Virologische moleculaire diagnostiek in een labo zonder viruskweken

Virologische moleculaire diagnostiek in een labo zonder viruskweken

Virologie geschiedenis On 14th May 1796, Edward Jenner used cowpox-infected material obtained from the hand of Sarah Nemes, a milkmaid from his home village of Berkley in Gloucestershire to vaccinate 8 year old James Phipps. On 1st July 1796, Jenner challenged the boy by deliberately inoculating him with material from a real case of smallpox ! He did not become infected !!! hdb Virologische mol biol

3

Lijstje humane virussen • • • • • • • • • • •

Adenoviruses Arboviruses - Arthropod-borne Viruses Arenaviruses - Lassa virus Astroviruses Bunyaviridae - Hantavirus Caliciviridae - Norovirus Coronaviridae - newly arrived: SARS Filoviridae - Ebola Flaviviridae - Hepatitis C Virus, Dengue, Yellow Fever Hepadnaviridae - Hepatitis B Virus Herpesviridae – – –

•

Alphaherpesvirinae - Herpes simplex-like viruses Betaherpesvirinae Cytomegalovirus (CMV) Gammaherpesvirinae - Epstein Barr Virus (EBV)

Orthomyxoviridae - Influenza Viruses

•Paramyxoviridae –Paramyxoviruses - Para-Influenza Viruses –Rubulaviruses - Mumps Viruses –Morbilliviruses - Measles Viruses •Papovaviridae - Papillomaviruses •Parvoviridae •Picornaviridae –Aphthoviridae –Cardioviridae –Enteroviridae –Rhinoviridae •Poxviridae •Reoviridae - Rotavirus •Retroviridae - Retroviruses HIV, HTLV •Rhabdoviruses - Rabies Viruses •Togaviridae –Rubiviridae - Rubella Viruses

hdb Virologische mol biol

4

Virologische diagnostiek • In België valt die eer te beurt aan de "klinisch bioloog", voor de gelegenheid soms omgedoopt tot "klinisch microbioloog" en heel soms: "klinisch viroloog" !


5

Virale diagnostiek 1 Geschiedenis:

• Filtreerbare ziekte (1909: Polio) • Na WO I : culturen in dieren, in diercellen, eieren,… • Na WO II (opkomst AB): celkweken, humane cellijnen Nu standaard techniek:

celkweken, humane cellijnen hdb Virologische mol biol

6

Virale diagnostiek 2 • Electronen microscopie • 1931


7

Virale diagnostiek

3

• Serologie: – Hemagglutinatie – ELISA – RIA – IF, IP (Ag detectie) – Western Blot – Monoclonale AS


8

Virale diagnostiek 4 • Moleculaire biologie ¾Hybridisatie gebaseerde testen ¾Amplificatie gebaseerde testen – Signaal amplificatie – Target amplificatie


9

Virale diagnostiek conclusie acute phase

time to result

laborious

price

++

++

Culture

Y

Microsc.

Y

+++

+++

+++

Serology

N

+

+

+

Mol biol

Y

+

++ to +

++

++

to

+++


10

Klinische microbiologie • Term die meestal meer slaat op de plaats van uitvoering ⇒ ("kliniek")

dan wel op de wijze van uitvoering ⇒ ("infectiebeleidsmanager" van de patiënt)


11

PROBLEM: Limited impact of clinical microbiology on infectious disease management ⇒ The underdevelopment of diagnostic microbiology has created the art of empiric therapy. Prof. J. Van Eldere : Eskulaap cyclus infectieziekten; 7 oktober 2003


12

Solutions for the problem

Improve impact of diagnostic microbiology on infectious diseases management

Prof. J. Van Eldere : Eskulaap cyclus infectieziekten; 7 oktober 2003


13

How to increase impact diagnostic microbiology • more reliable & clinically (therapeutically) meaningful results. • faster turn-around time: same day reporting, point of care testing.

Prof. J. Van Eldere : Eskulaap cyclus infectieziekten; 7 oktober 2003


14

Rapid HSV testing Manual of Clinical Microbiology; 5th ed. (1991) •

For non-life-threatening HSV infections, the availability of a diagnostic laboratory able to perform viral cultures is adequate. Since these infections can usually be recognized clinically, it generally is sufficient for a clinician to obtain virologic confirmation within several days of specimen submission. This can be accomplished readily with viral cultures. However, for life-threatening infections which mandate prompt antiviral therapy, an accurate and rapid diagnostic test for HSV must be available. The best currently available test is immunofluorescence staining. It has been shown that patients with HSV encephalitis are more likely to have a favorable outcome if their antiviral therapy is administered early in the infection. Since HSV encephalitis is a difficult infection to diagnose clinically, brain biopsies are recommended for these patients (58). hdb Virologische mol biol

15

Virale diagnostiek conclusie acute phase

time to result

Culture

laborious

price

Y

++ to +++

++

++

Microsc.

Y

+++

+++

+++

Serology

N

+

+

+

Mol biol

Y

+

+ to ++

++


16

Moleculair biologische virologische diagnostiek • Nieuw !! Î apparatuur, opleiding personeel, beperkt # kits, technisch complex, ervaring/know-how, interpretatie, contaminatieproblematiek, …

• Duur !! Î geen terugbetaling hdb Virologische mol biol

17

Moleculair biologische diagnostiek • Oprichting van de CMD's (2000) • Haperingen +++ • Microbiologie, hematologie, anatomopathologie • Opstellen lijst testen • Opstellen van indicaties Îhttp://www.uia.ac.be/cmd hdb Virologische mol biol

18

Mol biol virologie CMV: opvolging van Tx patiënten • (D +; R - ) en (D +; R +) • profylactische / pre-emptive / curatieve aanpak • pre-emptive op basis van 'viremie'


19

Mol biol: CMV 10000 1000

R/

100

CMV IgM

CMV IgG 10

PCR

1 0,1

29 /1 1/ 19 99 7/ 12 /1 99 16 9 /1 2/ 19 99 27 /1 2/ 19 99 10 /0 1/ 20 00 24 /0 1/ 20 00

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0


HTX: 03/11/99

20

Mol biol: CMV 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1000 100

CMV IgM 10

CMV IgG

PCR 1

25 /1 0/ 8/ 99 11 22 /99 /1 1/ 2/ 99 12 10 /99 /1 2 16 /99 /1 2 28 /99 /1 2 24 /99 /0 1/ 00

0,1


HTX: 05/10/99

21

Mol biol: HSV • Indicaties voor toepassing van moleculaire amplificatietechnieken voor de detectie van Herpes Simplex Virus (HSV1-HSV2) •

1. Patiënten met neurologische symptomen: encefalitis, meningoencefalitis, meningitis, myelitis.

•

2. Patiënten met ophthalmologische aandoeningen: keratitis, uveïtis, acute retinitis.

•

3. Herpes neonatorum

•

4. Immuungecompromiteerde patiënten met slokdarm-, en darmletsels, de visu waargenomen


22

Mol biol: HSV CASUS: Man 35j • Dag 0: Spoed Hoofdpijn, lichtschuw, meningeale prikkeling

•

•

CSV: 56 WBC, 3 RBC Eiw: nl, Glu: nl Dag 1: +- stabiel Kweek: neg Herpes PCR: POS Dag 2: deterioratie controle CSV: POS CT-scan : POS hdb Virologische mol biol

23

Mol biol virologie • Herpes encefalitis: 40 gevallen/jaar België • Herpes diagnostiek: +++ • RIZIV: terugbetalingsmodaliteiten op basis van aantonen virus ! • Snelle, simpele, goedkope, betrouwbare test hdb Virologische mol biol

24

Mol biol virologie Snelle, simpele, goedkope, betrouwbare test •DNA-extractie + klassieke PCR + gel-electroforese •Staalprocessor + Real-time PCR hdb Virologische mol biol

25

Real time PCR


26

Real time PCR


27

Aanbod testen Ê • Diagnostiek meer doorgedreven – Ag testen Ê Ê (Rota, RSV, Influenza,…)

• Diagnostiek accurater – Differentiatie HSV / VZV of HSV 1 / 2

• Diagnostiek complexer – Immuun-gecompromiteerde patiënten, know-how infectiologie Ê, uitzonderingen

• Diagnostiek uitgebreider – HCV, SARS-virus, hMPV, … hdb Virologische mol biol

28

Aanbod testen uitbreiden • Respiratoir panel (RSV, influenza, para-influenza, hMPV, adeno, …) • Hepatitis panel • GI panel


29

Accuraatheid verhogen • Meerdere targets/virus • Meerdere parameters/ virus • Meerdere virussen/ ziekte-episode • Link met bacteriologie


30

Micro-array technologie

Moleculair biologische diagnostiek snelle simpele goedkope betrouwbare

+ + ? + test


32

How to increase impact diagnostic microbiology • more reliable & clinically (therapeutically) meaningful results. • faster turn-around time: same day reporting, point of care testing.

Prof. J. Van Eldere : Eskulaap cyclus infectieziekten; 7 oktober 2003 hdb Virologische mol biol

33

Aanbod testen uitbreiden • Respiratoir panel (RSV, influenza, para-influenza, hMPV, adeno, …) • Hepatitis panel • GI panel Wie gaat dat betalen ?


34

Mol biol diagnostiek CASUS Urgentiedienst: – vrouw, 25 jaar – 2 dagen voordien: malaise, hoofdpijn, keelpijn, t° Ê D/ angina

R/ Biclar

– nu: braken, 38.5°, nekstijf – LP: 580 WBC (70% neutro), 10 RBC Gramkleuring = neg hdb Virologische mol biol

35

CASUS Hospitalisatie: – hospitalisatie (voorzien minimum 7d) – cefalosporines 3e gen IV – kweek = negatief – evolutie: snel gunstig


36

CASUS: Kosten Te voorzien kostenplaatje 7d: – hospitalisatie : 2.000 € – cefalosp 3e gen (75 € / dag): 520 €

Totaal: > 2.500 €


37

CASUS Hospitalisatie: – hospitalisatie (voorzien min 7d) – cefalosporines 3e gen IV – kweek = negatief

Î Labo: detectie enterovirussen


38

CASUS: Kosten met mol biol Detectie enterovirus: POS Îhospitalisatie Þ 2 dagen

– hospitalisatie : 570 € – cefalosp 3e gen (75 € / dag): 75 à 150 € – Labo: detectie entero: 83 €

Totaal: ± 800 € Besparing: 2500 - 800 = 1.700 € hdb Virologische mol biol

39

Klinische microbiologie • Term die meestal meer slaat op de plaats van uitvoering ⇒ ("kliniek")

dan wel op de wijze van uitvoering ⇒ ("infectiebeleidsmanager" van de patiënt)


40

Virologische moleculaire diagnostiek in een labo zonder viruskweken

Recommend Documents