriën als ook de kwaliteit van kolompakking zijn hier van belang. Deze term wordt gegeven als:

(19)

waarbij

λ : pakkingsefficiëntie (λmax = 1) dp : diameter van deeltje

De B-term stelt de bijdrage van longitudinale diffusie voor. Naast diffusie in axiale richting (loodrecht op de kolomas) is ook longitudinale diffusie of diffusie langsheen de kolomas mogelijk. Dit proces is het resultaat van concentratieverschillen in de mobiele fase. In het centrum van de band van analytmolecules zal de concentratie maximaal zijn, hierdoor zullen molecules, onder invloed van de wetten van Fick, diffunderen en dit zowel in de richting waarin de mobiele fase vloeit als in de tegenovergestelde richting. Deze diffusie zal leiden tot een verbreding van de band en is omgekeerd evenredig met de snelheid van het eluens. Wanneer de snelheid van de mobiele fase verhoogd wordt, zullen de analytmolecules minder tijd in de kolom doorbrengen en daardoor dus minder onderhevig zijn aan deze diffusie. De longitudinale diffusie-term wordt gegeven door

(20)

met DM de diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase. De longitudinale diffusie is gerelateerd aan moleculaire diffusie en wordt dus bepaald door de viscositeit van de mobiele fase, de temperatuur, de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire massa van het analyt (Hens 2009). Enkel bij lage snelheid van de mobiele

15


fase wordt de B-term relevant, aangezien de diffusiecoëficiënt van een component in vloeistof in de meeste gevallen klein zal zijn in vergelijking met de snelheid van de mobiele fase.

De transportweerstand geeft aan dat tijdens elutie van analyten de massa van een analyt niet enkel kan worden getransporteerd van mobiele naar stationaire fase maar ook opnieuw van stationaire naar mobiele fase. Analyt molecules aanwezig in mobiele fase zullen diffunderen naar de grens tussen mobiel en stationaire fase en zo overgaan naar de stationaire fase. Om evenwicht te behouden zullen naast overgang van molecules van mobiele naar de stationaire fase ook molecules vanuit de stationaire fase terug naar de de mobiele fase overgaan. Na een zekere tijd zullen alle analytmolecules de stationaire fase verlaten hebben en terug overgegaan zijn in de mobiele fase. Het gehele proces zorgt ervoor dat voortdurend massa uitgewisseld wordt tussen de twee fasen gedurende de analyse. De snelheid waarmee het evenwicht tussen de twee fasen wordt bereikt zal bepalend zijn voor de bijdrage van de transportweerstand. Zoals reeds vermeld bevinden molecules van eenzelfde component zich niet allemaal op dezelfde locatie in de kolom, hierdoor zal ook de transportweerstand voor elke molecule verschillen en dus een piekverbreding als gevolg hebben.

De transportweerstand kan worden opgedeeld in twee bijdragen: de bijdrage van de mobiele (CM) en de bijdrage van de stationaire fase (CS) . De CM-term beschrijft de bijdrage tot band- of piekverbreding in de mobiele fase. Deze verbreding ontstaat door onderscheid in lineaire viscositeit bij de mobiele fase. Mobiele fase die dicht langs deeltjes in de kolom vloeit, zal trager bewegen dan mobiele fase die zich verder van kolomdeeltjes bevindt. Door dit verschil in snelheid van mobiele fase, zullen ook de analyten aanwezig daarin dit onderscheid ondervinden. De CS-term beschrijft de bijdrage tot band- of piekverbreding in de stationaire fase. Deze term wordt onder andere bepaald door de interacties tussen analyt en stationaire fase en de hoeveelheid stationaire fase.

De van Deemter-curve stelt grafisch H in functie van de snelheid van de mobiele fase u en wordt gebruikt om de optimale snelheid te achterhalen. Deze optimale waarde uopt komt overeen met de minimale waarde van HETP (figuur 4).

16


Figuur 4. Invloed op de van Deemter-curve van factoren A, B en C.

Zoals vermeld werd en tevens te zien is in figuur 4, is de term A onafhankelijk van de snelheid u, is de B-term enkel van belang bij lage snelheden en staat de C-term lineair in verband met de snelheid.

In werkelijkheid zal de piekverbreding echter niet enkel veroorzaakt worden door de factoren in de van Deemter-vergelijking. Een bijkomende piekverbreding wordt steeds door de instrumentatie veroorzaakt. Dit effect van piekverbreding door instrumentatie vergroot als het volume van de kolom relatief kleiner wordt ten opzichte van het volume buiten de kolom. De totale piekbreedte is de som van bandverbreding door injectie bandverbreding binnen de scheidingskolom de bijdrage van de detector

2 kol,

2 inj,

de bijdrage van dode volumes ²dv, en

²det. De bandverbreding heeft dus bijdragen van zowel de

kolom zelf als bijdragen door externe factoren.

(21)

3.3 Instrumentatie van een HPLC-systeem Een HPLC-syteem kan opgedeeld worden in verscheidene onderdelen waarvan een overzicht wordt weergegeven in figuur 5. Linksboven is het reservoir van de mobiele fase te zien. Deze mobiele fase wordt naar een pomp geleid die zorgt dat de mobiele fase onder een gecontroleerde druk en snelheid door de kolom gestuurd wordt. Rechtsboven in de figuur wordt de autosampler weergegeven die het monster in het systeem zal injecteren. Na de introductie van het monster op de kolom zullen de analyten in het monster de kolom doorlopen en gescheiden worden.

17


Figuur 5. Schematisch overzicht van instrumentatie bij HPLC.

Een detector zal analyten die uit de kolom elueren registeren onder de vorm van signalen. De

signalen

gemeten

door

de

detector

corresponderen

met

de

aanwezige

analytconcentratie. Een computer die in verbinding staat met de detector zal de output van de detector opslaan zodat dataverwerking mogelijk is (Dolan, Kirkland et al. 2010).

3.3.1

Mobiele fase

Solvent gebruikt als mobiele fase wordt in een inert reservoir bewaard, meestal vervaardigd uit bruin glas. De zuiverheid van het solvent bij een analyse is essentieel, dit wil zeggen zonder contaminatie van bijproducten of vaste stof deeltjes. Om deeltjes zoals stof tegen te houden, wordt een filter gekoppeld aan het uiteinde van de verbinding tussen de solventreservoir en pomp. Luchtbellen in de mobiele fase kunnen vermeden worden door ontgassen van de solventen. De ontgassing kan via verschillende technieken gebeuren. Het solvent kan een tijd in een ultrasoonbad geplaatst worden of een inert gas zoals helium kan door het solvent borrelen zodat de opgeloste gassen diffunderen naar de heliumbellen en zo uit het solvent gezuiverd worden. Een derde ontgassingstechniek is vacuümontgassing waarbij het ontgassen online kan gebeuren en voor de pomp zal geplaatst worden (Dolan, Kirkland et al. 2010). Bij een analyse kunnen meerdere solventen (bij meeste HPLC-toestellen tot 4 solventen) gebruikt worden en indien nodig online gemengd worden in een mengkamer. Elutie kan op twee manieren gebeuren: isocratische elutie waarbij een constante compositie van de mobiele fase behouden wordt gedurende de analyse en gradiënt elutie waarbij de compositie in functie van de elutietijd stapsgewijs of continu wordt gewijzigd. 18


3.3.2

Injector

De injector in de autosampler zorgt dat het monster reproduceerbaar en kwantitatief kan worden toegevoegd aan het systeem. De meest gebruikte injector is de zeswegkraan. Deze kraan bestaat zoals de naam aantoont uit zes poorten. Naargelang de toestand van de zeswegkraan: de laadpositie en de injectiepositie, zijn deze poorten op een andere manier gekoppeld aan elkaar. Zoals schematisch is weergegeven in figuur 6, staat elke poort in verbinding met een onderdeel van het HPLC-systeem. In de laadpositie zal de poort in verbinding met de pomp de mobiele fase aanvoeren naar de poort in verbinding met de kolom. De poort bovenaan, in verbinding met de injectienaald, zal het monster in de zogenaamde sample loop aanbrengen tot deze loop, met een vast volume, helemaal gevuld is. De poort die met het einde van de sample loop verbonden is, gaat naar de afval (waste).

Figuur 6. Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van een zeswegkraan.

Nadat de sample loop gevuld is (en dus geen lucht meer aanwezig is in de loop) zal van de laadpositie overgeschakeld worden naar de injectiepositie. Nu zal de poort waar de mobiele fase uit stroomt gekoppeld worden aan de poort van de sample loop, zodanig dat het monster nu in de tegenovergestelde richting stroomt in de sample loop. De poort die in laadpositie de ingang van sample loop aangeeft, zal nu verbonden worden met de poort die naar de kolom loopt zodat het monster geïntroduceerd wordt op de kolom. 3.3.3

Kolom

Klassiek worden roestvrije stalen kolommen gebruikt met lengte van 5 tot 25 cm en inwendige diameters van 1 tot 1.6 mm. Deeltjes van 1.8 tot 5 µm met een variëteit van 19


geometrie of vorm zijn commercieel beschikbaar. Indien een hogere

temperatuur

gewenst is dan kamertemperatuur, kan gebruik worden gemaakt van een kolomoven.

3.3.4

Detector

Direct na de kolom wordt een detector geplaatst. Universele detectoren zoals bijvoorbeeld een

brekingsindexdetector

of

een

corona-ontladingsdetector

hebben

een

lage

detectorselectiviteit aangezien een eigenschap wordt gemeten die aanwezig is bij alle componenten. Detectoren die componentspecifiek zijn, meten een eigenschap die uniek is voor bepaalde analyten, zoals bijvoorbeeld een UV-detector. Andere methoden maken gebruik van onafhankelijke analytische instrumenten als detector. LC-NMR stuurt het eluens uit de kolom naar een NMR-toestel, LC-MS koppelt een massaspectrometer na de kolom. In dit werk werd gebruik gemaakt van een massaspectrometer en een coronaontladingsdetector.

3.3.4.1 Corona-ontladingsdetector De corona-ontladingsdetector (corona discharge detector of charged aerosol detector, CAD) is een universele detector. Het eluaat dat uit de kolom vloeit, wordt verneveld door een stroom vernevelingsgas, zoals N2, en wordt verdampt in een verwarmde buis. Door verdamping van de vluchtige mobiele fase blijven analytmolecules over in de gasfase. Een positief geladen dragersgas, geladen door een corona-ontlading, wordt hierna gemengd met de analyten, waarbij de lading overgedragen wordt van dragergas naar analytmolecules. De analytionen worden door een electrometer opgevangen die de elektrisch lading omzet in een signaal (Dolan, Kirkland et al. 2010).

3.3.4.2 Massaspectrometrie Massaspectrometrie (MS) is een methode waarbij gasvormige ionen worden gevormd die kunnen gescheiden worden op basis van verhouding massa tot lading (m/z-ratio). De uitkomst van een analyse is een spectrum waarin relatieve of absolute abundatie wordt geplot in functie van de m/z-verhouding. Uit deze spectra kan het moleculaire gewicht en eventuele informatie over de structuur van een analyt verworven worden. Een massa spectrometer is op te delen in drie onderdelen: een ionenbron, de massaanalysator en een detector. De ionenbron genereert ionen van de componenten in het monster, de massa-analysator scheidt binnenkomende ionen op basis van m/z, waarna het detectiesysteem elke bundel van ionen omzet in een meetbaar signaal. Gezien het belang van massaspectrometrie in dit werk wordt dit in detail besproken in het volgende hoofdstuk met nadruk op de gebruikte opstellingen (Ardrey 2003; Niessen 2006). 20

Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie

4 Fundamentele aspecten van de massaspectrometrie 4.1 LC-MS LC-MS is een techniek waarbij een massaspectrometer gekoppeld wordt na een HPLCsysteem. Dit is hedendaags een standaardmethode voor onderzoek van organische en bio-organische monsters. Vermits een MS-detector ionen meet in gasfase, is er nood aan een interface die naast ionizatie van de monsteranalyten ook het vloeibare eluens kan verdampen. De twee meest gebruikte interfaces zijn APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) en ESI (Electrospray Ionization). Beide technieken zorgen ervoor dat fragmentatie van de analyten zoveel mogelijk wordt vermeden, APCI en ESI worden daarom soms zachte ionisatietechnieken genoemd. De massa-analysator scheidt de ionen op basis van de massa-ladingverhouding (m/z) en registreert tevens de intensiteit van elk ion. Deze scheiding kan, afhankelijk van de gebruikte massa-analysator, gebeuren op basis van tijd of ruimte. De resolutie en de accuratesse bepalen de prestatie van een massa-analysator. Mogelijke analysatoren zijn onder andere de iontrap, de Time of Flight-analyzer (TOF), een quadrupool of een combinatie

van

massaspectometers

meerdere wordt

analysatoren. gebruikt,

Indien

spreekt

een men

koppeling van

van

LC-MS/MS

twee of

tandemmassaspectrometrie. Een elektronenmultiplicator (electronmultiplier: EM) zet de binnenkomende ionenbundel om in een meetbaar en versterkt signaal. Er wordt dieper ingegaan op de gebruikte technieken.

4.1.1

Electrospray ionisatie

Electrospray ionisatie zal achtereenvolgens het eluaat omvormen tot druppels, daarna deze druppels van een lading voorzien en desolvateren en tenslotte zullen ionen gevormd worden van de aanwezige analyten. Het eluaat komende uit de kolom wordt door een capillair gestuurd onder atmosferische druk waarbij rondom het capillair een verstuivergas stroomt. Het uiteinde van het capillair is een fijne tip dat onderheven is aan een hoge potentiaal (ca. 3-4 kV). De vloeistof die door de fijne tip gaat, zal door het elektrisch veld een overmaat lading krijgen en bij verlaten van de tip zal de vloeistof verneveld worden tot geladen deeltjes, ook aerosol genoemd.

21


De geladen druppels zullen, onderhevig aan elektrostatische krachten, door een tegenelektrode worden aangetrokken. Naargelang het teken van de aangebrachte spanning zullen de resulterende analytionen ofwel positief of negatief geladen zijn. Eenmaal de druppels gevormd zijn, zal desolvatatie plaatsvinden en solvent uit de druppels verwijderd worden. Dit wordt bevorderd door een drooggas, bijvoorbeeld N2, in de tegenovergestelde richten te laten stromen. De druppels worden hierdoor steeds kleiner zodanig dat gelijke lading in een druppel steeds meer en meer geconcentreerd wordt. Bij overschrijden van een kritisch punt, de Rayleigh limiet genaamd, zullen de druppels exploderen. Dit kritisch punt wordt bereikt wanneer in een druppel de elektrostatische krachten te groot worden ten opzichte van de oppervlaktespanning (figuur 7).

Figuur 7. Desolvatatieproces bij ESI.

Nadat desolvatatie heeft plaatsgevonden, zullen de kleine druppels omgevormd worden tot ‘naakte’ ionen van de analyten. Het mechanisme van vorming van deze ionen is nog steeds omstreden en kan door twee verschillende modellen beschreven worden: het ionevaporatie-model en het ladingresidue-model. Het ionevaporatie-model stelt dat ionen onmiddelijk uit een druppel vrijgesteld kunnen worden en in de gasfase overgaan aangezien, door continue verdamping van solvent, het oppervlak van de druppel voldoende geladen zal zijn. Eenmaal de lading van ionen aan de oppervlakte van de druppel, en zo dus het elektrisch veld aan de oppervlakte, groter wordt dan de oppervlaktespanning kunnen naakte ionen uit de druppel ‘ontsnappen’ (figuur 8).

Het ladingresidue-model neemt aan dat de ionen van analytmolecules reeds gevormd zijn in de vloeibare fase en het proces van desolvatatie doorgaat tot slechts één ion per druppel overblijft. Tot slot zal ook bij deze druppel desolvatatie plaatsvinden zodat het ion over kan gaan naar de gasvormige fase.

22


Figuur 8. Ionevaporatie-model bij ESI.

De tegenelektrode is voorzien van een spleet waar de gevormde ionen door kunnen gaan en in verschillende zones terecht komen met een steeds verlagende druk, zodat de ionen uiteindelijk in de hoog-vacuüm-zone van de massaspectrometer geïntroduceerd worden. Figuur 9 geeft schematisch een ESI-interface weer (Ardrey 2003; Herbert and Johnstone 2003; Niessen 2006; Dolan, Kirkland et al. 2010).

Figuur 9. ESI-interface (Herbert and Johnstone 2003).

4.1.2

Massaspectrometer: quadrupool

Een quadrupool bestaat uit vier cilindervormige staven die evenwijdig liggen ten opzichte van elkaar en geplaatst zijn op de hoekpunten van een denkbeeldig vierkant. Een hoge gelijkstroomspanning (DC) en radiofrequentiespanning (RF) worden aangebracht over de staven. Twee tegenover elkaar liggende staven dragen een positieve lading, de overige twee staven dragen een negatieve lading. Een ion dat het gebied tussen de vier staven binnenkomt, zal onder invloed van de DC- en RF-spanning oscilleren via een bepaald traject doorheen de quadrupool. Door instellen van de gelijkstroomspanning en

23


radiofrequentie zullen enkel ionen in een specifiek, klein m/z-interval het einde van de quadrupool kunnen bereiken. Ionen met een m/z-verhouding die niet in het ingestelde interval zitten, zullen een onstabiel traject volgen en bijgevolg de detector niet bereiken. Door aanpassen van DC- en RF-spanning kan het gedetecteerde m/z-venster over een gewenst massabereik gescanned worden (figuur 10). Een quadrupool is in staat snel het totale massabereik af te scannen en maakt gebruik van een lage spanning zodat een relatieve hoge druk, zoals bij LC-MS, kan gebruikt worden. Daarnaast is ook de lage kostprijs een voordeel van deze massaspectrometer. Een groot nadeel van de quadrupool is de lage resolutie (Ardrey 2003).

Figuur 10. Een quadrupool.

4.1.3

Detector : elektronenmultiplicator

De EM bestaat uit een aantal dynodes. Dit zijn metalen platen waarbij elke plaat steeds een hogere potentiaal heeft dan de vorige plaat. Bij invallen van de ionenbundel op de eerste dynode, komen secundaire elektronen vrij die door de hogere potentiaal van de tweede plaat versneld naar deze tweede plaat bewegen. Hierdoor komen opnieuw secundaire elektronen vrij. Dit proces vindt steeds opnieuw plaats bij het bewegen van de elektronen naar de volgende dynode. Aangezien voor elk elektron dat invalt op een dynode telkens meerdere elektronen vrijkomen, wordt een vermenigvuldigingsproces gecreëerd (elektronenlawine) (Herbert and Johnstone 2003).

4.2 MS-modes De massaspectrometer kan in twee verschillende modes gebruikt worden: Total ion current (TIC) of Selected ion monitoring (SIM).

24


De scan mode TIC zal het vooraf ingestelde massabereik een aantal maal afscannen, afhankelijk van de resolutie van de massaspectrometer. Een hogere resolutie zal ervoor zorgen dat het bereik een aantal keren meer kan afgescanned worden. Verhogen van de scantijd of verkleinen van het massabereik kan de gevoeligheid verhogen. Dit heeft echter voor beiden nadelen: scantijd verhogen kan ervoor zorgen dat een te klein aantal datapunten gecollecteerd wordt, massabereik verkleinen kan ervoor zorgen dat waardevolle informatie verloren gaat (De Hoffmann E. 1996). In sommige gevallen is het niet nodig het volledige massabereik te scannen. Wanneer bijvoorbeeld de structuur van een component gekend is, kunnen ook eigenschappen en gedrag achterhaald worden. In dit geval zal SIM mode gekozen worden waardoor de gevoeligheid verhoogd wordt. De massaspectrometer wordt als massafilter gebruikt en zal enkel ionen binnen het bepaalde m/z-interval naar de detector doorzenden. De detector zal dus niet een massaspectrum opnemen, maar de intensiteit van de geselecteerde m/zwaarde registreren (Ardrey 2003; Niessen 2006).

4.3 Tandem massaspectrometrie (MS/MS) Door een zachte ionisatietechniek zoals ESI te gebruiken, zal er weinig tot geen fragmentatie van analytionen gebeuren. Soms is echter fragmentatie gewenst om bijkomende structurele informatie van de analyten te achterhalen. Hiervoor kan tandem massaspectrometrie als methode gebruikt worden. Tandem massaspectrometrie (MS/MS) maakt gebruik van een combinatie van massaanalysatoren (meestal twee): bijvoorbeeld een triple quadrupool (QqQ) of een quadrupoolTOF combinatie (Q-TOF). In QqQ worden drie quadrupolen in serie geplaatst. De eerste en derde quadrupool zijn massa-analysatoren terwijl de tweede quadrupool enkel onder invloed is van een radiofrequentie en gebruikt wordt als botsingscel. Deze middenste pool kan ook een hexapool zijn: dit zijn zes parallele staven in plaats van vier. Nadeel van een QqQ is de lage resolutie. Een Q-TOF kan hoge resolutie opleveren zoals in het addendum geïllustreerd wordt (De Hoffmann E. 1996; Ardrey 2003).

4.4 MS/MS modes De MS/MS kan in verschillende modes gebruikt worden: -

Product-ion scan

-

Precursor-ion scan

-

Constant neutral loss scan

-

Selected reaction monitoring 25


Product-ion scan Bij deze mode, ook daughter ion mode genoemd, zal de eerste quadrupool één of meerdere ionen selecteren op basis van een gedefinieerde m/z-verhouding. De doorgelaten ionen zullen in de botsingscel (Collision Induced Dissociation of CID-cel) gefragmenteerd worden door botsingen met een dragergas, bijvoorbeeld argon. De tweede massa-analysator zal nu alle m/z-waarden (in het opgegeven massabereik) scannen zodat de gevormde fragmenten van deze precursor-ionen in een spectrum worden weergeven.

Precursor-ion scan In de precursor-ion scan of parent ion mode zal de eerste quadrupool nu het totale opgegeven massabereik scannen en doorsturen naar de CID-cel. De tweede massaanalysator wordt ingesteld zodat slechts bepaalde fragmentionen van alle gevormde fragementen in de botsingcel worden doorgelaten naar de detector.

Constant neutral loss scan Sommige fragmentaties kunnen een herschikking van elektronen in de ionen teweeg brengen zodanig dat een (neutrale) massa vrijkomt. Dit verlies van een neutrale massa kan worden waargenomen voor alle ionen in de constant neutral loss mode. De twee massa-analysatoren scannen nu m/z-waarden, waarbij een massaverschil wordt ingesteld tussen beide (een off-set) zodat enkel wanneer dit massaverschil aanwezig is, een signaal wordt gedetecteerd.

Selected/Multiple-reaction monitoring Bij multiple reaction monitoring (MRM) zullen beide massa-analysatoren ingesteld worden zodat enkel specifiek geselecteerde ionen doorgelaten worden. Beide analysatoren zullen dus als massafilter werken. Deze mode wordt enkel gebruikt indien het analyt en de eigenschappen, zoals de fragmentatie, van het analyt gekend zijn. Een voordeel van gebruik van deze mode is de aanzienelijke verhoging van de gevoeligheid.

26

Ceramiden

5 Ceramiden 5.1 Structuur en voorkomen in de huid Ceramiden vallen onder de klasse sfingolipiden en bestaan uit twee onderdelen, een vetzuur en een lange amino-alcoholketen (sphingoid base), die covalent verbonden zijn via een amidebinding. Voor beide onderdelen bestaan echter variaties in aantal OHgroepen en aantal onverzadigde bindingen. Door deze variaties kunnen de ceramiden verder opgedeeld worden in verschillende subklassen. De lengte van vetzuurketen en amino-alcoholketen kan bij elke klasse eveneens variëren. Afhankelijk van de soort cel waarin de ceramiden zich bevinden, zullen de aanwezigheid en hoeveelheid van de soorten subklasses en de ketenlengtes binnenin elke subklasse verschillen. Ceramiden in de meeste menselijke cellen en/of weefsels bevatten slechts 3 soorten klasses, namelijk Cer[NS], Cer[NDS] en Cer[AS] (zie nomenclatuur 5.2.). Het stratum corneum (hoornlaag) van de mens bevat daarentegen niet alleen meer klasses maar ook ceramiden met een grotere variatie in ketenlengtes (Raith, Farwanah et al. 2004; Haynes, Allegood et al. 2009).

De opperste laag van de huid, ongeveer 10-40 µm dik, is de hoornlaag of stratum corneum. De laag bevat geen levende materie meer en is een onderdeel van de epidermis die een totale dikte heeft tussen 1.5-0.05 mm, afhankelijk van de locatie op het lichaam. De lagen van het epidermis zijn van binnen naar buiten achtereenvolgens (figuur 11) het stratum basale, het stratum spinosum, het stratum granulosum, het stratum lucidum en als buitenste laag het stratum corneum (Brannon 2007).

Figuur 11. Anatomie van de epidermis (Brannon 2007).

27

Ceramiden

Deze stratum corneum-laag bevat ceramiden die een belangrijke fysicochemische rol spelen bij eigenschappen zoals bescherming tegen waterverlies of afscherming van (schadelijke) externe omgeving. Daarenboven spelen ze ook een belangrijke rol in signaaltransductie en celregulatie in de huid. Naast ceramiden bevat de hoornlaag andere huidlipiden zoals vrije vetzuren en sterolen die samen met ceramiden intercellulaire ruimtes opvullen tussen de keratinocytcellen en hierbij een lamellaire structuur aannemen die parallel loopt met het oppervlak van de keratinocyten (Elias 1983; Brooks and Idson 1991).

Het diepteprofiel van de lipidensamenstelling in de epidermis varieert, aangezien de aanwezigheid van de lipiden in de hoornlaag een gevolg is van de opeenvolgende processen die doorgaan in dieperliggende epidermislagen. Eerst worden precursorlipiden gesynthetiseerd in het stratum basale, stratum spinosum en stratum granulosum en worden overgedragen naar lamellaire granules (keratinosomen) waarin lipiden gevormd worden; daarna worden de lipiden opnieuw afgescheiden door de keratinosomen. De lipiden worden omgevormd om uiteindelijk de lamellaire structuur aan te nemen in het stratum corneum. Bij de overgang naar het stratum corneum ondergaan de lipiden metabolisch een wijziging waarbij fosfolipiden gedegradeerd worden tot glycerol en vrije vetzuren en glucosfingolipiden omgezet worden tot ceramides (Coderch, Lopez et al. 2003).

5.2 Overzicht van onderzoek van ceramiden in de huid Aanvankelijk werden ceramide-klasses opgedeeld op basis van de retentie op een TLCplaat waarbij een hoger nummer (hogere retentie) een grotere polariteit betekent van de klasse. Gaandeweg het onderzoek van ceramiden kon dankzij ondermeer vooruitgang bij scheidingsmethodes en het daardoor groter inzicht in de structuren van de ceramiden, een meer specifieke en systematische manier gevonden worden om de verscheidene ceramiden te classificeren. Een duidelijk overzicht van de subklasses werd gegeven door Motta (Motta, Monti et al. 1993) via een systematische naamgeving volgens de gekoppelde delen. Deze nomenclatuur geeft combinaties van de vetzuurgroep: nonhydroxy-vetzuur (N), alfahydroxy-vetzuur (A), omega-hydroxy-vetzuren (O) veresterd aan een ander vetzuur (E), met de amino-alcoholketen: sfingosine (S), fytosfingosine (P) dihydrosfingosine (DS) en 6hydroxy-sfingosine (H); die via combinatie van de letters het ceramide aangeven, waarbij de letter gevolgd kan worden door een nummer die de ketenlengte van vetzuur/aminoalcoholketen aangeeft. Aanwezigheid van onverzadigde bindingen bij N, A, E en O kan 28

Ceramiden

aangegeven worden na het getal dat de ketenlengte aanduidt door middel van een dubbelpunt, gevolgd door het aantal onverzadigdheden. Figuur 12 geeft de verschillende klasses weer.

O HN

OH OH

Cer[N(18)S(18)

O HN

OH OH

Cer[N(18)P(18)]

OH

O HN

OH OH

Cer[N(18)DS(18)]

O HN

OH OH

Cer[N(18)H(18)]

OH OH O HN

OH

Cer[A(18)S(18)]

OH

OH O HN

OH OH

Cer[A(18)P(18)]

OH OH O HN

OH OH

Cer[A(18)DS(18)]

OH O HN

OH OH

OH

Cer[A(18)H(18)]

29

Ceramiden

OH O

O

O HN

OH OH

Cer[E(18:2)O(18)S(18)]

OH O O

O HN

OH OH

Cer[E(18:2)O(18)P(18)]

OH OH O

O

O HN

OH OH

Cer[E(18:2)O(18)DS(18)]

OH O

O

O HN

OH OH

OH

Cer[E(18:2)O(18)H(18)]

Figuur 12. Overzicht van ceramidenklassen.

In de beginjaren van ceramide-onderzoek werden voornamelijk dunlaagchromatografie en gaschromatografie als scheidingsmethodes gebruikt (Casparrini 1969; Gray and Yardley 1975; Wertz, Miethke et al. 1985). Beide methodes vertonen echter beperkingen: TLC bood enkel een idee over de polariteit van de ceramiden en slechts weinig tot geen bijkomende informatie over de diverse structuren, terwijl GC hydrolyse en derivatisatie vereiste van de componenten en daarbij informatie kon geven over de structuur van zowel het vetzuur-gedeelte als de amino-alcoholketen maar geen informatie gaf over welke combinaties van de ketens aan elkaar gekoppeld waren. Daarenboven was scheiding via een niet-geautomatiseerde en dus weinig reproduceerbare methode zoals TLC moeilijk om een complex mengsel van ceramiden, zoals in de huid, te analyseren waarin de structuren nauw verwant zijn. Automatisering van TLC (Automated Multiple DevelopmentHigh Performance Thin Layer Chromatography: AMD-HPTLC) kon meer nauwkeurige resultaten geven.

30

Ceramiden

Ook koppelen van GC na (geautomatiseerde) TLC leidde tot een meer volledige analyse (Bonte, Saunois et al. 1997; Farwanah, Neubert et al. 2002; Raith, Farwanah et al. 2004; Farwanah, Raith et al. 2005).

Aanvankelijk werden bij TLC-analyses van ceramiden in de huid zeven klasses toegekend, corresponderend met zeven spots (Imokawa, Abe et al. 1991). Onderzoek door zowel Robson en Vietzke wees echter uit dat deze zeven spots overeenkomen met negen ceramide-klasses vermits twee van de zeven spots niet één maar twee klasses omvatten. Vijf spots komen overeen met de klasses Cer[NP], Cer[NH], Cer[AP], Cer[AH] en Cer[EOS]. De overige twee spots omvatten elk twee niet gescheiden klasses, namelijk Cer[NDS] en Cer[NS] ,en Cer[AS] en Cer[EOH] (Robson, Stewart et al. 1994; Vietzke, Brandt et al. 2001). Een ander klasse, Cer[EOP], werd door Ponec weergevonden op spoor-niveau (Ponec, Weerheim et al. 2003). Een recentste toevoeging van de klasse Cer[ADS] in de hoornlaag werd geïdentificeerd door Masukawa (Masukawa, Narita et al. 2008). Daarnaast werden ook reeds twee klasses die covalent gebonden zijn aan proteïnen aan het licht gebracht (Cer[OS] en Cer[OH]) (Wertz, Madison et al. 1989).

Bij HPLC-analyse werden in het verleden reeds combinaties van zowel normaalfase als omkeerfase modes met verschillende detectorsystemen zoals UV-detectie, fluorescentiedetectie, evaporatie-lichtverstrooiingsdetectie (Evaporative Light Scattering Detector: ELSD) gebruikt. UV- en fluorescentie-detectie vereisten beiden derivatisatie net zoals bij GC, terwijl dit bij ELSD niet het geval was. Ontwikkeling van ESI-MS gekoppeld na een LC-systeem zorgde ervoor dat onmiddelijke online analyse van ceramiden mogelijk werd. Daarnaast bood HPLC-MS zowel hoge gevoeligheid als selectiviteit, waardoor deze analysemethode het laatste decennium de meest gebruikte en meest verkozen techniek is geworden om ceramiden te analyseren (Vietzke, Strassner et al. 1999; Raith, Farwanah et al. 2004; Masukawa, Narita et al. 2008). Omkeerfase HPLC scheidt ceramiden voornamelijk op basis van ketenlengtes van vetzuur en amino-alcoholketen. Normaalfase HPLC doet dit op basis van aantal aanwezige en positie van polaire OH-groepen.

31

Experimenteel gedeelte

6 Experimenteel gedeelte 6.1 Algemene aspecten 6.1.1

Chemicaliën

De solventen isopropanol, chloroform en dicholoromethaan zijn afkomstig van Sigma Aldrich, water en methanol van Biosolve en hexaan van Fisher Scientific. Alle bovenvermelde solventen zijn van LC-MS-kwaliteit. Mierenzuur afkomstig van Biosolve, ammoniumformiaat en azijnzuur afkomstig van Sigma Aldrich werden gebruikt. Van de ceramiden Cer[N(24)S(18)] en Cer[N(24)P(18)] afkomsting van Larodan en ceramide II (samengesteld

uit

Cer[A(23:0)S(18)],

Cer[A(18)S(18)], Cer[A(23:2)S(18)],

Cer[A(22:0)S(18)],

Cer[A(22:2)S(18)],

Cer[A(24:0)S(18)],

Cer[A(24:1)S(18)],

Cer[A(25:0)S(18)], Cer[A(25:2)S(18)], Cer[A(26:0)S(18)] en Cer[A(26:1)S(18)]) afkomstig van Sigma Aldrich, werden stockoplossingen gemaakt in isopropanol-dichloromethaan (1:1) van respectievelijk 2.5 mg/mL, 2 mg/mL en 5 mg/mL. De concentratie van de stockoplossingen voor glycerol trioleaat opgelost in dichloromethaan en cholesteryl oleaat opgelost in hexaan, bedragen respectievelijk 4 mg/mL en 10 mg/mL. Beiden zijn afkomstig van Sigma Aldrich. Alle standaardoplossingen werden bewaard bij - 4°C.

6.1.2

Instrumentatie

De analyses werden uitgevoerd op een Alliance HPLC-systeem (Waters). Detectie gebeurde met een Micromass Quattro Micro API LC-MS/MS-systeem (Waters) en een Corona Charged Aerosol Detector (ESA). Dataverwerking werd uitgevoerd met Masslynx MS software (Waters) en PeakSimple software (SRI Instruments).

6.2 Ontwikkeling en optimalisatie van een NPLC-methode voor analyse van ceramiden Een geschikte NPLC-methode werd gezocht voor de analyse van ceramiden, waarbij detectie werd uitgevoerd met een Corona Charged Aerosol Detector (ESA). Aangezien het scheidingsmechanisme bij normaalfase gebaseerd is op polariteit van ceramiden via aantal en locatie op de koolstofketen van OH-groepen, werd in dit opzicht gepoogd de ceramidenklasses te scheiden en te isoleren via een fractiecollector. Enkele methodes met een Zorbax RX-SIL kolom (10 cm L x 3 mm I.D. x 1.8 µm dp; Agilent Technologies) en verschillende solventen werden getest. Mobiele fase A hexaanisopropanol-mierenzuur (95:5:0.1) en mobiele fase B hexaan-isopropanol-50 mM ammonium formiaat (aq.) (25:65:10) gebruikt door Masukawa (Masukawa, Narita et al.

32


2008) werden in gradiënt elutie bij een debiet van 0.3 mL/min uitgevoerd. In 3 min werd van de initiële condities 100% mobiele fase A en 0% mobiele fase B lineair overgegaan naar 90% mobiele fase A en 10% mobiele fase B. Hierna werd overgegaan tot 0% mobiele fase A en 100% mobiele fase B in 32 min. Deze samenstelling werd 5 min aangehouden waarna in 10 min opnieuw de begincondities bereikt werden. De begincondities werden aangehouden gedurende 30 min zodat de kolom voldoende geconditioneerd werd voor de volgende analyse. Injecties (10 µL) van individuele standaardoplossingen van 250 µg/mL Cer[N(24)P(18)], Cer[N(24)S(18)] en ceramide II werden uitgevoerd ter identificatie van de pieken. Daarna werd injectie (10 µL) van een standaardmengsel van 250 µg/mL Cer[N(24)P(18)], Cer[N(24)S(18)] en ceramide II uitgevoerd. Vermits de retentie van de standaarden in het mengsel niet volledig reproduceerbaar was, waarbij voornamelijk de aanwezigheid van water in mobiele fase B een grote invloed hierop had, werd een aanpassing ingevoerd. Hierdoor kon de benodigde tijd voor de kolomconditionering ingekort worden. Mobiele fase B werd gewijzigd tot hexaanisopropanol-500 mM ammoniuim formiaat (aq.) (50:50:1). Verschillende gradiënten werden getest bij een standaardmengsel-injectie (10 µL) van 250 µg/mL Cer[N(24)P(18)], Cer[N(24)S(18)] en ceramide II. Ook de snelheid van de mobiele fase werd gewijzigd. Een debiet van 0.1 mL/min gaf problemen voor stabiliteit van de druk, een debiet van 0.2 mL/min bleek wel mogelijk te zijn. Hierna werd overgegaan tot ontwikkeling van de methode met een Alliance HPLCsysteem (Waters) gekoppeld aan een Micromass Quattro Micro API LC-MS/MS-systeem (Waters). De massaspectrometer is in de eerste plaats veel gevoeliger dan een coronaontladingsdetector, zodat injectie van 10 µL 10 µg/mL standaardmengsel volstond, daarenboven wordt structurele informatie verkregen via de massaspectra. De karakterisatie van de ceramiden wordt beschreven in 6.3. De MS-parameters zoals capillaire spanning en kegelspanning werden geoptimaliseerd zodat de gewenste ionisatie plaatsvond. Een capillaire spanning van 3.0 kV en een kegelspanning van 20 V werden optimaal bevonden bij positieve ionisatie. Bij de ontwikkeling van NPLC-ESI-MS werd ook hier eerst de methode ontwikkeld door Masukawa getest, ditmaal werd het debiet ingesteld op 0.1 mL/min, ditmaal zonder problemen met stabiliteit van de druk. Figuur 13 geeft de analyse weer van het standaardmengsel met deze methode. Vermits de nodige tijd voor conditionering van de kolom het grote nadeel is van deze methode, werd hierna een andere mobiele fase B gezocht. De finale mobiele fase B heeft een samenstelling van isopropanol-dichloromethaan-hexaan-mierenzuur (25:25:50:0.05). De waterige ammonium formiaat-oplossing werd uit deze fase verwijderd zodat de

33


reproduceerbaarheid van retentie verhoogd werd. Een post-kolom mobiele fase, zoals ook werd toegepast bij NPLC-MS onderzoek door Masukawa (Masukawa, Narita et al. 2008) werd toegevoegd zodat ionisatie van de ceramiden bij ESI-MS bevorderd werd.

Figuur 13. Scan chromatogram van standaardmengsel 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)] en ceramide II (10 µL injectie). Piekidentificatie: NS = Cer[N(24)S(18)], NP = Cer[N(24)P(18)], AS = ceramide II. Kolom: Zorbax RX-SIL (10 cm L x 3 mm I.D. x 1.8 µm dp), mobiele fase A: hexaan-isopropanol-mierenzuur (95:5:0.1), mobiele fase B: hexaanisopropanol-50 mM ammonium formiaat (aq.) (25:65:10). Gradiënt elutie: . 0% → 10% B in 3 min, 10% → 100% B in 32 min, 100% B (5 min), 100% → 0% B in 10 min, 0% B (30min), debiet: 0.1 mL/min.

Mobiele fase A en mobiele fase B werden in een gradiënt met een debiet van 0.2 mL/min gebruikt. De begincondities 100% mobiele fase A en 0% mobiele fase B% werden 20 min behouden waarna in 10 min werd overgegaan tot 50% mobiele fase A en 50% mobiele fase B. Dit werd 5 min aangehouden, waarna opnieuw overgegaan werd tot 100% mobiele fase A en 0% mobiele fase B in 5 min. Tenslotte werd dit 10 min aangehouden zodat de kolom geconditioneerd werd. De post-kolom mobiele fase, bestaande uit methanol-isopropanol-500 mM ammonium formiaat (50:50:1) met een debiet van 0.1 mL/min, werd via een T-connectie gekoppeld aan de stroom komende van de kolom zodat beiden geïntroduceerd werden in de massaspectrometer.

De elutie van een

standaardmengsel wordt weergegeven in figuur 14. Deze methode werd gebruikt bij ontwikkeling van de monstervoorbereiding en bij de analyse van ceramiden in de huid. 34


Figuur 14. Scan chromatogram van standaardmengsel 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)] en ceramide II (10 µL injectie). Piekidentificatie: NS = Cer[N(24)S(18)], NP = Cer[N(24)P(18)], AS = ceramide II. Kolom: Zorbax RX-SIL (10 cm L x 3 mm I.D. x 1.8 µm dp), mobiele fase A: hexaan-isopropanol-mierenzuur (95:5:0.1), mobiele fase B: isopropanol-dichloromethaan-hexaan-mierenzuur (25:25:50:0.05). Gradiënt elutie: . 0% B (20 min), 0% → 50% B in 10 min, 50% B (5 min), 50% → 0% B in 5 min, 0% B (10min). debiet: 0.2 mL/min.

Een mengsel van de klasse Cer[NS] (50 µg/mL Cer[N(14)S(18)], Cer[N(15)S(18)], Cer[N(16)S(18)],

Cer[N(18)S(18)];

Cer[N(20)S(18)],

Cer[N(24:0)S(18)]

en

Cer[N(24:1)S(18)]) werd eveneens geanalyseerd met de methode. Figuur 15 geeft het chromatogram (A) weer van dit mengsel van de klasse Cer[NS] (10µL injectie) en het chromatogram (B)

van het

standaardmengsel van 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)],

Cer[N(24)P(18)] en ceramide II (10 µL injectie). De retentie van zowel de klasse Cer[NS]ceramiden als de klasse Cer[AS]-ceramiden zijn verspreid over enkele minuten. Aangezien de scheiding tussen de verschillende klasses onderling niet groot genoeg is, zal overlapping van verschillende klasses te verwachten zijn. Het is in dit geval dus niet aangewezen fractionatie van de ceramideklasses toe te passen.

35


Figuur 15. Overlappende scan chromatogrammen van A: 50 µg/mL Cer[NS]-mengsel bestaande uit: Cer[N(14)S(18)], Cer[N(15)S(18)], Cer[N(16)S(18)], Cer[N(18)S(18)]; Cer[N(20)S(18)], Cer[N(24:0)S(18)] en Cer[N(24:1)S(18)] (10 µL injectie) en B: 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)] en ceramide II: samengesteld uit Cer[A(18)S(18)], Cer[A(22:0)S(18)], Cer[A(22:2)S(18)], Cer[A(23:0)S(18)], Cer[A(23:2)S(18)], Cer[A(24:0)S(18)], Cer[A(24:1)S(18)], Cer[A(25:0)S(18)], Cer[A(25:2)S(18)], Cer[A(26:0)S(18)] en Cer[A(26:1)S(18)] (10 µL injectie).

6.3 Karakterisatie van ceramiden door MS-analyse Aangezien de structuren van de verschillende ceramideklasses analoog zijn, kunnen bij variaties van ketenlengtes van de vetzuurketen en aminoalcohol-keten niet enkel gelijke massa’s terug gevonden worden binnen één klasse, maar ook bij de verschillende ceramideklasses onderling. Zo zijn dezelfde massa’s terug te vinden bij de klasses Cer[NP], Cer[AH] en Cer[ADS] alsook bij de klasses Cer[AS], Cer[NDS] en Cer[NH]. ESIMS/MS in positieve ionisatiemode maakt het mogelijk de ketenlengte van de aanwezige aminoalcohol-ketens te achterhalen. Product-ionmassa’s van klasse Cer[NDS] en Cer[NH], en Cer[ADS] en Cer[AH] zijn eveneens gelijk indien de dihydrosfingosine-keten één koolstof meer bevat dan de 6-hydroxy-sfingosine-keten. De intensiteiten van productionen O’ en O’’ van beide klasses verschillen echter zodat een onderscheid kan gemaakt worden. De precursor- en product-ionen worden weergegeven in tabel 1, de twee product-

36


ionen O en O’’’, respectievelijk [M+H-RvetzCO]+ en [M+H-RvetzCO-3H2O]+, worden niet weergegeven in de tabel. Tabel 1. Positieve precursor- en productionen van de ceramideklasses. klasse precursor-ion product-ion product-ion O'

product-ion O''

Cer[NS]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[NP]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[NDS]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

*

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[NH]

[M+H]+

<

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

>

*

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[AS]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[AP]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[ADS]

[M+H]+

>

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

>

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

Cer[AH]

[M+H]+

<

[M+H-H2O]+

[M+H-RvetzCO-H2O]+

<

[M+H-RvetzCO-2H2O]+

*: verschilt van het onderzoek door Masukawa (Masukawa, Narita et al.2009)

Gezien de uitgebreide dataverwerking werden de ω-estergelinkte ceramiden Cer[EOS], Cer[EOP] en Cer[EOH] en de weinig abundante klasse Cer[AP] niet geanalyseerd in dit werk (Masukawa, Narita et al. 2009). Figuur 16. toont de spectra van de standaard Cer[N(24)S(18)] respectievelijk in de scan mode (A) en in de product-ion scan mode (B).

Figuur 16. A: scan mode spectrum van standaard Cer[N(24)S(18)].

37


Figuur 16. B: product-ion scan mode spectrum van standaard Cer[N(24)S(18)].

6.4 Monstervoorbereiding Het voorbereidend werk van een monster is vaak de belangrijkste maar ook meest tijdrovende

stap

van

de

analyse.

Monstervoorbereiding

voor

analyse

van

hoornlaagceramiden kan opgedeeld worden in twee stappen, extractie uit de huid via tape-stripping en zuiveren van matrixeffecten via vaste fase extractie.

6.4.1

Tape stripping-techniek en tape-extractie

Aanrijken van de ceramiden uit de huid is één van de cruciaalste stappen. Verschillende in vivo procedures zijn reeds ontwikkeld waaronder oppervlak-extractie met organische solventen zoals chloroform en methanol. (Imokawa and Hattori 1985; Bonte, Pinguet et al. 1995; Lavrijsen, Bouwstra et al. 1995; Farwanah, Neubert et al. 2002). Nadeel van deze methode is de mogelijk permanente schade aangericht aan de huid. Bekomen van huidcellen via het schrapen van de huid is een tweede methode (Lavrijsen, Higounenc et al. 1994; Gildenast and Lasch 1997; Farwanah, Wohlrab et al. 2005). Een derde methode bestaat uit collectie van een dunne laag stratum corneum via een glasplaat bedekt met een cyanoacrylaatpolymeer (Marks and Dawber 1971; Imokawa, Abe et al. 1991; Vietzke, Strassner et al. 1999). Een vierde en laatste methode is het strippen van de huid via een tape. Deze methode werd in dit werk gebruikt (Weerheim and Ponec 2001; Masukawa, Narita et al. 2008). Hoornlaag-extract werd gecollecteerd door aanbrengen van een tape (Corneofix) van 20 x 20 mm op een specifieke regio van de voorarm. Daarna werd druk uitgeoefend op deze plaats met behulp van een rol die 10 maal heen en weer werd bewogen. De tape werd vervolgens in één snelle beweging manueel van de huid verwijderd. Een tweede tape werd op dezelfde regio aangebracht en werd in de richting tegengesteld aan de richting

38


van de eerste tape-stripping verwijderd, ofwel van pols naar elleboog toe, ofwel van elleboog naar pols toe (Tassopoulos 2006). De procedure wordt aan de hand van de foto in figuur 17 (A) geïllustreerd, samen met de tape vóór (B) en na aanbrengen op de huid (C).

Figuur 17. A: principe van tape aanbrengen op de huid (Tassopoulos 2006), B: tape vóór aanbrengen op de huid en C: na aanbrengen op de huid (B).

In het totaal werden tien tapes verzameld. Extractie van de tapes werd getest via een aantal extractiesolventen, namelijk methanol, isopropanol, dichloromethaan:methanol (2:1), dichloromethaan-isopropanol (1:1). Methanol bleek het beste extractiesolvent voor de tapes. Verzamelde extracten in isopropanol en vooral in dichloromethaan:methanol (2:1) en in dichloromethaan-isopropanol (1:1) vertoonden na verdampen een kleverige residu afkomstig van de tape. Heroplossen na verdampen en ook verdere analyse werd hierdoor bemoeilijkt, onder andere voor de SPE-procedure resulteerde dit in een zeer

39


trage elutie na laden van de monsters. Ook meer dan één tape-extractie uitvoeren leidde tot loskomen van polymeermateriaal van de tape. Opdat de interferenties van de tape zo laag mogelijk werden gehouden, werd enkel de eerste tape-extractie uitgevoerd. De volgende methode werd gebruikt: -

onderdompelen van individuele tapes in 3 mL methanol.

-

10 min sonicatie

-

collecteren van extract per 2 tapes

-

verdampen bij 90°C

-

2 maal wassen van residu’s met 150 µL dichloromethaan-isopropanol (1:1)

-

wasvolumes van alle 10 tapes verzamelen en opnieuw verdampen bij 90°C

-

oplossen in 120 µL hexaan-dichloromethaan-isopropanol (100:10:10)

Hierna werd de SPE-procedure, besproken in 6.4.2., toegepast op het extract. 6.4.2

Vaste fase extractie

Vaste fase extractie (solid phase extraction of SPE) is een veel gebruikte monstervoorbewerkingsmethode voor HPLC. SPE wordt ondermeer toegepast voor concentreren van een analyt, voor verwijderen van interferenties of verwijderen van componenten die mogelijks schade aan de kolom aanrichten en voor solventuitwisseling. Het principe van vaste fase extractie is gelijk aan dat van vloeistofchromatografie. Componenten vertonen een zekere affiniteit tegenover de stationaire fase (het bed van de cartridge) en de mobiele fase. Bij SPE wordt enkel isocratische elutie gebruikt. Er kan gekozen worden om ofwel de interferenties vast te houden op de cartridge en de analyten die weinig tot geen interactie met de stationaire fase vertonen onmiddellijk te elueren, ofwel worden eerst interferenties geëlueerd en de analyten op de cartridge gehouden. Na verwijderen van de interferenties kunnen de analyten geëlueerd worden met een geschikt solvent. In SPE wordt meestal een kleine (enkele cm’s) uit polymeer vervaardigde kolom (cartridge) voorzien van een gepakt bed. Elutie gebeurt ofwel onder invloed van de zwaartekracht ofwel onder vacuüm. Een SPE-methode bestaat in de meeste gevallen uit vier verschillende stappen: een conditioneringsstap die het sorbent op de cartridge reinigt en activeert, een laadstap waarbij het monster aangebracht wordt (loading), een wasstap die interferenties wegspoelt met een geschikt solvent en een elutiestap van de analyten met een geschikt solvent (figuur 18). Voordelen ten opzichte van vloeistof-vloeistofextractie zijn onder andere: vlot en eenvoudig verzamelen van een analytfractie, reductie van het gebruikte organisch

40


solvent, verwijderen van vaste deeltjes, efficiëntere scheiding van interferenties en volledige extractie van analyten. Daarentegen bevat deze techniek ook enkele nadelige eigenschappen zoals niet uniform gepakte cartridges, nood aan een (tijdsrovende) ontwikkeling van de SPE-methode en een soms irreversibele retentie van analyten op de cartridge (Dolan, Kirkland et al. 2010).

Figuur 18. SPE-procedure (Dolan, Kirkland et al. 2010).

Zoals reeds vermeld, heeft de huid een complexe samenstelling. Indien ceramiden geanalyseerd wensen te worden, kunnen talrijke andere componenten interferenties vormen bij analyse. Na de in vivo extractie uit de huid (zie 6.4.1.), zal via vaste fase extractie gepoogd worden de ceramiden zoveel mogelijk te isoleren van deze mogelijke interferenties. Er moet eveneens rekening gehouden worden met interferenties afkomstig van de tape. Verificatie van de SPE-methode werd hierbij eerst toegepast op een standaardmengsel van 200 µg/mL Cer[N(24)P(18)], Cer[N(24)S(18)], ceramide II, glycerol trioleaat en cholesteryl oleaat, waarvan 10 µL opgelost werd in 100 µL hexaan. De verschillende stappen werden in fracties gecollecteerd en geanalyseerd. Hierna werd ook extract van tapes die gespiked werden met 5µL van het 200 µg/mL standaarmengsel geanalyseerd. Elutie gebeurde telkens onder invloed van de zwaartekracht. De analyse gebeurde met de NPLC-MS methode, besproken in 6.4., in de scan mode en in

de

MRM

mode.

Enkel

Cer[A(24)S(18)],

analoog

aan

Cer[N(24)S(18)]

en

Cer[N(24)P(18)], werd beschouwd in ceramide II bij de analyse. Bij Cer[N(24)S(18)] werd

41


in MRM mode de massatransitie m/z 650.9 → 263.9 beschouwd, bij Cer[N(24)P(18)] de transitie 669 → 282 en bij Cer[A(24)S(18)] de transitie 667 → 264. Twee bijkomende standaarden glycerol trioleaat en cholesteryl oleaat, mogelijke interferenties aanwezig in de huid, werden toegevoegd aan de oplossing. De transities 903 → 603 en 669 → 369 werden gevolgd respectievelijk voor glycerol trioleaat en cholesteryl oleaat. Verschillende types cartridges en methodes werden getest. De methode gebruikt door Masukawa (Masukawa, Narita et al. 2008) werd getest met drie cartridgetypes van 100 mg/1 mL, namelijk een silica-cartridge (Sigma Aldrich), een diol-cartridge (Sigma Aldrich) en een aminopropyl-cartridge (Alltech). Het protocol houdt in totaal vijf stappen in:

- conditionering: 10 mL chloroform-methanol (99.5:0.5) - laden van de standaardoplossing - wassen met 10 mL chloroform-methanol (99.5:0.5) - elutie met 10 mL chloroform-methanol (99:5) - een additionele elutie met 10 mL chloroform-methanol (99:5) als controlestap

De 3 laatste stappen werden respectievelijk als fractie 1, 2 en 3 gecollecteerd, verdampt in een oven (90°C) en terug opgelost in 360 µL hexaan-isopropanol-dichloromethaan (100:10:10). Uit de analyse bleek dat bij de diol-cartridge zowel Cer[N(24)P(18)] als Cer[N(24)S(18)]

reeds

volledig

geëlueerd

werden

bij

de

wasstap

(fractie

1).

Cer[A(24)S(18)] werd teruggevonden zowel in fractie 1 als in fractie 2. Bij de aminopropylcartridge werden Cer[N(24)P(18)] en Cer[A(24)S(18)] enkel in fractie 2 teruggevonden maar werd Cer[N(24)S(18)] geëlueerd in fractie 1 en 2. De silica-cartridge gaf een analoog resultaat: Cer[N(24)S(18)] werd eveneens teruggevonden in fractie 1 en 2. Geen van de drie gebruikte cartridge-types vertoonde het gewenste resultaat, namelijk alle ceramide-klasses in de elutiestap (fractie 2) elueren.

Andere aanpakken werden getest, waarbij zowel verschillende cartridgetypes als solventen gebruikt werden. Hierbij bleek voornamelijk, net zoals bij HPLC in normaalfase mode, voldoende conditionering van de SPE-cartridge van belang te zijn. De beste resultaten werden bekomen via volgende methode met een 100 mg/1 mL aminopropylcartridge (Alltech):

- conditionering met 20 mL hexaan-0.5% azijnzuur - laden van standaardoplossing - wassen met 1.5 mL hexaan

42


- elutie met 7 mL hexaan-dichloromethaan-isopropanol (8:1:1) - additionele elutie met 1 mL dichloromethaan als controle

De fracties werden opnieuw verdampt bij 90°C en terug opgelost in 360 µL hexaanisopropanol-dichloromethaan

(100:10:10).

Figuur

19

geeft

achtereenvolgend

de

chromatogrammen weer van de SPE-fracties 1, 2 en 3.

Figuur 19. F1: scan TIC-chromatogram van SPE fractie 1 en F2: scan TIC-chromatogram van SPE fractie 2. Piekidentificatie F2: NS = Cer[N(24)S(18)], NP = Cer[N(24)P(18)], AS= ceramide II.

43


Figuur 19. F3: scan TIC-chromatogrammen van SPE fractie 3.

Figuur 20 geeft achtereenvolgend de extracted ion chromatogrammen weer van de m/z waarden voor Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)] en Cer[A(24)S(18)] bekomen uit het TICchromatogram van de tweede SPE-fractie.

Figuur 20a. XIC respectievelijk van m/z 650.9 en 669 van fractie 2. Piekidentificatie: NS = Cer[N(24)S(18)], NP = Cer[N(24)P(18)], * = isotoop van Cer[A(24)S(18)].

44


Figuur 20b. XIC van m/z 667 van fractie 2. Piekidentificatie: AS = Cer[A(24)S(18)].

In de scan mode-chromatogrammen van de verschillende fracties is telkens een piek te zien bij tR = 2.30 min. Analyse van een standaardmengsel van cholesteryl oleaat en glycerol trioleaat, geeft aan dat beide componenten rond deze retentietijd geëlueerd worden. Bij nader onderzoek van de massspectra onder de piek (tR= 2,30 min) van elke fractie, kan worden aangetoond dat alle cholesteryl oleaat en glycerol trioleaat in de eerste fractie geëlueerd werd. Figuur 21 toont zowel de massaspectra van de standaardoplossing cholesteryl oleaat en glycerol trioleaat als fractie 1, 2 en 3. Hoewel de concentratie cholesteryl oleaat en glycerol trioleaat in de standaardoplossing even groot is, wordt een minder grote piek waargenomen in het massaspectrum voor cholesteryl oleaat. Dit is toe te kennen aan de lage ioniseerbaarheid van de cholesteryl ester.

Figuur 21a. Massaspectrum van standaardoplossing (10 µg/mL) cholsteryl oleaat en glycerol trioleaat. Piekidentificatie: CE = cholesteryl oleaat, TG = glycerol trioleaat.

45


Figuur 21b. F1: massaspectrum van SPE-fractie 1. F2: massaspectrum van SPE-fractie 2, F3: massaspectrum van SPE-fractie 3. Piekidentificatie: CE = cholesteryl oleaat, TG = glycerol trioleaat.

Bovenstaande procedure werd hierna getest op twee tapes, beiden gespiked met 5 µL van een 200 µg/mL standaardoplossing van Cer[N(24)P(18)], Cer[N(24)S(18)], ceramide II, glycerol trioleaat en cholesteryl oleaat opgelost in dichloromethaan:isopropanol (1:1).

46


Hierbij werd na verdampen, elke fractie terug opgelost in 360 µL hexaan-isopropanoldichloromethaan (100:10:10). Dit werd in drievoud uitgevoerd zodat de precisie, meer bepaald de herhaalbaarheid getest werd. Herhaalbaarheid wordt gedefinieerd als de mate van spreiding van meetwaarden die onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd werden. Onder dezelfde omstandigheden worden onder andere dezelfde meetmethode en – apparatuur, dezelfde waarnemer, dezelfde plaats en binnen een kort tijdsbestek verstaan. De maat voor precisie kan worden uitgedrukt aan de hand van de relatieve standaardafwijking (relative standard deviation: RSD)

(22)

waarbij

de gemiddelde meetwaarde is en

de experimentele standaardafwijking is, die

gedefinieerd is als:

(23)

met

de ide meetwaarde en

de gemiddelde meetwaarde.

Tabel 2 geeft het gemiddelde piekoppervlak en de relatieve standaardafwijking weer en de verhouding van het piekoppervlak tussen de klasses onderling met de relatieve standaardafwijking. Tabel 2. Reproduceerbaarheid getest op 3 tapes (gespiked). klasse gemiddelde piekoppervlak ± standaardafwijking

RSD (%)

Cer[N(24)S(18)] Cer[N(24)P(18)]

313300 ± 44650 17770 ± 1687

14.25 9.49

Cer[A(24)S(18)]

27500 ± 3386

21.33

verhouding

gemiddelde verhouding ± standaardafwijking

RSD (%)

0.057

6.33

0.08733

12.61

Onderling vergelijken van de standaarden bij eenzelfde meting, geeft een idee over de instrumentele fout. Er kan uit de bekomen resultaten opgemaakt worden dat de instrumentatie een belangrijke rol speelt bij de herhaalbaarheid.

47


6.5 NPLC-analyse van ceramiden in de huid Zoals eerder vermeld, werden ceramideklasses gespreid over enkele minuten bij de ontwikkelde methode. In dit opzicht bleek fractionatie van de ceramideklasses niet adequaat te zijn. Desalniettemin werd de ontwikkelde NPLC-methode toegepast op extract (50 µL injectie) bekomen na tape-extractie en SPE, in de scan mode. Via extracted ion chromatogram (XIC) kunnen de m/z-waarden van ceramiden geselecteerd worden uit het TIC-chromatogram en zo ruis onderdrukt worden. Extract van een blanco tape werd via dezelfde monstervoorbereiding bekomen en geanalyseerd (50 µL injectie) zodat mogelijke interferenties van de tape gecontroleerd werden. De data verkregen in scan mode bij NPLC zijn niet voldoende om identificatie van de ceramiden mogelijk te maken. Vermits bij de extracted ion chromatogrammen nog steeds een lage signaalruisverhouding werd bekomen, werd een gevoeligere en uitgebreidere analyse in omkeerfase chromatografie uitgevoerd.

6.6 Ontwikkeling van een RPLC-methode voor analyse van ceramiden Een chromatografische methode werd ontwikkeld en geverifieerd via standaardceramideoplossingen. Ceramide-extract werd in de scan mode geanalyseerd. Om alle klasses te onderscheiden en de lengte van zowel de amino-alcoholketen als van de vetzuurketen toe te kennen, werd eveneens een analyse in de product-ion scan mode uitgevoerd.

Op basis van voorgaand onderzoek op ceramiden in bloedplasma, werd een RPLCmethode ontwikkeld met een Kinetex C18 kolom (5 cm L x 2.1 mm I.D.; 2.6 µm dp; Phenomenex) en mobiele fase A en B respectievelijk water-0.5 M ammonium formiaat (100:1) en methanol-mierenzuur (100:0.2). Er werd een gradiënt elutie uitgevoerd met een debiet van 0.3 mL/min en als begincondities 20% mobiele fase A en 80% mobiele fase B. Dit werd 1 min aangehouden. Hierna werd een stapsgewijze overgang naar 0% mobiele fase A en 100% mobiele fase B gemaakt. Deze compositie werd behouden gedurende 10 min. Vervolgens werd opnieuw een stapsgewijze overgang gemaakt naar de beginsituatie 20% mobiele fase A en 80% mobiele fase B. Deze verhouding werd 5 min aangehouden zodat de kolom geconditioneerd werd voor de daaropvolgende analyse. Figuur 22 geeft een chromatogram weer van 20 µL injectie van 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)] en Cer[N(24)P(18)] in MRM-mode waarbij respectievelijk massatransitie 650.9 → 263.9 en 669 → 282 werden beschouwd.

48


Figuur 22. MRM-Chromatogram van 10 µg/mL Cer[N(24)S(18)] en Cer[N(24)P(18)] (20 µL injectie). Piekidentificatie: NP = Cer[N(24)P(18)], NS = Cer[N(24)S(18)]. Kolom: Kinetex C18 (5 cm L x 2.1 mm I.D.; 2.6 µm d p), mobiele fase A = water-0.5M ammonium formiaat (100:1), mobiele fase B = methanol-mierenzuur (100:0.02). Gradiënt elutie: 0 tot 1 min 80% B, 1.05 min 100% B, 1.05 tot 10 min 100% B, 10.05 min 80% B, 10.05 tot 15 min 80% B.

6.7 RPLC-analyse van ceramiden in de huid

Dezelfde methode beschreven in 6.6. werd gebruikt voor analyse van ceramiden in de hoornlaag. De monstervoorbereiding werd uitgevoerd via de procedure beschreven in 6.4., waarbij de laatste stap gewijzigd werd tot heroplossen in 300 µL isopropanol-water (80:20). Extract van een blanco tape werd opnieuw geanalyseerd; eerst in de scan mode en dan in de product-ion scan mode en vergeleken met de data verkregen van het ceramide-extract. Bij analyse van zowel ceramide-extract als blanco tape-extract werd telkens 50 µL geïnjecteerd.

Omtrent de gevoeligheid van RPLC-MS tegenover NPLC-MS wordt in figuren 23 en 24 ter illustratie de vergelijking gemaakt tussen de extracted ion chromatogrammen van Cer[NP] met een totale ketenlengte van 44 koolstoffen, een adundante ceramide-massa. Hierbij is zowel een betere signaal-tot-ruis-verhouding merkbaar als een 10 maal hogere intensiteit bij omkeerfase.

49


Figuur 23. Extracted ion chromatogram (m/z 697) in normaalfase mode.

Figuur 24. Extracted ion chromatogram (m/z 697) in omkeerfase mode.

In scan mode werd gezocht naar m/z-waarden van de ceramiden. Nadien werden in product-ion scan mode via de massaspectra naar de karakteristieke fragmentatiepatronen van de ceramiden gezocht. Figuur 25 geeft van boven naar onder A: het scan chromatogram, B: het extracted ion chromatogram van m/z 711 (de m/z-ratio van Cer[NP] met een totale ketenlengte van 45 koolstoffen) en C: het massaspectrum bij tR = 9,30 min van de productionscan (m/z 711) weer. In het totaal werden onder deze piek 7 ceramiden van de klasse Cer[NP] geïdentificeerd met een variërende ketensamenstelling. In C wordt ter identificatie van de pieken telkens het soort production gegeven O, O’, O’’ of O’’’(zie 6.3.) met daarboven het aantal koolstoffen aanwezig in de fytosfingosine-keten.

50


Figuur 25. A: scan TIC-chromatogram van ceramide-extract (50 µL injectie), B: XIC van m/z 711 en C: massaspectrum bij tR = 9.30 min van de productionscan (m/z 711).

Alle ceramiden gevonden via deze procedure worden weergegeven in tabel 3.

51


Tabel 3. Ceramiden aanwezig in de hoornlaag. + klasse # C's [M+H] ceramiden Cer[NS] 34 539 [N(16)S(18)]

Cer[NP]

Cer[NDS]

35

553

[N(18)S(17)]

36

567

[N(16)S(20)]

[N(18)S(18)]

38

595

[N(16)S(22)]

[N(18)S(20)]

[N(20)S(18)]

[N(22)S(16)]

39

609

[N(19)S(20)]

[N(20)S(19)]

[N(21)S(18)]

[N(23)S(16)]

40

623

[N(16)S(24)]

[N(18)S(22)]

[N(20)S(20)]

[N(22)S(18)]

41

637

[N(16)S(25)]

[N(17)S(24)]

[N(18)S(23)]

[N(19)S(22)]

[N(20)S(21)]

41

637

[N(21)S(20)]

[N(22)S(19)]

[N(23)S(18)]

[N(24)S(17)]

[N(25)S(16)]

42

651

[N(18)S(24)]

[N(20)S(22)]

[N(22)S(20)]

[N(24)S(18)]

43

665

[N(21)S(22)]

[N(22)S(21)]

[N(23)S(20)]

[N(24)S(19)]

[N(25)S(18)]

44

677

[N(24:1)S(20)]

[N(26:1)S(18)]

44

679

[N(22)S(22)]

[N(24)S(20)]

[N(26)S(18)]

45

693

[N(23)S(22)]

[N(24)S(21)]

[N(25)S(20)]

[N(26)S(19)]

[N(27)S(18)]

46

707

[N(24)S(22)]

[N(25)S(21)]

[N(26)S(20)]

[N(27)S(19)]

[N(28)S(18)]

47

721

[N(21)S(26)]

[N(22)S(25)]

[N(23)S(24)]

[N(24)S(23)]

[N(25)S(22)]

47

721

[N(26)S(21)]

[N(27)S(20)]

[N(28)S(19)]

[N(29)S(18)]

48

735

[N(24)S(24)]

[N(26)S(22)]

[N(28)S(20)]

[N(29)S(19)]

39

627

[N(24)P(16)]

40

641

[N(22)P(19)]

[N(23)P(18)]

[N(24)P(17)]

[N(25)P(16)]

41

655

[N(22)P(20)]

[N(24)P(18)]

[N(25)P(17)]

[N(26)P(16)]

42

669

[N(23)P(20)]

[N(24)P(19)]

[N(25)P(18)]

[N(26)P(17)]

43

683

[N(24)P(20)]

[N(26)P(18)]

[N(27)P(17)]

[N(28)P(16)]

44

697

[N(23)P(22)]

[N(24)P(21)]

[N(25)P(20)]

[N(26)P(19)]

[N(27)P(18)]

44

697

[N(28)P(17)]

45

711

[N(24)P(22)]

[N(26)P(20)]

[N(28)P(18)]

46

725

[N(25)P(22)]

[N(26)P(21)]

[N(27)P(20)]

[N(28)P(19)]

[N(29)P(18)]

47

739

[N(24)P(24)]

[N(26)P(22)]

[N(28)P(20)]

[N(30)P(18)]

48

753

[N(24)P(25)]

[N(25)P(24)]

[N(26)P(23)]

[N(27)P(22)]

48

753

[N(29)P(20)]

[N(30)P(19)]

[N(31)P(18)]

49

767

[N(24)P(26)]

[N(26)P(24)]

[N(28)P(22)]

36

569

[N(25)DS(21)]

42

649

[N(23:2)DS(19)]

42

651

[N(23:1)DS(19)]

42

653

[N(26)DS(16)]

43

667

[N(24)DS(19)]

44

677

[N(25:2)DS(19)]

44

681

[N(25)DS(19)]

45

695

[N(24)DS(21)]

[N(28)P(21)]

[N(30)P(20)]

[N(27)DS(16)]

52


klasse Cer[NDS]

Cer[NH]

Cer[AS]

+

# C's 46

[M+H] 709

ceramiden [N(28)DS(18)]

47

723

[N(28)DS(19)]

48

737

[N(29)DS(19)]

49

751

[N(26)DS(23)]

50

765

[N(29)DS(21)]

51

779

[N(30)DS(21)]

[N(32)DS(19)]

36

583

[N(14)H(22)]

[N(16)H(20)]

[N(17)H(19)]

[N(18)H(18)]

37

597

[N(12)H(25)]

[N(16)H(21)]

[N(18)H(19)]

[N(20)H(17)]

39

625

[N(18)H(21)]

[N(20)H(19)]

[N(22)H(17)]

[N(24)H(15)]

40

639

[N(16)H(24)]

[N(17)H(23)]

[N(18)H(22)]

[N(19)H(21)]

N[(20)H(20)]

40

639

[N(22)H(18)]

[N(23)H(17)]

[N(24)H(16)]

41

653

[N(16)H(25)]

[N(18)H(23)]

[N(20)H(21)]

[N(22)H(19)]

[N(24)H(17)]

41

653

[N(26)H(15)]

42

667

[N(17)H(25)]

[N(18)H(24)]

[N(19)H(23)]

[N(20)H(22)]

[N(21)H(21)]

42

667

[N(22)H(20)]

[N(23)H(19)]

[N(24)H(18)]

[N(25)H(17)]

[N(26)H(16)]

43

681

[N(18)H(25)]

[N(20)H(23)]

[N(22)H(21)]

[N(24)H(19)]

[N(26)H(17)]

44

695

[N(19)H(25)]

[N(20)H(24)]

[N(21)H(23)]

[N(22)H(22)]

[N(23)H(21)]

44

695

[N(24)H(20)]

[N(25)H(19)]

[N(26)H(18)]

[N(27)H(17)]

[N(28)H(16)]

45

709

[N(20)H(25)]

[N(22)H(23)]

[N(24)H(21)]

[N(26)H(19)]

[N(28)H(17)]

46

723

[N(21)H(25)]

[N(22)H(24)]

[N(23)H(23)]

[N(24)H(22)]

[N(25)H(21)]

46

723

[N(26)H(20)]

[N(27)H(19)]

47

737

[N(22)H(25)]

[N(24)H(23)]

[N(26)H(21)]

[N(28)H(19)]

34

555

[A(16)S(18)]

[A(18)S(16)]

40

639

[A(22)S(18)]

[A(23)S(17)]

42

667

[A(24)S(18)]

[A(26)S(16)]

43

681

[A(25)S(18)]

[A(26)S(17)]

44

695

[A(24)S(20)]

[A(26)S(18)]

45

709

[A(23)S(22)]

[A(24)S(21)]

45

709

[A(28)S(17)]

[A(29)S(16)]

46

723

[A(24)S(22)]

[A(26)S(20)]

[A(28)S(18)]

47

737

[A(24)S(23)]

[A(25)S(22)]

[A(26)S(21)]

[A(27)S(20)]

48

751

[A(24)S(24)]

[A(26)S(22)]

[A(28)S(20)]

[A(30)S(18)]

49

765

[A(27)S(22)]

[A(28)S(21)]

[A(29)S(20)]

[A(30)S(19)]

[A(31)S(18)]

49

765

[A(32)S(17)]

50

779

[A(24)S(26)]

[A(26)S(24)]

[A(28)S(22)]

[A(30)S(20)]

[A(32)S(18)]

51

793

[A(25)S(26)]

[A(27)S(24)]

[A(29)S(22)]

[A(30)S(21)]

[A(31)S(20)]

51

793

[A(32)S(19)]

[A(33)S(18)]

52

807

[A(30)S(22)]

[A(32)S(20)]

[A(27)S(19)]

[A(25)S(20)]

[A(26)S(19)]

[A(27)S(18)]

[A(34)S(18)]

53


klasse Cer[AS]

Cer[ADS]

Cer[AH]

# C's 53

[M+H] 821

53

+

ceramiden [A(29)S(24)]

[A(30)S(23)]

821

[A(34)S(19)]

[A(35)S(18)]

39

641

[A(14)H(25)]

49

781

41

[A(31)S(22)]

[A(32)S(21)]

[A(33)S(20)]

[A(16)H(23)]

[A(18)H(21)]

[A(20)H(19)]

[A(30)H(19)]

[A(31)H(18)]

[A(32)H(17)]

[A(33)H(16)]

651

[A(21)H(20)]

[A(23)H(18)]

42

665

[A(20)H(22)]

[A(21)H(21)]

[A(22)H(20)]

[A(23)H(19)]

[A(24)H(18)]

42

665

[A(25)H(17)]

43

677

[A(23:1)H(20)]

[A(25:1)H(18)]

43

679

[A(23)H(20)]

[A(25)H(18)]

44

693

[A(23)H(21)]

[A(24)H20)]

[A(25)H(19)]

[A(26)H(18)]

[A(27)H(17)]

45

707

[A(23)H(22)]

[A(25)H(20)]

[A(27)H(18)]

47

735

[A(25)H(22)]

[A(27)H(20)]

[A(29)H(18)]

Bij identificatie van de ceramiden moet echter rekening gehouden worden met aanwezigheid van onverzadigde bindingen in het vetzuurgedeelte. De massa’s van verschillende klasses (met verzadigde vetzuurketens) verschillen soms slechts 2 massaeenheden. Introductie van een dubbele binding in de vetzuurketen van de ceramide met de hogere massa geeft dus dezelfde massa als de ceramide met de lagere massa. Bij klasses waarin de aminoalcohol-keten verschilt, vormt dit bij identificatie geen probleem. Wanneer echter de vetzuurketen dezelfde is bij beide ceramiden, kan via positieve ionisatie niet bepaald worden over welke klasse het gaat. Aangezien in de literatuur voornamelijk wordt aangenomen dat de vetzuurketen verzadigd is, werd ook in dit werk aangenomen dat in geval van twijfel de verzadigde vetzuurketen aanwezig was. Enkel analyse in negatieve ionisatie mode zou hierbij uitsluitsel kunnen geven of deze onderstelling waar is.

54

Conclusie

7 Conclusie Er werd een normaalfase chromatografische methode ontwikkeld met als opzet hoornlaagceramiden te analyseren. Daarna werd een monstervoorbereidingprocedure ontwikkeld om de ceramiden uit de hoornlaag te collecteren via tape-stripping en zoveel mogelijk te isoleren van interferenties (cholesterylesters en triglyceriden) door gebruik te maken van vaste fase extractie. De intentie de ceramideklasses te scheiden bleek niet succesvol, aangezien overlapping van de verschillende klasses plaatsvond. Het ceramide-extract werd via NPLC-MS geanalyseerd in de scan mode. Identificatie van de lengte van het vetzuurgedeelte en de aminoalcohol-keten van de ceramiden vereist daarenboven tandemmassaspectrometrie vermits variaties in ketenlengte van beide onderdelen resulteren in ceramiden met dezelfde massa’s. Wegens de hogere gevoeligheid van RPLC-MS, werd in dit opzicht gekozen de ceramiden in omkeerfase LC-MS te analyseren. Een methode werd ontwikkeld gebaseerd op analyse van ceramiden in bloedplasma. De methode werd hierna toegepast op ceramide-extract, zowel in de scan mode als in de product-ion scan mode. In de scan mode werd via extracted ion chromatogrammen naar de massa’s van de ceramiden gezocht. Extract van blanco tape werd tevens in scan en product-ion scan mode geanalyseerd en mogelijke interferenties werden gecontroleerd. Via de massaspectra van analyse in product-ion scan mode, werden de fragmentaties van ceramiden onderzocht en de aanwezige amino-alcoholketens geïdentificeerd. Met kennis van de massa’s van zowel

precursor-

als

product-ionen,

werden

hierna

de

aanwezige

ceramiden

geïdentificeerd. Hierbij moet rekening gehouden worden met de aanwezigheid van eventuele onverzadigde bindingen. Vermits een bijkomende analyse in negatieve ionisatie mode ter identificatie van de vetzuurketen nodig is, werd in dit werk aangenomen dat bij geval van twijfel de verzadigde vetzuurketen aanwezig was. Een totaal van 281 ceramiden werd geïdentificeerd met positieve mode ESI tandem quadrupool MS. In samenwerking met Metablys werden door gebruik te maken van negatieve mode ESI in combinatie met hoge resolutie Q-TOF MS meer dan 950 ceramiden éénduidig geïdentificeerd.

Dit

succes

is

voornamelijk

gebaseerd

op

een

goede

monstervoorbewerkingstechniek, dit is tape-aanrijking en SPE, ontwikkeld in dit werk. De bekomen resultaten geven nieuwe perspectieven voor onder andere studie van huidkanker, psoriasis, invloed van cosmetica (antioxidanten) en metabolome studies.

55

Referenties

8 Referenties Ardrey, R. E. (2003). Liquid chromatography–mass spectrometry: an introduction, John Wiley & Sons Ltd. Bonte, F., P. Pinguet, et al. (1995). "Analysis of all stratum corneum lipids by automated multiple development high-performance thin-layer chromatography." Journal of Chromatography B-Biomedical Applications 664(2): 311-316. Bonte, F., A. Saunois, et al. (1997). "Existence of a lipid gradient in the upper stratum corneum and its possible biological significance." Archives of Dermatological Research 289(2): 78-82. Brannon, H. L. (2007). "Epidermis Anatomy." from http://dermatology.about.com/od/anatomy/ss/epidermis.htm. Brooks, G. and B. Idson (1991). "Skin lipids." International Journal of Cosmetic Science 13(2): 103-113. Casparrini, G. H., E. C. ; Horning, M. G. (1969). "Gas phase analytical separation and structural study of ceramides." Chemistry and Physics of Lipids 3(1): 1-10. Coderch, L., O. Lopez, et al. (2003). "Ceramides and skin function." American Journal of Clinical Dermatology 4(2): 107-129. De Hoffmann E., C. J., Stroobant V. (1996). Mass Spectrometry Principles and Applications, John Wiley & Sons. Di Nardo, A., P. Wertz, et al. (1998). "Ceramide and cholesterol composition of the skin of patients with atopic dermatitis." Acta Dermato-Venereologica 78(1): 27-30. Dolan, J. W., J. J. Kirkland, et al. (2010). Introduction to Modern Liquid Chromatography, A John Wiley & Sons, Inc., Publication. Elias, P. M. (1983). "Epidermal Lipids, Barrier Function, and Desquamation." The Journal of investigative dermatology 80(6): 44-49. Engelhardt, H. (2004). "One century of liquid chromatography from Tswett's columns to modem

high

speed

and

high

performance

separations."

Journal

of

Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 800(1-2): 3-6. Ettre, L. S. (2000). "Chromatography: the separation technique of the 20th century." Chromatographia 51(1-2): 7-17. Farwanah, H., R. Neubert, et al. (2002). "Improved procedure for the separation of major stratum corneum lipids by means of automated multiple development thin-layer chromatography." Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 780(2): 443-450. 56

Referenties

Farwanah, H., K. Raith, et al. (2005). "Ceramide profiles of the uninvolved skin in atopic dermatitis and psoriasis are comparable to those of healthy skin." Archives of Dermatological Research 296(11): 514-521. Farwanah, H., J. Wohlrab, et al. (2005). "Profiling of human stratum corneum ceramides by means of normal phase LC/APCI-MS." Analytical and Bioanalytical Chemistry 383(4): 632-637. Gildenast, T. and J. Lasch (1997). "Isolation of ceramide fractions from human stratum corneum lipid extracts by high-performance liquid chromatography." Biochimica Et Biophysica Acta-Lipids and Lipid Metabolism 1346(1): 69-74. Gray, G. M. and H. J. Yardley (1975). "Lipid compositions of cells isolated from pig, human, and rat epidermis." Journal of Lipid Research 16(6): 434-440. Haynes, C. A., J. C. Allegood, et al. (2009). "Sphingolipidomics: Methods for the comprehensive analysis of sphingolipids." Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 877(26): 2696-2708. Hens, Z. (2009). Molecular Physical Chemistry. Gent, Universiteit Gent. Herbert, C. G. and A. A. W. Johnstone (2003). Mass spectrometry basics CRC Press LLC. Holleran, W. M., Y. Takagi, et al. (2006). "Epidermal sphingolipids: Metabolism, function, and roles in skin disorders." Febs Letters 580(23): 5456-5466. Imokawa, G., A. Abe, et al. (1991). "Decreased Level of Ceramides in Stratum Corneum of Atopic Dermatitis: An Etiologic Factor in Atopic Dry Skin?" Journal of Investigative Dermatology 96(4): 523-526. Imokawa, G. and M. Hattori (1985). "A Possible Function of Structural Lipids in the WaterHolding Properties of the Stratum Corneum." Journal of Investigative Dermatology 84(4): 282-284. Lavrijsen, A. P. M., J. A. Bouwstra, et al. (1995). "Reduced Skin Barrier Function Parallels Abnormal Stratum Corneum Lipid Organization in Patients with Lamellar Ichthyosis." Journal of Investigative Dermatology 105(4): 619-624. Lavrijsen, A. P. M., I. M. Higounenc, et al. (1994). "Validation of an in-vivo extraction method for human stratum-corneum ceramides." Archives of Dermatological Research 286(8): 495-503. Marks, R. and R. P. R. Dawber (1971). "Skin Surface Biopsy - improved technique for examination of horny layer." British Journal of Dermatology 84(2): 117-&. Masukawa, Y., H. Narita, et al. (2009). "Comprehensive quantification of ceramide species in human stratum corneum." Journal of Lipid Research 50(8): 1708-1719.

57

Referenties

Masukawa, Y., H. Narita, et al. (2008). "Characterization of overall ceramide species in human Stratum corneum." Journal of Lipid Research 49(7): 1466-1476. Motta, S., M. Monti, et al. (1993). "Ceramide composition of the psoratic scale." Biochimica Et Biophysica Acta 1182(2): 147-151. Niessen, W. M. A. (2006). Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, Taylor and Francis Group, LLC. Ponec, M., A. Weerheim, et al. (2003). "New acylceramide in native and reconstructed epidermis." Journal of Investigative Dermatology 120(4): 581-588. Poole C. F., P. S. K. (1991). Chromatography today, Elsevier Science. Raith, K., H. Farwanah, et al. (2004). "Progress in the analysis of Stratum corneum ceramides." European Journal of Lipid Science and Technology 106(8): 561-571. Robson, K. J., M. E. Stewart, et al. (1994). "6-hydroxy-4-sphingenine in human epidermal ceramides." Journal of Lipid Research 35(11): 2060-2068. Sandra, P. (2007). Analytische Scheidingstechnieken. Gent, Universiteit Gent. Tassopoulos, T. F. (2006). Evaluation of topical bioavailibility in human stratum corneum in vivo by tape stripping using a direct spectroscopic method. Basel, University of Basel. Vietzke, J. P., O. Brandt, et al. (2001). "Comparative investigation of human stratum corneum ceramides." Lipids 36(3): 299-304. Vietzke, J. P., M. Strassner, et al. (1999). "Separation and identification of ceramides in the human stratum corneum by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry and electrospray multiple-stage mass spectrometry profiling." Chromatographia 50(1-2): 15-20. Weerheim, A. and M. Ponec (2001). "Determination of stratum corneum lipid profile by tape stripping in combination with high-performance thin-layer chromatography." Archives of Dermatological Research 293(4): 191-199. Wertz, P. W., K. C. Madison, et al. (1989). "Covalently Bound Lipids of Human Stratum Corneum." Journal of Investigative Dermatology 92(1): 109-111. Wertz, P. W., M. C. Miethke, et al. (1985). "The Composition of the Ceramides from Human Stratum Corneum and from Comedones." Journal of Investigative Dermatology 84(5): 410-412.

58

Woordenlijst

Woordenlijst HPLC

High Performance Liquid Chromatography

TLC

Thin Layer Chromatography

RPLC

Reverse Phase Liquid Chromatography

NPLC

Normal Phase Liquid Chromatography

HILIC

Hydrophilic Interaction Chromatography

IPC

Ion-Pair Chromatography

IEC

Ion-Exchange Chromatography

SEC

Size Exclusion Chromatography

HETP

Height Equivalent of a Theoretical Plate

LC-NMR

Liquid Chromatography-Nuclear Magnetic Resonance

LC-MS

Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

CAD

Corona Aerosol Detector

MS

Massaspectrometrie

APCI

Atmospheric Pressure Chemical Ionization

ESI

Electrospray Ionization

TOF

Time of Flight

LC-MS/MS

Liquid Chromatography-Tandem mass spectrometry

EM

Electronmultiplier

DC

Direct Current

RF

Radio Frequency

TIC

Total Ion Current

SIM

Selected Ion Monitoring

QqQ

triple quadrupole

Q-TOF

Quadrupole-Time of Flight

CID

Collision Induced Dissociation

MRM

Multiple-Reaction Monitoring

GC

Gass Chromatography

AMD-HPTLC

Automated Multiple Development-High Performance Thin Layer Chromatography

ELSD

Evaporative Light Scattering Detector

NS

Nonhydroxy-fatty acid + Sphingosine

NP

Nonhydroxy-fatty acid + Phytosphingosine

AS

Alpha-hydroxy-fatty acid + Sphingosine

59

Woordenlijst

CE

Cholesteryl Ester

TG

Triglyceride

RSD

Relative Standard Deviation

60

Symbolenlijst

Symbolenlijst tR

retentietijd (s)

t0

dode tijd (s)

tR’

netto retentietijd (s)

u

lineaire snelheid van de mobiele fase (m/s)

L

kolomlengte (m)

k

retentiefactor

mS

massa van de component in de stationaire fase (g)

mM

massa van de component in de mobiele fase (g)

cS

concentratie van de component in de stationaire fase (mol/L)

cM

concentratie van de component in de mobiele fase (mol/L)

K

verdelingscoëfficiënt

β

fase-ratio

VM

volume van de component in de mobiele fase (L)

VS

volume van de component in de stationaire fase (L)

α

selectiviteit of scheidingsfactor

µ

verwachtingswaarde

σ

standaardafwijking

wb

breedte van een piek aan de basis (s)

wh

breedte van een piek op halve hoogte (s) ruimtelijke variantie

z

migratie-afstand (m)

H

schotelhoogte (m)

Dax

axiale dispersiecöeffiënt (m²/s)

N

schotelgetal

Rs

resolutie

A

Eddydiffusieterm

B

longitudinale diffusieterm

C

transportweerstand

λ

pakkingsefficiëntie

dp

diameter van deeltje (m)

DM

diffusiecoëfficiënt in de mobiele fase (m²/s)

CM

bijdrage tot piekverbreding in de mobiele fase

CS

bijdrage tot band- of piekverbreding in de stationaire fase

61

Symbolenlijst

σ2inj

bandverbreding door injectie

σ2kol

bandverbreding binnen de scheidingskolom

σ²dv

bijdrage van dode volumes

σ²det

bijdrage van de detector

σ²tot

totale piekbreedte gemiddelde meetwaarde experimentele standaardafwijking

xi

ide meetwaarde

n

aantal metingen

62

Addendum

Addendum Recent beschreven K. Sandra et al. een lipidomic platform voor totaal analyse in bloedplasma monsters (J. Chromatogra. A. doi:10.1016/j.chroma.2010.02.039)

De abstract van de publicatie wordt weergegeven:

Comprehensive blood plasma lipidomics by liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry

Koen Sandra, Alberto dos Santos Pereira, Gerd Vanhoenacker, Frank David and Pat Sandra Metablys, Kennedypark 26, 8500 Kortrijk, Belgium

Abstract A lipidomics strategy, combining high resolution reversed-phase liquid chromatography (RPLC) with high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry (Q-TOF), is described. The method has carefully been assessed in both a qualitative and a quantitative fashion utilizing human blood plasma. The inherent low technical variability associated with the lipidomics method allows to measure 65% of the features with an intensity RSD value below 10%. Blood plasma lipid spike-in experiments demonstrate that relative concentration differences smaller than 25% can readily be revealed by means of a t-test. Utilizing an advanced identification strategy, it is shown that the detected features mainly originate from (lyso-)phospholipids, sphingolipids, mono-, di- and triacylglycerols and cholesterol esters. The high resolution offered by the up-front RPLC step further allows to discriminate various isomeric species associated with the different lipid classes. The added value of utilizing a Jetstream electrospray ionization (ESI) source over a regular ESI source in lipidomics is for the first time demonstrated. In addition, the application of ultra high performance LC (UHPLC) up to 1200 bar to extend the peak capacity or increase productivity is discussed.

De methode ontwikkeld voor de monstername en SPE opzuivering van de huid-ceramiden beschreven in dit werk, werd gecombineerd met de identificatie mogelijkheden van het beschreven platform. Het resultaat wordt weergegeven in de volgende figuur.

63

Addendum

Figuur. Plot van ceramidemassa’s tegenover de retentietijd.

Ieder punt in de plot stemt éénduidig overeen met een bepaald ceramide en alle klasses (Figuur 12 pagina 32) zijn vertegenwoordigd. Meer dan 950 ceramiden zijn aanwezig met een variatiecoefficient < 10%. Dit opent perspectieven voor metabolome studies van de huid.

Deze gegevens werden ter beschikking gesteld door Pauline Couturon, stagaire in het RIC vanuit de KUL.

64

Development of an LC-MS method for the determination of ceramides in the skin B. Dhoopa*, B. Bicalhoa, F. Lynena and P. Sandraa&b a

Laboratory Separation Sciences, Department of Organic Chemistry, University of Ghent, B-9000 Ghent, Belgium. b Metablys, Research Institute of Chromatography, B-8500 Kortrijk, Belgium * email: [email protected] Ceramides have been indicated to play a physicochemical and physiological role in the skin. Compared to intracellular ceramides, ceramides in the skin are more complex. Not only are there more classes present in the stratum corneum but the variation in chain length is also higher. A sample preparation method has been developed which successfully separated the ceramides from compounds such as triglycerides and cholesteryl esters, present in the skin. Since separation in normal phase mode is based on polarity, an attempt was made to separate/fractionate the different ceramide classes. However, separation of the different classes was not sufficient compared to the spreading of 1 class using the developed method. For a sensitive analysis of the stratum corneum ceramides, a reverse phase mass spectrometry method was used. Identification of 281 species of ceramides in positive ionization mode was accomplished. Introduction

The human horny layer (stratum corneum) provides protection to the human body from a (harmful) environment and water loss. Due to the unique structure of this skin layer, a combination of keratinocytes (‘bricks’) and intracellular lipid lamellae (‘mortar’) [1], a barrier is formed between the body and surroundings. The skin lipids mainly consist of free fatty acids, cholesterol and ceramides. Ceramides play a crucial physicochemical role in formation of the barrier, but also physiologically in cell regulation and differentiation and signal transduction [2]. Several skin diseases, such as psoriasis and atopic dermatitis have been linked to altered ceramide compositions in the skin [3-4]. Compared to ceramides present in other human cells or tissues, the ceramide composition in the horny layer is more complex. Intracellular ceramides consist only of 3 ceramide subclasses, in the skin however 10 classes have already been assigned [5]. Not only are there more classes present in the stratum corneum, but variation of the chain length can also be large. An overview of the ceramide structures is given in the following section. Nomenclature Ceramides are a subclass of the sphingolipids and are made out of a long chain base (sphingoid base) and a fatty acid chain linked to each other via an amide bond. In this report the nomenclature proposed by Motta [6] is used. The different ceramide classes are termed according to their combination of sphingoid base and fatty acid chain. The sphingoid base can be a sphingosine (S), phytosphingosine (P), dihydrosphingosine (DS) or a 6-hydroxy-sphingosine (A). The fatty acid can be a non-hydroxy fatty acid (N), an alpha-

hydroxy fatty acid (A) or an esterified (E) omega-hydroxy fatty acid (O). If all possible combinations are considered, a total of 12 ceramide classes can be determined, namely Cer[NS], Cer[NP], Cer[NDS], Cer[NH], Cer[AS], Cer[AP], Cer[ADS], Cer[AH], Cer[EOS], Cer[EOP], Cer[EODS] and Cer[EOH]. The structures of both chain parts consisting of 18 carbons (the esterified chain contains 36 carbons) and the names of the different classes are given in figure 1. As mentioned before, the chain length of each class may vary, both in the sphingoid base chain as in the fatty acid chain. The number of carbons in each chain can be denoted between brackets after the letter. If unsaturated bonds are present in the fatty acid chain, this can be added after the chain length number, denoted by the number of double bonds preceded by a colon. For example a combination of S consisting of 18 carbons and an esterified omega-hydroxy fatty acid (O) consisting of 20 carbons where 2 double bonds are included in E with a chain of 18 carbons gives: Cer[E(18:2)O(20)S(18). fatty acid

OH

O

sphingoid base H2N

OH

H2 N

OH

Cer[NS]

Cer[AS]

Cer[EOS]

Cer[NP]

Cer[AP]

Cer[EOP]

Cer[NDS]

Cer[ADS]

Cer[EODS]

Cer[NH]

Cer[AH]

Cer[EOH]

OH OH

OH OH

OH

O

OH OH

H2N

O O

OH

OH OH

H2 N

OH

O

OH

Figure 1. Nomenclature of ceramides proposed by Motta [6] according to composition. Chemicals Isopropanol, chloroform and dichloromethane are from Sigma Aldrich, water and methanol are from Biosolve and hexane is from Fisher Scientific. All mentioned solvents are of HPLC grade. Formic acid from Biosolve and ammonium formate and acetic acid from Sigma Aldrich were used. Stock solutions of ceramides Cer[N(24)S(18)] and Cer[N(24)P(18)] from Larodan and ceramide II (a composition of Cer[A(18)S(18)], Cer[A(22:0)S(18)], Cer[A(22:2)S(18)], Cer[A(23:0)S(18)], Cer[A(23:2)S(18)], Cer[A(24:0)S(18)], Cer[A(24:1)S(18)], Cer[A(25:0)S(18)], Cer[A(25:2)S(18)], Cer[A(26:0)S(18)] and Cer[A(26:1)S(18)]) from Sigma Aldrich, of 2.5 mg/mL, 2 mg/mL and 5 mg/mL respectively, were made in isopropanol-dichloromethane (1:1). The concentration of stock solutions of glycerol trioleate dissolved in dichloromethane and cholesteryl oleate dissolved in hexane, are 4 mg/mL and 10 mg/mL respectively. Both are from Sigma Aldrich. All standard solutions were kept at - 4°C. Sample preparation The sample preparation of ceramides in the horny layer can be divided in two separate parts: tape stripping to extract the horny layer and solid phase extraction (SPE) to isolate the ceramides from interferences in the horny layer extract.

Tape-stripping Several in vivo methods have been developed to extract the horny layer, one of them being stripping of the skin via a tape [5, 7]. This method has also been used in this report. The ceramides in the horny layer are collected by applying a tape (20 x 20 mm) on a specific region of the fore arm. Pressure is applied on this area by moving a roll back and forth 10 times [8]. Afterwards, the tape was removed rapidly by hand. A second stripping on the same region was performed, this time stripped in the direction opposite to the direction of the first stripping (from wrist to elbow or vice versa). In total 10 tapes were collected using this method. Subsequently, the following procedure was used: immersion of individual tapes in 3 mL methanol, sonication (10 min), collecting of extract per 2 tapes, evaporation at 90°C, washing (2x) of residue with 150 µL dichloromethane-isopropanol (1:1), collecting wash volumes of all 10 tapes, evaporation at 90°C and redissolving in 120 µL hexane-dichloromethane-isopropanol (100:10:10). The SPE procedure discussed in the next section was applied to this extract. Solid Phase Extraction Several procedures have been explored, of which the following, performed on an 100 mg/1 mL aminopropyl-cartridge (Alltech), worked the best; conditioning step: 20 mL of hexane-0.5% acetic acid, loading of sample, washing step: 1.5 mL of hexane, elution step: 7 mL of hexane-dichloromethane-isopropanol (8:1:1), and an additional elution step: 1 mL of dichloromethane as a check up. The last three steps were collected as fractions, evaporated at 90°C and redissolved in 360 µL hexane-dichloromethane-isopropanol (100:10:10) for normal phase liquid chromatography (NPLC) analysis and in 300 µL isopropanol-water (80:20) for reverse phase liquid chromatography (RPLC) analysis. The procedure was first tested on a sample of a standard mix of 200 µg/mL Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)], ceramide II, glycerol trioleate and cholesteryl oleate of which 10 µL was dissolved in 100 µL hexane. Glycerol trioleate (a triglyceride) and cholesteryl oleate (a cholesteryl ester), two compounds present in the skin, were proven to be eluted in the washing step. The ceramide classes Cer[NS], Cer[NP] and Cer[AS] were eluted in the elution step. LC-MS and LC-MS/MS analysis An NPLC method was developed using an Alliance HPLC-system (Waters). Detection was executed with a Micromass Quattro Micro API LC-MS/MS system. Development of a method was explored using several solvents and a Zorbax RX-SIL column (10 cm L x 3 mm I.D. x 1.8 µm dp; Agilent Technologies). The final method, using mobile phase A hexane-isopropanol-formic acid (95:5:0.1) and mobile phase B isopropanoldichloromethane-hexane-formic acid (25:25:50:0.05), consists of the following steps: initial conditions 100% A and 0% B were maintained 20 min, afterwards a transition to 50% A and 50% B was made in 10 min. This composition was maintained 5 min. Afterwards, the initial conditions were reached again in 5 min. These conditions were maintained 10 min to condition the column for the next analysis. The flow was set to 0.2 mL/min. Separation in normal phase mode is based on polarity, for ceramides this is mainly based on the number and position of OH-groups. In this context, a separation of the different ceramide classes was attempted. However analysis of the ceramide II standard and a mix of

ceramides of class Cer[NS] both indicated that ceramides of the same class elute over a time span of several minutes. Furthermore, analysis of a standard mix containing classes Cer[NS], Cer[NP] and Cer[AS] showed that different classes are not separated enough to enable fractionation of the classes without class overlapping, as is illustrated in figure 2.

Figure 2. Overlapping chromatograms in normal phase mode of A: a 50 µg/mL mix of Cer[NS] (10 µL injection) B: a 10 µg/mL mix of Cer[N(24)S(18)], Cer[N(24)P(18)] and ceramide II (10 µL injection). Peaks for A: NSs = Cer[N(14)S(18)], Cer[N(15)S(18)], Cer[N(16)S(18)], Cer[N(18)S(18)]; Cer[N(20)S(18)], Cer[N(24:0)S(18)] and Cer[N(24:1)S(18)]; peaks for B: NS = Cer[N(24)S(18)], NP = Cer[N(24)P(18)] and ASs = Cer[A(18)S(18)], Cer[A(22:0)S(18)], Cer[A(22:2)S(18)], Cer[A(23:0)S(18)], Cer[A(23:2)S(18)], Cer[A(24:0)S(18)], Cer[A(24:1)S(18)], Cer[A(25:0)S(18)], Cer[A(25:2)S(18)], Cer[A(26:0)S(18)] and Cer[A(26:1)S(18)]. For a detailed analysis of the ceramides, reverse phase mode was preferred since a higher sensitivity is reached when an RPLC coupled to electrospray ionization mass spectrometry (RPLC-ESI-MS) is used. A method based on previous analysis of ceramides in plasma was utilized. A Kinetex C18 column (5 cm L x 2.1 mm I.D.; 2.6 µm dp; Phenomenex) and mobile phases A: water-0.5 M ammonium formate (100:1) and B: methanol-formic acid (100:0.2) were used. A gradient elution was performed at a flow of 0.3 mL/min starting from 20% A and 80% B, which was maintained for 1 min. After this a stepwise change was made to 0% A and 100% B. This composition was kept for 10 min. Subsequently a stepwise transition was made again to the initial conditions and maintained 10 min to condition the column for the next analysis. Results and discussion Variation in chain length of both the fatty acid and sphingoid base part, give rise to the same mass. Moreover, the same masses can also be found in some of the different classes. This makes it necessary in MS analysis to perform tandem mass spectrometry to identify clearly each ceramide. MS/MS analysis in positive ionization mode will reveal the masses of the sphingoid bases. Characteristic fragmentations take place: the fatty acid chain together with 0 to 3 water molecules can be lost. The intensities of these fragmentation ions will differ for each ceramide class. Since fragmentation ions of sphingoid base H and sphingoid base DS with one carbon more, give the same masses; these two can only be distinguished by different intensities of the fragment ions. Another issue differentiating

classes is the possibility that the introduction of a double bound in the fatty acid chain results in the same mass as a ceramide of another class. If the sphingoid bases of these ceramides are different, the ceramide can be identified in positive ionization mode. If the sphingoid base is the same for both ceramides, the identity of the ceramide cannot be verified clearly in positive ionization mode. In this report it is assumed that if unsaturation in a fatty acid chain leads to a conflict of mass, the saturated chain was present. Only negative ionization mode, where the mass of the fatty acid chain can be revealed, could justify this assumption. The extract of the elution step in SPE was first analyzed in NPLC-MS (50 µL) in the scan mode which, compared to RPLC-MS analysis, showed that searching for ceramide masses in the extracted ion chromatograms (XIC), the signal-to-noise ratios as well as the intensity in reverse phase mode were both higher. After the search for ceramide masses in the scan mode in RP, analysis in product ion scan mode was performed. Both were performed in positive ionization mode. In the product ion scan mode the fragment ions of the ions found in the XICs were investigated. Here, mass spectra clearly show how product ions of the sphingoid bases with different chain lengths descend from one precursor ion mass. Due to large data processing, the esterified classes Cer[EOS], Cer[EOP], Cer[EODS] and Cer[EOH] and the less abundant class Cer[AP] were not investigated in this report. A total of 281 ceramides have been identified. A table of the identified ceramides is enclosed as appendix. Although the attempt to fractionate the different ceramide classes in normal phase mode was not successful, an analysis in reverse phase positive ionization tandem quadrupole MS enabled to identify 281 species of ceramides by applying the developed tape stripping technique and SPE procedure as it has been demonstrated that the ceramides can be isolated successfully from cholesteryl esters and triglycerides using this sample preparation. Using the sample preparation developed in this work and a method of identification, developed by Metablys [9], a department of Research Institute for Chromatography, a study on skin ceramides was done in negative electro spray ionization mode in combination with high resolution Q-TOF MS. More than 950 ceramides were unambiguously identified. All 12 classes, shown in figure 1, were found. A plot of the ceramide masses in function of retention time is given in figure 3. The obtained results provide new perspectives for studies of skin cancer, psoriasis, influence of cosmetics (antioxidants) and metabolomic studies.

Figure 3. Plot of all ceramides found in the skin.

References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8.

9.

Elias, P.M., Epidermal Lipids, Barrier Function, and Desquamation. The Journal of investigative dermatology, 1983. 80(6): p. 44-49. Brooks, G. and B. Idson, Skin lipids. International Journal of Cosmetic Science, 1991. 13(2): p. 103-113. Di Nardo, A., et al., Ceramide and cholesterol composition of the skin of patients with atopic dermatitis. Acta Dermato-Venereologica, 1998. 78(1): p. 27-30. Holleran, W.M., Y. Takagi, and Y. Uchida, Epidermal sphingolipids: Metabolism, function, and roles in skin disorders. Febs Letters, 2006. 580(23): p. 5456-5466. Masukawa, Y., et al., Characterization of overall ceramide species in human Stratum corneum. Journal of Lipid Research, 2008. 49(7): p. 1466-1476. Motta, S., et al., Ceramide composition of the psoratic scale. Biochimica Et Biophysica Acta, 1993. 1182(2): p. 147-151. Weerheim, A. and M. Ponec, Determination of stratum corneum lipid profile by tape stripping in combination with high-performance thin-layer chromatography. Archives of Dermatological Research, 2001. 293(4): p. 191-199. Tassopoulos, T.F., Evaluation of topical bioavailibility in human stratum corneum in vivo by tape stripping using a direct spectroscopic method. 2006, University of Basel: Basel. Sandra, K.d.S.P., A.; Vanhoenacker, G.; David, F.; Sandra, P., Comprehensive blood plasma lipidomics by liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2010.

Appendix +

class

# C's

[M+H]

Cer[NS]

34 35 36 38 39 40 41 41

539 553 567 595 609 623 637 637

[N(16)S(18)] [N(18)S(17)] [N(16)S(20)] [N(16)S(22)] [N(19)S(20)] [N(16)S(24)] [N(16)S(25)] [N(21)S(20)]

[N(18)S(18)] [N(18)S(20)] [N(20)S(19)] [N(18)S(22)] [N(17)S(24)] [N(22)S(19)]

[N(20)S(18)] [N(21)S(18)] [N(20)S(20)] [N(18)S(23)] [N(23)S(18)]

[N(22)S(16)] [N(23)S(16)] [N(22)S(18)] [N(19)S(22)] [N(24)S(17)]

42

651

[N(18)S(24)]

[N(20)S(22)]

[N(22)S(20)]

[N(24)S(18)]

43 44 44 45 46 47 47 48 39 40 41 42 43 44 44 45 46 47 48 48 49 36 42 42 42 43 44 44 45 46 47 48 49 50 51 36 37 39 40 40

665 677 679 693 707 721 721 735 627 641 655 669 683 697 697 711 725 739 753 753 767 569 649 651 653 667 677 681 695 709 723 737 751 765 779 583 597 625 639 639

[N(21)S(22)] [N(24:1)S(20)] [N(22)S(22)] [N(23)S(22)] [N(24)S(22)] [N(21)S(26)] [N(26)S(21)] [N(24)S(24)] [N(24)P(16)] [N(22)P(19)] [N(22)P(20)] [N(23)P(20)] [N(24)P(20)] [N(23)P(22)] [N(28)P(17)] [N(24)P(22)] [N(25)P(22)] [N(24)P(24)] [N(24)P(25)] [N(29)P(20)] [N(24)P(26)] [N(25)DS(21)] [N(23:2)DS(19)] [N(23:1)DS(19)] [N(26)DS(16)] [N(24)DS(19)] [N(25:2)DS(19)] [N(25)DS(19)] [N(24)DS(21)] [N(28)DS(18)] [N(28)DS(19)] [N(29)DS(19)] [N(26)DS(23)] [N(29)DS(21)] [N(30)DS(21)] [N(14)H(22)] [N(12)H(25)] [N(18)H(21)] [N(16)H(24)] [N(22)H(18)]

[N(22)S(21)] [N(26:1)S(18)] [N(24)S(20)] [N(24)S(21)] [N(25)S(21)] [N(22)S(25)] [N(27)S(20)] [N(26)S(22)]

[N(23)S(20)]

[N(24)S(19)]

[N(25)S(18)]

[N(26)S(18)] [N(25)S(20)] [N(26)S(20)] [N(23)S(24)] [N(28)S(19)] [N(28)S(20)]

[N(26)S(19)] [N(27)S(19)] [N(24)S(23)] [N(29)S(18)] [N(29)S(19)]

[N(27)S(18)] [N(28)S(18)] [N(25)S(22)]

[N(23)P(18)] [N(24)P(18)] [N(24)P(19)] [N(26)P(18)] [N(24)P(21)]

[N(24)P(17)] [N(25)P(17)] [N(25)P(18)] [N(27)P(17)] [N(25)P(20)]

[N(25)P(16)] [N(26)P(16)] [N(26)P(17)] [N(28)P(16)] [N(26)P(19)]

[N(26)P(20)] [N(26)P(21)] [N(26)P(22)] [N(25)P(24)] [N(30)P(19)] [N(26)P(24)]

[N(28)P(18)] [N(27)P(20)] [N(28)P(20)] [N(26)P(23)] [N(31)P(18)] [N(28)P(22)]

Cer[NP]

Cer[NDS]

Cer[NH]

ceramides

[N(28)P(19)] [N(30)P(18)] [N(27)P(22)]

[N(20)S(21)] [N(25)S(16)]

[N(27)P(18)]

[N(29)P(18)] [N(28)P(21)]

[N(30)P(20)]

[N(27)DS(16)]

[N(32)DS(19)] [N(16)H(20)] [N(16)H(21)] [N(20)H(19)] [N(17)H(23)] [N(23)H(17)]

[N(17)H(19)] [N(18)H(19)] [N(22)H(17)] [N(18)H(22)] [N(24)H(16)]

[N(18)H(18)] [N(20)H(17)] [N(24)H(15)] [N(19)H(21)]

N[(20)H(20)]

class

# C's

[M+H]

Cer[NH]

41 41 42 42 43 44 44 45 46 46 47 34 40 42 43 44 45 45 46 47 48 49 49 50 51 51 52 53 53 39 49 41 42 42 43 43 44 45 47

653 653 667 667 681 695 695 709 723 723 737 555 639 667 681 695 709 709 723 737 751 765 765 779 793 793 807 821 821 641 781 651 665 665 677 679 693 707 735

Cer[AS]

Cer[ADS] Cer[AH]

+

ceramides [N(16)H(25)] [N(26)H(15)] [N(17)H(25)] [N(22)H(20)] [N(18)H(25)] [N(19)H(25)] [N(24)H(20)] [N(20)H(25)] [N(21)H(25)] [N(26)H(20)] [N(22)H(25)] [A(16)S(18)] [A(22)S(18)] [A(24)S(18)] [A(25)S(18)] [A(24)S(20)] [A(23)S(22)] [A(28)S(17)] [A(24)S(22)] [A(24)S(23)] [A(24)S(24)] [A(27)S(22)] [A(32)S(17)] [A(24)S(26)] [A(25)S(26)] [A(32)S(19)] [A(30)S(22)] [A(29)S(24)] [A(34)S(19)] [A(14)H(25)] [A(30)H(19)] [A(21)H(20)] [A(20)H(22)] [A(25)H(17)] [A(23:1)H(20)] [A(23)H(20)] [A(23)H(21)] [A(23)H(22)] [A(25)H(22)]

[N(18)H(23)]

[N(20)H(21)]

[N(22)H(19)]

[N(24)H(17)]

[N(18)H(24)] [N(23)H(19)] [N(20)H(23)] [N(20)H(24)] [N(25)H(19)] [N(22)H(23)] [N(22)H(24)] [N(27)H(19)] [N(24)H(23)] [A(18)S(16)] [A(23)S(17)] [A(26)S(16)] [A(26)S(17)] [A(26)S(18)] [A(24)S(21)] [A(29)S(16)] [A(26)S(20)] [A(25)S(22)] [A(26)S(22)] [A(28)S(21)]

[N(19)H(23)] [N(24)H(18)] [N(22)H(21)] [N(21)H(23)] [N(26)H(18)] [N(24)H(21)] [N(23)H(23)]

[N(20)H(22)] [N(25)H(17)] [N(24)H(19)] [N(22)H(22)] [N(27)H(17)] [N(26)H(19)] [N(24)H(22)]

[N(21)H(21)] [N(26)H(16)] [N(26)H(17)] [N(23)H(21)] [N(28)H(16)] [N(28)H(17)] [N(25)H(21)]

[N(26)H(21)]

[N(28)H(19)]

[A(26)S(24)] [A(27)S(24)] [A(33)S(18)] [A(32)S(20)] [A(30)S(23)] [A(35)S(18)] [A(16)H(23)] [A(31)H(18)] [A(23)H(18)] [A(21)H(21)] [A(25:1)H(18)] [A(25)H(18)] [A(24)H20)] [A(25)H(20)] [A(27)H(20)]

[A(27)S(19)] [A(25)S(20)]

[A(26)S(19)]

[A(27)S(18)]

[A(28)S(18)] [A(26)S(21)] [A(28)S(20)] [A(29)S(20)]

[A(27)S(20)] [A(30)S(18)] [A(30)S(19)]

[A(31)S(18)]

[A(28)S(22)] [A(29)S(22)]

[A(30)S(20)] [A(30)S(21)]

[A(32)S(18)] [A(31)S(20)]

[A(34)S(18)] [A(31)S(22)]

[A(32)S(21)]

[A(33)S(20)]

[A(18)H(21)] [A(32)H(17)]

[A(20)H(19)] [A(33)H(16)]

[A(22)H(20)]

[A(23)H(19)]

[A(24)H(18)]

[A(25)H(19)] [A(27)H(18)] [A(29)H(18)]

[A(26)H(18)]

[A(27)H(17)]

Ontwikkeling van een HPLC-MS methode voor de bepaling van ceramiden in de huid

Recommend Documents