Academiejaar ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN EEN METHODE VOOR DE GELIJKTIJDIGE BEPALING VAN VANCOMYCINE, TEICOPLANINE EN COLISTINE

UNIVERSITEIT GENT

UNIVERSITAIR ZIEKENHUIS GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

LABORATORIUM VOOR KLINISCHE BIOLOGIE

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie

24uurs lab Laboratorium voor Toxicologie

Academiejaar 2013-2014

ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN EEN METHODE VOOR DE GELIJKTIJDIGE BEPALING VAN VANCOMYCINE, TEICOPLANINE EN COLISTINE

Karen VANCOPPENOLLE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor Dr. V. Stove Commissarissen Prof. Dr. C. Stove Prof. Dr. W. Lambert

UNIVERSITEIT GENT

UNIVERSITAIR ZIEKENHUIS GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

LABORATORIUM VOOR KLINISCHE BIOLOGIE

Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie

24uurs lab Laboratorium voor Toxicologie

Academiejaar 2013-2014

ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN EEN METHODE VOOR DE GELIJKTIJDIGE BEPALING VAN VANCOMYCINE, TEICOPLANINE EN COLISTINE

Karen VANCOPPENOLLE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor Dr. V. Stove Commissarissen Prof. Dr. C. Stove Prof. Dr. W. Lambert

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

30 mei 2014

Promotor

Auteur

Dr. Apr. Veronique Stove

Karen Vancoppenolle

SAMENVATTING Het doel van deze masterproef is de ontwikkeling en validatie van een Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Tandem Massaspectrometrie (UHPLC-MS/MS) methode voor de gelijktijdige bepaling van de drie antibiotica vancomycine, teicoplanine en colistine. De ontwikkeling van deze methode gebeurt in het kader van therapeutische drug monitoring van deze antibiotica. Er is een methode ontwikkeld gebaseerd op het artikel van Tsai et al. [1] waarbij een optimalisatie is gebeurd van de chromatografische en massaspectrometrische parameters. Daarna is overgegaan tot de validatie van de ontwikkelde methode volgens de FDA richtlijnen, maar de methode bleek niet aan de vooropgestelde criteria te voldoen. Het matrixeffect-experiment heeft aangetoond dat de methode beperkingen heeft, wat ook al duidelijk was geworden tijdens het uittesten van accuraatheid en precisie. De validatie van de methode werd hierom stopgezet. De afwijkende resultaten konden verklaard worden door adsorptie van de drie peptide-antibiotica aan allerhande materialen. Vooral voor colistine bleek dit een bepalende factor te zijn. Na het uittesten van de invloed van diverse media en verschillende materialen, werd de PEEK-naald van de UHPLC-MS/MS vervangen door een roestvrij stalen naald. De resultaten verbeterden merkbaar door deze ingreep, waarop de validatie werd hernomen. Heruitvoeren van het matrixeffect-experiment leverde resultaten op die binnen de vooropgestelde criteria lagen. Deze proef werd gevolgd door een methodevergelijking met de immunoassay voor teicoplanine. Hieruit bleek dat de methode nog steeds niet aan de verwachtingen voldeed, aangezien er een grote variatie op de resultaten zat bij vergelijking van de twee methoden. Ook het within-run precisie experiment leverde bijkomend bewijs voor de onvolmaaktheid van de methode. Verder onderzoek zal deze bevindingen moeten uitklaren. Mogelijke oplossingen zijn echter niet meteen beschikbaar, aangezien dergelijke resultaten nog niet beschreven zijn in de literatuur. Mogelijk zal in de toekomst gekozen worden voor de ontwikkeling van twee afzonderlijke methoden, één voor colistine en één voor teicoplanine (voor vancomycine is een bijkomende methode minder belangrijk in het laboratorium). De momenteel ontwikkelde methode lijkt geschikt voor de afzonderlijke bepaling van colistine A en B. Voor de teicoplaninecomponenten zal echter een nieuwe methode ontwikkeld moeten worden.

DANKWOORD Ik dank in de eerste plaats mijn promotor Dr. Veronique Stove voor het mogelijk maken van deze masterproef, voor de begeleiding en voor het nalezen van deze masterproef. Daarnaast wil ik Prof. C. Stove en Prof. W. Lambert bedanken voor de opvolging en het nakijken van deze masterproef. Mijn dank gaat ook uit naar Prof. A. Verstraete van het laboratorium Toxicologie voor het beschikbaar stellen van de UHPLC-MS/MS, maar ook dank voor het meezoeken naar oplossingen en voor de begeleiding. Ik ben ook heel dankbaar voor de hulp en begeleiding van doctoraatsstudente Mieke Carlier. Zonder haar was deze masterproef niet mogelijk geweest. Haar volharding en haar passie voor wetenschap hebben indruk gemaakt. Ook bedankt aan de laboranten van laboratorium Toxicologie voor het gezelschap tijdens het laboratoriumwerk en voor hun technische ondersteuning. Speciale dank gaat uit naar alle bloeddonoren van het 24uurslab en het laboratorium Toxicologie, zonder hun plasma en serum was deze masterproef niet mogelijk geweest. Ook bedankt aan mijn ouders, zus en schoonbroer om in mij te geloven en om dit werk helemaal na te lezen, ook al was de inhoud onbegrijpelijk voor hen. Tenslotte wil ik ook nog mijn vriend bedanken, om mij steeds weer te motiveren om verder te gaan op moeilijke momenten.

INHOUDSOPGAVE 1

INLEIDING ........................................................................................................................................ 1 1.1

THERAPEUTISCHE DRUG MONITORING .................................................................................. 1

1.1.1

Algemene aspecten van Therapeutische Drug Monitoring............................................. 1

1.1.2

Toepassing van Therapeutische Drug Monitoring .......................................................... 1

1.2

VANCOMYCINE ........................................................................................................................ 2

1.2.1

Structuur en eigenschappen van vancomycine............................................................... 2

1.2.2

Indicatie van vancomycine en mechanismen van resistentie ......................................... 2

1.2.3

Toxiciteit .......................................................................................................................... 4

1.2.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor vancomycine ........................................ 4

1.3

TEICOPLANINE ......................................................................................................................... 5

1.3.1

Structuur en eigenschappen van teicoplanine ................................................................ 5

1.3.2

Indicatie van teicoplanine en mechanismen van resistentie .......................................... 6

1.3.3

Toxiciteit .......................................................................................................................... 7

1.3.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor teicoplanine ......................................... 7

1.4

COLISTINE ................................................................................................................................ 7

1.4.1

Structuur en eigenschappen van colistine ...................................................................... 7

1.4.2

Indicatie van colistine en mechanismen van resistentie................................................. 9

1.4.3

Toxiciteit ........................................................................................................................ 10

1.4.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor colistine .............................................. 10

1.5

BEPALINGSMETHODEN VOOR DE EERDER GENOEMDE ANTIOBIOTICA ............................... 11

1.5.1

Immunoassays ............................................................................................................... 11

1.5.2

LC-MS/MS ...................................................................................................................... 11

2

OBJECTIEVEN ................................................................................................................................. 12

3

MATERIALEN EN METHODEN ........................................................................................................ 14 3.1

MATERIALEN.......................................................................................................................... 14

3.1.1

Apparaten en toebehoren ............................................................................................. 14

3.1.2

Reagentia en chemicaliën.............................................................................................. 15

3.2

METHODEN ........................................................................................................................... 16

3.2.1

Aanmaak van standaarden en kwaliteitscontroles ....................................................... 16

3.2.1.1

Standaarden .............................................................................................................. 16

3.2.1.2

Kwaliteitscontroles .................................................................................................... 16

3.2.1.3

Interne Standaard...................................................................................................... 17

3.2.2

Chromatografische condities ........................................................................................ 17

3.2.3

Massaspectrometrische condities ................................................................................. 18

3.2.4

Staalvoorbereiding ........................................................................................................ 19

3.2.5

Bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine en colistine ........................ 19

3.2.5.1

Teicoplanine .............................................................................................................. 19

3.2.5.2

Colistine ..................................................................................................................... 22

3.2.6 3.2.6.1

Selectiviteit ................................................................................................................ 23

3.2.6.2

Precisie en accuraatheid............................................................................................ 23

3.2.6.3

Stabiliteit van de prodrug Colistimethaat Sodium (CMS) ......................................... 24

3.2.6.4

Matrixeffect en terugvinding .................................................................................... 24

3.2.7

4

Validatie ......................................................................................................................... 23

Karakterisatie van de adsorptie van de verschillende antibiotica ................................ 26

3.2.7.1

Invloed van de matrix ................................................................................................ 26

3.2.7.2

Invloed van verschillende materialen ....................................................................... 27

3.2.7.3

Invloed van de naald voor staalname ....................................................................... 27

3.2.7.4

Heruitvoeren van het matrixeffect............................................................................ 28

3.2.8

Methodevergelijking ..................................................................................................... 29

3.2.9

Within-Run Precisie ....................................................................................................... 30

RESULTATEN & DISCUSSIE ............................................................................................................. 31 4.1

Chromatografische condities ................................................................................................ 31

4.2

Massaspectrometrische condities ......................................................................................... 31

4.3

Interne Standaard.................................................................................................................. 33

4.4

Staalvoorbereiding ................................................................................................................ 33

4.5

Bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine en colistine ................................ 34

4.5.1

Teicoplanine .................................................................................................................. 34

4.5.2

Colistine ......................................................................................................................... 36

4.6

Validatie................................................................................................................................. 37

4.6.1

Selectiviteit .................................................................................................................... 37

4.6.2

Precisie en accuraatheid................................................................................................ 37

4.6.3

Stabiliteit van de produg CMS ....................................................................................... 39

4.6.4

Matrixeffect en terugvinding ........................................................................................ 39

4.7

Karakterisatie van de adsorptie ............................................................................................ 41

4.7.1

Invloed van de matrix .................................................................................................... 41

4.7.2

Invloed van verschillende materialen ........................................................................... 43

4.7.3

Invloed van de naald voor staalname ........................................................................... 44

4.7.4

Heruitvoeren van het matrixeffect................................................................................ 45

4.8

Methodevergelijking ............................................................................................................. 46

4.9

Within-Run Precisie ............................................................................................................... 48

5

CONCLUSIES................................................................................................................................... 50

6

LITERATUURLIJST ........................................................................................................................... 52

BIJLAGEN BIJLAGE 1:

INTERNATIONALISATION @ HOME

BIJLAGE 2:

TEICOPLANINE MONOGRAFIE

BIJLAGE 3:

COLISTINE MONOGRAFIE

BIJLAGE 4:

RESULTATEN ACCURAATHEID EN PRECISIE

BIJLAGE 5:

RESULTATEN INVLOED VAN DE MATRIX VOOR DE OVERIGE COMPONENTEN

BIJLAGE 6:

RESULTATEN INVLOED VAN VERSCHILLENDE MATERIALEN VOOR DE OVERIGE COMPONENTEN

BIJLAGE 7:

RESULTATEN

INVLOED

VAN

DE

STAALNAMENAALD

VOOR

DE

OVERIGE

COMPONENTEN BIJLAGE 8:

RESULTATEN

VOOR

PROCESEFFICIENTIE

HERUITGEVOERDE MATRIXEFFECT

EN

TERUGVINDING

VOOR

HET

LIJST MET AFKORTINGEN AUC:

Area Under the Curve

CMS:

Colistimethaat Sodium

FA:

Mierenzuur / Formic Acid

FDA:

Food and Drug Administration

FPIA:

Fluorescence Polarization Immunoassays

HM:

Hoge Massa Resolutie

HPLC-DAD:

High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector

hVISA:

Heteroresistente

Vancomycine-Intermediair-Resistente

Staphylococcus

aureus IA:

Immunoassay

IS:

Interne Standaard

LC-MS/MS:

Liquid Chromatography - Tandem Massaspectrometrie

LC-UV:

Liquid Chromatography – Ultraviolet Detectie

LLOQ:

Lower Limit Of Quantification

LM:

Lage Massa Resolutie

LPS:

Lipopolysacchariden

ME:

Matrixeffect

MIC:

Minimum Inhibitory Concentration

MRSA:

Methicilline-Resistente Staphylococcus aureus

PE:

Procesefficiëntie

Ph.Eur:

Europese Farmacopee

Pip D5:

Piperacilline D5

PMB:

Polymyxine B

PP:

Polypropyleen

QC:

Kwaliteitscontrole / Quality Control

RE:

Recovery/Terugvinding

TDM:

Therapeutische Drug Monitoring

UHPLC-DAD:

Ultra-High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector

UHPLC-MS/MS:

Ultra-High

Performance

Liquid

Chromatography

Massaspectrometrie VISA:

Vancomycine-Intermediair-Resistente Staphylococcus aureus

VRSA:

Vancomycine-Resistente Staphylococcus aureus

CV%:

Variatiecoëfficiënt, uitgedrukt als een percentage

-

Tandem

1 INLEIDING 1.1 THERAPEUTISCHE DRUG MONITORING 1.1.1

Algemene aspecten van Therapeutische Drug Monitoring

Therapeutische drug monitoring (TDM) is een medische discipline die een belangrijk onderdeel vormt van de klinische farmacologie. Het doel van TDM is om geneesmiddeltherapie te optimaliseren voor individuele patiënten door het bepalen van geneesmiddelconcentraties, waardoor het een vorm is van gepersonaliseerde geneeskunde. Hierbij wordt ernaar gestreefd om een zo hoog mogelijke therapeutische efficaciteit te bereiken in combinatie met een minimale toxiciteit. TDM vereist een multidisciplinaire

aanpak,

waarbij

er

wordt

samengewerkt

tussen

klinisch

biologen,

verpleegkundigen, artsen en apothekers [2]. Concentraties van geneesmiddelen worden bij TDM voornamelijk bepaald in plasma of serum, hoewel ook andere matrices zoals speeksel en gedroogde bloed spots aan belang winnen. Afhankelijk van het geneesmiddel, wordt de dal- of piekconcentratie bepaald. De dalspiegel is de concentratie van het geneesmiddel net voor het toedienen van een nieuwe dosis. Op dit tijdstip is de concentratie in principe op zijn laagste punt. Wanneer TDM specifiek wordt uitgevoerd omwille van mogelijke toxiciteit, dan zijn piekconcentraties de beste optie [2, 3]. Bepaling van geneesmiddelconcentraties gebeurt tegenwoordig vaak via immunoassays, maar in het laatste decennium hebben chromatografische methoden (bv. Liquid Chromatography - Tandem Massaspectrometrie (LC MS/MS)) een prominente plaats verworven bij TDM. Het belang van deze technieken gaat nog steeds in stijgende lijn, omwille van de hogere selectiviteit en sensitiviteit van chromatografische methoden in vergelijking met immunoassays (zie ook 1.5) [4]. 1.1.2

Toepassing van Therapeutische Drug Monitoring

Een geneesmiddel waarop TDM van toepassing is, voldoet ideaal gezien aan volgende voorwaarden: het geneesmiddel heeft een nauwe therapeutisch-toxische marge en een grote interindividuele variabiliteit. Een duidelijke relatie tussen concentratie en effect moet aanwezig zijn. Er mag geen meer eenvoudige methode beschikbaar zijn voor de opvolging van het effect van het geneesmiddel, zoals bijvoorbeeld bloeddrukmeting voor antihypertensiva. Hierbij kan de therapie immers getitreerd worden op basis van het effect. Ook patiënt-afhankelijke factoren spelen een rol. Zo kan het vermoeden van een interactie (met andere geneesmiddelen, voedsel, alcohol, etc.), van geneesmiddel-gerelateerde bijwerkingen of van toxiciteit aanleiding geven tot het opstarten van

1

TDM. Ook mogelijk geneesmiddelmisbruik, slechte therapietrouw en onverklaarbaar falen van de therapie kunnen de arts doen beslissen om TDM te doen bij een patiënt [5]. Traditioneel wordt TDM toegepast in 4 grote therapeutische gebieden, namelijk bij immunosuppressie, epilepsie, infectieziekten en psychiatrie [3].

1.2 VANCOMYCINE 1.2.1

Structuur en eigenschappen van vancomycine

Vancomycine is een glycopeptide antibioticum. De chemische structuur van vancomycine omvat een geglycosyleerd tricyclisch niet-ribosomaal peptide, waarbij het peptidedeel overheerst ten opzichte van het suikergedeelte (zie Figuur 1-1). Het is een zeer omvangrijke structuur, met een hoog moleculair gewicht van 1449,3 Da. Vancomycine is oplosbaar in water, maar niet in apolaire organische solventen [6]. De eliminatie van het antibioticum gebeurt voornamelijk via de nieren, waarbij tot 90% onveranderd in de urine terecht komt. Omwille hiervan wordt bij dosisaanpassing van vancomycine zowel rekening gehouden met de creatinineklaring als met de steady-state serumconcentraties van het antibioticum [7]. Vancomycine is voor een deel eiwitgebonden. Dit percentage is echter sterk variabel. Naargelang de studie wordt bijvoorbeeld een proteïnebinding van 3,7 – 47% [8] tot zelfs 7,9 – 71% [9] gevonden. Vancomycine is een tijdsafhankelijk antibioticum, waarbij de oppervlakte onder de curve (AUC) over de minimale inhiberende concentratie (MIC) (= AUC/MIC) bepalend is voor de efficaciteit [10]. In de praktijk wordt echter eerder de dalspiegel bepaald, aangezien deze een goede correlatie vertoont met AUC/MIC en minder bloedafname vereist [5, 11]. 1.2.2

Indicatie van vancomycine en mechanismen van resistentie

Vancomycine is enkel werkzaam bij infecties met gram-positieve bacteriën. Het heeft geen activiteit tegen gram-negatieve bacteriën, mycobacteriën en fungi. Het antibioticum is de standaardtherapie voor de behandeling van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Daarnaast wordt vancomycine ook nog gebruikt voor de behandeling van ernstige infecties met (al dan niet multiresistente) enterococcen. Bij darminfecties veroorzaakt door Clostridium difficile wordt het antibioticum oraal toegediend [11]. Vancomycine heeft ook een belangrijke plaats in de behandeling van ernstige gram-positieve infecties wanneer de patiënt allergisch is voor penicillines en cefalosporines [12]. Het werkingsmechanisme van vancomycine omvat de inhibitie van de celwandsynthese door nietcovalente binding van het antibioticum aan de peptidoglycaanbouwsteen van de celwand, meer bepaald aan de terminale D-alanine-D-alanine-sequentie van de bouwsteen (zie Figuur 1-1). Hierdoor 2

wordt de aanhechting van een nieuwe bouwsteen geïnhibeerd, waardoor de celwandsynthese in zijn geheel wordt geblokkeerd [13, 14]. Hierin wordt ook de verklaring gevonden voor de activiteit tegen gram-positieve bacteriën, hun celwand bestaat immers voornamelijk uit peptidoglycaan, in tegenstelling tot die van gram-negatieve bacteriën. Dit verklaart het gebrek aan activiteit van vancomycine tegen gram-negatieve bacteriën.

Figuur 1-1 (Jia Y. et al. [15]): Structuur van vancomycine. De bindingsinteracties van vancomycine met D-Alanine-D-Alanine van de peptidoglycaanbouwsteen worden getoond.

In principe wordt vancomycine enkel gebruikt als er geen alternatieven meer zijn voor behandeling. Doordat het gebruik van vancomycine in de praktijk toch relatief frequent is, worden er tegenwoordig meer en meer vancomycine-resistente bacteriestammen gevonden [12, 16]. Het voornaamste mechanisme van resistentie is de wijziging van de terminale D-Alanine-D-Alanine sequentie van de peptidoglycaanbouwsteen naar D-Alanine-D-Lactaat. Er kunnen hierdoor geen 5 Hbruggen meer worden gevormd (zie Figuur 1-1), waardoor de interactie van vancomycine met de peptidoglycaanbouwsteen onvoldoende sterk is [13]. Er zijn verschillende categorieën gekarakteriseerd voor vancomycine-resistente stafylokokken. Zo wordt onderscheid gemaakt tussen heteroresistente vancomycine-intermediair-resistente S. aureus (hVISA), vancomycine-intermediair-resistente S. aureus (VISA) en vancomycine-resistente S. aureus (VRSA). Deze indeling is gebaseerd op de grootte van de MIC van vancomycine voor de stafylokokken. Het voorkomen van dergelijke bacteriestammen kan leiden tot falen van de therapie [11, 16].

3

1.2.3

Toxiciteit

Kort na het op de markt brengen van vancomycine werden bijwerkingen zoals nefrotoxiciteit relatief frequent vastgesteld. Ook infusie-gerelateerde toxiciteit en mogelijk zelfs ototoxiciteit worden geassocieerd met het gebruik van vancomycine. Het is om deze reden dat TDM van vancomycine in vele laboratoria frequent wordt uitgevoerd [17, 18]. Deze bijwerkingen werden vroeger voor een groot deel veroorzaakt door onzuiverheden aanwezig in de oudere preparaten, waardoor kan getwijfeld worden aan een oorzakelijke relatie tussen vancomycine en deze bijwerkingen. Globaal gezien zou de kans op nefropathie echter nog steeds 10 tot 20 % bedragen [19]. Afhankelijk van welke definitie voor nefrotoxiciteit wordt gehanteerd kan dit percentage wel sterk variëren [10, 19]. De incidentie van nefropathie zou bovendien nog stijgen bij combinatietherapie met de aminoglycoside antibiotica (in vergelijking met monotherapie), waarbij wordt vermoed dat vancomycine de toxiciteit van de aminoglycosiden potentialiseert [20]. Voor ototoxiciteit zijn geen dierproeven beschikbaar die een duidelijk verband aantonen met het gebruik van vancomycine. In combinatie met het feit dat er een zeer lage incidentie is van ototoxiciteit, wordt daarom meestal gesteld dat er geen associatie is met het gebruik van vancomycine [10, 11]. Voor het optreden van infusie-gerelateerde reacties bij het gebruik van vancomycine is wel veel evidentie beschikbaar. Meestal wordt naar deze bijwerking verwezen met de term ‘Red Man Syndrome’. Symptomen zijn roodheid en jeuk aan onder meer het gezicht, de nek en de romp. Soms komt daar ook nog hypotensie bij. De bijwerking treedt meestal op wanneer vancomycine te snel wordt geïnfuseerd, maar verdwijnt normaal gezien vlug wanneer het infuseren wordt gestaakt [11, 21]. Algemeen gezien vertoont vancomycine een relatief lage incidentie van bijwerkingen. Bovendien werd vastgesteld dat deze bijwerkingen vaak pas optreden bij een plasmaconcentratie van 80100mg/L, wat zelden noodzakelijke spiegels zijn [22]. Toch moet zeker nog voorzichtig worden omgesprongen met het gebruik van vancomycine, aangezien bijwerkingen nooit helemaal uitgesloten zijn. 1.2.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor vancomycine

Toepassen van TDM voor vancomycine is een praktijk die historisch gegroeid is, vooral met het oog op de mogelijke nefrotoxiciteit. Aangezien er tegenwoordig echter wat discussie is over de werkelijke toxiciteit van vancomycine, wordt het nut van TDM soms in vraag gesteld. TDM kan echter ook zinvol zijn omwille van het risico op onderdosering bij vancomycine, wat kan leiden tot therapiefalen en mogelijk ook kan bijdragen tot het optreden van resistentie [11, 17].

4

Vancomycine kan zowel via een continu infuus worden toegediend als via intermittente dosering. Bij TDM van vancomycine worden er dalconcentraties in serum bepaald wanneer intermittente dosering wordt toegepast. Deze spiegels moeten hoger zijn dan 10 mg/L voor ‘normale’ infecties tot zelfs 15 20 mg/L voor de behandeling van endocarditis en zeer ernstige infecties [3, 5]. Bij hogere serumconcentraties (80 - 100 mg/L) is er vastgesteld dat de incidentie van bijwerkingen sterk toeneemt [22]. Wanneer gebruik wordt gemaakt van een continu infuus bedraagt de targetspiegel 20 - 25 mg/L. Bij ernstige infecties is de richtlijn zelfs 25 - 35 mg/L. Zoals hoger vermeld is de beste farmacodynamische parameter voor vancomycine echter de AUC/MIC waarde. Ideaal wordt hiervoor een waarde groter dan 400 behaald. Aangezien deze parameter in de praktijk echter moeilijk te meten valt, wordt er met dalconcentraties gewerkt [10, 11]. Bepaling van de toe te dienen dosis gebeurt op basis van de nierfunctie (via de creatinineklaring) en het gewicht van de patiënt. Voor een patiënt met een goede nierfunctie is een dosering van 15 - 20 mg/kg om de 8 tot 12 uur aangewezen bij intermittente dosering. Bij ernstig zieke patiënten kunnen echter hogere doseringen nodig zijn. Wanneer een oplaaddosis wordt toegediend bij de start van de therapie, mag 25 - 30 mg/kg gedoseerd worden, waarna wordt overgeschakeld op het normale doseringsschema [11].

1.3 TEICOPLANINE 1.3.1

Structuur en eigenschappen van teicoplanine

Teicoplanine is een glycopeptide antibioticum, net als vancomycine waar het grote gelijkenissen mee vertoont. Het werd voor het eerst geïsoleerd uit Actinoplanes teichomyceticus in 1978. Teicoplanine is de verzamelnaam voor een groep omvangrijke verbindingen met een gelijkaardige structuur en activiteit en een gemiddeld moleculair gewicht van 1881 Da [23]. De 5 voornaamste verbindingen van het complex worden aangeduid met A2-1, A2-2, A2-3, A2-4 en A2-5. Ze verschillen enkel in lengte, verzadiging en vertakking van de vetzuurketen die is gebonden op het basisglycopeptide. Elke teicoplanine A2 component geeft na hydrolyse aanleiding tot de meer polaire A3 vorm. Teicoplanine A3 maakt meestal een significant deel uit van het teicoplanine mengsel en wordt daarom eveneens tot de majeure componenten gerekend. Naast de 6 veelvoorkomende componenten, komen er ook nog 4 mineure componenten voor. Deze maken samen maximum 5-10% van het totaal uit en worden daarom meestal verwaarloosd bij de bepaling [23-25]. Alle componenten van het teicoplaninecomplex zijn sterk eiwitgebonden. Het percentage gebonden teicoplanine kan zelfs oplopen tot 98% van de totale concentratie [14]. De componenten zijn 5

allemaal wateroplosbaar en worden hoofdzakelijk renaal geëxcreteerd [26]. Tenslotte is teicoplanine, net als vancomycine, een tijdsafhankelijk antibioticum [27].

Figuur 1-2 (Ph.Eur. 8th Edition, [28]): Chemische structuur van teicoplanine. Links staat de basisstructuur, rechts staan de R-groepen die overeenkomen met teicoplanine A2-1, teicoplanine A2-2, teicoplanine A2-3, teicoplanine A2-4, teicoplanine A2-5 en teicoplanine A3-1.

1.3.2

Indicatie van teicoplanine en mechanismen van resistentie

De indicatie van teicoplanine is vergelijkbaar met die van vancomycine. Zo wordt het eveneens gebruikt voor de behandeling van MRSA. Op die manier kent het antibioticum toepassingen als therapie voor endocarditis, osteomyelitis en septische artritis [29]. Het kan ook gebruikt worden voor de behandeling van pseudomembraneuze colitis veroorzaakt door Clostridium difficile [30]. Teicoplanine is echter geen standaardtherapie, omdat er in verband met veiligheid en efficaciteit veel meer evidentie beschikbaar is voor vancomycine. Vandaar dat vancomycine nog steeds de standaardtherapie is, ondanks de lichte voordelen van teicoplanine. Zo zou teicoplanine minder bijwerkingen vertonen en heeft het potentieel voor intra-musculaire toediening [31, 32]. Teicoplanine is enkel actief tegen gram-positieve bacteriën. Dit is te wijten aan zijn werkingsmechanisme, dat hetzelfde is als bij vancomycine. Er gebeurt niet-covalente binding van teicoplanine aan het terminaal D-Alanine-D-Alanine gedeelte van de peptidoglycaanbouwsteen. De aanhechting van nieuwe bouwstenen wordt verhinderd en de celwandsynthese wordt geïnhibeerd. Aangezien gram-negatieve bacteriën zeer weinig peptidoglycaan in hun celwand bevatten, heeft teicoplanine hier geen activiteit tegen [14, 33]. De mechanismen van resistentie zijn, zoals te

6

verwachten valt, dezelfde als bij vancomycine. Het belangrijkste resistentiemechanisme is dat waarbij D-Alanine-D-Alanine wordt vervangen door D-Alanine-D-Lactaat (zie 1.2.2). 1.3.3

Toxiciteit

Over het algemeen wijzen studies erop dat teicoplanine minder toxisch is dan vancomycine [32, 34]. Toch werden ook voor teicoplanine al gevallen van nefrotoxiciteit en ototoxiciteit gerapporteerd. In vergelijking met vancomycine zijn er wel duidelijk minder gevallen van ‘Red Man Syndrome’ [34]. Trombocytopenie en hypersensitiviteit zijn dan weer meer frequent voorkomende bijwerkingen van teicoplanine. Over het algemeen wordt toxiciteit waargenomen bij concentraties hoger dan 60 mg/L [32, 35]. 1.3.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor teicoplanine

Een voordeel van teicoplanine ten opzichte van vancomycine is dat het minder frequent moet worden onderworpen aan TDM. Wanneer TDM toch wordt gedaan voor teicoplanine, is het vooral om therapeutische concentraties te verzekeren (en dus onderdosering te vermijden), aangezien grote interindividuele variaties in farmacokinetiek kunnen voorkomen. Net als bij vancomycine worden dalconcentraties in serum gemeten wanneer intermittente toediening gebeurt. Wanneer deze lager zijn dan 10 mg/L spreken we van subtherapeutische spiegels. De gewenste concentratierange voor gewone infecties ligt bij 10 - 20 mg/L en de nodige dalconcentratie bij zeer ernstige stafylokokkeninfecties ligt rond 20 - 60 mg/L [32, 35]. Bij de dosering van teicoplanine wordt meestal gestart met een oplaadregime van 6 mg/kg 3 keer per dag gedurende de eerste 24u. Vervolgens wordt eenmaal daags 6 mg/kg toegediend [32, 36]. Afhankelijk van het ziekenhuis kan het doseringsregime wel afwijken. Momenteel wordt met behulp van een immunoassay de totale concentratie van teicoplanine bepaald. Nochtans wordt vermoed dat de vrije concentratie verantwoordelijk is voor het effect, aangezien enkel de ongebonden vorm van het antibioticum kan penetreren in de weefsels. Aangezien teicoplanine zeer sterk eiwitgebonden is, kan bepaling van vrije concentraties dan ook zeer nuttig zijn. Er is echter nog geen routinetechniek beschikbaar voor dergelijke bepaling [37].

1.4 COLISTINE 1.4.1

Structuur en eigenschappen van colistine

Colistine of polymyxine E is een kationisch lipopeptide antibioticum. Het werd voor het eerst geïsoleerd in 1950 uit Bacillus colistinus [38-40]. De structuur bestaat uit een cyclisch polypeptide met een N-terminaal vetzuursegment (zie Figuur 1-3) [40, 41]. Elke molecule bezit 5 vrije aminogroepen, waardoor ook 5 positieve ladingen per molecule aanwezig zijn [42]. Net als 7

teicoplanine is colistine een mengsel van verschillende componenten. In totaal maken een dertigtal verschillende structuren deel uit van het mengsel, maar de twee belangrijkste componenten zijn colistine A (polymyxine E1) en B (polymyxine E2) [43]. Zij maken samen tot 85% van het totaal uit [44]. Net als teicoplanine en vancomycine bestaat colistine uit zeer omvangrijke structuren. Zo heeft colistine A een moleculair gewicht van 1169,5 Da, terwijl dit voor colistine B 1155,4 Da bedraagt. Colistine B heeft een kortere vetzuurketen, vandaar het lagere moleculair gewicht [38, 45]. Colistine is commercieel beschikbaar als een inactieve methaangesulfoneerde prodrug (colistimethaat sodium = CMS) voor parenteraal gebruik [46, 47]. Deze wordt in waterig milieu snel gehydrolyseerd naar de actieve vorm colistine, waardoor snelle toediening na reconstitutie van bijzonder belang is [48].

Figuur 1-3 (Xu Y. et al. [38]) : Structuur van Colistine A (boven) en Colistine B.

Over de farmacokinetiek en –dynamiek van colistine is zeer weinig geweten. We weten wel dat colistine, in tegenstelling tot vancomycine en teicoplanine, grotendeels niet-renaal geklaard wordt, hoewel het zeer goed wateroplosbaar is. Het precieze mechanisme van klaring is echter nog niet gekend. De inactieve prodrug van colistine wordt wel renaal geklaard [49]. Tenslotte moet nog vermeld worden dat colistine een concentratie-afhankelijk antibioticum is [50]. 8

1.4.2

Indicatie van colistine en mechanismen van resistentie

Colistine is een antibioticum dat 40 jaar geleden quasi volledig van de markt verdween omwille van toxiciteit. Het werd vervangen door minder toxische alternatieven, zoals bijvoorbeeld de aminoglycosiden. De voorbije 10 jaar is het echter opnieuw in gebruik genomen, omwille van het gebrek aan alternatieven voor de behandeling van multiresistente, gram-negatieve bacteriën (waaronder Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii en Klebsiella pneumoniae) [46, 51]. Het mag enkel gebruikt worden bij ernstig zieke patiënten, wanneer de infectie resistent is aan behandeling met β-lactams, aminoglycosides en quinolones [41]. Colistine is niet werkzaam tegen gram-positieve en anaerobe bacteriën [51, 52]. Het werkingsmechanisme van colistine verschilt sterk van de glycopeptiden. De positieve lading van colistine speelt een belangrijke rol, net als de hydrofobe vetzuurketen. Colistine bindt hierdoor immers met hoge affiniteit aan het lipide A deel van de lipopolysacchariden (LPS) in de buitenste celmembraan van gram-negatieve bacteriën (zie Figuur 1-4). Door de binding neemt het de plaats in van Mg2+ en Ca2+. Deze divalente kationen zijn noodzakelijk voor de stabiliteit van de buitenste membraan. Door het verdrijven van Mg2+ en Ca2+ wordt de integriteit van de membraan verstoord, waardoor de permeabiliteit ervan stijgt. Dit geeft uiteindelijk aanleiding tot celdood. Aangezien LPS niet aanwezig zijn bij gram-positieve bacteriën, verklaart dit ook het gebrek aan activiteit van colistine tegen deze micro-organismen. Toch is dit werkingsmechanisme volgens verschillende auteurs niet helemaal juist en spelen ook andere (onbekende) mechanismen nog een rol [41, 52, 53].

Figuur 1-4 (Biswas et al. [41]): Werkingsmechanisme van colistine.

9

Over het algemeen is de aanwezigheid van resistentie tegen colistine nog beperkt. Er is uiteraard natuurlijke resistentie (zoals bij de gram-positieve bacteriën), maar de verworven resistentie is voorlopig relatief gering. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat colistine 30 jaar quasi niet gebruikt werd. Een aantal bacteriën heeft echter wel al resistentie ontwikkeld, voornamelijk door wijziging van de structuur van het lipide A gedeelte van de LPS. Ook wijzigingen aan andere delen van de LPS of de productie van een capsule kan tot resistentie leiden [41, 46]. 1.4.3

Toxiciteit

Zoals reeds vermeld zijn de indicaties voor colistine beperkt omwille van de toxiciteit van het antibioticum. Vooral neuro- en nefrotoxiciteit treden frequent op. Experimenteel is vastgesteld dat de

toxiciteit

dosis-gerelateerd

is,

waarbij

de

symptomen

verdwijnen

wanneer

de

geneesmiddeltoediening wordt gestaakt. Het mechanisme dat de toxiciteit veroorzaakt is niet bekend. Nefrotoxiciteit komt relatief frequent voor bij colistine (±20 %), maar onderzoek heeft uitgewezen dat het minder vaak voorkomt dan bij de veel gebruikte aminoglycosiden. Het zijn nochtans deze antibiotica die colistine van de markt hebben verdreven, aangezien vroeger werd geloofd dat ze minder toxisch waren. Er bestaat ook verwarring over de grootte van het deel van de bevolking waarin nefrotoxiciteit optreedt. Vaak worden sterk verschillende percentages gevonden, naargelang de definitie van nefrotoxiciteit die werd gehanteerd. Neurotoxiciteit komt minder vaak voor, hoewel toch 7 % van de patiënten symptomen als duizeligheid, visusstoornissen en spierzwakte ervaart [41, 46, 52]. 1.4.4

Nut van Therapeutische Drug Monitoring voor colistine

Net zoals voor de glycopeptiden vancomycine en teicoplanine kan TDM mogelijk nuttig zijn voor het lipopeptide colistine. Dit kan zowel gebeuren om het therapeutisch effect te waarborgen, als om toxiciteit te vermijden. Vooral dit laatste is voor colistine belangrijk. De aanbevolen dosering voor colistine ligt rond 5 mg/kg/dag CMS, verdeeld over 2 tot 4 dosissen. In de literatuur is er echter wel variatie in de dosering gerapporteerd. Zo verschillen de 2 meest gebruikte colistinepreparaten, Colomycin en Coli-Mycin, sterk in aanbevolen dagelijkse hoeveelheid. Voor Coli-Mycin is de aanbevolen maximale dosis bijna dubbel zo groot als voor Colomycin (800 mg versus 480 mg) [41, 46]. Toediening van colistine gebeurt vooral intraveneus en intramusculair. Voorlopig is er geen immunoassay beschikbaar voor de routinebepaling van colistine. De ontwikkeling van een goede bepalingsmethode voor colistine is dus van groot belang.

10

1.5 BEPALINGSMETHODEN VOOR DE EERDER GENOEMDE ANTIOBIOTICA 1.5.1

Immunoassays

Immunoassays worden frequent gebruikt bij TDM voor de bepaling van geneesmiddelconcentraties. Belangrijke voordelen van immunoassays zijn de mogelijkheid tot automatisatie en de snelle ‘turn around time’, dit is de tijd tussen ontvangst van het staal en het doorgeven van het resultaat [5]. Immunoassays vertonen echter ook belangrijke nadelen. Zo ondervinden ze vaak problemen door niet-specifieke interferentie van gelijkaardige componenten, alsook zijn ze sterk onderhevig aan matrixeffecten [4]. Voor veel geneesmiddelen is de ‘lower limit of quantification’ (LLOQ) bekomen met immunoassays ook veel hoger dan gewenst [54]. Voor de concentratiebepaling van vancomycine en teicoplanine werden in het verleden vaak ‘fluorescence polarization immunoassays’ (FPIA) gebruikt [55, 56]. Voor colistine is een dergelijke techniek niet beschikbaar. Deze FPIA’s hebben bijkomende nadelen, zo worden de resultaten sterk beïnvloed door onder meer lichtverstrooiing en endogene fluoroforen [57]. Tegenwoordig wordt ‘Liquid Chromatography’ gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) echter belangrijker als bepalingsmethode. 1.5.2

LC-MS/MS

LC-MS/MS technieken worden meer en meer gebruikt in klinische laboratoria voor TDM. LC-MS/MS heeft verschillende voordelen ten opzichte van immunoassays. Zo vertonen bepalingen met LCMS/MS een veel grotere selectiviteit en sensitiviteit. Hierdoor wordt het mogelijk om verschillende gelijkaardige componenten te bepalen met 1 methode, wat onmogelijk is met immunoassays [3, 4]. Ook de bepalingssnelheid is in het algemeen hoger bij LC-MS/MS methoden. Nadeel aan LC-MS/MS is het feit dat het moeilijk in gebruik is en veel technische ervaring vereist [4]. Bovendien is ook de kostprijs van de apparatuur zeer hoog. In functie van de tijd blijkt LC-MS/MS soms echter toch meer kosten-effectief te zijn dan immunoassays, wat toch een belangrijk voordeel is in die gevallen [54].

11

2 OBJECTIEVEN Het doel van deze masterproef is de ontwikkeling en validatie van een methode voor de gelijktijdige bepaling van de antibiotica colistine, vancomycine en teicoplanine met behulp van een UHPLCMS/MS apparaat. De methode is gebaseerd op het artikel van Tsai et al. [1], waarin reeds een methode voor de gelijktijdige bepaling van deze drie antibiotica is beschreven. Er werd gekozen deze methode te gebruiken omwille van de toepasbaarheid ervan in het laboratorium. Er is behoefte aan een dergelijke bepalingsmethode in het klinisch laboratorium van het UZ Gent. Voor colistine is immers nog geen bepalingsmethode beschikbaar. Voor vancomycine en teicoplanine zijn er wel reeds immunoassays aanwezig op het 24uurs lab, maar een LC-MS/MS bepaling is nuttig als back-upmethode. Aangezien het laboratorium bovendien interesse heeft in het meten van vrije concentraties voor teicoplanine (± 98 % eiwitbinding) is de ontwikkeling van een meer gevoelige LCMS/MS methode van belang. Deze kan immers ook in lagere concentratieranges (<2 mg/L) accurate resultaten rapporteren, in tegenstelling tot immunoassays. Voor vancomycine is het meten bij lage concentraties minder relevant, aangezien deze component slechts een beperkte eiwitbinding vertoont (± 30 %). Er wordt gestart met een optimalisatie van de massaspectrometrische parameters. Hierbij gaan ook de m/z ratios bepaald worden van de precursor- en productionen van de verschillende antibiotica. Ook de chromatografische parameters zullen worden nagegaan. Er zal onder meer onderzocht worden of de gradiënt die momenteel in de routinepraktijk van het laboratorium gebruikt worden een even goed resultaat geven als de mobiele fasen gebruikt door Tsai et al. [1]. Nadat de optimalisatie afgerond is, moet de relatieve samenstelling van de mengsels van teicoplanine en colistine bepaald worden, aangezien deze niet vermeld is op het analysecertificaat. Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van monografieën uit de Europese Farmacopee (Ph.Eur). Vervolgens zal worden overgegaan tot de validatie. Het valideren van een methode is van belang om te weten of de resultaten die je verkrijgt met de methode voldoende betrouwbaar en reproduceerbaar zijn. Tijdens deze validatie moeten verschillende dingen onderzocht worden zoals selectiviteit, accuraatheid en precisie, stabiliteit, de kalibratiecurve en LLOQ. Dit zal uitgevoerd worden op basis van de ‘Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation’ uitgegeven door de Food and Drug Administration (FDA) [58]. Bij het onderdeel stabiliteit zal naast bench-top, autosampler en vries/dooi stabiliteit ook de stabiliteit van CMS, de prodrug van colistine, onderzocht worden. Deze kan immers de concentratie van colistine beïnvloeden.

12

Ook het matrixeffect en de terugvinding moeten worden onderzocht. Dit zal gebeuren op basis van de methode van Matuszewski et al. [59]. Daarnaast zal een methodevergelijking met de reeds bestaande immunoassay voor teicoplanine en vancomycine worden uitgevoerd. Zoals eerder vermeld is er voor colistine nog geen bepalingsmethode beschikbaar, waardoor een methodevergelijking voor deze component niet mogelijk is. Na afronding van de validatie is het de bedoeling dat de methode operationeel is voor gebruik in de praktijk van het laboratorium. De methode zal een back-up bepalingsmethode vormen voor teicoplanine en vancomycine. Verdere studies zullen ook onderzoeken of vrije concentratiebepaling van teicoplanine mogelijk is met deze methode. Tenslotte zal ook concentratiebepaling van colistine mogelijk worden in het UZ Gent.

13

3 MATERIALEN EN METHODEN 3.1 MATERIALEN 3.1.1

Apparaten en toebehoren

•

Centrifuge Microfuge 16 (Beckman Coulter, Fullerton, Californië, USA)

•

Eppendorf Cups 1,5 mL (Hamburg, Duitsland)

•

Glazen Vials (Waters, Milford, USA)

•

HPLC-DAD (High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector) o

Agilent 1100 series (Waldbronn, Duitsland)

o

Diode Array Detector (Agilent, Waldbronn, Duitsland)

o

Kolom: C18; 3,5 µm; 4,6 x 150 mm (Waters, Milford, USA)

•

Mettler AE200 weegschaal (Mettler-Toledo, Greifensee, Zwitserland)

•

Pipetten Eppendorf (Hamburg, Duitsland) o

2 - 20 µL + tips

o

10 - 100 µL + tips

o

100 - 1000 µL + tips

•

Polypropyleen screw top vials 750 µL (Supelco, Bellefonte, PA, USA)

•

Protein LoBind Eppendorf Cups 1,5 mL (Hamburg, Duitsland)

•

Schott Duran Laboratorium glaswerk (Duran, Mainz, Duitsland)

•

UHPLC-MS/MS

•

•

o

Binary Solvent Manager (Waters, Milford, USA)

o

Column Manager (Waters, Milford, USA)

o

Kolom: Acquity UHPLC, C18; 1,7 µm; 2,1 x 100 mm (Waters, Milford, USA)

o

Polyether Ether Keton (PEEK) naald (Waters, Milford, USA)

o

Sample Manager (Waters, Milford, USA)

o

Stainless Steel Naald (Waters, Milford, USA)

o

TQ Detector (Waters, Milford, USA)

UHPLC-DAD (Ultra-High Performance Liquid Chromatography – Diode Array Detector) o

Kolom: Acquity UHPLC, C18; 1,7 µm; 2,1 x 100 mm (Waters, Milford, USA)

o

Photodiode Array Detector (Waters, Milford, USA)

o

Quaternary Solvent Manager (Waters, Milford, USA)

o

Sample Manager (Waters, Milford, USA)

o

Stainless Steel Naald (Waters, Milford, USA)

Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, New York, USA) 14

3.1.2

Reagentia en chemicaliën

•

Acetonitrile (LC-MS) (Biosolve BV, Dieuze, Frankrijk)

•

Kalfsserum (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

•

Colistine natrium methaansulfonaat (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

•

Colistine sulfaatzout, 100mg (>15000 U/mg) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

•

Mierenzuur 98 % (Fluka Analytical, part of Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

•

Natriumsulfaat Watervrij (Merck, Darmstadt, Duitsland)

•

Orthofosforzuur 85 % (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Frankrijk)

•

QMS Teicoplanine Immunoassay Quality Controls (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)

•

Piperacilline D5 (Alsachim, Straatsburg, Frankrijk)

•

Polymyxine B sulfaatzout (Fluka Analytical, part of Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)

•

Teicoplanine A2, 50 mg (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)

•

Teicoplanine complex, 25mg (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)

•

Vancomycin hydrochloride, 100mg (European Pharmacopoeia Reference Standard, Strasbourg, France)

•

Water met hoge zuiverheid, gedeïoniseerd en gefilterd, geproduceerd door Elga Medica R7 (Veolia Water Solutions & Technologies, Ede, Nederland)

15

3.2 METHODEN 3.2.1 3.2.1.1

Aanmaak van standaarden en kwaliteitscontroles Standaarden

Er worden 7 standaarden aangemaakt over een bereik dat realistische concentraties voor de antibiotica omvat. De concentraties vermeld in Tabel 3-1 betreffen de totale concentraties van de mengsels van teicoplanine en colistine. Hierbij wordt voor elk van de antibiotica een stockoplossing aangemaakt in ultra-puur water (verder aangeduid als water). Voor ‘Vancomycine hydrochloride’ en ‘Colistine sulfaatzout’ (verder aangeduid als vancomycine en colistine) wordt een stockoplossing van 3,00 g/L gemaakt door nauwkeurig 0,0300 g af te wegen en op te lossen met water in een maatkolf van 10 mL. Voor teicoplanine wordt op dezelfde manier een stockoplossing van 1,00 g/L aangemaakt, waarbij 0,0100 g ‘Teicoplanine Complex’ (verder aangeduid als teicoplanine) wordt afgewogen en opgelost in water in een maatkolf van 10 mL. Deze stockoplossingen worden bewaard bij -80 °C. Van de hoogste standaard (K7, concentratie 100 mg/L) wordt een stockoplossing aangemaakt door 1000 µL stock teicoplanine, 333 µL stock vancomycine en 333 µL stock colistine te pipetteren en nauwkeurig aan te lengen met kalfsserum in een maatkolf van 10 mL. Deze stockoplossing van K7 wordt uitverdeeld in aliquots van 600 µL en bewaard bij -80 °C. Alle andere standaarden worden in situ aangemaakt uit K7, zoals blijkt uit Tabel 3-1. Hierbij wordt eerst een kleine hoeveelheid stockoplossing van K3 aangemaakt door 20 µL K7 aan te lengen met 380 µL kalfsserum. Tabel 3-1: Overzicht van volumes nodig voor aanmaak van de zeven standaarden voor de kalibratiecurve.

Kalibrator K7 K6 K5 K4 K3 K2 K1

3.2.1.2

Concentratie vancomycine, totaal teicoplanine en totaal colistine (mg/L) 100 75 45 20 5 2 1

Volume Standaard

Volume Kalfsserum

100 µL K7 75 µL K7

0 µL 25 µL

45 µL K7 20 µL K7 100 µL K3 40 µL K3 20 µL K3

55 µL 80 µL 0 µL 60 µL 80 µL

Kwaliteitscontroles

Voor de kwaliteitscontroles (QC) worden aparte stockoplossingen aangemaakt met dezelfde concentraties als gebruikt voor de standaarden (zie 3.2.1.1 voor werkwijze). Er worden oplossingen 16

aangemaakt van QCL (lage concentratie, 2 mg/L), QCM (medium hoge concentratie, 10 mg/L) en QCH (hoge concentratie, 90 mg/L) die worden uitverdeeld in aliquots van 200 µL. Ook 2 oplossingen met concentraties van 1 en 0,5 mg/L (worden uitgetest als LLOQ-streefwaarde) worden aangemaakt uit de QC-stockoplossingen. Deze LLOQ-testoplossingen worden in verdere experimenten behandeld als QC’s, maar aangeduid als LLOQ’s. Tabel 3-2 toont een overzicht van de benodigde volumes van de verschillende stockoplossingen. Deze worden aangelengd met kalfsserum in een maatkolf van 10 mL en vervolgens uitverdeeld in aliquots van 200 µL. Bewaring van deze oplossingen gebeurt zowel voor de QC’s als de LLOQ’s bij -80 °C. Tabel 3-2: Overzicht van de benodigde volumes van de verschillende stockoplossingen voor de aanmaak van de QC’s en de LLOQ’s. Staal

Concentratie (mg/L)

Volume stockoplossing Vancomycine (µL)

Volume stockoplossing Colistine (µL)

Volume stockoplossing Teicoplanine (µL)

QCH

90

300

300

900

QCM

10

33,3

33,3

100

QCL

2

222 µL QCH in 10 mL totaal

LLOQ 1

1

111 µL QCH in 10 mL totaal

LLOQ 2

0,5

55,6 µL QCH in 10 mL totaal

3.2.1.3

Interne Standaard

We hebben gebruik gemaakt van twee verschillende interne standaarden (IS), namelijk polymyxine B (PMB) en piperacilline D5 (pipD5). Voor pipD5 wordt er eerst een stockoplossing aangemaakt van 1,00 g/L door 0,0100 g nauwkeurig af te wegen en op te lossen in 10 mL water (nauwkeurig met behulp van een maatkolf). Deze oplossing wordt nog 1 op 10 verdund, waarna ze wordt uitverdeeld in aliquots van 500 µL. De concentratie van de pipD5 stockoplossing bedraagt dus 100 mg/L. Voor PMB hebben we volgens hetzelfde principe gewerkt als voor pipD5, maar zonder de verdunningsstap. We maken een stockoplossing van 1,00 g/L aan door 0,0100 g nauwkeurig af te wegen en op te lossen in 10 mL water (nauwkeurig met behulp van een maatkolf). Deze oplossing verdelen we uit over aliquots van 500 µL. 3.2.2

Chromatografische condities

Voor de ontwikkeling van de UHPLC-MS/MS methode maken we gebruik van een Waters UHPLCMS/MS met een binaire solvent pomp. Er wordt een Acquity UHPLC C18 kolom (2,1 x 100 mm, Ø = 1,7 µm) gebruikt om de componenten te scheiden.

17

Mobiele fase A bestaat uit water met 0,1 % mierenzuur (FA), terwijl mobiele fase B acetonitrile met 0,1 % FA omvat. Dit zijn ook de fasen die worden gebruikt door Tsai et al. [1]. De vloeisnelheid wordt ingesteld op 0,300 mL/min en het injectievolume bedraagt 20 µL. De sample manager wordt ingesteld op een temperatuur van 4 °C, terwijl de kolom een temperatuur van 50 °C heeft. De gebruikte gradiënt omvat startcondities van 5 % B, waarna in 2,5 min wordt overgegaan naar 95 % B. Vervolgens wordt 1 min isocratisch geëlueerd, waarna op 0,05 min naar 95 % A en 5 % B wordt gegaan (= startcondities). Tenslotte wordt nog 1,45 min op startcondities (met 5 % B) gereëquilibreerd. De totale looptijd bedraagt 5 min. Dit gradiënt is eveneens gebaseerd op Tsai et al. [1]. 3.2.3

Massaspectrometrische condities

De detectie wordt uitgevoerd met een Waters triple quadrupole systeem, ingesteld in de positieve elektrospray ionisatie modus (ESI+). Als drooggas wordt N2 gebruikt met een vloeisnelheid van 800 L/u. Argon wordt gebruikt als collisiegas met een vloeisnelheid van 30 L/u. De capillaire voltage bedraagt 3000 V. De lage en hoge massa resolutie 1 (LM en HM) resoluties bedragen respectievelijk 14 en 11, voor LM en HM 2 resoluties wordt dit 14 en 15. Voor de brontemperatuur en de desolvatatietemperatuur werden de standaardinstellingen gebruikt die ook voor de andere methodes op de UHPLC-MS/MS worden toegepast, namelijk 140 en 400 °C respectievelijk. De software die wordt gebruikt om de resultaten te verwerken is Masslynx. Tabel 3-3: Overzicht van gebruikte precursor- en productionen, cone voltage en botsingsenergie voor de verschillende antibiotica, evenals voor de interne standaarden. a

Product ion

a

Component

Cone Voltage (V)

Botsingsenergie (V)

Precursor ion (m/z)

Vancomycine

22

35

725,5

100,0

144,1

Colistine A

30

30

585,6

101,0

241,2

Colistine B

35

34

578,5

101,0

227,2

Teicoplanine A3-1

20

20

783,0

204,1

126,0

Teicoplanine A2-1

20

20

940,2

314,2

296,2

Teicoplanine A2-2 & A2-3

20

20

940,8

316,2

298,2

Teicoplanine A2-4 & A2-5

20

15

948,0

330,2

204,1

PipD5

32

17

523,28

148,1

-

PMB

35

35

602,5

101,0

241,1

a) Gebaseerd op de ionen gevonden in de literatuur [1, 45] b) Kwantificatie-ion c) Kwalificatie-ion (ter identificatie)

18

b

Q1 (m/z)

c

Q2 (m/z)

Tabel 3-3 toont een overzicht van de gebruikte precursor- en productionen voor de verschillende verbindingen, met de vereiste cone voltage en botsingsenergie. Voor colistine maken we onderscheid tussen de componenten colistine A en B. Voor teicoplanine worden de componenten A2-2 en A2-3 samengenomen, evenals A2-4 en A2-5, aangezien dit twee paren van isomeren zijn. We kijken afzonderlijk naar teicoplanine A2-1 en A3-1. Voor elke component werd een kwantificatie- en een kwalificatie-production bepaald. Het kwantificatie-ion wordt gebruikt voor de concentratiebepaling, terwijl het kwalificatie-ion belangrijk is voor de identificatie van de verschillende componenten. 3.2.4

Staalvoorbereiding

De gebruikte staalvoorbereiding is gebaseerd op deze van Tsai, et al. [1]. Eerst wordt een verdunning gemaakt van de stockoplossingen van de IS door 12 µL pipD5 en 16 µL PMB toe te voegen aan 300 µL water en te vortexen (= Stock IS). Vervolgens wordt 100 µL staal in een epje gepipetteerd, waarna 20 µL van de Stock IS (concentratie pip D5 = 3,659 mg/L, PMB = 48,78 mg/L) wordt toegevoegd. Het geheel wordt gevortext, waarna 150 µL acetonitrile wordt toegevoegd om de eiwitten te laten neerslaan. Er wordt opnieuw gevortext, waarna de stalen in de centrifuge worden geladen. Deze laten we gedurende 5 min draaien aan 16162 x g. Tachtig µL van het supernatans wordt toegevoegd met 400 µL mobiele fase A (water + 0,1 % FA) in de vial, waarna opnieuw wordt gevortext. Deze oplossing wordt vervolgens geïnjecteerd op de UHPLC-MS/MS. 3.2.5 3.2.5.1

Bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine en colistine Teicoplanine

Vooraleer met de validatie van de methode kan worden gestart, moet de relatieve samenstelling van het teicoplaninemengsel bepaald worden, aangezien deze niet vermeld wordt door de fabrikant. Zoals reeds gemeld in de inleiding bestaat teicoplanine grotendeels uit 6 componenten, namelijk teicoplanine A3-1, A2-1, A2-2, A2-3, A2-4 en A2-5. De percentages van deze componenten worden bepaald op basis van een methode uit de Ph.Eur, vermeld in de monografie van teicoplanine [28] (zie bijlage 2). Deze methode kon niet precies gereconstrueerd worden, maar de afwijkingen werden tot een minimum beperkt. Er werd gebruik gemaakt van een UHPLC-DAD met een photodiode array detector en een C18 kolom (1,7 µm) (zie 3.1.1). Eerst werd een oplossing van ‘Teicoplanine Complex’ aangemaakt met een concentratie van 1,00 g/L. Dit is dezelfde stockoplossing als diegene gebruikt voor de aanmaak van de standaarden (zie 3.2.1.1).

19

De volgende mobiele fasen worden gebruikt: mobiele fase A bestaat uit water met 0,1 % FA, terwijl mobiele fase B acetonitrile met 0,1 % FA is. De gebruikte gradiënt is beschreven in Tabel 3-4. De detectie van de teicoplaninecomponenten gebeurt bij 254 nm. Tabel 3-4: Overzicht van de gebruikte gradiënt voor de bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine.

Tijd (min) 0 – 30 30 – 31 31 – 35 Er

wordt

een

chromatogram

Mobiele fase A (% V/V) 100 → 50 50 → 10 10 verkregen

waaruit

de

Mobiele Fase B (% V/V) 0 → 50 50 → 90 90 relatieve

samenstelling

van

het

teicoplaninemengsel kan worden bepaald. Eerst wordt in het chromatogram gezocht naar de piek van de meest abundante component, namelijk teicoplanine A2-2, aangezien dit de grootste piek zal zijn. Vervolgens worden de andere componenten relatief bepaald ten opzichte van de retentietijd van A2-2 (=1), zoals getoond in Tabel 3-5. In Figuur 3-1 staat een voorbeeldchromatogram voor teicoplanine.

Figuur 3-1: overgenomen uit Ph.Eur (60): Voorbeeldchromatogram waarin aangeduid staat welke pieken deel uitmaken van de groepen teicoplanine A3, A2-1, A2-3 en A2-5. Ook de pieken voor A2-2 en A2-4 staan aangeduid. Met R.S. worden de onzuiverheden aangeduid.

20

Tabel 3-5: Relatieve retentietijden van de teicoplaninecomponenten ten opzichte van teicoplanine A2-2. Deze waarden zijn overgenomen uit de Ph.Eur. [28].

Teicoplanine A3

≤ 0,7

Teicoplanine A2-1

0,7 < x < 1

Teicoplanine A2-2

1

Teicoplanine A2-3

1 < x < 1,12

Teicoplanine A2-4

Ongeveer 1,12

Teicoplanine A2-5

1,12 < x ≤ 1,25

Onzuiverheden

> 1,25

Het percentage van de verschillende componenten wordt berekend met behulp van de volgende formules:

2 − 1

=

2−2=

,

2 − 3

=

2 − 4

=

2 − 5

=

3

=

,

∗ 100

∗

∗ 100

∗

,

∗ !

,

∗ #

, ,

∗

,

∗

∗

(3.1) (3.2)

∗ 100

(3.3)

∗ 100

(3.4)

∗ 100

(3.5)

∗ 100

(3.6)

Hierbij staan de afkortingen voor: S1 = som van de piekoppervlakten van de A2-1 groep bekomen met het chromatogram S2 = piekoppervlakte van de A2-2 component bekomen met het chromatogram S3 = som van de piekoppervlakten van de A2-3 groep bekomen met het chromatogram S4 = piekoppervlakte van de A2-4 component bekomen met het chromatogram S5 = som van de piekoppervlakten van de A2-5 groep bekomen met het chromatogram Sa = som van de piekoppervlakten van de A2 groep (A2-1 tot A2-5) bekomen met het chromatogram Sb = som van de piekoppervlakten van de A3 groep bekomen met het chromatogram Sc = som van de piekoppervlakten voor de pieken met een relatieve retentietijd hoger dan 1,25 (= onzuiverheden)

21

3.2.5.2

Colistine

De relatieve samenstelling van het colistinemengsel wordt bepaald op basis van een methode uit de Ph.Eur [60] (zie bijlage 3). We hebben gebruik gemaakt van een HPLC-DAD met een C18 kolom (Ø = 3,5 µm; 4,6 x 150 mm) (zie 3.1.1). Eerst wordt een oplossing van colistine aangemaakt met een concentratie van 3,00 g/L. Dit is dezelfde stockoplossing als gebruikt voor de aanmaak van de standaarden (zie 3.2.1.1). Van deze oplossing wordt 500 µL gepipetteerd in een eppendorf cupje waarna 200 µL acetonitrile en 300 µL water worden toegevoegd. Het geheel wordt gevortext. Van dit mengsel wordt 7,5 µL geïnjecteerd op de kolom van het apparaat. Als mobiele fase hebben we een oplossing gebruikt die bestaat uit 22 % acetonitrile en 78 % oplossing A. Deze oplossing A maken we aan door 4,46 g anhydrisch natriumsulfaat op te lossen in 900 mL water, waarna 2,5 mL fosforzuur wordt toegevoegd. Tenslotte wordt nauwkeurig aangelegd tot 1,000 L met water. De pH van de mobiele fase is ongeveer 2,4. De looptijd van deze methode bedraagt 18 min en de detectie van de colistinecomponenten gebeurt bij 215 nm. Tabel 3-6: Relatieve retentie van de colistinecomponenten ten opzichte van colistine A.

Colistine A

1

Colistine B

±0,45

Colistine E3

±0,5

Colistine A-I

±0,8

Colistine A-7MOA

±1,1

Onzuiverheden

Som van de resterende pieken

Er wordt een chromatogram verkregen waaruit de relatieve samenstelling van het colistinemengsel kan worden bepaald. Eerst wordt gezocht naar de piek voor colistine A, dit is de laatst eluerende grote piek. Vervolgens worden de andere colistinecomponenten bepaald op basis van de relatieve retentietijd ten opzichte van colistine A (zie Tabel 3-6). Het percentage colistine A en B wordt bepaald met behulp van volgende formules:

$

%&

=

$

%&

B =

'()*+,,)-./ *0) 1+/(20(3) 4 +5 ,()*+,,)-./ *0)3 1+/(20(3) 4, 6, 7 , 489, 48:;<4 )3 +3=>(.)-?)@)3

A 100

'()*+,,)-./ *0) 1+/(20(3) 6 +5 ,()*+,,)-./ *0)3 . 3 1+/(20(3) 4, 6, 7 , 489, 48:;<4 )3 +3=>(.)-?)@)3

22

(3.7)

A 100 (3.8)

3.2.6 3.2.6.1

Validatie Selectiviteit

Met selectiviteit wordt gedoeld op het vermogen van de methode om de te bepalen componenten te onderscheiden van andere aanwezige stoffen in een staal, zoals bijvoorbeeld metabolieten en onzuiverheden. Om selectiviteit te testen wordt gebruik gemaakt van bloedstalen (plasma) van 24 ziekenhuispatiënten die niet met de te onderzoeken antibiotica worden behandeld. Elk staal wordt onderworpen aan staalvoorbereiding (zoals uitgelegd in 3.2.4) en vervolgens worden de stalen geanalyseerd. Er wordt gekeken of er een signaal optreedt bij de ionen die we gebruiken voor kwantificatie. 3.2.6.2

Precisie en accuraatheid

Accuraatheid omvat strikt gezien zowel de precisie (toevallige fout) als de juistheid (systematische fout) van een methode. Juistheid is een maat voor de systemische afwijking van een methode en wordt uitgedrukt als de bias. Bias drukt de nabijheid uit van de gemiddelde waarde van een aantal resultaten ten opzichte van de nominale waarde. Via 8 opeenvolgende analyses van QC’s die een gekende hoeveelheid aan teicoplanine, colistine en vancomycine bevatten wordt de bias bepaald. We gebruiken QC’s met 3 verschillende concentraties, die worden aangeduid als QCL (laag), QCM (medium) en QCH (hoog). Voor de aanmaak en concentraties van deze QC’s wordt verwezen naar 3.2.1.2. De gemiddelde waarde mag volgens de FDA richtlijnen maximum ±15 % afwijken, behalve voor de LLOQ waar een afwijking van ±20 % is toegestaan [58]. Berekening van de bias gebeurt via formule 3.9: B % C%E =

F)5(@@)/@) G -@)83+5(3 /) G 3+5(3 /) G -@)

-@)

A 100

(3.9)

Met precisie wordt gedoeld op de nabijheid van individuele resultaten ten opzichte van elkaar. Precisie wordt meestal uitgedrukt als de imprecisie met behulp van een variatiecoëfficiënt (CV%): $H% =

0 3@ -@@).( 0() A 100 I)5(@@)/@)

(3.10)

De inter-run precisie wordt eveneens bepaald via de 8 opeenvolgende runs op verschillende dagen van QC’s met gekende lage, medium en hoge concentratie. CV% mag volgens de FDA richtlijn voor elke QC maximum ±15 % afwijken, behalve voor de LLOQ waar een afwijking van ±20 % wordt aanvaard [58].

23

3.2.6.3

Stabiliteit van de prodrug Colistimethaat Sodium (CMS)

De prodrug CMS wordt in het lichaam gehydrolyseerd tot colistine. Wanneer er bloed wordt afgenomen bij een patiënt, zal er steeds een hoeveelheid CMS aanwezig zijn. We willen niet dat dit tijdens de bewaring of de staalvoorbereiding wordt omgezet tot colistine, aangezien dit aanleiding kan geven tot een artificieel hoog gehalte aan colistine. Eerst wordt er een stockoplossing van CMS aangemaakt in water. Hiervoor wordt 0,0100 g CMS opgelost in 10 mL water. Deze oplossing wordt 100 maal verdund in kalfsserum zodat een startconcentratie van 10 mg/L CMS wordt bekomen. Vervolgens ondergaat deze oplossing staalvoorbereiding en gebeurt er analyse op verschillende tijdstippen om te zien hoeveel colistine er is gevormd. Er wordt eenmaal onmiddellijk geanalyseerd, eenmaal na 40 min op kamertemperatuur en tenslotte ook na 2 uur op kamertemperatuur. Een reeks kalibratoren wordt ook meegenomen in de staalvoorbereiding, zodat de juiste concentratie afgelezen kan worden via een kalibratiecurve. 3.2.6.4

Matrixeffect en terugvinding

Matrixeffect omvat de suppressie of de toename van het signaal van een analiet door co-eluerende componenten aanwezig in de matrix. Dit zorgt bij LC-MS/MS methoden vaak voor problemen. Het kan worden veroorzaakt door onder meer de staalvoorbereiding en de gebruikte matrix. Om het matrixeffect en de terugvinding te bepalen, wordt een methode gebruikt die gebaseerd is op het artikel van Matuszewski et al. [59]. Hiervoor worden 3 sets van stalen aangemaakt. Elke set omvat in totaal 8 stalen waarbij de ene helft een lage concentratie heeft en de andere helft een hoge. Voor de lage concentraties hebben we ervoor gekozen om een oplossing met een concentratie van 2 mg/L aan te maken voor colistine en vancomycine en 3 mg/L voor teicoplanine. In de stalen met een hoge concentratie is ervoor gekozen om zowel voor vancomycine, totaal colistine als totaal teicoplanine een concentratie van 50 mg/L aan te maken. Ook het matrixeffect van de interne standaard pipD5 wordt getest, door te werken met een concentratie van 0,766 mg/L voor deze verbinding. •

Set 1 bevat verdunde stockoplossing aangelengd met mobiele fase.

•

Set 2 bevat blanco plasmastalen, afkomstig van 6 gezonde vrijwilligers, die na extractie belast worden met dezelfde hoeveelheid stockoplossing als bij set 1.

•

Set 3 omvat opnieuw blanco plasmastalen afkomstig van dezelfde 6 gezonde vrijwilligers als bij set 2. De stalen worden met stockoplossing belast voor de extractie gebeurt. De hoeveelheid analiet die wordt toegevoegd is dezelfde als bij set 1 en 2.

24

Op basis van de piekoppervlakten die worden verkregen, kan dan het matrixeffect (ME), de terugvinding (RE) en de procesefficiëntie (PE) berekend worden met behulp van volgende formules:

JK C%E = MK C%E = NK C%E =

,()*+,,)-./ *0) 20

/ L (3 2)0

F)5(@@)/@) ,()*+,,)-./ *0) 2)0

,()*+,,)-./ *0) 20

/ L (3 2)0

,()*+,,)-./ *0) 20

/ L (3 2)0

,()*+,,)-./ *0) 20

A 100

(3.11)

A 100

/ L (3 2)0

F)5(@@)/@) ,()*+,,)-./ *0) 2)0

A 100 =

(3.12) ;7 L O7

(3.13)

In de praktijk moeten er verschillende stockoplossingen worden aangemaakt. Vertrekkende van de afzonderlijke stockoplossingen van colistine (3,00 g/L), teicoplanine (1,00 g/L) en vancomycine (3,00 g/L) beschreven in 3.2.1.1 wordt een eerste stockoplossing (‘stock laag’) aangemaakt voor de lage concentraties, waarin alle antibiotica aanwezig zijn. De afgemeten volumes zijn te zien in Tabel 3-7. Er wordt nog een 2e stockoplossing aangemaakt (‘stock laag set 2’), waarbij ‘stock laag’ 1 op 10 wordt verdund. Tenslotte wordt ook ‘stock hoog’ aangemaakt, die als basis dient voor de aanmaak van de hoge concentraties. Tabel 3-7: Overzicht van de vereiste volumes voor de aanmaak van stockoplossingen nodig om het matrixeffect te testen. STOCK LAAG

Colistine stock (3,00 g/L)

Teicoplanine stock (1,00 g/L)

Vancomycine stock (3,00 g/L)

Water

Volume (µL)

100

450

100

2350

STOCK HOOG

Colistine stock (3,00 g/L)

Teicoplanine stock (1,00 g/L)

Vancomycine stock (3,00 g/L)

PipD5 stock (0,100 g/L)

Water

Volume (µL)

250

750

250

115

1635

STOCK LAAG SET 2

30 µL ‘stock laag’ aanlengen met 270 µL water

Vervolgens worden de verschillende sets aangemaakt. Voor set 2 en 3 wordt er onderscheid gemaakt tussen de 3 stalen met lage concentratie en de 3 met hoge concentratie. Voor elk concentratieniveau wordt ook een staal aangemaakt in kalfsserum in deze twee sets. •

SET 1: Hiervan maken we in elke concentratie slechts 2 stalen aan. De lage concentraties worden aangemaakt door 7,40 µL van ‘stock laag set 2’ te pipetteren in een epje en aan te lengen 92,6 µL zuiver water. Vervolgens wordt van deze oplossing 80 µL toegevoegd aan 400 µL mobiele fase A (water met 0,1 % FA). Voor de hoge concentraties wordt dezelfde werkwijze gebruikt, maar nu wordt 7,40 µL ‘stock hoog’ aangelengd met 92,6 µL water, waarna ook hier 80 µL oplossing aan 400 µL mobiele fase A wordt toegevoegd rechtstreeks in de vial.

25

•

SET 2: We nemen 100 µL plasma van de vrijwilliger en voeren daarop de staalvoorbereiding uit. Na de extractie gaan we het supernatans gevormd door centrifugeren belasten met analiet. Dit gebeurt op dezelfde wijze als uitgelegd voor set 1.

•

SET 3: Hiervoor nemen we 10 µL ‘Stock Laag’, waaraan we 490 µL plasma van de vrijwiligger toevoegen voor de lage concentraties. Voor de hoge geldt hetzelfde principe maar wordt 10 µL ‘Stock Hoog’ genomen. Van deze belaste stalen gaan we nu 100 µL onderwerpen aan staalvoorbereiding (zie 3.2.5).

Alle stalen worden aangemaakt en vervolgens geanalyseerd en geïnterpreteerd. 3.2.7

Karakterisatie van de adsorptie van de verschillende antibiotica

Colistine, teicoplanine en vancomycine zijn peptiden. Een algemene eigenschap van peptiden is dat ze adsorberen aan vele verschillende materialen zoals glas, polyethyleen, etc. [61]. Het is echter niet mogelijk om op voorhand te voorspellen hoe de adsorptie zich zal voordoen op de verschillende materialen. Bovendien heeft ook de matrix waarin de peptiden zich bevinden een invloed op de adsorptie. Er is getracht dit alles te karakteriseren. 3.2.7.1

Invloed van de matrix

Om de invloed van de matrix na te gaan, is er gestart met een experiment waarin een dilutiereeks wordt aangemaakt in water, kalfsserum en plasma van twee vrijwilligers om te kijken wat de invloed van deze media is op de concentratie van de verschillende antibiotica. Tabel 3-8: Benodigde volumes voor het aanmaken van de verschillende standaarden. Elke kalibrator wordt 4 maal gemaakt: eenmaal met water, eenmaal met kalfsserum en tweemaal met plasma als medium. Kalibrator K7 K6 K5 K4 K3 K2 K1

Concentratie Vancomycine, Totaal Teicoplanine en Totaal Colistine (mg/L) 100 75 45 20 5 2 1

Volume Standaard

Volume Medium (water, kalfsserum, plasma)

100 µL K7 75 µL K7 45 µL K7 20 µL K7 100 µL K3 40 µL K3 20 µL K3

0 µL medium 25 µL medium 55 µL medium 80 µL medium 0 µL medium 60 µL medium 80 µL medium

Voor K7 wordt een stockoplossing met een volume van 1,000 mL aangemaakt, door 33,3 µL stock vancomycine (3,00 g/L), 33,3 µL stock colistine (3,00 g/L) en 100 µL stock teicoplanine (1,00 g/L) aan te lengen met 833,4 µL medium. Zowel water, kalfsserum als het plasma van twee vrijwilligers wordt gebruikt als medium. Vanuit de K7 stockoplossing wordt vervolgens nog een tweede stockoplossing aangemaakt voor kalibrator 3 (met een concentratie van 5 mg/L voor de verschillende antibiotica). 26

Hiervoor wordt 20 µL K7 toegevoegd aan 380 µL medium. Dit wordt opnieuw voor de vier verschillende media gedaan. De andere kalibratoren worden aangemaakt uit deze twee stockoplossingen. De gebruikte volumes hiervoor staan beschreven in Tabel 3-8. Er wordt van elke kalibrator 100 µL aangemaakt, waarop dan staalvoorbereiding wordt uitgevoerd (zie 3.2.4). 3.2.7.2

Invloed van verschillende materialen

Het volgende experiment wordt voornamelijk uitgevoerd om te kijken of het gebruik van zogenaamde ‘LoBind’ epjes een positieve invloed heeft op de adsorptie van colistine, teicoplanine en vancomycine. Deze epjes zijn speciaal ontworpen om de adsorptie van peptiden en proteïnen te beperken. Normaal gezien moeten epjes eerst gesatureerd worden met zogenaamde bovine serum albumine om een goede terugvinding van peptiden te bekomen maar met ‘LoBind’ epjes is dit overbodig. Om optimale resultaten te bekomen zullen polypropyleen (PP) vials worden gebruikt in plaats van de gebruikelijke glazen vials. Uit de literatuur is immers gebleken dat PP voor veel peptiden betere resultaten geeft in vergelijking met glas [61, 62]. Voor dit experiment wordt gebruik gemaakt van reeds aangemaakte K7 stockoplossing met een concentratie van 100 mg/L. Hieruit worden nog 3 bijkomende standaarden aangemaakt met een concentratie van 75, 35 en 10 mg/L, door respectievelijk 75 µL, 35 µL en 10 µL aan te lengen tot 100 µL met kalfsserum. Op deze 4 standaarden wordt de klassieke staalvoorbereiding uitgevoerd, maar de normale eppendorf cupjes worden dus vervangen door ‘LoBind’ eppendorf cupjes en in plaats van glazen vials worden PP vials gebruikt. Om een vergelijking te kunnen maken, wordt hetzelfde experiment ook uitgevoerd met gewone plastic eppendorf cupjes, eenmaal in combinatie met polypropyleen vials en eenmaal samen met glazen vials. Dit laatste is eigenlijk de klassieke staalvoorbereiding, zoals uitgelegd in 3.2.4. Tenslotte wordt het experiment nogmaals herhaald, maar met het gebruik van enkel glas (glazen buisjes in plaats van epjes en glazen vials). De resultaten van deze experimenten zullen vergeleken worden om de invloed van de verschillende materialen na te gaan. 3.2.7.3

Invloed van de naald voor staalname

De naald gebruikt voor de staalname kan ook een invloed hebben op de adsorptie van peptiden. Op de UHPLC-MS/MS op het laboratorium Toxicologie van het UZ Gent wordt standaard een PEEK-naald gebruikt. PEEK staat voor Polyether Ether Keton, wat een soort plastic is. Aangezien peptiden vaak adsorberen aan plastics werd de invloed van de naald nagegaan door de PEEK-naald te vervangen door een roestvrij stalen naald.

27

Na installatie van deze naald werd het experiment uit 3.2.7.1 herhaald. Er worden dus opnieuw 7 kalibratoren aangemaakt in verschillende media (meer bepaald water, kalfsserum en plasma van 2 vrijwilligers). De kalibratiecurves voor de verschillende media worden vervolgens met elkaar vergeleken. 3.2.7.4

Heruitvoeren van het matrixeffect

In 3.2.6.4 wordt beschreven hoe we tijdens de validatie van een methode het matrixeffect testen. Dit experiment wordt opnieuw uitgevoerd om te kijken wat de resultaten zijn bij het gebruik van een roestvrij stalen naald in combinatie met polypropyleen vials. Zowel het matrixeffect in serum als in plasma wordt nu getest. Er worden hiervoor opnieuw 3 sets van stalen aangemaakt. Elke set wordt zowel in hoge concentratie als in lage concentratie aangemaakt. De hoge concentratie is zowel voor vancomycine, totaal teicoplanine als totaal colistine gelijk aan 50 mg/L. Voor de lage concentraties is gekozen voor een concentratie van 4 mg/L voor colistine en vancomycine en 9 mg/L voor teicoplanine. Aan beide concentratieniveaus voegen we ook een vaste concentratie pipD5 (0,766 mg/L) en PMB (50 mg/L) toe. •

Set 1 bevat stockoplossing die is verdund met acetonitrile en wordt aangelengd met mobiele fase. Hiervan maken we twee stalen in elke concentratie.

•

Set 2 bevat zowel blanco plasmastalen als blanco serumstalen, afkomstig van vijf gezonde vrijwilligers. Deze worden na extractie belast met dezelfde hoeveelheid stockoplossing als de stalen in set 1. Ook een staal kalfsserum wordt meegenomen in de analyse.

•

Set 3 omvat opnieuw blanco plasma- en serumstalen afkomstig van dezelfde vijf gezonde vrijwilligers als bij set 2. Ook hier wordt een staal kalfsserum meegenomen in de analyse. Deze stalen worden belast met stockoplossing voor de extractie. De hoeveelheid analiet die wordt toegevoegd is dezelfde als bij set 1 en 2.

Het matrixeffect (ME), de terugvinding (RE) en de procesefficiëntie (PE) worden berekend met behulp van dezelfde formules als in 3.2.6.3 (formule 3.11 tot 3.13). In de praktijk moeten er dus opnieuw verschillende stockoplossingen worden aangemaakt. Vertrekkende van de afzonderlijke stockoplossingen van colistine (3,00 g/L), teicoplanine (1,00 g/L) en vancomycine (3,00 g/L) beschreven in 3.2.1.1 wordt een eerste stockoplossing (‘stock laag’) aangemaakt voor de lage concentraties, waarin alle antibiotica aanwezig zijn. De afgemeten volumes kan u zien in Tabel 3-9. Er wordt nog een tweede stockoplossing aangemaakt (‘stock laag set 2’),

28

waarbij ‘stock laag’ 1 op 10 wordt verdund. Tenslotte wordt ook ‘stock hoog’ aangemaakt, die als basis dient voor de hoge concentraties. Tabel 3-9: Overzicht van de benodigde volumes voor de aanmaak van de stockoplossingen om het matrixeffect te testen.

STOCK LAAG: Volume (µL) STOCK HOOG: Volume (µL) STOCK LAAG SET 2

Colistine stock (3,00 g/L)

Teicoplanine stock (1,00 g/L)

Vancomycine stock (3,00 g/L)

PipD5 (0,100 g/L)

PMB (1,00 g/L)

Water

16,7

112,5

16,7

95,8

625

133,3

83,3

250

83,3

38,3

250

295

50 µL ‘stock laag’ aanlengen met 450 µL water

Vervolgens worden de verschillende sets aangemaakt. Voor set 2 en 3 wordt onderscheid gemaakt tussen de 11 stalen met lage concentratie en de 11 met hoge concentratie. •

SET 1: De 2 stalen met lage concentratie worden aangemaakt door 29,6 µL van ‘stock laag set 2’ te pipetteren in een vial en aan te lengen 70,4 µL acetonitrile. Vervolgens wordt aan deze oplossing 500 µL mobiele fase A (water met 0,1 % FA) toegevoegd. Voor de 2 stalen met hoge concentraties wordt exact dezelfde werkwijze gebruikt, maar nu wordt 7,40 µL ‘stock hoog’ aangelengd met 92,6 µL acetonitrile, waarna ook hier 500 µL mobiele fase A wordt toegevoegd.

•

SET 2: Op 100 µL plasma/serum van de vrijwilliger/kalfsserum wordt staalvoorbereiding uitgevoerd. Na de extractie wordt het supernatans belast met analiet in plaats van acetonitrile. De werkwijze is identiek aan set 1.

•

SET 3: Hiervoor wordt 8 µL ‘Stock Laag’ gepipetteerd in een epje, waarna 92 µL plasma/serum van de vrijwilliger/kalfsserum wordt toegevoegd voor de lage concentraties. Voor de hoge concentraties geldt hetzelfde principe maar wordt 20 µL ‘Stock Hoog’ genomen en 80 µL plasma/serum van de vrijwilliger. Deze met analiet belaste stalen gaan we nu onderwerpen aan staalvoorbereiding (zie 3.2.4).

Alle stalen worden aangemaakt en vervolgens geanalyseerd en geïnterpreteerd. 3.2.8

Methodevergelijking

Een methodevergelijking is enkel mogelijk voor teicoplanine en vancomycine, aangezien voor colistine geen andere bepalingsmethode aanwezig is in het laboratorium. Het tijdsbestek van de thesis heeft enkel de uitvoering van een methodevergelijking voor teicoplanine toegelaten. Dertig stalen, afkomstig van patiënten die teicoplanine krijgen toegediend, worden geanalyseerd met zowel de bestaande QMS-teicoplanine-immunoassay als met onze LC-MS/MS methode. De resultaten worden vervolgens geanalyseerd in het programma ‘Medcalc’ met behulp van PassingBablok Regressie en een Bland-Altman plot. 29

We onderwerpen de patiëntenstalen hiervoor aan de klassieke staalvoorbereiding. Gelijktijdig doen we dit ook voor de 7 kalibratoren, zodat we een kalibratiecurve hebben om onze resultaten mee te kwantificeren. De resultaten van de stalen via de immunoassay worden bepaald door de laboranten van het 24uurslab in de routinepraktijk. 3.2.9

Within-Run Precisie

De within-run precisie wordt bepaald door binnen 1 run elke QC (3 concentraties) en elke LLOQ 7 keer te bepalen. Het CV% (zie formule 3.10) mag volgens de FDA richtlijn maximum 15 % afwijken, behalve voor de LLOQ waar een afwijking van 20 % wordt aanvaard [58]. Bijkomend wordt ook de bias berekend volgens formule 3.9 uit 3.2.6.2. Als interne standaard wordt zowel PMB als pipD5 meegenomen, waarbij wordt nagegaan welke IS het beste werkt voor elke individuele component. In dit experiment worden bovendien ook de commerciële QC’s (Thermo Scientific) van de teicoplanine-immunoassay meegenomen. Dit betreft QCL (concentratie 10 mg/L), QCM (concentratie 35 mg/L) en QCH (concentratie 75 mg/L) die eveneens elk 7 keer bepaald worden. Ook hiervan wordt vervolgens een bias en een CV% berekend op basis van formules 3.9 en 3.10.

30

4 RESULTATEN & DISCUSSIE 4.1 Chromatografische condities Twee soorten mobiele fasen werden met elkaar vergeleken bij de optimalisatie van de chromatografische condities. In de routinepraktijk van het laboratorium Toxicologie wordt het UHPLC-MS/MS apparaat gebruikt voor de analyse van de immunosuppressiva sirolimus en tacrolimus. Hierbij wordt als mobiele fase A water met 0,1 % FA en 2 mM ammoniumacetaat gebruikt, terwijl mobiele fase B bestaat uit methanol met 0,1 % FA en 2 mM ammoniumacetaat. Zoals eerder gezegd is onze methode echter gebaseerd op het artikel van Tsai et al. [1], waarin water met 0,1 % FA als mobiele fase A wordt gebruikt en waarbij mobiele fase B bestaat uit acetonitrile met 0,1 % FA. Er werd gekozen voor de mobiele fasen gebruikt door Tsai et al. [1], omdat de intensiteit van de pieken van de verschillende componenten hier hoger lijkt te zijn in vergelijking met de andere geteste fasen. Deze andere fasen bevatten ammoniumacetaat, wat overbodig is in onze methode, aangezien we geen ammoniumadducten meten. Dit is wel het geval voor sirolimus en tacrolimus. De gebruikte gradiënt (zie 3.2.2) is eveneens gebaseerd op het artikel van Tsai et al. [1]. Het is een vrij snelle gradiënt, waarbij in 2,5 min tijd wordt overgegaan van 5 % B naar 95 % B. Alle componenten komen er echter uit boven 50 % B. We hebben daarom geprobeerd om te starten bij hogere concentraties van mobiele fase B (30 en 40 %), maar hierbij werd een sterke daling van het signaal gezien. Hierom is besloten de gradiënt van Tsai et al. te behouden.

4.2 Massaspectrometrische condities Om te beginnen werden de verschillende antibiotica manueel geïnfuseerd om zo de massaspectrometrische parameters te ‘tunen’. Hiervoor werd van elk antibioticum een oplossing in water aangemaakt (hoge concentratie: 1,00 g/L). Bepaalde parameters, zoals de cone voltage en de botsingsenergie, zijn component-specifiek, waardoor ze voor elke component individueel worden geoptimaliseerd (zie verder). Er zijn echter ook methode-specifieke parameters zoals de capillaire voltage, de desolvatatie temperatuur en de temperatuur van de bron. Deze liggen vast voor elke component die wordt bepaald met eenzelfde methode. De methode-specifieke parameters werden als eerste geoptimaliseerd. De capillaire voltage werd gevarieerd tussen 0,5 en 4 kV, maar 3 kV bleek de beste resultaten te geven. Ook de LM en HM werden geoptimaliseerd. Standaard staan deze parameters ingesteld op 15, maar door verlagen van deze waarde kan de gevoeligheid van de detectie verhoogd worden. De selectiviteit vermindert hierdoor echter. LM en HM werden in de MS-modus ingesteld op respectievelijk 14 en 11. In de

31

MS/MS modus (Multiple Reaction Monitoring) werden LM en HM ingesteld op respectievelijk 14 en 15. Zo wordt het beste signaal verkregen zonder een groot verlies aan selectiviteit. Infuseren wordt ook uitgevoerd voor de bepaling van de verschillende moeder- en bijhorende dochterionen. In de SIR-modus (Single Ion Recording) werd zowel gekeken naar [M+H]+, [M+2H]2+ als [M+3H]3+ voor de moederionen. Het beste signaal (na optimalisatie van de cone voltage) werd verkregen voor [M+2H]2+, wat ook terug te vinden is in de literatuur [1, 45]. Vervolgens werd op zoek gegaan naar de productionen, met behulp van Multiple Reaction Monitoring. Er werd hier gezocht naar de twee dochterionen die het hoogste signaal gaven na optimalisatie van de cone voltage en botsingsenergie. De resultaten staan opgelijst in Tabel 3-3 (zie 3.2.3). De verkregen resultaten liggen in de lijn van de verwachtingen gebaseerd op de literatuur [1, 45]. Voor elke te bepalen component werd zowel een kwantificatie-ion als een kwalificatie-ion opgelijst. Een overzicht van de chromatogrammen voor de kwantificatie-ionen van de verschillende componenten is te vinden in Figuur 4-1. In Tabel 3-3 worden teicoplanine A2-2 & A2-3 samengenomen evenals A2-4 & A2-5, aangezien dit twee paren van isomeren zijn. Ze geven aanleiding tot exact dezelfde moeder- en dochterionen en hebben dezelfde retentietijd, waardoor ze dus niet los van elkaar kunnen gemeten worden met onze methode. Vandaar dat we elk isomerenpaar als één geheel gaan behandelen.

Figuur 4-1: Overzicht van de verkregen chromatogrammen voor de kwantificatieionen van de verschillende componenten. Rechts staan de transities en de componenten vermeld. De retentietijden staan vermeld boven de pieken.

32

4.3 Interne Standaard Deze methode maakt gebruik van twee verschillende IS. Een IS wordt gebruikt om te compenseren voor het verlies aan analiet tijdens de staalvoorbereiding. Bij voorkeur wordt een structureel verwante verbinding gekozen als IS, die op dezelfde manier zal reageren op de staalvoorbereiding als de te bepalen component. Gedeutereerde vormen van het analiet krijgen de voorkeur, maar stoffen die chemisch vergelijkbaar zijn met het analiet volstaan ook. Indien geen van deze twee opties mogelijk is, kan worden gekozen voor een structureel niet-verwante verbinding. PMB wordt door Tsai et al. [1] gebruikt als interne standaard. Bij het ontwikkelen van de methode bleek deze echter onvoldoende te compenseren voor de glycopeptiden teicoplanine en vancomycine. PMB is structureel verwant met colistine (= polymyxine E) en dus niet met de glycopeptiden, waardoor het enkel voor colistine een goede interne standaard vormt. Er zijn momenteel geen goede interne standaarden beschikbaar voor vancomycine en teicoplanine: noch structureel verwante verbindingen, noch gedeutereerde standaarden zijn verkrijgbaar. Er werd daarom geopteerd voor een structureel niet-verwante verbinding, namelijk pipD5. Deze compenseert redelijk, maar de resultaten zijn niet altijd consequent. De ionisatie-efficiëntie van pipD5 varieert immers sterk. Er is echter geen beter alternatief.

4.4 Staalvoorbereiding Verschillende staalvoorbereidingen werden vergeleken om te kijken welke de beste resultaten gaf. Als stalen worden de zes hoogste kalibratoren gebruikt (zie 3.2.1.1). Tabel 4-1: Vergelijking van de verschillende geteste staalvoorbereidingen op het vlak van staalvolume, eiwitprecipitatie en handelingen met het supernatans. STAALVOORBEREIDING 1

STAALVOORBEREIDING 2

STAALVOORBEREIDING 3

Volume Staal

100 µL (+ 20 µL IS)

100 µL (+ 20 µL IS)

100 µL (+ 20 µL IS)

Eiwitprecipitatie

150 µL acetonitrile

400 µL acetonitrile

200 µL acetonitrile met 0,1 % trifluoroazijnzuur

Supernatans

1 op 6 verdunnen met mobiele fase A

1 op 6 verdunnen met mobiele fase A

300 µL droogdampen met N2 en reconstitueren in 100 µL mobiele fase A

Staalvoorbereiding 1 is gebaseerd op deze gebruikt door Tsai et al. [1]. Staalvoorbereiding 2 is een meer conventionele eiwitprecipitatie, met een 4:1 verhouding van acetonitrile ten opzichte van het volume staal. Bij staalvoorbereiding 3 gebeurt er zowel een precipitatiestap als een droogdampstap onder N2. Een dergelijke staalvoorbereiding met een droogdampstap wordt regelmatig gebruikt in de literatuur [40, 63]. 33

Resultaten staalvoorbereiding in functie van de concentratie Teicoplanine A2-2 en A2-3

Respons

25 20

Staalvoorbereiding 1

15

Staalvoorbereiding 2

10 Staalvoorbereiding 3 5 0 0

20

40

60

80

Concentratie (mg/L)

Figuur 4-2: Resultaten voor de verschillende staalvoorbereidingen (uitgedrukt als de respons) in functie van de concentratie van de voornaamste component van teicoplanine, meer bepaald teicoplanine A2-2 & A2-3.

Na vergelijking van de verkregen resultaten (zie Figuur 4-2) werd besloten om staalvoorbereiding 1 te gebruiken. De resultaten van staalvoorbereiding 3 (droogdampen) geven aanleiding tot een afgeplatte curve in de hoge concentraties, vandaar dat deze niet werd gekozen. Staalvoorbereiding 1 geeft vergelijkbare resultaten wat betreft lineariteit in vergelijking met staalvoorbereiding 2, maar de respons is hoger bij gebruik van minder acetonitrile zoals duidelijk te zien is in Figuur 4-2. Ook voor de andere componenten werden gelijkaardige resultaten bekomen.

4.5 Bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine en colistine 4.5.1

Teicoplanine

De bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine werd eerst uitgeprobeerd op de UHPLCMS/MS, maar aangezien er geen zekerheid is over de mate van ionisatie van elke teicoplaninecomponent, is er ook geen zekerheid over de samenstelling die met dit instrument wordt bepaald. Er werd op zoek gegaan naar een gestandaardiseerde methode voor de bepaling van de relatieve samenstelling, welke werd gevonden in de Ph.Eur. In de monografie van teicoplanine (zie bijlage 2) wordt een LC-UV methode vermeld, die ons heeft toegelaten op een gevalideerde manier de samenstelling van ‘Teicoplanine Complex’ te bepalen. In het laboratorium Toxicologie van het UZ Gent is een UHPLC-DAD (Waters) beschikbaar, maar de methode van de farmacopee exact nabootsen was niet mogelijk. Alle instrumenten in het laboratorium worden immers gebruikt voor routinebepaling van geneesmiddelen en drugs, waardoor het aanbrengen van grote aanpassingen in de instrumentatie bij voorkeur wordt vermeden. Zo was het niet mogelijk om te werken met mobiele fasen die fosfaatbuffers bevatten zoals gevraagd door 34

de Ph. Eur, maar moest er gebruik gemaakt worden van mobiele fasen met FA als buffer. Er werd ook een andere kolom gebruikt, aangezien deze gevraagd door de Ph.Eur niet beschikbaar was op dit apparaat. De gebruikte concentraties evenals de gradiënt waren wel identiek aan de farmacopeemethode (zie 3.2.5.1).

Figuur 4-3: Chromatogram verkregen met HPLC-DAD voor de bepaling van de relatieve samenstelling van teicoplanine. De (groepen van) pieken zijn benoemd op de figuur. De grootste piek is teicoplanine A2-2, de andere componenten werden benoemd op basis van de relatieve retentietijd t.o.v. A2-2.

Relatieve Samenstelling Teicoplanine Complex 64,47

60,00

Percentage (%)

50,00

52,01

40,00 30,00 20,00 10,00

12,89

9,58

12,46 5,87

5,77

3,81

7,19

0,00 Teicoplanine Teicoplanine Teicoplanine Teicoplanine Teicoplanine Teicoplanine Impurities A3-1 A2-1 A2-2 A2-3 A2-4 A2-5

Figuur 4-4: Relatieve Samenstelling van ‘Teicoplanine Complex’, zoals bepaald met behulp van de farmacopeemethode. Aangezien teicoplanine A2-2 & A2-3 voor de kwantificatie samengenomen worden zal verder gerekend worden met de som. Hetzelfde geldt voor teicoplanine A2-4 en A2-5.

Nadat de pieken werden geïdentificeerd op basis van de retentietijden (zie Figuur 4-3) gebeurden de berekeningen volgens formule 3.1 tot 3.6 (zie 3.2.5.1). In Figuur 4-4 staan de bekomen resultaten voor de relatieve samenstelling van ‘Teicoplanine Complex’. Hieruit wordt duidelijk dat teicoplanine A2-2 de meest voorkomende component is. Aangezien het voor de kwantificatie van stalen belangrijk is om de samenstelling te weten, zullen deze resultaten verder nog gebruikt worden voor de kwantificatie. De relatieve samenstelling die werd verkregen met deze methode voldoet ook aan de vereisten van een farmaceutisch teicoplaninepreparaat (zoals vermeld in de monografie in bijlage 2).

35

4.5.2

Colistine

Ook voor colistine werd een methode uit de Ph. Eur. gebruikt voor de bepaling van de relatieve samenstelling van het colistinemengsel. Net als bij teicoplanine stelde de Ph.Eur een LC-UV-methode voor. Deze werd eerst uitgetest op de UHPLC-DAD (Waters) waarmee voor teicoplanine goede resultaten werden verkregen, maar voor colistine bleek dit niet te lukken. Waarschijnlijk hebben de afwijkingen ten opzichte van de oorspronkelijke methode een te grote invloed voor dit antibioticum. De methode werd daarom uitgetest op een HPLC-DAD (Agilent), omdat er daarop wel de mogelijkheid was om met de juiste mobiele fasen te werken. Dit instrument beschikte eveneens over de kolom gevraagd door de Ph.Eur. De resultaten die hiermee werden verkregen liggen in de lijn van de verwachtingen.

Relatieve Samenstelling Colistine 60,00

53,40

Percentage (%)

50,00 40,00 30,00

27,52

20,00 10,00

5,17

1,80

4,04

Polymyxine E3

Polymyxine E1-I

Polymyxine E1-7MOA

8,07

0,00 Colistine A

Colistine B

Impurities

Figuur 4-5: Overzicht van de relatieve samenstelling van het colistinemengsel.

Colistine B

Colistine A

Figuur 4-6: Chromatogram van colistine, verkregen via HPLC-DAD. De grootste piek wordt veroorzaakt door colistine B, de 2e grootste is te wijten aan de aanwezigheid van colistine A.

36

Voor colistine werd het chromatogram bekomen in Figuur 4-6. De identificatie van de pieken is gebeurd op basis van de relatieve retentietijden. Vervolgens zijn de percentages van colistine A en B berekend op basis van formule 3.7 en 3.8 (zie 3.2.5.2). Op die manier is gevonden dat het colistinemengsel 27,52 % colistine A en 53,40 % colistine B bevat. Zoals eerder vermeld zijn er nog andere componenten in het mengsel aanwezig, zoals bv. polymyxine E3, E1-7MOA en E1-1 (zie Figuur 4-5). Deze percentages zijn echter verwaarloosbaar in vergelijking met die van colistine A en B.

4.6 Validatie 4.6.1

Selectiviteit

Bij de analyse van de 24 patiëntenstalen werden geen problemen vastgesteld. Bij geen enkel kwantificatie-ion wordt een interfererende piek vastgesteld bij de retentietijden van de verschillende antibiotica. Ook bij de interne standaard pipD5 zien we geen piek. De methode is dus selectief voor colistine, teicoplanine, vancomycine en pipD5. 4.6.2

Precisie en accuraatheid

De resultaten van de experimenten uitgevoerd voor bepaling van de precisie en juistheid staan samengevat in Tabel 4-2 tot Tabel 4-5. Een volledig overzicht van de resultaten is te vinden in bijlage 4. De variatiecoëfficiënt (CV%) en de bias worden uitgedrukt in percent voor elke QC en voor de LLOQ. Er wordt voor elke component aan de voorwaarden voldaan (CV% en bias <15 % afwijking voor de QC’s en <20 % voor LLOQ). De methode is dus geslaagd op het vlak van juistheid en precisie. Er moet opgemerkt worden dat voor colistine B twee kalibratiecurven worden gebruikt, 1 voor de lage concentraties (tot en met QCM, concentratie 5,24 mg/L) en 1 voor de hoge concentraties (hoger dan QCM). Indien deze 2 curves niet worden gebruikt, dan ligt de QCL van colistine B 30 % te laag. Wanneer echter twee kalibratiecurves worden gebruikt verdwijnen deze afwijkende resultaten. Voor de ene kalibratiecurve gebruiken we K1 tot en met K4. Hierin ligt zowel QCL als QCM goed, met kleine afwijkingen wat betreft accuraatheid en precisie. Voor de tweede kalibratiecurve gebruiken we K4 tot en met K7, waarbij zowel QCM als QCH voldoen op het vlak van afwijkingen (<15 %). Voor colistine A stelt het probleem zich niet zo duidelijk als voor colistine B, maar wanneer het gebruik van twee kalibratiecurves hier wordt toegepast, worden eveneens kleinere afwijkingen verkregen. Dit verschijnsel kan worden verklaard door adsorptie van colistine, waardoor exponentiele curves worden bekomen. Waarschijnlijk situeert de QCL zich net in de ‘bocht’ van de curve, wat aanleiding geeft tot de grote afwijking bij accuraatheid. Voor teicoplanine A2-2 & A2-3 en teicoplanine A2-4 & A2-5 wordt er extern gekalibreerd. Onder de resultaten bevonden er zich een aantal uitschieters die verdwenen wanneer extern gekalibreerd 37

werd in plaats van met de interne standaard pipD5. De gebruikte interne standaard corrigeert dus niet goed voor deze twee componenten. Het is wel opmerkelijk dat hij voor teicoplanine A3-1 en A21 wel goed corrigeert. Teicoplanine A3-1 is meer polair dan A2-1 tot A2-5, aangezien het geen vetzuurketen meer heeft, maar A2-1 is volledig vergelijkbaar met de afwijkende componenten. Er is dus geen pasklare verklaring voor het verschil in reactie. Tabel 4-2: Overzicht van de resultaten van de juistheid (bias (%)) en precisie (CV% (%)) runs voor de verschillende componenten voor QCL.

QCL

Colistine A

Colistine B

Teicoplanine A3-1

Teicoplanine A2-1

Teicoplanine A2-2 & A2-3

Teicoplanine A2-4 & A2-5

Vancomycine

Gemiddelde Concentratie (mg/L)

0,4632

0,9209

0,2391

0,1080

1,3058

0,1854

2,0210

SD

0,0417

0,0869

0,0215

0,0129

0,0855

0,0133

0,3193

Ware Concentratie (mg/L)

0,5420

1,066

0,2550

0,1160

1,2750

0,1890

2,0110

CV% (%)

8,99

9,43

8,99

11,94

6,54

7,16

15,80

BIAS (%)

-14,54

-13,61

-6,24

-6,95

2,42

-1,90

0,49

Tabel 4-3: Overzicht van de resultaten van de juistheid (bias (%)) en precisie (CV% (%)) runs voor de verschillende componenten voor QCM.

QCM

Colistine A

Colistine B

Teicoplanine A3-1

Teicoplanine A2-1

Teicoplanine A2-2 & A2-3

Teicoplanin A2-4 & A2-5

Vancomycine

Gemiddelde Concentratie (mg/L)

2,648

5,429

1,273

0,566

6,238

0,886

9,229

SD

0,252

0,517

0,153

0,0468

0,353

0,063

0,535

Ware Concentratie (mg/L)

2,649

5,294

1,276

0,582

6,383

0,948

10,057

CV% (%)

9,50

9,52

12,02

8,27

5,65

7,16

5,80

BIAS (%)

-0,02

2,55

-0,24

-2,70

-2,28

-6,50

-8,23

Tabel 4-4: overzicht van de resultaten van de juistheid (bias (%)) en precisie (CV% (%)) runs voor de verschillende componenten voor QCH.

QCH Gemiddelde Concentratie (mg/L) SD Ware Concentratie (mg/L) CV% (%) BIAS (%)

Colistine A

Colistine B

Teicoplanine A3-1

Teicoplanine A2-1

Teicoplanine A2-2 & A2-3

Teicoplanin A2-4 & A2-5

Vancomycine

24,17

45,90

10,36

4,81

51,04

7,77

83,93

2,61

4,02

0,83

0,42

3,64

0,38

6,35

24,27

47,69

11,49

5,23

57,45

8,53

90,60

10,80

8,76

8,03

8,69

7,13

4,89

7,57

-0,44

-3,75

-9,80

-8,08

-11,16

-8,92

-7,36

38

Tabel 4-5: overzicht van de resultaten van de juistheid (bias (%)) en precisie (CV% (%)) runs voor de verschillende componenten voor LLOQ.

LLOQ Gemiddelde Concentratie (mg/L) SD Ware Concentratie (mg/L) CV% (%) BIAS (%)

Colistine A

Colistine B

Teicoplanine A2-2 & A2-3

Teicoplanin A2-4 & A2-5

Vancomycine

0,2762

0,5188

0,2801

0,0976

0,9539

0,0367

0,0563

0,0497

0,0105

0,1473

0,271

0,533

0,319

0,095

1,006

13,30

10,85

17,74

10,74

15,45

1,91

-2,67

-12,20

2,75

-5,18

In principe kan het gebruik van gedeutereerde standaarden van de verschillende teicoplanine- en colistinecomponenten deze afwijkende resultaten laten verdwijnen. Deze zijn echter niet beschikbaar zoals vermeld in 4.3, vandaar dat we voorlopig gebruik maken van de eerder genoemde oplossingen. 4.6.3

Stabiliteit van de produg CMS

Vervolgens is de stabiliteit van de prodrug van colistine getest. De resultaten van dit experiment staan in Tabel 4-6. Tabel 4-6: Overzicht van de gemeten concentraties van colistine gevormd uit CMS op verschillende tijdstippen. Concentratie (mg/L) bij

Concentratie (mg/L) na 40

Concentratie (mg/L) na 2u

onmiddellijke staalvoorbereiding

min op kamertemperatuur

op kamertemperatuur

Colistine A

0,8

0,6

1,1

Colistine B

0,4

0,3

0,4

Component

Uit de resultaten kunnen we afleiden dat de omzetting naar colistine minimaal is. Zelfs na 2 uur op kamertemperatuur is er slechts een kleine hoeveelheid colistine gevormd uit CMS. De invloed op het eindresultaat van colistine zal dus verwaarloosbaar zijn. 4.6.4

Matrixeffect en terugvinding

De resultaten voor het matrixeffect (ME), de terugvinding (RE) en de procesefficiëntie (PE) staan in Tabel 4-7 voor de lage concentraties. Voor de hoge concentraties zijn de gegevens beschreven in Tabel 4-8. Voor het ME en de PE is geen resultaat gevonden in de lage concentraties voor alle componenten van colistine en teicoplanine (zie Tabel 4-7). Dit wordt veroorzaakt doordat er geen signaal is voor deze componenten in water, waardoor set 1 geen resultaten oplevert. Enkel voor vancomycine werd 39

een signaal opgetekend. Deze resultaten werden ook bevestigd na herhalen van het experiment. Voor set 2 en set 3 werden wel resultaten bekomen, waardoor de RE berekend kan worden. We zien hier echter resultaten tot 300 % terwijl de streefwaarde ± 100 % is. Bij teicoplanine A3-1 hebben we bovendien geen signaal in plasma voor set 2 en 3. Enkel voor kalfsserum krijgen we hier wel een signaal. Tabel 4-7: Overzicht van de resultaten verkregen voor ME, RE en PE voor lage concentraties van de verschillende componenten. Alle resultaten zijn uitgedrukt in percentages. De letter X staat voor geen resultaat. Met ‘Teico’ wordt teicoplanine bedoeld.

Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%)

Colistine A X X X X Colistine A 73,6 0 213,4

Colistine B X X X X Colistine B 96,5 109,8 83,0

Teico A3-1 X X X X Teico A3-1 X X X

Teico A2-1 X X X X Teico A2-1 147,9 261,2 301,3

Teico A2-2 & A2-3 X X X X Teico A2-2 & A2-3 255,4 252,7 208,6

Teico A2-4 & A2-5 X X X X Teico A2-4 & A2-5 155,5 148,5 181,9

Kalfsserum (%)

151,7

118,8

189,3

351,7

170,9

203,8

PROCES EFFICIENTIE Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%)

Colistine A X X X

Colistine B X X X

Teico A3-1 X X X

Teico A2-1 X X X

Teico A2-2 & A2-3 X X X

Teico A2-4 & A2-5 X X X

Kalfsserum (%)

X

X

X

X

X

X

MATRIX EFFECT Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Kalfsserum (%) TERUGVINDING

Vancomycine 173,7 141,1 120,2 220,9 Vancomycine 111,3 101,9 109,8 125,6 Vancomycine 193,3 143,9 131,9 277,4

In Tabel 4-8 kunnen ook een aantal opmerkelijke resultaten worden aangeduid. Er is nog steeds geen signaal in water voor teicoplanine A2-1 en teicoplanine A2-4 & A2-5, waardoor er geen waarden zijn voor set 1 om ME en PE mee te berekenen. Voor teicoplanine A2-2 & A2-3 wordt een matrixeffect opgetekend van ± 16000 % (in plaats van 100 %) wat te wijten is aan het zeer lage signaal in water. Bovendien is er ook voor de interne standaard pipD5 een matrixeffect van 2000 % dat niet verklaard kan worden. Hetzelfde fenomeen keert ook terug bij de procesefficiëntie, aangezien ook hier met set 1 (zeer laag signaal) gewerkt wordt. Er kan dus worden besloten dat de afwijkingen zich voornamelijk bij gebruik van water bevinden. Bij de terugvinding zien we dat er in de hoge concentraties vooral voor colistine een groot verlies optreedt. Aangezien de resultaten van het matrixeffect grote afwijkingen vertonen ten opzichte van wat we verwachten, werd hierna besloten om de validatie stop te zetten en uit te zoeken wat de oorzaak is van deze resultaten. Zoals bij accuraatheid en precisie reeds vermeld is, vertonen de meeste componenten een exponentiële curve (in plaats van een lineair verloop). Dit doet adsorptie 40

vermoeden. Ook de ongewone resultaten voor het matrixeffect hebben ons in deze richting doen denken. We hebben de (mogelijke) adsorptie dan ook proberen karakteriseren in het verdere verloop van deze masterproef. Tabel 4-8: Overzicht van de resultaten verkregen voor ME, RE en PE voor hoge concentraties van de verschillende componenten. Alle resultaten zijn uitgedrukt in percentages. De letter X staat voor geen resultaat. Met ‘Teico’ wordt teicoplanine bedoeld. MATRIX EFFECT

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Kalfsserum (%)

197,2 158,8 142,5 132,5

195,5 179,3 206,8 181,7

214, 4 214,2 224,6 289,5

X X X X

TERUGVINDING

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Kalfsserum (%)

47,2 52,3 48,4 74,1

49,5 46,4 44,4 69,8

64,1 74,4 57,5 88,3

129,8 104,8 119,0 121,1

PROCES EFFICIENTIE

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Kalfsserum (%)

93,2 103,7 103,3 173,9

96,8 83,3 91,8 126,8

137,5 159,3 129,2 255,7

X X X X

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

14342,5 18023,7 18558,5 16119,5 Teico A2-2 & A2-3 127,0 102,7 106,3 102,7 Teico A2-2 & A2-3 18215,7 18520,7 19723,4 16555,9

X X X X Teico A2-4 & A2-5 95,8 96,5 96,1 99,2 Teico A2-4 & A2-5 X X X X

Vancomycine

PipD5

117,6 87,83 141,1 98,28

2098,7 2180,2 2329,8 1200,8

Vancomycine

PipD5

75,3 100,9 63,3 102,7

47,2 52,3 48,4 74,1

Vancomycine

PipD5

88,6 88,6 89,4 100,9

2414,6 2392,4 2219,3 1697,5

4.7 Karakterisatie van de adsorptie 4.7.1

Invloed van de matrix

In Figuur 4-7 en Figuur 4-8 zijn enkel de resultaten voor colistine B en teicoplanine A2-2 & A2-3 opgelijst, omdat zij de voornaamste componenten zijn van de respectievelijke mengsels. De resultaten voor de overige componenten en vancomycine zijn te vinden in bijlage 5. Uit deze grafieken kan worden afgeleid dat er bij water een duidelijk verlies van analiet optreedt bij alle drie de antibiotica. Dit gebeurt in grotere mate bij colistine (bij vergelijking met teicoplanine en vancomycine). Het gebruik van water als medium heeft dus een belangrijke invloed op het signaal. Bij het gebruik van kalfsserum en humaan plasma is er onderling weinig verschil te zien bij de colistines, maar ook hier treedt een duidelijk verlies van signaal op in vergelijking met de ideale situatie. De afwijkingen ten opzichte van de referentie wijzen duidelijk op adsorptie bij colistine. Ook in de literatuur is dit reeds beschreven [64].

41

Voor teicoplanine ligt de zaak anders. Teicoplanine A2-2 & A2-3 wordt hier als typevoorbeeld gebruikt, de andere componenten reageren gelijkaardig. Hier liggen de resultaten voor kalfsserum en humaan plasma iets hoger dan verwacht op basis van de referentiecurve. Dit wijst op een matrixeffect door deze media, waarbij het signaal van de teicoplaninecomponenten wordt versterkt. Teicoplanine A3-1 reageert afwijkend ten opzichte van de andere teicoplanines, hier wordt geen te hoog signaal genoteerd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de licht verschillende structuur van A3-1, dat hydrofieler is. Voor vancomycine is er een vergelijkbaar verlies van signaal in water, kalfsserum en plasma. Dit wijst op een evenwaardige adsorptie in alle media. Bij één van de plasmastalen zijn de resultaten wel afwijkend, wat wijst op een variabele reactie van vancomycine in plasma.

Overzicht van de invloed van de matrix op colistine B %piekoppervlakte

100 80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum

20

Plasma 1

0

Plasma 2 0

20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Figuur 4-7: Overzicht van de invloed van verschillende matrices op dilutiereeksen van colistine B. Met referentie wordt het resultaat in de ideale situatie bedoeld.

Overzicht van de invloed van de matrix op teicoplanine A2-2 & A2-3 %piekoppervlakte

100 80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum

20

Plasma 1

0

Plasma 2 0

20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Figuur 4-8: Overzicht van de invloed van verschillende matrices op dilutiereeksen van teicoplanine A2-2 & A2-3. Met referentie wordt het resultaat in de ideale situatie bedoeld.

42

4.7.2

Invloed van verschillende materialen

Overzicht van de invloed van glaswerk op colistine B 100 %piekoppervlakte

Referentie 80 Glazen Buisje + Glazen Vial LowBind Epje + PP Vial Gewoon Epje + PP Vial Gewoon Epje + Glazen Vial

60 40 20 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Figuur 4-9: Overzicht van de resultaten voor dilutiereeksen van colistine B bij gebruik van verschillende materialen. Met referentie wordt het resultaat in de ideale situatie bedoeld.

In Figuur 4-9 wordt duidelijk dat het gebruik van glas niet aan te raden is voor colistine B. Bij het gebruik van gewone epjes en glazen vials (oorspronkelijke staalvoorbereiding), zien we ook verlies van analiet met een exponentiele kalibratiecurve tot gevolg. Het gebruik van ‘LoBind’ epjes en PP vials lijkt een licht beter resultaat op te leveren. Bij gewone epjes met PP vials zien we een te hoog signaal in de hoge concentraties. De resultaten voor colistine A zijn vergelijkbaar met die voor colistine B (zie bijlage 6).

%piekoppervlakte

Overzicht van de invloed van glaswerk op teicoplanine A2-2 & A2-3 100 Referentie

80

Glazen Buis + Glazen Vial LowBind Epje + PP vial Gewoon Epje + PP vial Gewoon Epje + Glazen vial

60 40 20 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Figuur 4-10: Overzicht van de resultaten voor dilutiereeksen van teicoplanine A2-2 & A2-3 bij gebruik van verschillende materialen. Met referentie wordt het resultaat in de ideale situatie bedoeld.

Voor teicoplanine (met A2-2 & A2-3 als typevoorbeeld) lijkt het gebruik van enkel glas dan weer de beste optie. De resultaten bij gebruik van andere materialen lijken niet significant te verschillen van elkaar en geven slechts een licht exponentiele curve. De resultaten voor de overige componenten zijn te vinden in bijlage 6. Ook hier reageert teicoplanine A3-1 licht verschillend van de andere componenten. Gebruik van uitsluitend glas geeft hier het meest afwijkende resultaat, de andere 43

combinaties van epjes en vials leveren betere uitkomsten. Ook hier is het verschil in reactie te verklaren door de afwijkende structuur van teicoplanine A3-1. Vancomycine geeft een sterk exponentiële curve bij gebruik van glas. PP vials geven duidelijk betere resultaten, welke soort epje wordt gebruikt lijkt minder van belang. Aangezien het gebruik van glas inhoudt dat het resultaat voor colistine en vancomycine duidelijk slechter wordt (hoewel het voor de teicoplanine A2 groep ideaal lijkt) hebben we gekozen voor een staalvoorbereiding met ‘LoBind’ epjes en PP vials als compromis. Onze methode houdt immers een gelijktijdige bepaling van deze antibiotica in, waardoor er moet gekozen worden voor de beste optie voor het geheel. Hoewel ‘LoBind’ epjes in onze experimenten geen duidelijk verschil lijken te geven, worden deze toch gekozen, aangezien ze speciaal ontwikkeld zijn om adsorptie van peptiden te beperken. Door Karvanen et al. [64] is bovendien beschreven dat ‘LoBind’ epjes wel een duidelijke verbetering geven voor colistine A en B. 4.7.3

Invloed van de naald voor staalname

Resultaten voor colistine B met roestvrij stalen naald bij gebruik van verschillende media % piekoppervlakte

100

Referentie

80

Water

60

Kalfsserum

40

Plasma 1

20

Plasma 2

0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Figuur 4-11: Resultaten van dilutiereeksen van colistine B in verschillende media bij gebruik van een roestvrij stalen staalnamenaald. Ter vergelijking werden ook de resultaten van een dilutiereeks in water bij gebruik van een PEEK-naald opgenomen in de grafiek.

De resultaten van het experiment zijn te vinden in Figuur 4-11 en Figuur 4-12 voor colistine B en teicoplanine A2-2 & A2-3, de meest abundante componenten van de respectievelijke mengsels. De resultaten van de overige componenten zijn te vinden in bijlage 7. Om een directe vergelijking met de resultaten van de PEEK-naald te maken werd ook het resultaat in water met deze naald in de grafiek geïncorporeerd. De grafieken tonen voor alle componenten aan dat het vervangen van de PEEK-naald door een roestvrij stalen naald een positieve invloed heeft op de resultaten. De curves zijn minder exponentieel dan voorheen, wat het vermoeden van adsorptie aan de naald bevestigt. De impact van het vervangen van de naald lijkt vooral groot voor colistine en teicoplanine, bij vancomycine is het effect minder groot, maar nog steeds aanwezig. 44

Uit dit experiment kan geconcludeerd worden dat een groot deel van de afwijkende resultaten voor colistine werd veroorzaakt door de naald voor staalname. Voor teicoplanine lijkt de invloed minder groot te zijn. De resultaten zijn nog steeds niet lineair, ondanks het vervangen van de naald, het beperken van het aantal stappen en het gebruik van ‘LoBind’ epjes en PP vials. Er kunnen echter geen extra maatregelen meer genomen worden. Aangezien de resultaten evenwel minder afwijking vertonen als voorheen, wordt opnieuw gestart met de validatie. Hiermee kan worden nagegaan of de resultaten voldoende verbeterd zijn. Omdat de afwijkende resultaten bij de eerdere validatie vooral duidelijk werden in het matrixeffect-experiment, wordt dit als eerste herhaald.

Resultaten voor teicoplanine A2-2 & A2-3 met roestvrij stalen naald bij gebruik verschillende media % piekoppervlakte

100

Referentie

80

Water

60

Kalfsserum

40

Plasma 1

20

Plasma 2

0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Figuur 4-12: Resultaten van dilutiereeksen van teicoplanine A2-2 & A2-3 in verschillende media bij gebruik van een roestvrij stalen staalnamenaald. Ter vergelijking worden ook de resultaten van een dilutiereeks in water bij gebruik van een PEEK-naald opgenomen.

4.7.4

Heruitvoeren van het matrixeffect

De resultaten voor het ME in de lage concentratierange voldoen aan de vooropgestelde criteria (zie Tabel 4-9). De afwijkingen ten opzichte van 100 % liggen immers binnen de verwachtingen (±30 %). Enkel voor teicoplanine A2-1 zijn nog grotere afwijkingen te zien (gemiddeld 157 % in plaats van 100 %), maar omdat dit procentueel de kleinste component is, wordt hier minder belang aan gehecht. Ook pipD5 vertoont nog een ME van gemiddeld 180 % in de lage concentratierange, maar aangezien deze interne standaard eerder een ME vertoonde van 2000 %, is dit wel reeds een behoorlijke verbetering. Een grote afwijking van pipD5 wordt niet gezien bij het experiment met hoge analietconcentraties. Verder onderzoek naar mogelijke oorzaken van dit verschil is noodzakelijk. Voor de PE en de RE zijn de resultaten nu zoals verwacht. Ze vertonen slechts beperkte afwijkingen vergelijkbaar met deze voor het ME. De resultaten voor PE en RE staan opgelijst in bijlage 8. De ingrepen die zijn uitgevoerd om de adsorptie in te perken, hebben dus een duidelijke verbetering teweeg gebracht. Er zijn nergens meer grote afwijkingen te zien zoals bij het eerdere matrixeffectexperiment. Ook in de hoge concentraties zijn de resultaten goed, zoals wordt getoond in Tabel 4-10 45

met betrekking tot het ME. Enkel voor vancomycine zijn hier afwijkende resultaten te vinden, maar aangezien dit uitsluitend bij hoge, supra-therapeutische spiegels is, werd besloten dat dit klinisch niet relevant is. Resultaten voor PE en RE in de hoge concentratierange kunnen worden teruggevonden in bijlage 8. Als besluit kan worden gesteld dat de methode geslaagd is voor het onderdeel matrixeffect. Tabel 4-9: Resultaten van het matrixeffect (%) voor de verschillende componenten in de lage concentratierange, evenals resultaten voor de interne standaarden (Teico = teicoplanine). ME LAAG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vancomycine

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum(%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%) Gemiddelde (%) SD CV% (%)

109,4 107,0 99,6 99,1 108,2 96,1 113,7 112,8 115,3 113,1 105,4 107,3 6,564 6,12

107,7 107,0 104,8 110,4 107,0 102,9 110,3 106,8 116,1 104,0 110,1 107,9 3,684 3,41

98,5 88,7 89,9 93,8 87,7 90,0 94,0 94,5 104,9 98,7 110,6 95,6 7,156 7,49

139,4 166,4 165,1 160,4 173,3 170,4 145,5 157,2 152,5 154,8 146,6 157,4 10,887 6,92

118,7 114,1 118,8 119,5 119,7 118,1 131,6 132,6 127,2 127,7 127,4 123,2 6,214 5,04

103,4 96,7 97,1 102,2 90,6 115,3 109,6 105,9 112,1 111,4 100,7 104,1 7,600 7,30

111,7 93,9 86,9 83,2 93,5 87,7 89,6 102,7 103,7 85,7 88,0 93,3 9,001 9,64

188,7 191,0 189,5 187,9 183,3 178,9 169,6 169,0 174,6 175,7 178,0 180,6 7,987 4,42

104,5 107,3 116,8 116,2 114,8 127,0 96,6 101,3 105,2 106,9 107,1 109,5 8,531 7,80

Tabel 4-10: Resultaten van het matrixeffect voor de verschillende componenten in de hoge concentratierange, evenals resultaten voor de interne standaarden (Teico = teicoplanine). ME HOOG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vanco

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum (%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%) Gemiddelde (%) SD CV% (%)

97,7 96,6 98,3 93,8 98,2 91,8 100,7 100,0 96,00 97,3 99,2 91,8

108,3 108,6 113,5 106,1 110,0 104,5 110,1 114,8 112,7 108,1 106,4 104,5

78,9 85,4 86,8 78,8 89,6 80,7 92,5 93,1 89,6 90,7 88,9 80,7

73,3 83,8 70,3 73,5 73,1 75,5 84,3 88,0 75,7 88,3 82,1 75,5

65,3 69,2 62,0 62,1 65,0 66,6 77,6 77,1 69,2 76,6 75,2 66,6

58,5 63,7 61,7 59,4 57,8 71,9 66,5 67,8 66,9 72,7 61,8 71,9

448,5 435,7 445,2 425,2 458,9 444,0 486,6 483,1 455,7 384,9 468,0 444,0

125,9 115,9 131,1 137,7 118,8 110,0 104,5 114,9 134,1 108,2 121,3 110,0

114,5 112,9 105,5 121,7 102,1 105,6 93,2 104,4 112,8 98,6 108,5 105,6

2,952 3,05

3,395 3,12

5,295 6,13

6,272 7,98

5,824 8,40

5,361 8,24

26,955 6,01

10,835 9,08

7,639 7,13

4.8 Methodevergelijking Op de resultaten van de methodevergelijking voor teicoplanine (LC-MS/MS versus immunoassay (IA)) werd Passing-Bablok regressie uitgevoerd (zie Figuur 4-13). De verkregen relatie kan worden uitgedrukt met de vergelijking “LC-MS/MS = 1,338356 + 0,907305 IA”. De waarde voor het snijpunt met de y-as van de rechte (1,338356) is niet significant verschillend van 0, aangezien 0 tot het 95 % betrouwbaarheidsinterval (BI) [-3,9307 ; 7,2942] behoort. Op basis hiervan kan gesteld worden dat er 46

geen systematisch verschil is tussen de beide methoden. Er is echter wel een zeer grote spreiding tussen de resultaten, wat toch wijst op een probleem van de LC-MS/MS methode ten opzichte van de IA. De waarde voor de helling (0,907305) is niet significant verschillend van 1, aangezien 1 nog tot het 95 % BI [0,6225 ; 1,1590] behoort. Er zijn dus geen significante proportionele verschillen, maar ook hier valt de grote spreiding op van de resultaten. De ‘random’ verschillen vertonen bovendien ook een grote spreiding: het ± 1,96 RSD Interval bedraagt [-6,7195 ; 6,7195], wat er op kan wijzen dat de twee methoden niet vergelijkbaar zijn. 45 40 35

LCMS

30 25 20 15 10 5 5

10

15

20

25

30

35

40

45

Immunoassay

Figuur 4-13: Resultaten van de Passing-Bablok regressie voor de vergelijking van de uitkomsten van LCMS/MS en de IA met betrekking tot de concentratie van totaal teicoplanine. 60

(Immunoassay - LCMS) / Average %

+1.96 SD 40

42,3

20 Mean 0

1,2

-20 -1.96 SD

-40

-39,9

-60 5

10

15

20

25

30

35

40

45

Mean of Immunoassay and LCMS

Figuur 4-14: Resultaten van de Bland-Altman plot voor de vergelijking van de uitkomsten van LCMS/MS en de immunoassay met betrekking tot de concentratie van totaal teicoplanine. De y-as drukt het procentueel verschil tussen de twee methoden uit.

Er is ook nog een Bland-Altman plot gemaakt (zie Figuur 4-14). Hieruit kan worden afgeleid dat er een zeer grote spreiding van de resultaten is (±1,96 SD van het gemiddeld procentueel verschil = ±41,1 %). De LC-MS/MS methode is dus nog niet perfect, maar aangezien gemiddeld wel correcte resultaten werden verkregen, werd toch verder gegaan met de validatie. 47

4.9 Within-Run Precisie In het finale experiment van deze masterproef werd de within-run precisie nagegaan van de ontwikkelde methode. De resultaten staan opgelijst in Tabel 4-11 voor de precisie (CV%) en in Tabel 4-12 voor de accuraatheid (bias). De concentratie van teicoplanine A3-1 en A2-1 bij LLOQ was te laag om te meten, vandaar dat er geen resultaten zijn voor de precisie en accuraatheid. Tabel 4-11: Resultaten van within-run precisie (uitgedrukt als CV%) voor elke component. Zowel de gemiddelde concentratie (mg/L), de CV% (%) als de gebruikte interne standaard worden vermeld voor LLOQ, QCL, QCM en QCH. Mean staat voor de gemiddelde concentratie, X betekent dat er geen waarde gemeten kon worden. Component

Interne Standaard

Colistine A Colistine B Teicoplanine A3-1 Teicoplanine A2-1 Teicoplanine A2-2 & A2-3 Teicoplanine A2-4 & A2-5 Vancomycine

LLOQ (%)

QCL (%)

QCM (%)

QCH (%)

Mean (mg/L)

CV% (%)

Mean (mg/L)

CV% (%)

Mean (mg/L)

CV% (%)

Mean (mg/L)

CV% (%)

PMB

0,322

6,55

0,576

7,98

2,646

3,24

23,548

4,90

PMB

0,511

8,49

0,954

6,08

4,711

6,89

46,008

3,83

PipD5

X

X

0,284

6,75

1,374

4,00

11,452

5,86

PipD5

X

X

0,115

12,43

0,559

8,68

5,748

5,71

PipD5

0,379

5,02

1,438

10,15

6,522

5,19

56,208

11,55

PipD5

0,107

12,57

0,187

7,71

0,871

3,15

8,212

9,70

PipD5

1,103

5,62

2,172

6,10

10,514

6,24

101,071

4,69

Tabel 4-12: Resultaten van de juistheid (uitgedrukt als bias (%)) voor elke component. Zowel de gebruikte interne standaard, de targetconcentratie (mg/L) als de bias op LLOQ, QCL, QCM als QCH worden vermeld. Target staat voor de targetconcentratie, X betekent dat er geen waarde gemeten kon worden. Component

Interne Standaard

Colistine A Colistine B Teicoplanine A31 Teicoplanine A21 Teicoplanine A22 & A2-3 Teicoplanine A24 & A2-5 Vancomycine

LLOQ (%)

QCL (%)

QCM (%)

QCH (%)

Target (mg/L)

BIAS (%)

Target (mg/L)

BIAS (%)

Target (mg/L)

BIAS (%)

Target (mg/L)

BIAS (%)

PMB

0,271

18,91

0,542

6,29

2,649

-0,11

24,273

-2,99

PMB

0,533

-4,06

1,066

-10,49

5,294

-11,01

47,691

-3,53

PipD5

X

X

0,255

11,27

1,276

7,67

11,486

-0,30

PipD5

X

X

0,116

-1,23

0,582

-3,90

5,234

9,81

PipD5

0,319

18,96

1,275

12,79

6,383

2,17

57,447

-2,16

PipD5

0,095

12,97

0,189

-1,13

0,948

-8,14

8,531

-3,74

PipD5

1,006

9,67

2,011

8,03

10,057

4,54

90,60

11,56

Voor colistine A en B geeft de interne standaard PMB de beste resultaten. PipD5 is de beste interne standaard voor alle teicoplaninecomponenten en vancomycine. In tegenstelling tot eerdere resultaten (zie 4.6.2) die aangaven dat teicoplanine A2-2 & A2-3 en teicoplanine A2-4 & A2-5 extern gekalibreerd dienden te worden, lijkt dit nu niet meer nodig. Dit heeft mogelijk te maken met het 48

gebruik van de nieuwe naald. Deze heeft vermoedelijk ook gezorgd voor betere resultaten voor colistine A en B, waardoor het gebruik van twee kalibratiecurves niet meer nodig is. Uit Tabel 4-11 en Tabel 4-12 kan afgeleid worden dat de methode voldoet aan de voorwaarden met betrekking tot de precisie en de accuraatheid. Voor geen enkele component wordt een CV% hoger dan 15 % genoteerd, noch wordt voor juistheid een afwijking groter dan 15 % in de QC’s en 20 % in de LLOQ vastgesteld. We kunnen besluiten dat aan dit onderdeel van de validatie is voldaan. Dit experiment omvatte echter nog een tweede luik, waarbij ook de commerciële QC’s van de teicoplanine-immunoassay in zevenvoud werden bepaald. In Tabel 4-13 staan de resultaten voor de precisie (uitgedrukt als CV%). Nergens wordt een afwijking groter dan 15 % gerapporteerd. Bij het berekenen van de totale concentratie van de QC’s worden echter afwijkende resultaten opgetekend. Hiervoor

tellen

we

de

gemiddeld

gemeten

concentraties

van

de

verschillende

teicoplaninecomponenten op. Uit de resultaten in Tabel 4-14 kan worden afgeleid dat de juistheid van de methode niet aan de vooropgestelde criteria voldoet. De gemeten concentratie van de QC’s ligt immers 40 tot 50 % lager dan de werkelijke waarde. Dit wijst er opnieuw op dat er iets fout zit in de concentratiebepaling bij de teicoplaninecomponenten, wat ook al werd vermoed bij de methodevergelijking. Verder onderzoek is hier vereist. Tabel 4-13: Variatiecoëfficiënten van QCL, QCM en QCH van de teicoplanine-immunoassay.

CV%

QCL

QCM

QCH

Teicoplanine A3-1 (%) Teicoplanine A2-1 (%) Teicoplanine A2-2 & A2-3 (%) Teicoplanine A2-4&A2-5 (%)

10,35 8,25 5,41 8,12

8,43 5,91 2,41 2,74

7,19 4,86 3,72 4,29

Totaal teicoplanine (%)

5,80

2,20

3,79

Tabel 4-14: Gemiddelde concentraties van de verschillende componenten van teicoplanine voor QCL, QCM en QCH. Ook de bias (%) wordt vermeld. GEMIDDELDE CONCENTRATIE

QCL

QCM

QCH

10

35

75

Teicoplanine A3-1 (mg/L) Teicoplanine A2-1 (mg/L) Teicoplanine A2-2 & A2-3 (mg/L) Teicoplanine A2-4 & A2-5 (mg/L)

0,47 0,70 3,70 1,17

1,66 2,56 11,44 4,14

2,63 4,19 20,81 8,40

Totaal teicoplanine (mg/L)

6,04

19,80

36,03

-39,57

-43,43

-51,96

Nominale Waarde (mg/L)

Bias (%)

49

5 CONCLUSIES Het doel van deze masterproef, meer bepaald de ontwikkeling en validatie van een UHPLC-MS/MS methode voor de gelijktijdige bepaling van de drie antibiotica vancomycine, teicoplanine en colistine, werd niet gehaald. Er is een methode ontwikkeld, gebaseerd op deze van Tsai et al. [1]. Er is geoptimaliseerd voor de chromatografische en massaspectrometrische parameters. Een geschikte staalvoorbereiding werd gekozen, meer bepaald eiwitprecipitatie met acetonitrile. Vervolgens is de samenstelling van de mengsels van teicoplanine en colistine bepaald met behulp van LC-DAD. Teicoplanine A2-2 en colistine B bleken de voornaamste componenten te zijn van de respectievelijke mengsels. Daarna werd overgegaan tot de validatie van de ontwikkelde methode volgens de FDA richtlijnen, maar de methode bleek niet aan de vooropgestelde criteria te voldoen. De selectiviteit van de methode voldeed aan de voorwaarden, aangezien nergens een interfererende piek gevonden werd bij de verschillende componenten in blanco plasmastalen van patiënten. Het matrixeffectexperiment heeft echter aangetoond dat onze methode niet optimaal werkt, wat ook al duidelijk was geworden tijdens het uittesten van de accuraatheid en precisie. Hierbij moest immers gewerkt worden met twee kalibratiecurves voor colistine A en B, terwijl teicoplanine A2-2 & A2-3 en teicoplanine A2-4 & A2-5 extern gekalibreerd dienden te worden. Voor het matrixeffect werd bij teicoplanine A2-2 & A2-3 een resultaat van 15000 % gerapporteerd in plaats van de beoogde 100 %, terwijl teicoplanine A2-1 en A2-4 & A2-5 geen resultaat opleverden. De methode voldeed dus niet aan de verwachtingen en de validatie werd stopgezet. De methode van Tsai et al. [1] kon dus niet als dusdanig gereproduceerd worden. Adsorptie van de drie peptide-antibiotica aan allerhande materialen kon de afwijkende resultaten verklaren. Vooral voor colistine A en B bleek adsorptie een belangrijke invloedsfactor te zijn, zoals ook reeds werd beschreven door Karvanen et al. [64]. Na het uittesten van de invloed van diverse media en verschillende materialen, werd ook de PEEK-naald vervangen door een roestvrij stalen naald. De resultaten verbeterden merkbaar door deze ingreep, vooral voor colistine. Voor teicoplanine bleek adsorptie een minder bepalende factor te zijn, maar ook hier werd een verbetering gezien met de roestvrij stalen naald. Er is dan ook besloten om de validatie te hernemen. Opnieuw uitvoeren van het matrixeffect-experiment leverde resultaten op die aan de verwachtingen voldeden. De resultaten bevonden zich nu grotendeels binnen 100 ± 30 % voor alle componenten. Deze proef werd gevolgd door een methodevergelijking voor teicoplanine, aangezien dit een snelle 50

indicatie kan geven of een nieuwe methode resultaten geeft die vergelijkbaar zijn met deze van reeds gevalideerde methoden. Hieruit bleek echter dat de methode nog steeds niet aan de verwachtingen voldeed, aangezien er een zeer grote variatie zat op de resultaten van patiëntenstalen bij vergelijking van de twee methoden. Ook het within-run precisie toonde afwijkingen van de methode aan, aangezien de commerciële QC’s van de reeds bestaande teicoplanine-immunoassay grote afwijkingen qua accuraatheid vertoonden met de nieuwe LC-MS/MS methode. Verder onderzoek zal deze afwijkende resultaten voor teicoplanine moeten uitklaren. Mogelijke oplossingen zijn echter niet meteen beschikbaar, aangezien dergelijke bevindingen nog niet beschreven zijn in de literatuur. Mogelijk zal in de toekomst gekozen worden voor de ontwikkeling van twee afzonderlijke methoden, één voor colistine en één voor teicoplanine (voor vancomycine is een bijkomende methode minder belangrijk in het laboratorium). Bij de simultane bepaling van verschillende verbindingen moet er immers steeds naar compromissen worden gezocht, waardoor niet altijd de optimale omstandigheden worden bekomen voor elke stof. Voor de afzonderlijke bepaling van teicoplanine en colistine is dit wel mogelijk. Er zijn bovendien al meerdere individuele bepalingsmethoden beschreven in de literatuur, zowel voor colistine [38, 45, 63] als teicoplanine [23, 24]. De momenteel ontwikkelde methode is vermoedelijk wel geschikt voor de afzonderlijke bepaling van colistine A en B, aangezien adsorptie hier de voornaamste oorzaak was van de afwijkende resultaten. Een verdere validatie zal moeten uitwijzen of de methode voldoet aan de verwachtingen. Eén van de voornaamste tekortkomingen van deze methode is het ontbreken van een goede interne standaard voor teicoplanine. Vaak wordt in de literatuur immers vancomycine gebruikt, aangezien gedeutereerde teicoplanine niet beschikbaar is [24]. Bij een afzonderlijke bepalingsmethode is het wel mogelijk vancomycine te gebruiken in plaats van het structureel niet-verwante pipD5. Dit zal vermoedelijk aanleiding geven tot betere resultaten voor teicoplanine. Als algemene conclusie kan gesteld worden dat de ontwikkeling van een methode voor de gelijktijdige bepaling van teicoplanine, colistine en vancomycine niet mogelijk was binnen het tijdsbestek van deze masterproef. De resultaten van het artikel van Tsai et al. [1] waarop de methode is gebaseerd bleken niet te reproduceren. Er werd twee maal een poging ondernomen tot validatie, maar door onder meer adsorptie van de drie antibiotica is methodevalidatie niet gelukt. Verder onderzoek naar oorzaken van de afwijkende resultaten is gewenst.

51

6 LITERATUURLIJST 1.

2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

12.

13.

14.

15.

16.

17. 18. 19.

20.

Tsai IL, Sun HY, Chen GY, Lin SW, Kuo CH: Simultaneous quantification of antimicrobial agents for multidrug-resistant bacterial infections in human plasma by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Talanta 2013, 116:593-603. Llorente Fernandez E, Pares L, Ajuria I, Bandres F, Castanyer B, Campos F, Farre C, Pou L, Queralto JM, To-Figueras J: State of the art in therapeutic drug monitoring. Clin Chem Lab Med 2010, 48(4):437-446. Eliasson E, Lindh JD, Malmstrom RE, Beck O, Dahl ML: Therapeutic drug monitoring for tomorrow. Eur J Clin Pharmacol 2013, 69 Suppl 1:25-32. Adaway JE, Keevil BG: Therapeutic drug monitoring and LC-MS/MS. J Chromatogr B 2012, 883:33-49. Roberts JA, Norris R, Paterson DL, Martin JH: Therapeutic drug monitoring of antimicrobials. Br J Clin Pharmacol 2012, 73(1):27-36. Garcia-Ruiz C, Marina ML: Recent advances in the analysis of antibiotics by capillary electrophoresis. Electrophoresis 2006, 27(1):266-282. Moellering RC, Jr., Krogstad DJ, Greenblatt DJ: Vancomycin therapy in patients with impaired renal function: a nomogram for dosage. Ann Intern Med 1981, 94(3):343-346. Li L, Miles MV, Lakkis H, Zaritsky AL: Vancomycin-binding characteristics in patients with serious infections. Pharmacotherapy 1996, 16(6):1024-1029. Ackerman BH, Taylor EH, Olsen KM, Abdel-Malak W, Pappas AA: Vancomycin serum protein binding determination by ultrafiltration. Drug Intell Clin Pharm 1988, 22(4):300-303. Rybak MJ: The pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of vancomycin. Clin Infect Dis 2006, 42 Suppl 1:S35-39. Avent ML, Vaska VL, Rogers BA, Cheng AC, van Hal SJ, Holmes NE, Howden BP, Paterson DL: Vancomycin therapeutics and monitoring: a contemporary approach. Intern Med J 2013, 43(2):110-119. Cass RT, Villa JS, Karr DE, Schmidt DE, Jr.: Rapid bioanalysis of vancomycin in serum and urine by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry using online sample extraction and parallel analytical columns. Rapid Commun Mass Spectrom 2001, 15(6):406-412. Putty S, Vemula H, Bobba S, Gutheil WG: A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant enterococci. Anal Biochem 2013, 442(2):166-171. Dykhuizen RS, Harvey G, Stephenson N, Nathwani D, Gould IM: PROTEIN-BINDING AND SERUM BACTERICIDAL ACTIVITIES OF VANCOMYCIN AND TEICOPLANIN. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39(8):1842-1847. Jia Y, Bois-Choussy M, Malabarba A, Brunati C, Zhu J: Importance of the structure of vancomycin binding pocket in designing compounds active against vancomycin-resistant enterococci (VRE). J Antibiot (Tokyo) 2006, 59(9):543-552. Howden BP, Davies JK, Johnson PDR, Stinear TP, Grayson ML: Reduced Vancomycin Susceptibility in Staphylococcus aureus, Including Vancomycin-Intermediate and Heterogeneous Vancomycin-Intermediate Strains: Resistance Mechanisms, Laboratory Detection, and Clinical Implications. Clin Microbiol Rev 2010, 23(1):99-+. Ye ZK, Tang HL, Zhai SD: Benefits of therapeutic drug monitoring of vancomycin: a systematic review and meta-analysis. PLoS One 2013, 8(10):e77169. Moellering RC, Jr.: Vancomycin: a 50-year reassessment. Clin Infect Dis 2006, 42 Suppl 1:S3-4. Elyasi S, Khalili H, Dashti-Khavidaki S, Mohammadpour A: Vancomycin-induced nephrotoxicity: mechanism, incidence, risk factors and special populations. A literature review. Eur J Clin Pharmacol 2012, 68(9):1243-1255. Rybak MJ, Albrecht LM, Boike SC, Chandrasekar PH: Nephrotoxicity of vancomycin, alone and with an aminoglycoside. J Antimicrob Chemother 1990, 25(4):679-687. 52

21. 22. 23.

24.

25. 26.

27.

28. 29. 30.

31. 32.

33.

34. 35. 36.

37.

38.

39.

Bauters T, Claus B, Schelstraete P, Robays H, Benoit Y, Dhooge C: Vancomycin-induced red man syndrome in pediatric oncology: still an issue? Int J Clin Phar, 2012, 34(1):13-16. de Hoog M, Mouton JW, van den Anker JN: Why monitor peak vancomycin concentrations? Lancet 1995, 345(8950):646; author reply 646-647. Fung FHY, Tang JCY, Hopkins JPP, Dutton JJ, Bailey LM, Davison AS: Measurement of teicoplanin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: development of a novel method. Ann Clin Biochem 2012, 49:475-481. Mueller DM, von Eckardstein A, Saleh L: Quantification of teicoplanin in plasma by LC-MS with online sample clean-up and comparison with QMS(R) assay. Clin Chem Lab Med 2014:1-9. Shen J, Jiao Z, Zhou YN, Zhu HL, Song ZJ: Quantification of teicoplanin in human plasma by liquid chromatography with ultraviolet detection. Chromatographia 2007, 65(1-2):9-12. Verbist L, Tjandramaga B, Hendrickx B, Van Hecken A, Van Melle P, Verbesselt R, Verhaegen J, De Schepper PJ: In vitro activity and human pharmacokinetics of teicoplanin. Antimicrob Agents Chemother 1984, 26(6):881-886. Caillon J, Juvin ME, Pirault JL, Drugeon HB: [Bactericidal effect of daptomycin (LY 146032) compared with vancomycine and teicoplanin against gram-positive bacteria]. Pathol Biol (Paris) 1989, 37(5 Pt 2):540-548. Teicoplanin monograph. In: European Pharmacopeia 8th Edition. Strasbourg (France) Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe; 2009: 3367-3369. Schaison G, Graninger W, Bouza E: Teicoplanin in the treatment of serious infection. J Chemother 2000, 12 Suppl 5:26-33. de Lalla F, Nicolin R, Rinaldi E, Scarpellini P, Rigoli R, Manfrin V, Tramarin A: Prospective study of oral teicoplanin versus oral vancomycin for therapy of pseudomembranous colitis and Clostridium difficile-associated diarrhea. Antimicrob Agents Chemother 1992, 36(10):2192-2196. Harding I, Sorgel F: Comparative pharmacokinetics of teicoplanin and vancomycin. J Chemother 2000, 12 Suppl 5:15-20. Matthews PC, Chue AL, Wyllie D, Barnett A, Isinkaye T, Jefferies L, Lovering A, Scarborough M: Increased teicoplanin doses are associated with improved serum levels but not drug toxicity. J Infect 2014, 68(1):43-49. Davani S, Berard M, Royer B, Kantelip JP, Muret P: Comparison of fluorescence polarization immunoassay and high-performance liquid chromatography methods for assay of teicoplanin: can correlation be improved? Pathol Biol 2004, 52(10):584-588. Wilson AP: Comparative safety of teicoplanin and vancomycin. Int J Antimicrob Agents 1998, 10(2):143-152. Tobin CM, Lovering AM, Sweeney E, MacGowan AP: Analyses of teicoplanin concentrations from 1994 to 2006 from a UK assay service. J Antimicrob Chemother 2010, 65(10):2155-2157. Matsumoto K, Kanazawa N, Watanabe E, Yokoyama Y, Fukamizu T, Shimodozono Y, Maeda C, Yasuda T, Kakihana Y, Ikawa K et al: Development of initial loading procedure for teicoplanin in critically ill patients with severe infections. Biol Pharm Bull 2013, 36(6):10241026. Hanada K, Kobayashi A, Okamori Y, Kimura T, Ogata H: Improved quantitative determination of total and unbound concentrations of six teicoplanin components in human plasma by high performance liquid chromatography. Biol Pharm Bull 2005, 28(10):2023-2025. Xu YJ, Tian XH, Ren CB, Huang H, Zhang XZ, Gong XH, Liu HH, Yu ZQ, Zhang LM: Analysis of colistin A and B in fishery products by ultra performance liquid chromatography with positive electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 2012, 899:1420. Dotsikas Y, Markopoulou CK, Koundourellis JE, Loukas YL: Validation of a novel LC-MS/MS method for the quantitation of colistin A and B in human plasma. J Sep Sci 2011, 34(1):3745. 53

40.

41. 42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51. 52. 53. 54.

55.

56. 57.

Gikas E, Bazoti FN, Katsimardou M, Anagnostopoulos D, Papanikolaou K, Inglezos I, Skoutelis A, Daikos GL, Tsarbopoulos A: Determination of colistin A and colistin B in human plasma by UPLC-ESI high resolution tandem MS: Application to a pharmacokinetic study. J Pharm Biomed Anal 2013, 83:228-236. Biswas S, Brunel JM, Dubus JC, Reynaud-Gaubert M, Rolain JM: Colistin: an update on the antibiotic of the 21st century. Expert Rev Anti-Infect Ther 2012, 10(8):917-934. Vaara M, Fox J, Loidl G, Siikanen O, Apajalahti J, Hansen F, Frimodt-Moller N, Nagai J, Takano M, Vaara T: Novel polymyxin derivatives carrying only three positive charges are effective antibacterial agents. Antimicrob Agents Chemother 2008, 52(9):3229-3236. Elverdam I, Larsen P, Lund E: Isolation and characterization of three new polymyxins in polymyxins B and E by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1981, 218:653-661. Decolin D, Leroy P, Nicolas A, Archimbault P: Hyphenated liquid chromatographic method for the determination of colistin residues in bovine tissues. J Chromatogr Sci 1997, 35(12):557-564. Cheng C, Liu SR, Xiao DQ, Hollembaek J, Yao LL, Lin J, Hansel S: LC-MS/MS method development and validation for the determination of polymyxins and vancomycin in rat plasma. J Chromatogr B 2010, 878(28):2831-2838. Li J, Nation RL, Turnidge JD, Milne RW, Coulthard K, Rayner CR, Paterson DL: Colistin: the reemerging antibiotic for multidrug-resistant Gram-negative bacterial infections. Lancet Infect Dis 2006, 6(9):589-601. Bergen PJ, Li J, Rayner CR, Nation RL: Colistin methanesulfonate is an inactive prodrug of colistin against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2006, 50(6):19531958. Wallace SJ, Li J, Rayner CR, Coulthard K, Nation RL: Stability of colistin methanesulfonate in pharmaceutical products and solutions for administration to patients. Antimicrob Agents Chemother 2008, 52(9):3047-3051. Li J, Milne RW, Nation RL, Turnidge JD, Smeaton TC, Coulthard K: Pharmacokinetics of colistin methanesulphonate and colistin in rats following an intravenous dose of colistin methanesulphonate. J Antimicrob Chemother 2004, 53(5):837-840. Corvec S, Furustrand Tafin U, Betrisey B, Borens O, Trampuz A: Activities of fosfomycin, tigecycline, colistin, and gentamicin against extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli in a foreign-body infection model. Antimicrob Agents Chemother 2013, 57(3):1421-1427. Falagas ME, Kasiakou SK: Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections. Clin Infect Dis 2005, 40(9):1333-1341. Yahav D, Farbman L, Leibovici L, Paul M: Colistin: new lessons on an old antibiotic. Clin Microbiol Infect 2012, 18(1):18-29. Newton BA: The properties and mode of action of the polymyxins. Bacteriol Rev 1956, 20(1):14-27. Aucella F, Lauriola V, Vecchione G, Tiscia GL, Grandone E: Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method as the golden standard for therapeutic drug monitoring in renal transplant. J Pharm Biomed Anal 2013, 86:123-126. Najjar TA, al-Dhuwailie AA, Tekle A: Comparison of high-performance liquid chromatography with fluorescence polarization immunoassay for the analysis of vancomycin in patients with chronic renal failure. J Chromatogr B Biomed Appl 1995, 672(2):295-299. Yu L, Zhong M, Wei Y: Direct fluorescence polarization assay for the detection of glycopeptide antibiotics. Anal Chem 2010, 82(16):7044-7048. Smith DS, Eremin SA: Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem 2008, 391(5):1499-1507. 54

58. 59.

60. 61. 62. 63.

64.

FDA: Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. In. United States; 2001: 1-22. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM: Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Anal Chem 2003, 75(13):3019-3030. Colistin Sulphate. In: European Pharmacopeia 5th Edition. Strasbourg (France): Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe; 2005: 1361-1362. Goebel-Stengel M, Stengel A, Tache Y, Reeve JR, Jr.: The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem 2011, 414(1):38-46. Stejskal K, Potesil D, Zdrahal Z: Suppression of peptide sample losses in autosampler vials. J Proteome Res 2013, 12(6):3057-3062. Leporati M, Bua RO, Mariano F, Carignano P, Stella M, Biancone L, Vincenti M: Determination by LC-MS/MS of Colistins A and B in Plasma and Ultrafiltrate From Critically Ill Patients Undergoing Continuous Venovenous Hemodiafiltration. Ther Drug Monit 2014, 36(2):182-191. Karvanen M: Optimization of Colistin Dosage in the Treatment of Multiresistant Gramnegative Infections. Hörsalen: Uppsala; 2013.

55

BIJLAGEN BIJLAGE 1: INTERNATIONALISATION @ HOME In de inaugurale lezing heeft Prof. Dr. Daan J.A. Crommelin een overzicht gegeven van de evolutie die de farmaceutische wereld heeft doorgemaakt de voorbije decennia. Een mooi voorbeeld hierbij zijn de grote geneesmiddelblockbusters. Tot 30 jaar geleden werden hier voornamelijk 'small molecules' zoals ACE-inhibitoren en statines bij gezien. Tegenwoordig zijn dit met voorsprong de biologicals. Een aspect dat werd benadrukt tijdens deze lezing was het 'precautionary principle'. Er zijn tegenwoordig zeer veel regels die ons moeten beschermen, maar er wordt hierdoor zeer weinig ruimte gelaten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Zo zouden aspirine en paracetamol met de huidige regels nooit op de markt zijn geraakt omwille van het hoge veiligheidsrisico. In de lezing werd de parallel met het wiel en de ladder getrokken, die volgens dezelfde analogie veel te gevaarlijk zouden zijn omwille van het risico op verwondingen. De boodschap van professor Crommelin lijkt me te zijn dat alles op zijn manier gevaarlijk is en dat we ons dus momenteel meer zorgen maken over de risico's van geneesmiddelen dan nodig is. In de tweede lezing van prof. Crommelin kwamen we meer te weten over biotech geneesmiddelen. Deze zogenaamde biologicals winnen sterk aan belang, zo was in 2012 meer dan de helft van de blockbustergeneesmiddelen een biotech geneesmiddel. Er zijn echter nadelen verbonden aan deze biologicals: enerzijds heb je de hoge kostprijs en anderzijds zorgt de stabiliteit voor problemen. Biologicals zijn immers proteïnen, die vooral gestabiliseerd worden door niet-covalente en dus relatief zwakke interacties. Bewaaromstandigheden zijn dus heel belangrijk en moeten strikt opgevolgd worden. Een ander nadeel dat hiermee verbonden is, vinden we in de toedieningsvorm: enkel injectie is mogelijk. Bij orale inname worden biologicals immers volledig afgebroken. Er is wel al veel onderzoek verricht naar andere toedieningsvormen. In het verleden werd bijvoorbeeld geprobeerd insuline toe te dienen via de huid en de mond, maar dit bleef echter zonder succes. Enkel via de pulmonaire route werd wat absorptie gezien (±10 %), maar toepassingen hierop zijn niet erg succesvol. Tegenwoordig zijn er wel enkele veelbelovende 'naald-vrije' technieken in ontwikkeling, zoals bv. de naald-vrije jet injectors die gebruik maken van micro- of nanopartikels. Hier moet echter nog veel onderzoek naar verricht worden. Er zijn ook risico's verbonden aan het gebruik van biofarmaceuticals: zo houden ze een hoog risico van heterogeniciteit in. Dit kan geïllustreerd worden door de Tegenerotragedie, waarbij vrijwiligers bijna stierven bij het testen van het geneesmiddel. Hierna werden de regels voor het testen van biologicals verstrengd. Dit vind ik persoonlijk wel belangrijk, aangezien zeer kleine veranderingen in de structuur van biotech geneesmiddelen al een immuunreactie kunnen veroorzaken. Er moet

daarom ook bijzonder belang worden gehecht aan het productieproces, alsook aan de bewaring. De apotheker speelt daar in het eindstadium van aflevering ook een belangrijke rol in vind ik. Hij moet zorgen dat de biologicals die hij aflevert altijd op de juiste temperatuur zijn bewaard. De apotheker is dus een belangrijke schakel in de kwaliteitscontrole. Het is belangrijk dat apothekers worden gewezen op hun rol en op alles waar ze rekening mee moeten houden. Iets interessant dat ik heb opgepikt tijdens de derde lezing is het nut van scenario analyse. Dit zijn denkoefeningen die ons dwingen om na te denken over een toekomst die we misschien niet meteen wensen. Mensen denken immers vaak in lineaire termen, maar het verleden heeft reeds uitgewezen dat ook abrupte veranderingen kunnen optreden. Scenario analyse helpt om hiermee rekening te houden. De farmaceutische wereld verandert immers net zo snel als de rest van de wereld. Zo is het onmogelijk te voorspellen wat er ons binnen 20 jaar te wachten staat: welke geneesmiddelen hebben de bovenhand, hoe zal het systeem van gezondheidszorg en geneesmiddelverstrekking eruitzien, worden er nog nieuwe baanbrekende geneesmiddelen gevonden, etc. Het zijn allemaal vragen die we nu niet exact kunnen beantwoorden, maar waar we ons wel proberen op voor te bereiden met behulp van scenario analyse. Professor Crommelin heeft ons in deze lezing ook gewezen op het belang van investeren in innovatie. Financiering vanuit de overheid voor innovatie is immers schaars aan het worden. Daarbovenop komt nog dat grote farmabedrijven vaak fuseren tegenwoordig, waardoor het logge, bureaucratische structuren worden met weinig ruimte voor innovatie. Het is nochtans broodnodig om vooruitgang te blijven boeken: zonder innovatie worden er immers geen nieuwe geneesmiddelen of technieken meer ontwikkeld. Een ander aspect dat werd benadrukt tijdens de lezingen was de functie van de apotheker als zorgverstrekker. Apothekers kunnen een belangrijke stimulans vormen voor de patiënt, zodat die zijn geneesmiddelen correct inneemt. Onderzoek laat immers uitschijnen dat 50 tot 75 % van de patiënten die chronisch geneesmiddelen innemen dit verkeerd doet. Het staat zonder twijfel dat dit veel geld kost aan de overheid. Apothekers kunnen een cruciale rol spelen om dit uit de wereld te helpen. Prof. Crommelin merkte ook correct op dat het onderwijs tekort schiet op het vlak van geneesmiddelen. Noch in de lagere school, noch in het middelbaar wordt aan kinderen geleerd hoe ze veilig met geneesmiddelen kunnen omgaan. Dit vind ik persoonlijk iets dat in de toekomst moet veranderen, omdat dit op termijn zowel gezondere mensen als minder kosten zal opleveren. De lezingen in het teken van Internationalisation@Home waren zeer leerzaam. De onderwerpen hebben me doen nadenken over mijn belangrijke rol als apotheker, zowel in de industrie als in officina, wat toch de bedoeling was van de lezingen. Vooral het precautionary principle en het belang van scenario analyse zullen me bijblijven.

BIJLAGE 2: TEICOPLANINE MONOGRAFIE

BIJLAGE 3: COLISTINE MONOGRAFIE

BIJLAGE 4: RESULTATEN ACCURAATHEID EN PRECISIE

QCL 20-03-14 24-03-14 26-03-14

Colistine A

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanin

A3-1

A2-1

A2-2 & A2-3

A2-4 & A2-5

Colistine B

Vancomycine

0,472

1,109

0,238

0,114

1,267

0,173

2,021

0,466

0,867

0,230

0,095

1,271

0,204

1,673

0,477

0,842

0,246

0,100

1,360

0,178

1,870

0,429

1,033

0,280

0,105

1,411

0,180

1,772

0,382

0,882

0,231

0,106

1,372

0,169

2,474

0,450

0,875

0,222

0,106

1,099

0,188

2,632

27-03-14

0,478

0,889

0,262

0,102

1,301

0,179

1,854

VM

0,489

0,951

0,228

0,092

1,344

0,178

1,818

27-03-14

0,446

0,848

0,204

0,132

1,323

0,206

1,870

VM

0,542

0,915

0,249

0,126

1,309

0,200

2,224

28-03-14

0,475

0,926

0,254

0,112

1,285

0,180

1,695

VM

0,485

0,822

0,229

0,127

1,288

0,190

1,967

28-03-14

0,471

0,940

0,215

0,130

1,270

0,184

1,870

VM

0,476

0,980

0,251

0,097

1,298

0,190

2,224

0,472

0,969

0,268

0,135

1,336

0,171

2,124

31-03-14

0,556

0,988

0,236

0,138

1,340

0,213

2,130

GEMIDDELD

0,463

0,921

0,239

0,108

1,306

0,185

2,021

SD

0,042

0,087

0,022

0,0129

0,085

0,013

0,319

0,542

1,066

0,255

0,116

1,275

0,189

2,011

CV%

8,99

9,43

9,00

11,94

6,54

7,16

15,80

BIAS (%)

-14,54

-13,61

-6,24

-6,95

2,42

-1,90

0,49

QCM

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanin

Colistine A

Colistine B A3-1

A2-1

A2-2 & A2-3

A2-4 & A2-5

1,276

0,576

5,623

0,863

Ware Concentratie

20-03-14

2,781

5,410

Vancomycine 9,494

2,829

5,283

1,359

0,627

6,006

0,917

9,604

2,556

5,368

1,125

0,580

6,268

0,812

8,800

2,456

5,601

1,233

0,537

6,817

0,816

8,297

2,713

5,151

1,331

0,527

6,179

0,959

9,373

2,111

4,458

0,933

0,542

6,689

0,887

9,715

27-03-14

2,649

5,702

1,374

0,509

6,160

0,833

9,313

VM

2,527

4,998

1,303

0,520

5,911

0,842

9,061

27-03-14

2,877

6,189

1,302

0,645

6,345

0,946

8,609

VM

2,985

6,130

1,494

0,599

6,377

0,989

10,03

28-03-14

2,715

5,802

1,317

0,662

6,147

0,799

8,579

VM

3,046

5,988

1,402

0,623

5,809

0,849

9,564

28-03-14

2,816

6,231

1,176

0,627

6,479

0,919

8,609

24-03-14 26-03-14

VM 31-03-14

2,792

5,913

1,296

0,591

6,377

0,910

10,03

3,118

6,067

1,364

0,640

6,160

0,933

11,75

2,840

5,606

1,424

0,625

6,370

0,955

10,01

GEMIDDELD

2,648

5,429

1,273

0,566

6,238

0,886

9,229

SD

0,252

0,517

0,153

0,047

0,353

0,063

0,535

2,649

5,294

1,276

0,582

6,383

0,948

10,057

CV%

9,50

9,52

12,02

8,27

5,65

7,16

5,80

BIAS (%)

-0,02

2,55

-0,24

-2,70

-2,28

-6,50

-8,23

QCH

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanine

Teicoplanin

Colistine A

Colistine B A3-1

A2-1

A2-2 & A2-3

A2-4 & A2-5

9,99

4,76

50,61

7,93

Ware Concentratie

20-03-14

22,91

43,78

Vancomycine 85,16

23,76

46,16

9,97

4,90

49,17

7,66

91,69

22,91

41,63

9,10

3,96

44,12

7,18

75,47

20,05

45,59

10,82

4,79

55,55

7,83

78,91

22,09

39,97

9,28

4,82

54,12

7,77

79,18

29,54

53,99

10,88

5,14

46,19

7,09

89,51

27-03-14

26,51

45,78

10,14

5,51

51,36

8,10

83,81

VM

23,81

44,16

10,42

5,14

53,77

8,30

75,83

27-03-14

25,63

49,07

11,64

4,50

53,43

7,98

87,16

VM

24,44

48,88

11,37

4,61

52,05

7,87

92,59

28-03-14

27,04

47,17

11,51

5,34

53,48

8,08

92,59

VM

26,70

46,88

11,82

5,16

52,05

8,12

94,50

28-03-14

25,58

46,88

10,34

5,08

55,72

8,37

87,16

VM

26,75

46,16

9,98

5,03

55,21

8,30

92,59

26,26

49,41

10,48

4,40

54,63

7,96

83,53

26,04

48,79

11,66

4,82

50,09

8,22

82,26

GEMIDDELD

24,17

45,90

10,36

4,81

51,04

7,77

83,93

SD

2,61

4,02

0,83

0,42

3,64

0,38

6,35

24,27

47,69

11,49

5,23

57,45

8,53

90,60

CV%

10,80

8,76

8,03

8,69

7,13

4,89

7,57

BIAS (%)

-0,44

-3,75

-9,80

-8,08

-11,16

-8,92

-7,36

24-03-14 26-03-14

31-03-14

Ware Concentratie

LLOQ

20-03-14 24-03-14

Colistine A

Teicoplanine

Teicoplanin

A2-2 & A2-3

A2-4 & A2-5

Colistine B

Vancomycine

0,3070

0,5143

0,3066

0,0828

0,615

0,2680

0,5021

0,2976

0,0943

0,952

0,2772

0,4754

0,3270

0,0815

0,955

0,2488

0,5767

0,3372

0,0955

1,047

26-03-14

0,3333

0,4685

0,2542

0,1103

0,831

0,1986

0,4760

0,1914

0,0891

1,107

27-03-14

0,2802

0,5074

0,3378

0,1050

1,119

VM

0,2911

0,5010

0,2699

0,1062

0,913

27-03-14

0,2992

0,5127

0,2552

0,1043

1,000

VM

0,2583

0,6535

0,2239

0,1071

1,001

28-03-14

0,3032

0,5559

0,2791

0,1018

0,928

VM

0,2783

0,6433

0,2632

0,1001

1,112

28-03-14

0,3035

0,5719

0,3244

0,1122

1,000

VM

0,2883

0,6300

0,2852

0,0962

1,001

0,2661

0,4962

0,2893

0,1067

1,286

0,3035

0,6002

0,3375

0,1052

1,406

GEMIDDELD

0,2762

0,5188

0,2801

0,0976

0,954

SD

0,0367

0,0563

0,0497

0,0105

0,1473

0,2710

0,5330

0,3190

0,0950

1,006

CV%

13,30

10,85

17,74

10,74

15,45

BIAS (%)

1,91

-2,67

-12,20

2,75

-5,18

31-03-14

Ware Concentratie

BIJLAGE 5: RESULTATEN INVLOED VAN DE MATRIX VOOR DE OVERIGE COMPONENTEN

Overzicht van de invloed van een matrix op colistine A 100

%piekoppervlakte

80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum

20

Plasma 1

0

Plasma 2 0

20

-20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Overzicht van de invloed van de matrix op teicoplanine A3-1 %piekoppervlakte

100 80 Referentie

60

Water

40

Kalfsserum

20

Plasma 1

0 0

20

40

60

80

100

Plasma 2

Concentratie (mg/L)

Overzicht van de invloed van de matrix op teicoplanine A2-1 %piekoppervlakte

100 80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum

20

Plasma 1

0

Plasma 2 0

20

40

60

Concentratie (mg/L)

80

100

Overzicht van de invloed van de matrix op teicoplanine A2-4 & A2-5

%piekoppervlakte

100 80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum

20

Plasma 1 Plasma 2

0 0

20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Overzicht van de invloed van de matrix op vancomycine 100

%piekoppervlakte

80 Referentie

60

Water 40

Kalfsserum Plasma 1

20

Plasma 2

0 0

20

40

60

Concentratie (mg/L)

80

100

BIJLAGE 6: RESULTATEN INVLOED VAN VERSCHILLENDE MATERIALEN VOOR DE OVERIGE COMPONENTEN

Overzicht van de invloed van glaswerk op colistine A 100

% piekoppervlakte

80

Referentie Glazen Buis + Glazen Vial

60

LowBind Epje + PP vial 40

Gewoon Epje + PP vial Gewoon epje + Glazen vial

20 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Overzicht van de invloed van glaswerk op teicoplanine A3-1 100

%piekoppervlate

80

Referentie LowBind Epje + PP Vial

60

Gewoon Epje + PP Vial 40

Gewoon Epje + Glazen Vial Glazen Buisje + Glazen vial

20 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Overzicht van de invloed van glaswerk op teicoplanine A2-1 100

%piekoppervlakte

80

Referentie LowBind Epje + PP Vial

60

Gewoon Epje + PP Vial 40

Gewoon Epje + Glazen Vial Glazen Buisje + Glazen Vial

20 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Overzicht van de invloed van glaswerk op teicoplanine A2-4 & A2-5 100 Referentie

% piekoppervlakte

80

LowBind Epje + PP Vial 60 Gewoon Epje + PP Vial 40 Gewoon Epje + Glazen Vial Glazen Buisje + Glazen Vial

20 0 0

20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Overzicht van de invloed van glaswerk op vancomycine

% piekoppervlakte

100 80

Referentie LowBind Epje + PP Vial

60

Gewoon Epje + PP Vial 40

Gewoon Epje + Glazen Vial Glazen Buisje + Glazen Vial

20 0 0

20

40

60

Concentratie (mg/L)

80

100

BIJLAGE 7: RESULTATEN INVLOED VAN DE STAALNAMENAALD VOOR DE OVERIGE COMPONENTEN

Resultaten voor colistine A met stainless steel naald bij gebruik verschillende media 100

% piekoppervlakte

80 Water 60

Referentie Kalfsserum

40

Plasma 1 20

Plasma 2 Water PEEK Naald

0 0

20

-20

40

60

80

100

Concentratie (mg/L)

Resultaten voor teicoplanine A3-1 bij gebruik verschillende media met stainless steel naald 100

% piekoppervlakte

80 Referentie 60

Water Kalfsserum

40

Plasma 1 20

Plasma 2 Water PEEK naald

0 0

20

40

60

Concentratie (mg/L)

80

100

Resultaten voor teicoplanine A2-1 bij gebruik verschillende media met stainless steel naald 100

% piekoppervlakte

80 Referentie Water

60

Kalfsserum 40

Plasma 1 Plasma 2

20

Water PEEK Naald 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Resultaten voor teicoplanine A2-4 & A2-5 bij gebruik verschillende media met stainless steel naald

% piekoppervlakte

100 Referentie

80

Water 60

Kalfsserum Plasma 1

40

Plasma 2 20

Water PEEK Naald

0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

Resultaten voor vancomycine met stainless steel naald bij gebruik verschillende media 100

% piekoppervlakte

80 Referentie Water

60

Kalfsserum 40

Plasma 1 Plasma 2

20

Water PEEK Naald 0 0

20

40 60 Concentratie (mg/L)

80

100

BIJLAGE 8: RESULTATEN VOOR PROCESEFFICIENTIE EN TERUGVINDING VOOR HET HERUITGEVOERDE MATRIXEFFECT RE LAAG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vancomycine

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum (%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%)

92,39 109,79 109,70 112,05 99,71

98,47 100,37 97,27 103,99 97,30

94,51 125,13 133,38 128,93 130,28

107,03 88,78 77,36 79,81 74,82

97,47 101,46 88,02 81,88 82,42

84,26 97,03 87,30 81,09 85,31

97,99 114,12 119,34 129,78 122,95

102,22 85,71 96,94 114,98 106,34

84,56 68,49 65,21 73,75 73,19

103,61

93,00

112,30

72,50

82,54

85,98

119,90

116,85

76,08

100,35 96,25 103,16 97,84 108,02

97,67 94,00 99,07 105,73 95,75

161,96 196,22 130,91 150,83 134,94

103,27 105,23 93,82 97,95 93,58

96,74 95,47 97,23 96,84 96,85

83,74 98,86 86,22 85,76 84,06

137,05 131,31 130,65 151,42 152,36

102,24 105,08 120,46 99,80 108,25

64,63 53,53 62,00 51,47 60,31

102,99

98,42

136,31

90,38

92,45

87,24

127,90

105,35

66,66

6,335 6,151

3,845 3,906

26,526 19,461

12,606 13,948

7,248 7,840

5,554 6,366

15,825 12,373

9,846 9,346

9,883 14,826

PE LAAG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vancomycine

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum (%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%)

101,06 117,52 109,25 111,01 107,92

106,09 107,38 101,96 114,82 104,16

93,05 110,96 119,93 120,87 114,22

149,16 147,75 127,72 128,03 129,66

115,72 115,75 104,54 97,85 98,69

87,09 93,84 84,75 82,87 77,30

109,45 107,18 103,73 108,02 114,97

192,89 163,73 183,66 216,00 194,93

88,35 73,52 76,17 85,72 84,02

99,55

95,72

101,05

123,55

97,45

99,11

105,09

208,99

96,65

114,09 108,58 118,94 110,65 113,87

107,78 100,40 114,98 110,01 105,43

152,19 185,36 137,30 148,86 149,29

150,26 165,38 143,10 151,64 137,21

127,27 126,58 123,70 123,62 123,35

91,77 104,71 96,64 95,57 84,61

122,77 134,89 135,47 129,75 134,04

173,45 177,55 210,36 175,33 192,71

62,43 54,25 65,24 55,05 64,61

110,22

106,25

130,28

141,22

114,05

90,75

118,67

189,96

73,27

6,042 5,48

5,796 5,46

27,087 20,79

13,045 9,24

12,136 10,64

8,144 8,97

12,934 10,90

16,927 8,91

14,156 19,32

Gemiddelde (%) SD CV% (%)

Gemiddelde (%) SD CV% (%)

RE HOOG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vancomycine

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum (%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%)

99,03 105,48 99,69 100,55 104,12

93,69 101,91 93,30 91,01 94,70

144,10 147,65 149,35 150,12 147,29

109,44 93,51 100,30 92,93 101,68

107,37 99,48 97,85 97,57 94,38

107,15 90,85 89,68 90,52 92,97

108,61 116,88 116,68 123,77 117,24

83,58 87,66 87,85 86,51 94,79

57,02 53,41 59,64 52,26 62,37

99,04

88,04

124,71

81,86

84,97

84,71

97,80

117,81

74,45

106,39 112,01 105,55 105,25 103,97

102,07 98,40 95,92 104,22 109,72

168,61 204,81 192,14 195,33 203,06

95,59 95,95 106,08 90,30 96,57

91,59 94,83 101,87 97,28 94,27

96,05 96,57 96,51 91,86 96,62

128,63 157,51 150,56 109,02 146,53

107,75 100,00 84,36 97,36 95,28

55,23 43,27 39,87 43,49 43,44

103,73

97,54

166,11

96,75

96,50

93,95

124,84

94,81

53,13

3,938 3,80

6,401 6,56

27,984 16,85

7,585 7,84

5,734 5,94

5,742 6,11

19,098 15,30

10,649 11,23

10,308 19,40

PE HOOG

Colistine A

Colistine B

Teico A3-1

Teico A2-1

Teico A2-2 & A2-3

Teico A2-4 & A2-5

Vancomycine

Pip D5

PMB

Serum 1 (%) Serum 2 (%) Serum 3 (%) Serum 4 (%) Serum 5 (%) Kalfsserum (%) Plasma 1 (%) Plasma 2 (%) Plasma 3 (%) Plasma 4 (%) Plasma 5 (%)

96,76 101,91 98,01 94,33 102,24

101,43 110,63 105,89 96,52 104,13

113,69 126,13 129,67 118,31 132,04

80,26 78,32 70,48 68,33 74,32

70,12 68,87 60,66 60,61 61,36

62,72 57,89 55,35 53,73 53,74

487,10 509,27 519,51 526,25 537,98

105,19 101,63 115,15 119,15 112,62

65,27 60,28 62,91 63,61 63,69

90,93

92,01

100,61

61,78

56,55

60,87

434,24

129,60

78,62

107,16 112,04 101,32 102,36 103,10

112,33 112,97 108,11 112,60 116,77

155,90 190,66 172,24 177,25 180,59

80,55 84,40 80,34 79,70 79,25

71,10 73,15 70,45 74,56 70,85

63,91 65,51 64,55 66,80 59,66

625,89 760,97 686,11 419,61 685,76

112,63 114,88 113,15 105,29 115,61

51,44 45,17 44,99 42,89 47,12

100,92

106,67

145,19

76,16

67,12

60,43

562,97

113,17

56,91

5,843 5,79

7,611 7,14

31,103 21,42

6,723 8,83

6,113 9,11

4,727 7,82

110,918 19,70

7,602 6,72

11,322 19,90

Gemiddelde (%) SD CV% (%)

Gemiddelde (%) SD CV% (%)