In Situ Hybridisatie in de routine pathologie diagnostiek Winand Dinjens Afdeling Pathologie Josephine Nefkens Instituut (JNI) Erasmus MC, Rotterdam Pathologendagen; 11 april 2007, Ede
In Situ Hybridisatie (ISH): *
Methode om nucleïne zuren (DNA en RNA) zichtbaar te maken in hun natieve locatie in de cel (in situ)
*
Gebaseerd op de affiniteit die complementaire DNA of RNA strengen voor elkaar hebben (hybridisatie) en het zichtbaar maken van die interactie
In Situ Hybridisatie (ISH): *
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”: Immunocyto/histochemie: specifieke interactie antilichaam - antigeen In situ hybridisatie: specifieke interactie probe – target DNA/RNA (hybridisatie)
en het zichtbaar maken van die interacties
In Situ Hybridisatie (ISH, FISH)
Single copy gene FISH #18q, probes centro- and telomeric SYT gene
Chromosome copy number determination # 1 centromere probe CISH
RNA-ISH Seminal Vesicle Secreted Protein 2 35S-probe
Dig-probe
In Situ Hybridisatie (ISH): *
Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”: Target
Probe
DNA
DNA
DNA
RNA
RNA
DNA
RNA
RNA
In Situ Hybridisatie (ISH): Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”: *
Weefselcoupe (vries of routine paraffine)
*
Weefsel toegankelijk maken (paraffine: digestie)
*
Denaturatie van de in situ target (enkelstrengs maken)
*
Enkelstrengs probe(s) toevoegen
*
Incuberen (hybridiseren)
*
Wassen, interactie zichtbaar maken (vgl IHC)
In Situ Hybridisatie (ISH): Vorm van “affiniteits cyto/histochemie”: *
Interactie van probe met target DNA of RNA zichtbaar maken (vgl IHC)
-
Fluorescent label: FISH
(FITC, TRITC, SpectrumGreen,
SpectrumOrange Texas red etc)
-
Chromogeen: CISH (PO, AP, Silver)
In Situ Hybridisatie (ISH): FISH
CISH
Morfologie
-
+
Overlappende kernen
-
+
Out of focus
-
+
Autofluorescentie
-
+
Evaluatietijd
-
+
Houdbaarheid
-
+
Speciale microscoop
-
+
Gevoeligheid
+
-
Multiple probes
+
-
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Virus detectie (DNA of RNA)
*
Numerieke chromosomale afwijkingen
*
Chromosomale translocaties (lymfomen en sarcomen)
*
Gen-amplificatie/deleties
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Virus detectie (DNA of RNA)
EBV RNA ISH “EBER”
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Numerieke chromosomale afwijkingen - Mola diagnostiek (triploidie) - weefselverwisseling - Blaaskanker (recurrence) Urovision: p16 probe en chromosoom 3, 7 en 17
Chromosome copy number determination Complete mola, # 1 ISH
Chromosome copy number determination Partial mola, # 1 ISH
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Chromosomale translocaties -
Lymfomen:
Burkitt (like):
t(14;18)
Diffuse large B-cell:
t(8;14), t(14;18)
Folliculair:
t(14;18)
Mantel cell:
t(11;14)
MALT:
t(11;18)
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Chromosomale translocaties - Sarcomen: Synoviosarcoma:
t(X;18)
Alveolair Rhabdomyo: t(2;13), t(1;13) Ewing’s/PNET:
t(11;22), t(21;22), t(7;22) t(17;22), t(2;22)
Myxoid liposarcoom:
t(12;16), t(12;22)
Dual-fusion probes
Beide fusiepartners bekend
a
Dual-fusion probes
1 fusiepartner (breuk) bekend
Dual color break-apart probes
1 fusiepartner (breuk) bekend
Chromosome translocation (break) FKHR Break Apart Probe 13q14 Region Telomere
Centromere
FKHR 3’
~720 kb
ELF1
5’
~650 kb
RH45465
RH26447
D13S320
RH93960
RH98592
SHGC-79327
SHGC-142993
13q14 region
Dual Color Break Apart FKHR Normal
Abnormal
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek *
Gen-amplificatie - Her2/neu (17q11), mamma - EGFR (7p12), long - C-MYC (8q24), prostaat
*
Deleties - PTEN (10q23), gliomen - 1p36/19q13, gliomen - P16 (9p21), blaas
In Situ Hybridisatie (ISH) in de routine pathologie diagnostiek: Succes van Her2 FISH en CISH: - procedure robuust - detectie amplificatie - kit format - klinische impact - incidentie
ISH in de pathologie diagnostiek: Problemen: - over/onder digestie (fixatie) - weefselarchitectuur - interpretatie (vals pos/neg), getrunceerde kernen (deleties), break-aparts - genoom van kanker cel (zeer) complex CONTROLES: procedure, neg/pos, binnen zelfde coupe, externe QC (werkgroep rondzendingen, SKKP)
In Situ Hybridisatie (ISH) in de routine pathologie diagnostiek: Toekomst: - betere toegangkelijkheid paraffine - meer kits - multicolor combinatie IF-FISH - multiple targets (Urovision) - meer translocaties (carcinomen) - automatisering (procedure en evaluatie)
