Serologische testen in de routine diagnostiek: een update

Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw

Serologische testen in de routine diagnostiek: een update Dr. Ellen Van Driessche, DVM, MSc, PhD

Serologie in routinediagnostiek: update 1. Inleiding

2. Serologische testen 1. Agar gel precipitatie test (AGPT) 2. Agglutinatietest (AG) 3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI) 4. ELISA

3. Serum poolen – interpretatie? 4. Conclusies

2




3

Inleiding: antigeen • De meeste effectieve antigenen zijn grote, rigide (vaste vorm), chemisch complexe moleculen en normaal nieteigen aan het dier of mens

• Epitoop = het deel van het antigeen dat herkend wordt door de antistof • Soorten: bacterie, virus, dierlijke cel ...

4

Inleiding: antistof Er bestaan verschillende antistoffenfracties die verschillende eigenschappen hebben: IgG 1 monomeer, agglutinerend IgA 1-2 monomeren, agglutinerend

IgM begin infectie, agglutinerend, 5 monomeren IgD 1 monomeer

IgE 1 monomeer Elke serologische test kijkt slechts naar een deel van de immuunrespons 5

Inleiding: antigeen-antilichaambinding • Komt tot stand door niet-covalente krachten: ‐ zwakke krachten ‐ talrijk en daardoor zeer sterk • Evenwichtsreactie: Ag + As  Ag-As

6

Inleiding: affiniteit • Sterkte van de binding tussen 1 epitoop van het antigeen en 1 antigeen-bindende zijde van het antistof • Of vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden • Beïnvloedende parameters : pH, temp, reactietijd, vaste fase……

•  AVIDITEIT : functionele term die de prestatie van een POLYKLONAAL antiserum in een welbepaalde test weergeeft Polyklonaal antiserum bevat antistoffen gericht tegen verschillende epitopen van een antigeen Monoklonaal antiserum bevat antistoffen tegen slechts 1 epitoop van een antigeen

7

Inleiding: sensitiviteit & specificiteit Testkarakteristieken van specifieke test:

1. Sensitiviteit Kans (%) dat een test een positief resultaat geeft in een populatie 100% positief voor de geteste ziekte

Maat voor vals-negatieve resultaten bv. PRRSv Se = 98,8%

2. Specificiteit Kans (%) dat een test een negatief resultaat geeft in een populatie 100% negatief voor de geteste ziekte Maat voor vals-positieve resultaten bv. PRRSv Sp = 99,9% 8




9

AGPT: agar gel precipitatie test Algemeen principe precipitatie Equivalentiepunt =

Conc immuuncomplexen

Y YY

precipitatielijn

Y Y

Afnemende concentratie As

As

Y

YYYY

Y Y

Y

Afnemende concentratie Ag

Ag

10

AGPT: agar gel precipitatie test Principe :

antigeen in oplossing en te onderzoeken serum (As) diffunderen naar elkaar toe doorheen een gel

bij optimale concentratie zal precipitatie optreden

precipitaat wordt vastgehouden door de gel

11

AGPT: agar gel precipitatie test Praktische uitvoering (dubbele immunodiffusie)

Ag

As

12

AGPT: agar gel precipitatie test • Redelijk ongevoelige test : er moeten veel As en Ag aanwezig zijn zodat de grote complexen ontstaan • Met dit type test kan zowel Ag als As geïdentificeerd worden in serum • Geschikt Ag : 40000-60000 Dalton • Niet kwantitatief • pH buffer gel en temperatuur beïnvloeden de precipitatiereactie • In labo: pluimveeanalysen zoals Adeno, AI, IB, ILT, Marek, Reo 13

AGPT: agar gel precipitatie test • Voordelen ‐ Eenvoudige test ‐ Minimum 24h (overnacht incubatie) ‐ Lage kostprijs • Nadelen

‐ Lage sensitiviteit ‐ Lage specificiteit

14




15

Agglutinatietesten • Algemeen principe: Agglutinatie is een fenomeen gekenmerkt door een massaal samenklitten van partikels in suspensie ten gevolge van een As-Ag binding : er vormen zich aggregaten die met het blote oog of microscopisch zichtbaar zijn • Partikels : bacteriën, RBC, Ag met diameter van 0.1 - 10 µm (> dan bij precipitatie testen) : hoe meer epitopen, hoe betere agglutinerende capaciteit • IgM antistoffen beter agglutinerend dan IgG: IgM meer bindingsplaatsen

16

Agglutinatietesten Agglutinatie testen gevoeliger dan precipitatietest omwille van een toename in aviditeit en een betere detectie (AG is veel groter en vooral beter te zien) Agglutinatie: signaal vlugger optreden - langer waarneembaar Conc immuuncompexen

Equivalentiepunt = precipitatielijn

Y Y YY Y

Y

YYYY

Y Y

Y

Afnemende concentratie Ag Afnemende concentratie As 17

Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie • Deze test laat toe As aan te tonen tegenover bacteriële Ag of Ag gecoat op latex partikels • In labo: Rose-Bengaal test (Brucellose) : aantonen IgG1 test met lage aviditeit

POS

NEG

Ag Serum

18

Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie

POS

NEG

19

Agglutinatietesten • Voordelen ‐ Zeer snelle test (enkele minuten) ‐ Lage kostprijs

• Nadelen ‐ Lagere specificiteit door mogelijke interferentie met andere agglutinerende elementen in serum

20




21

Hemagglutinatie-inhibitietest Algemeen principe: • Staaltype: SERUM A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B C

D

E

F

G

H

1/2

• Opeenvolgende tweevoudige verdunningen van het serumstaal in de cupjes • Toevoegen van een constante hoeveelheid virus (4 HAU) : virus die kan binden aan receptoren op membraan van

RBC • Incubatie 1h – 20°C 22

Hemagglutinatie-inhibitietest Positief serum

Negatief serum

Y Y Y Y Y

Antistof Virus RBC

Toevoegen RBC

Y Y Y Y Incuberen

Y Y Y Y

23

Hemagglutinatie-inhibitietest Interpretatie: De HI-titer is het omgekeerde van de serumverdunning die nog juist inhibitie geeft van de hemagglutinatie, rekening houdend met de startverdunning van serum

24

Hemagglutinatie-inhibitietest Well n°

SIV - H1N1

SIV – H1N2 / H3N2

Parvovirus

1

2

20

8

2

4

40

16

3

8

80

32

4

16

160

64

5

32

320

128

6

64

640

256

7

128

1280

512

8

256

2560

1024

9

512

5120

2048

10

1024

10240

4096

25

Hemagglutinatie-inhibitietest Klinische interpretatie SIV: H1N2 / H3N2

interpretatie

H1N1

< 20

NEGATIEF

<4

≥ 20

POSITIEF

≥4

≥ 320

INFECTIETITER

≥ 64

• Seroconversie bij gepaarde sera: ‐ Titerstijging x4 ‐ bv. H3N2: 40  160 of 160  640

26

Hemagglutinatie-inhibitietest Klinische interpretatie Parvo

• Maternale immuniteit tot 5 mnd • Negatief, vaccinatie of infectie titer

resultaat

interpretatie

<8

NEGATIEF

Niet besmet

≥8

POSITIEF

Besmet/vaccinatie

> 512

POSITIEF

Infectietiter zeug

≥ 256

POSITIEF

Infectietiter foeti (> 70 d dracht)

27

Hemagglutinatie-inhibitietest • Voordelen ‐ Goedkope test ‐ Duidelijke hoogte titer ~ hoeveelheid antistoffen serum

• Nadelen ‐ Zeer arbeidsintensief ‐ Aflezing vereist ervaring laborant

28




29

ELISA • Enzyme-Linked Immunosorbent Assay • Algemeen principe: Een Ag-As binding aantonen gebruikmakend van een enzyme als merker en een vaste drager ELISA detectie mogelijk van:  antigeen  antistoffen ELISA-varianten:  Direct/indirect  Sandwich/competitieve/blocking

30

ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv

Stap 1

Bloed Serum

Stap 2

Stap 3

Stap 4

Stap 5

+

+ Wassen +

-

-

-

31


Stap 7

Stap 6

+

NEG

Incubatie

POS

+

32


33


34

ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE

Stap 1

Bloed Serum

Stap 2

Stap 3

Stap 4

Stap 5

+

+ Wassen +

-

-

-

35

ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE

Stap 6

Stap 7 POS

+

-

Stopoplosssing

NEG

+

-

36

ELISA – antigen-ELISA: rotavirus

Stap 1

Stap 2

Stap 3

+

Conjugaat

-

-

Stap 4

Mest

+ -

Detectie Ag

+

+

Wassen

-

37

ELISA – antigen-ELISA: rotavirus

Stap 5

+ -

Stap 6

Incubatie

NEG

POS

+ -

38

ELISA •

Voordelen ‐ Snelle techniek en werken op vaste drager : grote aviditeit want veel Ag op kleine oppervlakte : gevoelige testmethode ‐ Men kan richten op welke soort As men wil werken : IgG, IgM… ‐ Gebruik van een enzymatische reactie die een versterking van het verkregen signaal veroorzaakt : er moet slechts weinig Ag-As complexen gevormd worden om toch een sterk signaal te krijgen ‐ Standaardisatie (ringtesten) ‐ Automatisatie mogelijk

•

Nadelen ‐ Dure commerciële kits ‐ Het coaten van de platen moet met zorg gebeuren : zuiver Ag noodzakelijk anders daling specificiteit van de test 39




40

Serum poolen – interpretatie? • Objectief ‐ Bekijken of serum poolen een ‘kostenbesparende’ optie is voor groepsdiagnostiek ‐ Interpretatie bij combinaties van negatieve en positieve serumstalen

• Materiaal & Methoden ‐ Serumstalen met gekend PRRSv S/P-ratio ‐ Pools van 5 serumstalen ‐ Diverse combinaties van negatieve, zwak, matig en hoog positieve PRRSv S/P-ratios 41

01333

11233

01332

11232

00233

01133

01322

11123

00133

01132

00223

11113

01222

11112

11122

00033

01113

00123

01122

00222

00023

00113

00122

01112

00013

00022

00112

01111

00003

00012

00111

00002

00011

00001

3

2

1

0

S/P-ratio

Serum poolen – interpretatie? Serumpool combinaties

3,5

3

2,5

2

1,5

1

0,5

0

Codes

42

Serum poolen – interpretatie? • Duidelijk verband tussen aantal positieve dieren en mate van positiviteit • Poolen van serumstalen moet toch zeer omzichtig geïnterpreteerd worden ‐ Slechts bij 5 negatieve stalen of 1 licht positief staal blijft de pool negatief ‐ Van zodra een sterk positieve of meerdere licht positieve dieren in de pool = positief! ‐ Indien infectiegraad (% positieve dieren of individuele titers) van belang is, dan gaat een groot deel van de informatie verloren!! ALTIJD POSITIEF 43




44

Conclusie Wat hebben we vandaag geleerd? 1. HI-test vereist 4x titerstijging voor seroconversie 2. ELISA ruwe data gewenst: opvragen van S/P, SN, blocking % en GEEN OD-waarden 3. Serum poolen leidt tot verlies van informatie

45

Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw

Dank u 46

Serologische testen in de routine diagnostiek: een update

Recommend Documents