Ontwerpen van sensoren voor de HPLC bepaling van organische anionen Kevin Hellemans 17 juni 2008
1. Inleiding HPLC is een veelgebruikte methode in de analytische scheikunde en kent vele toepassingen in de kwantitatieve en kwalitatieve bepaling van analieten. In de farmaceutische industrie bijvoorbeeld wordt 53% van alle analysen uitgevoerd aan de hand van HPLC. Het heeft echter enkele beperkingen: men kan alleen maar analyseren wat men kan detecteren. De gebruikte detector is dus van cruciaal belang. In HPLC zijn enkele courante detectoren voorhande, zoals UV-VIS detectie, fluorescentie, MS, etc . Iedere detector is gekenmerkt door enkele tekortkomingen. De UV-VIS detector is uitermate geschikt voor aromatische verbindingen of verbindingen met uitgebreide geconjugeerde systemen. Als de molecule die we wensen te analyseren dit niet bezit, krijgen we slechts een zwak signaal of soms zelfs helemaal geen signaal. Bovendien is voor elke molecule de λmax verschillend, wat er voor zorgt dat de UV-VIS detector geschikt is voor het kwantitatief analyseren van een gekende verbinding, maar minder geschikt is voor de bepaling van een onbekende. De vraag naar een meer geschikte detector is bijgevolg evident. In de onderzoeksgroep organische chromatografische sporenanalyse ontwikkelt men potentiometrische sensoren voor ionaire organische verbindingen. In dit gebied is er nog niet veel onderzoek gebeurd, aangezien het membraan voornamelijk uit lipofiele componenten bestaat, waar de te bepalen verbindingen in hoofdzaak hydrofiel van aard zijn. Als direct gevolg daarvan zijn deze verbindingen moeilijker te bepalen met deze techniek [1]. De potentiometrische detector bestaat uit een plastic omhulsel waarin zich een draad en een elektronische geleider gemaakt van glassy carbon bevindt. Er werd gekozen voor glassy carbon (sp² gehybridiseerde koolstofatomen) vanwege zijn goed geleidend karakter en zijn resistentie tegen chemische aantasting. Op deze detector wordt onderaan een ionengeleidend membraan aangebracht. Vanuit de LC wordt de eluensstroom op korte afstand van de detector geplaatst. (typische waarde 100 µm) In tegenstelling tot redox elektroden gebruiken ion selectieve elektroden zoals de potentiometrische sensor (figuur 1) geen redoxreactie om een potentiaal op te wekken. De potentiaal wordt echter opgewekt door een verschil in ionenconcentraties over het ionengeleidend membraan of de neiging van het analietion om zich te verdelen tussen het
1 / 12
sample en het membraanoppervlak of -binnenste. Het potentiaalverschil wordt gemeten tussen de elektroden en een referentie-elektrode, dit signaal wordt versterkt en naar de PC gestuurd.
Figuur 1: Schematische voorstelling van de potentiometrische detector
De neiging van het analietion om zich te verdelen tussen het sample en het membraan oppervlak, geeft een Gibbs energie ∆Gtr, die omgezet wordt in een elektrische energieterm –q ∆E. Dit is enkel mogelijk als het tegenion van het membraan geweerd wordt. Het analietion zal interageren met het membraan, meer specifiek met de ionofoor die in het membraan aanwezig is. In HPLC gebeurt dit enkel aan het membraanoppervlak. Analietion en tegenion worden plaatselijk gescheiden, wat aanleiding geeft tot een potentiaal E, die we meten in mV [2].
2. Doelstelling In deze bachelorproef werden sensoren ontwikkeld die dienst moeten doen als detector voor een HPLC opstelling. De doelstelling was de optimalisatie van verschillende weekmakers (figuur 2) op de HPLC detectie van organische ionen (figuur 3) Daarnaast wensen we enkele nieuw gesynthetiseerde ionoforen (figuur 4) te testen op de detectiekarakteristieken. Terloops wordt ook het effect van de temperatuur op het verkregen signaal even bekeken.
2 / 12
Dioctyl ftalaat (DOP)
Dioctyl sebacaat (DOS) H3C
CH3 O H3C
O
O
O
CH3
O O
CH3
CH3
2-nitrophenyl octyl ether (NPOE)
tris (2-ethylhexyl) trimellitaat (C)
Figuur 2: De gebruikte weekmakers
Citroenzuur
Maleïnezuur
Figuur 3: De gebruikte zuren
3 / 12
Malonzuur
H N H N
O OH HN
N
N
HN
CH3
HN HN
Substantie 2
Substantie 1
H3C
O
N H N
H37C18 NH
HN
NH
N CH3
O H37C18 NH
Substantie 3
NH
HOST4 Figuur 4: de ionoforen
3. Experimenteel 3.1.
Bereiding van membranen en elektroden
Voor de synthese van het membraan werd 1 mg ionofoor, 33 mg PVC, 66 mg weekmaker en 0,5 mg MTDDACl (figuur 5) opgelost in 1 ml THF. 50 µl van deze oplossing werd aangebracht op een substraat elektrode van het coated-wire (glassy carbon) type. De elektrode werd blootgesteld aan de lucht, opdat de THF zou verdampen (zgn. “dip-coating” methode). Wat overblijft op de sensor is een dun membraan, van ongeveer 50 µm. Deze sensor met membraan wordt in een waterige oplossing geplaatst om het membraan te hydrateren en in evenwicht te laten komen met zijn omgeving. Voor elke weekmaker werden de membranen in drievoud aangemaakt.
Figuur 5: MTDDACl
4 / 12
3.2.
Metingen
Alle metingen warden uitgevoerd met een Thermo P4000 pomp en Synergi 4u Hydro-RP 80A kolom van Phenomenex. Ter controle werd simultaan ook een UV-VIS detector gebruikt. Van een -3
10
M oplossing van het gebruikte zuur werd telkens 10 µl ingespoten. De gegevens werden
verzameld met het Labview softwarepakket en verder verwerkt met Excell [5]. (figuur 6)
Figuur 6: Schematische voorstelling van de HPLC-opstelling
5 / 12
4. resultaten en discussie 4.1.
De gebruikte zuren
35
30
signaal (10mV/S-1)
25
20
maleinezuur malonzuur
15
citroenzuur 10
5
0 3
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
-5
tijd (min)
Figuur 7: vergelijking respons van de drie zuren Het is duidelijk dat maleïnezuur een beter signaal oplevert dan de andere zuren (figuur 7). Daarom wordt voor de verdere resultaten verder gewerkt met maleïnezuur, om de fout op de resultaten zo laag mogelijk te houden. Een mogelijke reden voor het verschil in signaal is dat het citroenzuur beter gehydrateerd kan worden door de vele polaire groepen, waar maleïnezuur bvb. veel minder polair is, minder gehydrateerd zal worden en dus gemakkelijker interactie kan ondergaan met de receptormoleculen. Bovendien zal citroenzuur vanwege zijn polaire karakter moeilijker interactie aangaan met een hoofdzakelijk apolair membraan. Aangezien we geïnteresseerd zijn in analytische toepassingen, gaan we de reproduceerbaarheid na van de detector. In Tabel 1 zijn de verschillende piekhoogtes van de zuren weergegeven.
1 2 3
citroenzuur maleïnezuur malonzuur 0,88 29,53 3,02 0,78 26,57 2,88 0,84 29,20 3,00
st.afw. 0,05 1,62 0,08 %afw 5,81 5,50 2,52 Tabel 1: piekhoogtes van de verschillende zuren
6 / 12
Het is duidelijk dat de procentuele standaardafwijking varieert van zuur tot zuur, maar dat bij citroenzuur en maleïnezuur de grens van 5% overschreden is. Voor analytisch werk is dit net teveel, waardoor verdere optimalisatie van de sensor vereist is.
4.2.
De calibratiecurve
90
80
70
signaal (mV)
60
Experimenteel Nicolski-Eisenmann fit
50
40
30
20
10
0 0
1
2
3
4
5
6
7
- log concentratie
Figuur 8: Calibratiecurve voor maleïnezuur Via verdunningsreeks hebben we een mV versus -logC grafiek uitgevoerd (figuur 8). Het bovenste gedeelte van de curve is nagenoeg lineair en kan beschreven worden met de de Nernst vergelijking. De totale curve wordt beschreven door een Nicolski – Eisenmann vergelijking.
E (mV ) = E 0 + S log(c analyte + Cst ) In deze vergelijking wordt ook nog een constante interferentieterm in rekening gebracht. Het is belangrijk deze interferentieterm, afkomstig van een interfererend ion uit het eluens, zo laag mogelijk te houden, anders verandert het signaal te weinig in functie van canaliet en zal de sensor ongevoelig worden [3]. De Nicolski-Eisenmann vergelijking wordt tevens gebruikt om het verkregen signaal om te zetten. De omzetting van het signaal wordt verkregen door: mV/S
Signaal = 10
–1
7 / 12
Door het logaritmische verband tussen piekhoogte en concentratie worden namelijk de hoge signalen onderdrukt en de lage signalen worden te hoog ingeschat. Daarom gebruiken we deze omzetting, waardoor de de signaal-concentratie verhouding beter klopt.
4.3.
Temperatuursafhankelijkheid 11
10
signaal (10mV/S-1)
9
8
7
6
5
4
3
2 10
15
20
25
30
35
40
temperatuur (°C)
Figuur 9: signaal vs temperatuur plot Alhoewel de gegeven meetpunten geen aanleiding geven tot een eenduidige ijklijn, is er een duidelijke tendens: de respons neemt toe met de temperatuur (figuur 9). Een verklaring voor dit fenomeen ligt in de glastransitietemperatuur: Eens het membraan onder een bepaalde temperatuur komt, gaat het van een rubberfase toestand naar een hardere, glasachtige toestand. In deze toestand is het veel moeilijker voor ionen om door het membraan te migreren, waardoor de sterkte van het signaal sterk afneemt. De slechte fit is te wijten aan de oven waarmee de opstelling op temperatuur werd gebracht. Bij het inschakelen van de ventilatie zorgde de ventilatie voor een enorme ruis in het chromatogram, waardoor de piekhoogte niet bepaald kon worden. Daarom was het nodig om de ventilatie uit te schakelen. Door deze uit te schakelen veranderde de temperatuur echter zeer snel tot kamertemperatuur, waardoor het inschatten van de meettemperatuur bemoeilijkt werd.
8 / 12
4.4.
Opname van een chromatogram 0,7
0,6
signaal (10mV/S-1)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-0,1
tijd (min)
Figuur 10: chromatogram van de drie zuren De organische zuren die we hier gebruiken zijn erg polair, en bijgevolg zijn het “moeilijke gevallen” voor onze sensor, die eerder goede signalen oplevert voor lipofiele verbindingen. Het chromatogram duidt aan dat de drie zuren die gebruikt werden tijdens dit onderzoek op voldoende wijze getetecteerd kunnen worden met de ontwikkelde sensoren. De eerste piek, kort na 4 minuten is die van malonzuur, gevolgd door die van maleïnezuur na 7 minuten en die van citroenzuur rond 8 minuten. Maleïnezuur vertoonde in alle chromatogrammen een zekere tailing. Door deze tailing kunnen onder de huidige condities de pieken niet gebruikt worden voor kwantitatief werk (vallei boven de 10 % van de citroenzuurpiek), maar wel voor kwalitatief werk. Verdere optimalisatie van het eluens en het membraan is dus vereist voor dit product. Op basis van de eerste piek bepalen we het plaatgetal van de kolom:
z 2 t R2 Np = 2 W Aan de hand van deze formule berekent men een plaatgetal van 15 000 schotels per m [4]. Het is vrij duidelijk dat indien de tweede piek, die van maleïnezuur, wordt gebruikt, men een veel lager plaatgetal zal uitkomen. De tailing van die piek is echter zeer uitzonderlijk en dus niet representatief. Daarom wordt de eerste piek gebruikt.
9 / 12
4.5.
Weekmakers
35
30
signaal (10mV/S-1)
25
C
20
DOS 15
DOP NPOE
10
5
0 3
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
-5
tijd (min)
Figuur 11: vergelijking respons van de weekmakers Het is vrij duidelijk dat NPOE de beste weekmaker is. DOS, DOP en C liggen duidelijk een stuk lager. We hebben dit aangetoond met maleïnezuur, aangezien dat zuur de beste respons geeft (figuur 11). De chromatogrammen van de andere zuren geven gelijkaardige resultaten, al wordt af en toe de relatieve volgorde van DOS en DOP omgedraaid, maar overal schiet NPOE er ver bovenuit.
Opnieuw wensen we na te gaan of de weergegeven resultaten reproduceerbaar zijn. In Tabel 2 staan de standaardafwijkingen getabelleerd van de verschillende weekmakers. Het is duidelijk dat ook hier verdere optimalisatie vereist is, vooral in het geval van C, waar de afwijking 20% bedraagt. Andere weekmakers leveren dan weer een beter resultaat op, zoals DOP, met een standaardafwijking van slechts 1,73 %.
1 2 3
dop 1,62 1,65 1,68
npoe 29,53 26,57 29,20
c 2,43 1,94 1,46
dos 5,01 4,81 4,69
st.afw. 0,03 1,62 0,49 0,16 % afw 1,73 5,49 19,94 3,18 Tabel 2: piekhoogten bekomen met de verschillende weekmakers
10 / 12
4.6.
Ionoforen
60
50
signaal (10mV/S-1)
40
HOST 4 geen ionofoor 30
sub 2 sub 1 sub 3
20
10
0 3
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
-10
tijd (min)
Figuur 12: vergelijking van de ionoforen Voor “substance 1”, “substance 2” en “substance 3” is de interactie tussen weekmakers en analiet gebaseerd op coulomb krachten. Bij “HOST4”, dat een ureumfunctie bevat en dus moeilijk wordt geprotoneerd, zijn de interacties vooral te wijten aan waterstofbruggen. Het blijkt ook dat de logP waarde een belangrijke invloed heeft op de respons. De logP waarde is een verhouding tussen het aantal moleculen in organische fase (membraan) en anorganische fase (water, eluens). Hoge logP waarden betekenen dus dat de molecule goed in het membraan zal blijven zitten en bijgevolg goed zal functioneren. Men kan verwachten dat ionoforen met hoge logP waarden betere respons zullen leveren, wat wordt bevestigd in de resultaten, waar we zien dat de ionoforen met grote apolaire ketens en dus hogere logP waarden (“Substance 3” en “HOST4”) beter presteren dan de andere ionoforen.
5. besluit We kunnen dus besluiten dat NPOE de beste weekmakers is voor organische anionen wat betreft respons ten opzichte van de andere weekmakers, maar dat er voor het gebruik in analytische toepassingen nog verfijningen moeten worden uitgevoerd aan de membranen om de reproduceerbaarheid te verhogen. We kunnen eveneens stellen dat het temperatuurseffect niet te verwaarlozen valt bij de rubber fase coatings, zodat men zich er telkens moet van vergewissen dat de opstelling voldoende boven de glastransitietemperatuur van het membraan is gebracht. Tot slot kunnen we ook stellen dat de geteste ionoforen een grote invloed hebben op de respons,
11 / 12
waarbij HOST4 veruit voor de beste gevoeligheid zorgt voor de hier geteste heel polaire verbindingen.
6. referenties [1]
Characteristics of new composite- and classical potentiometric sensors for the
determination of pharmaceutical drugs, Vissers B, Bohets B, Everaert J, Cool P, Vansant EF, Du Prez F, Kaufmann JM, Nagels LJ. Electrochimica acta 51 (2006) 5062-5069
[2]
Molecular Interaction sensors: A New Type of Detector for Separation Methods, Nagels
LJ, Everaert J, Vissers B. LC·GC Europe 20 (2007) 558-565
[3]
Potentiometric detection for high-performance liquid chromatography id a reality: which
classes of organic substances are the targets?, Nagels LJ. Pure Appl. Chem. 76 (4) (2004) 839845 [4]
Scheidingsmethoden, Luc Van Vaeck, 2007
[5]
Microsoft Excell 2007
12 / 12
