KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 (CYANOCOBALAMINE) IN LEVENSMIDDELEN (HPLC)

Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria

I-MET-FLVVT-026a

I-MET-FLVVT-026a

KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 (CYANOCOBALAMINE) IN LEVENSMIDDELEN (HPLC)

Versie

02

Datum van toepassing

2012-11-06

Opgesteld door :

Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke

Nazicht door :

Sophie De Volder, QAM; 2012-10-25

Goedkeuring vrijgave door :

Mandy Lekens, Laboratoriummanager; 2012-10-31

Beheer & locatie geldende versie :

FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem

Bestemmelingen :

Medewerkers FLVVT

Trefwoorden :

Toevoegingsmiddelen, Vitaminen

KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC)

Overzicht wijzigingen Herziening * door/datum M. Vanbrabant, 04/2012 M. Vanbrabant, 10/2012

Reden van de herziening Opsteller initiële versie

Tekstdeel/draagwijdte van de herziening Volledige tekst

Actualisatie en verduidelijking

8.2; 10.1;10.2

*

Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar

bedragen.

Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood.

Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document.

LAB 25 I-MET-FLVVT-026a - Bepaling van Vitamine B12 in levensmiddelen v.02 2/10

KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) INHOUDSTABEL

1

DOEL .................................................................................................................................. 4

2

TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4

3

WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4

4

DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 4

5

PRINCIPE........................................................................................................................... 4

6

PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 4

7

VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5

8

REAGENTIA EN MATERIALEN........................................................................................ 5

9

8.1

REAGENTIA..................................................................................................................... 5

8.2

STANDAARDEN................................................................................................................ 6

8.2.1

Vitamine B12 standaard stockoplossing, 200 µg/ml (W1411) ............................ 6

8.2.2

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 10 µg/ml (W1413) ................................ 6

8.2.3

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 0,25 µg/ml (W1414) ............................. 6

8.2.4

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 0,5 µg/ml (W1415) ............................... 6

TOESTELLEN .................................................................................................................... 6 9.1

ALGEMEEN ..................................................................................................................... 6

9.2

SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE .............................................................................. 7

10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 7 10.1

EXTRACTIE ................................................................................................................. 7

10.1.1

Voedingssupplementen ....................................................................................... 7

10.1.2

Melk, melkpoeders en graanproducten ............................................................... 7

10.1.3

Dranken en Vruchtensappen ............................................................................... 8

10.2

OPZUIVERING OVER IMMUNOAFFINITEITSKOLOM ........................................................... 8

10.3

HPLC-BEPALING ........................................................................................................ 9

11 KWALITEITSCONTROLE ................................................................................................. 9 12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................... 9 13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN ................................................................................................ 10


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 1

Doel

Kwantitatieve bepaling van vitamine B12 in levensmiddelen.

2

Toepassingsgebied

De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van vitamine B12 in levensmiddelen (voedingssupplementen, zuigelingenmelk, dranken, vruchtensappen en ontbijtgranen). De rapporteringsgrens bedraagt 0,005 mg/kg.

3

Wettelijke en normatieve documenten

Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT.

4

Definities en afkortingen

Term HPLC IA

5

Definitie High Performance Liquid Chromatography Immunoaffiniteit

Principe

Vitamine B12 wordt, afhankelijk van de matrix, uit het monster geëxtraheerd met water of natriumacetaatbuffer. Het extract wordt vervolgens opgezuiverd over een Easi-extract B12 immunoaffiniteitskolom en geconcentreerd. Het gehalte aan vitamine B12 (cyanocobalamine) wordt geanalyseerd met behulp van reversed-phase HPLC met UV-detectie bij 361 nm.

6

Prestatiekenmerken

De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De

waarden

voor

de

reproduceerbaarheid

(RSDR%)

zijn

terug

te

vinden

in

M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx.


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 7

Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen

De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden.

Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT.

8

Reagentia en materialen

8.1

Reagentia

Alle reagentia dienen van ‘pro analyse ‘-kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld.

Reagentia

Labonr.

8.1.1

Methanol, HPLC-kwaliteit (CH3OH)

R0183

8.1.2

Water, HPLC-kwaliteit

R1003

8.1.3

Taka-Diastase from Aspergillus oryzae (α-amylase), ~100 Units/mg

R0001

8.1.4

Pepsin from porcine gastric mucosa, 400-800 units/mg

R0491

8.1.4

Easi-Extract Vitamine B12 (IA-kolom), bewaard tussen 2-8°C

R2025

8.1.5

Natriumhydroxide pellets (NaOH)

R0206

8.1.6

NaOH 1M: los 40 g NaOH pellets (R0206) op in 1 l H2O

W0110

8.1.7

Citroenzuur (C6H8O7)

R0673

8.1.8

Citroenzuur 1M: Los 21 g citroenzuur (R0673) op in 100 ml water

W1190

8.1.9

Natriumacetaat

R0439

8.1.10 PBS 8.1.11

R0301

Natriumacetaatbuffer (pH 4 ): NaAc.3H2O = 6,8g/l op pH 4 met HAcgeconc

W0601

Mobiele fase: Methanol/H2O (22/78). 8.1.12 Naargelang de gebruikte kolom kan de verhouding van het eluens

W0600

aangepast worden. 8.1.13 Extractievloeistof: water

R1003

8.1.14 Kaliumcyanide (KCN)

R2024

8.1.15 Kaliumcyanide (KCN) 1%

W0599


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 8.2 

Standaarden

Vitamine B12 (Cyanocobalamine) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid (S0013)

8.2.1

Vitamine B12 standaard stockoplossing, 200 µg/ml (W1411)

Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, 10 mg op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 50 ml. Los op in H2O en leng aan tot de maatstreep met hetzelfde oplosmiddel. Deze oplossing is 3 maand houdbaar, bewaard in de koelkast bij 4 ± 4 °C.

8.2.2

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 10 µg/ml (W1413)

Pipetteer 1,0 ml van de standaard stockoplossing (W1411) in een maatkolf van 20 ml. Leng aan tot de maatstreep met H2O en meng. Deze oplossing is 1 maand houdbaar, bewaard in de koelkast bij 4 ± 4 °C.

8.2.3

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 0,25 µg/ml (W1414)

Pipetteer 0,5 ml van de standaard werkoplossing (W1413) in een maatkolf van 20 ml. Leng aan tot de maatstreep met H2O en meng. Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie en wordt bereid op de dag van de analyse.

8.2.4

Vitamine B12 standaard werkoplossing, 0,5 µg/ml (W1415)

Pipetteer 1ml van de standaard werkoplossing (W1413) in een maatkolf van 20 ml. Leng aan tot de maatstreep met H2O en meng. Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie en wordt bereid op de dag van de analyse.

9 9.1

Toestellen Algemeen

Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21

APPARATUUR

GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT.


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 9.2

Specificaties voor deze methode

De volgende condities worden als leidraad gegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen. 

HPLC-kolom: o

Analytische kolom: Nova-Pak C18, 4 µm, 3,9 x 150 mm of gelijkwaardig eventueel met overeenkomstige voorkolom



Detector

: UV op 361 nm



Eluens

: Methanol/H2O (22/78)



Loopsnelheid

: 0,8 ml/min



Injectievolume

: 100 µl



Kolomoven

: 30°C

10 Werkwijze Laadvolume op Easi-extract kolom bevat 0,01 tot 0,5 µg vitamine B12 (niet meer dan 1 µg).

10.1 Extractie

10.1.1 Voedingssupplementen 

Maal het monster tot een fijn poeder



Weeg, afhankelijk van het veronderstelde gehalte, 0,25 g (± 0,01) à 5 mg (± 0,1) van het poeder af en voeg 50 à 200 ml H2OAD toe



Soniceer het mengsel gedurende 15 minuten



Schud gedurende 30 minuten op het schudtoestel



Controleer of de pH zich bevindt tussen 4,5 en 7 a. Indien pH > 7

 citroenzuur toevoegen

b. Indien pH < 4,5  opnieuw beginnen en H2OAD vervangen door PBS 

Centrifugeer gedurende 5 min. op 4000 rpm



Verdun het mengsel eventueel met H2OAD en breng een bepaalde hoeveelheid op de immuno-affiniteitskolom (R2025) die overeenkomt met ± 0,25 µg vitamine B12

10.1.2 Melk, melkpoeders en graanproducten 

Weeg 5 g monster af tot op 0,1 g nauwkeurig



Voeg achtereenvolgens toe: o

0,5 g amylase (R0001)

o

1 g pepsine (R0491)


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) o

2 ml KCN 1% (W0599)

o

50 ml natriumacetaat (W0601)



Schud gedurende 30 minuten in waterbad bij 37°C



Plaats in warmwaterbad op 100°C gedurende 30 minuten en roer indien nodig



Leng aan tot 100 ml met H2O



Controleer of de pH zich bevindt tussen 4,5 en 7 a. Indien pH > 7

 citroenzuur toevoegen

b. Indien pH < 4,5  opnieuw beginnen en H2OAD vervangen door PBS 

Centrifugeer gedurende 5 minuten op 4000 toeren



Filtreer en breng 50 ml filtraat op immuno-affiniteitskolom (R2025)

10.1.3 Dranken en Vruchtensappen 

Breng, afhankelijk van verondersteld gehalte, een hoeveelheid monster op pH 7 met NaOH 1M (W0110)



Centrifugeer gedurende 5 minuten op 4000 toeren



Breng, afhankelijk van het veronderstelde gehalte, een hoeveelheid monster op de immuno-affiniteitskolom (R2025)

10.2 Opzuivering over immunoaffiniteitskolom 

Kolommen op kamertemperatuur laten komen



Deksel bovenaan en plug onderaan van kolom verwijderen



Kolom in SPE vacuümfold rek plaatsen



Reservoir met behulp van tussenstuk op kolom bevestigen



Breng het gewenste volume op kolom



Stuur het monster over de kolom aan 2-3 ml/min a.d.h.v. de zwaartekracht of via vacuüm (een trage constante flow is essentieel voor een goede werking van de antilichamen)



Was de kolom met 10 of 20 ml H2OAD afhankelijk van de matrix (20 ml voor melk, melkpoeders en graanproducten; 10 ml voor andere matrices)



Blaas de kolom droog met lucht om restjes water te verwijderen



Droog de kolom boven- en onderaan met behulp van een papieren doekje (alles moet zoveel mogelijk watervrij zijn!)



Plaats een proefbuisje onder de kolom



Elueer met 3 ml methanol aan een flow van 1 druppel per seconde o

‘Back flushing’ met eluens wordt aangeraden door de voorzichtig zuiger open neer te bewegen


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 

Damp het eluaat droog bij 60-70°C onder N2-stroom



Los op in een bepaalde hoeveelheid water, vortex 20 sec en injecteer in HPLCsysteem o

Voor melk, melkpoeder en graanproducten oplossen in 0,25 ml H2O

o

Voor andere matrices is de hoeveelheid water afhankelijk van het verwachte gehalte

10.3 HPLC-bepaling Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema,…) worden weergegeven in LAB 25-P 04.

11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 04.

12 Berekening en rapportering De berekening van de hoeveelheid vitamine B12 wordt uitgevoerd door de software aan de hand van een standaardcurve (zie ook LAB 25-P 02).

Het gehalte aan vitamine B12 in mg/kg in het monster kan ook bepaald worden met behulp van formule:

waarbij :

A = piekoppervlakte of -hoogte van de monsteroplossing B = piekoppervlakte of -hoogte van de standaardoplossing V = volume van het monsterextract in ml (rekening houdend met eventueel uitgevoerde verdunningen) m = massa van het monster in g C = concentratie van de standaardoplossing in µg/ml

De rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 04. Enkel resultaten  0,005 mg/kg worden gerapporteerd.


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 IN LEVENSMIDDELEN (HPLC) 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 36

W ERKWIJZE VITAMINE B12

LAB 25-F 62

REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART

LAB 25-L 18

OVERZICHT WETGEVING FLVVT

LAB 25-L 21

APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT

LAB 25-L 22

OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT

LAB 25-P 04

RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN

LAB 25-P 07

VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT


KWANTITATIEVE BEPALING VAN VITAMINE B12 (CYANOCOBALAMINE) IN LEVENSMIDDELEN (HPLC)

Recommend Documents