Serologische testen en interpretatie van testresultaten
Serologische testen Serologie is de leer van de stoffen die zich bevinden in het bloedserum. Bloedserum is het vocht dat verkregen is nadat bloed gestold is en het stolsel verwijderd is. Met serologische testen wordt vaak bedoeld: het aantonen van specifieke antilichamen tegen bepaalde ziektekiemen (zoals virussen, bacteriën en parasieten). Soms wordt de term serologie ook gebruikt voor testen waarin geen antilichamen maar de ziektekiem zelf wordt aangetoond. In de varkenshouderij is het nemen van bloedmonsters om antilichamen in aan te tonen een veel voorkomend fenomeen. Het doel is vaak het stellen van een diagnose bij voorkomen van ziekte, maar in steeds grotere mate is het ook een methode om aan te tonen of een bepaalde infectie op het bedrijf al of niet voorkomt. Het is belangrijk om te realiseren dat een laboratoriumbevinding alleen geen diagnose is. Een diagnose wordt gesteld op basis van een combinatie van de symptomen die bij specifieke dieren gezien worden, de bevindingen van het lichamelijk onderzoek van deze dieren en als laatste de resultaten van aanvullend labonderzoek of sectieonderzoek. Voordat bloedmonsters genomen worden, is het belangrijk dat eerst wordt vastgesteld wat de vraag is die men wil beantwoorden. De vraag bepaalt namelijk het bemonsteringsprotocol: het aantal dieren dat bemonsterd moet worden en de diercategorie waarin de monsters genomen moeten worden.
Infectie vs. ziekte: Er is verschil tussen de begrippen infectie en ziekte: Een infectie treedt op als een ziektekiem een dier ‘binnendringt’. Op de confrontatie van het afweersysteem van het dier met de kiem kan een immuunrespons volgen: er worden dan antilichamen gemaakt tegen de ziektekiem. Ziekte is het voorkomen van symptomen bij een dier, dit kan optreden na een infectie maar het hoeft niet. De tijd tussen infectie en ziekte kan zeer variabel zijn. Als deze tijd lang is kan dat betekenen dat wanneer bloedmonsters genomen worden als de dieren ziek zijn, antistoffen al aanwezig zijn.
Basisbegrippen Verschillen tussen een infectie door een bacterie en infectie door een virus: Een virus heeft levende cellen van de gastheer (in dit geval het varken) nodig om zich te vermeerderen, hierdoor is er contact met het afweersysteem en worden er antistoffen geproduceerd. Een bacterie kan zich zonder gastheer vermenigvuldigen en kan verstopt blijven voor het afweersysteem (bijvoorbeeld in de tonsillen), er hoeven dan dus geen antistoffen aanwezig te zijn. Een infectie moet in dat geval aangetoond worden door de kiem zelf aan te tonen. In dat geval heeft het varken geen afweerstoffen gevormd en het nemen
1
van een bloedmonster toont de infectie dan niet aan. Soms kunnen ook virussen zich verstoppen in het lichaam, zodat er geen afweerstoffen tegen worden gevormd. Dit kan o.a. het geval zijn bij de ziekte van Aujeszky. Enkelvoudige bemonstering: Met een eenmalige monstername kan vastgesteld worden dat een dier op enig moment een bepaalde infectie heeft doorgemaakt. Afhankelijk van hoe lang de antilichamen na deze specifieke infectie aanwezig blijven kan daarbij een periode aangegeven worden. Sommige infecties geven een levenslange immuniteit en daarvan kan dus alleen gezegd worden dat de dieren ‘ooit in hun leven’ deze infectie doorgemaakt hebben. Bij jonge dieren moeten we rekening houden met het feit dat ze antilichamen opnemen die in de biest zitten (maternale antilichamen). Er zijn dan antilichamen aan te tonen tegen bepaalde infecties waarmee het moederdier (de zeug), maar niet het dier (de big) zelf in aanraking is geweest. Om onderscheid te kunnen maken, kunnen gepaarde sera genomen worden. Als de antilichamen afkomstig zijn van de moeder, zal het niveau in het tweede monster vaak lager zijn dan in het eerste. Is er sprake van een infectie, dan zal het niveau in het tweede monster hoger zijn. Gepaarde sera: Om een koppeling te kunnen maken tussen acuut optredende problemen en een ziektekiem kunnen gepaarde sera genomen worden. Essentie van deze manier van bemonsteren is dat dezelfde dieren met een tussentijd van minimaal 3 weken getapt worden. Dit wordt gepaard onderzoek genoemd. Voor de eerste monstername moeten dieren geselecteerd worden die als acute fase representanten aangemerkt kunnen worden: ze laten de symptomen zien die passen bij de infectie/ziekte die men wil bevestigen, ze zijn in het beginstadium, dat wil zeggen: gisteren waren ze nog niet ziek. Na minimaal 3 weken worden deze dieren nogmaals getapt en de monsters uit beide onderzoeken worden gelijktijdig getest. Dit om testinvloeden te voorkomen. Als in het eerste monster geen of weinig antilichamen aanwezig zijn en in het tweede significant (duidelijk) meer wordt aangenomen dat een infectie met de betreffende kiem heeft plaatsgevonden. en dat de betreffende kiem als mogelijke oorzaak van de ziekte kan worden aangemerkt. Deze manier van testen werkt alleen als de symptomen kort na de infectie optreden, dus voordat de productie van antilichamen op gang is gekomen. Bij bv. verwerpen ligt er vaak een lange tijd tussen het optreden van de infectie en het uiteindelijke verwerpen, hierdoor zijn zeugen al positief als het eerste monster genomen wordt en zal er dus geen titerstijging waargenomen worden. Bij een infectie met Mycoplasma hyopneumoniae kan het 3 tot 11 weken duren voordat dieren antilichamen gaan maken. Dit betekent dat bij deze infectie het moeilijk is om via gepaarde sera een diagnose te stellen, op het moment van de tweede monstername zijn er misschien nog geen antilichamen aanwezig en de bevestiging van de klinische diagnose wordt dus niet gekregen. Om een waarschijnlijke diagnose te stellen kan onderzoek aan de slachtlijn gedaan worden waarbij gekeken wordt naar afwijkingen in de longen die bij een Mycoplasma-infectie passen. Antilichaam titer: Bij uitslagen van kwantitatieve antilichaamonderzoeken wordt meestal gesproken van een ‘titer’. Er staat dan bijvoorbeeld dat de titer 1:400 is. Dat betekent dat bij een
2
verdunning van het serum van 1:400 nog steeds antilichamen aangetoond kunnen worden. Hoe meer antilichamen er zijn in het monster, hoe groter het getal achter het deelteken. Bij bv. PRRSV wordt een s/p ratio gegeven, een ‘sample to positive’ ratio. Deze ratio geeft aan hoe positief het geteste monster is ten opzichte van het standaard positieve monster dat altijd meegenomen wordt in de testreeks. Bij PRRS is de s/p ratio tot een waarde van 2 vergelijkbaar met een titer, bij hogere waarden dan 2 is dat niet meer het geval. Gevoeligheid van testen: Sensitiviteit: de sensitiviteit van een test is het percentage van de positieve dieren dat in een deze test ook positief bevonden wordt. Als een test een sensitiviteit van 90% heeft, zullen bij het testen van 100 dieren die in werkelijkheid positief zijn, 90 dieren positief getest worden. De overige 10 positieve dieren zullen een negatieve testuitslag laten zien. Dit zijn de valsnegatieven. Specificiteit: de specificiteit van een test is het percentage van de negatieve dieren dat in een test ook negatief bevonden wordt. Als een test een specificiteit van 90% heeft, zullen bij het testen van 100 dieren die in werkelijkheid negatief zijn, 90 dieren negatief getest worden. De overige 10 negatieve dieren zullen een positieve testuitslag laten zien. Dit zijn de valspositieven. Het combineren van verschillende testen kan de zekerheid van de uitslagen vergroten doordat de ene test de minder sterke eigenschappen van de andere kan compenseren. Valspositieven: Een valspositieve uitslag geeft een reactie in de test terwijl het dier in werkelijkheid niet geïnfecteerd is. Oorzaken hiervan kunnen zijn: • Technische aspecten van de test zelf • Kruisreacties doordat het dier met een andere kiem is besmet die ook een positieve reactie in de test geeft Om valspositieve uitslagen (proberen) te identificeren kunnen alle positieve monsters (onbekend is ten slotte welke valspositief zijn) hertest worden in een andere test. Dit moet dan een ander type test zijn, die liefst een hogere specificiteit heeft. Valsnegatieven: Een valsnegatieve uitslag geeft geen reactie in de test terwijl het dier in werkelijkheid wel geïnfecteerd is. Oorzaken hiervan kunnen zijn: • Technische aspecten van de test zelf, bv de gevoeligheid voor antilichamen • De monsters zijn te vroeg of te laat na de infectie genomen • Er worden geen of weinig antilichamen gemaakt • Het immuunsysteem van het dier is onderdrukt waardoor er geen of weinig antilichamen gemaakt worden Testen van koppels: Om bij bedrijfsproblemen inzicht te krijgen wanneer een infectie bij bv. de vleesvarkens de koppel in komt, kan via een uitgebreidere studie getest worden. Dan kan gebruik gemaakt worden van een longitudinaal onderzoek of een cross sectional onderzoek. Bij een longitudinaal onderzoek worden dezelfde dieren op bv. 3 tijdstippen tijdens de mestperiode getest, gekeken wordt dan wanneer de eerst negatieve dieren positief worden. Hiermee wordt een indicatie gekregen wanneer de dieren geïnfecteerd 3
worden. Voordeel van deze methode is dat het een betrouwbaar beeld geeft, omdat steeds dezelfde dieren getest worden. Nadeel van deze methode is dat het lang duurt voordat de resultaten bekend zijn, omdat vrijwel een gehele mestperiode afgewacht moet worden. Bij een cross sectional onderzoek worden op 1 tijdstip bv. 3 leeftijdsgroepen van vleesvarkens getest, gekeken wordt dan welke leeftijdsgroepen positief zijn. Voordeel van deze methode is dat de resultaten snel bekend zijn, omdat alle monsters op 1 moment verzameld worden. Nadeel van deze methode is dat verschillende leeftijdsgroepen uit verschillende afdelingen getest worden, het zou kunnen zijn dat oudere dieren die positief getest worden, op jonge leeftijd ook al positief waren. Het moment van infectie is via deze methode dus minder betrouwbaar vast te stellen.
Vraagstelling Voordat monsters genomen worden, moet de onderzoeksvraag geformuleerd worden. Zonder duidelijke vraagstelling zal investering qua tijd en geld in het nemen van monsters en het laten testen ervan vaak weinig zinvol blijken. Vragen kunnen zijn: Is ziekte X de oorzaak van het probleem dat ik op mijn bedrijf heb? Komt ziekte X voor bij mijn varkens? Is ziektekiem Z aanwezig op mijn bedrijf? Is ziektekiem Z afwezig op mijn bedrijf? Om de vraag te kunnen beantwoorden of ziekte X de oorzaak van de problemen op het bedrijf is, moet een aantal stappen genomen worden: • Definitie van het (gezondheids)probleem • Besluit of het probleem met ziekte X kan samenhangen; dit wordt samen met de dierenarts gedaan, o.a. op basis van kennis en beschikbare literatuur • Selectie van acute fase representanten (AFR’s of ‘patiënten’) op basis van de definitie van het probleem; aan de hand van de ‘inclusiecriteria’ (symptomen passend bij de ziekte) worden de dieren geselecteerd. • Van zieke dieren wordt vervolgens tweemaal bloed afgenomen; de eerste keer direct na het zien van de eerste symptomen, de tweede keer drie weken later. Om de vraag te kunnen beantwoorden of ziekte X bij de varkens voorkomt, moeten de volgende stappen genomen worden: • Vaststellen van de kenmerken van ziekte X (samen met de dierenarts) • Selecteren van acute fase representanten (dieren die de ziekteverschijnselen vertonen zoals die hierboven benoemd zijn) • Van de acute fase dieren wordt vervolgens bloed afgenomen en dit wordt 3 weken later herhaald. Om de vraag te kunnen beantwoorden of kiem Z aanwezig is op het bedrijf, moet een aantal stappen genomen worden: • Schatting van de prevalentie (het aantal geïnfecteerde dieren) van ziektekiem Z (op basis van literatuur)
4
• Bepalen van de steekproefgrootte (zie onder) • Bloedtappen van dieren, bij voorkeur de relevante leeftijdsgroep bij de betreffende kiem Om de vraag te kunnen beantwoorden of kiem Z afwezig is op het bedrijf, moet een aantal stappen genomen worden: • De minimale prevalentie (het laagste mogelijke aantal geïnfecteerde dieren) van ziektekiem Z moet bepaald worden • Bepaling van de steekproefgrootte • Bloedtappen van dieren, bij voorkeur de relevante leeftijdsgroep bij de betreffende kiem • Voor monitoring van het bedrijf moet een x aantal keren per jaar bemonsterd worden (afhankelijk van de kiem en de uitspraak die men wil doen)
Steekproefgrootte Om de hoeveelheid te nemen bloedmonsters te kunnen bepalen is het belangrijk om het volgende te weten of te schatten: • De omvang van de koppel (aantal dieren) • Geschatte prevalentie: als de ziekte in de populatie voorkomt, hoeveel dieren zijn er dan geïnfecteerd. Hoe meer dieren in een populatie geïnfecteerd zijn, hoe minder monsters genomen hoeven worden om een infectie aan te tonen. • Gevoeligheid (sensitiviteit en specificiteit) van de test die gebruikt gaat worden: als een test minder goede testeigenschappen heeft (een lage gevoeligheid), zijn meer monsters nodig om te compenseren voor foutieve uitslagen Monsters kunnen at random of gestratificeerd genomen worden: • Bij random monstername worden willekeurig dieren geselecteerd voor de monstername, verdeeld over de afdeling of stal • Bij gestratificeerde monstername worden de monsters uit een bepaalde groep dieren genomen, daarbij wordt gekozen voor de diergroep waarin de meeste infecties worden verwacht. Dit betekent dat om de aanwezigheid van de infectie op het bedrijf vast te stellen, minder monsters genomen hoeven te worden. Op het bedrijf kan over alle dieren bekeken 5% geïnfecteerd zijn, in de geselecteerde leeftijdsgroep (bv. gespeende biggen) kunnen echter bijna alle dieren geïnfecteerd zijn. Er is dan maar een heel klein aantal monsters nodig om de aanwezigheid van de infectie vast te stellen.
Conclusie: Cruciaal in serologisch onderzoek is welke vraag men wil beantwoorden. Het nemen van bloedmonsters is eenvoudig. Echter, de moeilijkheid ligt in het bepalen hoeveel en van welke dieren monsters genomen moeten worden. Daarvoor is de formulering van de onderzoeksvraag een voorwaarde. Serologisch onderzoek kan antwoord geven op een goed geformuleerde vraag, maar het kan ook meer vragen oproepen dan er aanvankelijk bestonden.
5
Testuitslagen zijn geen absolute waarheid; er kunnen valspositieve en valsnegatieve resultaten bij zitten die grote consequenties kunnen hebben. De uitslagen moeten altijd in context gezien worden; ze zijn geen absolute diagnose, maar geven informatie aanvullend aan die verkregen uit de bedrijfshistorie en de bevindingen in de stal.
6
