Moleculaire Diagnostiek binnen een routine Pathologie Laboratorium
Winand N.M. Dinjens Laboratorium voor Moleculaire Diagnostiek Afdeling Pathologie Josephine Nefkens Instituut (JNI) Erasmus MC, Universitair Medisch Centrum Rotterdam
[email protected]
Hogeschool Rotterdam, 11 oktober 2011
DNA in de Cel chromosome
cell nucleus Double stranded DNA molecule
Individuele nucleotiden
Beschrijving (haploide) genoom: 3 x 109 basen In de celkern: haploide genoom = 3 x 109 baseparen Dus: haploide genoom = 6 x 109 basen Dus: diploide genoom = 12 x 109 basen
3 x 106 dubbelzijdige A4 (pts 12) = 150 meter
Kankerbiologie dogma:
Kanker is een ziekte van het DNA Wordt veroorzaakt door afwijkingen (mutaties) in het DNA die leiden tot afwijkingen (afwezigheid, inactivatie, overexpressie of activatie) in eiwitten.
GEN (DNA) mRNA Eiwit
gemuteerd gen (DNA)
* *
gemuteerd mRNA gemuteerd
*
Eiwit
Karyogram van normale cellen van een man
Chromosomale instabilieit (CIN) Spectraal karyogram van een kankercel
Normale cel meerdere genetische veranderingen ongecontroleerde groei clonale expansie benigne tumor meerdere genetische veranderingen invasief en metastaserend maligne tumor
Proto-oncogenen activatie Oncogenen
(gereguleerd)
(gedereguleerd)
activatie celcyclus
activatie celcyclus
remming apoptose
remming apoptose
Tumorsuppressorgenen inactivatie
remming celcyclus
remming geïnactiveerd
stimuleren apoptose apoptose geremd
PROTO-ONCOGEN ACTIVATIE EN TUMORSUPPRESSORGEN INACTIVATIE Tumor fenotype
afwijking
wildtype PROTO-ONCOGEN
ACTIVERENDE MUTATIE
1 activerende hit
DELETIE OF INACTIVERENDE
TUMOR SUPPRESSORGEN
MUTATIE
DELETIE OF INACTIVERENDE
MUTATIE
2 inactiverende hits Knudson’s 2 hit hypothesis
Tumoren: A: clonaal B: DNA afwijkingen C: activatie proto-oncogenen D: inactivatie tumorsuppressorgenen
Clonaliteitsbepaling van meerdere tumoren binnen een patient
Tumorcellen onderscheiden zich van normale cellen door het voorkomen van afwijkingen in hun DNA Die DNA afwijkingen kunnen worden gebruikt als tumor-specifieke clonale markers
Vrouw 49 jaar: Mammatumor (T1) 35 maanden later tumor (T2) in lies lymfeklier Vraag: tumor in liesklier metastase mammatumor?
DNA isolatie: -
normaal weefsel
-
mammatumor (T1)
-
liesklier tumor (T2)
LOH-analyse
Mammatumor (T1)
Lymfeklier tumor (T2)
Laser Capture Microscopie microdissectie
DNA polymorfismen: In de natuur voorkomende variatie in de DNA volgorde binnen één soort
Polymorfismen Microsatelliet: CA/TG di-nucleotide repeat aatgcCACACACACACACACACACACAgggat ttacgGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTcccta
Aantal CA: 19, 20, 21, 22, 23, 24 Frequentie: 0,1 - 0,3 - 0,1 - 0,2 - 0,05 - 0,25
Polymorfismen CA/TG di-nucleotide repeat: - Hoog polymorf (19-20-21-22-23-24) - Frequent in het genoom ( > 50.000 maal) - Geflankeerd door uniek DNA
Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p
p
q
q CA(20)
14(a)
14(b)
Heterozygoot
14(a)
(CA)20
14(b)
(CA)15
CA(15)
PCR amplificatie van normaal DNA
Hoog-resolutie fragment scheiding
Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p
p
q
q CA(20)
14(a)
14(b)
14(a)
(CA)20
14(b)
(CA)15
CA(15)
PCR amplificatie van normaal en tumor DNA
Hoog-resolutie fragment scheiding NORMAAL
Heterozygoot
TUMOR DNA p
p
q CA(20) 14(a)
14(b)
Analyse van polymorfe microsatellieten om DNA afwijkingen te detecteren Loss Of Heterozygosity (LOH) NORMAAL DNA p
p
q
q CA(20)
14(a)
14(b)
14(a)
(CA)20
14(b)
(CA)15
CA(15)
p
p
PCR amplificatie van normaal en tumor DNA
q CA(20)
Hoog-resolutie fragment scheiding NORMAAL
Heterozygoot
TUMOR DNA
TUMOR
LOSS
LOH
14(a)
14(b)
D13S155
N T1
LOH - Upper
T2
No - loss
T1 # T2
D8S133
N T1
No - loss
T2
LOH - Lower
T1 # T2
D17S786
N T1
LOH
T2
LOH
T1 # T2
Lower
Upper
Resultaat: -
Beide tumoren vertonen een verschillend LOH patroon
Conclusie: -
Lymfeklier metastase waarschijnlijk niet afkomstig van mammatumor
Patiënte opnieuw onderzocht: Ovariumtumor (T3) LOH analyse
Ovariumtumor (T3)
D13S155
N T1
LOH - Upper
T2
No - Loss
T3
No - Loss
T2 = T3 # T1
D8S133
N T1
No - Loss
T2
LOH - Lower
T3
LOH - Lower
T2 = T3 # T1
D17S786
N T1
LOH
T2
LOH
Lower
Upper
LOH
T3 T2 = T3 # T1
Upper
Resultaat: -
Ovarium- (T3) en liesklier tumor (T2) identiek LOH patroon
-
Mammatumor (T1) verschillend LOH patroon
Conclusie: Lymfekliermetastase zeer waarschijnlijk afkomstig van ovariumtumor
Behandeling tumoren conventioneel: “one size fits all”:
bij bepaald tumortype en stadium standaard behandeling (chemo-radiotherapie etc.)
PROTO-ONCOGEN ACTIVATIE Tumor fenotype
afwijking
wildtype PROTO-ONCOGEN
ACTIVERENDE MUTATIE
1 activerende hit
“Oncogene addiction”: Tumorcel is “verslaafd” aan moleculaire afwijking(en) voor overleving en groei: Remming van (effect van) moleculaire afwijking leidt tot remming van de proliferatie en mogelijk tot dood van de tumorcellen.
Behandeling tumoren modern: “personalized therapy”: “targeted therapy”: “patient-tailored therapy“:
therapie gebaseerd op moleculaire karakteristieken van de tumor (en de patiënt)
“pharmacogenetics“: “pharmacogenomics”: Mamma carcinoom Her2/neu gen amplificatie Her2/neu eiwit over-expressie Herceptin/trastuzumab (anti-Her2/neu) therapie response
Targeted therapieën Een nieuwe generatie meer selectieve kanker drugs
Behandeling tumoren modern:
EGFR Wildtype
EGFR-gen activerende mutatie
EGFR-gen activerende mutatie + TKI “Targeted therapy”
Targeted therapy in longkanker * Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) beschikbaar die de Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) activatie remmen: • Erlotinib en Gefitinib
EGFR (en KRAS) mutatie analyse in NSCLC dus van belang voor de behandeling met TKIs Gefitinib en Erlotinib
EGFR en KRAS mutatie analyse: DNA sequencing -
DNA isolatie uit hoog percentage tumorcellen
-
manuele of laser microscoop dissectie
-
routine FFPE weefsel: resectie, biopt, cytologie blokje, ongekleurde coupes, gekleurde coupes
-
cytologie suspensie, ongekleurd, gekleurd preparaat
DNA isolatie uit rourine verkregen preparaten Paraffine blokje
Immuno gekleurde coupe
Paraffine coupe
(gekleurd) cytologiepreparaat)
H&E gekleurde coupe
Hoog % tumorcellen voor DNA isolatie: manuele of laser capture microscoop microdissectie
EGFR/KRAS analyse Op elke aanvraag worden de volgende bepalingen uitgevoerd:
-
EGFR-gen mutatie-analyse (exonen 18, 19, 20 en 21)
-
KRAS gen mutatie-analyse (codon 12 en 13)
EGFR-gen DNA sequentie analyse Wildtype
TGC Cysteine
Mutant
TAC Tyrosine
Toekomst moleculaire diagnostiek NSCLC: Bepaald door het beschikbaar komen van andere “addicted-oncogene” remmers
Nabije toekomst moleculaire diagnostiek voor targeted therapies II Bepaald door het beschikbaar komen van andere “addicted-oncogene” remmers: -
EML4-ALK fusie ALK inhibitor Crizotinib
+/- 5% NSCLC, KRAS mutually exclusive
-
KRAS mutatie RAF-MEK-ERK signaaltransductie inhibitor Sorafinib, +/- 15% NSCLC
-
BRAF codon 600 mutatie inhibitor PLX4032/RG7204 50% melanomen
Dank voor uw aandacht
