Visueel en infraroodspectroscopie voor de bepaling van de melksamenstelling

Katholieke Universiteit Leuven

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Visueel en infraroodspectroscopie voor de bepaling van de melksamenstelling

Promotor: Dr. Ir. Wouter Saeys Copromotor: Prof. Dr. Ir. Jeroen Lammertyn Departement Biosystemen Afdeling Mechatronica, Biostatistiek en Sensoren

Masterproef voorgedragen tot het behalen van het diploma van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: landbouwkunde Ben Aernouts Juli - 2010

“Dit proefschrift is een examendocument dat na de verdediging niet meer werd gecorrigeerd voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag naar dit proefwerk verwezen worden mits schriftelijke toelating van de promotor, vermeld op de titelpagina.”

Katholieke Universiteit Leuven

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Visueel en infraroodspectroscopie voor de bepaling van de melksamenstelling

Promotor: Dr. Ir. Wouter Saeys Copromotor: Prof. Dr. Ir. Jeroen Lammertyn Departement Biosystemen Afdeling Mechatronica, Biostatistiek en Sensoren

Masterproef voorgedragen tot het behalen van het diploma van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: landbouwkunde Ben Aernouts Juli - 2010

Voorwoord Deze masterthesis is het slotstuk van een studententijd die ondertussen toch al 6 jaar loopt, een belangrijk moment is aangebroken. Het schrijven van deze thesis was een zenuwslopend werk, waarvan de realisatie maar mogelijk was door de hulp van velen. Een woordje van dank aan de mensen die me gesteund en geholpen hebben is in dit voorwoord dan ook zeker niet misplaatst. In de eerste plaats wens ik mijn promotor Dr. Wouter Saeys en co-promotor Prof. Jeroen Lammertyn te bedanken voor de vrijheid en het vertrouwen dat ik steeds van hen heb gekregen. Ik kwam naar hen met een idee, en dat hebben we samen mooi uitgewerkt. Het was mij een waar genoegen om met hen te mogen samenwerken, en ik hoop dat in de toekomst nog te mogen doen. Ik ben Jean-Marie Van Crombrugge en het personeel van MCC-Vlaanderen bijzondere dank verschuldigd voor het ter beschikking stellen van de melkstalen en de melksamenstellingen, zonder dewelke dit onderzoek nooit mogelijk zou geweest zijn. Ook wil ik de mensen van het labo bedanken, in het bijzonder de leden van de „biophotonicsmeeting group‟: Bart, Cédric, Chyngyz, Eva, Kristof, Mizuki, Nghia, Rodrigo, Tijs, Prof. De Baerdemaeker en Prof. Ramon, bedankt voor de leerrijke discussies, de vruchtbare samenwerking en de inspiratie. Ik wil ook Evgeny Polshin ten zeerste bedanken bij het opweg helpen met de FTIR metingen of wanneer de Bruker Tensor zijn „kuren‟ weer eens had. Het was bijzonder aangenaam om met jullie samen te werken. Ik wens ook Prof. Yves Engelborghs en Els De Ridder van de afdeling Biochemie, Moleculaire en Structurele Biologie (Departement chemie) te bedankten voor het in bruikleen stellen van hun ultrasone homogenisator. In dit dankwoord mogen mijn ouders zeker niet ontbreken. Ze hebben me steeds moreel en financieel gesteund. Dankzij hen kon ik mijn interesse voor landbouw verder aanscherpen. Het welslagen van mijn studies is dan ook grotendeels aan hen te danken. Tot slot wil ik mijn collega-studenten van Geel en Leuven bedanken voor de mooie studententijd waar ze mee deel vanuit maakten. Bedankt! Ben Aernouts Heverlee, april 2010

Samenvatting De economische situatie van vandaag dwingt melkveebedrijven om te groeien, te specialiseren en hun efficiëntie op te drijven. Een belangrijke voorwaarde voor een verhoogde winstmarge in de melkveehouderij is een toename van de melkproductie per lactatie en over de levensduur van een melkkoe. Daarom is de preventie en vroege detectie van alle ziekten, maar zeker de zogenaamde productieziekten, noodzakelijk. Omwille van de sterke interactie tussen de bloedstroom en het melkvormend weefsel bevat de gevormde melk heel wat waardevolle informatie over de metabole status van het dier. Door online opmeten van deze melksamenstelling tijdens het melkproces zou een vroege detectie van aandoeningen en deficiënties mogelijk zijn, waardoor de melkveehouder sneller zou kunnen ingrijpen. Spectroscopie heeft zich in het verleden meer dan eens bewezen als een waardevolle techniek voor snelle en niet-destructieve analyse van landbouwproducten zoals melk. Uit de vele publicaties blijkt echter niet eenduidig wat de beste staalpresentatie (reflectantie of transmittantie) is voor een adequate detectie van de melksamenstelling met behulp van Vis/NIR spectroscopie. Daarom werden in dit onderzoek reflectantie- en transmittantiespectroscopie objectief met elkaar vergeleken voor eenzelfde reeks rauwe melkstalen. Reflectantie Vis/NIR spectroscopie gaf een - niet-significant - betere predictie voor vet en ruw eiwitgehalte van rauwe melkstalen, terwijl spectrale metingen in transmittantie betere resultaten opleverden voor de lactose predictie. Een beperkt aantal onderzoekers beschreven het gebruik van ATR-FTIR spectroscopie voor de analyse van melk. Goede resultaten werden bekomen voor gehomogeniseerde melk en beduidend minder goede resultaten voor rauwe melkstalen. Om het potentieel van ATR-FTIR spectroscopie voor online detectie van de melksamenstelling goed te kunnen inschatten, werden de gehomogeniseerde en de rauwe versies van een reeks melkstalen apart gebruikt voor de predictie van de verschillende melkcomponenten. Homogenisatie blijkt noodzakelijk voor een nauwkeurige meting van het vetgehalte, terwijl het niet essentieel is voor een nauwkeurige predictie van het ruw eiwit-, lactose en ureumgehalte in rauwe melk. Een combinatie van Vis/NIR reflectantie- en ATR-FTIR spectroscopie maakt een nauwkeurige detectie van de belangrijkste melkcomponenten in rauwe melk mogelijk, terwijl beide technieken geschikt zijn voor online-metingen.

5

Abstract Today‟s economic reality forces dairy farms to further grow, specialize and become more efficient. Since a precondition for increased profitability of dairy farming is an increase in both the lactation and lifetime production per cow, more effective prevention and early treatment of all diseases, but especially these so-called 'production diseases', is needed. To meet these demands individual cow health, diet and udder status should be carefully monitored. Since the milk production is a dominant factor in the metabolism of dairy cows involving a very intensive interaction with the blood circulation, the extracted milk contains valuable information on the metabolic status of the cow. Online measurement of milk components during milking two or more times a day would promote early detection of systemic and local alterations, thus providing a great input for strategic and management decisions. Spectroscopy has been shown to be a valuable technique for rapid and nondestructive analysis of the quality and composition of agricultural products. Many researchers already used Vis/NIR spectroscopy for composition measurement of raw milk, however there is no consensus in literature about which sample presentation method (reflectance or transmittance) is most suitable. Therefore both sample presentation modes have been compared objectively in this study on the same set of raw milk samples. Reflectance seems to be the best sample presentation mode for measuring fat and crude protein in raw milk with Vis/NIR spectroscopy, while transmittance is not significant worse. However, transmittance gave much better results for lactose prediction. Only very limited research has been performed with respect to the usefulness of ATR-FTIR spectroscopy for milk composition measurement. Very good results have been reported for commercial homogenized milk, while considerably worse results have been reported for raw milk. In order to evaluate the potential of ATR-FTIR spectroscopy for on-line analysis of milk the prediction accuracies were determined separately for raw and homogenized copies of a wide range of milk samples. Homogenisation is required for a sufficient prediction of fat content, while it is not essential for the adequate detection of crude protein, lactose and urea in raw milk.

6

Lijst met afkortingen AMTIR ATR C Cv% CV SG1D(m,x); SG2D(m,x); EMSC ER FIPLS FIR FTIR GenAl HATR IDF InGaAs IPLS IR ISO µATR MCC MIR MLR MPR MSC NEB NIR NPN OSC P PC PCA PLS RIPLS RMSEC RMSECV RMSEP RPD SD Si SEC SECV SEP SM(m,x) SNV VIP Vis

'Amorphous material transmitting infrared radiation' Geattenueerde totale reflectie Koolstof Variatiecoëfficiënt; % 'Cross'-validatie 1e en 2e Savitzky-Golay afgeleide (interval m, xe orde polynomische functies) Uitgebreide multipele signaal correctie Endoplasmatisch reticulum „Forward interval partial least squares‟ Ver-infrarood Fourier getransformeerd infrarood Genetisch algortime Horizontale geattenueerde totale reflectie International Dairy Federation Indium Gallium Arsenide „Interval partial least squares‟ Infrarood Internationale Organisatie voor Standaardisatie Micro-geattenueerde totale reflectie Melkcontrolecentrum Midden-infrarood Multivariabele lineaire regressie Melkproductieregistratie Multiplicatieve verstrooiingscorrectie Negatieve energiebalans Nabij-infrarood Niet-eiwit stikstof (N) Orthogonale signaal correctie Predictie Principiële component Principiële componentenanalyse Partiële kleinste kwadraten regressie „Reverse interval partial least squares‟ 'Root mean square error' voor kalibratie 'Root mean square error' voor cross-validatie 'Root mean square error' voor predictie Ratio van predictiefout en standaarddeviatie Standaarddeviatie Silicium 'Standard error' voor kalibratie 'Standard error' voor cross-validatie 'Standard error' voor predictie Savitzky-Golay smoothing (interval m, xe orde polynomische functies) Standaard normaal variabele „Variance importance in projection‟ Visueel licht

7

Lijst met symbolen A a â C c D dp E e h h2 I I0 j l L m n nx P q R R2 r T T δ θc θi κ λ W w ν σ x X y y

Absorptie Regressiecoëfficiënt Geschatte parameter voor a Concentratie; mol/l Lichtsnelheid; 3.108 m/s Donkere referentie Penetratiediepte; nm Energiehoeveelheid van foton; J Random fout Constante van Planck; 6,626 10-34 Js Erfelijkheidsgraad Gedetecteerde lichtintensiteit Intensiteit van inkomende licht Aantal geselecteerde principale componenten Verplaatsing spiegel; mm Optische padlengte, m Aantal onafhankelijke x-variabelen Aantal stalen Brekingsindex staal x Matrix van eigenvectoren Principale componenten regressiecoëfficiëntvector Relatieve reflectie, reflectantie Determinatiecoëfficiënt kalibratiedata Correlatiecoëfficiënt Relatieve transmissie, transmittantie Matrix van principale componenten Optisch padlengteverschil; mm Kritische brekingshoek; ° Brekingshoek; ° Absorptie of extinctiecoëfficiënt Golflengte; nm Witte referentie Gewicht; g Trillingsfrequentie van foton; Hz Golfgetal; cm-1 Onafhankelijke variabele Datamatrix van onafhankelijk variabele x Afhankelijke variabele, component concentratie Geschatte parameter voor y Vector van afhankelijk variabele y

8

Inhoudstafel Voorwoord ................................................................................................................................. 4 Samenvatting .............................................................................................................................. 5 Abstract ...................................................................................................................................... 6 Lijst met afkortingen .................................................................................................................. 7 Lijst met symbolen ..................................................................................................................... 8 Algemene inleiding .................................................................................................................. 11 I.

Literatuurstudie ................................................................................................................ 13

1

Fysicochemische aspecten van koemelk .......................................................................... 13

2

3

4

1.1

Melkvorming ............................................................................................................. 13

1.2

Melksamenstelling ..................................................................................................... 15

Variatie in melksamenstelling .......................................................................................... 19 2.1

Variatie tussen rassen en als gevolg van selectie ...................................................... 19

2.2

Variatie door voeding ................................................................................................ 20

2.3

Variatie over de seizoenen en effect van klimaat ...................................................... 22

2.4

Variatie met pariteit ................................................................................................... 23

2.5

Variatie doorheen lactatie .......................................................................................... 23

2.6

Variatie tijdens melken .............................................................................................. 24

2.7

Variatie als gevolg van ziekten .................................................................................. 25

Visueel en infraroodspectroscopie ................................................................................... 28 3.1

Theoretische aspecten van visuele en infrarode straling ........................................... 28

3.2

Interactie met materiaal ............................................................................................. 29

3.3

Visueel en nabij-infraroodspectroscopie ................................................................... 32

3.4

Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie .................................................... 33

3.5

Statistische analysetechnieken voor spectrale data ................................................... 36

Visueel en infraroodspectroscopie op melk ..................................................................... 44 4.1

Visueel en nabij-infraroodspectroscopie ................................................................... 44

4.2

Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie op melk ...................................... 48

5

Doelstelling ...................................................................................................................... 51

II.

Transmittantie- en reflectantiespectroscopie .................................................................... 52

6

Keuze van beste staalpresentatie bij Vis/NIR spectroscopie ........................................... 52 6.1

Inleiding ..................................................................................................................... 52

6.2

Materiaal en methode ................................................................................................ 52

6.3

Resultaten .................................................................................................................. 57

6.4

Discussie .................................................................................................................... 66

6.5

Besluit ........................................................................................................................ 68 9

III. 7

µATR-FTIR spectroscopie ............................................................................................ 69 Ultrasone homogenisatie van rauwe melk ....................................................................... 69

7.1

Inleiding ..................................................................................................................... 69

7.2

Materiaal en methode ................................................................................................ 70

7.3

Resultaten .................................................................................................................. 71

7.4

Discussie en besluit ................................................................................................... 72

8

µATR-FTIR spectroscopie voor predictie van melksamenstelling .................................. 73 8.1

Inleiding ..................................................................................................................... 73

8.2

Materiaal en methode ................................................................................................ 73

8.3

Resultaten .................................................................................................................. 77

8.4

Discussie .................................................................................................................... 86

8.5

Besluit ........................................................................................................................ 88

IV.

Algemeen besluit ........................................................................................................... 89

V.

Toekomstperspectieven .................................................................................................... 90

9

Literatuurlijst .................................................................................................................... 91

10

Algemene inleiding Koemelk en afgeleide melkproducten zijn belangrijke onderdelen van het Westerse dieet. De samenstelling van rauwe melk bepaalt in belangrijke mate de nutritionele waarde en de fysicochemische eigenschappen tijdens bewerking van de melk en verwerking tot melkproducten. Daarom is de samenstelling van melk belangrijk voor melkveehouder, melkindustrie en consument. De melkprijs, en daarmee ook het inkomen van de landbouwer, hangt samen met de samenstelling van de geleverde melk. De prijs per liter melk wordt in de eerste plaats bepaald door het vet- en eiwitgehalte. Sinds september 2006 is deze prijsverhouding verschoven van 40/60 naar 35/65. Het eiwitgehalte krijgt dus een steeds grotere waarde. Bovendien heeft elk Belgisch melkveebedrijf een vet gecorrigeerd melkquotum. Dit wil zeggen dat de melkveehouder het recht heeft om de hoeveelheid liters van zijn quotum vol te melken indien deze geleverde melk exact hetzelfde vetgehalte heeft als in 1986. Voor de meeste melkveebedrijven is dit vetgehalte door genetische selectie en betere voeding gestegen waardoor er een vetcorrectie op het quotum moet toegepast worden en de melkveehouder minder melk mag leveren. De hoogste efficiëntie wordt bijgevolg gehaald wanneer het eiwitgehalte stijgt terwijl het vetgehalte constant blijft: dus een nauwere vet/eiwit verhouding in de melk. Landbouwbedrijven zijn genoodzaakt om zich meer en meer te specialiseren en uit te breiden. Zo is in België tussen 1984 en 2008 het aantal melkkoeien ongeveer gehalveerd van 993 871 tot 494 731 en het aantal melkleveraars afgenomen van 39 554 tot 10 886, terwijl de totale hoeveelheid geleverde melk nagenoeg constant is gebleven (Belgische Confederatie van de Zuivelindustrie vzw, 2009). Omdat landbouwbedrijven steeds groter worden is de efficiëntie van de melkwinning van toenemend belang. Door jarenlange genetische selectie, verbetering van het voeder en management is de melkproductie van een koe enorm toegenomen. Hierdoor zijn de hoogproductieve koeien van vandaag ook gemakkelijker vatbaar voor de zogenaamde productieziekten. Dit, samen met het feit dat het aantal koeien per melkveebedrijf ongeveer verdubbeld is, maakt het moeilijk voor de melkveehouder om al deze dieren te controleren en in te grijpen waar nodig. Daarom is er een duidelijke evolutie naar de ontwikkeling en toepassing van sensoren en systemen die automatisch en online gegevens verzamelen per koe. Voor de vorming van 1 liter melk stroomt er ongeveer 400 liter bloed doorheen het uierweefsel van de koe (Bramley et al., 1992, chap. 2). Door deze sterke interactie tussen het uierweefsel en het bloed geven de verschillende componenten in melk heel wat informatie over de voedings- en gezondheidstoestand van de koe. Daarom is regelmatige analyse van de geproduceerde melk de meest efficiënte manier om de koeien te controleren op aanwezigheid van ziekten of een imbalans in het dieet. Vandaag de dag worden de belangrijkste melkcomponenten (vet, eiwit, lactose en ureum) samen met het gehalte aan somatische cellen voor individuele melkstalen 4-wekelijks bepaald als een onderdeel van melkproductieregistratie (MPR). De gegevens zijn waardevol in het kader van een genetisch selectieprogramma of voor het afstemmen van het dieet op macroschaal, maar worden niet frequent genoeg waargenomen voor detectie van uierproblemen en de metabole status van de koe of voor optimaliseren van de voeding op dagniveau (Friggens et al., 2007). Verhogen van de frequentie bij MPR is niet mogelijk omwille van logistieke problemen en een te hoge kost per geanalyseerd staal. Daarom zal individuele koegezondheidsmonitoring enkel mogelijk worden indien de melksamenstelling op een eenvoudige manier gedetecteerd wordt op het 11

melkveebedrijf. Online meten van de melkcomponenten tijdens het melken zou voldoende informatie kunnen geven om vroegtijdig afwijkingen te detecteren waardoor dit een belangrijk hulpmiddel wordt bij een verantwoorde bedrijfsvoering. Door de ontwikkeling van automatische melksystemen kan met één melkeenheid een veel groter aantal dieren gemolken worden. Hierdoor wordt het efficiënter om te investeren in systemen die de melksamenstelling online meten. Dergelijke systemen zijn onder experimentele omstandigheden reeds uitvoerig getest. Toch ondervindt men vaak problemen bij de praktische uitwerking ervan. In dit thesisonderzoek trachten we na te gaan welke techniek het meest geschikt is om de melksamenstelling online te meten. In hoofdstuk 1 van deze thesis wordt de vorming van melk en de samenstelling van de belangrijkste melkcomponenten toegelicht. Dit vormt een belangrijke basis voor het begrijpen van mogelijke variaties in de melksamenstelling. Deze variaties en de mogelijke oorzaken hiervan worden uiteengezet in hoofdstuk 2, met de nadruk op het effect van gezondheid en voeding van het melkvee. Het online bewaken van deze gezondheids- en voedingstoestand is mogelijk via het opvolgen van de individuele melksamenstelling tijdens elke melkbeurt. Voor het online bepalen van deze melksamenstelling moet daarom worden gezocht naar een nietdestructieve methode die amper of geen staalvoorbereiding vereist. Visueel en infraroodspectroscopie zijn technieken die het best beantwoorden aan dit vooropgestelde profiel. De belangrijkste theoretische aspecten, de basisprincipes en de praktische uitwerking van deze technieken alsook de statistische verwerking van spectrale data worden verduidelijkt in hoofdstuk 3. De meeste van deze spectrale technieken zijn reeds uitvoerig getest voor de bepaling van de melksamenstelling onder experimentele omstandigheden. Een overzicht van de verschillende publicaties en een korte samenvatting van de resultaten hieromtrent wordt gegeven in hoofdstuk 4. Dit literatuuronderzoek leidde tot het definiëren van nieuwe onderzoeksvragen waarvoor in de daaropvolgende hoofdstukken antwoorden worden gezocht. In hoofdstuk 6 wordt het gebruik van transmittantie en reflectantie Vis/NIR spectroscopie voor de bepaling van de verschillende melkcomponenten op een objectieve manier met elkaar vergeleken. Daarnaast blijkt midden-infraroodspectroscopie (MIR) ook een zeer nauwkeurige techniek voor de analyse van de melksamenstelling. Voor het opmeten van de MIRtransmissie is het gebruik van zeer dunne cuvettes echter noodzakelijk, waardoor dit moeilijk combineerbaar is met online opmeten van de melksamenstelling. In hoofdstuk 8 wordt daarom een andere meetconfiguratie voor MIR spectroscopie getest. In dit onderzoek wordt ook nagegaan of homogenisatie van de rauwe melk noodzakelijk is voor de analyse van de verschillende melkcomponenten met behulp van deze meetconfiguratie. Uiteindelijk wordt er ook een algemeen besluit en een aantal toekomstperspectieven weergegeven.

12

I.

Literatuurstudie

1 Fysicochemische aspecten van koemelk Door de sterke interactie tussen het bloed en het melksecretieweefsel kan de gevormde melk en de samenstelling ervan fungeren als een belangrijke parameter voor het monitoren van de gezondheids- en voedingstoestand van de koe (Friggens et al., 2007). Om de relatie tussen de melksamenstelling en de gezondheid van het dier, die besproken wordt in hoofdstuk 2, beter te begrijpen wordt er in dit hoofdstuk dieper ingegaan op melkvorming en de belangrijkste componenten aanwezig in koemelk.

1.1 Melkvorming De uier is opgebouwd uit vier kwartieren die volledig van elkaar gescheiden zijn via een mediale ophangband en kapsels van bindweefsel. De functionele eenheid van het secretorische weefsel van één uierkwartier is de alveolus (0,1 tot 0,5 mm diameter) die bestaat uit een holte omgeven door een enkelvoudige laag epitheelcellen die rusten op een basaalmembraan (Figuur 1.1). Tussen het basaalmembraan en de epitheelcellen bevinden zich de myo-epitheelcellen die samentrekken onder invloed van oxytocine tijdens het melken van de koe. Hierdoor gaat de melk wegvloeien uit de alveoli via kleine afvoergangen die samenkomen in grotere interlobulaire melkkanalen. Deze melkkanalen monden uit in de melkboezem die verbonden is met de tepelholte (Bramley et al., 1992, chap. 2).

Figuur 1.1 Anatomie van een uierkwartier (Delaval, 2009).

De melkvorming vindt plaats in het éénlagig epitheel (melkvormende cellen) van de alveolus. Via een stelsel van fijne bloedvaten en haarvaten, die de alveolus omgeven, worden de grondstoffen voor de melkvorming aangevoerd doorheen de dunne haarvatwand naar het éénlagig epitheel (Blowey & Edmondson, 1995). 1.1.1 Vorming van melkvet Melkvetzuren met een lengte van 4 tot 14 koolstoffen (C‟s) worden voornamelijk in het alveolair éénlagig epitheel aangemaakt (via het vetzuur synthetase enzym complex) uit vluchtige vetzuren (azijn- en boterzuur) afkomstig van microbiële activiteit in de pens. In de pens ontstaat azijnzuur voornamelijk bij de fermentatie van ruwe celstof, terwijl boterzuur 13

vrijkomt bij de fermentatie van suikers en fructosanen. Deze vluchtige vetzuren worden geabsorbeerd ter hoogte van de penswand en via de bloedbaan getransporteerd naar de alveaolaire epitheelcellen. Bij een ketenlengte van 18 C‟s of meer zijn de melkvetzuren rechtstreeks afkomstig uit de voeding na lipolyse van triglyceriden (Fox & Mcsweeney, 1998). De vetfractie van het dieet van een koe bevat voornamelijk onverzadigde vetzuren uit plantenmateriaal die in de pens door de bacteriën worden gehydrogeneerd tot verzadigde vetzuren. Na absorptie ter hoogte van de dunne darm of afbraak van depotvet worden de vetzuren via de bloedbaan getransporteerd naar het uierweefsel waar een gedeeltelijke dehydrogenatie plaatsvindt door enzymen (Pereira et al., 2003). In het glad endoplasmatisch reticulum (ER) van de alveolaire epitheelcellen worden triglyceriden gesynthetiseerd uit de vetzuren en glycerol, afkomstig uit de bloedbaan. Naast triglyceriden bevat melk ook vet onder de vorm van fosfolipiden, sterolen, mono- en diglyceriden en vrije vetzuren door lypolyse (Fox & Mcsweeney, 2006). In de alveolaire epitheelcellen worden de triglyceriden en andere vettypes geassembleerd in vetglobules, die vervolgens op apocriene wijze in de alveolaire holte gesecreteerd worden (Figuur 1.2). Hierbij worden de vetglobules omgeven door een deel van het apicale celmembraan (Bylund, 1995).

Figuur 1.2 Schematische structuur van de alveolaire epitheelcel en vorming van de melkbestanddelen (Delaval, 2009).

1.1.2 Vorming van melkeiwit Melkeiwitten worden voor het grootste deel aangemaakt in het alveolair epitheel uit aminozuren waarvan 60% rechtstreeks afkomstig is uit de voeding na absorptie ter hoogte van de dunne darm (Bylund, 1995). De aanmaak van de eiwitten gebeurt via de eiwitsynthese in de ribosomen op het ER. Daarna migreren de eiwitten naar het golgi-apparaat en worden ze samen met water, lactose, vitaminen, enzymen en mineralen verpakt in kleine secreetblaasjes (Figuur 1.2). Daarnaast zijn er ook albuminen en globulinen die rechtstreeks via diffusie uit het bloed doorheen het alveolair epitheel in de melk terechtkomen. 14

1.1.3 Vorming van lactose Het belangrijkste koolhydraat in de melk is lactose, een disacharide dat is opgebouwd uit één molecule glucose en één molecule galactose. Naast de lactose zelf, komen in melk ook haar bouwstenen, glucose en galactose, en afbraakproducten, melkzuur en boterzuur, in kleine hoeveelheden voor (Bylund, 1995). Voor de vorming van lactose is er naast glucose ook galactose nodig, dat in het cytoplasma van de alveolaire epitheelcellen gevormd wordt uit glucose. Glucose kan afkomstig zijn van zetmeelafbraak in de dunne darm (bestendig zetmeel = niet aangetast door pensbacteriën) of uit afbraak van glycogeen, propionzuur of glucogene aminozuren in de lever. Glucose en galactose komen samen in het golgi-apparaat van de alveolaire epitheelcellen en lactose wordt gevormd door tussenkomst van het enzym lactose-synthetase. De wand van het golgi-apparaat is niet permeabel voor het disacharide. Samen met de osmotische activiteit van lactose zorgt dit ervoor dat water uit de bloedbaan in het golgi-apparaat wordt gezogen. Lactose wordt samen met het water, eiwitten, vitaminen, enzymen en mineralen verpakt in kleine secreetblaasjes en gesecreteerd op merocriene wijze, waarbij het vacuolaire membraan fusioneert met het apicale celmembraan (Fox & Mcsweeney, 2009).

1.2 Melksamenstelling Tabel 1.1. geeft de gemiddelde concentratie en het interval van de belangrijkste melkcomponenten. Zoals hieruit kan afgeleid worden bestaat melk voornamelijk uit water, vet, eiwit en lactose. Daarnaast bevat melk ook nog mineralen (vooral calcium en magnesium), organische zuren envitaminen. Hierna worden de componenten die het belangrijkste zijn voor managementdoeleinden in de melkveehouderij besproken: Vet, eiwit, lactose en ureum. Tabel 1.1 Samenstelling van koemelk uitgedrukt in percentage gewicht/gewicht (%w/w) (Walstra et al., 1999).

Component Water Droge stof (niet vet) Vet in droge stof Lactose Vet Proteine2 Caseïne Mineralen Organische zuren Andere

Gemiddelde concentratie in melk (%w/w) 87.1 8.9 31 4.6 4.0 3.3 2.6 0.7 0.17 0.15

Interval1 (%w/w) 85.3-88.7 7.9-10.0 22-38 3.8-5.3 2.5-5.5 2.3-4.4 1.7-3.5 0.57-0.83 0.12-0.21

Gemiddelde concentratie in droge stof (%w/w)

36 31 25 20 5.4 1.3 1.2

1

Interval van 98% van individuele koemelkstalen (exclusief colostrum)

2

Niet-eiwit stikstof niet inbegrepen

1.2.1 Vet Het meest voorkomende vettype in melk is triglyceride (98%), een ester bestaande uit drie vetzuren gekoppeld aan glycerol. Omdat er in melk tot 416 verschillende vetzuren (4 tot 22 koolstoffen, vertakt of niet, verzadigd, mono- of polyonverzadigd, cis of -trans) in verschillende combinaties gekoppeld aan glycerol voorkomen zijn er waarschijnlijk enkele 15

duizenden verschillende triglyceriden aanwezig in melk (Jensen, 2002). Toch maken maar 15 tot 20 vetzuren (voornamelijk onvertakt, verzadigd en 4 tot 18 even aantal koolstoffen) tot 95% uit van het melkvet omdat de verdeling van vetzuren over de posities van het triglyceride niet willekeurig is (Walstra et al., 1999). Melk is een olie-in-water emulsie, waarbij de emulsiestabiliteit afhankelijk is van de groottedistributie van de vetglobules. In rauwe melk varieert de grootte van de vetglobules van 0.1 tot 15 μm, waarbij drie te onderscheiden groepen aanwezig zijn: kleine globules (< 1 μm), middelgrote globules (1-12 μm), en grote globules (> 12 μm). De middelgrote globules bevatten meer dan 95% van het totale melkvetgehalte (Bylund, 1995). Elke vetglobule is omgeven door een oppervlaktelaag of membraan van 10 tot 20 nm dik dat verhindert dat vetglobules aggregeren. De samenstelling hiervan is volledig verschillend van het melkvet of melkplasma en is gelijk aan dat van een celmembraan (vnl. eiwitten, fosfolipiden, cerebrosiden en cholesterol) (Walstra et al., 1999). Het membraan van de vetglobule speelt een rol in verschillende fysicochemische eigenschappen van melk, zoals het opromen (agglutinatiereactie tussen melk-immunoglobulines en het membraan van de melkvetglobule), de adsorptie van ijzer en koper aan het membraan, het behoud van stabiliteit van de melkvetfractie (via bescherming tegen het vetsplitsend enzym lipase) en de adsorptie van micro-organismen aan het membraan, een natuurlijk pasteurisatieproces (Bylund, 1995). Bij homogenisatie van melk (via hoge druk of ultrasone golven) worden de vetglobules verkleind (bereik van 0.01 tot 3 μm) en de totale oppervlakte van de vetglobules vergroot (Wu et al., 2001). Deze toename van de globuleoppervlakte wordt opgevangen door vorming van extra membraan bestaande uit een zeer kleine fractie van de caseïne-eiwitten. Hierdoor veranderen ook de fysicochemische eigenschappen van het globulemembraan (Thiebaud et al., 2003). De referentiemethode voor de bepaling van het totaal vetgehalte in melk is de Röse-Gottlieb gravimetrische methode (ISO, 1999). 1.2.2 Eiwit Normale koemelk bevat 30 - 35 g eiwit per liter melk. Melkeiwitten bevatten alle negen voor de mens essentiële aminozuren. De twee voornaamste eiwitten in melk zijn caseïne, onderverdeeld in αs1-, αs2-, β-, κ- en γ-caseïne, en de wei-eiwitten, zoals α-lactalbumine, βlactoglobuline, immunoglobulinen, serum albumine, lactoferrine, lactoperoxidase, proteose pepton en andere (Tabel 1.2). Caseïne en α- en β-lactalbumine maken ongeveer 90% uit van de melkeiwitten (Farrell et al., 2004). In tegenstelling tot de wei-eiwitten coaguleren of precipiteren caseïne-eiwitten bij een pH lager dan 4.6 (kaasbereiding). In verse rauwe melk bestaat de caseïnefractie voor ± 95% uit colloïdale partikels, micellen genaamd (0.04 - 0.3 µm diameter), waarbij αs1-, αs2-, β-, en κ-caseïne heterogeen verdeeld zijn over de verschillende submicellen (10 - 12 nm diameter). αs- en β-caseïne zijn fosfoproteïnen die via hun fosfaatgroep Ca2+ ionen binden (Walstra et al., 1999). De calciumzouten van αscaseïne en β-caseïne zijn nagenoeg onoplosbaar in water, terwijl de zouten van κ-caseïne geglycosyleerd en bijgevolg goed oplosbaar zijn (Figuur 1.3). Door de dominante aanwezigheid van κ-caseïne aan het oppervlak van de micellen zijn deze volledig oplosbaar als colloïde (Bylund, 1995). De caseïnemicellen zijn poreus en water kan vrij in en uit de micel bewegen. Zowel vetglobules als micellen hebben een negatieve lading waardoor ze niet samensmelten.

16

Tabel 1.2 Gemiddelde concentratie van eiwitten in melk. (Bylund, 1995)

Conc. melk (g/kg) Caseïne αs1-caseïne

(Heck, 2009)

% tot. eiwit (w/w) % tot. eiwit (w/w)

αs2-caseïne β-caseïne κ-caseïne Totaal caseïne

10,0 2,6 10,1 3,3 26,0

30,6 8,0 30,8 10,1 79,5

33,6 10,1 27,2 8,4 79,3

Wei-eiwitten α-lactalbumine β-lactoglobuline Serum albumine Immunoglobuline Andere Totaal wei-eiwit

1,2 3,2 0,4 0,7 0,8 6,3

3,7 9,8 1,2 2,1 2,4 19,3

2,4 8,3

Vetglobule membraaneiwit

0,4

1,2

Totaal eiwit

32,7

100

Wei-eiwitten komen voor als individuele eenheden opgelost in de waterige fase van melk. βlactoglobuline is het belangrijkste wei-eiwit, daarnaast is α-lactalbumine een bestanddeel dat een belangrijke rol speelt in de synthese van lactose in de alveolaire epitheelcellen. Serum albumine is een lekkage eiwit, afkomstig uit de bloedcirculatie. Dit eiwit is een goede indicator voor de aanwezigheid van mastitis in de melkklier (Vangroenweghe, 2004). De immunoglobulinen zijn in hoge concentratie (100 g/l) aanwezig in biestmelk en zorgen voor de overdracht van passieve immuniteit van het moederdier op de pasgeboren nakomelingen. Binnen de week na het afkalven daalt dit gehalte echter tot minder dan één g per liter (Fox & Mcsweeney, 2003).

Figuur 1.3 Schematische tekening van caseïnemicel met A: submicel; B: hydrofiele staart; C: Calcium fosfaat; D: κcaseïne en E: fosfaatgroep (Bruynseels, 2008).

17

Naast eiwitten bevat melk ook andere niet-eiwit stikstof (NPN) verbindingen zoals ureum (50% van totale NPN), aminozuren, peptiden, creatine, orotinezuur, creatinine, ammoniak, ureumzuur en hippuurzuur die samen met de echte eiwitten het ruw eiwit uitmaken (Fox & Mcsweeney, 2003). Referentieanalyse voor bepaling van het ruw eiwitgehalte in melk gebeurt met de Kjeldahl-methode (ISO, 2001). 1.2.3 Lactose Melksuiker of lactose is de belangrijkste osmotische component in melk die zorgt voor het onttrekken van water uit de bloedbaan naar het alveolair lumen waardoor het rechtstreeks verantwoordelijk is voor de hoeveelheid geproduceerde melk (Bramley et al., 1992, chap. 2). De concentratie aan lactose in melk is daardoor relatief constant en bedraagt 48 tot 52 g per liter melk. In biestmelk en mastitismelk zijn lagere concentraties aan lactose aanwezig, voornamelijk door het wegsijpelen van lactose vanuit de melkklier naar het bloedplasma doorheen de onvolledig gesloten (biestmelk) of beschadigde (mastitis) bloed-melkbarrière (Burvenich, 1983). Het gehalte aan glucose in melk is vrij beperkt (100 mg/l) (Vangroenweghe et al., 2001). Lactose in melk wordt gedetecteerd met behulp van een enzymatische methode, de Boehringer-Mannheim-methode (ISO, 2002). 1.2.4 Ureum Ongeveer 1/3 van de eiwitten die opgenomen worden via de voeding kunnen onaangetast de pens passeren en worden verteerd ter hoogte van de dunne darm (bestendige eiwitten). Dit resulteert in een absorptie van aminozuren en peptiden doorheen de darmwand in het bloed. Een ander deel van de proteïnen (+/- 2/3) is onbestendig en wordt in de pens door de bacteriën afgebroken tot ammoniak (NH3). Het gebruik van ammoniak voor de aanmaak van microbieel eiwit is afhankelijk van de beschikbare energie (fermenteerbare koolhydraten) voor de bacteriën (Lefebvre, 1996). De overmaat aan ammoniak, die niet aangewend wordt door de pensflora, wordt via diffusie doorheen de penswand opgenomen in de hepatische aders. In de lever wordt het grootste deel van de ammoniak via de ureumcyclus omgezet naar ureum en vervolgens grotendeels via de urine uit het lichaam verwijderd. Een klein deel wordt echter ook uitgescheiden ter hoogte van het alveolair uierepitheel en komt terecht in de melk (Hutjens & Bannore, 1995). Dit transport gebeurt door passieve diffusie waardoor het gehalte aan ureum in de melk in evenwicht is met dat van het bloed. Een normaal melkureumgehalte ligt tussen 175 en 275 mg/l (Kohn et al. 1999). Een te hoog of te laag ureumgehalte wordt vaak geassocieerd met een lagere vruchtbaarheid (Carlsson et al., 1995). Te hoge melkureumgehaltes wijzen op een overmaat aan eiwitten (ten opzichte van energie) in het voer. Eiwitrijke voeders zijn vaak zeer duur waardoor dit leidt tot verspilling en onnodig hoge belasting van het milieu door verhoogde stikstofuitscheiding via urine en feces (Frank & Swensson, 2002). De referentieanalyse voor ureum gebeurt op basis van het verschil in pH na een enzymatische reactie met een enzymatische kit: CL 10 Micro, EuroChem (ISO, 2004).

18

2 Variatie in melksamenstelling Variaties in de melksamenstelling worden veroorzaakt door variaties in voeding, ras, pariteit, lactatiestadium en eventuele aandoeningen. Figuur 2.1 geeft de variatie weer van het gehalte aan de belangrijkste componenten in melkstalen van individuele koeien zoals het opgemeten werd door Walstra et al. (1999). Zij observeerden de grootste variatie voor vet, gevolgd door (ruw) eiwit, lactose en as. Naast de variaties van de hoofdcomponenten kan ook de samenstelling van een bepaalde hoofdcomponent sterk wijzigen (bv vetzuursamenstelling van vetfractie). De relatie tussen de melksamenstelling en de verschillende beïnvloedende parameters wordt in dit hoofdstuk toegelicht.

Figuur 2.1 Frequentie verdeling van ruw eiwit, vet en lactose gehalte (%w/w log-schaal) van melkstalen van individuele koeien doorheen het jaar (Walstra et al., 1999).

2.1 Variatie tussen rassen en als gevolg van selectie Het koeras heeft een belangrijke impact op de samenstelling van de geproduceerde melk (Tabel 2.1). Het vetgehalte varieert sterk van gemiddeld 3.4% (w/w) bij het Holsteinras tot gemiddeld 5.3% bij Jersey-koeien, terwijl ruw eiwit en zeker lactose een beperktere variatie tussen de rassen vertonen (Walstra et al., 1999). Variatie in ruw eiwitgehalte tussen rassen wordt voornamelijk veroorzaakt door een genetische variatie in de eiwitten die bijdragen tot het ruw eiwit. Zo is het dominante B-allel van -caseïne, dat zorgt voor een hoger eiwitgehalte, frequenter aanwezig bij Jersey-koeien dan bij Holstein-koeien (DePeters & Cant, 1992). De lactoseconcentratie is vrij constant omdat lactose optreedt als de belangrijkste osmotische component van melk en dus de melkhoeveelheid bepaalt (Bylund, 1995). Er werd geen relatie gevonden tussen het melkureumgehalte en de genetica (Stoop et al., 2007). Tabel 2.1 Gemiddelde samenstelling (%w/w) van melkcomponenten voor verschillende rassen (Walstra et al., 1999).

Ras Droge stof Friesian 13.3 Holstein-Friesian 12.1

Vet 4.4 3.4

Ruw eiwit 3.4 3.3

Lactose 4.6 4.5

As 0.75 0.75

Brown Swiss Jersey

4.0 5.3

3.3 4.0

4.7 4.9

0.72 0.72

12.9 15.1

De laatste 50 jaar is er in België en Nederland een sterke toename van het gemiddelde melkvetgehalte en een kleinere maar toch significante toename van het gemiddeld eiwitgehalte door genetische selectie en het optimaliseren van de voeding (Figuur 2.2) Voor 19

het melkvet- en melkeiwitgehalte wordt een erfelijkheidsgraad (h2) van 0.30 aangenomen (Heck, 2009). Binnen rassen bestaat er ook een positieve correlatie tussen het vet- en eiwitgehalte. Een 25 jaar durend onderzoek in Nederland toonde aan dat selectie een mogelijkheid biedt om tot een nauwere vet/eiwit-verhouding te komen (Vos & Groen, 1998).

Figuur 2.2 Verandering in tijd van melkproductie (kg), vet- en eiwitpercentages (w/w) voor melkkoeien in Nederland (Heck, 2009).

Naast het gehalte aan melkvet en melkeiwit kan ook de samenstelling van het melkvet en het melkeiwit wijzigen. De diversiteit in aminozuursamenstelling van een eiwit is slechts beperkt en wordt enkel veroorzaakt door genetische variatie. Anderzijds wordt er voor extra heterogeniteit gezorgd door posttranslationele modificaties van eiwitten zoals glycosylatie, fosforylatie en vorming van disulfidebruggen (Fox & Mcsweeney, 1998). Ook de verhouding tussen concentraties van verschillende eiwitten (vnl. wei-eiwitten) kan sterk wijzigen in functie van de genetica (Walstra et al., 1999). Het vetzuurpatroon binnen het melkvet wordt ook beïnvloed door de genetica. Zo werd aangetoond dat het gehalte aan vetzuren met een even aantal C‟s sterk genetisch afhankelijk, terwijl het gehalte aan vetzuren met 18 C‟s in de melk weinig genetisch bepaald is. De variaties in de vertakkingen van de vetzuren konden slechts in geringe mate aan de genetica gelinkt worden, terwijl de onverzadigdheid van de vetzuren sterk afhankelijk bleek van de genetica door verschillen in de desaturase-activiteit (Heck, 2009).

2.2 Variatie door voeding Het effect van seizoens- en voedingsverandering op de wijzigingen in de melksamenstelling zijn moeilijk van elkaar te onderscheiden omdat de voeding van de melkkoeien in onze streken sterk seizoensgebonden is. Tijdens de zomermaanden is er buitenbeloop met een groot aandeel vers gras in het rantsoen, terwijl de dieren tijdens de wintermaanden vooral geënsileerde voedingsmiddelen (maïskuil, voordroog) opnemen. Dit valt ook op te merken aan de kleur van het melkvet: tijdens de wintermaanden kleurt het melkvet minder geel door een lagere opname van carotenoïden uit geënsileerde voedermiddelen (Bernabucci et al., 2002; Vangroenweghe, 2004). Voor een goede gezondheid van de koe en de daaraan gerelateerde melkproductie is een goed uitgebalanceerd voer onontbeerlijk. In de volgende paragrafen wordt het belang van glucogene energie, ruwe celstof, vetten en eiwit in het voer verder toegelicht alsook het effect van een ontwricht voer op de samenstelling van de melk. Individuele opvolging van de melksamenstelling levert daardoor informatie over de individuele voedervoorzieningen 20

waardoor hierop ingespeeld kan worden. Dit opent heel wat perspectieven, zeker met de opkomst van individuele voedersystemen (Zom & André, 2004). Bij een te laag energieaanbod gaat de koe aminozuren afbreken om hieruit energie vrij te maken. Dit proces gaat ten koste van de vorming van melkeiwit en kan voorkomen worden door voldoende energie in het rantsoen te voorzien via zetmeelrijke producten en krachtvoeders op basis van glucogene grondstoffen. Daarnaast moet de ruwvoeropname (lagere energie-inhoud) zoveel mogelijk gestimuleerd worden om pensverzuring of -acidose te voorkomen (zie paragraaf 2.7.1.1). Dit geldt ook wanneer hoogproductieve koeien onvoldoende energie kunnen opnemen. In de pens wordt door microbiële activiteit ruwe celstof en suiker omgezet naar respectievelijk azijnzuur en boterzuur, terwijl onbestendig zetmeel wordt gefermenteerd naar propionzuur. Deze vluchtige vetzuren worden opgenomen doorheen de penswand en via de bloedbaan naar de uier getransporteerd. Propionzuur heeft naast glucose, afkomstig van de vertering en absorptie van bestendig zetmeel ter hoogte van de dunne darm, een stimulerend effect op de melkhoeveelheid omdat ze de grondstoffen vormen voor de lactoseproductie (zie paragraaf 1.1.3 en 1.2.3) . De verhouding tussen azijnzuur en propionzuur heeft een belangrijke invloed op de melksamenstelling. Een hoog gehalte aan azijnzuur (vezelrijk voeder) ten opzichte van propionzuur geeft een hoog melkvetgehalte (Kennelly & Glimm, 1998). Indien teveel propionzuur in de pens aanwezig is, wordt de boterzuurproductie geremd en stopt ook de mobilisatie van weefselvet. Dit leidt tot een verlaging van het melkvetgehalte. Het melkvetgehalte kan dus worden verhoogd door de boterzuurproductie te stimuleren via suikertoevoeging aan het rantsoen. Bij vettoevoegingen aan het rantsoen zal de opbouw van het toegevoegde vet bepalend zijn voor het effect op de melksamenstelling. Zo zal bijvoorbeeld de aanwezigheid van veel onverzadigde vetten in de voeding, zoals beschermd geconjugeerd linolzuur, leiden tot een drukking van het melkvetgehalte. Naast het totale vetgehalte in de melk heeft de voeding ook een sterk effect op de vetsamenstelling (Bruynseels, 2008; Heck, 2009; Walstra et al., 1999). Het ureumgehalte in melk is negatief gecorreleerd met het energiegehalte van het voeder (Figuur 2.3). Indien het voeder meer energie bevat, wordt meer onbestendig eiwit ter hoogte van de pens gebruikt voor aanmaak van microbieel eiwit. Hierdoor komt er minder ammoniak in het bloed en zal er minder ureum geproduceerd worden (DePeters & Ferguson, 1992). De proteïne/energie-verhouding van het voeder heeft de sterkste (positieve) correlatie met het ureumgehalte van de melk (Carruthers et al., 1997).

Figuur 2.3 Eiwit/energie-balans aan de hand van eiwit- en ureumgehalte van melk (Van den Bijgaart, 2002).

21

Het rantsoen moet voldoende eiwitten bevatten om een hoog melkeiwitgehalte te bekomen. Een tekort aan voedereiwitten drukt het melkeiwitgehalte en is daarnaast ook waar te nemen aan een laag ureumgehalte in de melk (<80 mg/l) (Hamann & Krömker, 1997). Een overschot aan voedereiwitten heeft geen invloed op het melkeiwit omdat de overmaat afgebroken wordt door de pensbacteriën en als ammoniak wordt opgenomen in het bloed. In de lever wordt de ammoniak omgezet naar ureum, die vervolgens via de urine en ook beperkt via melk uitgescheiden wordt (zie paragraaf 1.2.4). Dit resulteert in een toename van het melkureum (Figuur 2.3). Veel onderzoekers bevestigen dat ureum positief gecorreleerd is met het gehalte aan ruw eiwit in het voer (Cannas et al., 1998; Nousiainen et al., 2004). Er is sprake van een eiwitoveraanbod indien het ureumgehalte in melk 390 mg/l overschrijdt (Hamann & Krömker, 1997). Onderzoek van Misciatteilli et al. (2003) heeft ook aangetoond dat bepaalde essentiële aminozuren zoals methionine en lysine limiterend kunnen zijn voor de melkeiwitproductie. Supplementatie van deze aminozuren onder beschermde vorm deed het melkeiwitgehalte verhogen. Anderzijds kan microbieel (hoogwaardig) eiwit gestimuleerd worden door een gesynchroniseerde verhouding tussen energie en afbreekbare (onbestendige) ruwe eiwitten in de voeding. Dit leidt tot een hogere melkeiwitproductie en minder eiwitverliezen onder de vorm van ureum (Bruynseels, 2008; Walstra et al., 1999). Het caseïnenummer van de melk (aandeel caseïne in totaal eiwit) wordt nagenoeg niet beïnvloed door de voeding (Coulon et al., 1998, DePeters & Cant, 1992).

2.3 Variatie over de seizoenen en effect van klimaat Ondanks het feit dat het klimaatseffect op de melksamenstelling moeilijk kan losgekoppeld worden van het effect van voeding en lactatiestadium wordt er een afname in zowel het ruw eiwit- als vetgehalte van de melk waargenomen bij hoge omgevingstemperaturen (Figuur 2.4 en Figuur 2.5b) (DePeters & Cant, 1992). Bij temperaturen boven de 25°C loopt de voederopname terug met 5 à 10%. Een te lage voederopname zorgt er voor dat hoogproductieve koeien een lagere eiwit- en energieopname hebben waardoor het melkeiwitgehalte en de totale melkproductie dalen (Silanikove et al., 2009). Anderzijds gaat bij hoge omgevingstemperaturen door de versnelde, maar oppervlakkige ademhaling extra koolstofdioxide (CO2) uitgeademd worden waardoor de zuurtegraad (pH) van het bloed toeneemt (= respiratoire alkalose omdat CO2 een zwak zuur is in het bloed). Ter compensatie gaan de nieren extra bicarbonaat (HCO3-) en kationen zoals natrium (Na+) uitscheiden en protonen (H+) resorberen (West, 2003). Door de verminderde hoeveelheid natriumbicarbonaat (NaHCO3) in het bloed verlaagd de buffercapaciteit van de pens waardoor de kans op pensverzuring toeneemt. Dit wordt bovendien versterkt door de verlaagde ruwe celstofopname (zie paragraaf 2.7.1.1). Eén van de eerste melkwijzigingen die dan optreedt, is een verlaagd vetgehalte. Het eiwitgehalte en de eiwitsamenstelling van de melk zijn in sterke mate onderhevig aan seizoensinvloeden. Tijdens de zomermaanden kan een daling van het totaal ruw eiwit in de melk waargenomen worden, als gevolg van een lager gehalte aan caseïne en een kleine stijging van de melk serumeiwitten (Figuur 2.4 en Figuur 2.5b). De afname van de caseïnefractie wordt voornamelijk veroorzaakt door een daling van s- en -caseïne in de melk, terwijl de -caseïneconcentratie weinig of geen seizoensveranderingen ondergaat (Bernabucci et al., 2002). Het ureumgehalte in de melk is significant hoger tijdens het weideseizoen, waarschijnlijk door de hogere opname van eiwitten en oplosbare stikstof uit vers jong gras (Carlsson et al., 1995).

22

Figuur 2.4 Verloop van het gemiddeld vet- en eiwitgehalte (‰ w/w) in Vlaanderen in de periode 2007-2009 (MCCVlaanderen, 2009).

2.4 Variatie met pariteit De meeste concentraties van melkcomponenten nemen licht af met de leeftijd van de koe (Walstra et al., 1999). Bij een toenemende pariteit neemt het caseïnegehalte van de melk af, voornamelijk door een daling van αs-caseïne. Het effect is minder voor het totale proteïnegehalte omdat het gehalte aan wei-eiwitten (vooral serum eiwitten) toeneemt (DePeters & Cant, 1992). Eenzelfde daling wordt waargenomen voor het vetgehalte en de vetvrije drogestof, met een geleidelijke afname van beide parameters tijdens opeenvolgende lactatiecycli (Bylund, 1995). Het vetgehalte daalt met ongeveer 0.2% (w/w) over de ganse levensduur van een koe (5 lactaties) (Fox & McSweeney, 1998).

2.5 Variatie doorheen lactatie Tijdens de eerste dagen na het afkalven is er een sterke verandering in melksamenstelling (Figuur 2.5a). De eerste melk, colostrum, bevat een zeer hoog gehalte aan serumproteïnen (zoals immunoglobulinen) en caseïne. Het gehalte aan serumproteïnen en caseïne zal de eerste vijf dagen dalen terwijl het lactosegehalte stijgt (Walstra et al., 1999). Over het volledige lactatiestadium treden er ook een aantal wijzigingen op in de melksamenstelling. Vanaf het begin van de lactatie tot ongeveer de tiende lactatieweek is er een daling van zowel het ruw eiwit- als vetgehalte van de melk. Dit komt door de negatieve energiebalans als gevolg van een te lage voeropname die het energieverbruik, door hoge melkproductie, niet dekt (zie paragraaf 2.7.1.2). Hierdoor gaat het dier aminozuren afbreken om hieruit energie vrij te maken, ten koste van melkeiwit en -vet. Vanaf ongeveer week 10 stijgt zowel het eiwit- als het vetgehalte die voortduurt tot aan het einde van de lactatie (DePeters & Cant, 1992). Het verschil tussen de uiterste waarden bedraagt voor beide gehalten meestal 0.6 - 0.7% (w/w). Dit 23

stemt overeen met een stijging van 0.1% per maand, na het dieptepunt op week 10 (De Wilde, 2003; De Brabander & De Campeneere, 2007). Lactose blijft gedurende de ganse lactatie nagenoeg op hetzelfde niveau (Bylund, 1995). Net zoals het ruw eiwitgehalte is de concentratie van ureum in melk gedurende de eerste maanden van de lactatie laag, waarschijnlijk door de lagere, maar energierijke voeropname. Daarna stijgt de ureumconcentratie naar het einde van de lactatie, om uiteindelijk terug te dalen (Carlsson et al., 1995).

Figuur 2.5 (a) Verandering van de melksamenstelling (%w/w) gedurende de eerste dagen (n) na afkalven. (b) Samenstelling van melk in functie van het seizoen en het lactatiestadium waarbij het gemiddelde voor elke component is vastgesteld op 100% (Walstra et al., 2006).

De melkvetsamenstelling wordt ook systematisch beïnvloed door het lactatiestadium omwille van een verandering in energiebehoefte. In het begin van de lactatie is de energiebehoefte hoog en worden de lichaamsreserves aangesproken met een langere ketenlengte van de vetzuren tot gevolg. Naar het einde van de lactatie toe wordt een groter deel van de vetzuren aangemaakt in het alveolair uierepitheel waardoor de gemiddelde ketenlengte van de vetzuren in de melk afneemt (Walstra et al., 1999). Kruker et al. (1985) vonden dat gedurende de eerste twee maanden van de lactatie het relatieve aandeel van αs-caseïne afnam terwijl dat van β-caseïne toenam. Het percentage κ-caseïne veranderde niet.

2.6 Variatie tijdens melken Tijdens het melken stijgt het vetgehalte van voormelk tot stripmelk en bereikt het zijn hoogste waarde in de residuele melkfractie (Figuur 2.6). Deze eerste en laatste fracties zijn echter minder belangrijk wat betreft volume (Nielsen et al., 2005; Vangroenweghe et al., 2002). Fractie I II III IV V

% van totaal volume Voormelk 0.8 Cisternemelk 1.3 Bulkmelk 92.9 Stripmelk 3.0 Residuele melk 2.0 Melk

Figuur 2.6 Evolutie van de melksamenstelling over een melkbeurt (Vangroenweghe et al., 2002; Walstra et al., 1999).

24

Bij een kortere tussenmelktijd zal de melkhoeveelheid afnemen, maar het vetgehalte toenemen. Anderzijds heeft avondmelk meestal een hoger vetgehalte (+/- 0.25% w/w) dan ochtendmelk, maar de verschillen tussen koeien zijn groot. Het melkeiwit- en lactosegehalte wordt veel minder beïnvloed door melking (Walstra et al., 1999).

2.7 Variatie als gevolg van ziekten Koeien reageren zeer snel op de aanwezigheid van ziekten. Toch duurt het in de praktijk vaak te lang vooraleer deze reacties zichtbaar worden voor de melkveehouder zodat deze niet eerder kan ingrijpen. Een eerste aanpassing van de melkkoe gebeurt via productieadaptatie. De verlaagde melkproductie geeft een mogelijke indicatie van ziekte, maar niet over de aard van de ziekte. Bij de belangrijkste metabole aandoeningen is de relatie tussen de ziekte en melksamenstelling gekend en kan opvolging van de melksamenstelling een indicatie geven over de aard en ernst van de ziekte. Voor de meeste infectieuze aandoeningen is het effect op de wijziging van de melksamenstelling echter ongekend en onvoldoende bestudeerd. Daarentegen is de relatie tussen mastitis en melksamenstelling beter gekend omdat mastitis één van de grootste verliesposten vormt in de melkveehouderij. De relatie tussen de melksamenstelling en belangrijkste metabole ziekten en mastitis wordt in de volgende paragrafen toegelicht. 2.7.1 Variatie als gevolg van metabole aandoeningen De melkvorming heeft een sterke interactie met de rest van het metabolisme door de sterke doorbloeding van het uierweefsel. De melksamenstelling geeft daardoor een rechtstreekse weerspiegeling van het metabolisme van de koe weer. In de volgende paragrafen wordt de interactie tussen de belangrijkste metabole aandoeningen en de melkvorming verduidelijkt. Pensverzuring is het gevolg van een nutritioneel probleem en de sterke interactie met het metabolisme. 2.7.1.1 Pensverzuring Pensverzuring of -acidose treedt op wanneer de pH van de pens te laag wordt (<5.5). Deze situatie kan ontstaan wanneer het rantsoen uit veel en snel afbreekbare koolhydraten bestaat, bijvoorbeeld bij een te hoog krachtvoeraandeel ten opzichte van het aandeel vezels in de voeding. Door het tekort aan structuur van deze voedersoorten wordt het kauwen en herkauwen te weinig gestimuleerd, waardoor een verminderde speekselproductie optreedt en de vluchtige vetzuren in de pens onvoldoende gebufferd worden door het natriumbicarbonaat in het speeksel. De pH in de pens zal blijven dalen met als gevolg dat de pensflora niet goed functioneert of gedeeltelijk afsterft. Ook de productie van vluchtige vetzuren verschuift naar meer propionzuur en minder azijnzuur en boterzuur. Hierdoor daalt vooral de afbraak van structuurrijk voeder gevolgd door een lagere pensactiviteit, en vermindert de ruwvoederopname. Aangezien melkvet voor 50% gevormd wordt uit boterzuur en azijnzuur, zal ook het melkvetgehalte dalen (Dado & Allen, 1994). Onderzoek van Mulligan et al., (2006) toonde aan dat pensverzuring duidelijk aanwezig was bij melkkoeien indien het vetgehalte van de melk daalt onder het eiwitgehalte verminderd met 0.4%. De effecten van pensverzuring kunnen langdurig zijn. Als er in het begin van de lactatie pensverzuring optreedt, kan dit de vetgehaltes verminderen voor meer dan drie maanden (Varga & Ishler, 2006). Pensverzuring wordt ook geassocieerd met klauwbevangenheid, het lage melkvetsyndroom, lebmaag-verplaatsingen (draaiing), een slechte conditie, diarree en immunosuppressie (Mulligan et al., 2006). Door verlagen van de eetlust kan pensverzuring uitdraaien op een negatieve energiebalans (zie paragraaf 2.7.1.2).

25

2.7.1.2 Negatieve energiebalans, leververvetting en ketose In de eerste weken van de lactatie kan een hoogproductieve koe niet de nodige energie opnemen om haar verbruik te compenseren. Hierdoor komt ze in een negatieve energiebalans (NEB). Ondanks het energietekort wordt de lactatie toch in stand gehouden, via de nodige aanpassingsmechanismen. Zo is de insulinespiegel zeer laag waardoor de eetlust wordt gestimuleerd en de opname van glucose door de spieren verhindert. Vetreserves worden afgebroken tot vetzuren of ketonen om de spieren te voorzien van brandstoffen. Bijna alle glucose wordt gebruikt voor lactoseproductie in de uier. Om het glucosetekort op te vangen moet de koe ook haar eiwitaanbod aanspreken. Eiwitafbraak om glucose te vormen gebeurt ten koste van het melkeiwitgehalte (Bruynseels, 2008; Hanigan et al., 2002). Het zijn vooral de diepte en de duur van de negatieve energiebalans die bepalend zijn voor de totale belasting van het dier. Bij een negatieve energiebalans zal door de mobilisatie van vetdepots leververvetting ontstaan. De lever wordt als het ware overspoeld met vetzuren. Bij een lever die meer dan 10% vet bevat ontstaan ernstige leverproblemen gekenmerkt door lage efficiëntie en vergiftigingsverschijnselen. Ook de productie van glucose uit propionzuur vermindert met 35% ten aanzien van een gezonde lever, met lagere melkproducties tot gevolg. Leververvetting kan opgespoord worden aan de hand van de eiwit- en vetgehaltes in de melk. Een vetgehalte boven 5% (afkomstig van vetweefsel mobilisatie) en een laag eiwitgehalte (minder dan 3%) duiden op leververvetting. Dit stemt overeen met een verschil van meer dan 1.5% tussen beide, voornamelijk in de periode van vijf tot zeven weken na afkalven (Friggens et al., 2007). Bij zeer uitgesproken energietekorten kan de lever de overvloed aan vetzuren (door vetmobilisatie) niet verwerken en worden ze omgezet naar ketonen. In beperkte mate zijn ketonen nuttig als energiebron voor spieren of hersenen, maar overmaat-ketonen zijn toxisch en geven aanleiding tot slepende melkziekte of ketose. De kans dat een koe slepende melkziekte heeft, is groot als de vet/eiwit-verhouding in de melk groter is dan 1.3 - 1.5 en het eiwitgehalte in de melk lager dan 3.1% is. Deze koeien vertonen geen toppiekproductie rond week vier van de lactatie (Grieve et al., 1986; Hamann & Krömker, 1997; Hanigan et al., 2002; Mulligan et al., 2006). Hoewel de vet/eiwit-verhouding sterk gecorreleerd is met de energiestatus was de nauwkeurigheid bij het voorspellen van de energiebalans laag bij het gebruik van maandelijkse individuele melkgegevens (Heuer et al., 2001a). Friggens et al. (2007) konden aan de hand van het dagelijkse melkeiwit- en vetgehalte, de dagelijkse melkproductie en het lactatiestadium de waarde van de energiebalans wel zeer nauwkeurig voorspellen. 2.7.2 Verandering in melksamenstelling als gevolg van mastitis Infectie van de uier met pathogene bacteriën zorgt voor een afname in melkproductie, een verandering in melksamenstelling en een stijging van het aantal witte bloedcellen in de melk (vooral polymorfonucleaire leukocyten). Men spreekt van (subklinische) mastitis vanaf 250.000 witte bloedcellen per ml melk (150.000 voor vaarzen) (Ogola et al. 2007). Naast het gehalte aan witte bloedcellen verandert ook de melksamenstelling bij mastitis (Figuur 2.7). Rajčevič et al. (2003) vonden een lactosegehalte van 4.68% en 4.38% voor koeien met een celgetal van respectievelijk 105 en 106/ml. Door de daling van het lactosegehalte daalt de osmotische waarde van de melk. Dit resulteert in een stijging van het aantal ionen in de melk en vervolgens een verhoogde elektrische geleidbaarheid. Bij de meeste vormen van mastitis begint de melksamenstelling sterk te lijken op die van het bloedserum, waarschijnlijk door de verhoogde doorlaatbaarheid van de beschadigde bloed-melkbarrière. Dit komt neer op een stijging van het natrium- en chloorgehalte en een daling van het kaliumgehalte. Daarnaast treedt er ook een verhoogde activiteit op van bepaalde enzymen (Walstra et al., 1999). 26

Mastitis resulteert in een daling van het caseïnegehalte en een stijging van het gehalte aan weiproteïnen, waarschijnlijk door enzymatische afbraak van caseïne via verhoogde activiteit van plasmine bij geïnfecteerde uierkwartieren. Het totale eiwit- en vetgehalte veranderen nauwelijks (DePeters & Cant, 1992). Deze veranderingen in melksamenstelling bij mastitis werden bevestigd in recente onderzoeken van Hamann & Krömker (1997), Hortet & Seegers (1998), Ogola et al. (2007) en Rajčevič et al. (2003).

Figuur 2.7 Verandering van de melksamenstelling in functie van het celgetal van melk (Walstra et al., 1999).

27

3 Visueel en infraroodspectroscopie Bij spectroscopie wordt er gemeten hoeveel elektromagnetische straling van verschillende golflengtes geabsorbeerd worden door het staal. Door het feit dat verschillende componenten in het staal absorberen bij verschillende golflengtes is het mogelijk om het gehalte van een bepaalde component in het staal te detecteren aan de hand van de absorptiewaarden bij deze golflengtes (= absorptiespectra). Bij visueel en infraroodspectroscopie wordt er gebruik gemaakt van visuele en infrarode elektromagnetische straling. Deze niet-destructieve techniek biedt het voordeel dat er geen of weinig staalvoorbereiding nodig is waardoor de analyse snel verloopt zonder het gebruik van milieuverontreinigende chemicaliën. In dit hoofdstuk worden de belangrijkste aspecten toegelicht van visueel en infraroodspectroscopie. Meer informatie hieromtrent is te vinden in Griffiths & de Haseth (2007), Naes et al. (2004) en Williams & Norris (2001).

3.1 Theoretische aspecten van visuele en infrarode straling Elektromagnetische straling bestaat uit golven die zich voortplanten in een ruimte met elektrische en magnetische componenten. Deze componenten trillen loodrecht ten opzichte van elkaar en ten opzichte van de voortplantingsrichting. De golven dragen een hoeveelheid energie E, foton genaamd, die berekend kan worden uit de trillingsfrequentie ν via de wet van Planck: (3.1) -34

met h: constante van Planck (6.626 10 Js). Een elektromagnetische golf plant zich voort in de ruimte met de snelheid van het licht c (+/- 3.108 m/s) waarbij de golflengte λ gelijk is aan de afgelegde weg tijdens één trilling. (3.2) Uit 3.1 en 3.2 is af te leiden dat er een omgekeerd evenredig verband bestaat tussen de golflengte λ en de energie-inhoud E van de elektromagnetische golf. De twee voorgaande vergelijkingen maken het mogelijk om een elektromagnetische golf uit te drukken in drie grootheden: E, λ en ν. Binnen de elektromagnetische golven kunnen op basis van de golflengte verschillende regio‟s onderscheiden worden. Van de kortste golflengte (hoogste frequentie en energie) naar de langste golflengte (laagste frequentie en energie): gamma stralen, X stralen, ultraviolet licht, zichtbaar licht, infrarood licht, terahertz straling, microgolven en radio frequenties (Figuur 3.1). Enkel zichtbaar (Vis) licht is waarneembaar voor het menselijk oog. Het start bij een golflengte van 350 à 400 nm over indigo, blauw, groen, geel, oranje naar rood en stopt bij 700 à 780 nm, vanaf hier start infrarode straling die onderverdeeld is in drie regio‟s: nabij-infrarood (NIR), midden-infrarood (MIR) en verinfrarood (FIR). De nabij-infrarode regio start bij 700-780 nm en stopt bij 2500 nm, waar midden infrarood start. Bij een golflengte van 10000 nm stopt midden-infrarood en start verinfrarood, dat uiteindelijk stopt bij 106 nm of 1 mm (Murray & Cowe, 1992).

28

Figuur 3.1 Elektromagnetische straling gaande van radiofrequenties tot gammastralen (Griffiths & de Haseth, 2007).

Bij zichtbare (Vis) en nabij-infrarode (NIR) straling wordt de golflengte uitgedrukt in nm (109 m). Indien er gebruik wordt gemaakt van een Fourier-transformatie instrument (voornamelijk bij midden-infraroodspectroscopie) spreekt men niet van golflengte, maar van golfgetal σ uitgedrukt in cm-1 en recht evenredig met de energie-inhoud van de elektromagnetische golf: (3.3)

3.2 Interactie met materiaal Elektromagnetische straling die passeert doorheen een medium kan in interactie gaan met dat medium. In de volgende paragrafen worden de verschillende interacties zoals absorptie en verstrooiing besproken. Indien er geen interactie is tussen het medium en de straling, plant de straling zich voort in dezelfde richting als voordien. 3.2.1 Absorptie van midden en ver infrarode straling Elk atoom of molecule bestaat uit kleinere entiteiten (atomen, elektronen, protonen, neutronen) die vibreren (stretchen en buigen) rond hun evenwichtspositie (laagste energieniveau). Deze evenwichtspositie ontstaat door interacties tussen de entiteiten zoals aantrekken en afstoten. Elke chemische binding heeft zijn eigen resonantiefrequentie die afhankelijk is van de massa‟s aan beide kanten van de binding en de grootte van de aantrekkings- en afstotingskrachten tussen beiden. Wanneer een straling passeert door een medium zullen de fotonen botsen met de moleculen in het medium. Wanneer de energieinhoud, die omgekeerd evenredig is met de golflengte, van een foton overeenkomt met de resonantiefrequentie van één van de bindingen dan kan het foton geabsorbeerd worden en het molecule tot een hoger vibratieniveau brengen. Moleculaire vibraties kunnen gaan van een simpel gekoppelde beweging tussen twee atomen van een diatoom molecule tot een veel complexere beweging van elke atoom in een grote polyfunctionele molecule (Figuur 3.2). 29

Molecules met N atomen hebben 3N vrijheidgraden (3 voor translatie in 3D-assenstelsel, rotatie rond elke as, 3N – 6 vrijheidsgraden voor vibraties van atomen in een niet lineair molecule en 3N – 5 vrijheidsgraden voor vibraties van atomen in een lineair molecule). Het energieverschil voor transitie tussen grondniveau (ν = 0) en eerste excitatieniveau (ν = 1) van de meeste vibraties komt overeen met de energie van de straling in de midden-infraroodregio. Doordat het energieverschil ook specifiek is voor de binding, is middeninfraroodspectroscopie uitermate geschikt voor de identificatie en kwantificatie van moleculen gebaseerd op hun specifieke absorptie van golflengtes in het midden-infrarood (Williams & Norris, 2001).

Figuur 3.2 Verschillende stretch- en buigvibraties bij een 3-atooms molecule (Griffiths & de Haseth, 2007).

De Lambert-Beer relatie is de basis voor de meeste kwantitatieve analyses bij gebruik van optische technieken. Wanneer een invallende lichtbundel met een lichtintensiteit I0 passeert door een absorberend materiaal, dan zal de lichtbundel het materiaal met een lagere intensiteit I verlaten. De intensiteit neemt exponentieel af met de padlengte L doorheen het materiaal en de concentratie C (mol/l) van de absorberende stof in het materiaal. ( )

(3.4)

met A: absorptie en κ: absorptiecoëfficiënt van de absorberende stof. De in het midden-infrarood goed geabsorbeerde banden kunnen vaak aangeduid worden als zeer specifiek, zodat hier de wet van Lambert-Beer soms rechtstreeks kan toegepast worden. In complexe mengsels overlappen de absorptiebanden zodat de absorptie op een gegeven golflengte niet meer afhangt van één enkele component (Griffiths & de Haseth, 2007). Uit de transmittantiespectra T kan via een transformatie (formule 3.5), gebaseerd op de wet van Lambert-Beer, de absorbantiespectra A berekend worden. Deze formule kan analoog gebruikt worden voor de transformatie van reflectantiespectra R naar absorbantiespectra A, T wordt dan vervangen door R. ( )

(3.5)

3.2.2 Absorptie van zichtbare en nabij infrarode straling Energieabsorptie uit zichtbare en nabij infrarode straling wordt veroorzaakt door drie mechanismen:  Overtonen van fundamentele vibraties in de infrarode regio  Combinaties van fundamentele vibraties in de infrarode regio  Elektronabsorptie Overtonen zijn veelvouden van fundamentele vibraties. Elke moleculaire vibratie die kan geëxciteerd worden door radiatie bij een bepaalde frequentie zal ook geëxciteerd worden bij een veelvoud van deze frequentie. De veelvouden worden beschreven als eerste, tweede, 30

derde, … overtoon van een fundamentele vibratie. De intensiteiten van deze achtereenvolgende absorpties zullen afnemen met een factor tussen 10 en 100. Combinaties van fundamentele vibraties zijn het gevolg van een energieabsorptie voor verschillende vibraties op hetzelfde moment. Fotonen hebben een bepaalde hoeveelheid energie. Bij overtoon is er een foton nodig met een overeenstemmende hoeveelheid energie om het molecule tot hogere vibratiestatus te brengen. Bij een combinatie wordt de energie van een geabsorbeerd foton gedeeld door twee of meer vibraties die individueel enkel zouden geëxciteerd worden door een foton met een lagere energie-inhoud (MIR). De combinatie kan bestaan uit verschillende (theoretisch onbeperkt) fundamentele vibraties of overtonen. Zo kunnen er onnoemelijk veel combinaties gevormd worden. Combinaties zorgen ervoor dat absorptie voorkomt op onverwachte plaatsen in het Vis/NIR spectrum of dat absorptieregio‟s breed en vertekend zijn door overlapping en veelvoud van verschillende absorpties. Elektronabsorptie komt voor wanneer fotonen de juiste hoeveelheid energie bezitten om een atoom of molecule te exciteren door één van de elektronen naar een hoger orbitaalniveau te brengen. Dit wordt meestal waargenomen bij radiatie in de golflengteregio beneden 1100 nm. Waterstof heeft de gewoonte om zwakke bindingen (waterstofbindingen) aan te gaan met elektrondonerende atomen zoals stikstof en zuurstof. Deze zwakke bindingen veranderen de structuur van het molecule dat elektronen doneert en van het molecule dat de waterstof bezit. Het verandert ook de vibratiefrequenties binnen deze moleculen. De waterstofbinding is afhankelijk van pH, temperatuur, ionenconcentratie, enz. . Waterstofbindingen resulteren in een verschuiving van de absorptiepiek naar hogere golflengtes met een lagere energie-inhoud. Dit kan zich voordoen in elk staal dat water bevat en dus een interactie kan aangaan met het water. Deze effecten maken Vis/NIR spectra zeer complex, maar door het feit dat atomen betrokken zijn bij absorpties ter hoogte van verschillende golflengtes is het mogelijk om via een complexe wiskundige analyse informatie te vergaren over specifieke functionele groepen (Osborne, 2000). 3.2.3 Lichtverstrooiing Verschillende materialen en verschillende aggregatietoestanden hebben verschillende brekingsindexen. Invallende stralen zullen gebroken worden ter hoogte van het grensvlak tussen twee verschillende materialen of aggregatietoestanden, waarbij de brekingshoek afhankelijk is van de brekingsindexen. Bij spectroscopie kan dit voorkomen wanneer de lichtbundel een partikel raakt zoals een poeder of een druppel (bv. vetglobule) in een vloeistof. Deze lichtverstrooiing is afhankelijk van het verschil in brekingsindex van de twee materialen en van het aantal interacties tussen het licht en de grenslaag, die afhangt van het aantal partikels of druppels, hun grootte en hun vorm. Er zal dus meer lichtverstrooiing en reflectie zijn bij kleine partikels of druppels dan bij grote (Williams & Norris, 2001). Deze lichtverstrooiing zorgt er bij gecollimeerde transmissiespectroscopie voor dat er geen onderscheid gemaakt kan worden tussen geabsorbeerd of verstrooid licht. Deze verstrooiingseffecten kunnen verwijderd of geminimaliseerd worden door middel van empirische spectrale voorbehandelingstechnieken of door gebruik van lichtverstrooiingsmodellen. Kubelka & Munck (1931) veronderstelden dat licht of geabsorbeerd of verstrooid wordt wanneer het penetreert doorheen een homogeen verstrooiend medium. Door deze 31

lichtpenetratie te bestuderen en wiskundige technieken toe te passen werd de Kubelka-Munck functie ontwikkeld voor de verstrooiingsgecorrigeerde berekening van de werkelijke absorbantie K : (3.6) met S de verstrooiing en R de reflectantie.

3.3 Visueel en nabij-infraroodspectroscopie Een absorbantiespectrum van een medium kan via de wet van Lambert-Beer gekoppeld worden aan de concentratie van componenten in dat medium. Deze absorbantiespectra A kunnen niet rechtstreeks opgemeten worden, maar moeten worden afgeleid via een transformatie (formule 3.5) van de transmittantiespectra T of reflectantiespectra R. In volgende paragrafen wordt toegelicht hoe deze spectra opgemeten kunnen worden.

Figuur 3.3 Verschillende meetopstellingen voor Vis/NIR spectroscopie met I0 de intensiteit van het invallende licht en I de intensiteit van het licht opgevangen door de detector (Saeys, 2006).

3.3.1 Transmissie Om transmissiespectra te meten wordt het staal tussen de lichtbron en de detector geplaatst (Figuur 3.3). De intensiteit I van de gedetecteerde lichtbundel bestaat uit een deel van de invallende straal met intensiteit I0 die recht doorheen het staal gaat (gecollimeerde transmissie) en het licht dat verstrooid is in de richting van de detector door partikels in het staal (diffuse transmissie). De optische padlengte kan gemakkelijk aangepast worden via de dikte van het staal (binnenkant cuvette). De ideale staaldikte moet voor iedere toepassing onderzocht worden. Bij gecollimeerde transmissie is de optische padlengte gekend en constant waardoor de wet van Lambert-Beer rechtstreeks kan toegepast worden. Bij diffuse transmissie is door verstrooiingseffecten de effectieve padlengte langer dan de dikte van het staal (Osborne, 2000). Bij zeer sterk absorberende of verstrooiende stalen moet de staaldikte dun genoeg zijn zodat er voldoende licht op de detector valt. Dit is een nadeel omdat het voor een langere en moeilijkere staalvoorbereiding zorgt. Transmissie- en reflectiespectra worden steeds getransformeerd (formule 3.7) naar transmittantie- en reflectantiespectra door te corrigeren voor (thermische) „drift‟ van de detectoren en variatie van het lampspectrum van de spectrofotometer. Op regelmatige tijdstippen wordt de intensiteit van of doorheen een witte (W) en donkere (D) referentie gemeten. Deze referenties zijn stabiel in de tijd en bij temperatuursvariaties. (3.7)

32

3.3.2 Diffuse reflectie Bij deze meetopstelling worden de lichtbron en de detector aan dezelfde kant van het staal geplaatst (Figuur 3.3). Licht dat gereflecteerd wordt door diepere lagen (diffuse reflectie) van het staal bevat meer informatie over het staal dan licht dat direct gereflecteerd wordt op het staaloppervlak (spiegelende reflectie). Daarom wordt de detector meestal geplaatst in een integrerende sfeer of onder een hoek van 45° ten opzichte van het staal. Deze laatste meet enkel het licht gereflecteerd onder deze hoek waardoor de rest van de informatie verloren gaat. Een ander nadeel van deze meetconfiguratie is dat de diffuse reflectie afhangt van de, vaak variabele, verstrooiingseigenschappen van het staal (Osborne, 2000). Een groot voordeel van de techniek is dat deze gebruikt kan worden voor sterk absorberende of sterk verstrooiende materialen. Het opmeten van de diffuse reflectie vereist geen staalvoorbereiding en is dus interessant voor niet-destructieve metingen en online-toepassingen. 3.3.3 Transflectie Transflectie probeert de voordelen van transmissie en reflectie te combineren. Het licht passeert eerst door het staal en wordt gedeeltelijk geabsorbeerd, verstrooid en gereflecteerd. Wanneer de lichtbundel het einde van het staal bereikt wordt het gereflecteerd door een reflectiestandaard (gouden reflector of teflon) zodat de lichtstraal terug door het staal passeert en opnieuw gedeeltelijk geabsorbeerd, verstrooid en gereflecteerd wordt. Het licht komt terug uit het staal aan de zijde van de lichtbron en wordt daar gedetecteerd (Figuur 3.3). Het gedetecteerde licht bestaat uit twee delen: licht getransmitteerd doorheen het staal en terug, en een tweede deel gereflecteerd door partikels zonder dat het de reflector bereikte (diffuse reflectie). Transflectie kan een goed signaal geven, waar transmissie en reflectie falen. De ideale optische padlengte is afhankelijk van het staal en moet dus onderzocht worden. 3.3.4 Keuze van de meetopstelling voor visueel en nabij-infraroodspectroscopie De interactie tussen het licht en het staal bepalen of transmissie, reflectie of transflectie de beste staalpresentatie is voor een toepassing. Voor doorzichtige vloeistoffen zal transmissie het beste werken indien de optische padlengte zorgvuldig gekozen wordt. Bij waterige oplossingen zal door sterke absorptie van water in de regio‟s boven 1000 nm een transmissiemeting enkel mogelijk zijn voor korte optische padlengtes (1 - 10 mm). Voor zeer troebele vloeistoffen waar licht niet doorheen kan, zelfs niet bij een korte padlengte, is reflectie de beste oplossing. Door sterke verstrooiing zal er voldoende licht gereflecteerd worden. Indien de verstrooiing niet voldoende is voor de reflectie van een groot deel van het invallende licht, of bij een variabele concentratie aan verstrooiende bestanddelen, zal transflectie de beste resultaten geven (Williams & Norris, 2001).

3.4 Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie Albert Abraham Michelson ontwikkelde in 1880 de Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie (FTIR). In 1907 kreeg hij de Nobelprijs voor Fysica voor de nauwkeurige golflengtemetingen van licht met zijn interferometer. Het interferogram werd eerst manueel opgemeten, maar de komst van de computer en de snelle Fourier transformatie zorgden voor de doorbraak van FTIR. Het eerste FTIR instrument maakte zeer snel kwalitatief hoge resolutie data en nam het gemiddelde van verschillende IR spectra. Middeninfrarood, met een golfgetal van 4000 cm-1 tot 1000 cm-1, was vroeger niet zo interessant voor de analyse van voedingsmiddelen omdat deze straling sterk geabsorbeerd wordt door water. Maar de nieuwe generatie FTIR spectrometers leveren meer energie en scannen sneller. Vaak overtreffen ze daarmee de prestaties van NIR spectroscopie. Dit komt enerzijds door de hoge nauwkeurigheid van de detector en de interferometer en anderzijds omdat de fundamentele 33

vibraties van de meeste bindingen overeen komen met het energieniveau van de straling in de midden-infraroodregio (zie paragraaf 3.2). 3.4.1 Het principe van Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie Het belangrijkste deel van een FTIR spectrofotometer is nog steeds de Michelson interferometer (Figuur 3.4) die bestaat uit een vaste spiegel, een beweegbare spiegel en een bundelsplitser (halfdoorlaatbare spiegel). De bron zendt een IR- straal uit die gesplitst wordt door de bundelsplitser. De helft van het licht gaat naar de vaste spiegel en de andere helft wordt gereflecteerd op de beweegbare spiegel. De twee lichtstralen komen terug bij elkaar ter hoogte van de bundelsplitser en worden naar het staal en vervolgens de detector gestuurd. Indien de afstand van de twee spiegels tot de bundelsplitser gelijk is, dan zijn de gereflecteerde stralen ter hoogte van de bundelsplitser in fase en treedt er constructieve interferentie op (maximale energie en amplitude) (Gunasekaran, 2001). Indien de beweegbare spiegel verschoven wordt over een afstand l (mm) ontstaat er een padlengteverschil van δ = 2l. Voor monochromatisch licht treedt er destructieve interferentie op indien δ = (n + ½)λ. Constructieve interferentie wordt gevonden als δ = nλ. Bij het bewegen van de spiegel ontstaat er een cosinusgolf, het interferogram. P(δ), de energie gedetecteerd door de detector wordt beschreven door: (3.8) met B(σ) de functie die de imperfecties van het optisch design in rekening brengt, δ de optisch padlengte en σ het golfgetal.

Figuur 3.4 Schematische weergave van Michelson interferometer (Griffiths & de Haseth, 2007).

Een echte IR bron produceert verschillende golflengtes zodat het interferogram de som is van een oneindig aantal cosinusgolven: ∫

(3.9)

Het interferogram bevat alle informatie van het spectrum, maar is moeilijk te interpreteren. Een Fourier transformatie zorgt ervoor dat het interferogram omgezet wordt naar een spectrum die de variatie in intensiteit weergeeft in functie van het golfgetal. Bij FTIR wordt het interferogram opgemeten en vervolgens getransformeerd door: ∫

(3.10)

met P(σ) de energie die uit de interferometer komt (Wilson and Goodfellow, 1994). 34

3.4.2 Transmissie Net zoals transmissie bij Vis/NIR spectroscopie bevindt het staal zich ook hier tussen lichtbron en detector (paragraaf 3.3.1). De meeste voedingsmiddelen bevatten grote hoeveelheden water, dat zeer sterk midden infrarode straling absorbeert. Hierdoor gaat een groot deel van de absorptie-informatie van andere componenten verloren. Om dit op te lossen wordt er gebruik gemaakt van zeer dunne staalkamers (bv 20 - 50 µm voor melk) en dus een zeer korte padlengte zodat de absorptie door water beperkt is. De wanden van deze staalkamers hebben geen covalente chemische bindingen en worden gekozen op basis van hun transparantie voor infrarood licht. Men gebruikt vaak NaCl, KBr, CaF2 of diamant. Stalen van vaste stoffen worden niet opgelost in water, maar in solventen die weinig infrarode straling absorberen. Indien er geen goed solvent voorhanden is worden vaste stoffen tot dunne pellets geperst. Het tablet wordt zo sterk geperst dat de infrarode straling niet wordt tegengehouden door insluitingen. 3.4.3 Attenuatie van Totale Reflectie (ATR) Attenuatie van totale reflectie of interne reflectie is één van de beste FTIR methoden omwille van de flexibele staal presentatie. Zoals in de vorige paragraaf werd aangehaald is transmissie-FTIR spectroscopie moeilijk voor vaste stalen en stalen die veel water bevatten. Bij ATR-FTIR spectroscopie is de penetratiediepte van de straling beperkt tot enkele µm ongeachte de hoeveelheid staal dat aangebracht wordt op het interne reflectie-element. Door de beperkte effectieve optische padlengte biedt ATR ook mogelijkheden voor stalen die veel water bevatten, zonder de nadelen van een zeer dunne cuvette (enkele μm‟s) zoals bij transmissie. Hierdoor blijft absorptie van MIR door water toch beperkt waardoor informatie over het staal niet verloren gaat. Waterhoudende vloeistoffen kunnen geanalyseerd worden door de vloeistof aan te brengen op het kristal terwijl vaste stoffen kunnen geanalyseerd worden door ze aan te drukken tegen het interne reflectie-element. Dit interne reflectieelement is het belangrijkste onderdeel van de ATR-cel. Meestal is dit een prisma van materiaal dat goed infrarode straling doorlaat en een grote brekingsindex heeft. Factoren die de keuze van het materiaal beïnvloeden zijn de infrarode analyse regio, de brekingsindex van het materiaal en het staal, de pH van het staal, de invalshoek en het contact tussen het staal en de ATR-cel. Horizontale ATR-cellen (HATR) bestaan uit een parallellogram prisma met spiegels aan uiteinden (Figuur 3.5). De uiteinden van de prisma zijn afgesneden op een hoek zodat het licht in de prisma komt onder een bepaalde hoek. Deze hoek wordt via de wet van Snellius bepaald door de brekingsindices van lucht en de prisma. Wanneer licht toekomt aan het grensvlak van het kristal met het staal wordt de straal gebroken of gereflecteerd onder een hoek beschreven door de wet van Snellius. Voor totale interne reflectie moet deze hoek θi die het licht maakt met het vlak loodrecht op het grensvlak kristal-staal groter zijn dan de kritische hoek θc: (

)

(3.11)

met n1 de brekingsindex van het prismamateriaal en n2 de brekingsindex van het staal.

35

Figuur 3.5 Schematische weergave van een horizontaal ATR kristal (Griffiths & de Haseth, 2007).

Indien θi > θc, dan zal er totale interne reflectie optreden aan het oppervlak van het kristal. Voordat de lichtstraal het kristal verlaat, wordt ze een aantal keer gereflecteerd. Op elk punt van interne reflectie ontstaat er een uitdovende golf die het staal binnendringt. Attenuatie van de totale reflectie ontstaat wanneer het staal de infrarode straling absorbeert. Het aantal reflecties en de penetratie van de uitdovende golf ter hoogte van iedere reflectie bepalen de effectieve padlengte van het ATR kristal. Het aantal reflecties, meestal tussen 1 en 10, wordt bepaald door θi en de afmetingen van het kristal. De penetratiediepte dp wordt bepaald door: √

(

)

(3.12)

met λ de golflengte van het licht (Etzion et al., 2004). Bij micro-ATR (µATR) wordt er gebruik gemaakt van een zeer klein kristal met een diameter van slechts enkele millimeters. Dit heeft een praktisch voordeel omdat er telkens een kleiner oppervlak schoongemaakt moet worden. Anderzijds vormt het kristal een vlak geheel met de behuizing waardoor er geen restjes kunnen achterblijven in de hoeken. Een nadeel van µATRFTIR is een lager aantal interne reflecties (bv. 3) waardoor de effectieve optische padlengte en dus ook de absorptie afnemen. Hierdoor daalt de signaal op ruis verhouding waardoor componenten met lagere concentraties moeilijker te detecteren zijn.

3.5 Statistische analysetechnieken voor spectrale data Het doel van spectroscopie in deze studie is het bepalen van de melksamenstelling via modellen die de absorbantiespectra koppelen aan de chemische samenstelling van het staal. In complexe mengsels zoals melk overlappen de absorptiebanden van individuele componenten zodat de absorptie op een gegeven golflengte niet meer afhangt van één enkele component. Bovendien is er verlies van licht door verstrooiing. Dit wil zeggen dat de spectra informatie bevatten over zowel fysische als chemische eigenschappen van het staal. Daar we in deze studie enkel geïnteresseerd zijn in de chemische samenstelling van melk moet het model enkel gebaseerd zijn op relevante informatie. Daarom zal er eerst een voorbehandeling van de data plaats vinden om ruis en niet relevante informatie te verwijderen. Dit is belangrijk voor een nauwkeurig, robuust en gemakkelijk interpreteerbaar model. Multivariabele kalibratietechnieken kunnen vervolgens gebruikt worden om modellen te bouwen voor predictie van de samenstelling. Tenslotte wordt de predictienauwkeurigheid statistisch geëvalueerd. 3.5.1 Data-voorbehandeling Reflectantie R en transmittantie T worden meestal getransformeerd naar absorbantie A volgens formule 3.5 voor linearisatie tussen absorptie en concentratie C volgens de wet van Lambert-Beer (formule 3.4). Bij diffuse reflectie wordt de absorbantie soms bepaald aan de 36

hand van de Kubelka-Munck theorie (formule 3.6), die ook corrigeert voor verstrooiingseffecten. Na de transformatie kunnen er verschillende voorbehandelingstechnieken toegepast worden op de spectra waardoor er mogelijk een duidelijkere relatie ontstaat tussen de spectra en het gehalte van bepaalde componenten in de stalen. Deze verschillende voorbehandelingstechnieken worden vaak empirisch toegepast om daarna de voorbehandelingstechniek te selecteren die leidt tot de beste predictieresultaten. Hieronder wordt „smoothen‟, „mean-centering‟, standaardisatie, afgeleide, multiplicatieve verstrooiingscorrectie en standaard normaal variabele verder toegelicht. 3.5.1.1 Standardisatie Standaardisatie wordt uitgevoerd zodat alle predictie variabelen (concentratie van een component) in het model een gelijke invloed hebben. Dit is belangrijk wanneer de verschillende variabelen uitgedrukt worden in verschillende meeteenheden, omdat een groter bereik van een bepaalde variabele in een kleinere meeteenheid anders belangrijker is dan een variabele met kleiner bereik in een grotere meeteenheid. Deze standaardisatie wordt uitgevoerd door elke variabele te delen door de standaardafwijking, berekend aan de hand van alle stalen binnen de dataset. 3.5.1.2 ‘Smoothing’ „Smoothing‟-technieken werken via het lopend gemiddelde of via Savitzky-Golay algoritmes om ruis te verwijderen uit de IR spectra. Beide technieken kunnen het visuele aspect van de spectra verbeteren, maar kunnen ook informatie verwijderen wanneer niet duidelijk is welke informatie belangrijk is. Vaak zullen kalibratietechnieken zoals PLS deze ruisvariaties ook uitfilteren en is afvlakken meestal niet nodig. Het idee achter de techniek is dat twee golflengtes dicht bij elkaar het resultaat zijn van dezelfde absorptie en dus niet in absorptiewaarde hoeven te verschillen. Voor elke golflengte wordt een nieuwe absorptiewaarde berekend aan de hand van een absorptiewaarde van de golflengtes in de nabije buurt. Voor het lopend gemiddelde gebeurt dit door het gemiddelde te nemen van de absorptiewaarden van golflengtes binnen een interval rond de desbetreffende golflengte. Dit interval kan vast zijn, maar ook variëren afhankelijk van de gemiddelde absorptiewaarde. Het Savitzky-Golay algoritme probeert af te vlakken door polynomische functies te „fitten‟ aan intervallen van het spectrum en vervolgens het spectrum te vervangen door deze polynomische functies. Deze methode wordt gebruikt bij data met zeer veel ruis, maar waar het belangrijk is om de vorm van de spectra te behouden. Ruis wordt vaak veroorzaakt door een te zwakke intensiteit van het gedetecteerde licht bij die bepaalde golflengte. Bij waterige oplossingen komt dit vaak voor ter hoogte van de absorptiebanden van water. 3.5.1.3 Afgeleiden Afgeleiden van spectra kunnen corrigeren voor additieve effecten en overlappende absorptiepieken. De afgeleide van de eerste orde geeft de helling weer van het spectrum op elke golflengte en verwijdert hierdoor het additief effect. Het valt dan zeer gemakkelijk af te leiden wanneer absorptie afneemt of toeneemt. Tweede orde afgeleiden zijn zeer populair omdat ze corrigeren voor het additief en multiplicatief effect. Hierdoor worden overlappende absorptiepieken beter zichtbaar. Hogere orde afgeleiden maken de overlappende banden nog beter zichtbaar, maar zijn ook zeer gevoelig aan ruis. Omdat de spectra geen functies zijn, maar een set van datapunten, worden de afgeleiden meestal berekend volgens de SavitzkyGolay of Norris-algoritme. Bij Savitzky-Golay algoritme wordt de afgeleide genomen van de polynomische curve die best fit aan het spectra ter hoogte van dat golflengtebereik. Bij de Norris-methode wordt de helling berekend van de rechte doorheen twee punten op een bepaalde afstand in het spectrum. De parameters voor deze algoritmen moeten zorgvuldig gekozen worden om ruis te vermijden. 37

3.5.1.4 Verstrooiingscorrectie Multiplicatieve verstrooiingscorrectie (MSC) is een van de normalisatietechnieken die het meeste toegepast wordt. Het wordt gebruikt om te corrigeren voor het additief (constante) en multiplicatief (helling) effect tussen de spectra, veroorzaakt door fysische effecten zoals niet uniforme verstrooiing door verandering in partikelgrootte, -vorm of -densiteit in het medium. Deze methode probeert het effect van verstrooiing te verwijderen via linearisatie van ieder spectrum naar een ideaal spectrum, het gemiddelde spectrum van de kalibratieset. Uitgebreide multipele signaal correctie (EMSC) is een uitbreiding van MSC en staat toe om ook te compenseren voor chemisch interfererende componenten door gekende spectra van deze componenten te incorporeren. Standaard normaal variabele (SNV) correctie normaliseert ieder individueel spectrum naar een nulgemiddelde en variantie-eenheid. 3.5.1.5 Orthogonale signaal correctie Orthogonaal signaal correctiefilters (OSC) zijn ontwikkeld om systematische variatie in de spectra (x) die niet gecorreleerd is aan variatie in de componentconcentratie (y) te verwijderen. De structurele y-orthogonale variatie in x wordt op de manier verwijderd terwijl diezelfde correctie later nog toegepast kan worden op nieuwe stalen. Deze datavoorbehandeling is vooral efficiënt wanneer de 1e latente variabele van het PLS-model (zie paragraaf 3.5.3) veel variatie van de spectrale data bezit, maar weinig van de predictievariabele y. 3.5.1.6 ‘Mean-centering’ Om de beste schatting van een spectrum te bekomen voor een bepaald staal kan het gemiddelde spectrum genomen worden van de verschillende substalen of van replica‟s van het staal. Hierdoor wordt het gemiddelde spectrum van alle spectra af getrokken en wordt alles interpreteerbaar als variatie rond het gemiddelde. Zo wordt de variatie van de absorbantiewaarde ter hoogte van een bepaalde golflengte belangrijk, en niet de absolute absorbantie. Deze datavoorbehandeling wordt uitgevoerd om te vermijden dat bepaalde golflengtevariabelen waarbij de absolute absorbantie hoger is, ook aanzien worden als belangrijker voor kalibratie. Deze behandeling uitvoeren wordt aangeraden voor de meeste chemometrische regressietechnieken omdat het gemiddelde spectrum enkel informatie geeft over het materiaal dat gemeten wordt, en niet over de concentratievariaties van de belangrijke componenten. 3.5.2 Variabele-selectie Variabele selectie is een eenvoudige methode om spectroscopische data te reduceren door een klein aantal golflengtevariabelen te selecteren voor het gebruik in multivariabele lineaire regressie. Het doel is om de meest relevante en belangrijke combinaties van golflengtevariabelen te selecteren terwijl andere golflengtevariabelen, die geen significant effect hebben, verwijderd worden. Meestal omvatten de regressiemodellen achteraf minder LV wat vaak resulteert in robuustere predictie. Later, bij de ontwikkeling van een sensor, moeten ook enkel de significante golflengtes opgemeten worden waardoor de kostprijs van de sensor gereduceerd wordt. Variabele selectie gebeurt meestal tussen de datavoorbehandeling en de ontwikkeling van het definitieve regressiemodel. Hieronder worden verschillende variabele selectietechnieken uitgelegd. 3.5.2.1 ‘Variable importance in projection’ Bij de „Variable importance in projection‟ (VIP) techniek wordt een score gegeven per golflengtevariabele die overeenkomt met hun bijdrage aan het predictiemodel. Ruwweg komt 38

dit overeen met grootte van de regressiecoefficient voor iedere golflengte (zie paragraaf 3.5.4). Golflengtes met een VIP-score van één of meer worden aanzien als belangrijk voor het model en worden geselecteerd voor de ontwikkeling van het definitieve model. 3.5.2.2 ‘Interval partial least squares’ „Interval partial least squares‟ (iPLS) gaat op zoek naar de beste combinatie van golflengteintervals die belangrijk of bruikbaar kunnen zijn bij het verklaren van de y-variabiliteit. In deze methode kan een interval een alleenstaande golflengtevariabele zijn, maar om rekentijd te sparen wordt meestal een bereik van enkele tientallen golflengtes opgegeven. In het laatste geval kunnen de verschillende intervals eventueel ook overlappen (opgeven in het model). Bij „forward‟ iPLS (FiPLS) wordt er eerst op zoek gegaan naar één interval dat de laagste predictiefout geeft voor y na partiële kleinste kwadratenschatting van dat interval (zie paragraaf 3.5.4). Indien dit interval gevonden is wordt de beste combinatie gezocht van het eerste en een tweede interval. Dit wordt herhaald totdat de predictiefout voor y niet meer afneemt na partiële kleinste kwadratenschatting. Bij „reverse‟ iPLS (RiPLS) wordt er vertrokken van alle golflengte variabelen, terwijl er gezocht wordt naar het minst belangrijke interval. Deze methode verwijderd alle mogelijke intervallen één voor één van de volledige spectra en het spectra dat leidt tot de laagste predictiefout geeft voor y na partiële kleinste kwadratenschatting wordt bijgehouden. Dit wordt herhaald totdat er geen daling meer waarneembaar is van de predictiefout voor y. 3.5.2.3 Genetische algoritmes Dit selectie-algoritme is afgeleid van de manier waarop men landbouwhuisdieren selecteert voor het verhogen van de productie. Het algoritme start van een „modelpopulatie‟ die willekeurig gegenereerd werd en waarbij ieder „individu‟ een bepaalde groep van golflengteintervals bevat. Enkel de „individuen‟ die leiden tot een goed model worden geselecteerd en met elkaar gecombineerd voor het bekomen van de volgende „generatie‟. Bepaalde veranderingen of „mutaties‟ kunnen eventueel toegelaten worden. Na een aantal generaties zullen er een aantal „individuen‟ overblijven die leiden tot een superieur model. Golflengtevariabelen die terugkomen in veel van deze „individuen‟ worden beschouwd als belangrijk. Via dat model zijn er mogelijkheden om variabelen in te geven: grootte van de populatie, intervalbereik, aantal generaties, mutatiefrequentie, …. Keuze van de juiste waarden voor de parameters is belangrijk voor de juiste selectie van golflengtes terwijl de rekentijd beperkt blijft. 3.5.3 Modelontwikkeling met multivariate lineaire regressie Univariabele kalibratie is het fitten van een (bijvoorbeeld lineair) model tussen een golflengte x en een afhankelijk variabele component y. Dit fitten gebeurt door middel van kleinste kwadraat schatting. Omdat absorptiespectra uit meerdere golflengtes bestaan, zijn er veel mogelijkheden om de golflengte te kiezen die het beste resultaat geeft. Bij MIR spectroscopie zullen er vaak duidelijke aparte absorptiepieken optreden voor iedere component, waardoor de keuze van deze “beste” golflengte gemakkelijker is. Bij Vis/NIR spectroscopie echter, overlappen absorptiepieken van verschillende componenten vaak zodat het niet mogelijk is om één golflengte te kiezen en zo de concentratie van één van de componenten te bepalen. Dit kan enkel opgelost worden door het gebruik van een combinatie van verschillende golflengtes die informatie bevatten over deze component. De eenvoudigste manier om al deze informatie te combineren is het gebruik van multivariate lineaire regressie (MLR) met m verschillende x variabelen: 39

(3.13) waarbij parameters a0, a1, a2, ..., am geschat worden door â0, â 1, â 2, ..., â kwadraat schatting van de kalibratieset van n stalen: ̂

̂

̂

̂ ∑

m

via kleinste (3.14) (3.15)

Meestal is het aantal golflengtevariabelen m zeer groot, zelfs groter dan het aantal stalen n. Dit wil zeggen dat het aantal parameters die geschat moeten worden gelijk is aan of groter dan het aantal stalen. Dit leidt altijd tot een lineaire relatie, daar het aantal onbekenden groter of gelijk is aan het aantal vergelijkingen. Anderzijds, wanneer het aantal stalen groter is dan het aantal spectrale variabelen, geeft MLR vaak een slechte predictie van nieuwe data door een sterke correlatie tussen verschillende spectrale variabelen (golflengtes). Hierdoor kan de ene spectrale variabele vaak als lineaire functie geschreven worden van een andere, omdat meerdere variabelen informatie bevatten over hetzelfde molecule. Dit noemt naburige multicolineariteit en veroorzaakt „overfitting‟ van de kalibratiedata waardoor het model niet stabiel is en slechte predictie geeft van nieuwe data. Het kan opgelost worden via data compressie zoals principale componentenanalyse (PCA) die de spectravariabelen projecteren in een klein aantal lineaire combinaties (principale componenten of latente variabelen). 3.5.4 Principale componentenanalyse Dit is een van de meest gebruikte technieken voor datacompressie. Het idee achter deze methode is het vinden van een aantal niet met elkaar gecorreleerde lineaire combinaties (principale componenten) van originele spectravariabelen die het grootste deel van de spectrale variatie beschrijven binnen de originele variatie. De eerste principale component (PC) bundelt de meeste variatie binnen de data, de tweede PC bevat de meeste variatie die nog niet omvat was in de eerste PC, enzovoort. Door het beperkte aantal PC‟s die de multivariabele data vertegenwoordigen, is het model vaak gemakkelijker te interpreteren dan de originele dataset. Deze PC‟s kunnen ook ten opzichte van elkaar uitgezet worden in een plot, waardoor verschillende stalen van elkaar kunnen onderscheiden worden op basis van de belangrijkste PC‟s. In een datamatrix X staan de kolommen voor de verschillende golflengtevariabelen, de rijen voor de opgemeten stalen (of replica‟s van stalen) en is de matrix gevuld met „mean-centered‟ absorbantiedata. Bij PCA worden de eigenvectoren berekend uit de covariantiematrix XtX/(n1). Dit resulteert in een matrix P van eigenvectoren die gerangschikt zijn volgens afnemende eigenwaarde. De matrix met de PC scores T kan vervolgens berekend worden via regressie van X op P. (3.16) Door enkel de eerste (belangrijkste) j principale componenten te selecteren, overeenstemmend met de j eigenvectoren met de hoogste eigenwaarde, kan de grootste variatie in X beschreven worden. In de matrixvorm van formule 3.13 kan de datamatrix X vervangen worden door de eerste j principale componenten. (3.17) Met q de principale componenten regressiecoëfficiëntvector die kan worden berekend via kleinste kwadraat schatting. Deze principale componenten regressie (PCR) is dus een 40

tweestaps procedure waarbij eerst de originele spectrale variabelen gecombineerd worden in PC‟s via PCA en vervolgens een MLR-model gefit wordt met een klein aantal niet met elkaar gecorreleerde PC‟s in plaats van de originele spectrale variabelen. De PC‟s worden aan het model toegevoegd in de volgorde van afnemende x variantie die ze beschrijven, maar de eerste PC‟s bevatten niet noodzakelijk het meeste informatie over y. 3.5.5 Partiële kleinste kwadraten regressie Partiële kleinste kwadraten regressie (PLS) is een procedure die eigenschappen van PCA en MLR gebruikt om de relatie tussen een dataset van spectrale variabelen x en een dataset van afhankelijke variabelen y te modelleren. In tegenstelling tot PCA wordt hier de variatie van de y-variabelen actief gebruikt om de lineaire combinaties van x (principale componenten of latente variabelen) te selecteren. Hierdoor geeft PLS meestal even goede kalibratiemodellen als PCR, maar met een lager aantal latente variabelen. Bij PLS bezit de eerst geselecteerde latente variabele (LV) de grootste covariantie met de y-variabelen en is dus het meest relevant om de y-variabelen te voorspellen. De variatie in x en y die deze latente variabele dekt, wordt vervolgens afgetrokken van respectievelijk x en y om de volgende LV te selecteren. De relatie tussen x- en y-variabele is gemakkelijk te interpreteren en ook robuuster indien deze relatie voornamelijk gebaseerd is op een klein aantal LV. Deze methode werkt het best wanneer er veel correlatie of zelfs co-lineariteit is tussen de verschillende x-variabelen, zoals het geval bij spectrale data. Er zij twee versies van het PLS algoritme: PLS1 en PLS2. Bij PLS1 wordt er een apart model berekend voor elke component waarin we geïnteresseerd zijn. Daarom wordt een aparte set van eigenvectoren en scores specifiek geoptimaliseerd per component. Maar PLS kan ook uitgebreid worden naar simultane predictie van de verschillende componenten: PLS2. De berekende vectoren worden niet geoptimaliseerd per individuele component, maar voor alle componenten tegelijk. Dit kan leiden tot verlies in predictienauwkeurigheid van een bepaalde y-variabele, zeker bij complexe mengsels. Anderzijds, omdat er geen aparte set van eigenvectoren en scores per component gegenereerd moeten worden, zullen de berekeningen veel minder tijd in beslag nemen. Een ander voordeel treedt op wanneer bepaalde y-variabelen sterk gecorreleerd zijn met elkaar, maar waarbij de metingen ruis bevatten. Zo wordt de covariantie tussen een lineaire combinatie (latende variabele) in x en een lineaire combinatie (de correlatie) in y gemaximaliseerd. 3.5.6 Modelvalidatie Nadat het model gebouwd is moet de nauwkeurigheid voor predictie geëvalueerd worden aan de hand van nieuwe stalen. Het model dat gebouwd is op basis van kalibratie data moet niet enkel de samenstelling van de kalibratiestalen goed voorspellen, maar ook deze van nieuwe stalen. Bij het oplossen van het multicolineariteitsprobleem via datacompressie moet er een optimaal aantal LV geselecteerd worden. Wanneer meer variabelen geselecteerd worden zal het model meer variabiliteit van de data kunnen verklaren en zullen de kalibratiedata beter „fitten‟. Maar indien er teveel variabelen opgenomen worden zal het model „overfit‟ geraken op de kalibratiedata waardoor er slechte predictie is van nieuwe stalen. Daarom moet het aantal LV bepaald worden aan de hand van voorspellingsprestaties bij nieuwe stalen. Dit kan door de data onder te verdelen in een kalibratieset (bijvoorbeeld 2/3 van totale dataset) voor het opstellen van het model en een validatieset (de rest) voor evaluatie van de predictiefout en het aantal benodigde LV. Bij het splitsen van kalibratiedata in een kalibratie- en validatieset bestaat de kans dat deze twee sets niet representatief zijn voor de volledige populatie. Daarom werd „cross‟-validatie ontwikkeld. 41

3.5.6.1 ‘Cross’-validatie Bij „cross‟-validatie wordt de oorspronkelijke set met stalen op verschillende manieren onderverdeeld in een kalibratie- en validatieset, terwijl voor elke combinatie zowel het model als de predictiefout wordt berekend. Een veel gebruikte methode is de „leave-one-out crossvalidatie‟ waarbij eerst de y-waarde van het eerste staal voorspeld wordt aan de hand van het predictiemodel dat berekend is met alle andere stalen. Vervolgens wordt het eerste staal terug opgenomen in de kalibratieset en wordt het tweede staal voorspeld. Dit gaat door totdat alle stalen één keer voorspeld zijn. Bij meervoudige cross-validatie wordt er telkens een groep stalen weggelaten uit de kalibratieset en voorspeld. De predictiefout voor het kalibratiemodel wordt berekend aan de hand van de gemiddelde predictiefout voor alle individuele stalen tijdens „cross‟-validatie. De predictiefout voor „cross‟-validatie geeft een goede benadering van de werkelijke predictienauwkeurigheid van het model, maar toch is deze vaak overoptimistisch omdat het model gebouwd op basis van diezelfde data. Een onafhankelijke testset moet daarom gebruikt worden om de echte predictienauwkeurigheid van het model te bepalen. 3.5.6.2 Statistische parameters voor evaluatie van de predictie Elk van de onderstaande statistische parameters kunnen berekend worden voor de kalibratieset, „cross‟-validatie (CV) van de kalibratieset of voor een onafhankelijke testset (P). Enkel deze laatste zullen het meeste informatie geven over de werkelijke predictie van het model. De determinatiecoëfficiënt (R2), variërend tussen 0 en 1, toont het deel van de variantie bij de voorspelde data die gelinkt kan worden aan variantie bij de referentiedata. Een R2 hoger dan 0.83 wordt aanvaard voor de meeste toepassingen (Williams & Norris, 2001). Deze factor geeft een goede indicatie over de kalibratiekwaliteit, maar geeft nog steeds geen informatie over de predictienauwkeurigheid. De helling van de lineaire kleinste kwadraatregressie tussen de gemeten en voorspelde waarden geeft informatie over hoe goed stalen met verschillende concentraties worden voorspeld. In het beste geval is deze gelijk aan 1. Bij een helling kleiner dan één zullen hoge concentraties overschat en lage concentraties onderschat worden, en omgekeerd voor een helling groter dan één. Het intercept van de lineaire kleinste kwadraatregressie tussen de gemeten en voorspelde waarden geeft weer was de voorspelde waarde is wanneer de gemeten waarde 0 is. De bias is een systematische fout van het model en wordt berekend als het verschil tussen de gemiddelde waarden van de referentie en predictie. Het bepaalt in belangrijke mate de nauwkeurigheid van de kalibratie. Bij een positieve bias wordt de concentratie steeds onderschat en omgekeerd. ∑

∑

̂

(3.18)

waarbij n het aantal stalen in de testset, ̂ de predictiewaarde en yi de gemeten waarde voor het ide staal van de testset.

42

De standaardfout voor kalibratie (SEC), „cross‟-validatie (SECV) of predictie (SEP) is een schatting van de predictiefout met correctie voor de bias: √

∑

̂

√

(3.19)

De „root mean square error‟ voor kalibratie (RMSEC), „cross‟-validatie (RMSECV) of predictie (RMSEP) is een schatting van de predictiefout aan de hand van respectievelijk de kalibratieset, „cross‟-validatie van de kalibratieset of een onafhankelijke testset: ∑ √

̂

(3.20)

RMSEP en RMSECV kunnen gebruikt worden om nauwkeurigheid van de kalibratie te vergelijken met standaardfout van de referentieanalyse. RMSEP geeft een betere indicatie van de predictiefout dan SEP omdat RMSEP niet gecorrigeerd is voor de bias. De ratio van predictiefout en standaarddeviatie (RPD) is een manier om de predictiefout uit te drukken als het veelvoud van de standaarddeviatie van de referentiedata SD. (3.21) Enkel RPD waarden groter dan 3 geven aan dat de nauwkeurigheid voor predictie voldoende is voor procescontrole (Williams & Norris, 2001).

43

4 Visueel en infraroodspectroscopie op melk 4.1 Visueel en nabij-infraroodspectroscopie Het dagelijks opvolgen van de melksamenstelling op individueel koeniveau kan selectie-, management- en voederschema‟s fors verbeteren. Toch zijn vandaag de dag de analytische methoden voor het bepalen van de melksamenstelling op individueel koeniveau destructief, duur, tijds- en arbeidsintensief. Daarnaast is er een duidelijke evolutie naar ontwikkeling en toepassing van sensoren en systemen die automatisch en online gegevens verzamelen per koe. Vandaar dat er de laatste twee decennia reeds heel wat onderzoek gevoerd is naar het gebruik van nabij-infraroodspectroscopie voor het online monitoren van de melksamenstelling tijdens het melken. Vis/NIR spectroscopie is snel, niet destructief en behoeft amper of geen staalvoorbereiding. Tabel 4.1 geeft een overzicht van de hieromtrent verschenen literatuur. 4.1.1 Homogenisatie van melk voor spectroscopische analyse Melk is niet alleen een complex mengsel van honderden componenten, maar heeft ook een complexe fysicochemie. Het grootste deel van het melkvet is aanwezig in vetglobules met diameters van 0.1 to 15 µm (gemiddeld 3 à 4 µm). Deze “vetdruppels” gedragen zich als dunne lenzen en zorgen voor verstrooiing van het licht waardoor reflectie en transmissie bij spectroscopie beïnvloed worden. Daar de diameterverdeling van de vetglobules niet constant is en ook niet volledig samenhangt met het gehalte aan melkvet, kan deze de spectroscopische metingen ongecontroleerd beïnvloeden. Dit is zeker het geval bij NIR en MIR spectroscopie daar de diameter van het grootste deel van de vetglobules binnen het golflengtebereik (0.7 10 µm) valt. Om dit probleem op te lossen tracht men de diameterverdeling van de vetglobules te „standardiseren‟ via homogenisatie onder hoge druk (100 – 400 MPa). Hierbij wordt de melk onder hoge druk doorheen een homogenisatorplug gestuurd. De homogenisatorplug bestaat uit een nauwe opening en een impactring. De vetglobules worden door cavitatie en turbulentie gesplitst waardoor hun diameter verkleind en de totale oppervlakte vergroot. Er is bijgevolg niet voldoende membraan om het volledige oppervlak van de vetglobules te bedekken, zodat deze taak overgenomen wordt door melkeiwitten (caseïne submicellen). Om te voorkomen dat de kleine vetglobules terug samensmelten wordt vaak gebruik gemaakt van een tweetraps homogenisator waarbij twee homogenisatorpluggen in serie geschakeld worden.

Figuur 4.1 Schematische voorstelling van een tweetraps homogenisator (links) en een detailtekening van een homogenisatorplug (rechts) (FOSS, 2008).

44

Tabel 4.1 Samenvatting resultaten van Vis/NIR spectroscopie op melk en melkproducten in de laatste decennia. Vet (% w/w ) Eiwit (% w/w ) Bron

Saranwong & Kawano, 2008 Kawasaki et al. , 2008 Kawamura et al. , 2007 Kawasaki et al. , 2005 Jankovská & Šustová, 2003

Barabássy, 2001

Tsenkova et al. , 2000

S taal

Data # S taal Range Importante #LV voorbehan stalen presentatie λ (nm) λ (nm) deling Transflectie

Rauwe melk

103

Rauwe melk

216

Rauwe melk Rauwe melk Rauwe melk

Melkpoeder

Rauwe melk

13,6 mm; Fruit tester

Optische densiteit 400 van diffuse transmissie 2300 90° 50

150

260

Reflectie; FTNIR Reflectie; Foss NIRS. 6500 Reflectie; PMC Spectralyz. 1025 Transmissie 1 mm; Foss NIRS. 6500

6001000

6001050

10002500

926

740, 840

/

Tsenkova et al. , 1999; Foss NIRS. 6500

258

Saranwong & Kawano, 2008

Rauwe melk

103

Navrátilová et al. , 2006

Runder colostrum

90

Šustová et al. , 2004

Schaap colostrum homogenised

90

Pouliot et al. , 1997

wei

53

Albanell et al. , 2003

Geitenmelk rauw

166

Purnomoadi et al. , 1999

Rauwe melk

506

Laporte & Paquin, 1999

Melk, wel en niet homogenised

96

Transflectie 0,45 mm; F. NIRS. 6500 Transflectie 0,3 mm; InfraAlyzer 450 Transmissie 1 mm; Neotec 6500 Transmissie 0,5 mm; F. NIRS. 6500

CV

R

2

0,99 0,06

geen

10

0,96 0,24

geen

7

/

/

geen

/

/

/

/

4

0,92

0,3

/

0,95 0,125

/ /

/

0,97 0,128

/ /

8

1,00 0,123

Log; SM(13)

930, 968, Log; 990, 1026, SM(17); 1076, 1092 SG1D(17) Log; Transmissie SM(25); 1 mm SG2D(25) Log; Transmissie 1100/ SM(17); 1 mm 2500 SG1D(17) Transmissie 400Log; MSC; 13,6 mm; F. 926 1100 SG2D(16,2) NIRS. 6500 Transflectie 10000,1 mm; / Log 2500 FTNIR Reflectie; FTNIR

R

7

Transmissie 7004 mm 1100 Rauwe melk

S EC

Log; MSC; SG2D(16,2)

912, 1234, 10001486, 1666, Log 2500 2464 2036, 2082, 10002130, 2132, Log 2500 2480 1160, 1210, 1100Log; MC; 1726, 2308, 2500 SG2D(25) 2354

Transmissie 10 mm

2

R

2

0.91 0.33 / /

/ /

/

/

/ /

/ /

762, 1774, 2146

Log

/

0,87 4,27

/ /

/ /

/ /

1454, 1878, 1932, 2110, 2336

Log

/

0,99 1,89

/ /

1 0.138 / /

/ /

1992, 2054, Log; MC; 2280 SG2D(25)

9

0,64 0,11

10

0.99 0.191 0,99 0,171 / /

/ /

10

0.99 0.203 0,99 0,178 / /

/ /

10

0,98 0,236

0.98 0.262 / / 1 / / /

0.11 / / 0.03

4

1,00 0,12

/ 1

/ /

0.16 0.07

13

/

/

0.56 0.15 / /

/ /

2

/ /

/ /

/ /

1442, 1460, 1464, 2144, 2284

Log

/

0,99 1,88

/ /

/ /

/ /

0.58 0.125 / /

/ /

2110

Log; MC; SG2D(25)

9

0,66 0,09

0.61 0.096 / /

/ /

Log; SM(17); SG1D(17)

0.23 0.191 10 0,38 0,17 / /

/ /

6

0.65 0.096 0,71 0,09 / /

/ /

Log; SM(9)

0.33 0.148 10 0,51 0,13 / /

/ /

10 0,69 0,08

0.61 0.089 / /

/ /

/ /

Log; SM(9)

10 0,63 0,11

0.50 0.129 / /

/ /

6

0.64 0.092 / /

/ /

/ /

Log; SM(25); SG1D(25)

10 0,79 0,09

0.72 0.096 / /

/ /

0.67 0.082 / /

/ /

/ 0.00

776, 880, 902, 952, 1034

/

908, 912, Log; MSC; 1026, 1032 SG2D(16,2)

1100/ / 1718, 2310 Log; SG2D MLR 0,94 0,29 2500 0.94 0.25

/ /

16,8

/ /

/ / MLR 0,96 0,256 0.94 0.243

/

0,31

/ /

7

0,96 0,07

/ /

/ 0.07

/

/

geen

/

/

/

Log; SM(5) 734, 750, 786, 812, 908, 974, 982, 1064

/

Log; SM(21) Log; SM(25); SG2D(25) Log; SM(25); SG1D(25)

11 0,87 0,08

0,67 0,09

10 0,73 0,08

/ 0.01

908

Log; MSC; SM(16,2)

6

0,89 0,09

/ /

/ 0.09

0.97 0.495 / /

/ /

/

Log

9

0,87 0,29

0.68 0.464 / /

/

5

0,97 0,69

0.94 0.94 / /

/ /

/

/

3

0,75 0,67

0.64 0.81 / /

/ /

/

SG2D

5

1,00 0,02

/ / 0.72 0.33

/ /

/

SG2D

4

1,00 0,08

/ / 0.98 0.23

/ /

/ /

1445, 1680, 1818, 2100, 2139, 2180, 2230, 2270

Log

MLR 0,90 0,15

/ / 0.90 0.163

/ /

/ /

1518, 2172, / / Log; SG2D MLR 0,88 0,09 2226, 1748 0.84 0.08

/ /

Log; SNV; SM(8,1); SG2D(8)

8

0,99 0,06

/ 0.08 0.99 0.06

/

/ 0,82

16,3

R2 CV S ECV Bias CV R2 P

S EP

BiasP

/ /

/ /

/ /

/ / 0.53 15 / / 0.9 13.3 / / 0.6 25.8

/ -0.30 / 0.00 / -1.50

0.68 21.8 / /

/ /

- λ: Golflengte - #LV: Geeft het aantal latente variabele gebruikt in het Partial Least Square model - R2 : Determinatiecoëfficiënt voor kalibratieset - R2 CV: Determinatiecoëfficiënt voor 'cross'-validatie - R2 P : Determinatiecoëfficiënt voor testset - SEC: 'Standard error of calibration' - SECV: 'Standard error of crossvalidation' - SEP: 'Standard error of prediction' - Log: Logaritmische transformatie - SG1D(n ,[x ]); SG2D(n ,[x ]); 1e en 2e Savitzky-Golay afgeleide (interval n , x e orde polynomische functies) - SM(n ,[x ]): Savitzky-Golay smoothing

(interval n , x e orde polynomische / functies) 0.03 - MSC: Multiplicatieve scatter correctie - SNV: Standaard normaal variabele / /

12 1,00 0,15

/ 2060, 2170 -0.01

/

8

0,86 6,79

12

/

/ 0.00 / 0.00 / -0.01

/

geen

/

/ / 0.83 0.26 / / 0.94 0.05 / / 0.74 0.14

Log

14 0,97 0,05

10 0,82 0,28

S EC

/ -0.01

1330, 1654, 1978

/

geen

2

R

/ 0.17

/ /

/

/ /

/

/ /

/ /

/

/

/

0,70 0,15

/

geen

/ /

/

8

/

/

0.89 0.62 / /

/

Log; MSC

/ /

/

0,93 0,47

11002500

908

0.90 0.08 / /

13

Log

5

/ / 0.01 0.08

/

geen

/

/

/ /

P

Data S ECV Bias CV Importante R CV S ECV Bias CV #LV R2 S EC 2 #LV voorbehand S EP Bias P λ (nm) R P S EP Bias P eling

/ 0.00 / 0.00 / -0.01

/ /

/

Ureum (mg/l)

/ / 0.72 0.15 / / 0.91 0.09 / / 0.64 0.22

0.95 0.885 / /

10002500

0,91 0,09

12 0,78 0,15

0,99 0,285

Log; SNV; SM(2,1); SG2D(6)

R

/

8

geen

10

11002320, 2350 2500

CV 2

/ -0.06 / 0.01 / -0.03

0,99 0,03

Log

R

/ / 0.95 0.25 / / 0.95 0.42 / / 0.91 0.53

5

1445, 1680, 14451759, 1778, 2348 2100, 2310

S EC

/ 0.00

1,00 0,098

908, 912, Log; MSC; 1026, 1032 SG2D(16,2)

2

R

Lactose (% w/w ) 2

/ 0.06

10

/ /

P

Data S ECV BiasCV Importante #LV voorbehan S EP BiasP λ (nm) deling

2

/ -0.01

45

De mate waarin de diameter van de vetglobules verkleind wordt, is afhankelijk van de bouw van de homogenisator, de druk en temperatuur tijdens het homogeniseren. Door het homogeniseren verkleint niet enkel de gemiddelde diameter (0.75 – 0. 85 µm), maar ook de spreiding van de diameter (Paquin, 1999). Laporte en Paquin (1999) onderzochten het effect van homogeniseren op de detectie van het vet- en eiwitgehalte van melk met Vis/NIR spectroscopie. Het toevoegen van gehomogeniseerde stalen aan de kalibratiereeks, die bestond uit ongehomogeniseerde stalen, zorgde voor het verlagen van SEC, SECV, SEP en het verhogen van R2 voor eiwitfracties in melk, maar voor een stijging van SEC en SECV bij vet. De verminderde nauwkeurigheid voor vetdetectie werd verklaard door de verhoogde spectrale variabiliteit door zowel ongehomogeniseerde als gehomogeniseerde stalen te gebruiken bij dezelfde kalibratie voor vet. Andere onderzoekers vonden echter dat het ook mogelijk is om voor ongehomogeniseerde melk nauwkeurig het eiwit-, vet-, lactose- en ureumgehalte te bepalen via Vis/NIR spectroscopie. 4.1.2 Staalpresentatiemethode In de literatuur is er geen duidelijkheid over welke van de drie staalpresentatiemethodes, transmissie, reflectie of transflectie, het meest aangewezen is voor de detectie van de melksamenstelling met Vis/NIR spectroscopie. Bij kaas en melkpoeder wordt meestal gebruik gemaakt van reflectie daar deze producten vaak te dens zijn voor transmissie- of transflectiemetingen (Barabássy, 2001; O'Callaghan et al., 2002). Voor de analyse van melk gebruiken de meeste onderzoekers Vis/NIR transmittantiespectroscopie met een optische padlengte die varieert van 0.5 mm tot 15 mm. Bij metingen in het golflengtegebied 400 – 1100 nm werden de beste resultaten behaald bij een optische padlengte van 10 mm (Tsenkova et al., 1999) tot 13.6 mm (Saranwong en Kawano, 2008), terwijl voor het golflengtebereik 1100 – 2500 nm een padlengte van 0.5 - 1 mm het beste bleek te werken (Laporte & Paquin, 1999; Purnomoadi et al., 1999; Tsenkova et al., 1999) (Tabel 4.1). Reflectantiespectroscopie werd in het verleden zelden gebruikt voor detectie van de melksamenstelling. Jankovská en Šustová (2003) en Šustová et al. (2004) vonden betere resultaten voor de bepaling van het ruw eiwitgehalte met reflectantie ten opzichte van transmittantie, maar vetdetectie was minder nauwkeurig. Ook voor transflectantie met staaldiktes van 0.1 tot 13.6 mm werden goede resultaten gerapporteerd (Albanell et al., 2003; Navrátilová et al., 2006; Pouliot et al., 1997; Saranwong & Kawano, 2008). Toch blijkt het niet eenduidig wat de beste methode is voor bepaling van melksamenstelling met behulp van Vis/NIR spectroscopie. Een objectieve vergelijking zal hierover uitsluitsel moeten geven. 4.1.3 Belangrijke golflengtes In Tabel 4.1 worden ook de belangrijkste golflengtes voor de predictie van een bepaalde component aangeduid met „Importante λ (nm)‟. De reden waarom bepaalde golflengtes een hogere correlatie hebben met een bepaalde component, is omdat deze excitaties van de vibraties veroorzaken in de chemische structuur van de component zoals aangegeven in Tabel 4.2. De OH-bindingen van water absorberen voornamelijk ter hoogte van 1450 en 1900 nm, terwijl eiwitten zeer sterk absorberen rond 1250 nm, 1550 nm, 1640 nm, tussen 2030 en 2190 nm en tussen 2310 en 2380 nm via NH-, CN-, CO- en CH-bindingen of allerlei combinaties. Vetten absorberen voornamelijk via de verzadigde alkyl-bindingen (CH) van de vetzuren tussen 1150 en 1200 nm en ter hoogte van 1725 nm, 1760 nm, 2305 nm en 2345 nm. 4.1.4 Effect van temperatuur Infrarode straling is niet zichtbaar met het oog, maar kan wel waargenomen worden als warmtestraling. De temperatuur van het staal zal een invloed hebben op de vibraties van de chemische bindingen in het staal en bijgevolg op de absorptie van infrarode straling. 46

Daarnaast heeft de temperatuur ook effect op de brekingsindex van het staal. Brennan et al. (2003) onderzochten dit en vonden dat een verhoging in temperatuur leidde tot een verandering in transmissie en een verschuiving van de absorptiepieken naar kortere golflengtes (+/- 0.2 nm/°C). Indien de temperatuur van de melkstalen binnen een range van 5°C bleef, was de gemaakte fout acceptabel en kon een nauwkeurigheid van 0.1% voor vet gehaald worden. Om het kalibratiemodel robuust te maken zijn er twee mogelijkheden: alle relevante temperaturen in de kalibratieset aan bod laten komen of spectra genomen bij andere temperaturen transformeren naar de referentietemperatuur. Volgens onderzoek van Thygesen en Lundqvist (2000) geeft de eerste mogelijkheid de beste resultaten. Omdat de melktemperatuur ook niet zo sterk fluctueert in de melkleiding (+/- 33 – 39°C), wordt deze kleine variatie best in rekening gebracht in de kalibratieset (Fordham et al., 1987). Tabel 4.2 Belangrijkste golflengtes in relatie tot de vibraties die ze teweegbrengen bij vet en eiwit met νa: asymmetrische stretchvibraties; δa: asymmetrische buigvibraties; νs: symmetrische stretchvibraties en δs: symmetrische buigvibraties; Amide A en B: N-H stretchvibraties; Amide I: C=O stretch + C-N stretch + N-H buigvibraties; Amide II: N-H buig + C-N stretchvibraties; Amide III: C-N stretch + N-H buig + C=O stretch + O=C=N stretchvibraties (Czarnik-Matusewicz et al.,1999; Hui, 2006; Šašić & Ozaki, 2000; Wang et al., 1998).

Golflengte (nm) 2366-2382

Vibraties νs(CH2) + δs(CH2) - eiwit

2351-2355

νs(CH3) + δs(CH3) - eiwit

2340-2346

νs(CH2) + δs(CH2) - vet

2332-2340

νs(CH2) + δa(CH2) - eiwit

2314-2318

νa(CH2) + δa(CH2) - eiwit

2308-2311

νs(CH) + δs(CH) - vet

2302 2186 2160 2124 2100 2038-2075 1920

νa(CH2) + δa(CH2) - vet Amide A + amide III Amide B + amide II Amide B + amide I Amide B + amide I Amide A + amide I νa(OH) + δa(OH) - water

1761-1763

1e overtoon νs(CH2) - vet

1722-1728 1638 1550-1584 1448-1468 1490 1440

1e overtoon νa(CH2) - vet 1e overtoon amide B 1e overtoon amide A νs(OH) + δa(OH) - waterhydraat water - eiwit interactie νs(OH) + νa(OH) - water

1390-1414 1290 1250-1255 1207

νs(OH) + δa(OH) - water water-eiwit interactie 1e overtoon amide A + amide II

1150

2e overtoon νa(CH2) - vet

2e overtoon νs(CH2) - vet

47

4.1.5 Individuele kalibratiemodellen Tsenkova et al. (2000) vonden dat Vis/NIR transmittantiespectroscopie een nauwkeurigheid gaf die zeer dicht lag bij die van de referentieanalyse. Deze nauwkeurigheid kon echter nog verbeterd worden door een kalibratiemodel op te stellen per individuele koe. Via individuele kalibratie werd de SECV gereduceerd met 22.46% voor vet, 26.4% voor eiwit en 31.25% voor lactose. Dit fenomeen werd onderzocht met behulp van principale componentenanalyse (PCA) en de verschillende principale componenten die instaan voor de meeste spectrale variatie van iedere koe en de gemeten melkcomponent werden met elkaar vergeleken. De verbetering in nauwkeurigheid zou gebaseerd op het in rekening brengen van het koe-effect op zowel chemische als fysische melksamenstelling. 4.1.6 Online-meten van de melksamenstelling Uit de aangehaalde literatuur blijkt dat Vis/NIR spectroscopie zeer geschikt is voor snelle, nauwkeurige en niet-destructieve detectie van de belangrijkste componenten in zowel rauwe als gehomogeniseerde melk. In een aantal onderzoeken (Kawamura et al., 2007; Kawasaki et al., 2005; Kawasaki et al., 2008) is diffuse transmittantie reeds succesvol toegepast voor online-detectie.

4.2 Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie op melk 4.2.1 Transmissie-FTIR spectroscopie op melk De uitbetaling van melk aan de melkveehouder gebeurt op basis van het aantal geleverde liters en het vet- en eiwitgehalte van die melk. Daarvoor is een exacte bepaling van vet- en eiwitgehalte van de melk noodzakelijk. Omdat de referentie-analysen (volgens ISO normen, zie hoofdstuk I) vaak te duur, tijd- en arbeidsrovend en milieubelastend zijn, wordt vandaag de dag voornamelijk gebruik gemaakt van snelle meetmethoden die weinig staalvoorbereiding vereisen en toch de nauwkeurigheid van de referentie-analyse benaderen. 85% van de wereldmelkproductie wordt geanalyseerd met behulp van analytische technieken van Foss (Hillerød, Denemarken). Voor het bepalen van de melksamenstelling ontwikkelde FOSS ongeveer 30 jaar geleden de Milkoscan. De recentste versie van dit toestel (Milkoscan FT+) maakt gebruik van transmissie-FTIR spectroscopie doorheen melk in een diamanten cuvette met een optische padlengte van 37 μm. Het toestel zuigt ongeveer 8.5 ml melk op. Vervolgens wordt de melk opgewarmd tot 40°C en gehomogeniseerd door een tweetraps-homogenisator bij 200 bar. Uiteindelijk wordt de cuvette gevuld en wordt de melk bij constante temperatuur en druk (40°C en 30 bar) geanalyseerd. Dit toestel is uitgerust met een PLS-basiskalibratie voor bepaling van vet, ruw eiwit, koolhydraten, ureum, vrije vetzuren, (on)verzadigde vetzuren, pH, droge stofgehalte en vetvrije droge stof in melk, room, wei en gefermenteerde melk. De bepaling van vet gebeurt op basis van vet A (absorptie ter hoogte van 5.73 μm door stretchvibraties van C=0carbonylgroep in vet, referentie gemeten op 5.6 μm), vet B (absorptie ter hoogte van 3.48 μm door stretchvibraties van de verzadigde C-H-alkyl bindingen in de vetzuurketen met referentie 3.60 μm) en vet C (absorptie van 6.8 μm door buigvibraties van de verzadigde C-H-alkyl bindingen in de vetzuurketen). Ruw eiwit (eiwit en NPN) wordt bepaald aan de hand van absorptie ter hoogte van 6.46 μm (referentie 6.7 μm) door buigvibraties in de N-Hpeptidebinding. De O-H-hydroxylgroep van koolhydraten, waaronder voornamelijk lactose, absorbeert sterk ter hoogte van 9.61 μm (referentie 7.7 μm). Ureum absorbeert net als vet C voornamelijk rond 6.7 - 6.8 μm. Door voedings- en seizoensinvloeden verandert naast het gehalte van de individuele componenten ook de samenstelling van de hoofdcomponenten. Daarom dient deze basiskalibratie op regelmatige basis gecontroleerd te worden. Zo kan de 48

gemiddelde vetzuurketenlengte of -verzadigingsgraad veranderen doorheen het seizoen. De basiskalibratie kan dan via een eenvoudige bias-correctie aangepast worden op basis van een kleine referentiereeks die representatief is voor de melk op dat moment. Dit gebeurt in de praktijk iedere twee maanden. Anderzijds wordt ook frequent (bijvoorbeeld elke 100 stalen) een referentiestaal geanalyseerd en getoetst aan de werkelijke samenstelling. Dit toestel voldoet volledig aan de vereisten van de IDF standaard 141C:2000 voor de bepaling van vet, ruw eiwit en lactose van rauwe melk met behulp van midden-infraroodtechnologie (ISO, 2000). De prestaties van het toestel worden weergegeven in Tabel 4.3 (FOSS, 2008) Tabel 4.3 Prestaties van FOSS Milkoscan FT+ met Cv als variatiecoëfficiënt (standaardafwijking / gemiddelde) (FOSS, 2008).

Component Vet Ruw eiwit Lactose Ureum

Meetbereik 0 - 15% (w/w) 0 - 10% (w/w) 0 - 10% (w/w) 100 - 1000 mg/l

Herhaalbaarheid Nauwkeurigheid 0.5% Cv 1% Cv 0.5% Cv 0.9% Cv 0.5% Cv 0.9% Cv 15 mg/l 35 mg/l

Rémillard et al. (1993) onderzochten de noodzaak voor het gebruik van homogenisatie bij bepaling van de melksamenstelling met behulp van transmissie-MIR spectroscopie. Resultaten van de vetgehaltemetingen toonden aan dat er een sterke relatie is tussen de vetglobulediameter en het MIR spectrum. De vetglobules in rauwe melk hebben een diameter van 1 - 15 μm en vallen daarmee in het bereik van de MIR golflengtes (2.5 - 10 μm). De vetglobules gedragen zich als dunne lenzen en zorgen voor verstrooiing van het licht, voornamelijk het licht met een golflengte in de buurt van of kleiner dan de vetglobulediameter. Daar de verdeling van de vetglobules varieert tussen verschillende individuele melkstalen, en ook niet bepaald wordt door de melksamenstelling, zou deze de spectroscopische metingen ongecontroleerd beïnvloeden. Door homogenisatie wordt de gemiddelde vetglobulediameter en de spreiding verkleind en hierdoor ook de variatie tussen individuele melkstalen. Het invallend licht wordt na homogenisatie nog steeds in sterke mate verstrooid, maar dit effect is dankzij de homogenisatie gestandaardiseerd. Belangrijk is wel dat de homogenisatie voor de detectie van de melksamenstelling identiek verloopt aan de homogenisatie van de melk bij kalibratie (Rémillard et al., 1993). Bij transmissie-FTIR spectroscopie van waterrijke stoffen zoals melk moet er gebruik gemaakt worden van een zeer dunne cuvette zodat absorptie door water beperkt blijft. Een alternatief voor transmissie-FTIR spectroscopie is ATR spectroscopie. Door de beperkte penetratiediepte van elektromagnetische straling bij ATR spectroscopie is de effectieve optische padlengte zeer kort, ongeacht de hoeveelheid staal die op het kristal aangebracht wordt. Deze techniek biedt bijgevolg heel wat voordelen voor online-meettoepassingen en zou in principe rechtstreeks in de melkleiding ingebouwd kunnen worden. Dit in tegenstelling tot transmissiemetingen waar door de dunne opening van de cuvette heel wat problemen kunnen optreden zoals verstopping, luchtbellen, onstabiele druk en moeilijke reiniging. 4.2.2 ATR-FTIR spectroscopie voor de analyse van de melksamenstelling Ondanks deze voordelen is er slechts beperkt onderzoek gebeurd naar het gebruik van ATRFTIR spectroscopie op gehomogeniseerde en rauwe melk voor detectie van de samenstelling. Door de beperkte penetratiediepte bij ATR-FTIR spectroscopie is het van groot belang dat het ATR-kristal proper en droog is voordat het staal of blanco op het kristal gebracht wordt. De aanwezigheid van vetten en eiwitten in melk kan deze procedure enorm bemoeilijken. Iñón et al. (2004) en Linker en Etzion (2008) bekwamen de beste resultaten door het staal 49

eerst weg te spoelen met warm water (45°C), dan te spoelen met een oplossing van commercieel detergent (5% gewicht/volume), vervolgens het detergent weg te spoelen met een ethanol/water oplossing (10 volume%) en uiteindelijk te wassen met methanol of aceton zodat het ATR-kristal snel opdroogt. Iñón et al. (2004) gebruikten HATR-FTIR spectroscopie om het vet-, ruw eiwit- en koolhydraatgehalte van verschillende commerciële (gehomogeniseerde) melkstalen te voorspellen. Opvallend was de sterke absorptie door water (3650 - 3000 cm-1 en 1680 - 1600 cm-1) en CO2 (2360 cm-1). De amide II-groep (CONH) van eiwitten absorbeerde bij 1546.8 cm-1, terwijl de O-H-hydroxylgroep van lactose absorbeerde ter hoogte van 1039.6 cm-1. Overtonen van deze absorptie door lactose werden waargenomen bij 2600 cm-1. De chemische structuur van triglyceriden absorbeert via de C=O-carbonyl en C-H-alkyl groep bij respectievelijk 1747.3 en 2873.6 cm-1. Deze golfgetallen komen exact overeen met de golflengtes die ook gehanteerd worden bij commerciële FTIR-transmissiemelkanalysetoestellen. In de absorptiespectra van ATR-FTIR spectroscopie is de absorptieband van eiwitten (Amide I) door C=O stretchvibraties in de 1680 - 1600 cm-1 regio zichtbaar, terwijl dit bij transmissiespectra door de sterke absorptie van water in deze regio niet het geval is. .Het beste kalibratiemodel voor de bepaling van ruw eiwit en lactose werd bekomen via PLS-2 met 12 principale componenten, gebaseerd op het hele spectrum. Dit model gaf een RMSECV van 0.33, 0.14 en 0.30% (w/w) en een RMSEP van 0.29, 0.1 en 0.32% (w/w) voor respectievelijk vet, ruw eiwit en koolhydraten in melk. In het geval van vet kon het gebruik van PLS-1 met 10 principale componenten en gereduceerde spectra (2877 2827 cm-1 en 1782 - 1705 cm-1) de RMSECV en RMSEP verbeteren tot respectievelijk 0.21 en 0.26% (w/w). Etzion et al. (2004) onderzochten de potentie van HATR-FTIR spectroscopie voor onlinedetectie van ruw eiwitgehalte in rauwe melk. Later werd deze studie verder uitgebreid naar de detectie van vet en ruw eiwit (Linker & Etzion, 2009). Het beste PLS-model voor de predictie van ruw eiwit in rauwe melk (RMSEP = 0.22 % w/w) werd bekomen met negen latente variabelen bij gebruik van de Amide II (1613 - 1480 cm-1), Amide III (1280 - 1200 cm-1) en O=P-O stretch (1100 - 1060 cm-1) regio‟s. Toevoeging van de Amide I (1705 - 1558 cm-1) regio gaf geen verbetering van het model. Dit kan waarschijnlijk verklaard worden door de te sterke overlap met de absorptieregio van water. Toevoeging van de absorptiepiek voor de fosfaatgroep draagt wel bij tot het verkleinen van de predictiefout omdat deze vaak voorkomt in een covalente binding met caseïne (Etzion et al., 2004). Het model kon nog verder verbeterd worden (RMSEP = 0.08% w/w) door de correlatie (r2 = 0.33) met het vetgehalte aan het model toe te voegen met behulp van neurale netwerken. In later onderzoek (Linker & Etzion, 2009) bleek dit model echter weinig robuust te zijn over verschillende seizoenen (RMSEP = 0.30% w/w). De predictiefouten voor vet in rauwe melk over verschillende seizoenen op basis van Vet A en Vet C (1800 - 800 cm-1), Vet B (3000 - 2700 cm-1) en Vet C (1400 - 1200 cm-1) was respectievelijk 0.81; 0.74 en 0.78% (w/w). Deze resultaten zijn onaanvaardbaar voor een nauwkeurige detectie van het melkvetgehalte als belangrijke ondersteunende parameter bij managementbeslissingen. De auteurs stelden dat deze minder goede resultaten ook niet verwonderlijk waren omdat de diameter van de vetglobules in rauwe melk varieert van 0.1 tot 15 μm en dus veel groter is dan de penetratiediepte van de infrarode straling (0.4 – 1.5 μm voor de spectrale range van 4000-1000 cm-1 in deze studie). De resultaten suggereren dat vetglobules uit rauwe melk een soort biofilm vormen aan het ATRoppervlak waardoor ze ongecontroleerd de ATR beïnvloeden. Er werden manipulaties zoals homogenisatie voorgesteld, maar deze zijn moeilijk online toe te passen (Linker & Etzion, 2009). 50

5 Doelstelling Het doel van deze thesis is de bruikbaarheid van Vis/NIR en ATR-FTIR spectroscopie voor online-detectie van het vet-, eiwit-, lactose- en ureumgehalte in rauwe koemelk na te gaan. Online-detectie van deze melksamenstelling gedurende het melken (twee of 3 keer per dag) zou de mogelijkheid bieden om de gezonheids- en voedingstoestand van de melkkoeien nauwkeurig op te volgen. Daardoor kan de voeding en de verzorging van de dieren sneller en tegelijkertijd ook op individuele behoefte afgestemd worden. Zoals aangegeven in paragraaf 4.1 werd Vis/NIR spectroscopie in het verleden reeds succesvol gebruikt op laboschaal voor de predictie van het gehalte van de belangrijkste componenten in melk. Deze techniek werd zelfs al een aantal keer toegepast voor het online opmeten van de melksamenstelling. Toch blijkt uit de vele publicaties omtrent dit onderwerp niet eenduidig wat de beste meetconfiguratie is bij het gebruik van Vis/NIR spectroscopie op melk. Bij de meeste onderzoeken werd gebruik gemaakt van transmissiespectroscopie, maar door de sterke extinctie van de elektromagnetische straling met een golflengte boven 1000 nm, door het hoge watergehalte in combinatie met de sterke verstrooiing van het licht door de vetglobules in rauwe melk, moet de optische padlengte beperkt worden tot een aantal mm. Deze staalpresentatie brengt extra moeilijkheden met zich mee bij het uitwerken van een sensor die in de praktijk gebruikt kan worden. Een aantal onderzoekers gebruikte reflectantiespectroscopie voor de detectie van de samenstelling van melk, melkpoeder en kaas. Ook deze meetmethode gaf in sommige onderzoeken goede resultaten. Reflectantiespectroscopie biedt extra voordelen met het oog op online-implementatie omdat het gemakkelijk gebruikt kan worden zonder enige staalvoorbereiding. Daarom is het belangrijk dat er een goede objectieve afweging wordt gemaakt tussen transmissie- en reflectantiespectroscopie. Deze vergelijking is in het verleden nooit gemaakt of gepubliceerd. Om die reden wordt in het eerste luik van dit onderzoek deze vergelijking tussen Vis/NIR reflectantie- en transmittantiespectroscopie voor dezelfde rauwe melkstalen gemaakt. Voor de bepaling van de melksamenstelling in het laboratorium wordt in de meeste gevallen gebruik gemaakt van transmissie-FTIR spectroscopie. De beperkte optische padlengte en de extra staalvoorbereiding maken deze techniek ongeschikt voor online toepassingen. ATRFTIR spectroscopie vraagt amper staalvoorbereiding waardoor het mogelijks wel geschikt is. Slechts twee onderzoeksgroepen (paragraaf 4.2.2) gebruikten deze techniek voor analyse van de melksamenstelling. Zeer goede resultaten werden bekomen voor de analyse van commerciële gehomogeniseerde melk (Iñón et al., 2004), terwijl een ander onderzoek minder goede resultaten opleverde bij de analyse van rauwe melkstalen (Linker & Etzion, 2009). Door het beperkt aantal publicaties is nog onvoldoende duidelijk of ATR-FTIR spectroscopie gebruikt kan worden voor de samenstellingsbepaling van rauwe melk. Anderzijds wordt in beide onderzoeken wel gesuggereerd dat homogenisatie van de melk voor analyse met MIR wezenlijk is. Toch werd er nog geen vergelijking tussen de analyse van gehomogeniseerde en rauwe melkstalen met behulp van ATR-FTIR spectroscopie gepubliceerd. In het tweede luik van dit thesisonderzoek worden daarom rauwe melkstalen verzameld en wordt elk melkstaal in twee gesplitst waarbij de helft van elk staal wordt gehomogeniseerd. Analyse van de rauwe en de gehomogeniseerde versie van hetzelfde melkstaal met behulp van ATR-FTIR spectroscopie maakt een objectieve vergelijking mogelijk.

51

II.

Transmittantie- en reflectantiespectroscopie

6 Keuze van beste staalpresentatie bij Vis/NIR spectroscopie voor de predictie van de samenstelling van rauwe melk 6.1 Inleiding Zoals aangegeven in paragraaf 4.1.2 is er geen consensus over wat de beste staalpresentatie is voor de detectie van de rauwe melksamenstelling met behulp van Vis/NIR spectroscopie. De meeste onderzoeken hieromtrent zijn gebaseerd op succesvol gebruik van transmittantiespectra, maar ook met behulp van reflectantiespectra zijn reeds goede resultaten gevonden (Šustová et al., 2004). Daarnaast heeft reflectantiespectroscopie door de gemakkelijkere staalpresentatie en de afwezigheid van staalvoorbereiding een aantal voordelen ten opzichte van transmittantiespectroscopie met het oog op online meten. In deze proef wordt het gebruik van transmittantie- en reflectantiespectra voor de detectie van vet-, eiwit-, lactose- en ureumgehalte in rauwe melk op een objectieve manier met elkaar vergeleken zodat de methode kan geselecteerd worden die het meest geschikt is voor onze toepassing. De verschillende spectra werden opgemeten voor dezelfde melkstalen bij exact dezelfde omgevingsomstandigheden. Het effect van de staalpresentatie, de verschillende spectra voorbehandelingstechnieken en variabelenselectiemethodes op de predictie van de multivariabele modellen werd nagegaan.

6.2 Materiaal en methode 6.2.1 Melkstalen De melkstalen gebruikt voor kalibratie en validatie in deze studie werden genomen in het kader van melkproductieregistratie (MPR), een dienst georganiseerd door de Coöperatie Rundveeverbetering (CRV Holding BV) in samenwerking met MCC-Vlaanderen, waarbij melkveehouders zich kunnen aansluiten om de individuele productie van hun melkvee op te volgen. Vier wekelijks wordt er van elk individueel dier een representatief melkstaal (ongeveer 27 ml) genomen en geanalyseerd op vet-, eiwit-, en lactosegehalte conform ISO 9622:2000 (ISO, 2000). Bijkomend kan ook het ureumgehalte en het gehalte aan somatisch cellen bepaald worden. De analyse op samenstelling (vet, eiwit, lactose en ureum) gebeurt met behulp van de Milkoscan FT+ (paragraaf 4.2.1). Aan de melkstalen wordt een conserveringsmiddel toegevoegd (0.11 volume% bewaarmiddel, Qlip, Leusden, Nederland) omdat het tot 3 dagen na staalname kan duren vooraleer ze geanalyseerd worden. De analyses in het kader van deze studie werden uitgevoerd binnen de 2 dagen na ophaling van de stalen, zodat er geen kans was op afbraak van melkcomponenten door bacteriële groei. De MPR-melkstalen bevatten een grote variatie met enerzijds variatie veroorzaakt door de afkomst (melkveebedrijf) en dus management, voederstrategie, diergenetica, … en anderzijds een grote variatie in concentratie van de verschillende melkcomponenten die we willen voorspellen. Deze variatie is belangrijk voor het opstellen van een nauwkeurig en robuust predictiemodel. De melkstalen werden verzameld in reeksen van 10 waarbij alle stalen van eenzelfde reeks afkomstig waren van verschillende koeien binnen eenzelfde melkveebedrijf. Bij verdere behandeling (zoals opwarmen) en analyse van de stalen werd er ook steeds gewerkt per reeks van 10. Bij de „cross‟-validatie werd hiermee rekening gehouden zodat stalen van een bepaalde reeks niet gebruikt werden voor het opstellen van het kalibratiemodel en vervolgens 52

de predictie van de samenstelling voor een staal van diezelfde reeks. Hierdoor werd het reeksspecifiek effect, en hiermee het bedrijfseffect, effect van opwarmen en analyse in functie van de tijd, verwijderd uit het kalibratiemodel. In totaal werden 300 melkstalen (geen replica‟s) verzameld en geanalyseerd met behulp van transmittantie en reflectantie Vis/NIR spectroscopie. Deze 300 melkstalen waren afkomstig van 300 verschillende melkkoeien van 30 verschillende bedrijven verspreid over heel Vlaanderen. Hieruit werden 200 melkstalen (20 reeksen) geselecteerd voor het opstellen van een kalibratiemodel, terwijl de overige 100 melkstalen (10 reeksen) gebruikt werden als onafhankelijke testset voor de bepaling van de werkelijke predictienauwkeurigheid van het model. De kalibratie- en testset werden geselecteerd uit de totale steekproef van 300 stalen via het duplex algoritme (Snee, 1977). Omdat een reeks volledig in de testset of volledig in de kalibratieset moest zitten, werd er bij de selectie gewerkt met de gemiddelde samenstelling van de stalen binnen die bepaalde reeks. Het algoritme bepaalde de euclidische afstand tussen de verschillende reeksen en ging op basis daarvan de reeksen verdelen over de test- en kalibratieset waarbij beide sets ongeveer dezelfde samenstellingsregio bestreken met vergelijkbare statistische eigenschappen. Deze statistische eigenschappen van de geselecteerde kalibratie- en testset zijn te vinden in respectievelijk Tabel 6.2 en Tabel 6.3. 6.2.2 Reflectantie Reflectantie van rauwe melkstalen werd opgemeten met de Carl Zeiss Corona 45 VISNIR 1.7 (Carl Zeiss AG, Jena, Duitsland) spectrofotometer. Dit toestel combineert een silicium (Si) diode-array, werkzaam in golflengtebereik van 306.5 tot 1135.5 nm bij een meetresolutie van 3.2 nm, met een Indium Gallium Arsenide (InGaAs) diode-array. Deze laatste werkt vanaf 944.5 tot 1710.9 nm met een resolutie van 6 nm. Het gebruikte toestel is uitgerust met een ingebouwde OMK meetkop met een halogeenlamp als lichtbron en waarbij het diffuse gereflecteerde signaal opgemeten wordt onder een hoek van 45° (effectief meetoppervlak van ongeveer 20 mm diameter). Een schematisch overzicht van de opstelling is weergegeven in Figuur 6.1.

Figuur 6.1 Schematische tekening van Carl Zeiss Corona 45 VISNIR 1.7 met OMK meetkop (Saeys et al., 2005).

Een diode-array spectrofotometer is een post-dispersief instrument waarbij het volledige spectrum (meestal halogeen lamp) tegelijkertijd naar het staal wordt gestuurd. Het gereflecteerde (of getransmitteerde) licht wordt vervolgens opgevangen en naar een diffractie rooster gestuurd waar het licht gesplitst wordt in de verschillende golflengtecomponenten. Deze worden vervolgens naar een rij van 200 tot 1000 detectordiodes verzonden (diode-array) waarbij iedere diode de intensiteit van het licht in een kleine golflengtebereik (~ resolutie) detecteert en omvormt naar een elektrisch signaal. Si diode-arrays worden gebruikt in het Vis, terwijl InGaAs en loodsulfide (PbS) diode-arrays worden toegepast in het NIR. Deze laatste 53

twee zijn echter zeer gevoelig aan temperatuurschommelingen en dienen daarom gekoeld te worden om een goede nauwkeurigheid te behouden. Alle golflengtecomponenten worden zo tegelijk opgemeten waardoor het volledige spectrum zeer snel gedetecteerd wordt. De geconnecteerde laptop was uitgerust met Aspect Plus 1.76 (Carl Zeiss AG, Jena, Duitsland) software voor het aansturen van de Zeis Corona spectrofotometer. De integratietijd werd voor zowel de Vis als NIR regio apart ingesteld zodat er geen saturatie was van de detectoren, maar toch voldoende signaal (maximaal aantal „digital numbers‟ tussen 45 000 en 55 000) tijdens het opmeten van de referenties en de melkstalen, om zo de signaal op ruis verhouding te maximaliseren. De integratietijden waren 46 en 49 ms voor respectievelijk de Si en InGaAs diode-arrays. Referenties werden elke 10 melkstalen (elke 20 minuten) opnieuw genomen en waren nagenoeg identiek voor en na. De donkere referentiemeting werd genomen na het afdekken van de OMK meetkop met een 0% reflectantiestandaard. Voor de „witte‟ referentiemeting werd gebruik gemaakt van een grijze gekalibreerde 20% reflectantiestandaard (Labsphere, North Sutton, USA) waarvan de gemiddelde reflectantie het dichtst lag bij die van rauwe melkstalen in de Vis/NIR regio. Bij het opmeten van de referentie- of staalspectra werden 50 scans gemaakt en het gemiddelde spectrum werd gebruikt. Voor het opmeten van de reflectantiespectrum van het melkstaal werd een silica glasbeker (48 mm diameter, 18 mm hoog) gevuld met 20 ml melk en geplaatst op de OMK meetkop. 6.2.3 Transmittantie Transmittantiespectra werden opgemeten met ASDI Labspec®Pro (ASDI, Colorado, USA) spectrofotometer. Dit toestel combineert een Si diode-array (golflengtebereik van 350 tot 1000 nm en een resolutie van 1.4 nm) met een post-dispersieve scannende monochromator bestaande uit 2 peltier-gekoelde InGaAs detectoren (detectie van 1000 - 2500 nm met 2 nm resolutie). Een scannende monochromator bestaat uit een ingangsopening, een bolvormige spiegel die een parallelle straal produceert, een dispersief medium en een uitgangsopening. Bij een postdispersieve scannende monochromator komt het getransmitteerde licht (volledig spectrum) binnen via de ingang en wordt het door de spiegel op het dispersierooster gereflecteerd. Het dispersierooster splitst de straal in verschillende golflengtes door deze onder verschillende hoeken te reflecteren. Dit licht wordt vervolgens gereflecteerd naar de uitgang via een vaste spiegel. De uitgangopening is zeer smal en laat daardoor enkel een zeer klein golflengtebereik door, terwijl alle andere golflengtes geblokkeerd worden. Achter de uitgang wordt de intensiteit van dat welbepaalde golflengtebereik gedetecteerd. De verschillende golflengtes worden na elkaar gemeten door het draaien van het dispersierooster. Door de sterke absorptie van licht door water (± 87% in melk) in combinatie met de sterke lichtverstrooiing door de vetglobules (diameter 0,1 tot 15 μm) is de gemiddelde transmissie van rauwe melk zeer beperkt (± 0,75% voor 1 mm rauwe melk met gemiddelde samenstelling). Om voldoende licht doorheen de rauwe melk te krijgen, werd gewerkt met een 1 mm suprasil quartz kuvet model 100-QS (Hellma Benelux, Den Haag, Nederland) geschikt voor spectrale metingen tot 2500 nm in combinatie met een externe sterkere lichtbron FiberLite® DC-950 (Dolan-Jenner Industries Inc., Massachusetts, USA) van 200 Watt. De geconnecteerde laptop was uitgerust met Indico Pro 3.1.6 software (ASDI, Colorado, USA). Deze software stelde automatisch de integratietijd in zodat het maximum aantal „digital numbers‟ voor de 3 verschillende detectoren gelegen was tussen 30 000 en 40 000. Deze 54

optimalisatiestap werd uitgevoerd tijdens het opmeten van een gemiddeld melkstaal. Deze integratietijden werden verder gebruikt voor alle referentiemetingen en opmeten van de melkstalen. Om saturatie te voorkomen, maar toch voldoende signaal te behouden voor een hoge signaal/ruis verhouding tijdens de referentiemetingen, moest een stabiele referentie gezocht worden die gemiddeld eenzelfde transmissie (in het bereik 350 tot 2500 nm) had als rauwe melk met een gemiddelde samenstelling. Teflontape (P.T.F.E) van 0.075 mm dikte (Polyflon, Norwalk, Connecticut, USA) had een transmissie van ongeveer 0.75% die dezelfde was over het volledige golflengtebereik van 350 tot 2500 nm. Om deze referentie stabiel te houden werd ze gemonteerd in een filterwiel. Tijdens het opmeten van de witte referentie ging de lege cuvette in de cuvettehouder en het filterwiel in de toestand waarbij de teflontape een deel van het signaal blokkeerde. Het toestel nam automatisch een zwarte referentie door het signaal volledig te blokkeren. Referenties werden voor elke reeks (elke 40 minuten) opnieuw genomen en waren voor en na analyse van een reeks nagenoeg identiek. Bij het opmeten van een staal werd het filterwiel in toestand geplaatst waarbij het geen licht blokkeerde. Een schematisch overzicht van de opstelling is weergegeven in Figuur 6.2. Bij het opmeten van referenties of melkstalen werden 100 scans gemaakt en het gemiddelde spectrum werd gebruikt.

Figuur 6.2 Schematische voorstelling van de transmittantie opstelling.

6.2.4 Methode Melkstalen werden voor analyse in reeksen van 10 samen met de 1 mm cuvette opgewarmd tot 40°C in een warmwaterbad (type 1004, GFL, Burgwedel, Duitland). Vervolgens werden de melkstalen zorgvuldig omgeroerd tot een homogene emulsie van vet in water. Bij de transmittantiemeting werd de 1 mm cuvette gevuld met 400 µl melk, de buitenkant afgedroogd, in de cuvettehouder gebracht en geanalyseerd. Bij het opmeten van reflectantie werd de silica glasbeker gevuld met 20 ml melk (11 mm dikke laag), op de OMK meetkop geplaatst, afgedekt met 0% reflectantiestandaard en geanalyseerd. Opmeten van transmittantie en reflectantie van de melkstalen binnen een bepaald reeks gebeurde random door elkaar. Analyse van de verschillende reeksen gebeurde ook volledig random door elkaar. Tussen het opmeten van 2 melkstalen werd de cuvette en silica glascup aan binnen- en buitenzijde grondig gepoetst met ethanol en water en vervolgens gedroogd. 6.2.5 Statistische analyse van de spectrale data De opgemeten spectra (transmittantie en reflectantie) werden samen met de referentieanalyses voor vet, ruw eiwit, lactose, ureum en SCC ingelezen in Matlab (versie 7.9, The MathWorks Inc., Massachusetts, USA) voor statistische verwerking met de PLS toolbox 5.5 (Eigenvector Technologies, Washington, USA). Het deel van de spectra beneden 400 nm werd verwijderd omdat de detectoren van de spectrofotometer niet geschikt waren voor detectie van UV55

straling. Door te sterke absorptie (transmittantie of reflectantie < 0.2%) van NIR-straling door water in de melk werd de regio 1392 – 1535 nm en de regio‟s 1890 – 2010 nm en 2392 – 2500 nm verwijderd uit respectievelijk de reflectantie- en transmittantiespectra. Het uiteindelijke doel van deze proef is de objectieve vergelijking tussen reflectantie en transmittantie Vis/NIR spectroscopie op basis van hun predictienauwkeurigheid voor de samenstellingsbepaling van rauwe melk. De transmittantiespectra werden opgemeten vanaf 400 tot 2500 nm, terwijl dit voor reflectantie slechts gebeurde tot 1700 nm. Voor een objectieve vergelijking moeten dezelfde golflengtebereiken (400 – 1700 nm) gehanteerd worden. Daarnaast is het ook interessant om na te gaan of verruiming van het transmittantiespectra van 1700 tot 2500 nm een significante verbetering gaf van de predictienauwkeurigheid. Voor de regio 400 – 1000 nm zijn goedkope Si diode-array detectoren beschikbaar, vandaar dat ook nagegaan werd of een vernauwing van de spectra tot dit bereik een significant slechtere predictienauwkeurigheid gaf voor de verschillende melkcomponenten. Dit resulteerde in vijf groepen die met elkaar vergeleken werden aan de hand van hun predictiefout (transmittantie vanaf 400 tot 2500, 1700 en 1000 nm en reflectantie vanaf 400 tot 1700 en 1000 nm). Per groep werd vooraf de spectravoorbehandeling, de variabeleselectie en het aantal geselecteerde latente variabelen voor de predictiemodellen van iedere melkcomponent afzonderlijk geoptimaliseerd. De beste spectravoorbehandeling (paragraaf 3.5.1) voor de predictie van iedere melkcomponent afzonderlijk werd empirisch bepaald aan de hand van de predictienauwkeurigheid van de modellen gebouwd met deze voorbehandelde spectra. De spectravoorbehandeling was een combinatie van al dan niet een transformatie (de logaritmische transformatie van transmittantie of reflectantie naar absorbantie, en de KubelkaMunck transformatie voor reflectantiespectra), al dan niet een verstrooiingscorrectie (basislijncorrectie, MSC, SNV, 1e en 2e orde Savitzky-Golay afgeleide), wel of geen orthogonaal signaal correctie (OSC) gevolgd door „mean-centering‟. De Savitzky-Golay afgeleide (SG1D en SG2D) werd genomen van tweede orde polynomische functies die gefit werden aan intervallen van de spectra. Verschillende bereiken van deze intervallen vanaf 9 tot 51 nm in stappen van 6 nm werden onderzocht. Per combinatie werd met behulp van PLS1 een predictiemodel gebouwd dat de relatie legde tussen de voorbehandelde spectra (xvariabele) en een bepaalde component (y-variabele). Via „cross‟-validatie (paragraaf 3.5.6.1), waarbij telkens een volledige reeks verwijderd werd uit de kalibratieset, werd een schatting van de predictienauwkeurigheid voor nieuwe stalen bekomen. Het aantal latente variabelen (tussen 1 en 20) waarbij de cumulatieve predictiefout minimaal was tijdens „cross‟-validatie werd geselecteerd, tenzij er bij een lager aantal latente variabelen een significant gelijke predictiefout optrad (Haaland & Thomas, 1988). De beste spectravoorbehandeling was diegene waarbij het PLS-model de laagste RMSECV opleverde. Indien er echter spectravoorbehandelingen waren waarbij het model significant (p ≤ 0.05) niet slechter presteerde volgens een gepaarde t-test van de absolute predictiefouten per melkstaal in „cross‟-validatie, werd hiervan diegene geselecteerd met het laagste aantal latente variabelen. Vervolgens werden een aantal variabele selectiemethodes (paragraaf 3.5.2) getest om na te gaan of het verwijderen van bepaalde x-variabelen (na toepassen van de „beste‟ spectravoorbehandeling) een verbetering gaf in robuustheid van het model (lager aantal latente variabelen) of in de predictienauwkeurigheid (lagere RMSECV). In tegenstelling tot „variable importance in projection‟ (VIP), werd er bij „forward-„ (FiPLS) en „reverse interval partial least squares‟ (RiPLS) en genetische algoritmes (GenAl) geen individuele x-variabelen geselecteerd, maar intervalen van 30 nm. Voor de andere parameters werden de 56

standaardinstellingen van de PLS toolbox gebruikt. Elk van de vier variabele selectiemethodes gaf aan welke x-variabelen het belangrijkste waren. De vier predictiemodellen gebaseerd op deze geselecteerde variabelen werden met elkaar en met het model zonder variabele selectie vergeleken. De geselecteerde variabelen die leidde tot het predictiemodel met het laagste aantal latente variabelen, maar dat significant (p ≤ 0.05) niet te onderscheiden was van het beste model (laagste RMSECV) werd gebruikt bij verdere berekeningen. De vergelijking was gebaseerd op een gepaarde t-test van de absolute predictiefouten in „cross‟-validatie. De predictiemodellen van de vijf groepen werden na optimalisatie met elkaar vergeleken via een „two-way‟ ANOVA test van de absolute predictiefouten voor de melkstalen in de onafhankelijke testset. De eerste factor binnen deze ANOVA test omvatte de groepen die we met elkaar wilden vergelijken. De individuele melkstalen werden opgenomen als tweede factor waardoor de test gepaard werd (Cederkvist et al., 2005). Omdat er geen replica‟s geanalyseerd werden per melkstaal kon de interactie tussen de twee factoren niet onderzocht worden. Indien de factor „groep‟ een significant (p ≤ 0.05) effect had, werden de verschillende groepen met elkaar vergeleken via de Tukey HSD multipele vergelijking (Kutner et al., 2005).

6.3 Resultaten 6.3.1 De nauwkeurigheid van de referentieanalyse In Tabel 6.1 worden de belangrijkste statistische parameters voor de nauwkeurigheid van de Milkoscan FT+ getoond. De predictie door de Milkoscan FT+ van de 3 maandelijkse referentiereeks van 10 melkstalen en de wekelijkse standaard voor het volledige werkjaar 2009 werd vergeleken met de Röse-Gottlieb gravimetrische methode (ISO, 1999), de Kjeldahl-methode (ISO, 2001), de Boehringer-Mannheim-methode (ISO, 2002) en de enzymatische methode (ISO, 2004) als werkelijke referentieanalyses voor respectievelijk vet, ruw eiwit, lactose en ureum in rauwe melk. Tabel 6.1 Prestaties van Milkoscan FT+ in 2009 ten opzichte van de werkelijke referentieanalyses.

Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/100ml)

RMSEP 0.069 0.059 0.094 14.814

R²P 0.991 0.990 0.249 0.394

BiasP HellingP InterceptP -0.025 0.965 0.105 -0.037 0.996 -0.024 -0.147 0.368 2.926 18.537 0.726 79.064

De predictiefout (RMSEP) voor de Milkoscan FT+ is voor alle 4 melkcomponenten zeer laag. Voor de predictie van vet en ruw eiwit gaat dit gepaard met zeer sterke lineaire relatie tussen de predictie en de referentieanalyse. Voor de predictie van lactose en ureum worden minder goede resultaten bekomen voor de lineaire regressie tussen de predictie en referentie. Dit wordt veroorzaakt door de beperkte variatie van deze melkcomponenten in de geteste stalen omdat deze componenten niet zijn opgenomen in de Belac accreditatienorm. MCCVlaanderen is dus niet verplicht om de Milkoscan FT+ te testen op predictie van lactose- en ureumgehalte met behulp van een lineaire referentiereeks. 6.3.2 Het bereik van de kalibratie- en testset De nauwkeurigheid en robuustheid van het predictiemodel wordt voor een groot deel bepaald door het bereik van de samenstellingswaarden van de kalibratieset die gebruikt wordt om het 57

model te berekenen. De statistisch beschrijvende parameters voor de verschillende componenten van de 200 rauwe melkstalen in de kalibratieset zijn weergegeven in Tabel 6.2. Uit deze tabel kan afgeleid worden dat de gebruikte kalibratieset een zeer groot samenstellingsbereik beschrijft die overeenkomt met eerdere waarnemingen van individuele melkstalen in de praktijk (Walstra et al., 1999). Tabel 6.2 Statistische parameters voor de samenstelling van de geselecteerde kalibratieset (200 stalen).

Gemiddelde Standaardafwijking Minimum Maximum 4.54 0.78 2.72 7.94 3.58 0.46 2.66 5.01 4.63 0.32 2.92 5.22 227.41 37.39 136 332 5.01 0.58 3.70 6.60 Log10SCC (log10 cellen/ml) Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/l)

Voor de bepaling van de werkelijke predictienauwkeurigheid van een berekend model is een onafhankelijke testset noodzakelijk die representatief is voor de situatie waarin dit model later werkzaam zal zijn. De statistische parameters van de testset zijn weergegeven in Tabel 6.3 en komen vrij goed overeen met deze van de kalibratieset. Dit geeft aan dat selectie van de kalibratie- en testset uit de steekproef van 300 melkstalen op een goede wijze gebeurde. Tabel 6.3 Statistische parameters voor de samenstelling van de geselecteerde testset (100 stalen).

Gemiddelde Standaardafwijking Minimum Maximum 4.50 0.81 3.26 6.84 3.69 0.49 2.65 4.95 4.59 0.34 3.15 5.09 226.01 33.56 155 324 5.07 0.61 3.85 6.92 Log10SCC (log10 cellen/ml) Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/l)

In Tabel 6.4 worden de kwadraten van de regressiecoëfficiënten weergegeven die de relatie tonen tussen de verschillende componenten in melk. Er was geen enkele significante correlatie aanwezig. De sterkste positieve correlatie (r = 0.51) werd gevonden tussen het melkvet- en melkeiwitgehalte, gebaseerd op hun genetische correlatie (Rosati & Van Vleck, 2002). Daarnaast was er ook een zwakke negatieve correlatie (r = -0.48) tussen het lactosegehalte en het logaritme van het gehalte aan witte bloedcellen in de melk. Deze correlatie is gerelateerd aan het optreden van mastitis (paragraaf 2.7.2). Door de afwezigheid van sterke correlaties is de voorwaarde voor het gebruik van het duplex algoritme voor selectie van kalibratie- en testset voldaan (paragraaf 6.2.1). Anderzijds zal hierdoor het PLS2 algoritme voor het berekenen van de predictiemodellen geen voordelen bieden ten opzichte van PLS1. Tabel 6.4 Kwadraten van de regressiecoëfficiënten tussen de verschillende componenten van 300 rauwe melkstalen.

Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/100ml) Log10SCC(log10 cellen/ml)

Vet 1.00

Ruw eiwit Lactose 0.26 0.04 1.00 0.18 1.00

Ureum 0.03 0.00 0.00 1.00

Log10SCC 0.02 0.08 0.23 0.01 1.00 58

6.3.3 Reflectantie- en transmittantiespectra Figuur 6.3 geeft de reflectantiespectra (ten opzichte van de 20% reflectantiestandaard) voor 6 rauwe melkstalen met uiteenlopende samenstelling. De regio 1392 – 1535 nm werd uit de spectra verwijderd omdat de signaal op ruis verhouding te laag was door te sterke absorptie van deze straling door de O-H stretch- en buigvibraties van de watermoleculen (Tabel 4.2). Vooral bij golflengtes boven 900 nm is er een duidelijke positieve relatie waar te nemen tussen het vetgehalte van de melk en de reflectantie. Deze relatie wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de verstrooiing van het licht in de richting van de detector door de vetglobules in de rauwe melk. Er is namelijk een sterke positieve relatie tussen het vetgehalte van de melk en het aantal en de grootte van de vetglobules en bijgevolg ook de verstrooiing van het licht (Wikings et al., 2004). Beneden 900 nm vertoont het laag lactose melkstaal (paars spectrum) een afwijking die waarschijnlijk veroorzaakt wordt door mastitis (bv. bloed in melk), gebaseerd op de relatie tussen mastitis en een laag lactosegehalte van de melk (paragraaf 2.7.2).

Figuur 6.3 Reflectantiespectra voor zes rauwe melkstalen met uiteenlopende samenstelling.

In Figuur 6.4 is de eerste orde afgeleide van de reflectantiespectra na logaritmische transformatie naar absorbantie weergegeven. Deze eerste orde Savitzky-Golay afgeleide van de tweede orde polynomische functies per golflengtebereik van 21 nm werd gebruikt omdat deze spectravoorbehandeling leidde tot goede PLS modellen voor predictie van zowel vet, ruw eiwit, als lactose in rauwe melk. Bepaalde delen van de spectra zijn verder uitvergroot omdat deze zeer belangrijk waren (hoge regressiecoëfficiënt) in het predictiemodel voor vet, ruw eiwit of lactose. Voor het golflengtebereik 920 tot 970 nm is er een relatie aanwezig tussen de y-waarde en het vetgehalte van de rauwe melkstalen. Dit golflengtebereik komt overeen met de derde overtoon van C-H stretchvibraties van triglyceriden bij 930 nm (van der Meer & de Jong, 2001). De hoogste regressiecoëfficiënten voor het eiwit predictiemodel werden gevonden tussen 1640 tot 1670 nm, wat overeenkomt met de eerste overtoon van amide B vibraties (Tabel 4.2). De regio 680 – 700 nm had een sterke relatie tot het 59

lactosegehalte, waarschijnlijk gerelateerd aan de derde overtoon van O-H stretchvibraties van suikers in dit gebied (Stuart & Ando, 1997).

Figuur 6.4 Eerste orde afgeleide van de reflectantiespectra na logaritmische transformatie naar absorbantie voor zes rauwe melkstalen met uiteenlopende samenstelling.

De transmittantiespectra (ten opzichte van de teflon transmittantiereferentie) van diezelfde melkstalen zijn weergegeven in Figuur 6.5. Ter hoogte van 1450, 1950 en 2500 nm is er een zeer lage transmittantie waarneembaar door sterke absorptie van de NIR straling door de O-H stretch- en buigvibraties van de watermoleculen (Tabel 4.2). In de regio‟s 1890 tot 2010 nm en 2390 tot 2500 nm was er bijna volledige absorptie waardoor de signaal op ruis verhouding te laag was. Deze delen werden daarom uit de spectra verwijderd. Ook bij de transmittantiespectra is er een duidelijke relatie tussen het vetgehalte en de transmittantie boven 1000 nm. Rauwe melkstalen met een hoger vetgehalte laten deze straling minder door, waarschijnlijk door sterkere verstrooiing van het licht door meer en grotere vetglobules.

60

Figuur 6.5 Transmittantiespectra voor zes rauwe melkstalen met uiteenlopende samenstelling.

De eerste orde Savitzky-Golay afgeleide van tweede orde polynomische functies over een golflengtebereik van 31 nm na logaritmische transformatie van de transmittantie- naar absorbantiespectra (Figuur 6.6) gaf goede PLS modellen voor predictie van zowel vet, ruw eiwit als lactose in rauwe melk. In de regressievector voor predictie waren er voor vet, ruw eiwit en lactose een aantal golflengteregio‟s met hoge regressiecoëfficiënten. Deze sterke correlatie tussen het vetgehalte en de voorbehandelde spectra kwam voor tussen 1660 en 1730 nm. De eerste overtoon van asymmetrische C-H stretchvibraties van vetten bij 1725 nm (Tabel 4.2) valt binnen dit bereik. Bij 2160 nm absorberen amide B en amide II vibraties van eiwitten (Tabel 4.2). Dit was merkbaar aan de hoge regressiecoëfficiënten in deze regio voor de predictie van het ruw eiwitgehalte. Voor lactose was 1480 tot 1500 nm de belangrijkste regio. Hierbinnen valt de eerste overtoon van O-H stretchvibraties bij suikers die plaatsvindt op 1490 nm (Stuart & Ando, 1997).

61

Figuur 6.6 Eerste orde afgeleide van de transmittantiespectra na logaritmische transformatie naar absorbantie voor zes rauwe melkstalen met uiteenlopende samenstelling.

6.3.4 PLS kalibratie Voor iedere groep en melkcomponent afzonderlijk werd de spectravoorbehandeling, variabele selectie en het aantal geselecteerde latente variabelen geoptimaliseerd zoals besproken in materiaal en methode (paragraaf 6.2.5). Voor de predictie van vet, ruw eiwit en lactose worden de resultaten hiervan weergegeven in respectievelijk Tabel 6.5, Tabel 6.6 en Tabel 6.7. Per groep wordt de geselecteerde (beste) spectravoorbehandeling, variabele selectie en aantal latente variabelen weergegeven samen met de predictieresultaten van het PLS model. Dit omvat de „root mean square error‟, determinatiecoëfficiënt en de ratio van predictiefout en standaarddeviatie voor zowel „cross‟-validatie als voor de onafhankelijke testset. Binnen een bepaalde tabel zijn de verschillende groepen gerangschikt van boven naar onder volgens toenemende RMSEP (gemiddelde predictiefout) en vervolgens met elkaar vergeleken via een gepaarde vergelijking van de absolute predictiefouten voor alle melkstalen binnen de onafhankelijke testset. Indien er via de „two-way‟ ANOVA een verschil waargenomen werd tussen de groepen, werden de groepen onderling vergeleken via een multipele vergelijking. Groepen die significant (p ≤ 0.05) niet van elkaar te onderscheiden waren, werden aangeduid met eenzelfde subscript bij de RMSEP. Voor de beste predictie (laagste RMSEP) van het vetgehalte in rauwe melk werd het volledige (400 – 1700 nm) reflectantiespectrum geselecteerd. Toch was de predictie van dit model enkel significant te onderscheiden van de predictie gebaseerd op de ingekorte (400 – 1000 nm) transmittantiespectra. De vier significant niet te onderscheidden modellen hadden allen een RPDP groter dan 6.5 en waren dus zeer geschikt voor procescontrole (Williams & Norris, 2001). 62

Tabel 6.5 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het vetgehalte in rauwe melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijkingII tussen de verschillende groepen op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Spectra Variabele 2 RPDCV RPDP Groep # LV RMSECI RMSECVI RMSEPI,II R2CV RP voorbehandeling selectie Reflectantie 400-1700 nm

Reflectantie SG2D(45,2) OSC

FiPLS

3

0.032

0.042

0.052a

0.997

0.996

18.461

15.442

Transmittantie 400-2500 nm

Absorbantie SG1D(39,2) OSC

FiPLS

3

0.045

0.058

0.070a

0.994

0.992

13.364

11.495

Transmittantie 400-1700 nm

Absorbantie SG1D(27,2) OSC

RiPLS

5

0.045

0.075

0.109a

0.991

0.982

10.457

7.406

Reflectantie 400-1000 nm

Absorbantie SG1D(15,2) OSC

FiPLS

8

0.073

0.098

0.119a

0.984

0.978

7.941

6.789

Transmittantie 400-1000 nm

.

Absorbantie OSC

RiPLS

17

0.190

0.264

0.629b

0.886

0.395

2.957

1.289

I II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

Ook voor de predictie van ruw eiwit werden de beste resultaten gevonden voor het volledige reflectantiespectra. Reductie van deze spectra tot enkel 400 – 1000 nm zorgde wel voor een significant hogere predictiefout. Beide waren echter niet te onderscheiden van de predictie gebaseerd op de volledige of deels gereduceerde (400 – 1700 nm) transmittantiespectra, die ook onderling niet significant van elkaar te onderscheiden waren. Deze modellen gaven voldoende nauwkeurige predictie (RPDP > 2.5) voor de ruwe opvolging van het eiwitgehalte in rauwe melk (Williams & Norris, 2001). Inkorten van de transmittantiespectra tot enkel 400 – 1000 nm zorgde ten opzichte van alle andere modellen voor een significant hogere predictiefout, merkbaar aan de slechte predictie (RPDP < 2). Tabel 6.6 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het ruw eiwitgehalte in rauwe melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijkingII tussen de verschillende groepen op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Spectra Variabele 2 RPDCV RPDP Groep # LV RMSECI RMSECVI RMSEPI,II R2CV RP voorbehandeling selectie Reflectantie 400-1700 nm

Reflectantie SG2D(45,2) OSC

RiPLS

3

0.064

0.097

0.113a

0.955

0.947

4.730

4.353

Transmittantie 400-2500 nm

Transmittantie SG1D(45, 2) OSC

GenAl

12

0.086

0.105

0.156a,b

0.948

0.898

4.376

3.144

Transmittantie 400-1700 nm

Absorbantie SG2D(51,2) OSC

RiPLS

3

0.072

0.131

0.162a,b

0.919

0.890

3.510

3.020

Reflectantie 400-1000 nm

Kubelka-Munk SG2D(51,2) OSC

RiPLS

3

0.121

0.150

0.189b

0.893

0.850

3.060

2.590

Transmittantie 400-1000 nm

Absorbantie SG1D(15,2) OSC

FiPLS

3

0.173

0.211

0.274c

0.789

0.687

2.179

1.790

I II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

Het model gebaseerd op transmittantiespectra van 400 tot 1700 nm gaf de beste resultaten voor de predictie van lactose. Deze waren ook aanvaardbaar voor ruwe screening (RPDP > 2.5). Verruiming van het spectra tot 2500 nm gaf geen significant verschil. Anderzijds was er ook geen significant verschil waarneembaar indien de volledige reflectantiespectra gebruikt werden. Toch zorgde dit voor een daling van de RPDP ver onder het aanvaardbaar niveau voor de opvolging van het lactosegehalte in rauwe melk (Williams & Norris, 2001). 63

Vernauwing van de reflectantiespectra tot een maximum van 1000 nm zorgde niet voor een significant hogere predictiefout, maar leidde wel tot een model dat slechter presteerde dan de modellen gebouwd met de volledige of deels gereduceerde transmittantiespectra. Transmittantiespectra met enkel informatie van 400 tot 1000 nm zijn ook voor de lactosepredictie ontoereikend en leveren een model dat significant slechter is dan alle andere. Tabel 6.7 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het lactosegehalte in rauwe melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijkingII tussen de verschillende groepen op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Spectra Variabele 2 RPDCV RPDP Groep # LV RMSECI RMSECVI RMSEPI,II R2CV RP voorbehandeling selectie Transmittantie 400-1700 nm

Absorbantie SG1D(27,2) OSC

RiPLS

9

0.045

0.091

0.115a

0.916

0.883

3.451

2.951

Transmittantie 400-2500 nm

Transmittantie SG1D(39,2) OSC

RiPLS

16

0.066

0.091

0.133a

0.916

0.843

3.458

2.553

Reflectantie 400-1700 nm

Reflectantie SG2D(51,2) OSC

FiPLS

2

0.129

0.166

0.182a,b

0.720

0.708

1.889

1.870

Reflectantie 400-1000 nm

Kubelka-Munk SG1D(21,2) OSC

FiPLS

3

0.189

0.230

0.224b

0.465

0.557

1.367

1.517

Transmittantie 400-1000 nm

Absorbantie SG2D(45,2) OSC

Geen

3

0.191

0.232

0.317c

0.453

0.111

1.353

1.071

I II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

Voor de bepaling van het ureumgehalte en het gehalte aan somatische cellen in de melk was transmittantie en reflectantie Vis/NIR spectroscopie ontoereikend. Bij het opstellen van modellen voor de verschillende groepen was de determinatiecoëfficiënt voor respectievelijk „cross‟-validatie en de onafhankelijke testset steeds lager dan 0.40 en 0.30. De beste spectravoorbehandeling voor transmittantie- en reflectantiespectra na al dan niet een transformatie bleek in de meeste gevallen een Savitzky-Golay afgeleide (eerste en tweede orde voor verschillende intervallen) gevolgd door een orthogonaal signaal correctie. Deze OSC is in principe een extra latente variabele waardoor in Tabel 6.5, Tabel 6.6 en Tabel 6.7 het aantal latente variabelen (#LV) vermeerderd moet worden met 1. De spreidingsdiagrammen van de predictiewaarden versus de referentiewaarden voor zowel „cross‟-validatie (blauwe bolletjes) als voor de onafhankelijke testset (groene kruisjes) zijn weergegeven voor vet, ruw eiwit en lactose in Figuur 6.7. De predictiemodellen waarvoor deze resultaten zijn weergegeven, zijn gebaseerd op de transmittantiespectra van 400 tot 1700 nm (links) en reflectantiespectra van 400 tot 1700 nm (rechts). Zowel voor „cross‟-validatie, als voor de onafhankelijke testset is de lineaire relatie tussen de voorspelde gehaltes en de referentiegehaltes zeer duidelijk. Enkel voor de predictie van lactose (onderaan) is er een significante verschil tussen het gebruik van transmittantie- en reflectantiespectra. Aan de hand van deze spreidingsdiagrammen valt ook op te merken dat de testset en kalibratieset representatief lijken voor de totale steekproef van de gebruikte rauwe melkstalen.

64

Figuur 6.7 De spreidingsdiagrammen voor ‘cross’-validatie (blauwe bolletjes) en de onafhankelijke testset (groene kruisjes) voor vet, ruw eiwit en lactose gebaseerd op transmittantiespectra van 400 – 1700 nm (links) en reflectantiespectra van 400 – 1700 nm (rechts).

65

6.4 Discussie De reflectantiespectra gaven zeer goede resultaten voor de predictie van het vetgehalte in rauwe melk. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de combinatie van absorptie en verstrooiing van het licht door de vetglobules in de melk. Het licht dat na reflectie opgevangen werd door de detector bevat dus informatie over zowel absorptie als verstrooiing van het invallende licht. De positieve correlatie (r gemiddeld 0.74 voor de 300 melkstalen) tussen het gereflecteerde licht van 900 tot 1700 nm en het vetgehalte in de melk (Figuur 6.3) in combinatie met de informatie in de specifieke vet-absorptiebanden bij bv. 930 – 950 nm (Figuur 6.4) zorgden waarschijnlijk voor de goede PLS modellering. Hoewel de reductie van deze reflectantiespectra (400 tot 1000 nm) heel wat informatie over de verstrooiing van het licht door de vetglobules en de absorptie door de CH-bindingen in vet verwijderde, leidden deze spectra toch tot een significant gelijkaardige predictie (Tabel 6.5). Dit wijst erop dat heel wat informatie over het vetgehalte aanwezig is in absorptiebanden beneden 1000 nm (bv. 920 – 970 nm). Voor de predictie van het ruw eiwitgehalte in rauwe melk bleken de volledige reflectantiespectra ook de beste resultaten te geven (Tabel 6.6). Ook hier kan de verstrooiing van het licht door de caseïnemicellen in de richting van de detector een mogelijke verklaring bieden voor de betere resultaten. Toch is er geen duidelijke relatie vast te stellen tussen de niet-voorbehandelde reflectantiespectra en het eiwitgehalte, waarschijnlijk door de zeer uitgesproken lichtverstrooiing veroorzaakt door de vetglobules in de melk. Reductie van deze spectra tot het bereik van 400 tot 1000 nm zorgde wel voor een significant hogere predictiefout. Hieruit blijkt dat de regio 1000 tot 1700 nm heel wat belangrijke informatie bevat over het ruw eiwitgehalte van de melk, zoals bijvoorbeeld de absorptieband voor de eerste overtoon van amide B tussen 1640 tot 1670 nm (Figuur 6.4). Voor de predictie van het lactosegehalte in rauwe melk waren de reflectantiespectra ontoereikend. Dit kan mogelijk verklaard worden door onvoldoende diepe penetratie van het gereflecteerde licht in het melkstaal om zo te interageren met lactose die in oplossing is in het melkserum. Door de aanwezigheid van grote aantallen vetglobules en caseïnemicellen wordt een groot deel van het invallende licht beneden 1000 nm weerkaatst (tot 80%) zonder dat het dieper kan penetreren in het melkstaal, terwijl de NIR-straling boven de 1200 nm zeer sterk geabsorbeerd wordt door het hoge watergehalte in de melk. Jankovská en Šustová (2003) en Šustová et al. (2004) gebruikten ook reflectantiespectroscopie voor de bepaling van vet, ruw eiwit en lactose in rauwe melk. Ook zij vonden goede (gelijkaardige) modellen voor de predictie van vet en ruw eiwit, maar slaagden er niet in om het lactosegehalte nauwkeurig te bepalen (R²CV respectievelijk 0.56 en 0.64). De sterk negatieve correlatie (r gemiddeld -0.82) tussen het vetgehalte van de 300 rauwe melkstalen en de transmittantiespectra van 1000 tot 2500 nm (Figuur 6.5) wordt vermoedelijk veroorzaakt door de sterke reflectie van de straling in de richting van de lichtbron (Figuur 6.3). Modellen gebaseerd op transmittantiespectra van 400 tot 1700 nm hadden voor elke melkcomponent een significant gelijke predictiefout ten opzichte van de reflectantiespectra voor datzelfde golflengtebereik. Reflectantiespectroscopie zou dus de beste oplossing bieden voor online opmeten van de melksamenstelling (vet, ruw eiwit en lactose) in een melkstroom, omdat de melk hierbij niet doorheen een cuvette moet. Bij verder bestuderen van de lactosepredictie blijkt er echter een duidelijk verschil te zijn indien er gebruikt gemaakt wordt van transmittantie- of reflectantiespectra met een RPDP van respectievelijk 2.55 en 1.87. Deze laatste is zelfs niet acceptabel voor een ruwe opvolging van het lactosegehalte in rauwe melk. Voor de bepaling van zowel het vet-, ruw eiwit-, als het lactosegehalte in rauwe melk wordt 66

daarom transmittantiespectroscopie aangeraden. Uitbreiden van het transmittantiespectrum tot 2500 nm zorgt niet voor een betere predictie van vet, ruw eiwit of lactose. Een mogelijke verklaring hiervoor is de lage signaal op ruis verhouding in deze regio door sterke absorptie van de straling door water. Hierdoor was er een beetje ruis aanwezig op het transmittantiesignaal tussen 1850 en 2500 nm. Bij de predictie van lactose leidde dit zelfs tot een (niet significant) slechter resultaat (hogere RMSEP). Door de ruis werd mogelijk een groter interval gekozen voor de Savitzky-Golay afgeleiden (Tabel 6.7), waardoor een deel van de informatie in de regio 400 – 1700 nm verloren ging. Hierdoor werden er meer latente variabelen geselecteerd voor het fitten van de kalibratiedata, wat leidde tot een minder robuuste predictie van de onafhankelijke testset. Silicium-detectoren die elektromagnetische straling tussen 400 en 1000 nm kunnen waarnemen kennen al heel wat toepassingen en zijn hierdoor relatief goedkoop (Tsenkova et al., 1999). Daarom werd ook onderzocht of reflectantie- en transmittatiespectra van 400 tot 1000 nm voldoende informatie verschaffen voor een adequate opvolging van de melksamenstelling. Reductie van de reflectantiespectra gaf enkel aanvaardbare resultaten voor vetpredictie. Transmittantiespectra van 400 tot 1000 nm gaven voor de predictie van zowel het vet-, ruw eiwit- als het lactosegehalte steeds de slechtste resultaten, met een significant slechtere predictie dan de vier andere groepen. Na het bestuderen van de witte referentiespectra voor transmittantie bleken deze niet perfect stabiel in de visuele regio. Dit kan te wijten zijn aan de lichtbron of de diode-array detector van de spectrofotometer. De minder goede resultaten van deze spectra kunnen dus toe te schrijven zijn aan het kleiner golflengtebereik in combinatie met een instabiele detectie van de transmittantie. Het kleiner golflengtebereik bevat enerzijds minder absorptiebanden voor de verschillende melkcomponenten en anderzijds nemen de intensiteiten van de specifieke absorpties af in de richting van het visuele spectrum. De predictie tijdens „cross‟-validatie voor vet en ruw eiwit was aanvaardbaar, maar omdat er bij het vetpredictiemodel teveel latente variabelen geselecteerd werden, was deze niet robuust voor predictie van de onafhankelijke testset. Transmittantiespectroscopie voor de bepaling van de melksamenstelling werd reeds uitvoerig onderzocht (Tabel 4.1). Saranwong en Kawano (2008) gebruikten 400 tot 1100 nm transflectie- en transmittantiespectroscopie doorheen een cuvette van 13.7 mm en bekwamen zeer goede resultaten voor de predictie van het vet-, ruw eiwit- en lactosegehalte in een aparte testset. Deze resultaten waren beperkt beter dan diegene gevonden in deze studie. Een Japanse onderzoeksgroep (Kawamura et al., 2007; Kawasaki et al., 2005; Kawasaki et al., 2008) onderzocht het gebruik van diffuse transmittantiespectroscopie in het 600 – 1050 nm bereik om de melksamenstelling tijdens het melken vast te stellen. De resultaten voor onafhankelijke predictie waren vaak uiteenlopend en globaal gezien minder goed dan de resultaten van dit onderzoek. Purnomoadi et al. (1999) gebruikten 1100 – 2500 nm transmittantiespectroscopie doorheen een 1 mm cuvette, net zoals in deze studie, en bekwamen vergelijkbare resultaten voor de bepaling (onafhankelijke testset) van ruw eiwit, maar minder goede resultaten voor de predictie van het vetgehalte. Betere resultaten voor de predictie van het vet- en ruw eiwitgehalte werden bekomen met transmittantiespectroscopie van hetzelfde golflengtebereik doorheen een cuvette van 0.5 mm (Laporte & Paquin, 1999). Albanell et al. (2003) vonden vergelijkbare resultaten met behulp van 1500 – 2400 nm transflectiespectroscopie met een optische padlengte van 0.6 mm. Een groot nadeel aan de meeste onderzoeken die gepubliceerd zijn rond het gebruik van Vis/NIR spectroscopie voor de samenstellingbepaling van rauwe melk, is de afwezigheid van een validatie op basis van een volledig onafhankelijke testset. Op die manier is het gepubliceerde resultaat moeilijk te vertalen naar een praktijksituatie. Tsenkova et al. (1999) vergeleek verschillende optische padlengtes voor 700 67

– 2500 nm transmittantiespectroscopie voor de bepaling van de drie hoofdcomponenten in rauwe melk. Voor golflengtes boven 1100 nm was de absorptie door water zeer groot waardoor enkel de 1 mm cuvette aanvaardbare resultaten gaf. Op basis van „cross‟-validatie was de predictie voor het vetgehalte vergelijkbaar (R²CV = 0.996) met dit onderzoek, maar de predictie van het ruw eiwit- en lactosegehalte was ondermaats (R²CV respectievelijk 0.72 en 0.67). Enkele onderzoekers trachtten ook tevergeefs het melkureumgehalte te bepalen met behulp van Vis/NIR spectroscopie (Jankovská & Šustová, 2003; Kawasaki et al., 2005; Kawasaki et al., 2008). Een mogelijke oorzaak van deze ongunstige resultaten ((R2P ≤ 0.68) is de zeer lage concentratie (100 – 400 mg/l) van ureum in melk. Bovendien bevinden de belangrijkste ureum absorptiebanden voor de Vis/NIR regio zich in het gebied waar er zeer sterke absorptie is door water (1990 – 2250 nm) (Workman & Weyer, 2007). Enkel Kawamura et al. (2007) bekwamen goede resultaten (R2P = 0.9) voor de online-predictie van het ureumgehalte in rauwe melk. Tsenkova et al. (2006) vonden ook een goed predictiemodel (R2P = 0.77) voor log10SCC met behulp van 1100 – 2500 nm transflectiespectroscopie. Ze besloten ook dat deze relatie voornamelijk gelinkt is aan een daling van het lactosegehalte, een verandering in de eiwitsamenstelling en een verandering in de verschillende ionconcentraties van de melk bij mastitis. Mastitis is dan op zijn beurt weer gerelateerd aan SCC (paragraaf 2.7.2). De mogelijke verklaring voor deze gunstige resultaten, in tegenstelling tot dit onderzoek, is het gebruik van melkstalen per uierkwartier. Mastitis treedt in de meeste gevallen slechts op in één uierkwartier tegelijk, waardoor de spectrale metingen van melk per kwartier veel duidelijkere informatie kunnen geven in het geval van mastitis.

6.5 Besluit Uit bovenstaande vergelijkingen blijkt dat er voor de bepaling van het vet-, ruw eiwit- en lactosegehalte in rauwe melk geen significant verschil bestaat tussen het gebruik van reflectantiespectra van 400 – 1700 nm, transmittantiespectra van 400 – 1700 nm en transmittantiespectra van 400 – 2500 nm. Voor een aanvaardbare opvolging van het lactosegehalte in de melk blijken de reflectantiespectra echter ontoereikend waardoor transmittantiespectroscopie de beste optie is voor de detectie van de melksamenstelling. Verruiming van deze spectra van 1700 tot 2500 nm zorgt niet voor betere predictie van één van de componenten. De meest efficiënte oplossing wordt bijgevolg behaald met transmittantiespectra van 400 tot 1700 nm. De resultaten die bekomen werden in dit onderzoek bevestigden de meeste eerder gepubliceerde resultaten.

68

III.

µATR-FTIR spectroscopie

7 Ultrasone homogenisatie van rauwe melk 7.1 Inleiding Rauwe melk is een olie-in-water emulsie waarbij vet voorkomt in ronde vetglobules met een diameter van gemiddeld 3 à 4 µm en een spreiding van 0.1 tot 15 µm. Het vet (vnl. triglyceriden) is hierbij omgeven door een vetglobulemembraan dat afkomstig is van het apicaal alveolair celmembraan. De vetglobules gedragen zich in melk als dunne lenzen en verstrooien het licht dat invalt op de melk. Hierdoor kan er bij transmittantiespectroscopie geen onderscheid gemaakt worden tussen geabsorbeerd of verstrooid licht. Daar de verdeling van de vetglobules niet constant is tussen de verschillende individuele melkstalen, en ook niet volledig bepaald wordt door de melksamenstelling, gaat deze de spectroscopische metingen ongecontroleerd beïnvloeden. Door homogenisatie wordt de spreiding en het gemiddelde van de vetglobulediameter drastisch verkleind en hierdoor ook de variatie ervan tussen individuele melkstalen. De lichtverstrooiing is nog steeds in sterke mate aanwezig, maar is dan gestandaardiseerd. Tijdens de homogenisatie verkleinen de vetglobules waardoor het totale oppervlakte van de vetglobules enorm toeneemt. Hierdoor is er niet voldoende membraan om de bijkomende oppervlakte te bedekken en worden de vetglobules bedekt met (een beperkt aantal) oppervlakteactieve caseïnemicellen uit de melk. De onderzoeken van Iñón et al. (2004) en Linker en Etzion (2009) doen vermoeden dat homogenisatie van rauwe melk onontbeerlijk is voor de detectie van de samenstelling met behulp van ATR-FTIR spectroscopie. De diameter van de vetglobules in rauwe melk is veel groter dan de penetratiediepte (0.4 – 1.5 μm) van de infrarode straling. Anderzijds suggereren Linker en Etzion (2009) ook dat de vetglobules uit rauwe melk een soort biofilm vormen aan het ATR-oppervlak waardoor ze ongecontroleerd de ATR beïnvloeden (Linker & Etzion, 2009). Om die reden werd homogenisatie van rauwe melk in deze studie betrokken en werd het effect ervan op de predictiemodellen voor de melksamenstelling bij ATR-FTIR spectroscopie onderzocht. Homogenisatie gebeurt conventioneel met een tweetraps hoge-druk homogenisator. Hierbij wordt melk 2 keer in serie onder hoge druk (bv. 100 bar) door een nauwe opening gestuwd, waarna het met een impactring botst. Door cavitatie en turbulentie worden de vetglobules verkleind. Omdat er geen dergelijke homogenisator voor kleine volumes (20 ml) voor handen was aan de faculteit werd er gezocht naar andere mogelijkheden zoals mechanische of ultrasone homogenisatie. Een korte test (resultaten niet weergegeven) toonde aan dat mechanische homogenisatie met behulp van een Ultra-Turrax® T18 basic (IKA, Staufen, Duitsland) niet geschikt was. De vetglobules werden over het algemeen niet verkleind en er ontstond aggregatie van de vetglobules (botervorming). Ultrasone homogenisatie werd reeds in de literatuur aangeduid als een efficiënte methode om vetglobules in melk te verkleinen en te stabiliseren (Ertugay et al., 2004; Wu et al., 2001). Wanneer intensief ultrasoon geluid passeert doorheen een vloeibaar medium zoals melk, leidt dit tot lokale oscillerende drukken. Indien deze drukvariaties groot genoeg zijn om de lokale druk tijdens de negatieve cyclus van de geluidsgolf beneden de dampspanning te brengen, zullen er gasbellen ontstaan. Deze gasbellen groeien en contraheren zeer snel samen met het geluidsveld en zijn goed samendrukbaar waardoor er veel potentiële energie in opgeslagen wordt. Als de gasbel zijn kritische grootte bereikt, barst ze en komt de kinetische energie vrij waardoor de druk en temperatuur lokaal zeer hoog kunnen oplopen. Turbulentie, 69

schuurkrachten en „microstreaming‟ zorgen ervoor dat de vetglobules uiteen barsten in kleinere entiteiten. Het proces waarbij de gasbellen worden gevormd, groeien en barsten, wordt akoestische cavitatie genoemd (Ashokkumar et al., 2008). Ertugay et al. (2004) en Wu et al. (2001) gebruikten voor de ultrasone homogenisatie van rauwe melk een ultrasone generator (450 Watt en 20 kHz), uitgerust met een 13-19 mm tip. Een energieniveau van ongeveer 1000 joule per ml rauwe melk (bv. 450 Watt * 360 s / 150 ml) was voldoende om de diameter van de vetglobules terug te dringen van 3.88 ± 0.43 µm tot 1.13 ± 0.13 µm.

7.2 Materiaal en methode In deze studie werd een ultrasone generator Branson Sonifier 450 (max. vermogen 400 Watt, 20 kHz) gebruikt die uitgerust was met 102-C converteerder, standaard 13 mm hoorn en standaard 3 mm microtip (Branson Instruments Inc., Stamford, Connecticut, USA). Dit toestel maakte enorm veel lawaai en wordt daarom in een geluidsdichte koffer geplaatst. Omdat er ongeveer 20 ml staal ter beschikking was voor de spectroscopische analyse, werd er 10 ml gehomogeniseerd in een plastiek beker (polypropyleen, 28 mm Ø en 68 mm hoog) en de andere 10 ml werd gebruikt als controle-groep (rauwe melk). Bij de homogenisatie werd de ultrasone microtip 0.5 cm in het melkstaal aangebracht. Tijdens homogenisatie warmde het melkstaal verder op waardoor het weer gekoeld moest worden met stromend water rondom het staal, dit om denaturatie (> 40°C) van de melkproteïnen te vermijden. Een melktemperatuur lager dan 35°C zorgde dan weer voor een te lage homogenisatie efficiëntie. De melk werd daarom voor homogenisatie opgewarmd tot 37 ± 1°C en de temperatuur werd tijdens homogenisatie constant gehouden door te koelen met water van 27 ± 1°C (resultaten voor de optimalisatie van de procedure niet weergegeven). Indien het vermogen hoger dan 25% (> 100 Watt) ingesteld werd, ontstond er schuim op het staal. Dit werd vermeden omdat de effecten hiervan op de fysiologische en chemische samenstelling van de melk ongekend zijn. Een vermogen lager dan 20% (< 80 Watt) zorgde ook weer voor een te lage efficiëntie. Daarom werd het vermogen ingesteld op 23% van het maximaal vermogen (= 92 Watt).

Figuur 7.1 Branson Sonifier 450 ultrasone generator met koeling en geluidsdichte kamer.

Vervolgens werd onderzocht wat de beste homogenisatieduur is bij deze instellingen. Er werd telkens gehomogeniseerd voor 3 replica‟s gedurende 1, 2, 3, …, 10 minuten en de vetglobulediameter werd bekeken bij 1000X vergroting onder een SMZ1000 stereomicroscoop, uitgerust met een JVC TK-C1360B kleuren videocamera (JVC, Yokohama, Japan). 70

7.3 Resultaten

Figuur 7.2 Foto’s van vetglobules in melk bij 1000X vergroting onder de microscoop voor: A) Rauwe melk; 71 B) 1 minuut homogenisatie; C) 2 minuten homogenisatie; D) 3 minuten homogenisatie; E) 4 minuten homogenisatie; F) 5 minuten homogenisatie;

Figuur 7.2 toont de vetglobulediameter (1000X vergroot) van rauwe melk en gehomogeniseerde melk bij verschillende homogenisatieduren. Op het microscopisch beeld van rauwe melk (subplot A) zijn de vetglobules gemakkelijk te herkennen aan de ronde structuren met een diameter van 1 tot 15 µm. Door homogenisatie worden de vetglobules verkleind, waardoor het aantal vetglobules toeneemt. Homogenisatie gedurende één minuut zorgde er voor dat de grootste vetglobules kleiner werden dan 4 µm diameter (subplot B). Homogenisatie gedurende langer dan één minuut zorgde voor een nog sterkere verkleining van de vetglobules (< 2 µm). Er kon echter geen visueel verschil in vetglobulediameter meer waargenomen worden tussen stalen die 4, 5, …, 10 minuten gehomogeniseerd werden (subplots E, F en G). Er werd visueel geen significant verschil waargenomen tussen de verschillende replica‟s voor eenzelfde homogenisatietijd waardoor de homogenisatie als constant kon worden beschouwd. 24 Uur na homogenisatie kon er geen veranderingen waargenomen worden ten opzichte van net na homogenisatie, waardoor aangenomen werd dat de homogenisatie ook zeer stabiel is in tijd.

7.4 Discussie en besluit Uit de resultaten bleek dat homogenisatie bij 92 Watt en 37°C voor een melkstaal van 10 ml niet verder verbeterde na 4 minuten. Om een zekere marge in te stellen zodat melkstalen met een zeer hoog vetgehalte ook voldoende gehomogeniseerd zouden zijn, werd de standaard homogenisatietijd voor verdere proeven vastgesteld op 5 minuten. Dit komt overeen met 2760 joule voor de homogenisatie van één ml rauwe melk. Gelijkaardige resultaten werden gevonden door Ertugay et al. (2004) en Wu et al. (2001). Ultrasone homogenisatie kan ook gemakkelijk toegepast worden op een doorstroomsysteem. Dit maakt deze techniek geschikt voor homogenisatie van rauwe melk in een „by-pass‟, eventueel gevolgd door spectroscopische analyse. De werkelijke homogenisatie efficiëntie kan enkel bepaald worden indien de gemiddelde diameter van de vetglobules gekend is voor en na homogenisatie. Dit kan eventueel via beeldanalyse van de microscopische afbeeldingen of via „laser light scattering‟.

72

8 µATR-FTIR spectroscopie voor predictie van melksamenstelling Vergelijking tussen rauwe en gehomogeniseerde melk 8.1 Inleiding Zoals blijkt uit paragraaf 4.2 wordt er voor de bepaling van de melksamenstelling in het laboratorium meestal gebruik gemaakt van transmissie-FTIR spectroscopie. Deze staalpresentatie is niet geschikt voor online opvolgen van de melksamenstelling omwille van de extra staalvoorbereiding en het gebruik van zeer dunne cuvetten (37 µm) die met behulp van hoge druk gevuld worden. ATR-FTIR spectroscopie vraagt amper staalvoorbereiding en het ATR accessoire kan in de melkleiding gemonteerd worden waardoor het mogelijk wel geschikt is voor deze toepassing. Door het beperkt aantal publicaties is nog onvoldoende duidelijk of ATR-FTIR spectroscopie kan gebruikt worden voor de samenstellingsbepaling van rauwe melk. In onderzoeken van Iñón et al. (2004) en Linker en Etzion (2009) werd deze techniek gebruikt voor de bepaling van de samenstelling van respectievelijk commerciële (gehomogeniseerde) en rauwe melkstalen. De gunstige resultaten die gevonden werden voor de commerciële melkstalen en de ongunstige resultaten voor rauwe melkstalen suggereren dat homogenisatie noodzakelijk is voor een adequate detectie. Mogelijke oorzaken zijn de diameters van de vetglobules in de rauwe melk die meestal veel groter zijn dan de penetratiediepte (0.4 – 1.5 μm) van de infrarode straling, en de vorming van een soort biofilm uit vet aan het ATR-oppervlak. Toch werd er nog geen vergelijking gepubliceerd tussen het gebruik van gehomogeniseerde en rauwe melkstalen voor de bepaling van de samenstelling met ATR-FTIR spectroscopie. Dit onderzoek tracht deze vergelijking op een objectieve manier te maken. Daarom werden rauwe melkstalen verzameld, waarvan elk melkstaal in twee gesplitst werd om dan één helft te homogeniseren. Analyse van de rauwe en de gehomogeniseerde versie van hetzelfde melkstaal maakt deze objectieve vergelijking mogelijk. Het effect van de homogenisatie, de verschillende spectra voorbehandelingstechnieken en variabelenselectiemethodes op de predictie van de multivariabele modellen werd nagegaan.

8.2 Materiaal en methode 8.2.1 Melkstalen De melkstalen gebruikt voor kalibratie en validatie in deze studie werden genomen in het kader van melkproductieregistratie (MPR), een dienst georganiseerd door de Coöperatie Rundveeverbetering (CRV Holding BV) in samenwerking met MCC-Vlaanderen, waarbij melkveehouders zich kunnen aansluiten om de individuele productie van hun melkvee op te volgen. Vier wekelijks wordt er van elk individueel dier een representatief melkstaal (ongeveer 27 ml) genomen en geanalyseerd op vet-, eiwit-, en lactosegehalte conform ISO 9622:2000 (ISO, 2000). Bijkomend kan ook het ureumgehalte en het gehalte aan somatisch cellen bepaald worden. De analyse op samenstelling (vet, eiwit, lactose en ureum) gebeurt met behulp van de Milkoscan FT+ (paragraaf 4.2.1). Aan de melkstalen wordt een conserveringsmiddel toegevoegd (0.11 volume% bewaarmiddel, Qlip, Leusden, Nederland) omdat het tot 3 dagen na staalname kan duren vooraleer de stalen geanalyseerd worden. Tussen de individuele MPR-melkstalen is er een zeer grote variatie met enerzijds een variatie tussen de verschillende melkveebedrijven en dus management, voederstrategie, diergenetica, … en anderzijds een grote variatie in concentratie van de verschillende melkcomponenten die we willen voorspellen. Deze variatie is belangrijk voor het opstellen van een nauwkeurig en robuust predictiemodel. 73

In de periode van 22 februari tot 31 maart 2010 werden wekelijks 20 MPR-melkstalen geselecteerd uit een reeks van 100 die het volledige bereik van de verschillende componenten (minima, maxima, gemiddelde) dekten. Dit gebeurde direct na de referentieanalyses. Homogenisatie en µATR-FTIR analyse werd uitgevoerd in reeksen van 10 melkstalen, verspreid over de 2 dagen direct na de referentieanalyse (1 reeks per dag, 2 reeksen per week) zodat er geen kans was op afbraak van de melkcomponenten door bacteriële groei. Bij „cross‟validatie werd er steeds een volledige reeks uit de kalibratieset gelaten om het effect van behandeling, bedrijf en dag uit het kalibratiemodel te sluiten. Iedere behandeling (homogenisatie en analyse) gebeurde namelijk in reeksen van 10 melkstalen, binnen een reeks konden melkstalen aanwezig zijn van eenzelfde melkveebedrijf en de analyse van een reeks was gekoppeld aan een bepaalde dag. Bij de „cross‟-validatie werden dus de stalen van een bepaalde reeks niet gebruikt voor het opstellen van het kalibratiemodel en vervolgens de predictie van de samenstelling voor een staal uit diezelfde reeks. In totaal werden 120 melkstalen verzameld die afkomstig waren van 120 verschillende melkkoeien van 20 verschillende melkveebedrijven verspreid over heel Vlaanderen. Hieruit werden 80 melkstalen (8 reeksen) geselecteerd voor het opstellen van een kalibratiemodel, terwijl de overige 40 melkstalen (4 reeksen) gebruikt werden als onafhankelijke testset voor de bepaling van de werkelijke predictienauwkeurigheid van het model. De kalibratie- en testset werden geselecteerd uit de totale steekproef van 120 stalen via het duplex algoritme (Snee, 1977). Omdat een reeks volledig in de testset of volledig in de kalibratieset moest zitten voor het uitsluiten van behandelings-, bedrijfs- en dageffect, werd er bij de selectie gewerkt met de gemiddelde samenstelling van de stalen binnen die bepaalde reeks. Het algoritme bepaalde de euclidische afstand tussen de verschillende reeksen en ging op basis daarvan de reeksen verdelen over de test- en kalibratieset waarbij beide sets ongeveer dezelfde samenstellingsregio bestreken met vergelijkbare statistische eigenschappen. Deze statistische eigenschappen van de geselecteerde kalibratie- en testset zijn te vinden in respectievelijk Tabel 8.1 en Tabel 8.2. Van de 120 oorspronkelijke melkstalen werd elk staal voor de helft gehomogeniseerd. Voor elk van die 240 substalen (rauw en gehomogeniseerd) werden 3 replica‟s geanalyseerd met behulp van µATR-FTIR spectroscopie (720 analyses in totaal). Binnen een reeks werden alle substalen en replica‟s van substalen random door elkaar geanalyseerd. 8.2.2 Homogenisatie Vóór de splitsing van de 120 melkstalen in 240 substalen werden de stalen opgewarmd tot 37 ± 1°C en omgeroerd om zo een homogene emulsie te bekomen. Van ieder melkstaal werd vervolgens 10 ml apart in een plastiek bekertje (polypropyleen, 28 mm Ø en 68 mm hoog) gebracht. Deze 10 ml stalen werden vervolgens gehomogeniseerd volgens de procedure beschreven in hoofdstuk I. 8.2.3 µATR-FTIR spectroscopie ATR-FTIR spectroscopie van rauwe en gehomogeniseerde melk werd opgemeten met behulp van de Bruker Tensor 27 (Bruker, Karlsruhe, Duitsland). Deze was uitgerust met een MIR bron (4000 tot 400 cm-1), een interferometer met kaliumbromide bundelsplitser, een zeer gevoelige en snelle mercury-cadmium-telluride (MCT) detector gekoeld met vloeibare stikstof en een drie-reflectie diamant PIKE MIRacle ATR accessoire (Pike Technologies, Madison, Wisconsin, USA). Het IR licht gaat via de interferometer naar het ATR-kristal met het melkstaal en vervolgens naar de detector. In het ATR accessoire komt het licht eerst door 74

de zinkselenidebasis (optische focus) die de straal naar het 0.5 mm dunne diamantkristal (6 mm diameter) stuurt. Via een smalle reflectiestrip tussen het diamantkristal en de zinkselenidebasis wordt de IR straal 3 keer intern gereflecteerd. Ter hoogte van de reflectie aan het raakvak staal-diamant ontstaat er een uitdovende golf die geabsorbeerd kan worden door het staal (Figuur 8.1).

Figuur 8.1 Schematische tekening van IR- straal transport doorheen het zinkselenide/diamant kristal en een foto van het PIKE MIRacle ATR accessoire (PIKE Technologies, 2009).

Het diamantkristal is zeer hard en bijgevolg gemakkelijk schoon te maken, anderzijds is het ook chemisch inert voor zure en basische stoffen. Door het kleine diamantoppervlak is er slechts 1 druppel (50 µl) melkstaal nodig voor analyse. Diamant absorbeert sterk onder de 700 cm-1 waardoor geen data gecollecteerd wordt beneden dit golfgetal. Het ATR kristal is omgeven door een metalen behuizing en de temperatuur ervan wordt niet gestuurd of gecontroleerd. Bijgevolg koelt het ATR-kristal een melkdruppel van 40°C zeer snel af tot op kamertemperatuur. Absorptie van MIR straling is zeer sterk afhankelijk van de temperatuur van het medium, zeker wanneer het medium veel water bevat zoals melk (paragraaf 4.1.4). Om deze temperatuurvariatie uit te schakelen werden de melkstalen voor analyse afgekoeld tot kamertemperatuur (22 ± 1°C) en vervolgens goed omgeroerd.

Figuur 8.2 Bruker Tensor 27 met het PIKE MIRacle ATR accessoire.

Uit een korte test bleek dat de spectra van de melkstalen best opgemeten werden bij een meetresolutie van 4 cm-1. Een hogere meetresolutie (2 cm-1) veroorzaakte meer ruis op de data en nam meer tijd in beslag. Een lagere meetresolutie (8 cm-1) kon er eventueel voor zorgen dat bepaalde absorptiepieken minder goed zichtbaar werden. De gebruikte meetresolutie stemt overeen met bevindingen in andere onderzoeken (Iñón et al., 2004; Linker & Etzion, 2009). Omdat de MCT detector zeer snel werkt, werd het aantal scans ingesteld op 128 om zo de signaal op ruis verhouding te maximaliseren. Dit is het twee- tot viervoud van de instellingen die in de meeste andere onderzoeken gebruikt worden (Iñón et al., 2004; Linker & Etzion, 2009). Voor elke analyse werd een achtergrondscan genomen van het lege kristal (lucht), 75

waardoor controle op zuiverheid mogelijk was. Daarna werd een druppel (50 µl) melk op het ATR accessoire aangebracht zodat het volledige diamantkristal bedekt werd. De 128 FTIR spectra werden vervolgens opgemeten (± 40 s.) en het gemiddelde spectrum werd verder gebruikt. De OPUS software (Versie 6.5, Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Duitsland) zorgde automatisch voor de Fourier transformatie naar een absorbantiespectrum en de subtractie van de achtergrondscan. Na analyse werd het melkstaal opgezogen met een absorberend papier en het kristal schoongemaakt en gedroogd met respectievelijk gedeïoniseerd water en een zacht doekje. Na elke reeks melkstalen werd op dezelfde werkwijze het absorbantiespectrum van gedeïoniseerd water opgemeten. 8.2.4 Statistische analyse van de spectrale data De gemeten absorbantiespectra (4000 – 700 cm-1) werden samen met de referentieanalyses voor vet, ruw eiwit, lactose, ureum en SCC geëxporteerd als MAT-file voor statistische verwerking met de PLS toolbox 5.5 (Eigenvector Technologies, Washington, USA) in Matlab 7.9 (The MathWorks Inc., Massachusetts, USA). Het deel van de spectra tussen 2405 en 1915 cm-1 bevatte geen informatie over de melkcomponenten en werd verwijderd (Figuur 8.3) omwille van sterke absorptie door CO2 (2380 – 2300 cm-1) en het diamantkristal (2200 – 1950 cm-1). Het uiteindelijke doel van deze proef is de objectieve vergelijking tussen het gebruik van gehomogeniseerde en rauwe melkstalen voor de bepaling van de melksamenstelling met behulp van µATR-FTIR spectroscopie, en meer specifiek, hun effect op de predictienauwkeurigheid voor de verschillende melkcomponenten. Daarnaast bevat melk ook veel water waardoor sommige onderzoekers voorstellen om het absorbantiespectrum van water af te trekken van dat van melk zodat de absorptiebanden voor de individuele melkcomponenten beter zichtbaar worden (Iñón et al., 2004). In dit onderzoek werd ook het effect van deze watersubtractie nagegaan. De predictienauwkeurigheid van de modellen gebaseerd op de ruwe spectra (geen watersubtractie), de spectra na subtractie van het reeksspecifieke waterspectrum en de spectra na subtractie van het gemiddelde waterspectrum (van de verschillende reeksen) werden met elkaar vergeleken. Dit resulteerde in een tweefactor design (behandeling van de melkstalen en type watersubtractie) met respectievelijk twee en drie groepen en dus 6 verschillende combinaties. Per combinatie werd de spectravoorbehandeling, de variabeleselectie en het aantal geselecteerde latente variabelen voor de predictiemodellen van iedere melkcomponent afzonderlijk geoptimaliseerd. De beste spectravoorbehandeling (paragraaf 3.5.1) voor de predictie van iedere melkcomponent afzonderlijk werd empirisch bepaald aan de hand van de predictienauwkeurigheid van de modellen gebouwd met deze voorbehandelde spectra. De spectravoorbehandeling was een combinatie van al dan niet een verstrooiingscorrectie (basislijncorrectie, MSC, SNV, 1e en 2e orde Savitzky-Golay afgeleide), wel of geen orthogonaal signaal correctie (OSC) gevolgd door „mean-centering‟. De Savitzky-Golay afgeleide (SG1D of SG2D) werd genomen van tweede orde polynomische functies die gefit werden aan intervallen van de spectra. Verschillende bereiken van deze intervallen vanaf 6 tot 62 cm-1 in stappen van 8 cm-1 werden onderzocht. Per combinatie werd met behulp van PLS1 een predictiemodel gebouwd dat de relatie legde tussen de voorbehandelde spectra (xvariabele) en een bepaalde component (y-variabele). Via „cross‟-validatie (paragraaf 3.5.6.1), waarbij telkens een volledige reeks verwijderd werd uit de kalibratieset, werd een schatting van de predictienauwkeurigheid voor nieuwe stalen bekomen. Het aantal latente variabelen (tussen 1 en 20) waarbij de cumulatieve predictiefout minimaal was tijdens „cross‟-validatie werd geselecteerd, tenzij er bij een lager aantal latente variabelen een significant gelijke 76

predictiefout optrad (Haaland & Thomas, 1988). De beste spectravoorbehandeling was diegene waarbij het PLS-model de laagste RMSECV opleverde. Indien er echter spectravoorbehandelingen waren waarbij het model significant (p ≤ 0.05) niet slechter presteerde volgens een gepaarde t-test van de absolute predictiefouten per melkstaal in „cross‟-validatie, werd hiervan diegene geselecteerd met het laagste aantal latente variabelen. Vervolgens werden een aantal variabele selectiemethodes (paragraaf 3.5.2) getest om na te gaan of het verwijderen van bepaalde x-variabelen (na toepassen van de „beste‟ spectravoorbehandeling) een verbetering gaf in robuustheid van het model (lager aantal latente variabelen) of in de predictienauwkeurigheid (lagere RMSECV). In tegenstelling tot „variable importance in projection‟ (VIP), werd er bij „forward-‟ (FiPLS) en „reverse interval partial least squares‟ (RiPLS) en genetische algoritmes (GenAl) geen individuele x-variabelen geselecteerd, maar intervalen van 30 cm-1. Voor de andere methodeparameters werden de standaardinstellingen van de PLS toolbox gebruikt. Elk van de vier variabele selectiemethodes gaf aan welke x-variabelen het belangrijkste waren. De vier predictiemodellen gebaseerd op deze geselecteerde variabelen werden met elkaar en met het model zonder variabele selectie vergeleken. De geselecteerde variabelen die leidde tot het predictiemodel met het laagste aantal latente variabelen, maar dat significant (p ≤ 0.05) niet te onderscheiden was van het beste model (laagste RMSECV), werd gebruikt bij verdere berekeningen. De vergelijking was gebaseerd op een gepaarde t-test van de absolute predictiefouten in „cross‟-validatie. Met behulp van een „three-way‟ ANOVA test van de absolute predictiefouten voor de melkstalen in de onafhankelijke testset werd het effect van „behandeling‟ en „watersubtractie‟, respectievelijk factor één en twee, nagegaan. De 120 melkstalen werden opgenomen als derde factor waardoor deze test gepaard werd (Cederkvist et al., 2005). Indien er een interactie aanwezig was (p ≤ 0.05) tussen de twee eerste factoren werden de (zes) verschillende combinaties onderling vergeleken. Bij afwezigheid van interactie kon worden nagegaan of de twee factoren afzonderlijk een effect hadden. Indien er een significant (p ≤ 0.05) effect aanwezig was werden de verschillende groepen binnen deze afzonderlijke factor onderling vergeleken. Deze onderlinge vergelijkingen gebeurde met behulp van de Tukey HSD multipele vergelijking.

8.3 Resultaten 8.3.1 HATR-FTIR spectroscopie In eerste instantie was het de bedoeling om de melkspectra op te meten met behulp van een AMTIR („amorphous material transmitting infrared radiation‟) horizontaal-ATR (HATR) kristal zoals in eerder onderzoek van Iñón et al. (2004) en Linker en Etzion (2009). De MIR straling wordt hierbij 9 keer intern gereflecteerd in het kristal en heeft bijgevolg meer interactie met het staal. Hierdoor zou een hogere predictienauwkeurigheid bekomen worden, zeker voor componenten met lage concentraties. Een korte test toonde echter aan dat het zeer moeilijk was om het kristal goed te reinigen. De vetglobules bleven aan het AMTIR oppervlak kleven, zelfs na spoelen met warm water, detergent, ethanol en hexaan. Een mogelijke oorzaak hiervan is de combinatie van vermoedelijk een lipofiel karakter en een poreus oppervlak van het AMTIR glas. Bij het gebruik van het diamanten µATR kristal werden er geen problemen ondervonden bij het schoonmaken.

77

8.3.2 Het bereik van kalibratie- en testset De nauwkeurigheid en robuustheid van het predictiemodel wordt voor een groot deel bepaald door het bereik van de samenstellingswaarden van de kalibratieset die gebruikt wordt om het model te berekenen. De statistisch beschrijvende parameters voor de verschillende componenten van de 80 rauwe melkstalen in de kalibratieset zijn weergegeven in Tabel 8.1. Uit deze tabel kan afgeleid worden dat de gebruikte kalibratieset een zeer groot samenstellingsbereik beschrijft dat overeenkomt met eerdere waarnemingen van individuele melkstalen in de praktijk (Walstra et al., 1999). Tabel 8.1 Statistische parameters voor de samenstelling van de geselecteerde kalibratieset (80 stalen).

Gemiddelde Standaardafwijking Minimum Maximum 4.28 1.05 1.92 6.83 3.44 0.57 2.38 4.83 4.69 0.30 3.54 5.18 206.34 87.79 59 453 5.13 0.69 3.78 6.94 Log10SCC (log10 cellen/ml) Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/l)

Voor de bepaling van de werkelijke predictienauwkeurigheid van een berekend model is een onafhankelijke testset noodzakelijk die representatief is voor de situatie waarin dit model later werkzaam zal zijn. De statistische parameters van de testset zijn weergegeven in Tabel 8.2 en komen vrij goed overeen met deze van de kalibratieset. Dit geeft aan dat selectie van de kalibratie- en testset uit de steekproef van 120 melkstalen op een goede wijze gebeurde. Tabel 8.2 Statistische parameters voor de samenstelling van de geselecteerde testset (40 stalen).

Gemiddelde Standaardafwijking Minimum Maximum 4.28 1.16 1.33 6.72 3.44 0.57 2.61 4.57 4.66 0.36 3.59 5.18 228.30 81.47 72 421 5.18 0.70 4.23 7.10 Log10SCC (log10 cellen/ml) Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/l)

In Tabel 8.3 worden de kwadraten van de regressiecoëfficiënten weergegeven die de relatie tonen tussen de verschillende componenten in melk. In principe was er geen enkele significante correlatie aanwezig. De sterkste correlatie (r2 = 0.34) werd gevonden tussen het melkvet- en melkeiwitgehalte, gebaseerd op hun genetische correlatie (Rosati & Van Vleck, 2002). Daarnaast was er ook een zwakke correlatie (r2 = 0.21) aanwezig tussen het lactosegehalte en het logaritme van het gehalte aan witte bloedcellen in de melk. Deze correlatie is gerelateerd aan het optreden van mastitis (paragraaf 2.7.2). Door de afwezigheid van sterke correlaties is de voorwaarde voor het gebruik van het duplex algoritme voor selectie van kalibratie- en testset voldaan (paragraaf 8.2.1). Anderzijds zal hierdoor het PLS2 algoritme voor het berekenen van de predictiemodellen geen voordelen bieden ten opzichte van PLS1.

78

Tabel 8.3 Kwadraten van de regressiecoëfficiënten tussen de verschillende componenten van 120 rauwe melkstalen.

Component Vet (% w/w) Ruw eiwit (% w/w) Lactose (% w/w) Ureum (mg/100ml) Log10SCC(log10 cellen/ml)

Vet 1.00

Ruw eiwit Lactose 0.34 0.09 1.00 0.19 1.00

Ureum 0.01 0.00 0.00 1.00

Log10SCC 0.01 0.05 0.21 0.00 0.49

8.3.3 ATR spectra In Figuur 8.3 zijn de niet-voorbehandelde spectra van alle replica‟s van de 120 gehomogeniseerd melkstalen weergegeven na subtractie van het gemiddelde waterspectrum. Uit deze ruwe spectra kunnen rechtstreeks een aantal belangrijke absorptiepieken voor de verschillende melkcomponenten afgeleid worden. Ter hoogte van deze absorptiepieken, behalve voor de O=P-O stretch vibratie, is er steeds een zeer sterke correlatie (r ≥ 0.84) aanwezig tussen absorbantie en de concentratie van de overeenkomstige melkcomponent. Lipiden absorberen MIR straling ter hoogte van 1745 (vet A), 2874 (vet B), 1464 (vet C) en 1120 cm-1, dat correspondeert met respectievelijk C=O (carbonyl) stretch-, C-H (alkyl) stretch-, C-H buig- en C-O stretchvibraties. Voor eiwitten zijn er ook een aantal belangrijke absorptiepieken: amide I (80% C=O stretch-, 10% C-N stretch- en 10% N-H buigvibraties), amide II (60% N-H buig- en 40% C-N stretchvibraties) en amide III (30% C-N stretch-, 30% N-H buig-, 10% C=O stretch- en 10% O=C=N buigvibraties) bij respectievelijk 1650, 1548 en 1240 cm-1 (Hui, 2006). Daarnaast was er ook nog een zwakke relatie (r² = 0.22) tussen het eiwitgehalte en absorptie door O=P-O stretch vibraties op 1080 cm-1. Deze fosfaatgroep komt vaak voor in een covalente binding met caseïne (Etzion et al., 2004). De amide I absorptiepiek overlapt zeer sterk met deze van water, toch werd een zeer sterke relatie met het eiwitgehalte gevonden. Water absorbeert naast de regio 1680 – 1600 cm-1 ook zeer sterk tussen 3650 en 3000 cm-1. De absorbantie is hier negatief na watersubtractie en is ook negatief gecorreleerd (r² = 0.4 – 0.5) met het vetgehalte van de melk. De lactose hydroxylgroep (O-H) absorbeert bij 1040 cm-1.

Figuur 8.3 Ruwe absorbantiespectra na watersubtractie voor alle (120) gehomogeniseerde melkstalen.

79

In Figuur 8.4 is het effect van homogenisatie op de absorbantiespecta, gemeten met µATRFTIR spectroscopie, zeer duidelijk merkbaar. De absorbantiespectra voor de rauwe en de gehomogeniseerde versie van twee melkstalen met respectievelijk een laag en een hoog vetgehalte (en ook eiwitgehalte) zijn weergegeven. Het grootste verschil situeert zich op de plaatsen van vetabsorptie (vet A, B, C en 1120 cm-1) met enerzijds een hoge absorptie door de gehomogeniseerde versies en anderzijds amper absorptie bij de rauwe melkstalen. Hierdoor is het verschil tussen rauwe melkstalen met een laag en hoog vetgehalte veel minder duidelijk, zeker ter hoogte van de belangrijke vet A absorptieband. Anderzijds is er bij de rauwe melkstalen ook een zwakkere negatieve correlatie aanwezig tussen het vetgehalte en de waterabsorptieband (3650 en 3000 cm-1). Op de amide I en II absorptiebanden is de absorptie echter groter bij de rauwe melkstalen, in tegenstelling tot de amide III absorptieband. Toch zijn er voor zowel de rauwe als voor de gehomogeniseerde melkstalen duidelijke absorptiepieken voor eiwit aanwezig, in tegenstelling tot de „vetabsorptiepieken‟ bij rauwe melkstalen. Het verschil in amide-absorptie tussen de melkstalen met een laag en een hoog eiwitgehalte bij de gehomogeniseerde stalen is ongeveer gelijk aan ditzelfde verschil bij de rauwe melkstalen. Ter hoogte van de absorptiepiek voor de hydroxylgroep van lactose is er nauwelijks een verschil waarneembaar tussen de gehomogeniseerde en rauwe melkstalen.

Figuur 8.4 Ruwe absorbantiepectra na watersubtractie van twee melkstalen (laag en hoog vetgehalte) voor en na homogenisatie.

Via PCA werden de spectra van alle replica‟s, voor alle substalen (rauwe en gehomogeniseerde) gecomprimeerd tot een aantal PC‟s. De zes eerste PC‟s beschreven samen meer dan 99% van de spectrale variatie. De beste scheiding tussen de spectra van de gehomogeniseerde en de rauwe melkstalen werd bekomen door de vierde PC (4% van spectrale variatie) uit te zetten ten opzichte van de eerste PC (78% van de spectrale variatie) (Figuur 8.5). De eerste en de vierde PC bevatten sterk positieve „loadings‟ voor de twee waterabsorptiebanden en sterk negatieve „loadings‟ voor de vier vetabsorptiebanden. Via deze PCA is er een duidelijke scheiding waar te nemen tussen rauwe en gehomogeniseerde 80

melkstalen. Toch zijn er in de plot een aantal gehomogeniseerde melkstalen aanwezig binnen de zone van de rauwe melkstalen. Van deze „misplaatste‟ gehomogeniseerde melkstalen bevat 70% een zeer laag vetgehalte (< 2.8% w/w) waardoor hun spectrum sterker op dat van rauwe melk lijkt door de lage absorptie ter hoogte van de vetabsorptiebanden.

Figuur 8.5 Scoreplot van de eerste PC ten opzichte van de vierde PC na PCA van de spectrale data van alle replica’s, van alle substalen.

8.3.4 PLS kalibratie Voor iedere combinatie (behandeling x watersubtractie) en melkcomponent afzonderlijk werd de spectravoorbehandeling, variabele selectie en het aantal geselecteerde latente variabelen geoptimaliseerd zoals besproken in materiaal en methode (paragraaf 8.2.4). Voor de predictie van vet, ruw eiwit, lactose en ureum worden de resultaten hiervan weergegeven in respectievelijk Tabel 8.4, Tabel 8.5, Tabel 8.6 en Tabel 8.7. Per combinatie wordt de geselecteerde (beste) spectravoorbehandeling, variabele selectie en aantal latente variabelen weergegeven samen met de predictieresultaten van het PLS model. Dit omvat de „root mean square error‟, determinatiecoëfficiënt en de ratio van predictiefout en standaarddeviatie (RPD) voor zowel „cross‟-validatie als voor de onafhankelijke testset. Binnen een bepaalde tabel zijn de verschillende combinaties gerangschikt van boven naar onder volgens toenemende RMSEP (gemiddelde predictiefout) en vervolgens met elkaar vergeleken via een gepaarde vergelijking van de absolute predictiefouten voor alle melkstalen binnen de onafhankelijke testset („three-way‟ ANOVA). Combinaties die significant (p ≤ 0.05) niet van elkaar te onderscheiden waren, werden aangeduid met eenzelfde subscript bij de RMSEP. Voor de predictie van vet was er geen interactie aanwezig tussen de „behandeling‟ van de melkstalen en de „watersubtractie‟ methode, waardoor het effect van de twee factoren afzonderlijk werd onderzocht. Homogenisatie van de melkstalen zorgde voor een significant (p < 0.001) lagere predictiefout en een RPDP groter dan 6.5. µATR-FTIR spectroscopie van gehomogeniseerde melkstalen is dus uiterst geschikt voor de controle van het vetgehalte (Williams & Norris, 2001). Bij het gebruik van rauwe melkstalen is de predictie voor het vetgehalte ontoereikend. De verschillende manieren van watersubtractie hadden voor de bepaling van het vetgehalte geen significant effect op de predictiefout. Subtractie van het reeksspecifieke waterspectrum bij de gehomogeniseerde melkstalen zorgde wel voor een

81

serieuze stijging van het aantal geselecteerde latente variabelen. Toch bleek het model voldoende robuust voor de predictie van de onafhankelijke testset. Tabel 8.4 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het vetgehalte in melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijkingII tussen de verschillende combinaties op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Behandeling Watersubstractie

Spectra Variabele # LV voorbehandeling selectie

Gehomogeniseerd Geen

Absorbantie SG1D(38,2) OSC

GenAl

1

0.072

0.097

Gehomogeniseerd Specifiek spectrum

Absorbantie SG2D(46,2)

GenAl

13

0.072

Gehomogeniseerd Absorbantie Gemiddeld spectrum SG1D(38,2) OSC

GenAl

4

Rauw Geen

Absorbantie baseline OSC

RiPLS

Rauw Specifiek spectrum

-

Absorbantie OSC

Rauw Gemiddeld spectrum

-

Absorbantie OSC

I II

-

R2CV

R2P

RPDCV

RPDP

0.132a

0.991

0.985

10.305

8.248

0.093

0.134a

0.991

0.985

10.797

8.136

0.070

0.105

0.140a

0.989

0.983

9.531

7.759

2

0.544

0.657

0.876b

0.569

0.350

1.523

1.240

Geen

2

0.637

0.684

0.933b

0.532

0.262

1.462

1.164

VIP

6

0.540

0.661

0.937b

0.564

0.256

1.514

1.159

RMSECI

RMSECVI RMSEPI,II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

Voor de predictie van het ruw eiwitgehalte van melk was er noch interactie tussen de twee eerste factoren, noch een significant effect van één van de factoren afzonderlijk. Alle combinaties leverden een RPDP groter dan 8.5. Bij de modellen voor de predictie van het ruw eiwitgehalte in rauwe melkstalen werden er wel meer latente variabelen geselecteerd. Dit resulteerde niet in een minder robuuste predictie van de melkstalen binnen de onafhankelijke testset. Tabel 8.5 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het ruw eiwitgehalte in melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijking II tussen de verschillende combinaties op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Behandeling Watersubstractie

Spectra voorbehandeling

Gehomogeniseerd Gemiddeld spectrum

Absorbantie SG2D(38,2) OSC

GenAl

3

0.018

0.032

Rauw Gemiddeld spectrum

Absorbantie SG1D(46,2) OSC

GenAl

5

0.032

Gehomogeniseerd Specifiek spectrum

Absorbantie SG2D(38,2) OSC

GenAl

2

Rauw Geen

Absorbantie SG1D(46,2) OSC

GenAl

Gehomogeniseerd Geen

Absorbantie SG2D(38,2) OSC

Rauw Specifiek spectrum

Absorbantie SG1D(54, 2) OSC

I II

Variabele # LV selectie

R2CV

R2P

RPDCV

RPDP

0.052a

0.997

0.991

17.410

10.702

0.039

0.055a

0.995

0.990

13.919

10.095

0.020

0.036

0.055a

0.996

0.990

15.289

10.067

9

0.030

0.041

0.057a

0.994

0.989

13.430

9.741

RiPLS

3

0.015

0.034

0.058a

0.996

0.989

15.979

9.593

GenAl

5

0.036

0.047

0.062a

0.993

0.987

11.643

8.910

RMSECI

RMSECVI RMSEPI,II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

De vergelijking van de verschillende modellen voor de predictie van het lactosegehalte, op basis van de absolute predictiefout voor de melkstalen binnen de onafhankelijke testset, toonde een sterke interactie (p < 0.001) tussen „behandeling‟ en „watersubtractie‟. Er kon dus geen rechtstreekse uitspraak gedaan worden over het effect van iedere factor afzonderlijk. De 82

zes verschillende combinaties werden vervolgens via een multipele vergelijking met elkaar vergeleken. Hieruit bleek dat het gebruik van rauwe melkstalen zorgde voor een significant hogere predictiefout. De spectra van de gehomogeniseerde melkstalen gaven de beste resultaten indien er geen watersubtractie plaatsvond, gevolgd door subtractie van het gemiddelde waterspectrum en uiteindelijk subtractie van het reeksspecifieke waterspectrum. Zowel bij gehomogeniseerde als rauwe melkstalen zorgde subtractie van het reeksspecifieke waterspectrum voor een stijging van het aantal geselecteerde latente variabelen. Bij de lactosebepaling zorgde dit echter wel voor iets minder robuuste modellen. Toch waren alle combinaties zeer geschikt voor controle van het lactosegehalte (RPDP > 5.5). Tabel 8.6 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het lactosegehalte in melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijking II tussen de verschillende combinaties op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Behandeling Watersubstractie

Spectra voorbehandeling

Gehomogeniseerd Geen

Absorbantie baseline OSC

GenAl

5

0.017

Gehomogeniseerd Gemiddeld spectrum

Absorbantie SG1D(38,2) OSC

GenAl

4

Gehomogeniseerd Specifiek spectrum

-

Absorbantie OSC

GenAl

Rauw Gemiddeld spectrum

Absorbantie SG1D(62,2) OSC

Rauw Geen Rauw Specifiek spectrum I II

Variabele # LV selectie

RMSEP

R2CV

R2P

RPDCV

RPDP

0.021

0.041a

0.994

0.988

12.691

8.991

0.014

0.021

0.045b

0.994

0.985

12.742

8.167

9

0.015

0.021

0.058c

0.994

0.975

12.510

6.316

RiPLS

5

0.027

0.034

0.064c

0.984

0.970

7.833

5.750

Absorbantie SG1D(62,2) OSC

RiPLS

5

0.027

0.034

0.064c

0.984

0.970

7.833

5.750

Absorbantie SG1D(62,2) OSC

GenAl

9

0.026

0.033

0.065c

0.984

0.969

7.997

5.676

RMSEC

I

I

RMSECV

I,II

uitgedrukt in % w/w RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

De predictie van het ureumgehalte met behulp van spectroscopie is vaak moeilijker, ook voor transmissie-FTIR spectroscopie, omdat de concentraties veel lager zijn (50 – 450 mg/l). Homogenisatie van de melkstalen bleek hier geen significante verbetering te geven van de predictie. De watersubtractie-methode had wel een significant (p < 0.01) effect. Indien er gewerkt werd met de spectra zonder watersubtractie of na subtractie van het gemiddelde waterspectrum werden betere resultaten bekomen dan na subtractie van het reeksspecifiek waterspectrum. Deze eerste twee watersubtractie-methodes leverden predictiemodellen met een RPDP groter dan 2.5 wat voldoende is voor een ruwe schatting van het ureumgehalte in melk.

83

Tabel 8.7 De prestaties van de beste modellen voor de predictie van het ureumgehalte in melk na selectie van beste spectravoorbehandeling en variabeleselectie, en multipele vergelijking II tussen de verschillende combinaties op basis van de absolute predictiefout voor een onafhankelijke testset. Behandeling Watersubstractie

Spectra Variabele # LV voorbehandeling selectie

Gehomogeniseerd Geen

Absorbantie SG1D(30,2) OSC

GenAl

8

15.375

31.662

26.831a

0.863

Rauw Geen

Absorbantie SG1D(30,2) OSC

GenAl

5

20.833

39.331

26.864a

Gehomogeniseerd Absorbantie Gemiddeld spectrum SG1D(30,2) OSC

GenAl

8

15.824

28.371

Rauw Absorbantie Gemiddeld spectrum SG1D(30,2) OSC

GenAl

7

16.846

Gehomogeniseerd Specifiek spectrum

Absorbantie SG2D(46,2) OSC

RiPLS

8

Rauw Specifiek spectrum

Absorbantie SG1D(62,2) OSC

GenAl

5

I II

RMSECI

RMSECVI RMSEPI,II

2

2

RPDCV

RPDP

0.868

2.700

2.750

0.788

0.867

2.173

2.747

28.541a

0.890

0.850

3.013

2.586

37.076

28.675a

0.812

0.849

2.306

2.573

9.405

28.376

33.531b

0.890

0.794

3.013

2.201

22.015

33.456

42.856b

0.847

0.663

2.555

1.722

R

CV

R

P

uitgedrukt in mg/l RMSEP's met verschillende subscripts verschillen significant (p ≤ 0.05) van elkaar op basis van de Tukey HSD multipele vergelijking.

Voor de bepaling van het gehalte aan somatische cellen bleek µATR-FTIR spectroscopie ontoereikend. Bij het opstellen van modellen voor de verschillende combinaties was de determinatiecoëfficiënt voor respectievelijk „cross‟-validatie en de onafhankelijke testset steeds lager dan 0.50 en 0.25. De beste spectravoorbehandeling voor de µATR absorbantiespectra, na al dan niet een watersubtractie, blijkt in de meeste gevallen een Savitzky-Golay afgeleide (eerste en tweede orde voor verschillende intervallen) gevolgd door een orthogonaal signaal correctie. Deze OSC is in principe een extra latente variabele waardoor in bovenstaande tabellen het aantal latente variabelen (#LV) vermeerderd moet worden met 1. Zowel voor spectra van gehomogeniseerde als rauwe melkstalen zorgt watersubtractie (gemiddeld of reeksspecifiek waterspectrum) niet voor een significant beter predictie van de verschillende melkcomponenten. De spreidingsdiagrammen van de predictiewaarden versus de referentiewaarden voor zowel „cross‟-validatie (blauwe bolletjes) als voor de onafhankelijke testset (groene kruisjes), gebaseerd op spectra (zonder watersubtractie) van de gehomogeniseerde (links) en de rauwe (rechts) melkstalen zijn weergegeven voor vet, ruw eiwit, lactose en ureum in Figuur 8.6. Zowel voor „cross‟-validatie, als voor de onafhankelijke testset is de lineaire relatie tussen de voorspelde gehaltes en de referentiegehaltes zeer duidelijk. Voor de predictie van vet is het significant verschil tussen het gebruik van gehomogeniseerde en rauwe melkstalen opvallend, in tegenstelling tot het significant verschil bij lactosepredictie. Op basis van de onafhankelijke testset blijkt homogenisatie echter niet noodzakelijk voor de bepaling van het ruw eiwit- en ureumgehalte in de melk. Toch werd er voor de predictie van ureum in rauwe melk ten opzichte van gehomogeniseerde melk een grotere predictiefout gevonden tijdens „cross‟validatie. Aan de hand van deze spreidingsdiagrammen valt ook op te merken dat de testset en kalibratieset representatief lijken voor de totale steekproef van de gebruikte rauwe melkstalen.

84

Figuur 8.6 De spreidingsdiagrammen voor ‘cross’-validatie (blauwe bolletjes) en de onafhankelijke testset (groene kruisjes) voor vet, ruw eiwit, lactose en ureum gebaseerd op gehomogeniseerde (links) en rauwe (rechts) melkstalen.

85

8.4 Discussie Linker en Etzion (2009) onderzochten reeds het gebruik van HATR-FTIR spectroscopie voor de bepaling van het vet- en ruw eiwitgehalte in rauwe melk. Ze bekwamen ongunstige resultaten (RMSEP > 0.74) voor de predictie van het vetgehalte en schreven dat toe aan de beperkte penetratiediepte van de MIR straling waardoor deze techniek extra gevoelig is voor de vorming van een biofilm van vet op het oppervlak van het ATR-kristal. De absorbantiespectra die zij bekwamen waren zeer gelijkaardig aan de spectra voor de rauwe melkstalen in deze studie, maar met een minder uitgesproken absorbantie voor de specifieke vetabsorptiebanden (Figuur 8.7). Bij de vergelijking in deze studie tussen de spectra van gehomogeniseerde en rauwe melkstalen (Figuur 8.4) is er duidelijk een lagere absorbantie ter hoogte van de vetabsorptiebanden en een hogere waterabsorptie voor de rauwe melkstalen. Indien er bij gebruik van rauwe melkstalen een biofilm van vet afgezet werd op het oppervlak van het diamanten µATR-kristal zou er net verwacht worden dat de absorbantie toeneemt voor die specifieke vetabsorptiebanden. Het feit dat de vetabsorptiebanden in de spectra van Linker en Etzion (2009) nog lager zijn dan die in de spectra van rauwe melkstalen voor dit onderzoek (Figuur 8.7) toont aan dat hetzelfde fenomeen bij hen voorkwam, ongeacht het gebruik van een ander ATR-kristal (ZnSe). Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is de verhoogde reflectie van de MIR straling door de grotere vetglobules in de rauwe melk, waardoor er minder interactie was met de melkcomponenten zelf. Dit verklaart echter niet de verhoogde waterabsorptie, en onveranderde lactoseabsorptie. Een andere verklaring is een mogelijk lipofoob karakter van het ATR-kristal in combinatie met het opromen van de melk tijdens de meting, waardoor er minder vetglobules aanwezig zijn in het meetbereik (0.4 tot 1.5 µm van het ATR-oppervlak). Dit laatste strookt echter niet met de praktische bevindingen van Linker en Etzion, ook zij hadden moeilijkheden om het kristaloppervlak proper te krijgen na analyse van rauwe melkstalen. Net zoals Linker en Etzion (2009) werden in dit onderzoek ontoereikende resultaten gevonden voor de predictie van het vetgehalte aan de hand van rauwe melkstalen (RPDP < 1.5). De oorzaak van de slechte PLS modellering is waarschijnlijk de beperkte absorptie ter hoogte van de vetabsorptiebanden, zelfs voor rauwe melkstalen met een hoog vetgehalte. Het verschil tussen de spectra van rauwe melkstalen met een hoog en laag vetgehalte is daardoor zeer beperkt, zeker ter hoogte van de belangrijke absorptieband vet A (Figuur 8.4). De oorzaak hiervan is echter nog onbekend. In de absorptieregio‟s voor amide I en II was er verhoogde absorptie bij rauwe melkstalen ten opzichte van gehomogeniseerde melkstalen, terwijl er een tegengesteld fenomeen werd waargenomen voor de amide III absorptieband. Anderzijds was er ook een verhoogde waterabsorptie in de regio 3650 en 3000 cm-1 (Figuur 8.4). Water absorbeert naast deze regio ook in de regio 1550 tot 1650 cm-1 die sterk overlapt met de absorptiebanden voor amide I en II. De verhoogde absorbantie ter hoogte van de absorptiebanden voor amide I en II bij rauwe melkstalen zal dus eerder te wijten zijn aan een verhoogde waterabsorptie in die regio, dan aan verhoogde absorptie door eiwitten. Een speciale watersubtractiemethode toegepast op de spectra van de rauwe melkstalen zoals voorgesteld door Rahmelow en Hübner (1997) zou een betere interpretatie geven van de werkelijke MIR-absorptie door de eiwitten. Deze watersubtractietechniek bleek echter niet noodzakelijk voor de zeer goede predictie van het eiwitgehalte bij gebruik van rauwe melkstalen (RPDP > 8.5). De in dit onderzoek bekomen predictienauwkeurigheid is veel beter dan de eiwitpredictie voor rauwe melkstalen door Etzion et al. (2004) (RMSEP = 0.22).

86

Figuur 8.7 Bovenaan: typische absorbantiespectra voor 2 rauwe melkstalen gevonden door Linker en Etzion (2009); onderaan: absorbantiespectra zonder watersubtractie voor alle replica’s van alle rauwe melkstalen.

Resultaten voor lactose- en ureumpredictie aan de hand van ATR-FTIR spectra van rauwe melkstalen werden niet teruggevonden in de literatuur. Zeer goede resultaten werden bekomen voor de bepaling van het lactosegehalte bij rauwe melkstalen (RPDP > 5.5), maar homogenisatie zorgde (behalve bij subtractie van het reeksspecifiek waterspectrum) toch voor een significant betere predictie (RPDP > 6). Deze homogenisatiestap is echter niet noodzakelijk voor een voldoende nauwkeurige detectie.

87

Voor de predictie van het vet-, ruw eiwit-, lactose- en ureumgehalte in gehomogeniseerde melkstalen werden zeer goede resultaten bekomen die zeer dicht lagen bij de nauwkeurigheid van de referentieanalyse (paragraaf 6.3.1). De resultaten waren beter dan diegene uit eerder onderzoek waarbij de samenstelling van gehomogeniseerde (commerciële) melkstalen werd bepaald met behulp van ATR-FTIR spectroscopie (Iñón et al., 2004). Hun minder goede resultaten (RMSEP voor bepaling van vet, ruw eiwit en koolhydraten respectievelijk 0.29, 0.1 en 0.32) zijn waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van verschillende commerciële melkproducten (volle, halfvolle en magere melk, verrijkte melk en vruchtenmelk). Subtractie van het (gemiddelde of reeksspecifieke) waterspectrum zorgde niet voor een significante verbetering van de verschillende predictiemodellen. Subtractie van het reeksspecifiek waterspectrum zorgde zelfs in veel gevallen voor een stijging van het aantal geselecteerde latente variabelen en in het geval van ureum voor een significant hogere predictiefout. Dit is te verklaren door de aanwezigheid van belangrijke ureumabsorptiebanden (hoge regressiecoëfficiënten) in de regio‟s van waterabsorptie (1650 – 1550 cm-1 en 3650 – 3000 cm-1). Zo absorbeert ureum via de N-H symmetrische en asymmetrische stretchvibraties bij respectievelijk 3300 en 3400 cm-1 en de amide I en II vibraties bij respectievelijk 1650 en 1548 cm-1. Voor de predictie van de verschillende melkcomponenten wordt er dus best geen dergelijke watersubtractie toegepast. Tijdens de voorbereiding en analyse van de verschillende melkstalen waren er een aantal manuele stappen die mogelijk aanleiding gaven tot onnauwkeurigheden zoals de scheiding van de submelkstalen voor homogenisatie of de homogenisatie zelf. Na homogenisatie werden alle melkstalen afgekoeld tot kamertemperatuur om temperatuursvariaties tijdens de FTIR-analyse te vermijden. Toch waren er wellicht temperatuursvariaties tussen de verschillende replica‟s en substalen. Anderzijds werd de vetfractie minder oplosbaar bij het afkoelen van de melk. Hierdoor was het moeilijk om een druppel melk (50 µl) te nemen voor µATR-analyse die representatief was voor het volledige substaal (10 ml), zeker voor rauwe melkstalen. Mogelijkerwijs worden er nog betere resultaten bekomen, voornamelijk voor vetbepaling in rauwe melk, indien er gewerkt wordt met een doorstroomsysteem dat de melk constant op 37°C houdt, al dan niet gecombineerd met een doorstroom ultrasone homogenisator.

8.5 Besluit µATR-FTIR spectroscopie is zeer geschikt voor de bepaling van het ruw eiwit-, lactose en ureumgehalte in rauwe melk. Voor een betrouwbare predictie van het vetgehalte is homogenisatie van de melkstalen evenwel noodzakelijk. De slechte predictie van het vetgehalte voor rauwe melkstalen wordt hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door de vetglobulediameter die voor de meeste vetglobules in rauwe melk groter is dan de penetratiediepte van de MIR straling bij het gebruik van een ATR-kristal. Anderzijds speelt de interactie van de vetglobules met het ATR-kristal ook een belangrijke rol, maar deze is momenteel nog onvoldoende begrepen. Verder onderzoek hieromtrent is aangewezen.

88

IV.

Algemeen besluit

Vis/NIR reflectantiespectroscopie met een golflengtebereik van 400 tot 1700 nm is zeer geschikt voor de online-detectie van het vet- en ruw eiwitgehalte in rauwe melk. Bij het gebruik van Vis/NIR transmittantiespectroscopie kan daarnaast ook het lactosegehalte behoorlijk voorspeld worden. Het nadeel van deze laatste meetopstelling is de noodzaak van een zeer dunne cuvette (1 mm) voor voldoende transmittantie van het signaal bij hogere golflengtes, wat moeilijk te combineren is met een online-meetsysteem. Een µATR-accessoire kan zonder al te veel moeilijkheden ingebouwd worden in de melkleiding voor online-detectie van de melksamenstelling. Deze techniek blijkt uit deze studie zeer geschikt voor de detectie van gehaltes aan ruw eiwit, lactose en ureum in rauwe melk. Voor een adequate detectie van het vetgehalte is homogenisatie echter noodzakelijk. Deze laatste blijkt echter moeilijk combineerbaar met online-metingen in de melkleiding. Op basis van de twee onderzoeken in deze thesis geeft het gebruik van Vis/NIR reflectantiespectroscopie in combinatie met µATR-FTIR spectroscopie de beste predictie voor de samenstelling van rauwe melkstalen. µATR-FTIR spectroscopie maakt de detectie van ruw eiwit, lactose, ureum en eventueel ook andere micronutriënten mogelijk, terwijl Vis/NIR reflectantiespectroscopie een zeer nauwkeurige detectie van het vetgehalte in rauwe melk toelaat. Deze laatste maakt homogenisatie overbodig, waardoor beide meetconfiguraties te gebruiken zijn voor online-metingen. Reflectantie en µATR kan echter rechtstreeks gemeten worden op rauwe melk die doorheen de melkleiding stroomt, zonder de melkstroom te beïnvloeden.

89

V.

Toekomstperspectieven

Reflectantiespectroscopie kan gemakkelijk gebruikt worden voor online-toepassingen. In principe moet de melk enkel doorheen een buis stromen die doorlaatbaar is voor visuele en nabij-infrarode straling. Het gereflecteerde licht kan hierdoor opgemeten worden zonder dat de melkstroom beïnvloed wordt, en bijgevolg treden er ook geen ongewenste vacuümfluctuaties op in de melkleiding. Deze techniek is dus uitermate geschikt voor onlinedetectie van het vet- en ruw eiwitgehalte in rauwe melk en kan in de toekomst voor deze toepassing getest worden. Voor adequate tramissiespectroscopie boven 1000 nm moet er gewerkt worden met dunne cuvetten (bv. 1 mm optische padlengte). Via een bypass kan een deel van de melk in de melkleiding doorheen de cuvette gepompt worden. Deze techniek brengt natuurlijk de nodige complicaties met zich mee bij het uitwerken van een online-meetopstelling: de cuvette en bypass moeten gemakkelijk te reinigen zijn, het vacuum in de melkleiding mag niet beïnvloed worden en doorheen de cuvette moet melk passeren die representatief is voor de geproduceerde melk. Toch biedt deze techniek mogelijkheden voor een voldoende nauwkeurige bepaling van het lactosegehalte in rauwe melk, en hiermee een belangrijke parameter voor vroege detectie van mastitis. Verdere testen onder praktijkomstandigheden moeten uitwijzen of deze techniek geschikt is voor de online-bepaling van de melksamenstelling. De transmittantie- (diffuse en gecollimeerde) en diffuse reflectantiespectra kunnen gebruikt worden in combinatie met lichtverstrooiingsmodellen voor het scheiden van fysische (verstrooiing) en chemische eigenschappen (absorptie) van rauwe melk. Zowel vetglobulediameter als de samenstelling van de rauwe melk kan hieruit nauwkeurig worden afgeleid waardoor dit een extra inzicht geeft in de koegezondheid door de sterke impact ervan op het melkvormend weefsel. µATR-FTIR spectroscopie biedt ten opzichte van Vis/NIR spectroscopie ook de mogelijkheid om melkcomponenten die aanwezig zijn in lagere concentraties te detecteren. Naast ureum, zou eventueel ook het gehalte aan specifieke vetzuren, ketonen, calcium en fosfor bepaald kunnen worden, zoals dit reeds mogelijk was voor transmissie-FTIR spectroscopie (Heuer et al., 2001b; Kaylegian et al., 2009; Soyeurt et al., 2009). Verder onderzoek moet hierover uitsluitsel geven.

90

9 Literatuurlijst Albanell, E., Caja, G., Such, X., Rovai, M., Salama, A.A.K., and Casals, R. (2003). Determination of fat, protein, casein, total solids, and somatic cell count in goat's milk by near-infrared reflectance spectroscopy. Journal of AOAC International, 86: 746-752. Ashokkumar, M., Sunartio, D., Kentish, S., Mawson, R., Simons, L., Vilkhu, K., and Versteeg, C. (2008). Modification of Food Ingredients by Ultrasound to Improve Functionality: A Preliminary Study on a Model System. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 9: 155-160. Barabássy, S. (2001). The application of near infrared spectroscopy (NIR) technique for nondestructive investigation of mixed milk powder products. Mljekarstvo, 51: 263-272. Belgische Confederatie van de zuivelindustrie (2009). Jaarverslag 2009: Werkingsjaar 2008. BCZ, Leuven, Belgium. 71p. Bernabucci, U., Lacetera, N., Ronchi, B., and Nardone, A. (2002). Effects of the hot season on milk protein fractions in Holstein cows. Animal Research, 51: 25-33. Blowey, R., and Edmondson, P. (1995). Mastitis control in dairy herds. Farming Press Books, Tonbridge, UK. 196p. Bramley, A.J., Dodd, F.H., Mein, G.A., & Bramley, J.A. (1992). Machine Milking and Lactation. Insight Books, Berkshire, England. 435p. Bruynseels, D. (2008). Het vet- en eiwitgehalte in de melk sturen via het basisrantsoen. Onuitgegeven verhandeling, Katholieke Hogeschool Kempen, Industriële en biowetenschappen, Geel. Bylund, G. (1995). Dairy Processing Handbook. Teknotext AB (Ed.), Tetra Pak Processing Systems AB, Lund, Zweden. 450p. Cannas, A., Pes, A., Mancuso, R., Vodret, B., and Nudda, A. (1998). Effect of dietary energy and protein concentration on the concentration of milk Urea nitrogen in dairy ewes. Journal of Dairy Science, 81: 499-508. Carlsson, J., Bergström, J., and Pehrson, B. (1995). Variations with breed, age, season, yield, stage of lactation and herd in the concentration of urea in bulk milk and individual cow's milk. Acta Veterinaria Scandinavica, 36: 245-254. Caruthers, V.R., Neil, P.G., and Dalley, D.E. (1997). Effect of altering the nonstructural:structural carbohydrate ratio in a pasture diet on milk production and ruminal metabolites in cows in early and late lactation. Journal Animal Scieince, 64: 393-402. Cederkvist, H.R., Aastveit, A.H., and Naes, T. (2005). A comparison of methods for testing differences in predictive ability. Journal of Chemometrics, 19: 500-509. Coulon, J.B., Hurtaud, C., Remond, B., and Verite, R. (1998). Factors contributing to variation in the proportion of casein in cow‟s milk true protein: a review of recent INRA experiments. Journal of Dairy Research, 65: 375-387. Czarnik-Matusewicz, B., Murayama, K., Tsenkova, R., and Ozaki, Y. (1999). Analysis of near-infrared spectra of complicated biological fluids by two-dimensional correlation spectroscopy: Protein and fat concentration-depending spectral changes of milk. Applied Spectroscopy, 53: 1582-1594. Dado, R.G., and Allen, M.S. (1994). Variation in and relationships among feeding, chewing, and drinking variables for lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 77: 132-144. De Brabander, D., and De Campeneere S., (2007). Invloeden op vet- en eiwitgehalte van melk. Melkveebedrijf, 8: 16-17. 91

Delaval. (2009). De uier. Gevonden op 5 maart 2009 op http://du.delaval.nl/Dairy_Knowledge/EfficientMilking/The_Mammary_Gland.htm DePeters, E. J. and J. P. Cant. (1992). Nutritional Factors Influencing the Nitrogen Composition of Bovine Milk: A Review. Journal of Dairy Science, 75: 2043-2070. DePeters, E.J. and Ferguson, J.D. (1992). Nonprotein nitrogen and protein distribution in the milk of cows. Journal of Dairy Science, 75: 3192-3209. De Wilde, R. (2003). Bijzondere dierenvoeding. Onuitgegeven Cursus, Universiteit Gent, Faculteit Dierengeneeskunde. Ertugay, M.F., Şengül, M., and Şengül, M. (2004). Effect of Ultrasound Treatment on Milk Homogenisation and Particle Size Distribution of Fat. Turkish Journal of Veterinairy and Animal Science, 28: 303-308. Etzion, Y., Linker, R., Cogan, U., and Shmulevich, I. (2004). Determination of protein concentration in raw milk by mid-infrared Fourier transform infrared attenuated total reflectance spectroscopy. Journal of Dairy Science, 87: 2779-2788. Fordham, D.P., McCarthy, T.T., and Rowlinson, P. (1987). An evaluation of milk temperature measurement for detecting oestrus in dairy cattle: I. Factors affecting measurement of milk temperature. Veterinary Research Communications, 11: 367-379. FOSS. (2008). Reference manual FOSS Milkoscan FT+. Unpublished, Hillerød, Denmark. Fox, P.F., and McSweeney, P.L.H. (1998). Dairy Chemistry and Biochemistry. Blackie Academic & Professional, an imprint of Chapman & Hall, London, UK. 478p. Fox, P.F., and McSweeney, P.L.H. (2003). Advanced dairy chemistry Volume 1: Proteins, 3rd edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, USA. 1349p. Fox, P.F., and McSweeney, P.L.H. (2006). Advanced Dairy Chemistry Volume 2: Lipids, 3rd edition. Springer, New York, USA. 801p. Fox, P.F., and McSweeney, P.L.H. (2009). Advanced Dairy Chemistry Volume 3: Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 3rd edition. Springer, New York, USA. 778p. Frank, B., and Swensson, C. (2002). Relationship between Content of Crude Protein in Rations for Dairy Cows and Milk Yield, Concentration of Urea in Milk and Ammonia Emissions. Journal of Dairy Science, 85: 1829-1838. Friggens, N.C., Ridder, C. and Lovendahl, P. (2007). On the use of milk composition measures to predict the energy balance of dairy cows. Journal of Dairy Science, 90: 54535467. Grieve, D.G., Korver, S., Rijpkema, Y.S., and Hof, G. (1986). Relationship between milk composition and some nutritional parameters in early lactation. Livestock Production Science, 14: 239-254. Griffiths, P. and de Haseth, J. (2007). Fourier transform infrared spectrometry - second edition. John Wiley and Sons Inc., Hoboken, New Jersey, USA. 529p. Gunasekaran, S. (2001). Nondestructive food evaluation: techniques to analyze properties and quality. M. Dekker, New York, USA. 423p. Haaland, D.M., and Thomas, E.V. (1988). Partial Least-Square Methods for Spectral Analysis. Analytical Chemistry, 60: 1193-1202. Hamann, J., and Krömker, V. (1997). Potential of specific milk composition variables for cow health management. Livestock Production Science, 48: 201-208. Hanigan, M.D., Crompton, L.A., Bequette, B.J., Mills, J.A.N., and France, J. (2002). Modelling mammary metabolism in the dairy cow to predict milk constituent yield, with

92

emphasis on amino acid metabolism and milk protein production: Model evaluation. Journal of Theoretical Biology, 217: 311-330. Heck, J.M.L. (2009). Milk Genomics Opportunities to improve the protein and fatty acid composition in raw milk. PhD thesis, Wageningen University, The Netherlands. Hermansen J.E., Ostersen S., Justesen N.C., and Aaes O. (1999). Effects of dietary protein supply on caseins, whey proteins, proteolysis and renneting properties in milk from cows grazing clover or N-fertilized grass. Journal of Dairy Research, 66: 193-205. Heuer, C., Van Straalen, W.M. Schukken, Y.H. Dirkzwager, A. and Noordhuizen, J.P.T.M. (2001a). Prediction of energy balance in high yielding dairy cows with test-day information. Journal of Dairy Science, 84: 471-481. Heuer, C., Luinge, H.J., Lutz, E.T.G., Schukken Y.H., van der Maas, J.H., Wilmink, H., and Noordhuizen, J.P.T.M. (2001b). Determination of acetone in cow milk by Fourier transform infrared spectroscopy for the detection of subclinical ketosis. Journal of Dairy Science, 84: 575-582. Hortet, P., and Seegers, H. (1998). Loss in milk yield and related composition changes resulting from clinical mastitis in dairy cows. Preventive Veterinary Medicine, 37: 1-20. Hui, Y.H. (2006). Handbook of food science, technology, and engineering, Volume 1, Taylor & Francis group, Florida, USA. 1000p. Hutjens, M.F. and Barmore, J.A. (1995). Milk urea test gives us another tool. Hoard's Dairyman, 25: 401. Iñón, F.A., Garrigues, S., and Guardia, M. (2004). Nutritional parameters of commercially available milk samples by FTIR and chemometric techniques. Analytica Chimica Acta 513: 401-412. ISO. (1999). Milk -- Determination of fat content -- Gravimetric method (Reference method). International Standard ISO 1211:1999. IDF 1D:1996. AOAC 905.02. International Dairy Federation, Brussels, Belgium. ISO. (2000). Whole milk -- Determination of milk fat, protein and lactose content -- Guidance on the operation of mid-infrared instruments. International Standard ISO 9622:2000. IDF 141C:2000. International Dairy Federation, Brussels, Belgium. ISO. (2001). Milk -- Determination of nitrogen content -- Part 1: Kjeldahl method. International Standard ISO 8968-1 / IDF 20-1:2001. AOAC 991.20. International Dairy Federation, Brussels, Belgium. ISO. (2002). Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese -- Determination of lactose content -- Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose. International Standard ISO 5765-2 / IDF 79-2:2002. International Dairy Federation, Brussels, Belgium. ISO. (2004). Milk -- Determination of urea content -- Enzymatic method using difference in pH (Reference method). International Standard ISO 14637 / IDF 195:2004. International Dairy Federation, Brussels, Belgium. Jankovská R., Šustová K. (2003): Analysis of cow milk by near-infrared spectroscopy. Czech Journal of Food Science, 21: 123-128. Jensen, R.G. (2002). The composition of bovine milk lipids: January 1995 to December 2000. Journal of Dairy Science, 85: 295-350. Kawamura. S., Kawasaki, M., Morita, S., Komiya, M., Itoh, K. (2004). On-line Near-infrared Spectroscopic Sensing Techniques for Assessing Milk Quality in Automatic Milking Systems. ASAE Paper No. 043155. Ottawa, Ontario, Canada: ASAE.

93

Kawamura, S., Kawasaki, M., Nakatsuji, H., and Natsuga, M. (2007). Near-infrared spectroscopic sensing system for online monitoring of milk quality during milking. Sensing and Instruments for Food Quality and Safety, 1: 37-43. Kawasaki, M., Kawamura, S., Nakatsuji, H., and Natsuga, M. (2005). Online Real-time Monitoring of Milk Quality during Milking by Near-infrared Spectroscopy. ASAE Paper No. 053045. Tampa, Florida, USA: ASAE. Kawasaki, M., Kawamura, S., Tsukahara, M., Morita, S., Komiya, M., and Natsuga, M. (2008). Near-infrared spectroscopic sensing system for online milk quality assessment in a milking robot. Computers and Electronics in Agriculture, 63: 22-27. Kaylegian, K.E., Lynch, J.M., Fleming, J.R., and Barbano, D.M. (2009). Influence of fatty acid chain length and unsaturation on midinfrared milk analysis. Journal of Dairy Science, 92: 2485-2501. Kennelly, J.J., and Glimm, D.R. (1998). The biological potential to alter the composition of milk. Canadian Journal of Animal Science, 78: 23-56. Kohn, R., Jonker, J., and Erdman, R. (1999). Milk urea nitrogen: theory and practice. Proceedings Of the Maryland Nutrition Conference, Baltimore, Maryland, USA. 83-90p. Kroeker, E.M., Ng-Kwai-Hang, K.F., Hayes, J.F., and Moxley, J.E. (1985). Effects of environmental factors and milk protein polymorphism on composition of casein fraction in bovine milk. Journal of Dairy Science, 68: 1752-1762. Kubelka, P., and Munk, F. (1931). Ein Beitrag zur Optik der Farbanstriche. Zeitschrift für technische Physik, 12: 593-601. Kutner, M.H., Nachtsheim, C.J., Neter, J., and Li, W. (2005). Applied Linear Statistical Models, 5th edition. McGraw-Hill International Edition, New York, USA. 1396p. Laporte, M.F., and Paquin, Q. (1999). Near-infrared analysis of fat, protein, and casein in cow's milk. Journal of agricultural and food chemistry, 47: 2600-2605. Lefebvre, D. (1996). L'urée du lait: un outil de plus à votre disposition. Le Producteur de Lait Québécois, 16: 13-15. Linker, R., and Etzion, Y. (2009). Potential and limitation of mid-infrared attenuated total reflectance spectroscopy for real time analysis of raw milk in milking lines. Journal of Dairy Research, 76: 42-48. Mackle T.R., Bryant A.M., Petch S.F., Hill J.P., and Auldist, M.J. (1999). Nutritional influences on the composition of milk from cows of different protein phenotypes in New Zealand. Journal of Dairy Science, 82: 182-180. MCC-Vlaanderen. (2009). Melkcontrolecentrum-Vlaanderen. Gevonden op 6 september 2009 op http://www.mcc-vlaanderen.be/. Misciatteilli, L., Kristensen, V.F., Vestergaard, M., Welsbjerg, M.R., Sejrsen, K., and Hvelplund, T. (2003). Milk production, nutrient utilization, and endocrine responses to increased postruminal lysine and methionine supply in dairy cows. Journal of Dairy Science, 86: 275-286. Mulligan, F.J., O‟Grady, L., Rice, D.A. and Doherty, M.L. (2006). A herd health approach to dairy cow nutrition and production diseases of the transition cow. Animal Reproduction Science, 96: 331-353. Murray, I., and Cowe, I.A. (1992). Making Light Work: Advances in Near Infrared Spectroscopy, VCH, Weinheim. Germany. 652p. Naes, T., Isaksson, T., Fearn, T., and Davies, T. (2004). A User-friendly Guide to Multivariate Calibration and Classication. NIR publications, Charlton, Chichester, UK. 344p. 94

Navrátilová, P., Hadra, L., Dračková, M., Janštová, B., Vorlová, L., and Pavlata, L. (2006). Use of FT-NIR spectroscopy for bovine colostrum analysis. Acta Veterianaria Brunensis, 75: 57-63. Nielsen, N.I., Larsen, T., Bjerring, M., & Ingvartsen, K.L. (2005). Quarter health, milking interval, and sampling time during milking affect the concentration of milk constituents. Journal of Dairy Science, 83: 3186-3200. Nousiainen, J., Shingfield, K.J., and Huhtanen, P. (2004). Evaluation of milk urea nitrogen as a diagnostic of protein feeding. Journal of Dairy Science, 87: 386-398. O'Callaghan, D.J., O'Donnell, C.P., and Payne, F.A. (2002). Review of systems for monitoring curd setting during cheese making, International Journal of Dairy Technology, 55: 65-74. Ogola, H., Shitandi, A., and Nanua, J. (2007). Effect of mastitis on raw milk compositional quality. Journal of Veterinary Science 8: 237-242 Osborne, B.J. (2000). Near-infrared spectroscopy in food analysis, Encyclopedia of analytical chemistry. John Wiley & Sons Ltd, UK. 200p. Paquin, P. (1999). Technological properties of high pressure homogenizers: the effect of fat globules, milk proteins and polysaccharides. International Dairy Journal, 9: 329-335. Pereira, S.L., Leonard, A.E. and Mukerji, P. (2003). Recent advances in the study of fatty acid desaturases from animals and lower eukaryotes. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, 68: 97-106. Pike Technologies. (2009). Performance and Application Comparisons for Single and Three Reflection Diamond Crystals for the MIRacle ATR Accessory. Gevonden op 22 december 2009 op http://www.piketech.com/technical/application-pdfs/Diamond-Crystal-Plates.pdf Pouliot, M., Paquin, P., Martel, R., Gauthier, S.F., and Pouliot, Y. (1997). Whey changes during processing determined by near infrared spectroscopy. Journal of Food Science, 62: 475-479. Purnomoadi, A., Batajoo, K.K., Ueda, K., and Terada, F. (1999). Infuence of feed source on determination of fat and protein in milk by near-infrared spectroscopy. International Dairy Journal. 9: 447-452. Rahmelow, K., and Hübner, W. (1997). Infrared spectroscopy in aqueous solution: Difficulties and accuracy of water subtraction. Applied Optics, 51: 160–170. Rajčevič, M., Potočnik, K., and Levstek, J. (2003). Correlations between somatic cells count and milk composition with regard to the season. Agriculturae Conspectus Scientificus, 68: 221-226. Rémillard, N., Robin, O., Martel, R., and Paquin, P. (1993). Influence of homogenization efficiency on milk fat content determination by infrared analysis. International Dairy Journal. 3: 197-208. Rosati, A., and Van Vleck, L.D. (2002). Estimation of genetic parameters for milk, fat, protein and mozzarella cheese production for the Italian river buffalo Bubalus bubalis population. Livestock Production Science,74: 185-190. Saeys, W., Mouazen, A.M., and Ramon, H. (2005). Potential for on-site and on-line Analysis of Pig Manure using visual and near-infrared Reflectance Spectroscopy. Biosystems Engineering, 91(4): 393-402. Saeys W. (2006). Technical Tools for the Optimal Use of Animal Manure as a Fertiliser: Online composition measurement and manure injection control. Unpublished Ph.D. thesis, Leuven, Belgium. 215p. 95

Šašić, S., and Ozaki, Y. (2000). Band Assignment of Near-Infrared Spectra of Milk by Use of Partial Least-Squares Regression. Applied Spectroscopy, 54: 1327-1338. Saranwong, S., and Kawano, S. (2008). System design for non-destructive near infrared analyses of chemical components and total aerobic bacteria count of raw milk. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 16: 389-398. Sharma, A.K., Rodriguez, L.A., Wilkox, C.J., Collier, R.J. Bachman, K.G., and Martin, F.G. (1988). Interactions of climatic factors affecting milk yield and composition. Journal of Dairy Science, 71: 819-825. Silanikove N., Shapiro F., and Shinder D. (2009). Acute heat stress brings down milk secretion in dairy cows by up-regulating the activity of the milk-borne negative feedback regulatory system. BMC Physiology, 9: 13. Snee, R.D. (1977). Validation of Regression Models: Methods and Examples. Technometrics, 19: 415-428. Soyeurt, H., Bruwier, D., Romnee, J.M., Gengler, N., Bertozzi, C., Veselko, D., and Dardenne, P. (2009). Potential estimation of major mineral contents in cow milk using mid-infrared spectrometry. Journal of Dairy Science, 92: 2444-2454. Stoop, W.M., Bovenhuis, H., and Arendonk van, J.A.M. (2007). Genetic Parameters for Milk Urea Nitrogen in Relation to Milk Production Traits. Journal of Dairy Science, 90: 19811986. Stuart, B., and Ando, D.J. (1997). Biological Applications of Infrared Spectroscopy, John Wiley & Sons, New York, USA. 520p. Šustová, K., Jankovská, R., Kráčmar, S. (2004). Analysis of basic composition of sheep colostrums by near-infrared spectroscopy. (Prepared for publication). Thiebaud, M., Dumay, E., Picart, L., Guiraud, J.P., and Cheftel, J.C. (2003). High-pressure homogenisation of raw bovine milk. Effects on fat globule size distribution and microbial inactivation, International Dairy Journal 13: 427-439. Thygesen L.G. and Lundqvist L.O. (2000). NIR measurement of moisture content in wood under unstable temperature conditions. Part 2. Handling temperature fluctuations. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 8: 191-199. Todorova D. (1998). Influence of the diet and season alteration on the cow's milk composition and properties. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 4: 525-530. Tsenkova, R., S. Atanassova, K. Toyoda, Y. Ozaki, K. Itoh, and T. Fearn. (1999). Near infrared spectroscopy for dairy measurement: Measurement of unhomogenized milk composition. Journal of Dairy Science, 82: 2344-2352. Tsenkova, R., Atanassova, S., Itoh, K., Ozaki, Y., and Toyoda, K. (2000). Near Infrared Spectroscopy for Biomonitoring: Cow Milk Composition Measurement in a spectral region from 1.100 to 2.400 nanometers. Journal of Animal Science, 78: 515-522 Tsenkova, R., Atanassova, S., Kawano, S., and Toyoda, K. (2001). Somatic cell count determination in cow's milk by near-infrared spectroscopy: a new diagnostic tool. Journal of Animal Science, 79: 2550-2557. Tsenkova, R., Atanassova, S., Morita, H., Ikuta, K., Toyoda, K., Iordanova, I.K., and Hakogi, E. (2006). Near infrared spectra of cows‟ milk for milk quality evaluation: Disease diagnosis and pathogen identification, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 14: 363-370. Van den Bijgaart, H. (2002). New applications of mid-infra-red spectrometry. Bulletin of the International Dairy Federation383, Brussels, Belgium. 11-12p. van der Meer, F.D., and de Jong, S.M. (2001). Imaging spectrometry: basic principles and prospective applications, Volume 1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Nederland. 380p. 96

Vangroenweghe F., Dosogne H., Mehrzad J., and Burvenich C. (2001). Effect of milk sampling techniques on milk composition, bacterial contamination, viability and functions of resident cells in milk. Veterinary Research, 32: 565-579. Vangroenweghe F., Dosogne H., and Burvenich C. (2002). Composition and milk cell characteristics in quarter milk fractions of dairy cows with low cell count. The Veterinary Journal, 164: 254-260. Vangroenweghe F. (2004). Experimentally induced Escherichia coli mastitis in lactating primiparous cows. Doctoraatsthesis Faculteit Diergeneeskunde, Gent. Varga, G.A., and Ishler, V.A. (2006). Managing nutrition for optimal milk components. MidSouth Ruminant Nutrition Conference, Texas, USA. 21-27p. Vos H., and Groen A.F. (1998). Altering milk protein/fat-ratio: results of a selection experiment in dairy cattle. Livestock Production Science, 53: 49-55. Walstra, P., Geurts, T.J., Noomen, A., Jellema, A., and van Boekel, M.A.J.S. (1999). Dairy Technology, Principles of Milk Properties and Processes. Marcel Dekker Inc., New York, USA. 727p. Wang, Y., Tsenkova, R., Amari, M., Terada, F., Hayashi, T., Abe, A., and Ozaki, Y. (1998). Potential of two-dimensional correlation spectroscopy in analyses of NIR spectra of biological fluids. I. Two-dimensional correlation analysis of protein and fat concentrationdependent spectral variations of milk. Analusis Magazine, 26: 64-69. West, J.W. (2003). Effects of Heat-Stress on Production in Dairy Cattle. Journal of Dairy Science, 86: 2131-2144. Wiking, J., Stagsted, J., Björck, L., Nielsen, J.H. (2004). Milk fat globule size is affected by fat production in dairy cows. International Dairy Journal, 14: 909-913. Williams, P., and Norris, K. (2001). Near-infrared technology in the agricultural and food industries, 2nd ed. American association of cereal chemists, Saint Paul, Minnesota, USA. 312p. Wilson, R. and Goodfellow, B. (1994). Spectroscopic techniques for food analysis. VCH Publishers, New York, USA. 246p. Wu, H., Hulbert, G.J., and Mount, J.R. (2001). Effects of Ultrasound on Milk Homogenisation and Fermentation with Yoghurt Starter. Innovate Food Science & Emerging Technologies, 1: 211-218. Workman, J. and Weyer, L. (2007) Practical guide to interpretive near-infrared spectroscopy, Taylor & Francis group, Florida, USA. 333p. Zom, R., André, G. (2004). Individueel voeren: elke koe een eigen rantsoen. Praktijkkompas Rundvee, 18(4): 26-27.

97