III. A.
METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan April sampai Januari 2016 dilakukan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. B. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan meliputi NAA, air kelapa, pisang ambon, kentang, ubi jalar, MnSO4, larutan makro, FeSO4, Ca(NO3)2, arang aktif, gula, agar, eksplan hasil persilangan anggrek Coelogyne asperata x Coelogyne pandurata, alat yang digunakan meliputi kertas buram, kertas wrap, tissue, alkohol dan spiritus, LAF (Laminar Air Flow), petridish, pinset, scapel dan bunsen. C. Perancangan Penelitian Rancangan yang digunakan dalam penelitian adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial. Perlakuan terdiri dari dua faktor yaitu konsentrasi NAA sebagai Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) dan bahan organik. Faktor pertama dalam penelitian ini adalah konsentrasi NAA (N) yang terdiri dari empat taraf yaitu : NAA 0 ppm (N0) NAA 1 ppm (N1) NAA 3 ppm (N2) NAA 5 ppm (N3) Faktor kedua adalah bahan organik (B) yang terdiri dari lima macam yaitu : Tanpa bahan organik (B0) Air kelapa 250 mL/l (B1) (Widiastoety 1997), Pisang ambon 150 g/l (B2) (Arditti 1982), Kentang 200 g/l (B3) (Gunawan 1987), Ubi jalar 150 g/l (B4) (Hendaryono 2000). Didapatkan 20 kombinasi perlakuan yang masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali yang meliputi :
10
N0B0 (NAA 0 ppm, tanpa bahan organik) N0B1 (NAA 0 ppm, dengan penambahan air kelapa 250 ml/l) N0B2 (NAA 0 ppm, dengan penambahan pisang ambon 150 ml/l) N0B3 (NAA 0 ppm, dengan penambahan kentang 200 g/l) N0B4 (NAA 0 ppm, dengan penambahan ubi jalar 150 g/l) N1B0 (NAA 1 ppm, tanpa bahan organik) N1B1 (NAA 1 ppm, dengan penambahan air kelapa 250 ml/l) N1B2 (NAA 1 ppm, dengan penambahan pisang ambon 150 ml/l) N1B3 (NAA 1 ppm, dengan penambahan kentang 200 g/l) N1B4 (NAA 1 ppm, dengan penambahan ubi jalar 150 g/l) N2B0 (NAA 3 ppm, tanpa bahan organik) N2B1 (NAA 3 ppm, dengan penambahan air kelapa 250 ml/l) N2B2 (NAA 3 ppm, dengan penambahan pisang ambon 150 ml/l) N2B3 (NAA 3 ppm, dengan penambahan kentang 200 g/l) N2B4 (NAA 3 ppm, dengan penambahan ubi jalar 150 g/l) N3B0 (NAA 5 ppm, tanpa bahan organik) N3B1 (NAA 5 ppm, dengan penambahan air kelapa 250 ml/l) N3B2 (NAA 5 ppm, dengan penambahan pisang ambon 150 ml/l) N3B3 (NAA 5 ppm, dengan penambahan kentang 200 g/l) N3B4 (NAA 5 ppm, dengan penambahan ubi jalar 150 g/l) D. Cara Pelaksanaan Penelitian 1. Pembuatan Larutan Stok Knudson C Pembuatan larutan stok Knudson C dilakukan dengan menimbang bahan-bahan kimia sesuai takaran untuk 1 liter (Tabel 1 dalam Lampiran 1). Kemudian larutan media Knudson C diencerkan dengan aquadest steril sampai 500ml. 2. Pembuatan Medium a. Larutan Knudson C sebanyak 500 ml diberi gula 20 gr/l dilarutkan dengan magnetic stirrer, kemudian diberi arang aktif sebanyak 1 g/l sampai larut
11
b. Pembuatan stok NAA sebagai contoh konsentrasi 1 ppm/l dilakukan dengan cara mengambil NAA berupa serbuk 1 mg, kemudian ditetesi NaOH 1 N sampai larut, kemudian ditambahkan aquades dengan takaran 10 ml/l (0, 1 ppm=10 ml/l, 3 ppm=30ml/l, 5 ppm=50ml/l), c. Pembuatan bahan organik sesuai dengan perlakuan dengan cara -
Air kelapa diukur sebanyak 250 ml/l dengan gelas ukur
-
Pisang ambon sebanyak 150 g/l diblender dengan air secukupkan
-
Kentang 200 g/l diblender dengan air secukupnya
-
Ubi jalar 150 g/l diblender dengan air secukupnya
d. Sebagai contoh pembentukan NAA 1 ppm sebanyak 10 ml/l kemudian dicampur dengan bahan organik berupa air kelapa sebanyak 250 ml/l sampai larut, dicampurkan kedalam larutan Knudson C yang telah terbentuk, diberikan aquadest hingga 1 liter, demikian selanjutnya untuk semua perlakuan. e. Sebelum diautoclave, pH diukur dengan pH meter sampai menunjukan angka 5,8 apabila pH larutan ingin ditingkatkan ditambahkan NaOH 1 N dan HCl 1 N apabila ingin diturunkan. f. Ditambahkan 8 g/l agar-agar ke dalam larutan media tersebut sebelum dipanaskan, lalu dipanaskan hingga mendidih. Pembuatan larutan media Knudson C ini digunakan untuk 40 botol kultur, yang masing-masing botol diisi dengan sekitar 25 ml. Sebanyak 25 ml setelah larutan tersebut mendidih dituangkan ke dalam botol-botol kultur, lalu ditutup dengan rapat menggunakan tutup botol kultur. Botol-botol kultur yang telah diisi dengan larutan tersebut dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 30 menit. Selanjutnya botol-botol tersebut disimpan pada rak-rak kultur. Selama satu hingga dua hari botol-botol medium kultur tersebut diamati apabila muncul kontaminan segera disingkirkan. 3. Sterilisasi alat
12
Alat-alat seperti pisau, pinset, petridish dicuci hingga bersih kemudian dibungkus kertas koran dan disterilisasi menggunakan autoklaf selama 30 menit. Kemudian didrying selama 15 menit. 4. Penanaman Peralatan sebelum dimasukan LAF(Laminar Air Flow), bunsen, pisau, botol, pinset, petridish, kertas buram, kertas wrap, dan tissue disterilkan terlebih dahulu dengan cara disemprot alkohol. Botol kultur yang berisi eksplan dibuka didekat bunsen yang menyala, kemudian mengambil eksplan yang mempunyai tinggi yang sama. Eksplan diletakkan pada petridish dengan pinset, dan membersihkan eksplan hingga hanya terdapat 1 batang dengan 2-4 helai daun. Eksplan ditanam dalam botol kultur sebanyak 3 buah. Setelah selesai menanam, menutup botol dengan rapat didekat nyala bunsen agar tetap steril dan disegel dengan plastik wrap. Proses penanaman dilakukan secara hati-hati dan steril untuk menghindari kerusakan eksplan dan kontaminasi. Hasil penanaman diinkubasi dalam ruang kultur yang bersuhu 250C. 5. Pengamatan Pengamatan dilakukan terhadap saat muncul akar, panjang akar, jumlah akar, tinggi eksplan, jumlah daun, saat muncul tunas, dan jumlah tunas. Pengamatan diakhiri setelah 10 bulan. E. Variabel Pengamatan Variabel yang diamati dalam penelitian ini yaitu: 1.
Saat muncul akar (hari) Saat muncul akar diamati dengan menghitung hari mulai penanaman eksplan hingga saat akar mulai muncul dari eksplan. Pengamatan dan perhitungan waktu muncul akar dilakukan apabila muncul bagian tanaman yang berwarna putih kecoklatan.
2.
Saat muncul tunas (hari) Saat muncul tunas dihitung mulai saat penanaman eksplan hingga hari pada saat tunas mulai muncul dari eksplan. Disebut tunas apabila terdapat bagian tanaman yang muncul berwarna putih kehijauan.
13
3.
Jumlah daun Jumlah daun diamati dengan menghitung banyaknya daun pada eksplan tersebut. Pengamatan dan perhitungan jumlah daun dilakukan setiap 2 minggu.
4.
Tinggi eksplan (cm) Tinggi eksplan diamati dari pangkal batang sampai ujung daun terpanjang. Pengamatan dan perhitungan tinggi eksplan diukur pada saat akhir penelitian.
5.
Jumlah tunas Jumlah tunas diamati dengan menghitung banyaknya tunas pada eksplan yang dilakukan setiap 2 minggu.
6.
Jumlah akar Jumlah akar diamati dengan menghitung banyaknya akar pada eksplan. Pengamatan dan perhitungan akar dilakukan pada akhir penelitian.
7.
Panjang akar (cm) Panjang akar diamati dengan menghitung panjangnya akar pada eksplan. Pengamatan dan pengukuran akar dilakukan pada akhir penelitian. F. Analisis data Uji F dilakukan untuk mengetahui pengaruh faktor tunggal dan interaksinya
terhadap pertumbuhan tanaman anggrek hasil persilangan Coelogyne asperata dengan Coelogyne pandurata pada taraf 5%. Apabila terdapat beda nyata dilanjutkan dengan DMRT 5% sedangkan untuk data yang tidak signifikan dianalisis dengan uji deskriptif.
