Moleculaire markers & risicostratificatie in 2020
Belangenverklaring NAAM :J.H. Jansen ORGANISATIE: Radboudumc In overeenstemming met de regels van de Inspectie van de Gezondheidszorg (IGZ), zijn sprekers verplicht een belangenverklaring in te vullen. Wij vragen u daarom dit formulier in te vullen. Pas als u dit formulier heeft ingevuld is het voor u toegestaan om uw abstract te presenteren. U bent verplicht om uw presentatie met dit formulier te beginnen.
VERKLARING x Ik heb geen “potentiële” belangenverstrengeling Ik heb de volgende mogelijke belangenverstrengelingen
Type van verstrengeling / financieel belang Ontvangst van subsidie(s)/research ondersteuning: Ontvangst van honoraria of adviseursfee: Lid van een commercieel gesponsord ‘speakersbureau’ Financiële belangen in een bedrijf (aandelen of opties) Andere ondersteuning (gelieve te specificeren):
Naam van commercieel bedrijf
Gebruik van moleculaire diagnostiek
I:
classificatie
II:
Aanpassen van behandeling op basis van risicoprofiel (bv stamcel transplantatie)
III:
Toepassing van therapie die zich richt op gemuteerde eiwit (bv tyrosine kinase inhibitors bij CML)
IV:
Gevoelige bepaling van restziekte, vroeg ingrijpen bij ontwikkelend recidief
Mutaties definieren verschillende prognostische groepen (AML)
Survival 100% 90
7%: PML-RAR
80 70
20%: CBF (AML1-ETO & CBFB-MYH11)
60 50 40
overall
30 20
1-2%: Bcr-Abl
10 0 0
1
25%: Flt3-ITD
10%: MLL
(years) 2
3
4
5
6
7
=> Behandeling wordt afgestemd op risicoprofiel
Mutaties definieren bepalen gevoeligheid voor gerichte therapie
Survival 100%
atra
90
7%: PML-RAR
80 70
20%: CBF
60 50 40
Overall
30 20
1-2%: Bcr-Abl
10 0 0
1
FLT3 inhibitors 25%: Flt3 eg PKC412
10%: MLL
(years) 2
3
4
5
6
7
=> Behandeling wordt afgestemd op type mutatie
CML: kwantitatief vervolg van subklinische ziekte
Bcr-abl abl positieve cellen
I
II
III
Huidige moleculaire diagnostiek bij AML
Mutaties
Incidentie (%)
Prognose
targeted behandeling
PML-RAR CBFB-MYH11 AML1-ETO Flt3 EVI1 C/EBPA NPM1
5-7 10 10 30 10 7 30
goed goed goed slecht zeer slecht goed goed
ATRA, arsenicum)
PKC412 /AC220
Klassieke technieken voor moleculaire diagnostiek
Cytogenetics FISH SNP-arrays Soutern blotting PCR voor specifieke mutaties Q-PCR voor gen-expressie
Nieuwe methode
Cytogenetics FISH SNP-arrays Soutern blotting PCR voor specifieke mutaties Q-PCR voor gen-expressie
Next generation sequencing (NGS)
Next Generation Sequencing
Sequentiele wasstappen met nucleotiden: bij incorporatie komt er een H+ vrij
Klassieke technieken voor moleculaire diagnostiek Basale principe: op een drager (glas, chip) wordt 1 DNA of cDNA molecuul aangebracht Op 1 lokatie, waarna een sequentie reactie wordt ingezet op het geheel
Next Generation Sequencing
1 chip bevat 11 x 106 sensors
Individuele sequenties worden vergeleken met referentie: aantal “reads” bepaalt gevoeligheid
Diepte: whole genome: 10-20 whole exome 50-100 amplicon-based 1000 en meer
Kosten van sequencing dalen exponentieel
Sequencing capaciteit per machine/dag stijgt exponentieel
1 genome = +/- 3 x 10E9 baseparen
De meeste klassieke moleculair diagnostische technieken zijn in principe door NGS vervangbaar mutaties Kwantitatief gen expressie (sequencen van cDNA) Fusie genen (software in ontwikkeling) Allel frequenties (mbv SNP analyse) komende jaren nog veel optimalisatie nodig: zowel hardware- als softwarematig
Kunnen we alle extra informatie interpreteren ?
Hematopoiesis
Stem cells
mature end cells IL2
B/T cells
IL4 FLT3-Ligand SCF
MCSF
Monocytes macrophages
GCSF IL6 IL3
granulocytes TPO GMCSF
IL5
IL7
platelets
EPO EPO
bone marrow
erythrocytes
Pheripheral blood
Pathways involved in proliferation and differentiation control
P P
Cell cycle G0
G1
d
d
M
S G2
d d
Gene transcription
In case of abberant regulation: p53 is activated leading to apoptotis
Biologische classificatie van AML
Gene
Frequency
Prognostic impact
Gene function
NPM1
25-35%
Favorable
Nuclear import, apoptosis
FLT3 ITD
20-25%
Unfavorable
Growth factor receptor
DNMT3A
20-23%
Unfavorable
Epigenetic transcription regulation
Various MLL
10-15%
Unfavorable
Epigenetic transcription regulation
N-RAS/K-RAS
10-15%
Intermediate
Signal transduction
CEBPA
10-15%
Favorable (bi-allelic mutations)
Transcription factor
CBFB-MYH11
10%
Favorable
Transcription factor
AML1-ETO
10%
Favorable
Transcription factor
TET2
8-13%
Unfavorable
Epigenetic transcription regulation
IDH2
6-10%
Unclear
Epigenetic transcription regulation
PML-RAR
5-10%
Favorable
Transcription factor
ASXL1
5-10%
Unfavorable
Epigenetic transcription regulation
RUNX1
5-10%
Unfavorable
Transcription factor
FLT3-TKD
5-7%
Intermediate
Growth factor receptor
WT1
3-10%
Unclear/poor
Transcription factor
IDH1
3-9%
Unclear
Epigenetic transcription regulation
PTPN11
3-5%
Intermediate
Signal transduction
C-KIT
2-6% (high in CBF leukemia)
Unfavorable in CBF leukemia
Growth factor receptor
CBL
<2% (16% in inv16)
Unclear
Signal transduction
Biologische classificatie van MDS
Gene
Frequency
Gene function
TET2
20-25%
Epigenetic regulation
ASXL1
15 %
Epigenetic regulation
RUNX1
15 %
Transcription Factor
SF3B1
10-20% (up to 80% in RARS-T)
Splicing Factor
CSF1R
10-15%
Growth factor receptor
NRAS (KRAS)
10-15%
Signal Transduction
TP53
10 %
Transcription factor, apoptosis
U2AF35
10 %
Splicing Factor
SRSF2
10%
Splicing Factor
EZH2
5-10%
Epigenetic regulation
DNMT3A
5-8%
Epigenetic regulation
IDH1
5-7 %
Epigenetic regulation
ATRX
5%
Epigenetic regulation
JAK2
5%
Signal Transduction
C/EBPa
5%
Transcription Factor
NPM1
3-5%
Nuclear import, apoptosis
IDH2
3-5%
Epigenetic regulation
MLL
3%
Epigenetic regulation
ETV6
3%
Transcription Factor
UTX
3%
Epigenetic regulation
FLT-3
2%
Growth factor receptor
ZRSR2
1-3%
Splicing Factor
PRPF40B
2%
Splicing Factor
SF3A1
1-2%
Splicing Factor
SF1
1-2%
Splicing Factor
CBL
1-2%
Signal Transduction
U2AF65
0-1%
Splicing Factor
Biologische classificatie van gemuteerde genen in AML en MDS
extracellular
I: growth factor receptors cytoplasm
II: signal transduction molecules
nucleus
III:cell cycle
IV:transcription factors VI: Epigenetic regulators V:Apoptosis
VII: RNA splicing factors
Biological classification of genes mutated in MDS with a frequency of > 1%
•
I: Growth factor receptors:
CSF1R / FLT3
•
II: Signal transduction:
RAS / JAK2 / CBL
•
III: Transcription factors:
C/EBPa / RUNX1 / ETV6
•
IV: Cell cycle regulators:
•
V: Apoptosis:
TP53 / NPM1
•
VI: Epigenetic regulators:
TET2 / IDH1 / IDH2 / DNMT3A / EZH2 / ATRX/ MLL / ASXL1 / UTX
•
VII: Spliceosome:
SF3B1 / SF1 / PRPF40B / U2AF65 / U2AF35/ SF3A1 / SRSF2 / ZRSR2
Mutaties in hetzelfde biologisch pad komen nbiet samen voor bij een patient
IDH-1
5-10%
2-oxoglutarate
DNMT3A
TET 2
5%
20-25%
Transcription repression
IDH-2
The long tail of cancer (MDS)
Campbell Blood 2013
Bij individuele patienten meestal meerdere mutaties
Campbell Blood 2013
Clonale evolutie van verschillende subcloons
Walter NEJM 2012
Clonale evolutie van verschillende subcloons
Walter NEJM 2012
Conclusies en kanttekeningen
• Next generation sequencing zal in de komend jaren snel zijn intrede doen. • 2% van ons genoom is coderend voor eiwitten. Belang van overige sequenties (miRNA, lncRNA, SNPs, Epigenetische code etc) is nog lang niet opgehelderd • Voor directe klinische praktijk is nog lang niet altijd duidelijk wat het nut van alle mogelijke informatie is: nut staat of valt bij mogelijkheid om therapie op basis van de verkregen informatie aan te passen. Dit wordt lastiger naarmate er meer subgroepen ontstaan. • Belang van subclones en clonale evolutie • Hopelijk convergentie door begrip van biologische werkingsmechanismen van mutaties, waardoor groepering van mutaties mogelijk wordt • Eerst verbreding, daarna versmalling ? • Komende 10 jaar: hardware heeft zeer korte afschrijvingstijd • Gezien dalende kosten, stijgend throughput en stijgende complexiteit: dom screenen, slim analyseren
