Mikrobiologické diagnostické metody MUDr. Pavel Čermák, CSc.
Princip identifikace soubor ZNAKŮ s rozdílnou separační hodnotou S
HODNOTA S:
S1 S2 S3
Základní problémy • Minimum morfologických znaků • Podobná antigenní struktura • Extragenomový materiál - plasmidy, transposomy • Systémově nejasné postavení mikroorganismů
Rozdělení metod • Detekce patogena - přímý průkaz (kultivace, antigeny, genetická detekce atd.) • Detekce patofys. odpovědi - protilátky, enzymy (markery)
Detekce patogena • Morfologie - barvení • Antigenní struktura • Chemická struktura, produkty metabolismu • Genetická informace • Biochemické vlastnosti - klasická mikrobiologická diagnostika
MIKROSKOPIE GRAM, ZIEHL-NEELSEN,GIEMSA
• VÝHODY
• NEVÝHODY
- rychlost
- zkušenosti
- jednoduchost
- interpretace
- dostupnost - cena
Elektronový mikroskop • Přímá elektronoptická metoda 50 000x prohlížení 100 000x foto • Imunoelektronoptická metoda 100x citlivější
Poxviridae 200 x 300 nm
Herpesviridae 150 nm
KLASICKÁ IDENTIFIKACE 1. MIKROSKOPIE 2. OBECNÁ půda - krevní agar, MC agar 3. SELEKTIVNÍ půdy - DC, Endův agar 4. BIOCHEMICKÉ testy zkvaš. cukrů, metab. bílkovin atd.= barevné reakce MATEMATICKÉ vyhodnocování - identifikační seznamy - počítačové programy komerční diagnostické sety: LACHEMA API
Disková difusní metoda Petriho miska s MH agarem a testovaným mikrobem
Citlivý k ATB
Rezistentní k ATB
ATB disk Zóna inhibice růstu
Diluční bujonová metoda MIC ATB1 ATB2 128 32
Plastová destička 8 x 12 jamek
64 16 32
8
16
4
8
2
4
1
2
0,5
1
0,2
MH bujon s dvojkovým ředěním ATB a testovaným kmenem
Koncentrace ATB
E - test Pertiho miska s testovaným kmenem 128 Zóna inhibice růstu 32
2
Proužek vytvářející koncetrační gradient
Izolace na tkáňové kultuře • TKÁŇOVÁ KULTURA – lidské, opičí buňky • Cytopatický efekt = destrukce kultury • namnožení viru - v praxi jediná možnost • vajíčka (embrya) se téměř nepoužívají
Antigenní struktura • • • • •
Aglutinace Vstřícná elektroforéza Imunofluorescence Latexová aglutinace, koaglutinace EIA metody
Vstřícná imunoelektroforéza pohyb detekovaného materiálu v agrovém gelu
+
Ig
Ag
Různé modifikace - Western blot
-
Imunofluorescence (IF) 1. PŘÍMÁ - detekce antigenu
Hledaný objekt
2. NEPŘÍMÁ - detekce protilátek
-
- subjektivní hodnocení - nespecifické reakce
+ - rychlost - jednoduchost - cena
Latexová aglutinace /koagl./ - různé modifikace (barva atd)
Ag
- vyšší citlivost - jednoduchost - cena
Diag + identifikační sety: bakt. meningitis
streptokoky, rotaviry
Imunoassay „Labeled“
„Nonlabeled“
homogenní x heterogenní kompetitivní x nekompetitivní
RIA
EIA ELISA
turbidimetrie nefelometrie
= enzyme linked imunosorbrnt assay
- princip sendviče - vazba x promývání - různé modifikace (IgG,IgM capture, „one step“ atd.)
ELISA Detekce protilátek
antigen
hledaná protilátka
protil. proti lidské protilátce
peroxidázový sys. avidin-biotinový sys.
enzym substrát
ELISA Detekce antigenu
vázaná protilátka proti antigenu značená protilátka proti antigenu
enzym
hledaný antigen substrát
ELISA Provedení: - „ ručně“ - poloautomat - automat
KFR • Inaktivované vyšetřované sérum • Ag • Morčecí komplement • Hemolytický systém
Genetické metody • Hybridizační - sondy DNA, RNA (nejčastější v dtekci bakterií - bakteriální buňka obsahuje mnohonásobně více RNA než DNA) Mykobakterie
specifita
citlivost
Neis. gonorh. Chlamydie
• Amplifikační - PCR, LCR + další (základní princip - syntéza části detekované NK, prodloužením primerů DNA, RNApolymerázou a basemi, geometrickou řadou do množství prokazatelného běžnými metodami)
citlivost riziko kontaminace
TBC, GO, Chlamydie hepatitida B + další
Hybridizace 1. rozvláknění NK 2. vazba známé sekvence DNA, RNA 3. detekce - enzymaticky - fluorescenčně - elektroforeticky
Amplifikace - PCR Polymerase Chain Reaction 1. rozvláknění NK 2. vazba primerů
primer 1 primer 2
3. syntéza pomocí polymerázy a bazí
4. Rozvláknění, vazba primerů, polymerace
40x 5. detekce NK 105
Další modifikace genetických metod Nested PCR - v principu dvojitá PCR reakce AMTD - průkaz rRNA M.tuberculosis (nejvyšší citlivost) RFLP - analýza restrikčních fragmentů DNA (poddruhové určení - epidemiologie)
Real time PCR - ukončení amplifikace v okamžiku dostatečného množství amplifikovaného produktu KVANTIFIKACE !!!
DNA - STRIP technologie 1. izolace DNA 2. Amplifikace DNA 3. Hybridizace na komplementární probě identifikace několika druhů v jednom kroku
Chemické identifikační metody Plynová chromatografie mastných kyselin
+ -
rychlost automatizace otevřený systém cena, náročnost
Chomatografie metabolitů (anaeroby) Elektroforéza celotělových proteinů Pyrolýzová hmotová spektrometrie
- tepelná degradace bakt. bb. - spektrometrická analýza
RYCHLOST
Vývojový trend - automatizace Základ
- klasické biochemické metody - ELISA - hybridizace, amplifikace
1. Počítač + fotometr - velké množství firemních systémů pro serologii - vysoká citlivost fotometru = rychlost - nutnost manuální obsluhy
2. Automaty a poloautomaty Serologie
- zpracování komerčních diag. setů pro ELISA stanovení antigenů a protilátek Abbot IMX Abbot AXSYM - princip individuálního sekvenčního zpracování materiálu Murex TECAN - dávkové zpracování „destička“
Bakteriologie
1. Přístroje pro kultivaci hemokultur a mykobakterií. 2. Systémy pro identifikaci a stanovení ATB citlivosti
Poloautomaty - hemokultury Stanovení CO2 Becton Dickinson - Bactec - Bactec TB 480 Organon Teknika - Bact/Alert - MB/Bact
Luminiscence bio Mérieux – VITAL – vývoj zastaven
Automaty pro identifikace a ATB citlivosti bio Mérieux
- mini API - ATB expression - VITEK
Roche - COBAS micro BAG - Merlin micronaut MAST - Mastascan colour (princip digitalizace obrazu Petriho misky - ATB citlivosti)
Výhled do budoucnosti Amplifikační genetické metody „ČIP“
V každém poli jiný primer = najednou se provede velké množství reakcí - pokryje
většinu běžně diagnostikovaných bakterií. Možnost stanovení ATB citlivosti má rovněž genetický základ ! 10 x 10 cm
