CML en stoppen moleculaire diagnostiek Moderator
Dr. P. Kuiper-Kramer 1st author / speaker
Dr. Bert A. van der Reijden
[email protected] Dept of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboudumc
Conflict of Interest Disclosure Form In accordance with the rules of the Health Care Inspectorate (IGZ)
Name:
Bert van der Reijden
Affiliation:
Radboudumc
☐
I have no potential conflict of interest to report
I have the following potential conflict(s) of interest to report
Type of affiliation / financial interest
Name of commercial company
Receipt of grants/research supports: Receipt of honoraria or consultation fees: Participation in a company sponsored speaker’s bureau: Stock shareholder: Other support (please specify): Scientific advisory board
CML advisory board Novartis
BCR-ABL: ABL is tyrosine constitutieve kinasefosforylering ABL is cytoplasmatisch eiwit Groeifactoren: activatie ABL Fosforylatie bindingspartners Celdeling , apoptose
ABL
ATP p
Signaal tr eiwit
BCRABL ATP
Fosforylatie zonder groeifactor p
Signaal tr eiwit
Toename celdeling Apoptose remming
Therapie gericht op BCR-ABL Imatinib lijkt op ATP, bindt ABL beter dan ATP
p BCRABL
Imatinib
Signaal tr eiwit
Celdeling Apoptose
10 jrs overleving van <50% naar ~90%
Tumorgrootte en reductie bij BCR-ABL positieve CML Aantal cellen Therapie (mnd)
1012 Diagnose
1011 3
1010 6
109 3*107 12 >12
Fusiegendetectie met PCR op cDNA (RNA) niveau BCR
ABL genomisch DNA
transcriptie en RNA splicing
fusie mRNA
reverse transcriptie fusie cDNA: RT-PCR Primers Polymerase, dNTPs, MgCl2 Genomisch DNA: breukpunten in grote intronen maar 1 kopie per cel RNA/cDNA:
RNA splicing: breukpunten bij elkaar meerdere kopieen per cel
Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qPCR BCR
ABL
cDNA 1 cyclus
2
2 cycli
4
3 cycli
8
UV
Q 4 cycli
16
n cycli
2n
R
Fluorescente DNA probe R = reporter Q = quencher licht wordt geabsorbeerd
Degradatie fluorescente probe tijdens amplificatie
Q
R
exonuclease activiteit polymerase: destructie probe
Q
R Geen absorptie licht Gemeten tijdens PCR (real time) Signaal = hoeveelheid PCR product
Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qPCR BCR
ABL
cDNA 1 cyclus
2
2 cycli
4
3 cycli
8
4 cycli
16
n cycli
2n
Exponentiële toename Signaal evenredig starthoeveelheid
qPCR amplificatieplot: toename signaal per cyclus
Fluorescent signaal
exponentiële fase
Drempelwaarde
0
PCR cycli
43
Signaal exponentiële fase correleert met oorspronkelijke cDNA concentratie
Kwantificering gebaseerd op calibratiereeks
Verdunningsreeks
0.01%
0.1%
1%
10%
cycli
100%
Bijv K562 cellijn
BCRABL sample
Vergelijk aantal cycli met calibrator cycli
qPCR normalisatie en voldoende input: referentiegen
Referentiegenen PBGD, GUS, ABL Verdunningsreeks: normalisatie Vaste cDNA input: gedefinieerd aantal cycli 1 cyclus meer: Q maal 2 1 cyclus minder: Q delen 2
Gevoeligheid: 1 op 100.000 gehaald?
BCRABL internationale schaal (%)
Major molecular repons (MMR), MR4 en MR4,5 bij CML
100
Maximale waarden na Imatinib
10
3 mnd
1
6 mnd
0.1
12 mnd MMR MMar3
0.01
MR4 MR4,5
Zwak positief Detectie limiet
100% IS: mediaan 3x30 BCRABL/BCR waarden 0.1% = major moleculaire respons
Tijd
Relatieve hoeveelheid samples
Uitstekende relatieve BCRABL kwantiteiten
0,1 0,09
n = 21 labs Maximaal 4x hoger tov ref Minimaal 4x lager tov ref
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 REF
10000-voudige verdunning tov 100-voudige BCRABL verdunning Gemiddeld ref = 0,025 (40-voudige verdunning)
BCRABL niveau
Kinetiek zeer goed, absolute waarden sterk verschillend
Oorzaken Referentiegen Berekening 1 ipv 100 Correctie gewenst BCRABL verdunning
Bepalen conversiefactor (CF)
Laboratorium A (centraal lab) Laboratorium B (deelnemend lab) 30 patiëntensamples Lab B naar Lab A Vergelijk data: conversiefactor
BCR-ABL lokaal * CF = BCR-ABL IS Iedere 2 jaar herhalen
Absolute waarden zeer vergelijkbaar naar conversie
BCR-ABL qPCR bewerkelijk, hoog afbreukgehalte
Poolen 3 buizen bloed Leukocyten- en RNA isolatie cDNA synthese BCR-ABL qPCR sample BCR-ABL qPCR calibratiereeks qPCR normalisatiegen Interpretatie resultaten
BCR-ABL qPCR in een cartridge (Cepheid technologie)
200 ul bloed Lysis stap (10 min) Pipetteer in cartridge
11 kamertjes RNA isolatie cDNA synthese BCRABL qPCR Normalisatie qPCR Resultaat na 2,5 uur Op Internationale Schaal Sensitiviteit indien negatief
Efficiency Genexpert Cepheid vs BCRABL qPCR Reductie “hands on” tijd (3:19 hrs vs 0:28 hrs) Spaghetti diagram Conv qPCR
Courtesy Nancy Boeckx, Leuven University
Spaghetti diagram Cepheid
Conclusies BCRABL chronische myeloide leukemie
Monitoren therapierespons: BCRABL qPCR BCRABL waarden op Internationale schaal 3 maanden na TKI: < 10% 6 maanden na TKI < 1% 12 maanden na TKI <0.1% Cepheid technologie: Geen conversiefactor nodig Resultaat < 24 uur
Additionele ABL puntmutaties in BCRABL: resistentie 10% van patiënten resistentie Vaak mutatie ATP-bindend domein BCRABL Imatinib bindt niet meer, ATP wel: recidief
BCRp ABL Imatinib ATP
Bewijs werking middel p
Signaal tr eiwit
Detectie ABL mutaties in BCRABL BCR
ABL
cDNA Amplificatie BCR-ABL: >10-3 Amplificatie tyrosinekinasedomein Sanger sequencen
Resistent? Puntmutatie Imatinib Nilotinib Dasatinib Ponatinib L248V Q252H E255V T315I
Ja Ja Ja Ja
Nee Nee Ja Ja
Nee Ja Nee Ja
Nee Nee Nee Nee
Resistentie: verlies Imatinib respons na initiële daling BCRABL internationale schaal (%)
100 10 1
Puntmutaties meetbaar boven MMR
0.1 0.01
Zwak positief Detectie limiet
Time
