Metody strukturní analýzy MS, RTG difrakce. Pavel Matějka

Metody strukturní analýzy – MS, RTG difrakce

Pavel Matějka

Metody strukturní analýzy – MS, RTG difrakce 1. MS 1. 2. 3. 4.

Princip metody Iontové zdroje Hmotnostní analyzátory Základy pro interpretaci spekter

2. RTG difrakce 1. 2. 3. 4.

Obecné principy Analýza práškových vzorků Analýza monokrystalů Základy vyhodnocení difraktogramů

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - samostatně - strukturní analýza, identifikace látek - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - prvková analýza – kombinace s ICP - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním prostředí - farmakokinetické studie - kvantifikace proteinů - priony - analýza nukleových kyselin - analýza potravin - detekce výbušnin, drog … - použití vnitřního standardu

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - MS - mass spectrometry - MS - mass spectrometer - MS - mass spectrum - destruktivní metoda, ale zcela minimální spotřeba vzorku - běžně mikrogramy

SPEKTROMETR - iontově-optické zařízení - separace iontů podle m/z

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MILNÍKY - 1899 - počátky hmotnostní spektrometrie - cca 1940 - použití v petrochemickém průmyslu - 1946 - TOF MS - „time of flight“ - 1953 - kvadrupólová MS - 1956 - identifikace organických látek pomocí MS - 1964 - GC-MS - 1966 - chemická ionizace - 1980 - ICP-MS - 1996 - MS viru

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HLAVNÍ SOUČÁSTI SPEKTROMETRU - vstup - zavedení vzorku - iontový zdroj - ionizace - separátor (analyzátor) - separace iontů podle m/z - detektor - četnost daného typu iontů - zpracování signálu - spektrální výstup - vakuový systém - vyloučení srážek iontů

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - vstup - zavádění vzorku do spektrometru - přímý vstup - přes zásobník - studený či vyhřívaný - chromatografický vstup - GC - LC

VOLBA IONIZAČNÍ TECHNIKY • těkavost (souvisí s polaritou a MR) - pro těkavé látky: EI, CI

• molekulová hmotnost (souvisí s těkavostí) - asi do MR=1000 lze EI/CI, do několika tisíc APCI, APPI a FAB, do desítek až stovek tisíc ESI a MALDI • tepelná stabilita látky - pro termolabilní látky nejsou vhodné techniky, kdy je nutné látku převést do plynné fáze před vlastní ionizací (EI, CI), volit šetrnější ionizační techniky (ESI nebo MALDI) • volba polarity ionizace (platí pro měkké ionizační techniky) - kladné ionty - pro většinu látek, musí být možné látku protonovat (vhodná přítomnost heteroatomu) či „kationizovat“ (Na+, K+, Li+, Ag+, apod.) - záporné ionty - sulfonové a karboxylové kyseliny, polyhydroxylované látky (snadná deprotonace), někdy tvorba aduktů s jednoduchými anionty, např. [M+octan]-, [M+mravenčan]-, [M+Cl]-, apod. • studium nekovalentních interakcí a prostorového uspořádání molekul (zejména pro biomakromolekuly) - ESI

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - iontový zdroj - ionizace a fragmentace vzorku - elektronová ionizace - ionizace nárazem elektronů EI - electron ionization (impact) - chemická ionizace - CI - ionizace urychlenými atomy – FAB - ionizace urychlenými ionty - FIB - ionizace polem - FI - ionizace laserem za účasti matrice - MALDI - termosprej - TSI, plasmasprej - PSI API - elektrosprej - ESI

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - iontový zdroj - ionizace a fragmentace vzorku - DART - DART (Direct Analysis in Real Time) is an atmospheric pressure ion source that instantaneously ionizes gases, liquids and solids in open air under ambient conditions Developed 2005 pharmaceuticals, metabolites, pesticides, peptides, oligosaccharides, drugs of abuse, explosives and toxic industrial chemicals

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - iontový zdroj - ionizace a fragmentace vzorku - DART - DART (Direct Analysis in Real Time) interaction between the analyte molecule (S) and electronically excited atoms or vibronically excited molecules (metastable species – M*):

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - iontový zdroj - ionizace a fragmentace vzorku - DART - DART (Direct Analysis in Real Time)

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - elektronová ionizace - EI - konvenční technika (od roku 1913) - M + eM+ + 2 e- (radikálkationty) propracovaná teorie - „tvrdá“ ionizační technika - fragmentace molekuly na menší části - slabá intenzita molekulárního píku - těkavé látky - termostabilní látky - existují knihovny/databáze spekter, vhodné pro strukturní analýzu

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - elektronová ionizace - EI Re či W

M+

urychlující potenciál e5 – 100 V - energie eběžně 70 eV (důležité pro knihovny) - záporně nabité ionty + záchyt evychytávány vytlačovací elektrodou

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - elektronová ionizace - EI Vliv energie elektronů na fragmentaci

EI

Vyšší urychlující potenciál epůsobí HLUBŠÍ FRAGMENTACI

CI

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - chemická ionizace - CI - konstrukce zdroje podobná jako pro EI - ve zdroji přítomen REAKČNÍ PLYN v nadbytku vůči vzorku - ionizace reakčního plynu - methan, amoniak, isobutan, propan, voda, dusík - reakce iontů s molekulami analytu - tvorba aduktů

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - chemická ionizace - CI - základní mechanismy ion-molekulárních reakcí R + eR+ + 2 e(ionizace reakčního plynu) R + R+ [R-H] + [R+H]+ (ion-mol. reakce plynu) R + R+ [R-H]+ + [R+H] (ion-mol. reakce plynu) [R+H]+ + M R + [M+H]+ (protonace) [R-H]+ + M R + [M-H]+ (abtrakce hydridu) R+ + M [R+M]+ (kondenzace) R+ + M R + M+ (výměna náboje)

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - chemická ionizace - CI - méně výrazná fragmentace než u EI (přítomnost iontů o m/z větším než odpovídá molekulárnímu iontu) - též vznik záporných iontů – (pozitivní/negativní mód) - záchyt elektronu - deprotonace - adice halogenidu

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - FAB - ionizace urychlenými atomy - urychlené atomy Xe, Ar - na terčíku vzorek ve viskosní matrici - matrice - chemicky inertní, málo těkavá - glycerol, thioglycerol - kapalné kovy - Ga, In - vznik aduktů (s matricí) - jedna z šetrnějších ionizačních technik

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE EI

FAB

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - ionizace laserem za účasti matrice - MALDI - velmi šetrná ionizační technika - vhodné pro biomolekuly - proteiny, oligosacharidy - pulzní lasery - UV - dusíkový - 337 nm (4 ns) - IR - Er-YAG - 2940 nm -matrice musí absorbovat laserové záření - kys. dihydroxybenzoová, chlorsalicylová, skořicová, nikotinová - nutný přebytek matrice (5000 :1) - kovová podložka - terč

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU MALDI

[M+H]+

IONIZACE VZORKU – NALDI/SALDI  simple matrix-free laser desorption/ionization mass spectrometric approach  NALDI plate contains a hydrophobic surface made of nano-structures of 20 nm in diameter and 100 to 500 nm in length, metal oxides, nitrides

IONIZACE VZORKU – NALDI/SALDI

GALDI – colloidal graphite

SELDI – surface enhanced

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - MALDI

Směs peptidů

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - ionizace elektrosprejem - ESI - velmi šetrná ionizační technika - vhodné pro biomolekuly - vhodné pro vzorky v roztoku (výstup z LC) - „vypařování iontů“ - rostoucí hustota náboje ve zmenšující se kapičce - na kovové kapiláře vloženo vysoké napětí (řádově kV) na rozdíl od termosprejové ionizace TSI (TSI - vyhřívaná kapilára)

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE IONIZACE VZORKU - ionizace elektrosprejem - ESI

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - analyzátory – rozdělení iontů podle m/z - vysoké vakuum - sektorové (magnetické pole + elektrická fokusace) - (odstředivá a dostředivá síla) - kvadrupolové (vysokofrekvenční pole) - iontová past (vysokofrekvenční pole) - průletový analyzátor – TOF – (odlišná doba letu různě těžkých iontů) - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) - Orbitrap – oscilace kolem centrální elektrody - FT

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - analyzátory - vysoké vakuum KLÍČOVÝ PARAMETR - rozlišovací schopnost (resolving power - RP) RP = m1/(m1 - m2) (dva stejně vysoké píky, údolí mezi nimi 10% jejich výšky) RP = m/ΔmFWHM spektrální ROZLIŠENÍ - reciproká hodnota RP relativní ještě rozlišitelný rozdíl hmotností

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - sektorový - magnetický s jednoduchou fokusací - zakřivení dráhy letu iontů těžší ionty větší odstředivá síla mv 2

r

- kruhová výseč

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - magnetický separátor

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Sektorový analyzátor - magnetický s jednoduchou fokusací - zakřivení dráhy letu - dostředivá síla (B e v) - úměrná magnetické indukci - odstředivá síla - mv2/r - při konstantním urychlovacím potenciálu a konstantní magnetické indukci odpovídá určité hmotnosti částic určitý poloměr zakřivení - pro proměření spektra nutno plynule měnit buď urychlovací potenciál nebo magnetickou indukci

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Sektorový analyzátor - s dvojitou fokusací - magnetická + elektrická

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - kvadrupolový separátor - hmotnostní „filtr“ - různá stabilita oscilací iontů v kombinaci stejnosměrného napětí a vysokofrekvenční střídavé složky (10 MHz)

buď plynulá změna radiofrekvence nebo současná změna hodnoty stejnosměrného napětí a amplitudy oscilací

separátory iontů - iontová past - radiofrekvenčně modulované pole, možnost MSn analýzy vstupní uzavírací elektroda

prstencová elektroda

výstupní uzavírací elektroda

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - průletový analyzátor - TOF - různá doba letu iontů lehčí atomy jsou rychlejší

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR) - záchyt na cykloidálních drahách - různé absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném silném magnetickém (6 až 7 Tesla) a elektrickém poli - každá hodnota m/z má charakteristickou cyklotronovou frekvenci - vysoké rozlišení, vysoká přesnost, vysoká cena

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů - iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací (FT-ICR)

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - FT-ICR excitace detekce

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR - separátory iontů – ORBITRAP s Fourierovou transformací

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Určení molekulárního iontu • správné určení molekulové hmotnosti lze považovat za první a nejdůležitější informaci, kterou lze získat interpretací hmotnostních spekter • elektronová ionizace (EI) - vzniká molekulární ion M+ • měkké ionizační techniky (např. ESI, APCI, MALDI, atd.) - protonovaná molekula [M+H]+ při záznamu kladných iontů a deprotonovaná molekula [M-H]- při záznamu záporných iontů - kromě uvedených iontů někdy pozorujeme další adukty, např. [M+Na]+, [M+K]+ - obvykle pík s nejvyšší hodnotou m/z ve spektru, izotopické píky se neberou v úvahu

Základní formulace dusíkového pravidla lichá molekulová hmotnost = lichý počet atomů dusíku v molekule

(podobně: sudá molekulová hmotnost = sudý počet nebo absence dusíku) • platí pro molekuly složené z běžných organických elementů (C, H, N, O, F, Si, P, S, Cl, Br, I)

Interpretace M+2 prvky 35Cl

: 37Cl = M : M+2 = 100 : 32 (přibližně 3:1) 79Br : 81Br = M : M+2 = 100 : 97.3 (přibližně 1:1) • pokud hmotnostní spektrum neobsahuje izotopické píky M+2 s intenzitou >25%, lze spolehlivě vyloučit přítomnost Cl a Br • toto pravidlo lze použít i pro jednotlivé fragmentové ionty • pokud molekula obsahuje větší množství atomů chloru a/nebo bromu, lze zastoupení jejich izotopů spočítat podle koeficientů binomického rozvoje: - Br: (a+b)n pro n=2: a2+2ab+b2 (poměr 1:2:1 pro ionty M : M+2 : M+4) pro n=3: a3+3a2b+3ab2+b3 (poměr 1:3:3:1 pro ionty M : M+2 : M+4 : M+6) - Cl: (3a+b)n pro n=2: 9a2+6ab+b2 (poměr 9:6:1 pro ionty M : M+2 : M+4) - platí obecně pro celočíselné hodnoty n, analogicky lze použít i pro výpočet relativního zastoupení jiných izotopů než Cl a Br • A/ C H Br 6

4

2

• B/ C2H3Cl3

RTG difrakce  Princip difraktometrie –  ohyb (difrakce) paprsků a jejich interference

2d sin Θ=n λ

n=1,2,3...

Rentgenová difraktometrie  Historické poznámky

 Max von Laue (9. října 1879, Pfaffendorf – 24. dubna 1960, Berlín) – laueogram

1912 - RTG difrakce na krystalech 1914 – Nobelova cena za fyziku Model difrakčního procesu – RTG záření rozkmitá elektronové obaly atomů a ty se stanou zdrojem sekundárního koherentního RTG záření, interference sekundárního záření způsobí, že v některých směrech dojde k zesílení intenzity, v jiných k zeslabení – difrakční obrazec Laueovy rovnice

Rentgenová difraktometrie

vektorově a (s – s0) = a (cos αn – cos α0) = n λ - podle hodnoty n (řádu difrakce) – jednotlivé (Laueho) kužely


Úseky a1, a2 a a3 značeny též a, b, c

Rentgenová difraktometrie  Historické poznámky  William Lawrence Bragg (31.března 1890 – 1. července 1971)

Matematický popis fyzikálního problému Formuloval Braggovu rovnici  William Henry Bragg (2. července 1862 – března 1942)

10.

Experimentátor, konstruktér spektrometru Společně Nobelova cena 1915 – analýza struktury krystalů s využitím rentgenového záření

Rentgenová difraktometrie  Braggova rovnice – interference fázově posunutých vln model „odrazu“ na soustavě rovnoběžných krystalových rovin – fyzikálně ekvivalentní k Laueovým rovnicím

2d sin Θ=n λ

n=1,2,3...

–

Rentgenová difraktometrie – web simulace


sin  =n λ / 2d n=1,2,3...

 The possible 2-THETA values where we can have reflections are determined by the unit cell dimensions.  However, the intensities of the reflections are determined by the distribution of the electrons in the unit cell.  The highest electron density are found around atoms. Therefore, the intensities depend on what kind of atoms we have and where in the unit cell they are located.  Planes going through areas with high electron density will reflect strongly, planes with low electron density will give weak intensities.


 vzorky  PRÁŠKOVÉ – polykrystalické – identifikace fází ve vzorku na principu „otisku palce“  Pokud možno vzorek s rovným a hladkým povrchem, rozetřený prášek – průřez částic 2 – 5 µm  Ideálně - homogenní vzorek s náhodnou distribucí orientace krystalitů – prášek vtlačen do držáku vzorků (běžně stovky mg)

 MONOKRYSTAL – běžné požadována velikost – průřez – cca 0,3 mm – určení molekulární struktury nových či dosud nepopsaných látek

Rentgenová difraktometrie  Obvykle snímána spektra 1. řádu – pouze pro rozlišení detailů spektra vyšších řádů – výrazné prodloužení doby expozice  Mezní dosažitelné rozlišení určeno rozlišovací schopností přístroje  Bragg-Brentanův difraktometr

For the THETA:2-THETA goniometer, the X-ray tube is stationary, the sample moves by the angle THETA and the detector simultaneously moves by the angle 2-THETA.

Rentgenová difraktometrie Bragg-Brentanův difraktometr  For the THETA:THETA goniometer, the sample is stationary in the horizontal position, the x-ray tube and the detector both move simultaneously over the angular range THETA.

Rentgenová difraktometrie prášková

Rentgenová difraktometrie prášková

Rentgenová difraktometrie “prášková“

 Difraktogram

Rentgenová difraktometrie • The X-ray diffraction pattern of a pure substance is like a fingerprint of the substance. • The powder diffraction method is thus ideally suited for characterization and identification of polycrystalline phases. • Today about 50,000 inorganic and 25,000 organic single component, crystalline phases, diffraction patterns have been collected and stored on magnetic or optical media as standards. The main use of powder diffraction is to identify components in a sample by a search/match procedure. Furthermore, the areas under the peak are related to the amount of each phase present in the sample.



http://rruff.info/yttrium%20aluminum%20garnet/display=default/

Rentgenová difraktometrie monokrystal




Metody strukturní analýzy MS, RTG difrakce. Pavel Matějka

Recommend Documents