ONTWIKKELING VAN EEN ANALYSEMETHODE VOOR DE BEPALING VAN CORTISOL IN HAAR ALS BIOMERKER VOOR CHRONISCHE STRESS BIJ KINDEREN

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2010-2011

ONTWIKKELING VAN EEN ANALYSEMETHODE VOOR DE BEPALING VAN CORTISOL IN HAAR ALS BIOMERKER VOOR CHRONISCHE STRESS BIJ KINDEREN

Morgane SUYS

Eerste master in de farmaceutische zorg

Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger

Commissarissen Dr. ir. I. Sioen Dr. apr. C. Van Poucke

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Bromatologie Academiejaar 2010-2011

ONTWIKKELING VAN EEN ANALYSEMETHODE VOOR DE BEPALING VAN CORTISOL IN HAAR ALS BIOMERKER VOOR CHRONISCHE STRESS BIJ KINDEREN

Morgane SUYS

Eerste master in de farmaceutische zorg

Promotor Prof. dr. apr. S. De Saeger

Commissarissen Dr. ir. I. Sioen Dr. apr. C. Van Poucke

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

13 mei 2011

Promotor

Auteur

Prof. dr. apr. S. De Saeger

Morgane Suys

Dankwoord Graag zou ik enkele mensen willen bedanken die me gedurende deze 3 maanden hebben bijgestaan. Allereerst Prof. dr. apr. S. De Saeger en Prof. dr. apr. C. Van Peteghem om me de kans te geven in hun laboratorium kennis te maken met wetenschappelijk onderzoek. Barbara Vanaelst, voor de dagelijkse begeleiding en uitleg, de steun, het nalezen en verbeteren van mijn thesis en de vele toffe momenten. Ook een welgemeend woord van dank aan Dr. apr. C. Van Poucke voor het ontwikkelen van de verschillende procedures, de antwoorden op de vele vragen, de interpretatie van de resultaten en het nalezen ervan. Daarnaast wil ik ook Apr. I. Becue bedanken voor de hulp tijdens het uitvoeren van de procedures en het antwoorden op mijn vragen. Ook Johan Aerts wil ik bedanken voor zijn bijdrage bij het ontwikkelen van de verschillende procedures. Verder wil ik nog mijn medestudenten en de andere medewerkers in het labo bedanken die steeds klaar stonden om te helpen. Ten slotte ook nog mijn vrienden en familie voor de steun gedurende de afgelopen 3 maanden.

INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING ..........................................................................................................................1 1.1. CHRONISCHE STRESS BIJ KINDEREN ..............................................................................1 1.2. DE FYSIOLOGISCHE STRESSREACTIE ..............................................................................3 1.2.1. De hypothalame-hypofysaire-bijnier as (HPA-as) .............................................................4

1.3. METEN VAN STRESS .....................................................................................................5 2. OBJECTIEVEN......................................................................................................................9 3. MATERIALEN EN METHODEN ...........................................................................................11 3.1. VRAGENLIJSTEN..........................................................................................................11 3.2. STAALAFNAME EN STAALVOORBEREIDING .................................................................12 3.2.1. Staalafname....................................................................................................................12 3.2.2. Verknippen van de haarstalen ........................................................................................13

3.3. CORTISOL ANALYSE IN HAARSTALEN ..........................................................................14 3.3.1. Reagentia........................................................................................................................14 3.3.2. Toestellen en hulpmiddelen ...........................................................................................14 3.3.3. Bereide oplossingen........................................................................................................15 3.3.4. Standaardoplossingen ....................................................................................................16 3.3.4.1. Cortisol-D4 100 ng/mL ..............................................................................................16 3.3.4.3. Cortisol 1 µg/mL .......................................................................................................17 3.3.4.4. Cortisol 0,1 µg/mL ....................................................................................................17 3.3.5. Gebruikte technieken .....................................................................................................17 3.3.5.1. Solid-phase extraction (SPE)......................................................................................17 3.3.5.2. Ultra performance liquid chromatography (UPLC)- tandem massaspectrometrie (MS/MS)................................................................................................................................19 3.3.6. LC-MS/MS condities........................................................................................................24

3.4. METHODEONTWIKKELING ..........................................................................................25 3.4.1. Testen van de ball mill ....................................................................................................25 3.4.2. Extractie en clean-up experimenten ...............................................................................26 3.4.2.1. Set-up 1 ....................................................................................................................28 3.4.2.2. Set-up 2 ....................................................................................................................30 3.4.2.3. Set-up 3 ....................................................................................................................31 3.4.2.4. Set-up 4 ....................................................................................................................32 3.8.2.5. Set-up 5 ....................................................................................................................33 3.8.2.6. Set-up 6 ....................................................................................................................34

3.4.2.7. Set-up 7 ....................................................................................................................34

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ..............................................................................................36 4.1. METHODEONTWIKKELING ..........................................................................................36 4.1.1. Testen van de ball mill ....................................................................................................36 4.1.2. Resultaten Set-up 1 ........................................................................................................36 4.1.3. Resultaten Set-up 2 ........................................................................................................38 4.1.4. Resultaten Set-up 3 ........................................................................................................40 4.1.5. Resultaten Set-up 4 ........................................................................................................41 4.1.6. Resultaten Set-up 5 ........................................................................................................44 4.1.7. Resultaten Set-up 6 ........................................................................................................45 4.1.7. Resultaten set-up 7 .........................................................................................................48

5. CONCLUSIE .......................................................................................................................49 6. LITERATUURLIJST .............................................................................................................51 7. BIJLAGEN ..........................................................................................................................56

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ACTH: Adrenocorticotropine hormoon C: Cortisol C-D4: Cortisol-D4 CID: Collision induced dissociation CLES: Coddington Life Events Scale CRH: Corticotropine releasing hormoon EC: Ethisch comité ESI: Electrospray ionisatie G: relatieve centrifugekracht HPA-as: Hypothalamus-pituitary-adrenal axis ( hypothalame-hypofysaire-bijnier as) HPLC: High Performance liquid Chromatography (hoge performantie vloeistofchromatografie) IS: Interne standaard LOD: Limit of detection MeOH: Methanol MS/MS: Tandem massaspectrometrie m/z: Massa/lading Q: Quadrupool Rf: Radiofrequentie RP: Reversed phase (omgekeerde fase) SPE: Solid phase extraction (vaste fase extractie) SRM: Selected reaction monitoring TCEP: Tris(2-carboxyethyl)phosphine UPLC: Ultra performance liquid chromatography (ultra performantie vloeistof chromatografie)

1. INLEIDING 1.1. CHRONISCHE STRESS BIJ KINDEREN Stress maakt deel uit van het dagelijkse leven van kinderen. Stress kan gedefinieerd worden als zijnde bepaalde veranderingen in de omgeving die een invloed hebben op de fysische en psychologische toestand van een individu (Grant et al., 2003) en kan van oorsprong chemisch, fysisch, biologisch, psychologisch of sociaal zijn. Deze laatste twee vormen worden samen omschreven als psychosociale stress (Faraday, 2006). Kinderen zijn voortdurend in interactie met hun omgeving waardoor ze blootgesteld kunnen worden aan verschillende stressvolle gebeurtenissen op hetzelfde moment (Skybo & Buck, 2007). Niet alle stressvolle gebeurtenissen zijn echter negatief. Sommige kunnen aanzien worden als positief (zoals bijvoorbeeld een goede persoonlijke prestatie) en een voordelig effect hebben op het leven en het zelfbeeld van kinderen (Ryan-Wenger et al., 2005). Schoolgaande kinderen kunnen zowel acute als chronische psychosociale stress ondervinden. Acute psychosociale stress is vaak gecorreleerd aan situaties die elke dag kunnen voorkomen zoals: familiale relaties, veranderingen in het dagelijkse leven en schoolactiviteiten (Attar et al., 1994; Romano, 1997; Taxis et al., 2004). Ondervragingen of toetsen op school worden door kinderen gezien als één van de dingen die hen het vaakst stress bezorgen, gevolgd door huiswerk en het behalen van slechte punten (Ryan-Wenger et al., 2005). Psychosociale stressoren of stressvolle gebeurtenissen met een aanhoudend of langdurig karakter kunnen aanleiding geven tot chronische stress. Aanhoudend geweld of conflicten, het verlies van een ouder, een scheiding en armoede zijn voorbeelden van psychosociale stressoren die kunnen leiden tot chronische stress (Skybo & Buck, 2007). Kinderen

die

opgroeien in minder gunstige

socio-economische

omstandigheden

ondervinden vaker negatieve gebeurtenissen zoals geweld en leven vaker in onstabiele omstandigheden, wat ervoor zorgt dat ze meer stress kunnen ondervinden (Lupien et al., 2001). Bovendien is de afgelopen 30 jaar het aantal en de aard van stressfactoren gewijzigd onder invloed van politieke en sociale veranderingen in onze samenleving (tabel 1.1). Zo ondervinden ouders een bepaalde druk om hun kinderen zoveel mogelijk kansen te geven, wat er echter voor kan zorgen dat kinderen steeds meer stress ervaren. Ze worden nu 1

overstelpt met naschoolse activiteiten, huiswerk, sportactiviteiten en multimedia waardoor ze vinden dat er geen tijd meer overblijft om te spelen (Ryan-Wenger et al., 2005). Dit alles leidt ertoe dat kinderen meer psychosociale stress kunnen ondervinden. Tabel 1.1: Voorbeelden van psychosociale stressoren over de afgelopen 30 jaar (Ryan-Wenger et al., 2005).

1970's •Bezorgd zijn om een familielid •Niet genoeg tijd doorbrengen met de ouders •Ouders die kwaad zijn •Ouders die reeds gescheiden zijn of aan het scheiden zijn •Ruzie tussen familieleden •Grote familieaangelegenheden •Een familielid missen •Problemen met stiefouder of nieuwe vriend(in) ouder •Arm zijn •Verhuizen •De dood van een geliefde •In de problemen geraken op school •Naar school gaan •Slechte punten •Zich uitgesloten voelen •Een vriend verliezen •Iets genants doen voor iedereen •Zich niet goed voelen of ziek zijn •Nachtmerries •Uiterlijk

1980's

1990's

•Thuis in de problemen geraken •Leerkrachten en directie •Laat huiswerk moeten maken •Vrienden dwingen me om iets te doen •Niet goed genoeg zijn in sport •Te laat komen •Ouders of volwassenen zetten me onder druk •Huisdier dat ziek, stervende of dood is

•Broer of zus pest me •Toetsen •Eenzaam zijn •Uitgelachen worden •Bezorgd zijn om vrienden •Gevaarlijke dieren of insecten •Gewond geraken in een ongeval •Vechten met vrienden •Gepest worden •Geweld op school of in de buurt •Vreemdelingen •Oorlog of terrorisme •Rampen zoals overstromingen en brand •Aan de dood denken •Gekwetst of aangeraakt worden door volwassenen op een manier die je niet graag hebt

2000's •Huiswerk: algemeen •Teveel huiswerk •Van iemand houden, of Problemen met vriendje of vriendinnetje •Sport en computerspelletjes •Teveel dingen te doen

Wanneer kinderen op jonge leeftijd gedurende een lange periode blootgesteld worden aan stress kan dit schadelijke gevolgen hebben voor hun verdere ontwikkeling (Tennes & Kreye, 1985). Naast deze effecten op lange termijn, wordt ook op het moment dat de kinderen stress ondervinden hun gezondheid op diverse vlakken beïnvloed (Knight et al., 1979; Gunnar et al.,1989, 1992). Zo kunnen gestresseerde kinderen moeilijker hun aandacht behouden bij bepaalde zaken, zoals het invullen van een toets. Bij sommige kinderen kan stress ook leiden tot fysische symptomen zoals hoofdpijn of maagpijn alsook tot gedrags- of emotionele stoornissen waarvan vaak gerapporteerde symptomen zijn: zich boos of 2

verdrietig voelen, ongerust, bang of zenuwachtig zijn. Niet alle stress symptomen zijn echter direct waarneembaar. Er zijn kinderen die stress ervaren zonder symptomen te uiten omwille van het feit dat elk kind op een andere manier met stress omgaat (Skybo and Buck, 2007). De manier waarop kinderen omgaan met stress hangt af van hun leeftijd, hun karakter en hun sociale vaardigheden (Lazarus, 1999). Ze gebruiken zowel cognitieve, fysische als emotionele strategieën om hun stress te verminderen. Zichzelf moed inspreken, alleen zijn en erover nadenken zijn de meest gebruikte cognitieve manieren (Romano, 1997; Taxis et al., 2004). Fysische en emotionele strategieën zijn vooral zich verontschuldigen, ontspannen, tekenen, eten en televisie kijken (Sharrer & Ryan-Wenger, 1995; Romano, 1997; Taxis et al., 2004). 1.2. DE FYSIOLOGISCHE STRESSREACTIE Het menselijk lichaam reageert op stress door activatie van een aantal centrale en perifere adaptieve responsen die tot neuro-endocriene, cardiovasculaire en immunologische veranderingen leiden. De stress respons wordt geregeld door het stress systeem dat zich zowel in het centraal zenuwstelsel als in de periferie bevindt. De centrale componenten bevinden zich in de hypothalamus en de hersenstam, de perifere componenten zijn de hypothalame-hypofysaire-bijnier as (HPA as), het efferente sympathisch zenuwstelsel alsook het perifeer zenuwstelsel (Charmandari et al., 2005). Op neuro-endocrien vlak worden in stresssituaties catecholamines en cortisol vrijgesteld. Cortisol is het vaakst bestudeerde stresshormoon in het kader van chronisch stress onderzoek (figuur 1.1).

Figuur 1.1: structuur van cortisol (http://biochem.siuc.edu/web_lessons/bmb_lip.htm) 3

Cortisol heeft echter ook nog een aantal andere functies. Het speelt een sleutelrol in het centraal zenuwstelsel, waar het een invloed heeft op het geheugen, de emoties en het leerproces, cortisol is ook belangrijk voor het immuunsysteem om de duur van een inflammatoire respons te regelen en speelt ook een rol in het metabool systeem waar het de glucoseopslag en het glucoseverbruik regelt (Miller et al., 2007). 1.2.1. De hypothalame-hypofysaire-bijnier as (HPA-as) De HPA-as is het belangrijkste fysiologische stress respons systeem in ons lichaam en speelt een belangrijke rol in de regeling van de glucocorticoïdvrijstelling. De secretie van glucocorticoïden wordt gecontroleerd door de vrijstelling van het adrenocorticotropine hormoon (ACTH) uit de hypofyse. De secretie van ACTH is op zijn beurt afhankelijk van de vrijstelling van het corticotropine releasing hormoon (CRH) uit de hypothalamus. ACTH werkt voornamelijk in op de bijnieren en regelt daar dus de vrijstelling van aldosteron, de androgenen en de glucocorticoïden, waarvan cortisol het belangrijkste is (Charmandari et al., 2005).

Figuur 1.2: anatomie van de bijnieren (http:/www.empowher.com/condition/addisons-disease/definition) De bijnieren liggen bovenop de nieren en zijn het meest doorbloede orgaan van het lichaam, met als functie het organisme beschermen tegen acute en chronische stress (figuur 1.2). De buitenste zone wordt de cortex genoemd en bestaat uit de zona glomerulosa, de zona fasciculata en de zona reticularis. Ter hoogte van de cortex worden de steroïden vrijgesteld. Deze ontstaan uit cholesterol, dat wordt gevormd uit AcetylCoA in de mitochondrieën van de bijnierschors of wordt opgenomen uit het bloed via plasmamembraan receptoren. Ter hoogte van de medulla, de binnenste zone van de bijnieren, worden de catecholamines, adrenaline en noradrenaline, vrijgesteld. In gevallen 4

van acute stress mobiliseren de catecholamines glucose en vetzuren voor energiegebruik en bereiden ze het hart, de longen en de spieren voor op actie. Bij chronische stress spelen de glucocorticoïden, als finale effectors van de HPA-as, een belangrijke rol bij de terminatie van de stress respons en beschermen hierdoor het lichaam tegen een overreactie van de stress respons (Kaplan, 1996). Wanneer de HPA-as onder normale omstandigheden functioneert, volgen de cortisol levels een circadiaans ritme met een verhoogde cortisol level in de ochtend en een verlaagde vrijstelling gedurende de rest van de dag. Onder invloed van stress echter zullen de cortisol levels zeer snel stijgen wat leidt tot activatie van katabole processen nodig voor de vrijstelling van energie en stimulatie van de gluconeogenese (Lupien et al., 2001).

Figuur 1.3: negatief feedback mechanisme van cortisol op HPA-as (http://www.atforum.com/SiteRoot/pages/current_pastissues/summer2000.shtmL) Verschillende feedback mechanismen zijn verantwoordelijk voor de regeling van de cortisol vrijstelling. Zoals geïllustreerd in figuur 1.3 kan cortisol de ACTH secretie en de CRH secretie inhiberen door direct in te werken op de hypofyse en de hypothalamus (Tsigos & Chrousos, 2002; Miller et al., 2007). Dit negatief feedback mechanisme zorgt ervoor dat de cortisol plasma levels op alle momenten constant blijven en is daardoor ook van belang bij de terminatie van de stress respons (Lupien et al., 2001). 1.3. METEN VAN STRESS Stress maakt deel uit van het dagelijkse leven van kinderen. Om de invloed van stress op verschillende gezondheidsparameters, zowel op korte als op lange termijn, te kennen is het dus belangrijk om dit op een accurate manier te kunnen meten. Stress kan gemeten worden op twee verschillende manieren: 1) “subjectieve” stressbevraging aan de hand van 5

vragenlijsten of interviews, dewelke het voorkomen van stressvolle gebeurtenissen of stressoren bevragen of 2) een meer “objectieve” analyse van stress biomerkers om de biologische stress respons als antwoord op stressoren te meten. Vragenlijsten kunnen door de kinderen zelf ingevuld worden of door de ouders. Bovendien kunnen de vragen in interviewvorm door de onderzoeker worden afgenomen wanneer de kinderen nog niet goed kunnen lezen. Aan de hand van de vragenlijsten kunnen een aantal specifieke stressvolle gebeurtenissen geanalyseerd worden. Het totaal aantal stressvolle gebeurtenissen dat het kind heeft meegemaakt kan opgeteld worden of er kan een stress-score berekend worden (Blount et al.,2008). Vragenlijsten hebben echter wel een aantal nadelen en zijn vooral bij kinderen niet altijd even betrouwbaar: ze zijn eerder subjectief, het is praktisch onmogelijk om alle stressvolle gebeurtenissen in een vragenlijst op te nemen, er kan niet altijd een onderscheid gemaakt worden tussen chronische en acute stress en ze zijn gevoelig voor recall-bias. Vooral bij kinderen is dit het geval aangezien hun geheugen nog niet volledig ontwikkeld is zodat ofwel teveel ofwel te weinig gebeurtenissen gerapporteerd worden (Eisen & Goodman, 1998; Salmon, 2001). Het is ook zo dat afhankelijk van de gedefinieerde tijdsperiode er bij vragenlijsten slechts gevraagd wordt naar gebeurtenissen van enkele maanden tot maximum een jaar geleden. Daardoor krijg je enkel informatie over een beperkte periode terwijl mensen ook op langere termijn gevolgen kunnen ondervinden van zaken die langer dan een jaar geleden gebeurd zijn (Turner et al., 1997). Omwille van bovenstaande moeilijkheden met vragenlijsten, wordt stress ook vaak op een meer objectieve manier bepaald aan de hand van biomerkers, vaak cortisol. Hierbij dient echter opgemerkt te worden dat de focus van de vragenlijsten enerzijds en cortisol anderzijds wel sterk verschillend is: vragenlijsten bevragen stressoren, terwijl cortisol (als stress hormoon) juist de biologische respons veroorzaakt door stressoren, representeert. Gezien deze verschillende focus is het interessant beide methodes toe te passen bij stressmetingen om zo een meer compleet zicht op de stressbeleving te hebben. Cortisol kan bepaald worden in bloed, urine, speeksel en haar. Detectie van cortisol in bloed in het kader van psychosociaal stress onderzoek wordt niet vaak uitgevoerd aangezien bloedafname invasief is en voor sommige mensen stresserend kan zijn waardoor 6

dit kan leiden tot verhoogde cortisol plasmalevels. Voor de bepaling van cortisol in urine, speeksel en bloed zijn meerdere staalafnames per dag nodig aangezien de cortisol vrijstelling een circadiaans ritme volgt (Sauvé et al., 2007). Daarom is het nodig dat speeksel en bloedstalen op specifieke tijdstippen van de dag worden genomen en dat urine optimaliter gedurende 24 uur verzameld wordt. Dit geeft echter nog altijd maar informatie over de cortisol levels van één dag. De cortisol concentratie kan ook door verschillende factoren beïnvloed worden zoals: eten, roken, geslacht, leeftijd,… (Hanrahan et al., 2006). Recent werd aangetoond dat chronische stress bij volwassenen kan leiden tot verhoogde cortisol concentraties in mensenhaar (Kirschbaum et al., 2009, Gow et al., 2010). Aangezien haar ongeveer 1 cm per maand groeit (Wenning, 1999) zegt een haarstaal van bijvoorbeeld 2 cm iets over de gemiddelde cortisol concentratie van de afgelopen 2 maanden. Daarom is cortisol in haar een betere biomerker voor chronische stress dan de ‘acute’ metingen in bloed, speeksel en urine (Sauvé et al., 2007). De voordelen van het afnemen van haarstalen zijn dat slechts 1 staal moet worden afgenomen, het niet-invasief of stresserend is, dit thuis kan gebeuren op elk tijdstip van de dag en dat haar kan bewaard worden bij kamertemperatuur zonder te ontbinden. Het nadeel is echter dat het haar lang genoeg moet zijn op de plaats waar men het gaat afknippen, namelijk de vertex posterior, dit is de plaats op het hoofd waar de cortisol concentraties het minst variëren (figuur 1.4) (Sauvé et al., 2007).

Figuur 1.4: Vertex posterior (Instruction for hair sampling, Technische Universität Dresden,faculty of Science, Department of Psychology, Chair of Biopsychology) Anderzijds is de maximale lengte van een haarstaal waarin cortisol kan bepaald worden beperkt tot 6 cm (van op de hoofdhuid gemeten) omdat de concentratie cortisol in meer distale fragmenten reeds gedaald kan zijn door wash-out effecten (Kirschbaum et al., 2006). De dagelijkse variaties in cortisolconcentraties kunnen echter niet gemeten worden in 7

haar. Ondanks het gemak van staalafname en staalbewaring werd haar-cortisol tot vandaag nog niet toegepast als biologische merker voor psychosociale stress bij kinderen. Dit onderzoek probeert deze wetenschappelijke leemte in te vullen. Het onderzoek wordt uitgevoerd in het kader van de ‘IDEFICS’ studie. ‘IDEFICS’ staat voor ‘Identification and prevention of Dietary- and lifestyle-induced health EFfects In Children and infantS’ (http://www.idefics.eu). Dit is een Europees project dat loopt in 8 landen, waaronder België, waarin de gezondheidseffecten van de verandering in voeding, levensstijl en sociale omgeving bij kinderen worden onderzocht in controle- en interventiegroepen. De effecten van voeding, levensstijl en psychosociale factoren worden geïdentificeerd om te kijken of er een causaal verband met overgewicht, het metabool syndroom en obesitas bestaat. Aan de hand van die resultaten zullen dan specifieke richtlijnen in verband met voeding en levensstijl opgesteld worden om de prevalentie van voedings- en levensstijl gerelateerde ziektes bij kinderen in Europa te verminderen (Ahrens et al., 2006). De proefpersonen in dit onderzoek, meisjes tussen 6 en 10 jaar (1ste tot en met 4de leerjaar) maken deel uit van de Belgische controle cohorte van het IDEFICS project (stad Aalter). Bij deze kinderen worden stressvolle gebeurtenissen gemeten met de Coddington Life Events Scales (CLES) en de daarbij horende neuro-endocriene respons, namelijk de vrijstelling van cortisol in haar, zal bepaald worden met behulp van vloeistofchromatografietandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) (Ethische Commissie (EC) bijlage 1). Beide technieken worden meer in detail besproken in hoofdstuk 3 ‘Materialen en methoden’. In dit verband dient opgemerkt dat in de meerderheid van haarcortisol-studies enzyme-linkedimmunosorbent-assay (ELISA) als techniek wordt gebruikt. In dit onderzoek opteren we voor het ontwikkelen van een LC-MS/MS methode gezien dit een veel specifiekere en nauwkeurigere methode is.

8

2. OBJECTIEVEN Uit een onderzoek in Mexico City is gebleken dat reeds 68 % van de 12-17 jarigen bepaalde negatieve ervaringen tijdens hun kinderjaren hebben ondervonden (zoals bijvoorbeeld het verlies van een ouder, financiële problemen,…) die kunnen leiden tot chronische stress (Benjet et al., 2009). Het is dus zo dat elk kind, onafhankelijk van zijn individuele levensomstandigheden, soms stress kan ondervinden. Stress kan de oorzaak zijn van fysische klachten zoals bijvoorbeeld hoofdpijn en maagpijn maar kan ook leiden tot psychologische problemen zoals slapeloosheid, zich depressief voelen, geïrriteerd zijn,... (Brobeck et al., 2006). Het menselijk lichaam reageert op stress door activatie van een fysiologisch stress respons systeem, waarin de HPA-as een sleutelrol speelt (Miller et al., 2007). Om de biologische stress respons te meten kan gebruik gemaakt worden van de biomerker cortisol. Zowel bij kinderen als bij volwassenen werd cortisol in het kader van stress onderzoek reeds bepaald in bloed, urine en speeksel. Bij volwassenen werd ook al aangetoond dat cortisol in haar een goede biomerker is voor stress, onderzoek naar cortisol in haar bij kinderen ontbreekt echter. De hoofddoelstelling van dit onderzoek is nagaan of cortisol in haar een goede biomerker is voor chronische psychosociale stress bij kinderen, meer bepaald bij meisjes tussen 6 en 10 jaar. In deze studie wordt enkel het haar van meisjes gebruikt omdat de lengte van het haarstaal 6 cm moet zijn om gegevens over het afgelopen half jaar te kunnen onderzoeken. Als eerste objectief van dit onderzoek is er de methodeontwikkeling voor de bepaling van cortisol in hoofdhaar van kinderen met behulp van LC-MS/MS. Hiervoor baseren we ons op verschillende reeds bestaande methodes uit de literatuur (Cirimele et al., 1999; Raul et al., 2004; Becue et al., 2011). Voor de bepaling van cortisol in haar wordt niet vaak gewerkt met LC-MS/MS (eerder met immunoassays) aangezien dit een eerder arbeidsintensieve en dure maar toch zeer specifieke en gevoelige methode is. Voor onze analyse opteren we voor het gebruik van ultra performantie vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (UPLC/MS-MS) om zo accuraat mogelijk lage fysiologische concentraties te kunnen meten, temeer ook omdat onduidelijk is in welke range de waarden bij kinderen zullen liggen. UPLC 9

is in vergelijking met hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) veel sneller, geeft een hogere resolutie en er moet minder solvent gebruikt worden, wat beter is voor het milieu en de kostprijs verlaagt. De hoeveelheid cortisol zal gekwantificeerd worden via tandem massaspectrometrie. De tweede doelstelling is de geanalyseerde hoeveelheid cortisol vergelijken met de stress-score van de CLES vragenlijst. De stress-score is een subjectieve parameter voor stress en kan bepaald worden aan de hand van verschillende vragenlijsten die door de kinderen worden ingevuld. Aangezien haar-cortisol een idee geeft over de blootstelling aan stress van de afgelopen maanden, is de hypothese dat deze waarden goed zouden correleren met zelfgerapporteerde stress door kinderen ofwel de stress-score. Dit zou het belang van haarcortisol als stressbiomerker versterken.

10

3. MATERIALEN EN METHODEN. 3.1. VRAGENLIJSTEN Aan de hand van CLES vragenlijsten wordt nagegaan met welke stressvolle gebeurtenissen kinderen het afgelopen jaar werden geconfronteerd, alsook hoe vaak dit gebeurde en hoe lang dit ongeveer geleden is (Coddington, 1972; Athanasou, 2001). Er zijn drie soorten CLES vragenlijsten: CLES-P (Preschool) voor kinderen jonger dan 5 jaar, CLEC-C (Child) voor kinderen tussen 6 en 11 jaar en CLES-A (Adolescent) voor kinderen van 12 tot 19 jaar. Afhankelijk van de soort vragenlijst die wordt gebruikt, verschilt het aantal en type van vragen. In dit onderzoek gebruiken we de CLES-C vragenlijst die bevraagt naar het voorkomen van 36 potentiële stressvolle gebeurtenissen in het leven van kinderen. De CLES vragenlijsten proberen de nadruk zoveel mogelijk op de objectieve stress belevenis te leggen. De bedoeling van deze vragenlijsten is om kinderen die een bepaald risico lopen op gezondheidsproblemen door de stress die ze ervaren, te gaan identificeren (Blount et al., 2008). De vragenlijst wordt afgenomen via interview van de kinderen. Hierbij wordt elke vraag voorgelezen. Wanneer een bepaalde gebeurtenis zich heeft voorgedaan wordt telkens aangeduid in welke periode in het verleden dit was: 0-3 maanden, 3-6 maanden, 6-9 maanden of 9-12 maanden geleden. Indien de gebeurtenis zich heeft voorgedaan in de afgelopen 3 maanden wordt hieraan een hogere score toegekend dan aan gebeurtenissen van langer geleden. Voor ons onderzoek zullen in eerste instantie enkel de gebeurtenissen van de afgelopen 6 maanden (0-3 en 3-6 maanden geleden) in rekening gebracht worden aangezien we de hoeveelheid cortisol bepalen in een stukje haar van 6 cm dat representatief is voor ongeveer 6 maanden in het verleden. Bovenop de CLES vragenlijsten worden in dit onderzoek nog aanvullende vragen gesteld om te weten wat kinderen precies doen wanneer ze zich niet goed voelen, ruzie hebben,… (bijvoorbeeld: snoepen, op je kamer blijven). De vragenlijsten die daarvoor gebruikt worden zijn de coping vragenlijsten, ontwikkeld voor de CASE-studie, Child & Adolescent Self-harm in Europe (Portzky et al., 2008). Verder wordt er ook aan de hand van emotievragenlijsten gevraagd hoe de kinderen zich de laatste tijd gevoeld hebben. Voor elke van de 4 basisemoties, namelijk: blij, boos, verdrietig en bang, moeten de kinderen zich een 11

score van 0 (nee) tot 10 (ja) geven. Deze laatste 2 vragenlijsten worden ook via interview afgenomen. De vragenlijsten zijn terug te vinden in bijlage 2 en 3 en zullen verder gebruikt worden als merker voor het voorkomen van stressvolle gebeurtenissen in het leven van de kinderen en gecorreleerd worden aan de cortisolconcentraties in het haar van deze kinderen, dewelke dienen als biologische merker van stress. In de volgende sectie worden alle materialen en methoden beschreven die nodig zijn voor de analyse van haar-cortisol in het laboratorium. 3.2. STAALAFNAME EN STAALVOORBEREIDING 3.2.1. Staalafname Haarstalen worden, na goedkeuring van de ouders, uitsluitend afgenomen bij meisjes (6 tot 10 jaar) deelnemend aan de IDEFICS studie omdat de haarlengte van jongens vaak ontoereikend is om een staal met een lengte van 6 cm te kunnen bekomen. Deze homogene steekproef zal echter veralgemening naar andere geslachten en leeftijdsgroepen niet toelaten. Voor de methodeontwikkeling van dit project worden bovendien ook een tiental haarstalen afgenomen van wel en niet gestresseerde volwassenen (EC bijlage 4). Zowel voor kinderen als voor volwassenen gebeurt de staalafname en -bewaring op dezelfde manier. Het haar wordt afgeknipt ter hoogte van de vertex posterior, een regio achteraan het hoofd waar de cortisol concentratie het minste variatie vertoont (Sauvé et al., 2007). We nemen een haarlok met een maximale diameter van een potlood met als doel 500 mg haar te bekomen. De praktijk leerde echter dat deze hoeveelheid staal niet altijd haalbaar is. De methode wordt dan ook ontwikkeld voor 100 of 200 mg haar afhankelijk van de set-up (zie 3.7). Achtereenvolgens worden volgende stappen voor staalafname ondernomen: ter hoogte van de oorlijn wordt het haar omhoog gespeld zodat de nodige hoeveelheid haar kan gesampled worden ter hoogte van de vertex posterior. Met een touwtje wordt de haarlok aan de haarwortel bijeen geknoopt. Deze wordt dan zo dicht mogelijk bij de schedel afgeknipt en tussen papier geklemd. Het staal wordt in een plastic zakje, voorzien van een identificatienummer in het donker bewaard in de koelkast om 12

temperatuurschommelingen te voorkomen. De verschillende stappen worden weergegeven in figuur 3.1.

A

B

C

D

Figuur 3.1.: A. materiaal nodig voor staalafname, B. merken van haardeel dichtst bij haarwortel met touwtje ter hoogte van de vertex posterior, C. klemmen van haarlok tussen papier, D. bewaren van haarstaal in plastiek zak en noteren van identificatienummer . 3.2.2. Verknippen van de haarstalen Aangezien voor dit project nog een geschikte methode moet ontwikkeld worden, is het aangewezen met proefstalen te werken alvorens de haarstalen van de kinderen te gebruiken. Deze proefstalen zijn ofwel afkomstig van afgeschoren varkenshaar, ofwel van een pool van kappershaar (identiteit en regio van haarafname van haarstalen onbekend), ofwel zijn het haarstalen afkomstig van de vertex posterior van al dan niet gestresseerde volwassenen (zoals in ‘3.2.1.’ toegelicht). Bij alle experimenten die verder zullen worden besproken, worden de stalen ongeveer op dezelfde manier behandeld. Afhankelijk van de set-up zijn er kleine verschillen. 13

Het mensenhaar verkregen uit een kapperszaak wordt in een grote maatbeker in kleine stukjes geknipt tot een homogeen mengsel, daarvan wordt dan de gewenste hoeveelheid met een pincet overgebracht in gosselinbuizen. Indien varkenshaar wordt gebruikt, wordt dit direct in gosselinbuizen afgewogen en pas geknipt vlak voor het in de ball mill gaat. Het verknippen van varkenshaar gebeurt op een glazen petrischaaltje. Wanneer we effectief werken met de stalen van de kinderen of de volwassenen afgenomen ter hoogte van de vertex posterior wordt de eerste 6 cm afgeknipt, dit stuk wordt dan in een maatbeker in kleine stukjes geknipt en dan wordt de gewenste hoeveelheid met een pincet overgebracht in gosselinbuizen. 3.3. CORTISOL ANALYSE IN HAARSTALEN 3.3.1. Reagentia Isopropanol en mierenzuur werden aangekocht bij Fluka (Buchs, Zwitserland), methyleenchloride, hexaan, aceton en ethylacetaat bij Acros organics (Geel, België), kaliumwaterstoffosfaat,

natriumhydroxide,

watervrij

natriumacetaat,

azijnzuur

en

natriumcarbonaat bij Merck (Darmstadt, Duitsland) en natriummonowaterstoffosfaat bij Vel (Leuven, België). Het gebruikte water (milli-Q water) werd gedeïoniseerd en extra gezuiverd door een Millipore toestel (Brussel, België). Tris(2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP) en ammoniumformaat werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (St-Louis, USA), methanol en acetonitrile bij VWR International (Leuven, België), uitgezonderd de acetonitrile voor de bereiding van de mobiele fase, deze werd aangekocht bij Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Voor de standaardoplossingen werd hydrocortisone (C21H30O5, 1g, Sigma H 4001) bij Sigma-aldrich (St-Louis, USA) en cortisol-9,11,12,12-d4 (Cortisol-D4, 5mg, CDN isotopes D-5280) bij J.H. Ritmeester B.V. (Nieuwegein, Nederland) aangekocht. 3.3.2. Toestellen en hulpmiddelen De stalen worden afgewogen op een analytische balans van Sartorius (Goettingen, Duitsland) en bewaard in gosselinbuizen van Novolab (Geraardsbergen, België). Voor de methodeontwikkeling worden een ball mill (Retsch, Haan, Duitsland), een pH-meter van Schott ( Hofheim, Duitsland), een droogstoof van Memmert, ( Schwabach, Duitsland), een vortex van de firma Vel ( Leuven, België), een overhead shaker van de firma Agitelec ( Parijs, 14

Frankrijk), een schud incubator (Heidolph, Schwabach, Duitsland) en een ultrasoon bad (Branson Danbury, CT, USA) gebruikt. Voor de verdere verwerking van de stalen zijn een centrifuge van Sigma-Aldrich ( Bornem, België), C18-kolommen (Grace PureTM, 500mg/6mL, Deerfield, UK) en centrifugal filter units met poriegrootte 0,22 µm (Millipore corporation, Billerica, MA) nodig. De analyse van cortisol in haar gebeurt op een Acquity UPLC van Waters (Milford, USA) die wordt gekoppeld aan een Quattro Premier XE massaspectrometer ook van Waters (Milford, USA). De kolom die gebruikt wordt is een Acquity BEH (Bridget Ethane Hybrid) C18kolom met een pakking met deeltjesgrootte 1,7µm (2,1 x 100 mm) van Waters (Milford, USA). Het verwerken van de resultaten gebeurt met Masslynx software van Waters (Milford, USA). 3.3.3. Bereide oplossingen De Soerensenbuffer wordt vooraf bereid door 12,8 mL KH2PO4 (9,07g/L) te vermengen met 87,2 mL Na2HPO4 (11,87 g/L). We brengen de pH op 7,6 door toevoeging van enkele druppels van een pH 3 buffer, die wordt gemaakt door 2mM ammoniumformaat (NH4 COOH) oplossing naar pH 3 te brengen met behulp van enkele druppels mierenzuur (HCOOH). Zowel bij de Soerensenbuffer als bij de pH 3 buffer wordt de pH gecontroleerd met een pH-meter. Een oplossing van 25 mM TCEP (286,65 g/mol) moet vooraf bereid worden. Om 50 mL van deze oplossing te maken, wegen we 358, 31 mg TCEP af en lossen dit op in 50 mL milli-Q water. Een 20/80 v/v aceton/water oplossing wordt bereid door 20 mL aceton in een schott duran fles te brengen en te vermengen met 80 mL water. Een 90/10 v/v water/MeOH oplossing wordt bereid door 90 mL milli-Q water te vermengen met 10 mL MeOH in een schott duran fles. Een 80/20 v/v water/MeOH oplossing wordt bereid door 80 mL milli-Q water en 20 mL MeOH in een Schott duranfles te brengen en goed te schudden.

15

H2O/MeOH (50/50 v/v) wordt gemaakt door 50 mL milli-Q water en 50 mL MeOH in een duranfles te brengen en nadien goed te schudden. Om een 10% (g/v) natriumcarbonaatoplossing te maken wordt 100 g natriumcarbonaat afgewogen en opgelost in 1 liter milli-Q water in een schott duran fles. Een natriumacetaatbuffer met een pH van 4,8 wordt bereid door 41 g natriumacetaat af te wegen en op te lossen in 2 liter milli-Q water in een schott duran fles. De pH wordt op 4,8 gebracht met enkele druppels azijnzuur en wordt gecontroleerd met een pH-meter. We maken 300 mL van mobiele fase A, hiervoor is 300 mL water nodig en 0,3 mL mierenzuur, en 300 mL van mobiele fase B waarvoor we 300 mL acetonitrile en 0,3 mL mierenzuur nodig hebben. Beide mobiele fasen worden gefiltreerd (Millipore, Nylon Membrane, 0,20 µm) onder vacuüm alvorens ze in de schott duran flessen worden gebracht. 3.3.4. Standaardoplossingen Er worden 2 standaardoplossingen gemaakt, namelijk een oplossing van cortisol-D4 en een oplossing van cortisol. Cortisol-D4 wordt in de verschillende experimenten gebruikt als interne standaard (IS). Er wordt gebruik gemaakt van een gecertificeerde ampul 5 mg cortisol-D4 die opgelost wordt in 5 mL MeOH. Deze oplossing wordt nog verder verdund zoals beschreven in ‘3.3.4.1.’. Voor de bereiding van de cortisoloplossing wordt 1 mg cortisol opgelost in 100 mL 90/10 v/v water MeOH, zo wordt een concentratie van 10 ng/µL (=10 µg/mL) bekomen. Van deze oplossing worden ook twee verdunningen gemaakt, deze worden beschreven in ‘3.3.4.2.’ en ‘3.3.4.3.’. 3.3.4.1. Cortisol-D4 100 ng/mL Van de cortisol-D4 standaardoplossing wordt een verdunningsreeks gemaakt tot een concentratie van 100 ng/mL cortisol-D4 bekomen wordt. Hiervoor wordt uit de standaardoplossing 1 mL genomen en aangelengd met 9 mL milli-Q water, de concentratie aan cortisol-D4 in deze oplossing bedraagt dan 0,1 mg/mL. Uit deze oplossing wordt weer 1 mL genomen die opnieuw wordt aangelengd met 9 mL water. Dit proces wordt hierna nog 2

16

keer herhaald zodanig dat uiteindelijk een concentratie van 100 ng/mL cortisol-D4 bekomen wordt. 3.3.4.2. Cortisol 1 µg/mL Om een 1/10 verdunning te maken van de standaardoplossing van cortisol wordt 1 mL uit de 100 mL standaardoplossing overgebracht in een proefbuis en aangelengd met 9 mL water. Zo wordt een concentratie van 1 µg/mL cortisol bekomen. 3.3.4.3. Cortisol 0,1 µg/mL Voor de 1/100 verdunning van de cortisoloplossing wordt 1 mL uit de oplossing beschreven in ‘3.3.4.2.’ genomen en aangelengd met 9 mL water in een proefbuis. Zo bedraagt de concentratie aan cortisol in deze oplossing 0,1 µg/mL. 3.3.5. Gebruikte technieken 3.3.5.1. Vaste fase extractie (SPE) Voor de opzuivering van de stalen wordt gebruik gemaakt van vaste fase extractie (SPE). Dit is een veel gebruikte techniek voor de aanconcentratie en opzuivering van monsters en wordt vaak gebruikt in combinatie met vloeistofchromatografie. Er wordt gebruik gemaakt van kleine kolommetjes met daarin een vast sorbens (pakkingsmateriaal). De keuze van het sorbens van de kolom hangt af van de fysisch-chemische eigenschappen van de matrix en de te analyseren component. Aangezien cortisol relatief apolair is, werken we met omgekeerde fase SPE (RP-SPE), waarbij C18-kolommen gebruikt worden. De binnenkant

van

een

dergelijke

silicakolom

bestaat

uit

octadecylgroepen.

De

interactiekrachten tussen cortisol en de octadecylgroepen zullen voornamelijk van der Waals krachten zijn (Lingeman, 2000). De SPE procedure bestaat uit vier verschillende stappen. Deze worden geïllustreerd in figuur 3.2.

17

Figuur 3.2: De 4 stappen van de SPE procedure; stap 1: activeren en conditioneren, stap 2: toevoegen van het monster, stap 3: wassen en drogen van de kolom en stap 4: de elutie van de te analyseren componenten. (http://www.crawfordscientific.com/Silicycle_SPE.htm) - De kolom wordt geactiveerd met een organisch oplosmiddel. Door het activeren van de silicakolommen wordt de nog aanwezige lucht verwijderd en gaan de silanolstaarten uit elkaar waardoor het interactie-oppervlak vergroot. Om de overmaat organische vloeistof te verwijderen wordt de kolom geconditioneerd. Aangezien de kolom gepakt is met een apolair sorbens, gebeurt het conditioneren met water of met een geschikte buffer. Conditioneren is ook noodzakelijk om de polariteit van de vloeistof in de poriën zoveel mogelijk te doen overeenstemmen met de polariteit van de matrix waarin het analyt zich bevindt. Tijdens deze 2 stappen mag de kolom nooit droog komen te staan. - Na de activering en de conditionering van de kolommen wordt het staal op de kolom gebracht. De analyten en de interfererende componenten zullen op het sorbens vast gehouden worden, de overmaat vloeistof elueert in het SPE afvalbakje. Opdat de retentie van de analyten op het sorbens optimaal zou zijn is het belangrijk dat het debiet waarmee het staal op de kolom wordt gebracht niet te hoog is. - Om de interfererende componenten te verwijderen wordt de kolom gewassen met oplosmiddelen met stijgende elutiesterkte. Bij het gebruik van C18-kolommen worden eerst alle componenten verwijderd die meer polair zijn dan het analyt, de componenten die minder polair zijn zullen na de elutie nog op de kolom aanwezig zijn. Nadien wordt de kolom gedroogd om de overmaat aan vloeistof in de poriën te verwijderen, dit gebeurt meestal onder vacuüm. 18

- Finaal wordt het analyt geëlueerd. Het eluens zorgt ervoor dat bij het gebruik van een apolaire pakking hydrofobe interacties verbroken worden waardoor het analyt kan elueren. Het volume van het eluens wordt best zo klein mogelijk gehouden om het monster niet te verdunnen (Lingeman, 2000). 3.3.5.2. Ultra performantie vloeistofchromatografie (UPLC)- tandem massaspectrometrie (MS/MS) Voor de detectie van glucocorticoïden in biologische matrices bestaan verschillende technieken

zoals:

radio-immuno-assays,

vloeistofchromatografie

gekoppeld

aan

spectrofotometrie en gas-of vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (Jusko et al.,1994; Logunov & Mazkhar, 1994; Delahaut et al., 1997; Shibasaki et al., 1997). We kiezen voor vloeistofchromatografie in combinatie van massaspectrometrische detectie aangezien dit een zeer specifieke en gevoelige techniek is. Bovendien kunnen de componenten via LC-MS/MS zowel gekwantificeerd als geïdentificeerd worden. Ultra performantie vloeistofchromatografie (UPLC) Chromatografie is de methode die het meest aangewezen is om componenten van elkaar te scheiden. Dit is noodzakelijk voor analyses van mengsels waarbij slechts enkele componenten dienen geïdentificeerd te worden. Hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) is één van de krachtigste technieken in de analytische chemie. Componenten kunnen via HPLC gescheiden, geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. Er is slechts een kleine hoeveelheid monster nodig voor detectie. Het is een eenvoudige, snelle en gevoelige techniek met een groot scheidingsvermogen. De mobiele fase kan zowel waterig als organisch zijn en zit in het reservoir van het HPLC systeem. De polariteit van de mobiele fase zal afhangen van de eigenschappen van de te scheiden componenten. Bovendien kan de samenstelling van de mobiele fase veranderen gedurende de run. De hoge druk pomp genereert een bepaalde druk die ervoor zorgt dat per minuut een constante hoeveelheid vloeistof naar de HPLC kolom gepompt wordt. Via het injectiesysteem wordt het monster geïnjecteerd en komt het terecht in de mobiele fase om zo naar de HPLC kolom geleid te worden.

19

Figuur 3.3: Onderdelen van het HPLC systeem (http://www.waters.com/waters) Op de kolom zit de stationaire fase waarop de componenten van het monster kunnen binden via onder andere waterstofbrugbindingen, covalente bindingen,…. Wanneer de analyt interactie vertoont met de stationaire fase zal er retentie optreden. Het verschil in retentietijd tussen de verschillende componenten is dus afhankelijk van hun affiniteit voor de stationaire fase. Bij gewone vloeistofchromatografie is de stationaire fase polair en de mobiele fase apolair. In 75% van alle HPLC methodes wordt omgekeerde fase (RP) HPLC gebruikt omdat dit beter reproduceerbaar is en een groter toepassingsgebied heeft. De stationaire fase die dan gebruikt wordt is apolair waardoor de scheiding op basis van hydrofobiciteit gebeurt. Meestal gebruikt men siliciumoxide, dat chemisch gemodificeerd kan worden zodanig dat een zeer polaire tot zeer apolaire stationaire fase kan bekomen worden. De mobiele fase bestaat dan uit een mengsel van water en een organisch solvent zoals bijvoorbeeld acetonitrile. Telkens wanneer een component uit de vloeistofchromatograaf elueert, geeft de detector een elektrisch signaal dat geregistreerd wordt door een recorder. Het signaal wordt, in functie van de tijd, grafisch voorgesteld onder de vorm van een chromatogram. Elke component heeft zijn specifieke retentietijd dewelke gebruikt wordt voor kwalitatieve analyses (www.waters.com).

20

De laatste jaren wordt steeds vaker ultra performantie vloeistofchromatografie (UPLC) gebruikt. Deze techniek werkt op exact dezelfde manier als HPLC maar de componenten worden veel sneller gescheiden en de resolutie is hoger. Door het ontwikkelen van kolommen met partikels kleiner dan 2 µm en aangepaste toestellen om een druk tot 15000 psi te kunnen opbouwen kan deze hogere performantie bereikt worden. Een extra voordeel aan UPLC is dat er minder solvent moet gebruikt worden wat de kostprijs lager maakt en waardoor het ook beter is voor het milieu. Om de componenten na chromatografische scheiding te analyseren kan het UPLC systeem gekoppeld worden aan een massaspectrometer. Het principe van de massaspectrometer is het vormen van ionen gevolgd door een scheiding van deze ionen op basis van hun massa/lading (m/z) verhouding om dan uiteindelijk de gevormde ionen te kunnen detecteren (Niessen, 1997). De respons van het ionendetectiesysteem is recht evenredig met het aantal ionen dat de detector bereikt. Electrospray ionisatie Vooraleer

de

componenten

kunnen

gekwantificeerd

worden

met

de

massaspectrometer worden ze geïoniseerd met een zachte ionisatietechniek, electrospray ionisatie (ESI). De componenten worden met behulp van het vernevelingsgas door een capillair gepompt. Het vernevelingsgas zorgt ervoor dat het solvent verneveld wordt en de spray in de juiste richting gaat. Ter hoogte van het capillair wordt een potentiaal van 2 tot 5 kV aangelegd. Deze voltage zorgt voor de vorming van sterk geladen druppels. Het desolvatiegas, een warme stroom van stikstofgas, bevordert de verdamping van het solvent waardoor de druppels inkrimpen en de ionen dichter bij elkaar komen liggen. Tussen het capillair en de bron van de massaspectrometer, waar een atmosferische druk heerst, ontstaat een potentiaalverschil. Dit zorgt voor het ontstaan van een elektrisch veld. Onder invloed van dat elektrisch veld migreren de ionen naar het oppervlak (= ionenevaporatie).

Verder

zijn

er

nog

Coulombse

repulsiekrachten

die

de

oppervlaktespanning van de druppels kunnen overwinnen met als gevolg dat de druppels uiteen spatten in kleinere minder geladen druppels. Deze kleinere druppeltjes zullen op hun

21

beurt ook weer inkrimpen en exploderen waardoor uiteindelijk enkelvoudig geladen moleculen ontstaan. Dit wordt geïllustreerd in figuur 3.4. De ionen worden dan via een cone naar de massaspectrometer geleid waar ze in de SRM mode (selected reaction monitoring, zie verder) worden gescheiden volgens hun m/z verhouding (Quattro LC operator training Course).

Figuur 3.4: Mechanisme van ionvorming via ESI (http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm) Tandem massaspectrometrie (MS-MS) MS-MS wordt gebruikt om fragmentatie te induceren. Tandem massaspectrometers worden ook soms “triple quadrupool” massaspectrometers genoemd omdat er 3 quadrupool filters aanwezig zijn, waarvan enkel de 1e en de laatste dienst doen als massafilter. De middelste is een hexapool collisioncel waar fragmentatie plaats grijpt (Quattro micro user’s guide). Fragmentatie wordt ook nog “collisionally activated dissociation” (CAD) of “collision-induced dissociation” (CID) genoemd. Moleculaire ionen worden gefragmenteerd in de gasfase door stijging van het voltage in vacuüm gevolgd door botsing van de ionen met een neutraal gas zoals helium of argon. Tijdens de botsing wordt een deel van de kinetische energie opgenomen waardoor chemische bindingen in het moleculair ion verbroken worden. Dit resulteert in kleine fragmentionen (www.waters.com). De meest gebruikte massa analysator bij LC-MS is een quadrupool filter. Figuur 3.5 illustreert dat een quadrupool bestaat uit vier hyperbolische staven die zich op gelijke afstand van een centrale as bevinden. Op de 4 staven wordt een wisselspanning en een 22

radiofrequentie (rf) aangelegd die men laat oscilleren. De ionen oscilleren in een veld loodrecht op de staven wanneer ze in het quadrupool veld worden gebracht. Enkel de ionen die een golfbeweging volgen synchroon met de golfbeweging van de rf- en wisselstroomspanning zullen de detector bereiken. De elektrische spanningen kunnen snel en gemakkelijk gewijzigd worden via een computersysteem (Niessen, 1997).

Figuur 3.5: Schematische voorstelling van een quadrupool massafilter (http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.htmL) De massaspectrometer wordt ingesteld op de SRM-modus. SRM is een techniek die zeer gevoelig en selectief is en gebruikt wordt als standaardmethode voor kwantitatieve analyses. De hoge selectiviteit zorgt voor een betere signaal-ruis verhouding van de te analyseren verbindingen in het monster. De werking wordt geïllustreerd in figuur 3.6. Quadrupool 1( Q1) wordt zo ingesteld dat enkel het precursorion wordt doorgelaten. Het precursorion bereikt dan de collision cel en wordt daar gefragmenteerd via collision induced dissociation (CID) met behulp van argon als botsingsgas. Q2 wordt ingesteld op een bepaalde m/z waarde zodat enkel de fragmentionen, die ontstaan zijn na fragmentatie van het precursorion, met deze welbepaalde m/z waarde worden doorgelaten en de detector kunnen bereiken. Omdat de beide quadrupolen dienst doen als massafilters gaan enkel de ionen specifiek voor cortisol geselecteerd worden (Quattro LC operator training course).

23

Figuur 3.6: SRM-modus: Q1 wordt ingesteld op de m/z-waarde van het precursorion, dit bereikt dan de collision cel waar het gefragmenteerd wordt. Enkel de fragmentionen die dezelfde m/z-waarde hebben als deze waar Q2 op ingesteld is, zullen doorgelaten worden en vervolgens de detector bereiken. Detectie Als detector wordt een fotonmultiplier gebruikt waarvan de werking gebaseerd is op het principe van secundaire elektronenemissie. De ionen uit de quadrupool worden door een conversie dynode omgezet in fotonen, die op hun beurt zullen invallen op een kathode waardoor een aantal elektronen worden vrijgesteld. Deze elektronen migreren dan naar de anode en worden, bij contact met de opeenvolgende anoden, geamplificeerd. Uiteindelijk worden uit 1 foton 10n elektronen verkregen die een elektrisch signaal uitzenden evenredig met het aantal invallende ionen. Het elektrisch signaal wordt opgenomen door een recorder waardoor een massaspectrum van de productionen bekomen wordt (Niessen, 1997). 3.3.6. LC-MS/MS condities In de LC-MS/MS methode die gebruikt wordt om cortisol te analyseren bestaat mobiele fase A uit water + 0,1 % mierenzuur en mobiele fase B uit acetonitrile + 0,1 % mierenzuur. Om een goede scheiding te verkrijgen maken we gebruik van gradiëntelutie, dit wil zeggen dat er wordt gestart met een zwak eluens, namelijk mobiele fase A en dat we geleidelijk aan overgaan naar een sterker eluens, namelijk mobiele fase B (zie tabel 3.1). Er wordt 10 µl staal geïnjecteerd die dan terecht komt op de Acquity UPLC® BEH C18-kolom (1.7 µm, 2.1 x 100mm). De temperatuur van de kolom wordt ingesteld op 30°C en de flow op 0,4 mL/min. 24

Tabel 3.1: Elutieschema toegepast voor de analyse van cortisol in haar Tijd (min) Flow(mL/min) MF* A (%) MF* B (%) 0 0,4 80 20 2 0,4 80 20 3 0,4 75 25 6 0,4 75 25 10 0,4 35 65 12 0,4 80 20 * mobiele fase

Curve lineair lineair lineair

Nadien worden de componenten geïoniseerd in de positieve electrospray modus (ESI+) en via de sample cone naar de massaspectrometer geleid. De gebruikte parameters van de massaspectrometer worden weergegeven in tabel 3.2. Tabel 3.2: MS-parameters Component

Precursorion

Cortisol

363,2

Cortisol-D4

367,3

Fragmention *

121 327 121* 331

Cone (V)

Collison energy (eV)

45 45 35 35

24 18 20 18

*

meest abundante fragmention

3.4. METHODEONTWIKKELING 3.4.1. Testen van de ball mill De ball mill (figuur 3.7) is een toestel dat gebruikt wordt om verschillende materialen zoals chemicaliën, cement, keramische grondstoffen,… te verpulveren. Bij de ball mill die in het onderzoek gebruikt wordt, worden 2 cilindervormige kokers, waarin telkens 5 epjes passen, vast gemaakt met een schroef. Het materiaal dat verpulverd moet worden, wordt in de epjes gebracht samen met bepaalde partikels die dienen om het staal te vermalen. Het is belangrijk dat deze partikels groter zijn dan het grootste deeltje dat moet verpulverd worden. In de experimenten worden kleine metalen kogeltjes met een diameter van 12 mm gebruikt. De 5 epjes worden in de kokers geplaatst die dan vast geschroefd worden. Na het sluiten van het deksel wordt de ball mill gestart en worden de 2 cilindervormige kokers horizontaal geschud bij een maximale frequentie van 30 Hz. Er wordt getest hoeveel kogeltjes er aan de epjes moeten toegevoegd worden om het haar volledig tot poeder te vermalen en hoeveel minuten daarvoor nodig zijn. Aangezien 25

de maximale frequentie van de gebruikte ball mill slechts 30 Hz is, wordt altijd deze maximale frequentie aangehouden.

Figuur 3.7: Afbeelding van de gebruikte ball mill (http://www.daigger.com/catalog/department/d-Mills/Mills) 3.4.2. Extractie en clean-up experimenten Vertrekkende vanuit de literatuur worden verschillende parameters getest voor het ontwikkelen van een goede UPLC-MS/MS methode voor de analyse van cortisol in haar. Voor het opstellen van het protocol wordt eerst gebruik gemaakt van een artikel van Cirimele et al. (1999) waarin 10 corticosteroïden in menselijk haar via LC-MS worden geïdentificeerd (set-up 1 en 2). Vervolgens worden andere procedures getest gebaseerd op methoden beschreven door Becue et al. (2011) (set-up 3 tot en met 6) en Raul et al. (2004) (set-up 7). In tabel 3.3 wordt een schematisch overzicht weergegeven van de verschillen tussen de zeven setups. Daaronder volgt een gedetailleerde beschrijving van de verschillende uitgevoerde experimenten.

26

Tabel 3.3: Schematisch overzicht van de verschillende set-ups. Setup 1

Setup 2

Setup 3

Setup 4

Setup 5

Setup 6

Setup 7

Soort haar

Varkenshaar

Varkenshaar

Kappershaar

Mensenhaar (niet van vertex posterior)

afwegen, wassen met(CH3)2CHOHa of CH2Cl2b, verknippen + verpulveren in ball mill IS+cortisol

afwegen, wassen met (CH3)2CHOHa, verknippen+ verpulveren in ball mill

verknippen tot homogeen mengsel en afwegen

verknippen tot homogeen mengsel en afwegen

mensenhaar van vertex posterior+ kappershaar voor calibratiecurve analoog setup 5

kappershaar

Staalvoorbereiding

IS+cortisol

IS+cortisol

Extractie

MeOH of Soerensenbuffer + droogstoof 30°C of 50°C, 14 of16u +centrifuge

TCEP+ultrasoonbad, MeOH toevoegen in overhead shaker +centrifuge

Wassolventen SPE

H2O + 90/10 H20/MeOH

6 stalen: TCEP+ Soerensenbuffer, rest: Soerensenbuffer; allen 16u bij 40°C in schudincubator+ centrifuge analoog setup 1

enkel IS, calibratiecurve: IS+cortisol 6stalen volledig analoog setup 3, 6 stalen geen TCEP+ ultrasoonbad

mensenhaar van vertex posterior+ kappershaar vr calibratiecurve stuk van 6cm verknippen en afwegen, kappershaar verknippen en afwegen enkel IS, calibratiecurve: IS+cortisol analoog setup 3

Elutiestap SPE

3 keer 0,5mL MeOH

analoog setup 1

3mL acetonitrile+3mL ethylacetaat Nee

Belasten

CH3COONabufferc+ H20+Na2CO3d+H20+ MeOH/H20 50/50

6 stalen: NatriumacetaatCH3COONabufferc+ buffer+H20+Na2CO3d d H20+Na2CO3 +H2O, 6 +H20 stalen: CH3COONabuffer+ H20+MeOH/H20 50/50 analoog setup 3 analoog setup 3

Nee Nee Nee Vloeistof/ vloeistofextractie a : isopropanol, b: methyleenchloride, c: natriumacetaatbuffer, d: natriumcarbonaat

27

Nee

analoog setup 5

4 stalen analoog setup 4, 8 stalen: verknippen, wassen met CH2Cl2b + verpulveren in ball mill allemaal met IS+ 6 stalen met cortisol

analoog setup 3

4 stalen analoog setup 3, 8 stalen soerensenbuffer+ schudincubator+ centrifuge

analoog setup 4

4 stalen analoog setup 4, 8 stalen aceton/H20 80/20+hexaan

analoog setup 3

4 stalen analoog setup 3, 8 stalen: 3 mL MeOH Ja

Nee

3.4.2.1. Set-up 1 Om te bepalen welke parameters een significante invloed hebben op de finale cortisolconcentratie wordt varkenshaar gebruikt. Aangezien er heel wat parameters zijn waarvan de invloed kan worden getest en er gestreefd wordt naar een minimaal aantal stalen, wordt het Plackett-Burman design gebruikt. Met dit soort experimenteel design kunnen N-1 factoren in N stalen (waarbij N een veelvoud is van 4) vergeleken worden. De significante factoren kunnen dan via lineaire regressie in SPPS bepaald worden. Een overzicht van de geteste parameters en het toegepaste Plackett-Burman design is weergegeven in tabel 3.4. Tabel 3.4: Overzicht van het toegepaste Plackett-Burman design voor het testen van de verschillende parameters. Staalnummer Wassolventa Duurb Herhc Extractie solventd Duure Tempf 1 & 13 2 & 14 + + + 3 & 15 + + + + 4 & 16 + + + + + 5 & 17 + + + 6 & 18 + + + 7 & 19 + + 8 & 20 + + + 9 & 21 + + + + 10 & 22 + + + + 11 & 23 + + + 12 & 24 + + a b : het soort wassolvent + = isopropanol; - = methyleenchloride, : het aantal minuten dat moet gewassen c d worden + = 4min; - = 2min, : aantal keren wassen + = 3 maal; - = 2 maal, : het soort extractiesolvent + = e f methanol; - = soerensenbuffer, : aantal uren in de droogstoof + = 14 uur; - = 16uur, : temperatuur van de droogstoof + = 30°C; - = 50°C.

Twaalf stalen worden in duplo gemaakt, door telkens 100 mg haar af te wegen op een analytische balans in gosselinbuizen. Als wassolvent wordt methyleenchloride of isopropanol gebruikt. Aan twaalf van de 24 stalen wordt 5 mL methyleenchloride toegevoegd, aan de andere 5 mL isopropanol. De haren worden dan bij kamertemperatuur gedurende 2 of 4 min gewassen en dit telkens 2 of 3 keer. Vervolgens worden de haren uit de gosselinbuizen gehaald en in kleine stukjes geknipt om verder in de ball mill verpulverd te worden. De verknipte stukjes worden met behulp van een pincet in een epje gebracht en in

28

elk epje worden 2 kogeltjes van 12 mm diameter gebracht. De epjes worden dan in de ball mill gedurende 10 min bij 30 Hz geschud. Wanneer het haar tot poeder is vermalen, wordt uit elk epje 50 mg overgebracht in een nieuw epje. Als interne standaard (IS) wordt 100 µl van een 100 ng/mL cortisol-D4 oplossing (‘3.3.4.1.’) toegevoegd. Aan elk staal moet ook nog 10 ng cortisol toegevoegd worden ter controle, daarvoor wordt in elk epje 1 µl van de cortisol oplossing, beschreven in ‘3.3.4.’, gebracht. Alle stalen worden nadien geïncubeerd met 1 mL methanol of 1 mL Soerensenbuffer. Na toevoeging van 1 mL Soerensenbuffer of 1 mL methanol worden de stalen geïncubeerd in een droogstoof, ofwel bij 30°C, ofwel bij 50°C. Dit gedurende 14 of 16 uur (zie tabel 4.1). Nadien worden de stalen 2 min gecentrifugeerd bij 5°C en 9167 g. Na centrifugatie is het cortisol, dat geëxtraheerd werd uit het haarpoeder, aanwezig in het supernatans. Voor de verdere analyse met UPLC is het belangrijk dat zo weinig mogelijk interfererende factoren aanwezig zijn dus wordt het supernatans verder opgezuiverd aan de hand van omgekeerde fase SPE. De kolom wordt geactiveerd met 3 mL MeOH en geconditioneerd met 3 mL milli-Q water. Tijdens deze 2 stappen wordt ervoor gezorgd dat de kolom niet droog komt te staan. Dan wordt de kolom beladen met het supernatans om nadien gewassen te worden met 1 mL milli-Q water en 1 mL water/MeOH oplossing ( 90/10 v/v). Als laatste moeten de corticosteroïden elueren. Nadat de kolommen gedurende 30 minuten hebben kunnen drogen, wordt onder elke kolom een proefbuisje geplaatst. Dan wordt 3 keer 0,5 mL MeOH over de kolom gebracht, waardoor de bindingen tussen de corticosteroïden en de silicagroepen verbroken worden en ze loskomen en elueren. Alle stalen moeten vervolgens worden droog gedampt onder continue stikstof stroom bij 60°C, dit gedurende ongeveer 45 min. Wanneer alles verdampt is, wordt aan elke proefbuis 100 µl 80/20 v/v gedeïoniseerd water/MeOH oplossing toegevoegd. Het geheel wordt 1 minuut gevortext, overgebracht in een HPLC vial en geanalyseerd volgens de condities beschreven in ‘3.3.6’.

29

3.4.2.2. Set-up 2 In deze set-up worden 2 reeksen van 12 stalen geanalyseerd. In de eerste reeks wordt aan stalen 1 tot en met 6 de IS toegevoegd voor de opzuivering, meer specifiek voor de incubatie, bij stalen 7 tot en met 12 wordt deze pas toegevoegd na de opzuivering. Dit wordt gedaan om te kijken hoeveel er verloren gaat tijdens de SPE procedure. Optimaal zouden de piekoppervlaktes van cortisol-D4 toegevoegd voor de SPE gelijk moeten zijn aan deze van de IS die pas na het opzuiveren is toegevoegd. Het doel van de tweede reeks is nagaan of het nuttig is van Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) aan de haarstalen toe te voegen. Opnieuw wordt de vergelijking gemaakt aan de hand van 6 stalen, aan stalen 13 tot en met 18 wordt geen TCEP toegevoegd, aan de laatste 6 stalen wel. Alle stalen worden vooraf 2 keer gewassen gedurende 2 minuten met 5 mL isopropanol. Nadien worden de varkensharen verknipt en verpulverd in de ball mill. Aan staal 19-24 wordt 2 mL TCEP toegevoegd, vervolgens wordt aan alle stalen 1 mL Soerensenbuffer toegevoegd en 1 µl van een 10 µg/mL oplossing cortisol (zie ‘3.3.4.’). Alle stalen, behalve 7 tot en met 12, worden belast met 100 µl van een 100 ng/mL cortisol-D4 oplossing (‘3.3.4.1.’). Dan volgt de incubatie, deze keer worden de stalen niet geïncubeerd in de droogstoof maar in een schud-incubator, dit gedurende 16u bij 40°C. Een overzicht van de verschillende stalen is weergegeven in tabel 3.5. Na het incuberen worden de stalen 2 min bij 9167 g gecentrifugeerd. Daarop volgt de opzuivering. De C18-kolommen worden geconditioneerd met 3 mL MeOH en geactiveerd met 3 mL water. Het supernatans wordt op de kolom gebracht en de kolommen worden gewassen met 1 mL water en 1 mL water/MeOH 90/10 v/v oplossing. Vervolgens worden de kolommen gedurende 30 min aan de lucht gedroogd. Nadien volgt elutie door 3 keer 0,5 mL MeOH op de kolom te brengen. De stalen worden drooggedampt onder continue stikstofstroom bij 60°C en heropgelost in 100 µl 80/20 water/MeOH oplossing. Na het vortexen wordt het geheel overgebracht in een HPLC vial en geanalyseerd.

30

Tabel 3.5: Overzicht van de 2 reeksen van 12 stalen in set-up 2 Staal

Wassen

Isopropanol-2min2herh Isopropanol-2min2&14 2herh Isopropanol-2min3&15 2herh Isopropanol-2min4&16 2herh Isopropanol-2min5&17 2herh Isopropanol-2min6&18 2herh Isopropanol-2min7 2herh Isopropanol-2min8 2herh Isopropanol-2min9 2herh Isopropanol-2min10 2herh Isopropanol-2min11 2herh Isopropanol-2min12 2herh Isopropanol-2min19 2herh Isopropanol-2min20 2herh Isopropanol-2min21 2herh Isopropanol-2min22 2herh Isopropanol-2min23 2herh Isopropanol-2min24 2herh * c= cortisol, c-D4= cortisol-D4 1&13

Vermalen

TCEP Extractiesolvent

Belasten

Incubatie

Belasten(na SPE)

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer 10ng c+10ng c-D4* 16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c+10 ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c +10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

/

Soerensenbuffer

10ng c

16u-40°C

10ng cd-4

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

15min -30Hz

2mL Soerensenbuffer

10ng c+10ng c-D4

16u-40°C

/

3.4.2.3. Set-up 3 In dit experiment wordt mensenhaar afkomstig van een kapperszaak gebruikt en wordt een volledig nieuw protocol toegepast beschreven door Becue et al. (2011). Zes stalen van 200 mg worden afgewogen in gosselinbuizen. Aan elk staal wordt 4 µl van een 10 µg/mL cortisol oplossing (‘3.3.4.’) toegevoegd, 400 µl van een 100 ng/mL cortisol-D4 oplossing (‘3.3.4.1.’) als interne standaard en 2 mL TCEP. Vervolgens worden alle stalen gedurende 1u30 in een ultrasoon bad geplaatst. Na toevoegen van 8 mL methanol, voor de extractie van cortisol, worden de stalen 15 min in de overhead shaker geschud en 12 min bij 3076 g 31

gecentrifugeerd. Het supernatans wordt met een pasteurpipet overgebracht in proefbuizen en wordt bij 40°C onder stikstof drooggedampt. Aan het overgebleven haar in de gosselinbuizen wordt opnieuw 8 mL methanol toegevoegd en vervolgens worden deze terug geschud in de overhead shaker en gecentrifugeerd. Het supernatans wordt dan bij het vorige supernatans gebracht en verder drooggedampt tot nog iets meer dan 2 mL in de proefbuis zit aangezien dit de toegevoegde hoeveelheid TCEP is en dit slecht verdampt. Daaraan wordt 3 mL methanol en 6 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8) toegevoegd. Dan volgt de opzuivering van de stalen met behulp van omgekeerde fase SPE. De C18kolommen worden geconditioneerd met 6 mL methanol gevolgd door 6 mL natriumacetaatbuffer. De extracten worden op de kolommen gebracht en na doorlopen worden

de

kolommen

gewassen.

Dit

gebeurt

achtereenvolgens

met

2

mL

natriumacetaatbuffer, 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10% (g/v), 2 mL water en 2 mL MeOH/water 50/50 (v/v). Na de wasstappen wordt cortisol van de kolom geëlueerd met 3 mL acetonitrile en 3 mL ethylacetaat. De proefbuisjes worden dan volledig drooggedampt bij 40° C onder continue stikstofstroom. Het gedroogde residu wordt heropgelost in 100 µl 80/20 v/v water/MeOH. Dit wordt gevortext, overgebracht op een ultracentrifuge-filter en gedurende 5 min bij 9167 g gecentrifugeerd. Nadien wordt het centrifugaat overgepipetteerd in een HPLC vial en wordt het cortisol gehalte bepaald via UPLC-MS/MS. 3.4.2.4. Set-up 4 Deze set-up wordt opgestart om te kijken of eventueel een wasstap tijdens de SPE kan worden weglaten en of TCEP echt noodzakelijk is en bijdraagt tot hogere cortisol opbrengsten. Om de vergelijking te kunnen maken, is 800 mg (4 stalen van 200 mg) haar nodig van 3 verschillende personen. Per persoon worden 2 stalen belast met 400 µL van een 100 ng/µL cortisol-D4 oplossing en 2 stalen met eveneens 400 µL van een 100 ng/µL IS oplossing en 2 mL TCEP. Er wordt analoog gewerkt als in set-up 3 maar de stalen worden niet belast met cortisol en als wasstap tijdens de opzuivering wordt ofwel 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water gebruikt, ofwel 2 mL natriumacetaatbuffer ( pH 4,8), 2 mL water en 2 mL MeOH/water 50/50 (v/v). Een overzicht is te vinden in tabel 3.6. 32

Tabel 3.6: Overzicht van de stalen met de verschillende SPE-wasstappen Staal

Belasten

SPE-wasstappen

1 2 3

persoon 1 persoon 2 persoon 3

geen cortisol geen cortisol geen cortisol

cd-4 cd-4 cd-4

Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O

4 5 6

persoon 1 persoon 2 persoon 3

geen cortisol geen cortisol geen cortisol

cd-4 cd-4 cd-4

Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50 Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50 Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50

7 8 9

persoon 1 persoon 2 persoon 3

geen cortisol geen cortisol geen cortisol

cd-4 +TCEP cd-4 +TCEP cd-4 +TCEP

Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O Natriumacetaatbuffer+H2O+natriumcarbonaat+H2O

10 11

persoon 1 persoon 2

geen cortisol geen cortisol

cd-4 +TCEP cd-4 +TCEP

Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50 Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50

12

persoon 3

geen cortisol

cd-4 +TCEP

Natriumacetaatbuffer+H2O+MeOH/water 50/50

Verder worden tijdens deze set-up ook 2 calibratiecurven meegenomen. Hiervoor worden 12 stalen (6 per calibratiecurve) van 200 mg kappershaar afgewogen. Bij elke calibratiecurve is het eerste staal een blanco. De volgende 5 worden belast met respectievelijk 10 ppb, 30 ppb, 50 ppb, 100 ppb en 200 ppb cortisol. Om de stalen met 10 en 30 ppb te belasten, wordt 20 en 60 µL van de verdunning beschreven in ‘3.3.4.3.’ toegevoegd. Voor 50, 100 en 200 ppb worden de stalen belast met 10, 20 en 40 µL van de oplossing uit ‘3.3.4.2.’. Alle stalen worden vervolgens belast met 400 µL van de cortisol-D4 oplossing beschreven in ‘3.3.4.1.’ en 2 mL TCEP. Tijdens de opzuivering zullen de C18kolommen met de stalen voor de eerste calibratiecurve worden gewassen met 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water, en deze voor de tweede calibratiecurve met 2 mL natriumacetaatbuffer ( pH 4,8), 2 mL water en 2 mL MeOH/water 50/50 (v/v). Deze stalen worden verder op dezelfde manier behandeld als deze in set-up 3. 3.4.2.5. Set-up 5 Aangezien de methode uit set-up 4, waarbij de C18-kolommen gewassen worden met 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water blijkt te werken, dient deze set-up als ultieme test voor de toepasbaarheid van deze methode om normale fysiologische cortisolconcentraties in haar te detecteren. De haarstalen die in dit experiment gebruikt worden zijn afgenomen ter hoogte van de vertex posterior van al dan niet gestresseerde volwassenen. De volwassenen worden 33

onderverdeeld in een controle groep en stress groep aan de hand van een stress vragenlijst (PSS vragenlijsten (Cohen et al., 1983) zie bijlage 5). Personen met een score hoger dan 20,2 (op 56) worden volgens de literatuur als eerder gestresseerd beschouwd, diegene met een score lager dan 20,2 als eerder weinig gestresseerd. Deze laatsten worden de ‘controle groep’ genoemd. Uit elke groep worden 7 haarstalen genomen, deze worden behandeld zoals beschreven in ‘3.2.2.’. De stalen worden belast met 200 µl van een 100 ng/mL cortisol-D4 oplossing. Er wordt opnieuw een calibratiecurve (met het kappershaar) opgesteld met 10 stalen om een bredere range te hebben aangezien er nu met haarstalen gewerkt wordt die effectief afkomstig zijn van de vertex posterior en de contisolconcentraties die zullen gedetecteerd worden ongekend zijn. Het eerste staal is een blanco, de volgende stalen worden belast met respectievelijk 10 ppb, 20 ppb, 30 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb, 300 ppb, 400 ppb en 500 ppb cortisol. Hiervoor worden de 1/10 en 1/100 verdunningen van de cortisol oplossing beschreven in ‘3.3.4.2.’ en ‘3.3.4.3.’ gebruikt. Vervolgens wordt aan alle 24 stalen 2 mL TCEP toegevoegd. Voor het vervolg van de procedure wordt analoog gewerkt als in set-up 3 en 4, met als enige wijziging dat alle C18-kolommen tijdens de opzuivering gewassen worden met 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water. 3.4.2.6. Set-up 6 Aangezien uit set-up 5 niets kon besloten worden, wordt de procedure herbegonnen. Er worden nieuwe haarstalen uit de controle en de gestresseerde groep genomen en de 14 stalen, die in de vorige set-up verloren gingen, worden heropgelost in 30 µl mobiele fase en mee geïnjecteerd. Op die manier kan bij deze stalen misschien toch nog het cortisol gehalte bepaald worden. De calibratiecurve is exact dezelfde als die van set-up 5. 3.4.2.7. Set-up 7 In dit experiment wordt voor de eerste 4 stalen dezelfde procedure gevolgd als deze in set-up 4-6, voor de volgende 8 stalen wordt een methode gebruikt gebaseerd op een protocol beschreven door Raul et al. (2003). Op deze manier kunnen 2 verschillende protocols met elkaar vergeleken worden. Het protocol van Raul et al. (2003), is redelijk 34

gelijkaardig aan dat van set-up 1 en 2. Acht stalen van 100 mg worden afgewogen, 4 daarvan worden 2 keer gedurende 2 minuten met 5 mL methyleenchloride gewassen, vervolgens worden alle 8 stalen verpulverd in de ball mill. Vier stalen worden belast met 2 µL van een 10 µg/mL cortisol oplossing, aan alle 8 stalen wordt 200 µl van een 100 ng/mL cortisol-D4 oplossing toegevoegd. Vervolgens wordt 2 mL Soerensenbuffer toegevoegd en worden de 8 stalen voor 16u bij 40°C geïncubeerd in de schud-incubator (zie tabel 3.7). Verder worden de stalen gecentrifugeerd bij 2492 g voor 10 minuten. Daarop volgt de opzuivering. De C18-kolommen worden geactiveerd met 3 mL MeOH en geconditioneerd met 3 mL gedeïoniseerd water. Het supernatans wordt op de kolommen gebracht en de kolommen worden gewassen met 4,5 mL aceton/water 20/80 v/v oplossing en 4,5 mL hexaan. Na drogen van de kolommen onder vacuüm wordt cortisol geëlueerd met 3 mL MeOH en worden de eluaten ingedampt. Tabel 3.7: Overzicht van de stalen in set-up 7 Staal

Procedure

5mL Methyleenchloride Ball mill

Cortisol

IS

TCEP

1

Becue et al.

Niet gewassen

Nee

Belast

c-D4 2 mL

2 3

Becue et al. Becue et al.

Niet gewassen Niet gewassen

Nee Nee

Belast Niet belast

c-D4 2 mL c-D4 2 mL

4 5

Becue et al. Raul et al.

Niet gewassen Niet gewassen

Nee Ja

Niet belast Belast

c-D4 2 mL c-D4 /

6 7

Raul et al. Raul et al.

Niet gewassen Niet gewassen

Ja Ja

Belast Niet belast

c-D4 c-D4

/ /

8 9

Raul et al. Raul et al.

Niet gewassen Gewassen

Ja Ja

Niet belast Belast

c-D4 c-D4

/ /

10 11

Raul et al. Raul et al.

Gewassen Gewassen

Ja Ja

Belast Niet belast

c-D4 c-D4

/ /

12

Raul et al.

Gewassen

Ja

Niet belast

c-D4

/

Na het indampen volgt een extra stap, namelijk vloeistof/vloeistofextractie. Het gedroogde extract wordt heropgelost in 0,5 mL NaOH, daarbovenop wordt 3 mL diethylether gebracht. Dan wordt gedurende 1 min gevortext en ongeveer 5 min krachtig geschud. De stalen worden nadien voor 10 min bij 1730 g gecentrifugeerd. De organische fase, het diëthylether, wordt dan overgepipetteerd in een nieuwe proefbuis en ingedampt onder continue stikstof bij 40°C. Wanneer het diëthylether volledig verdampt is, wordt 25 µl 80/20 v/v water/MeOH in de proefbuis gebracht. Dit wordt gevortext en dan overgebracht in een HPLC vial. Deze vloeistof/vloeistofextractie stap wordt ook toegepast op de eerste 4 stalen. 35

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1. METHODEONTWIKKELING 4.1.1. Testen van de ball mill Tijdens het testen van de ball mill wordt opgemerkt dat het varkenshaar niet tot poeder verpulverd wordt als het niet op voorhand wordt verknipt. Varkenshaar blijkt zeer stug te zijn. Wanneer de haren in stukjes van 0,5 cm op een petrischaaltje verknipt worden en dan met 3 metalen kogeltjes in een epje in de ball mill geschud worden gedurende 5 min op 30 Hz, zijn de haren nog steeds niet tot poeder vermalen. Dit ligt waarschijnlijk aan het feit dat het epje te vol is waardoor de 3 kogeltjes minder goed kunnen bewegen. Daarom wordt er opnieuw geprobeerd met 2 kogeltjes. Na 5 min in de ball mill is het varkenshaar opnieuw niet volledig tot poeder vermalen en zit een deel van het haar vast in het deksel van het epje. Dit wordt er met een spatel uitgehaald en het epje wordt opnieuw geschud gedurende 5 min. Na deze 5 min is het haar wel tot poeder vermalen. Dus wordt besloten om voor de volgende experimenten de haren gedurende 1 min te knippen en dan 10 min bij 30 Hz in de ball mill te vermalen met 2 kogeltjes maar de ball mill wel telkens na 5 min stop te zetten om het vastgelopen haar in het dekseltje van het epje los te maken. 4.1.2. Resultaten set-up 1 Zoals te zien is in figuur 4.1 vertonen de bekomen chromatogrammen sterk uiteenlopende pieken waaruit moeilijk iets kan afgeleid worden. Voor de stalen die in duplo werden behandeld, zijn de piekoppervlaktes van zowel cortisol als van de IS sterk verschillend. Daarom wordt staal per staal bekeken welke parameter het beste resultaat geeft. Aan de hand van deze analyse lijkt isopropanol een beter wassolvent dan methyleenchloride en Soerensenbuffer een beter extractiesolvent dan methanol. Daarom zal in de volgende set-up het haar met isopropanol gewassen worden en zal cortisol uit het haar geëxtraheerd worden met Soerensenbuffer.

36

Staal 1 20110323-1

MRM of 10 channels,ES+ 363.2 > 121 1.656e+003

Cortisol 5.11 181.59

100

10.16 10.41 9.54

%

10.82 1.38

3.01

2.03

3.94

9.28

8.72

7.88

4.59

11.21

0

min

20110323-1 9.59

Cortisol 5.12 51.32

100

2.76

% 1.33 0.52 0.90

1.83 2.34

8.15

10.00 10.46

3.98 8.38

2.98

4.31

3.29

MRM of 10 channels,ES+ 363.2 > 327 8.168e+002

4.83

10.61

8.86

10.82

7.88

6.44 6.61 6.79

6.14

8.72

11.24

7.51

0

min 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

20110323-1

MRM of 10 channels,ES+ 367.3 > 121 5.149e+003

8.11

100 Cortisol-D4 5.09 260.12

4.64 % 1.87

2.09

8.75 8.52

4.03

7.66

6.40

9.39

10.68

9.88

0

min

20110323-1

MRM of 10 channels,ES+ 367.3 > 331 3.313e+003

8.12

100

% 3.48 3.83 4.06

1.56

0.94

4.63

Cortisol-D4 5.11 90.01

7.18

9.17

7.64 8.99

5.66

9.43

6.43

9.93

10.61

0

min 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

Staal 13 20110323-14

MRM of 10 channels,ES+ 363.2 > 121 1.159e+004

Cortisol 5.14 1305.74

100

% 1.14

10.46

0

min

20110323-14

MRM of 10 channels,ES+ 363.2 > 327 4.516e+003

Cortisol 5.14 516.20

100

% 0.83

2.72

9.57

8.73

8.09

3.73

10.23

0

min 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

20110323-14

MRM of 10 channels,ES+ 367.3 > 121 2.041e+003

Cortisol-D4 5.10 245.93 4.66

100

% 0.84

1.45

1.73

3.17 3.38 3.91

8.74 8.12 8.52 9.08

7.46 7.70

6.23

9.43

9.94

10.63 10.90

11.21

0

min

20110323-14

MRM of 10 channels,ES+ 367.3 > 331 2.211e+003

7.23

100

9.17 8.22

% 0.78

2.76

1.58

3.21 3.54

4.08

5.11 5.36 5.84

4.52

6.52

7.80

8.48

9.42 8.86

9.93 10.13

10.68

0

11.65 min

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

Figuur 4.1: Chromatogrammen van 2 stalen die op dezelfde manier behandeld werden. De piekoppervlaktes verschillen zeer sterk. 37

Analyse van de chromatogrammen en piekoppervlaktes doen vermoedens rijzen over eventuele fouten in het protocol, dewelke worden bevestigd: van de 24 stalen werden er 12 in methanol opgelost terwijl eigenlijk beter geen organische solventen gebruikt worden wanneer RP SPE wordt toegepast. Bij omgekeerde fase SPE worden immers organische solventen als eluens gebruikt, dus wanneer de kolom beladen wordt met de analyt, opgelost in MeOH, zal reeds een groot deel van de analyt verloren gaan aangezien MeOH als sterk eluens fungeert. 4.1.3. Resultaten set-up 2 In vergelijking met de vorige set-up worden de haarstalen allemaal gewassen met isopropanol en wordt cortisol geëxtraheerd met behulp van methanol. Aan 6 stalen wordt TCEP toegevoegd, aan zes andere stalen wordt de IS pas als laatste stap toegevoegd. Staal A

Staal B

Figuur 4.2: Piekoppervlaktes van de quality control die enkel IS en mobiele fase bevat voor (A) en na (B) het runnen van de haarstalen. Over het algemeen zijn de cortisol waarden zeer laag, zit er veel ruis op en zijn ze dus bijgevolg niet reproduceerbaar. Omwille van die reden is het niet echt duidelijk of het 38

toevoegen van TCEP nuttig is of niet. Bovendien wordt ter controle voor en na het runnen van de haarstalen een staal, de quality control, geïnjecteerd bestaande uit 100 µl IS en 100 µl 80/20 v/v water/MeOH. Op figuur 4.2 is te zien dat wanneer de quality control voor de run geïnjecteerd wordt de piekoppervlakte veel groter is dan wanneer dit staal na het runnen van de haarstalen wordt geïnjecteerd. Dit duidt erop dat het toestel tijdens het runnen van de stalen vervuild wordt waardoor het signaal verzwakt naar het einde van de analyse. De 2de doelstelling van deze set-up was kijken of er verlies is van de interne standaard wanneer deze toegevoegd wordt voor het starten van de SPE procedure. In tabel 4.1 is te zien dat zeer veel fluctuatie bestaat tussen de piekoppervlaktes van de IS toegevoegd voor SPE. De piekoppervlaktes van de IS toegevoegd na SPE liggen vrij laag maar zijn wel beter reproduceerbaar aangezien er minder variatie op zit. Dit blijkt ook uit de grafische voorstelling van de piekoppervlaktes met behulp van de boxplot (figuur 4.3). Tabel 4.1: Overzicht van de piekoppervlaktes van de IS toegevoegd voor en na SPE IS voor SPE

IS na SPE

Staal 1 Staal 2 Staal 3 Staal 4 Staal 5

10,39 406,05 82,14 148,32 57,35

Staal 7 Staal 8 Staal 9 Staal 10 Staal 11

163,96 115,14 142,45 175,88 133,92

Staal 6

70,01

Staal 12

98,67

Figuur 4.3: Boxplot van de piekoppervlaktes van de IS voor (0) en na (1) SPE. Er is duidelijk minder fluctuatie op de piekoppervlaktes van de IS toegevoegd na SPE. 39

Verder wordt een niet-parametrische t-test uitgevoerd om te kijken of er een statistisch significant verschil is tussen deze waarden. Hieruit blijkt dat de nulhypothese, namelijk dat er geen verschil is tussen de piekoppervlaktes van de IS voor en na SPE, niet mag verworpen worden aangezien de P-waarde gelijk is aan 0,24 en dus duidelijk groter dan het vooropgestelde significantieniveau van 0,05. Er is dus geen statistisch significant verschil tussen de piekoppervlaktes van de IS toegevoegd voor en na SPE. 4.1.4. Resultaten set-up 3 Aangezien het protocol van Cirimele et al. (1999) absoluut geen goede resultaten oplevert, wordt een volledig andere procedure getest, gebaseerd op een in het labo ontwikkelde methode beschreven door Becue et al. (2011). Het haar wordt niet meer gewassen en verpulverd in de ball mill maar in kleine stukjes verknipt. Cortisol wordt geëxtraheerd met 2 keer 8 ml MeOH en na indampen heropgelost in natriumacetaatbuffer. Voor het elueren van cortisol wordt gebruik gemaakt van acetonitrile en ethylacetaat, de LCMS condities blijven dezelfde. Zoals weergegeven in tabel 4.2 is er een groot verschil in piekoppervlaktes en respons tussen de verschillende stalen ondanks dat ze volgens hetzelfde protocol werden behandeld. De oppervlakte onder de curve van cortisol varieert tussen 1545,92 en 2448,69 deze waarden liggen wel beduidend hoger dan deze van in set-up 1 en 2. Op de piekoppervlakten van cortisol-D4 zit veel meer variatie (van 413,15 tot 2397,72) dan op deze van cortisol, maar ook hier liggen de waarden hoger dan deze in de vorige set-ups. Een mogelijke oorzaak van de fluctuatie kan de opeenvolging zijn van de specifieke wasstappen. Tabel 4.2: Piekoppervlaktes van cortisol-D4 en cortisol en de responsfactor Staal

Piekopp c-D4

Piekopp cortisol Responsa

1 937,06 2200,18 2 888,12 1877,31 3 1707,79 1545,92 4 2397,73 2448,69 5 413,16 2227,12 6 1102,66 1556,12 a: respons =area cortisol/area c-d4

40

2,35 2,11 0,91 1,02 5,39 1,41

In deze procedure is het aantal wasstappen zo hoog aangezien het protocol oorspronkelijk was bedoeld voor bepaling van hormonen met een gist bioassay en deze gedurende de procedure niet mocht afsterven. Omdat de piekoppervlaktes wel hoger zijn dan deze uit set-up 2 wordt besloten dat deze procedure beter werkt. Daarom zal nu dezelfde procedure opnieuw opgestart worden om te kijken of eventueel bepaalde wasstappen kunnen weggelaten worden en wat de invloed daarvan is op de piekoppervlakte van cortisol-D4. Verder wordt ook hier, net als in set-up 2, bij het begin en op het einde van de run een quality control geïnjecteerd dat 100 µl 80/20 v/v water/MeOH en 100 µl cortisol bevat. Opnieuw is er sprake van hetzelfde fenomeen namelijk een lagere piekoppervlakte van de injectie na de run dan deze van voor de run. 4.1.5. Resultaten set-up 4 In dit experiment wordt dezelfde procedure gevolgd als in set-up 3 maar worden 2 verschillende wasstappen gebruikt, namelijk ofwel 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water ofwel 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water en 2 mL MeOH/water 50/50 (v/v). Na de ultracentrifugatie wordt opgemerkt dat voor alle stalen die tijdens de SPE procedure met water/MeOH werden gewassen de filter verstopt waardoor slechts heel weinig centrifugaat in de HPLC vial kan worden overgebracht. Tabel 4.3: Resultaten stalen met en zonder TCEP en met verschillende wasstappen Staal 1 2

Staalomschrijving Cortisol Cortisol

Piekopp cortisol 1,96e4 5,81e4

Piekopp IS 1,47 0,82

Respons

3 4 5 6 7 8

Niet belast haar- Met TCEP - wassen met Natriumcarbonaat Niet belast haar- Met TCEP - wassen met Natriumcarbonaat Niet belast haar- Met TCEP - wassen met Natriumcarbonaat Niet belast haar- zonder TCEP - wassen met Natriumcarbonaat Niet belast haar- zonder TCEP - wassen met Natriumcarbonaat Niet belast haar - zonder TCEP - wassen met Natriumcarbonaat

58,58 108,79 32,73 27,43 35,46 16,87

3432,78 3038,53 2159,82 3392,15 3718,07 3627,74

0,01707 0,03582 0,01516 0,008086 0,009536 0,004650

9 10 11 12 13

Niet belast haar- Met TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50) Niet belast haar- Met TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50) Niet belast haar- Met TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50) Niet belast haar- zonder TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50) Niet belast haar- zonder TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50) Niet belast haar - zonder TCEP - wassen met H2O/MeOH(50/50)

45,92 30,90 1,48 0,89 0,23

1173,91 1911,49 704,89 657,8 537,321

0,03911 0,01617 0,002104 0,001359 0,0004280

0,1000

184,18

0,0005430

14

41

Eén van de doelstellingen van dit experiment was het nut van TCEP onderzoeken. TCEP is een stof die de disulfide bindingen in haar verbreekt waardoor het haar brozer wordt en cortisol gemakkelijker kan geëxtraheerd worden. Ondanks dat er qua respons (tabel 4.3) geen duidelijke verschillen te zien zijn tussen de stalen die met of zonder TCEP werden behandeld, wordt besloten om in de verdere set-ups TCEP te blijven gebruiken op gronde van zijn aangetoonde theoretische werking (http://www.soltecventures.com/tcep.htm). Staal 8 20110413-8

4.42 %

3.12

3.42

3.58 3.97

3.21

MRM of 4 channels,ES+ 363.2 > 121 4.104e+002

Cortisol 5.18 18.38

100

5.10

4.96

4.65

4.06

5.27

5.50

5.69 5.82

6.09

6.65

6.48 6.24

5.94

6.76

0

min

20110413-8 3.29 100 4.86

4.21 3.55 3.66 3.82

3.38

%

4.39

3.91

4.80

4.57

4.09

MRM of 4 channels,ES+ 363.2 > 327 1.877e+002

Cortisol 5.14 3.89 4.99

5.99 5.31 5.49

5.57

6.19 6.27 6.37

5.80

4.69

6.59 6.73

6.86 6.94

0

min 3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

4.40

4.60

4.80

5.00

5.20

5.40

5.60

5.80

6.00

6.20

6.40

6.60

20110413-8

MRM of 4 channels ,ES+ 367.3 > 121 4.725e+004

Cortis ol-D4 5.12 3641.93

100

6.80

%

0

min

20110413-8

MRM of 4 channels ,ES+ 367.3 > 331 9.908e+003

Cortis ol-D4 5.13 726.50

100

%

0

min 3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

4.40

4.60

4.80

5.00

5.20

5.40

5.60

5.80

6.00

6.20

6.40

6.60

6.80

Staal 14 20110413-14

MRM of 4 channels,ES+ 363.2 > 121 6.63 1.349e+002

100 4.75 %

3.27 3.38

3.54

3.61

3.85

4.04

4.17

4.24

4.40

4.91

4.58

5.11

Cortisol 5.24 5.52 0.96 5.41

5.69 5.87

5.96

6.05

6.23

6.38

6.48

6.81

0

min

20110413-14 100

3.21 3.37 3.45 3.50

3.86 3.72

4.48 4.00 4.12

4.28

4.61

4.86

4.76

Cortisol 5.25 1.63 5.17 5.45

5.66

5.78

6.02 6.07

6.22 6.36 6.47

MRM of 4 channels,ES+ 363.2 > 327 6.59 6.82 6.254e+001

%

0

min 3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

4.40

4.60

4.80

5.00

5.20

5.40

5.60

5.80

6.00

6.20

6.40

20110413-14

6.80

MRM of 4 channels,ES+ 367.3 > 121 2.740e+003

Cortisol-D4 5.13 181.20

100

6.60

% 6.15 0

min

20110413-14

MRM of 4 channels,ES+ 367.3 > 331 2.128e+002

5.72

100 4.99

3.49 3.87 3.60

%

3.76

3.25

5.08

4.63 3.94

4.87

6.95

5.36

4.24

5.85

5.48

6.01 6.13

6.43

6.59

0

min 3.20

3.40

3.60

3.80

4.00

4.20

4.40

4.60

4.80

5.00

5.20

5.40

5.60

5.80

6.00

6.20

6.40

6.60

6.80

Figuur 4.5: Chromatogram van staal 8, gewassen met natriumacetaat en staal 14, gewassen met MeOH/water 50/50 waarbij duidelijk lagere piekoppervlaktes te zien zijn.

42

Een andere vaststelling is dat de piekoppervlaktes van cortisol en de IS veel lager zijn bij de stalen waar tijdens de opzuivering water/MeOH als laatste wasstap is gebruikt (zie figuur 4.5 en tabel 4.3 en 4.4). Dit was te verwachten aangezien er reeds bij het ultracentrifugeren werd opgemerkt dat de filter bij deze stalen verstopt zat. Vooral de piekoppervlaktes van de interne standaarden liggen bij deze stalen beduidend lager. Voor de piekoppervlaktes van de IS van de stalen waarbij de C18-kolommen gewassen werden met: 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water werden in vorige set-ups nog nooit zo hoge waarden bekomen als hier. Op deze waarden zit ook weinig fluctuatie. Vandaar dat wordt besloten bij de volgende experimenten de C18kolommen te wassen als volgt: 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water en dus water/MeOH te verwijderen als wassolvent. Tabel 4.4: Resultaten van de 2 calibratiecurves waarbij C18-kolommen met verschillende wassolventen gewassen werden. Staalomschrijving

Piekopp cortisol

1 2

Blanco Haar- Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat Haar 10 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat

112,73 319,8

3728,12 3392,23

0,03023 0,09427

3 4

Haar 30 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat Haar 50 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat

798,43 672,13

3694,00 3521,69

0,2161 0,1909

5 6

Haar 100 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat Haar 200 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen Natriumcarbonaat

1288,42 2693,49

3587,08 3897,78

0,3592 0,6910

7 8 9 10 11 12

Blanco Haar - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50) Haar 10 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50) Haar 30 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50) Haar 50 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50) Haar 100 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50) Haar 200 ppb cortisol - Met TCEP - Wassen H2O/MeOH(50/50)

0,13 23,12 37,20 51,82 125,98 117,57

331,57 455,40 209,24 269,88 365,65 161,35

0,000401 0,05076 0,1778 0,1920 0,3445 0,7286

13

Cortisol

6,25 4

e

Piekopp IS Respons

1,10

Voor wat betreft de resultaten van de calibratiecurve, is in tabel 4.4 te zien dat de piekoppervlakte van het staal dat belast is met 30 ppb cortisol hoger is dan dat van het staal belast met 50 ppb cortisol. Dit doet vermoeden dat een pipetteer fout werd gemaakt tijdens het belasten van de stalen. Wanneer we dit punt weglaten op de calibratiecurve bekomen we een hogere R2 waarde ( figuur 4.6). Wat verder nog opvalt, is dat in het blanco haarstaal ook een bepaalde hoeveelheid cortisol aanwezig is. Wanneer deze concentratie berekend wordt met behulp van de 43

calibratiecurve, wordt een waarde van 14,63 bekomen. De concentraties van de andere calibratiecurvestalen worden berekend door de hoeveelheid cortisol in de blanco op te

0,8

0,8

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Respons

Respons

tellen bij de hoeveelheid cortisol waarmee elk staal belast werd.

0,4 0,3

y = 0,003x + 0,0735 R² = 0,9799

0,2

0,4 0,3 0,2

0,1

0,1

0

0 0

100 200 Concentratie (ppb)

y = 0,0032x + 0,0468 R² = 0,9973

0

300

100 200 Concentratie (ppb)

300

Figuur 4.6: links: calibratiecurve van stalen 2 tot en met 6, rechts: calibratiecurve van stalen 2 tot en met 6 zonder staal 3 In deze set-up liggen de piekoppervlaktes van het quality control staal voor en na de run vrij hoog en verschillen niet echt veel, wat erop duidt dat het toestel niet vervuild wordt gedurende de run en dat de reproduceerbaarheid van de stalen gelijk blijft. 4.1.6. Resultaten set-up 5 Omdat de resultaten van set-up 4 veelbelovend waren, werd beslist de kwaliteit van het protocol te onderzoeken op haarstalen van al dan niet gestresseerde volwassenen als laatste test alvorens de kind-haarstalen te analyseren. De gebruikte methode was analoog als deze in set-up 4, rekening houdend met de beslissing die werd genomen over de wasstappen, namelijk 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water. Na ultracentrifugatie was heel weinig centrifugaat beschikbaar van staal 21 en 22, om over te brengen in de HPLC vials. Dit beïnvloedde bijgevolg de resultaten. Op de chromatogrammen van deze stalen is helemaal niets te zien. Tijdens de procedure werd 44

reeds opgemerkt dat deze stalen een andere kleur hadden. Achteraf bleek het om haarstalen te gaan die gekleurd waren, wat de verstopping van de ultracentrifugefilter en het resultaat op de chromatogrammen kan verklaren. Bij de calibratiecurvestalen zijn de piekoppervlaktes van cortisol en IS zeer laag. Dit doet vermoeden dat aan deze stalen waarschijnlijk geen IS werd toegevoegd waardoor er niet gecorrigeerd wordt voor eventuele fouten en verliezen gedurende de procedure. Deze test zal daarom herhaald worden (zie resultaten set-up 6). Bij de haarstalen van de controle en de gestresseerde volwassenen worden ook zeer lage waarden van cortisol teruggevonden wat mogelijks duidt op verontreiniging van het toestel. Omwille van deze twee problemen zal deze set-up volledig herhaald worden na grondige reiniging van de massaspectrometer. 4.1.7. Resultaten set-up 6 Op de chromatogrammen van de gestresseerde- en controlestalen is meestal slechts één van de fragmentionen te detecteren of zoals bij de stalen S18, S14 en C5 zelfs helemaal geen (figuur 4.7). Hierdoor kan niet met zekerheid gezegd worden dat het toestel cortisol detecteert, aangezien voor de bevestiging van de te analyseren component twee fragmentionen nodig zijn. Bovendien is de piekoppervlakte van de gedetecteerde fragmentionen ook vaak heel laag.

Figuur 4.7: chromatogram van een staal waar geen enkel fragmention van cortisol te zien is. Ook voor wat betreft de stalen van de calibratiecurve belast met 10, 20 en 30 ppb cortisol is slechts 1 fragmention te zien waarvan de concentratie zeer laag is. Net zoals in setup 4 is ook hier te zien dat een blanco haarstaal in principe niet bestaat, daarom moeten de stalen gekwantificeerd worden na correctie van de calibratiecurve. De calibratiecurve wordt gecorrigeerd door bepaling van de hoeveelheid cortisol in het blanco staal. De concentratie 45

van dit staal wordt in rekening gebracht voor de berekening van de hoeveelheid cortisol aanwezig in de andere stalen. 2,5

Respons

2 1,5 1

y = 0,0043x + 0,1191 R² = 0,9937

0,5 0 0

200 400 Concentratie (ppb)

600

Figuur 4.8: Calibratiecurve

De hoeveelheid cortisol in het blanco staal wordt berekend aan de hand van de vergelijking van de calibratiecurve (figuur 4.8) en geeft een waarde van 27,70 ppb. Dan wordt een nieuwe calibratiecurve (figuur 4.9) gemaakt met op de x-as de nieuwe concentratie (= de hoeveelheid cortisol belast + 27,70 ppb) en op de y-as de respons. 2,5

Respons

2

y = 0,0043x - 0,0067 R² = 0,9942

1,5 1 0,5 0 0

200 400 Concentratie (ppb)

600

Figuur 4.9: Calibratiecurve na bepaling concentratie blanco De concentratie cortisol in de haarstalen wordt weergegeven in tabel 4.5 en berekend aan de hand van de nieuwe calibratiecurve geïllustreerd in figuur 4.9. Deze concentraties zijn heel erg laag en liggen behalve bij S15 altijd onder de geschatte detectielimit (LOD) van 20 ppb. Dit is de laagst gemeten waarde waaruit de aanwezigheid van de analyt met redelijke statistische zekerheid kan worden bepaald en wordt berekend aan de hand van volgende formule:

46

LOD = 3 SD/r Waarin: LOD = detectielimiet SD = standaarddeviatie op het snijpunt van de calibratiecurve met de y-as r = richtingscoëfficiënt van de calibratiecurve

(4.1)

Tabel 4.5: Resultaten van stress en controle stalen Staal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Piekopp cortisol stress S3 stress S1 stress S18 stress S14 stress S10 stress S16 stress S19 stress S15 controle C5 stress S11 stress S20 stress S9 controle C9 stress S17

9,177

41,60 24,85 21,09 357,0 5,746 37,40 18,28 3,605 8,231

Piekopp IS Respons 622,61 904,56 971,99 523,16 810,63 828,40 921,49 829,41 206,66 1094,31 894,34 893,42 498,65 447,57

Concentratie

0,01000

3,88

0,05100 0,03000 0,02300 0,4300

13,42 8,54 6,91 101,56

0,005000 0,04200 0,02000 0,007000 0,01800

2,72 11,33 6,21 3,19 5,74

Ook de concentraties van de stalen uit set-up 5 die heropgelost werden in 30 µl mobiele fase liggen onder de geschatte detectielimiet van 20 ppb (resultaten hier niet weergegeven). Deze resultaten zijn dus niet betrouwbaar en kunnen niet gebruikt worden om aan de PSS score gecorreleerd te worden. Wanneer deze resultaten vergeleken worden met deze uit set-up 4 zijn ze beduidend slechter. In set-up 4 was de gevoeligheid veel beter en lagen de concentraties van de IS veel hoger. Bij de stalen uit set-up 4 waarvan de kolommen gewassen werden met 2 mL natriumacetaatbuffer (pH 4,8), 2 mL water, 1,5 mL natriumcarbonaat 10 % en 2 mL water lagen de piekoppervlaktes van de IS tussen 2158,81 en 3627,74 terwijl in deze set-up de piekoppervlaktes van de IS tussen de 206,661 en 1094,311 liggen. Oorzaken van deze verlaagde IS piekoppervlaktes kunnen zijn dat het toestel nog niet perfect staat of dat de methode niet of onvoldoende werkt. De eventuele oorzaken van de lage waarden gedetecteerd in de teststalen kunnen dezelfde zijn als deze voor de IS alsook het feit dat ze reeds te lang bewaard zijn (sinds september 2010 in koelkast) waardoor cortisol bijvoorbeeld 47

kan gedegradeerd zijn. Hiervoor zijn in de literatuur echter geen indicaties. Een laatste opmerking hierbij is dat zowel in set-up 4 als in deze set-up wel cortisol gevonden wordt in het kappershaar ondanks het feit dat dit niet afkomstig is van de vertex posterior. De detectielimiet van de huidige methode (set-up 5 en 6) is te hoog om lage fysiologische cortisol concentraties te kunnen detecteren. Dit doet ons besluiten dat deze methode nog niet optimaal is om de haarstalen van de kinderen te analyseren. 4.1.7. Resultaten set-up 7 In dit experiment wordt het protocol van Raul et al. (2004) in vergelijking met dit van Becue et al. (2011) getest. Ondanks de extra vloeistof/vloeistofextractie stap, die het staal zuiverder zou moeten maken, ligt de S/N (signaal/ruis) verhouding nog steeds hoog (er is dus niet minder ruis dan wanneer deze extra stap niet wordt uitgevoerd). Hoogstwaarschijnlijk heeft het toestel, ondanks de grondige reinigingsbuurt, nog niet zijn zelfde performantie terug bereikt als in set-up 4. Bij de 8 stalen waar de procedure van Raul et al. (2004) gevolgd werd, wordt vaak geen tweede ion gedetecteerd. Zowel de piekoppervlaktes van cortisol als deze van cortisol-D4 liggen zeer laag. Dit ondanks het feit dat de piekoppervlakte van het quality control staal dat voor de run geïnjecteerd werd ongeveer gelijk is aan de piekoppervlakte van het quality control staal dat na de run werd geïnjecteerd. De resultaten van deze laatste set-up zijn dus ook onvoldoende om deze methode verder te gebruiken.

48

5. CONCLUSIE De hoofddoelstelling van dit onderzoek was het ontwikkelen van een accurate analysemethode voor de bepaling van cortisol in haar. Bij het einde van dit thesisonderzoek zijn we hier echter niet in geslaagd. Uit de verschillende experimenten is gebleken dat de procedure van Becue et al. (2011) de beste resultaten geeft ondanks het feit dat dit protocol niet specifiek ontwikkeld werd in het kader van stress onderzoek bij mensen. Desondanks is deze procedure momenteel nog niet optimaal en nog vatbaar voor verbeteringen. De methodes van Cirimele et al. (1999) en Raul et al. (2004) daarentegen werden wel specifiek ontwikkeld voor de bepaling van cortisol in mensenhaar maar geven bij ons geen goede resultaten, waardoor deze protocols onbruikbaar worden geacht. Er zijn verschillende onderliggende factoren die ervoor kunnen zorgen dat geen betrouwbare resultaten bekomen worden. Een eerste factor is de gevoeligheid van het toestel die idealiter hoger zou moeten liggen. Wanneer cortisol concentraties uit de literatuur bekeken worden, liggen deze tussen 5 en 91 pg/mg (Raul et al., 2004), sommige rapporteren zelfs waarden van 3,28-24,83 pg/mg (Gao et al.,2010). Aangezien onze detectielimiet geschat is rond 20 ppb, kunnen de bekomen resultaten niet als betrouwbaar worden beschouwd. Het is ook zo dat de waarden die beschreven worden in de literatuur voornamelijk gelden voor volwassenen, slechts in één artikel (Yamada et al., 2007) worden cortisolwaarden tussen 44,58 pg/mg en 3175 pg/mg gerapporteerd voor baby’s. Deze cortisolconcentraties werden echter gedetecteerd met behulp van ELISA en kunnen daarom niet gebruikt worden als richtwaarden voor onze methode. Het is dus onduidelijk of de concentraties bij kinderen gelijkaardig, hoger of lager zullen liggen. Daarom is het van groot belang dat de detectielimiet veel lager komt te liggen. Hieraan kan in de toekomst nog gewerkt worden. Een tweede factor is de duur van bewaring van de haarstalen. Het is nog nooit officieel onderzocht hoelang haarstalen bewaard kunnen blijven, en onder welke omstandigheden, zonder verlies aan cortisol over de tijd (eventuele degradatie van cortisol in haarstalen is niet uit te sluiten). De Society of Hair Testing (http://www.soht.org) vermoedt echter geen problemen indien de stalen stabiel worden bewaard, wat in dit onderzoek wel het geval was. Toch is een belangrijke aanbeveling voor verder onderzoek het 49

opstellen van een test-design waarin stalen van dezelfde personen over de tijd worden geanalyseerd om eventuele degradatie van cortisol of dergelijke tijdens bewaring op te sporen en daaruit concrete aanbevelingen voor de bewaring van haar voor cortisolanalyse te formuleren. Bovendien bestaat er ook nog onduidelijkheid over de mate en de manier van cortisolincorporatie in haar. Bijgevolg is het dus ook niet geweten in welke mate dit kan verschillen van persoon tot persoon en of andere factoren zoals leeftijd en geslacht hier een bepaalde rol in spelen. Eventuele fouten die gemaakt werden tijdens het uitvoeren van de verschillende procedures kunnen een derde verklarende factor zijn. Verder onderzoek door een ervaren laborante zal dit uitwijzen, er zal een nieuwe calibratiecurve gemaakt worden met enkel cortisol en het toestel zal opnieuw grondig gereinigd worden. Indien deze resultaten veelbelovend zijn, kan de techniek verder geoptimaliseerd worden in het labo. Indien niet dan is het waarschijnlijk beter om een volledig nieuwe methode te ontwikkelen. Aangezien geen definitieve methode werd bekomen, konden de kind-haarstalen niet geanalyseerd worden. Bijgevolg kunnen deze ook niet vergeleken worden met de stressscores van de CLES-vragenlijsten, wat een tweede doelstelling van dit onderzoek was. Volgens de vragenlijsten lopen 18,9% van de kinderen een bepaald risico voor gebeurtenissen in de periode van 0-6 maanden geleden. Dit wil zeggen dat 18,9% van de kinderen voor deze periode een hogere score bekomen dan de vooropgestelde waarde van de vragenlijst. We vermoeden dat bij deze kinderen de cortisol waarden beduidend hoger zouden zijn. Deze hypothese kon echter niet worden onderzocht. Bij volwassenen werd reeds aangetoond dat haarcortisol een goede biomerker is voor stress. Dit onderzoek wou dit gegeven ook bevestigen bij kinderen en een pioniersstudie zijn voor verder epidemiologisch onderzoek naar stress bij kinderen. Momenteel blijkt het grootste obstakel echter de beschikbaarheid van een betrouwbare analysemethode. Een belangrijke persoonlijke vaststelling van dit thesisonderzoek is het belang van een goede analysemethode voor wetenschappelijk onderzoek en dat technieken en methoden beschreven in de literatuur niet noodzakelijkerwijs reproduceerbaar zijn.

50

6. LITERATUURLIJST Ahrens, W.; Bammann, K.; de Henauw, S.; Halford, J.; Palou, A.; Pigeot, I.; Siani, A.; Sjöström, M. (2006). Understanding and preventing childhood obesity and related disorders-IDEFICS: A European multilevel epidemiological approach. Nutrition, metabolism and cardiovascular diseases, 16, 302-308. Athanasou, J. A. (2001). Test review of the Coddington Life Events Scale. In : The fifteenth mental measurements yearbook, Plake, J. C.; Impara, J. C.; Spies, R. A. (Eds). Attar, B.; Guerra, N.; Tolan, P. (1994). Neighborhood disadvantage, stressful life events and adjustments in urban elementary-school children. Joural of clinical child psychology, 23, 391400. Becue, I.; Bovee, T.F.H.; Van Poucke, C.; Groot, M.J.; Nielen, M.W.F.; Van Peteghem, C. (2011). Applicability of a yeast bioassay in the detection of steroid esters in hair. Analytical and bioanalytical chemistry, 399, 1031-1039. Benjet, C.; Borges, G.; Medina-Mora, M.E.; Zambrano, J.; Cruz, C.; Mendez, E. (2009). Descriptive epidemiology of chronic childhood adversity in Mexican adolescents. Journal of adolescent health, 45, 483-489. Blount, R. L.; Simons, L. E.; Devine, K. A.; Jaaniste, T.; Cohen, L. L.; Chambers, C. R.; Hayutin, L. G. (2008). Evidence-based assessment of coping and stress in pediatric psychology. Journal of pediatric psychology, 33(9), 1021-1045. Brobeck, E.; Marklund, B.; Haraldsson, K., Berntsson, L. (2006). Stress in children: how fifthyear pupils experience stress in everyday life. Scandinavian journal of caring sciences, 21, 39. Charmandari, E.; Tsigos, C.; Chrousos, G. (2005). Endocrinology of the stress response. Annual Review Physiology, 67, 259-284. Cirimele, V.; Kintz, P.; Dumestre, V.; Goullé, J.P.; Ludes, B. (2000). Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionspray mass spectrometry. Forensic Science International, 107, 381-388.

51

Coddington, R. D. (1972). The significance of life events of etiologic factors in the diseases of children-2. Study of normal population. Journal of psychosomatic research, 16, 205-213. Cohen, S.; Kamarck, T.; Mermelstein, R. (1983). A global measure of perceived stress. Journal of health and social behavior, 24, 385-396. Delahaut, P.; Jacquemin, P.; Colemonts, Y.; Dubois, M.; De Graeve, J.; Deluyker, H. (1997). Quantitative determination of several synthetic corticosteroids by gas chromatography-mass spectrometry

after

purification

by

immunoaffinity

chromatography.

Journal

of

Chromatography, 696, 203-215. Eisen, M. L.; Goodman, G. S. (1998). Trauma, memory, and suggestibility in children. Developmental psychopathology, 10, 717-738. Faraday, M. M. (2006). Stress revisited: a methodological and conceptual history. In: Nutrients, stress and medical disorders, Yehuda, S.; Mostofsky, D. I. (Eds.), Humana Press, New Jersey, USA, pp. 3-20. Gao, W.; Qiaozhen, X.; Jin, J.; Qiao, T.; Wang, H.; Chen, L.; Deng, H.; Lu, Z. (2010). HPLC-FLU detection of cortisol distribution in human hair. Clinical Biochemistry, 43, 677-682. Gow, R.; Thomson, B.; Rieder, M.; Van Uum, S.; Koren, G. (2010). An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic science international, 196; 32-37. Grant, K. E.; Compas, B. E.; Stuhlmacher, A. F.; Thurm A. E.; McMahon, S. D.; Halpert, J. A. (2003). Stressors and child and adolescent psychopathology: Moving from markers to mechanisms of risk. Psychological Bulletin, 129, 447-466. Gunnar, M.; Connors, J.; Isensee, J. (1989). Lack of stability in neonatal adrenocortical reactivity because of rapid habituation of the adrenocortical response. Developmental psychobiology, 22, 221-233. Gunnar, M.; Hertsgaard, L.; Larson, M.; Rigatuso, J. (1992). Cortisol and behavioral responses to repeated stressors in the human newborn. Developmental psychobiology, 24, 487-505.

52

Hanrahan, K.; McCarthy, A. M.; Kleiber, C.; Lutgendorf, S.; Tsalikian, E. (2006). Strategies for salivary cortisol collection and analysis in research with children. Applied nursing Research, 19, 95-101. Jusko, W. J.; Pyszczynski, N. A.; Bushway, M. S.; D’Ambrosio R.; Mis, S. M. (1994). Fifteen years of operation of a high-performance liquid chromatographic assay for prednisolone, cortisol and prednisone in plasma. Journal of Chromatography, 658, 47-54. Kaplan, N. M. (1996). The adrenal glands. In: Textbook of endocrine physiology, Griffin, J. E.; Ojeda, S. R. (Eds.),Oxford university press, Oxford, UK, pp.284-313. Kirschbaum, C.; Tietze, A.; Skoluda, N.; Dettenborn, L. (2009). Hair as a retrospective calendar of cortisol production-increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology, 34, 32-37. Knight, R.B.; Atkins, A.; Eagle, C.J.; Evans, N.; Finkelstein, J.W.; Fukushima, D.; Katz, J.; Weiner, H. (1979). Psychological stress, ego defenses and cortisol production in children hospitalized for elective surgery. Psychosomatic medicine, 41, 40-49. Lazarus, R. (1999). Stress and emotion. In: Stress and emotion: A new synthesis, Springer, New York, USA. Lingeman, H. (2000). Vaste-fase extractive (SPE). In: Chromatografie in de praktijk, monsterbewerking in de chromatografie. Baars, B.; van den Berg, J.; Janssen H.G.; Schoenmakers, P.; Tijssen, R.; Vonk, N. (Eds.), ten hagen en stam, Den haag, Nederland. Logunov, V. P.; Mazkhar, S.A. ( 1994). Chromatographic measurement of urinary steroids in patients with psoriasis. Klinicheskaia Laboratornaia diagnostika, 4, 11-13. Lupien, S.J.; King, S.; Meaney, M.J.; McEwen, B.S. (2001). Can poverty get under your skin? Basal cortisol levels and cognitive function in children from low and high socioeconomic status. Development and psychopathology, 13, 653-676. Miller, G.; Chen, E.; Zhou, E. (2007). If it goes up, must it come down? Chronic stress and the hypothalamic-pituitary-adrenaocortical axis in humans. Psychological Bulletin, 133, 25-45.

53

Niessen, W. (1997). LC-MS. In: Chromatografie in de praktijk: Vloeistofchromatografie, Baars, B.; van den berg, J.; Janssen, H.G.; Maaskant, J.; Schoenmakers, P.; Tijssen, R.; Vonk, N. (Eds.), ten Hagen and Stam, Den Haag, Nederland. Portzky, G.; De Wilde, E .J.; van Heeringen, K. (2008). Deliberate self-harm in young people: differences in prevalence and risk factors between the Netherlands and Belgium. European Child & Adolescent Psychiatry, 17, 179-186. Quattro-micro-users’s guide. Quattro-LC-operator-training-course. Raul, J-S.; Cirimele, V.; Ludes, B.; Kintz, P. (2004). Detection of physiological concentration sof cortisol and cortisone in human hair. Clinical biochemistry, 37, 1105-1111. Romano, J. (1997). Stress and coping: A qualitative study of 4th and 5th graders. Elementary school guidance and counseling, 31, 273-283. Ryan-Wenger, N.; Sharrer, V.; Campbell, K. (2005). Changes in children’s stressors over the past 30 years. Pediatric nursing, 31, 282-291. Salmon, K. (2001). Remembering and reporting by children: The influence of cues and props. Clinical psychology review, 21, 267-300. Sauvé, B.; Koren, G.; Walsh, G.; Tokmakejian, S.; Van Uum, S. H. M. (2007). Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clinical and investigative medicine, 30, 183-191. Sharrer, V.; Ryan-Wenger, N. (1995). A longitudinal study of age and gender differences of stressors and coping strategies in school-aged children. Journal of pediatric health care, 9, 123-130. Shibasaki, H.; Furuta, T.; Kasuya, Y. (1997). Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography-thermospray mass spectrometry using stable isotope dilution. Journal of Chromatgraphy, 69, 7-14. Skybo, T.; Buck, J. (2007). Stress and coping responses to proficiency testing in school-age children. Pediatric nursing, 33, 410-418. 54

Taxis, J.; Rew, L.; Jackson, K.; Kouzekanani, K. (2004). Protective resources and perceptions of stress in a multi-ethnic sample of school-age children. Pediatric nursing, 30, 477-487. Tsigos, C.; Chrousos, G. P. (2002). Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress. Journal of Psychosomatic Research, 52, 865-871. Turner, R. J.; Wheaton, B. (1997). Checklist measurement of stressful life events. In: Measuring stress: a guide for health and social scientists, Cohen, S.; Kessler, R. C.; Gordon, L. U. (Eds.), Oxford university press, New York, USA, pp. 29-58. Wenning, R. (1999). Potential problems with the interpretation of hair analysis results. Forensic science international, 107, 5-12. Yamada, J.; Stevens, B.; de Silva, N.; Gibbins, S.; Beyene, J.; Taddio, A.; Newman, C.; Koren, G (2007). Hair cortisol as a potential biologic marker of chronic stress in hospitalized neonates. Neonatology, 92, 42-49. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.htmL ( 3-03-2011) http://www.waters.com ( 5-03-2011) http://www.idefics.eu ( 9-05-2011) http://www.soht.org ( 9-05-2011) http://www.soltecventures.com/tcep.htm ( 12-05-2011)

55

7. BIJLAGEN Bijlage 1: Commissie voor medische ethiek (aanvraag voor staalafname bij kinderen) Bijlage 2: CLES-vragenlijsten Bijlage 3: Vragenlijsten in verband met basisemoties Bijlage 4: Commissie voor medische ethiek (goedkeuring voor staalafname bij volwassenen) Bijlage 5: PSS-vragenlijst

56

Bijlage 1 : commissie voor medische ethiek-aanvraag voor staalafname bij kinderen

Afz: Commissie voor Medische Ethiek

COMMISSIE VOOR MEDISCHE ETHIEK

Maatschappelijke Gezondheidszorg Blok A - 2de Verdieping Prof. dr. Stefaan DE HENAUW ALHIER

Voorzitter: Prof. Dr. R. Rubens Secretaris: Prof. Dr. D. Matthys

CONTACT Secretariaat

TELEFOON +32 (0)9 332 56 13 +32 (0)9 332 59 25

FAX +32 (0)9 332 49 62

E-MAIL [email protected]

UW KENMERK

ONS KENMERK 2009/579

DATUM 17-dec-09

KOPIE Zie "CC"

BETREFT

Advies voor monocentrische studie met als titel: Het verband tussen chronische psychosociale stress en de lichaamssamenstelling van kinderen van 6-10 jaar (IDEFICS) (Doctoraatsstudente Barbara Vanaelst) Belgisch Registratienummer: B67020097277 * Protocol * Diverse - Informatie omtrent vragenlijst - goedkeuring BOF-project dd. 21/10/08 * Begeleidende brief dd. 12/11/2009 * Adviesaanvraagformulier dd. 12/11/2009 * (Patiënten)informatie- en toestemmingsformulier (cfr. Initieel goedgekeurde documenten en amendementen project 2007/243)

Advies werd gevraagd door: Prof. dr. S. DE HENAUW ; Hoofdonderzoeker BOVENVERMELDE DOCUMENTEN WERDEN DOOR HET ETHISCH COMITÉ BEOORDEELD. ER WERD EEN POSITIEF ADVIES GEGEVEN OVER DIT PROTOCOL OP 15/12/2009 Vooraleer het onderzoek te starten dient contact te worden genomen met het Trial Bureau (09/332 89 99). THE ABOVE MENTIONED DOCUMENTS HAVE BEEN REVIEWED BY THE ETHICS COMMITTEE. A POSITIVE ADVICE WAS GIVEN FOR THIS PROTOCOL ON 15/12/2009 Before initiating the study, please contact the Trial Bureau (09/332 89 99). DIT ADVIES WORDT OPGENOMEN IN HET VERSLAG VAN DE VERGADERING VAN HET ETHISCH COMITE VAN 15/12/2009 THIS ADVICE WILL APPEAR IN THE PROCEEDINGS OF THE MEETING OF THE ETHICS COMMITTEE OF 15/12/2009

° Het Ethisch Comité werkt volgens 'ICH Good Clinical Practice' - regels ° Het Ethisch Comité beklemtoont dat een gunstig advies niet betekent dat het Comité de verantwoordelijkheid voor het onderzoek op zich neemt. Bovendien dient U er over te waken dat Uw mening als betrokken onderzoeker wordt weergegeven in publicaties, rapporten voor de overheid enz., die het resultaat zijn van dit onderzoek.

° In het kader van 'Good Clinical Practice' moet de mogelijkheid bestaan dat het farmaceutisch bedrijf en de autoriteiten inzage krijgen van de originele data. In dit verband dienen de onderzoekers erover te waken dat dit gebeurt zonder schending van de privacy van de proefpersonen.

° Het Ethisch Comité benadrukt dat het de promotor is die garant dient te staan voor de conformiteit van de anderstalige informatie- en toestemmingsformulieren met de nederlandstalige documenten.

° Geen enkele onderzoeker betrokken bij deze studie is lid van het Ethisch Comité. ° Alle leden van het Ethisch Comité hebben dit project beoordeeld. (De ledenlijst is bijgevoegd)Universitair Ziekenhuis Gent

De Pintelaan 185,B- 9000 Gent www.uzgent.be

09/332 56 13 [email protected]

Wendy Van de Velde

./.

CONTACT Secretariaat

TELEFOON +32 (0)9 332 56 13 +32 (0)9 332 59 25

FAX +32 (0)9 332 49 62

E-MAIL [email protected]

UW KENMERK

ONS KENMERK 2009/579

DATUM 17-dec-09

KOPIE Zie "CC"

Vervolg blz. 2 van het adviesformulier betreffende project EC UZG 2009/579

° The Ethics Committee is organized and operates according to the 'ICH Good Clinical Practice' rules. ° The Ethics Committee stresses that approval of a study does not mean that the Committee accepts responsibility for it. Moreover, please keep in mind that your opinion as investigator is presented in the publications, reports to the government, etc., that are a result of this research.

° In the framework of 'Good Clinical Practice', the pharmaceutical company and the authorities have the right to inspect the original data. The investigators have to assure that the privacy of the subjects is respected.

° The Ethics Committee stresses that it is the responsibility of the promotor to guarantee the conformity of the non-dutch informed consent forms with the dutch documents.

° None of the investigators involved in this study is a member of the Ethics Committee. ° All members of the Ethics Committee have reviewed this project. (The list of the members is enclosed)

Prof. dr. R. RUBENS Voorzitter / Chairman CC: UZ Gent UZ Gent - Beheer en algemene directie FAGG -

Universitair Ziekenhuis Gent Wendy Van de Velde De Pintelaan 185,B- 9000 Gent www.uzgent.be

09/332 56 13 [email protected]

Bijlage 2: CLES vragenlijst ID-nummer 44395

Hoe vaak zijn volgende gebeurtenissen in het voorbije jaar gebeurd? 0-3 mnd

Nee

4-6 mnd

7-9 mnd

10-12 mnd

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

4. Zijn je ouders gescheiden

1

0

1

2+ 0

0

1

2+

0

1

2+

5. Stonden je ouders op het punt te scheiden

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

6. Is er een probleem ontstaan tussen je ouders

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

7. Is er een probleem tussen je ouders opgelost

1

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

8. Is één van je ouders opnieuw getrouwd

1

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

9. Is er een broer of zus geboren

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

10.Is je vader of moeder zijn/haar werk verloren

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

11.Zijn je ouders veel meer geld gaan verdienen

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

12.Zijn je ouders veel minder geld gaan verdienen

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

13.Was één van je ouders minder vaak thuis omdat hij/zij harder moest werken

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

14.Is één van je ouders buitenshuis beginnen werken

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

15.Is er een nieuwe volwassene bij jullie komen wonen

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

16.Ben je naar het eerste leerjaar gegaan

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

17.Ben je van school veranderd

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

18.Ben je een jaar blijven zitten

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

19.Werd je van school gestuurd

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

20.Is er een probleem ontstaan tussen je ouders en jezelf

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

1. Moest één van je ouders naar het ziekenhuis 2. Moest je broer of zus naar het ziekenhuis 3. Moest je zelf naar het ziekenhuis

1

2+

Bijlage 2: CLES vragenlijst 44395

0-3 mnd

Nee 21.Is er een probleem tussen je ouders en jezelf opgelost 22.Heb je iets wat je graag wilde niet kunnen bereiken 23.Moest je voor de jeugdrechter/rechtbank komen 24.Ben je met drugs in aanraking gekomen

4-6 mnd

7-9 mnd

10-12 mnd

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

1

0

1

2+ 0

0

1

2+

0

1

2+

1

2+

25.Ben je gestopt met drugs te gebruiken

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

26.Heb je een volwassene gevonden die jou respecteert

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

27.Heb je iets bijzonders bereikt dat je graag wou

1

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

28.Ben je uitgenodigd om bij een groep te komen

1

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

0

1

2+

29.Heb je geschitterd in een sport of andere activiteit

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

30.Is één van je ouders gestorven

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

31.Is je broer of zus gestorven

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

33.Is een goede vriend van jou gestorven

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

34.Is je huisdier gestorven

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

35.

1

0

1

2+ 0

1

2+

0

1

2+ 0

1

2+

32.Is één van je grootouders gestorven

bijlage 3: vragenlijst coping en basisemoties ID-nummer

31386

Wat doe je wanneer je je zorgen maakt of van streek bent of problemen hebt? Met iemand praten

nooit

soms

vaak

Mezelf de schuld geven dat ik problemen heb

nooit

soms

vaak

Kwaad worden

nooit

soms

vaak

In mijn kamer blijven

nooit

soms

vaak

Denken wat ik doe bij hetzelfde probleem

nooit

soms

vaak

Iets snoepen of eten

nooit

soms

vaak

Proberen aan iets anders te denken

nooit

soms

vaak

Denken hoe ik het kan oplossen

nooit

soms

vaak

Hoe voelde je je de laatste tijd? Duid een cijfer aan tussen 0 (nee) en 10 (ja).

Blij 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Ja

Nee

Boos 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Ja

Nee

Verdrietig 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Ja

Nee

Bang 0 Nee

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Ja

bijlage 4: commissie voor medische ethiek - goedkeuring staalafname volwassenen

bijlage 5: PSS-vragenlijst Instructies bij het invullen van de Perceived Stress Scale De vragen in deze vragenlijst zijn gericht op uw gevoelens en gedachten in de afgelopen zes maanden. In elk item zal u gevraagd worden hoe vaak u bepaalde gevoelens en gedachten hebt ervaren. Hoewel sommige vragen op elkaar lijken, zijn er toch verschillen en dient u elke vraag te behandelen als een aparte vraag. De beste manier van invullen is om elke vraag vrij snel te beantwoorden. Dat betekent dat het niet de bedoeling is een optelling te maken van hoe vaak u zich op die manier hebt gevoeld, wel van een aanvaardbare inschatting te maken. Voor elke vraag kan u uit de volgende mogelijke antwoorden een keuze maken: 0 = nooit 1 = bijna nooit 2 = soms 3 = regelmatig 4 = heel vaak De voorbije zes maanden,

1. hoe vaak bent u van streek geweest omdat zich iets onverwachts voordeed? 2. hoe vaak voelde u zich onmachtig om de belangrijke zaken in uw leven te controleren? 3. hoe vaak voelde u zich nerveus en gestresseerd? 4. hoe vaak overwon u succesvol ergerlijke hindernissen in het leven? 5. hoe vaak heeft u het gevoel gehad op een effectieve manier om te kunnen gaan met belangrijke veranderingen in uw leven? 6. hoe vaak heeft u zich zelfzeker gevoeld inzake uw bekwaamheid om persoonlijke problemen aan te pakken? 7. hoe vaak heeft u kunnen ervaren dat de zaken volgens uw wens verliepen? 8. hoe vaak heeft u het gevoel gehad dat u niet om kon met alle zaken die u diende te doen? 9. hoe vaak voelde u zich in staat uw ergernissen in uw leven te controleren? 10. hoe vaak heeft u het gevoel gehad uw zaken onder controle te hebben? 11. hoe vaak bent u kwaad geworden omwille van dingen die zich buiten uw controle voordeden? 12. hoe vaak heeft u zitten nadenken over dingen die u nog moet zien te bereiken? 13. hoe vaak heeft u zelf kunnen controleren hoe u uw tijd doorbrengt? 14. hoe vaak heeft u gevoeld dat problemen zich zo hoog opstapelden dat u ze niet meer aankon?