Moleculaire Diagnostiek binnen de Pathologie in Nederland

Moleculaire Diagnostiek binnen de Pathologie in Nederland

Moleculaire Pathologie in Nederland

1)

welke bepalingen komen in aanmerking voor moleculaire diagnostiek binnen de Pathologie ?

2)

welke technieken zijn daarvoor nodig ?

3)

wat zijn de randvoorwaarden voor een hoog kwalitatieve moleculaire diagnostiek ?

Ed Schuuring Moleculair bioloog Hoofd moleculair diagnostisch lab van Pathologie UMCG Voorzitter van de landelijke werkgroep Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie

Moleculaire diagnostiek:

* Het gebruik van moleculair-biologische technieken om

wat bedoelen we eigenlijk met moleculaire diagnostiek ?

genetische veranderingen (op RNA/DNA niveau) te detecteren

* Deze veranderingen te gebruiken als aanvullende informatie in de differentiaal diagnostiek


1)


2)


3)


Welke genetische veranderingen ? Chromosomale deleties DNA amplificaties Puntmutaties Chromosomale translocaties Numerieke chromosoom afwijkingen Expressie-verschillen Polymorfismen Exogene agentia (bv virussen)

1

Moleculaire diagnostiek in Nederland Waar gebeurt moleculaire diagnostiek ? pathologie hematologie (klinische) genetica klinische chemie transplantatie geneeskunde/immunologie medische microbiologie/virologie Centraal laboratorium (alleen uitvoering)

Pathologie HPV, EBV, B/T-cel clonaliteits, p53, t(11;22)

Belangrijkste verschillen zijn:

Hematologie BCR/ABL, MLL/AF4, inv(16), trisomy(12), B/T-cel clonaliteits, EBV

• Aanbod van materiaal (serum, urine, weefsel, blood)

(Klinische) genetica BRCA1-mutations, del(22q11), +21, p53, t(11;22)

• Indicatie (klinische vraagstelling)

Klinische chemie Factor V Leiden, APOE, HFE, TPMT, KIT Transplantatie geneeskunde/immunologie HLA-typering, EBV, CMV, chimerisme Medische microbiologie/virologie EBV, CMV, HPV, TBC

Aanbevelingen van de taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie aan de NVvP (1998/2001)

Taakgroep opgericht (1996) Moleculaire Diagnostische Pathologie

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998) Indicaties:

1) welke indicaties voor Pathologie ? 2) wat hebben we nodig ? 3) hoe toetsen we onze kwaliteit ?

1)

lijst met indicaties voor Pathologie

2)

voorstel voor de inrichting laboratoria en handelwijze

3)

kwaliteitsborging en toetsing

maligne lymfomen soliede tumoren hereditaire problematiek micro-organismen anders

In opdracht van de Ned Ver v Pathologie

www.moleculaire-pathologie.nl

2

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998) Indicaties voor maligne lymfomen

target

Folliculair lymfoom vs folliculaire hyperplasie B-NHL NOS vs B-cel hyperplasie T-NHL vs T-cel hyperplasie Mantelcellymfoom vs B-NHL Burkitt vs grootcellig B-NHL ALCL vs HD Posttransplantatie LPD vs mononucleosis B-cel clonale verwantschap T-cel clonale verwantschap Minimal Residual Disease (MRD)

t(14;18), Ig Ig TCR t(11;14) t(8;14) en varianten t(2;5), EBV EBV, Ig Ig TCR Ig, t(14;18)

Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie API-MALT in t(11;18) in MALT Translocatie BCL6, BCL2 en MYC voor classificatie DLCBL Expressie-microarray in borstkanker FUS/CHOP in t(12:16) in myxoid liposarcoom HHV8 in Kaposi sarcoom Del(1p) en del(19q) in dd oligodendroglioom DNA promoter methylering in prostaat carcinoom Numerieke chromosomale afwijkingen in urine blaascarcinoom BRAF-mutatie analyse in melanoom (e.a.) Hoog-risico HPV-detectie tbv vroeg-detectie cervixcarcinoom

Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie Moleculaire markers mbt gen-specifieke targeted therapie: HER2 amplificatie in borstkanker (Herceptin) MGMT-methylering glioblastoom (temozolomide) KIT-mutatie analyse in GIST (Glivec) HER2 amplificatie in maagcarcinoom (Herceptin) BRAF-mutatie analyse in melanoom (PLX4032) Laag-risico-HPV in larynxpapillomen (Cidofovir) EGFR/KRAS-mutatie analyse in longkanker (Erlotinib) KRAS-mutatie analyse in colonkanker (cetuximab)


EGFR-activatie voor selectie patienten EGFR-targeted therapie

Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie

* Vervanging door immunohistochemie (ALK, cycline D1 en HHV8)

EGFR-activatie voor selectie patienten EGFR-targeted therapie

Diagnostiek nu:

Diagnostiek nu:

EGFR-mutaties EGFR-amplificatie EGFR-expressie KRAS-mutatie

EGFR-mutaties EGFR-amplificatie EGFR-expressie KRAS-mutatie Effect andere componenten: BRAF-mutatie PTEN-deletie PI3K-mutatie EGFRviii-expressie ErbB2/3/4 co-expressie cMET-expressie pAKT-expressie

* Multifactor analyse: - Specifieke profielen op basis van expressie array (borstkanker) - Genomische profielen op basis van array-CGH - EGFR-activatie pathway analyse (longkanker)

Niet alleen veel EGFR-eiwit maar vele verschillende componenten kunnen leiden tot de zelfde EGFR-activatie

Niet alleen veel EGFR-eiwit maar vele verschillende componenten kunnen leiden tot de zelfde EGFR-activatie En daarmee de respons op therapie kunnen beïnvloeden

3

Samenspel tussen histopathologie en moleculaire pathologie

Macroscopische afwijking op de stemband

HER2 expressie en gen amplificatie in borstkanker

? Maligniteit Invasie-diepte Lymfo-infiltratie Groeipatroon Differentiatiegraad Pathologisch T-volume Angiogenese Apoptose/necrose immunofenotypering Moleculaire veranderingen

?

?

‘0’ (negatief)

‘1+’ (negatief)

Ernstige dysplasie

hrHPV-positief ~10-30%

papilloom

carcinoom

‘2+’ (twijfelachtig)

normaal

(23-43%)

‘3+’ (positief)

Wesseling, Nederlof, Bart

HPV6/11-positief

Amplificatie (clusters/ > 10x)

HER2 expressie en gen amplificatie in borstkanker

FISH

Her2/neu test-algorithme mammacarcinoom

AMPLIFICATIE: <5%

AMPLIFICATIE: 5-15% Interfase kernen

IHC

ISH metafase

‘0’ (negatief)

‘1+’ (negatief)

0

1+

2+

3+

-

Amplificatie her2 = her2/neu gen (1 kopie)

+ Amplificatie her2

AMPLIFICATIE: 15-50%

ISH

AMPLIFICATIE: 80-100% -

‘2+’ (twijfelachtig) Wesseling, Nederlof, Bart

(23-43%)

‘3+’ (positief)

Herceptin® Therapie

Herceptin® Therapie 1 kopie

+ Herceptin® Therapie

J Wesseling ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 (Guideline recommendations)

BRISH

cluster

FISH

SISH Ventana

4

HER2-testing in borstkanker voor behandeling met Herceptin

Een belangrijke voordeel van helderveld ISH (BRISH): amplificatie detectie in relatie tot de morfologie

De diagnostiek van een patiënt met een maligne lymfoom

GEEN HER2-amplificatie in het carcinoom

FISH

FISH

Carcinoom-in-situ

Invasief carcinoom

BRISH

BRISH

HER2-amplificatie in niet-maligne CIS Wesseling

Lymfeklier zwelling bij patiënt met folliculair lymfoom

Folliculair lymfoom

FISH geeft duidelijk signalen Maar geen morfologie

Wesseling

FISH

clonaliteitsanalyse


Anno 2009 beschikken we over heel veel moleculaire methode om genetische afwijkingen te detecteren

EBER-ISH

Folliculair lymfoom

1)


2)


3)


Moleculaire diagnostiek Diagnostische uitslag door de patholoog is de integratie van de verschillende applicaties immunofenotypering

normaal

Folliculair lymfoom

Klinische achtergond Anamnese Voorgeschiedenis histopathologie

normaal

Folliculair lymfoom

5

Het materiaal dat bij de pathologie voorhande is:

Het materiaal dat bij de pathologie voorhande is:

• Formaldehyde-gefixeerd/paraffine-ingebed weefsel • Vriesmateriaal • Cytologisch materiaal (urine, beenmerg, ruggemergvocht, BAL, puncties) * Bijzondere fixatieven (ontkalkt, plastic coupes)

• Formaldehyde-gefixeerd/paraffine-ingebed weefsel • Vriesmateriaal • Cytologisch materiaal (urine, beenmerg, ruggemergvocht, BAL, puncties) * Bijzondere fixatieven (ontkalkt, plastic coupes)

60-70% tumorcellen

Voor diagnose van maligniteiten is mbt moleculaire pathologie van verrijking van tumorweefsel noodzakelijk Kwaliteit van DNA verschilt enorm geïsoleerd uit verschillende voorhande zijnde weefsels

Op geleide van de patholoog macro- of microdissectie

< 30% tumorcellen

BioMed multiplex DNA Quality Control PCR

M

M

600 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

600 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

M

DNA extracted from formaldehyde-fixed/ paraffin-embedded tissue blocks 600 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

“Ladder” PCR op DNA om kwaliteit te testen

DNA extracted from freshly frozen tissues

vries ***

Kwaliteit van DNA uit paraffine-materiaal is veel slechter

mc

T02-36613

bl

T03-12964

T03-65591

L

T04-31990

L

M vries

par1

par2

vries

par1

Belangrijkste technieken in de moleculaire diagnostiek van de Pathologie:

par2

Steeds achtereenvolgend onverdund, 1/10, 1/100 en 1/1000 verdund.

* Standarisatie van de DNA-extractie methode * Optimale verrijking van tumormateriaal * Kleine hoeveelheden cellen * Aangepaste PCR condities

Hybrid Capture In situ hybridizatie (FISH/BRISH) PCR-sequencing PCR/fragment-analyse RT-PCR High-melting-resolution (expression-array-analysis) Next-generation-global sequencing

6


1)


2)


3)


Werkgroep Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie (NVVP) Doel:

Werkgroep Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie (NVVP) Activiteiten:

• stimuleren moleculaire diagnostiek binnen pathologie in NL • borging en verbetering van kwaliteit • vernieuwing moleculaire diagnostiek • inventarisatie en afstemming • advies • informatie uitwisseling • opleiding en training 4 pathologen, 4 moleculairmoleculair-biologen en 2 analisten allen werkzaam bij pathologie

Jaarlijkse rondzending moleculaire diagnostiek Jaarlijkse Moleculaire dag (met accreditatie) Opstellen van protocollen/richtlijnen voor kankertypes Organisatie internationale HPVHPV-rondzending Voorstel opleidingseisen pathologen Voorstel opleidingsplan voor klinisch moleculair bioloog Kwaliteitsrichtlijn BVOBVO-HPVHPV-triage Kwaliteitsrichtlijn moleculaire pathologie (2006)


Voorwaarden om optimale kwaliteitscontrole (richtlijnen van NVVP-WMDP 2006) Voor kwaliteitsborging is nodig: * Interne experimentele controles * Interne toetsing van analyses * Verslaglegging volgens praktijkrichtlijnen * Voldoende kwantiteit * Specifieke expertise (moleculair-bioloog, HLO-analisten en pathologen) * Bijscholing en training * Fysiek gescheiden ruimtes (voorkomen van contaminaties) * Specifieke inrichting laboratoria * Protocolering werkwijze (SOP) * (verplicht) participeren aan QC-rondzendingen moleculaire pathologie * Actieve interactie tussen verschillende PA-labs

laatste opmerkingen

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998)

Moleculaire diagnostiek: Het gebruik van moleculair-biologische technieken om genetische veranderingen (op RNA/DNA niveau) te detecteren Deze moleculaire veranderingen te gebruiken als aanvullende informatie in de differentiaal diagnostiek * Daarin heeft elke discipline zijn eigen specifieke expertise en inbreng en vereist een optimaal samenspel tussen patholoog en (klinisch) moleculair bioloog.

[email protected] www.moleculaire-pathologie.nl

Indicaties bot-/weke delen tumoren

target

Ewing/PNET Rhambdomyosarcoom (alv) Rhambdomyosarcoom (emb) Desmoplastische rondceltumor MF synoviosarcoom Zenuwschede tumor Myxoid liposarcoom Myxoid chondrosarcoom Clear cell sarcoom BF synoviosarcoom Neuroblastoom

t(11;22), t(21;22), t(7;22) t(1;13), t(2;13) +2q, +8, +20, del 11p15 t(11;22) t(X;18) NF1-mutatie t(12;16) t(9;22) t(12;22) t(X;18) N-MYC amplificatie www.moleculaire-pathologie.nl

7

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998)

Aanbevelingen van de VNV-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998)

Indicaties voor epitheliale tumoren

target

Indicaties hereditaire problematiek

target

MRD bij prostaatcarcinoom MRD bij colon-/maagcarcinoom MRD mammacarcinoom Maligne mesothelioom vs reactief DD Bowen/ bowenoide papulose DD endometrium/cervix adenocarc Nasopharynx carcinoom

PSA-expressie CK20; CEA epxressie CEA expressie del 1p, 3p, 6q, 22q HPV HPV EBV

HNPCC/AFAP

MSI, LOH


Indicaties divers Multiple tumoren (primair vs metastase) Verwisseling materiaal Floaters Tweelingidentificatie Partieel Mola onderzoek

p53, LOH, X-inactivatie allelotypering, XY-ISH allelotypering allelotypering tri/tetrasomie www.moleculaire-pathologie.nl

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998) Indicaties voor cytologie/biopt

target

PapII/IIIa (cervix) Cervix CINI/II vs CINIII Reactief vs maligniteit (pancreas) primair/follow-up (blaas/urine) primaire longcarcinoom

HPV HPV RAS-mutatie LOH, p53 KRAS-mutatie

Indicaties melanoom MRD en micrometastase Spitz naevus vs nodulair melanoom

numeriek, LOH TCR www.moleculaire-pathologie.nl

Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair Diagnostische Pathologie (1998) Indicaties voor niet kweekbare microorganismen Pseudolymfoom vs huis BNHL Lymfoepithelioma vs maagcarcinoom Oesofagitis Granulomateuze ontsteking Kattekrab ziekte Virale myo/endocarditis Chlamydia urogenitale infectie Onbegrepen intra-uteriene vruchtdood Onbegrepen luchtweginfecties

target

Borrelia burgdorferi EBV CMV TBC Bartonella henselae enterovirus Chlamydia trachomatis PARVO, CMV, HSV Ch. Pneumoniae, M. Pneum, TBC, HSV www.moleculaire-pathologie.nl

8

Moleculaire Diagnostiek binnen de Pathologie in Nederland

Recommend Documents