Mendlova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mendlova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Vliv účinných látek vybraných druhů koření na mikroorganismy

Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Ing. Libor Kalhotka, Ph.D

Petra Pinková

Brno 2010

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci s názvem „Vliv účinných látek vybraných druhů koření na mikroorganismy“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatuty. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MU v Brně.

Dne………………………………………… Podpis autora………………………………. Petra Pinková

Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala především vedoucímu bakalářské práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D za odborné vedení, cenné rady, věcné připomínky a za věnovaný čas, který mi vždy s ochotou poskytnul, při zpracovávání bakalářské práce. Mé poděkování patří i Ing. Zuzaně Matoušové za pomoc při zpracování praktické části bakalářské práce. A mé díky směřují i mým rodičům, kteří mi umožnili studovat a při studiu mě morálně a finančně podporovali.

ABSTRAKT Bakalářská práce je pojata formou literární rešerše na téma "Vliv účinných látek vybraných druhů koření na mikroorganismy“. Práce se zabývá kořením jako takovým, jeho definicí, klasifikací a postavením v legislativě České republiky. Nemalá pozornost je věnována i jednotlivým chemickým látkám obsaženým v koření. V další části práce je pojednáno o mikroorganismech, které mohou kontaminovat koření, zahrnuta je i jejich charakteristika a způsoby obrany proti nim. Důležitou částí práce je kapitola věnující se samotné antimikrobiální aktivitě koření. V závěru je praktické ověření inhibičního účinku koření vůči mikroorganismům.

Klíčová slova: koření, mikroorganismy, antimikrobiální aktivita

ABSTRACT Bachelor thesis is conceived of scientific literature on the topic ”Impact of active substances of selected spice against microorganisms“. The work deals with the spice as such, its definition, classification and status in legislation of the Czech Republic. Keen attention is paid to the individual chemicals contained in spice. In other part is dealing with microorganisms that can contaminate spice, their characteristics and methods of defense against them are also included in. The important part is the chapter devoted to its own antimicrobial activity of spice. In conclusion is a practical verification of the inhibitory effect of spice to the microorganisms.

Key words: spice, microorganisms, antimicrobial activity

OBSAH 1

ÚVOD.......................................................................................................... 8

2

CÍL PRÁCE................................................................................................ 9

3

SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ .......................................................... 10

3.1

Koření ....................................................................................................... 10

3.1.1

Definice koření ......................................................................................... 10

3.1.2

Koření v legislativě ČR............................................................................ 11

3.1.3

Klasifikace koření .................................................................................... 11

3.1.4

Chemické složení...................................................................................... 14

3.1.4.1

Základní látky .......................................................................................... 14

3.1.4.2

Aktivní látky............................................................................................. 17

3.2

Mikroorganismy....................................................................................... 23

3.2.1

Mikroflóra provázející koření ................................................................ 23

3.2.2

Charakteristika mikroorganismů kontaminujících koření ................. 26

3.2.2.1

Bakterie..................................................................................................... 26

3.2.2.1.1

Čeleď Enterobacteriaceae ........................................................................ 26

3.2.2.1.2

Čeleď Staphylococcaceae......................................................................... 28

3.2.2.1.3

Čeleď Bacillaceae..................................................................................... 29

3.2.2.1.4

Čeleď Clostridiaceae ................................................................................ 30

3.2.2.1.5

Čeleď Listeriaceae .................................................................................... 31

3.2.2.2

Plísně ......................................................................................................... 32

3.2.3

Způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům ............................ 35

3.2.4

Kontrolní systémy .................................................................................... 39

3.3

Antimikrobiální účinky koření ............................................................... 41

3.3.1

Mechanismus působení esenciálních olejů na mikroorganismy.......... 41

3.3.2

Způsoby měření antibakteriální aktivity............................................... 43

3.3.3

Některé z provedených výzkumů v této oblasti..................................... 44

3.3.4

Aspekty použití do budoucnosti.............................................................. 47

4

MATERIÁL A METODIKA.................................................................. 49

4.1

Charakteristika materiálu ...................................................................... 49

4.2

Příprava vzorků ....................................................................................... 50

4.3

Pracovní postup........................................................................................ 51

5

VÝSLEDKY A DISKUZE ...................................................................... 52

5.1

Výsledky stanovení .................................................................................. 52

6

ZÁVĚR ..................................................................................................... 55

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.................................................... 56

8

SEZNAM TABULEK.............................................................................. 59

1 ÚVOD Koření hraje důležitou roli v životech lidí již od dob starověku. Už v historii bylo ceněno pro své antiseptické a konzervační schopnosti. Starověcí Egypťané používali skořici, kasii, což je podřadný druh skořice, a jiné druhy koření k balzamovacím účelům. Aromatická dřeva, jako například kadidlo, byla spalována a používána takto jako popuzovadlo ke zbavení se nepříjemných pachů a k dezinfekci obydlí (Ito, 2009). Šíření rezistentních patogenů vůči lékům je jednou z nejvíce obávaných hrozeb při léčbě mikrobiálních onemocnění. Pokud se ohlédneme zpět v čase, esenciální a další výtažky z rostlin už nějakou dobu vyvolávají zájem jako zdroje přírodních produktů. Bylo testováno jejich potenciální použití jako alternativních prostředků pro léčbu mnoha infekčních onemocnění. Světová zdravotnická organizace (WHO) uvádí, že většina světové populace je v primární zdravotní péči závislá na tradičním lékařství (Prabuseenivasan, Jayakumar, Ignacimuthu, 2006). Lidé se stále častěji poohlížejí po alternativách v péči o své zdraví, prevenci a zbavení se různých chorob. Jako součást tohoto trendu byly objeveny bylinky a koření, které jsou takto schopné doplňovat obvyklé postupy v moderní medicíně. Rychle se rozrostl průmysl doplňků stravy a zahrnul do své produkce výrobky na bázi bylinek. Potravinářský průmysl poskytuje nové přípravky v oblasti péče o zdraví a zdravotní prevence a také v kategorii funkčních potravin. Mnohé z nich jsou právě potraviny obohacené různými druhy koření a bylinek (Ito, 2009). Opletal a Šimerda (2009) se zmiňují o rozvoji aplikace přírodních látek do krmiva, především v těch geografických oblastech, v nichž je doposud udržována silná tradice používání rostlinných zdrojů jako terapeutických prostředků a existuje zde příslušná technická úroveň umožňující zpracovat rostlinné suroviny na úrovni doby a zároveň pracovní teorie, že tato cesta je do budoucnosti schůdná, přinese komerční úspěch, a proto je do zemědělského a potravinářského výzkumu vkládán nemalý finanční a invenční kapitál pro jeho rozvoj. Klasickou ukázkou, demonstrující tento stav, je současná Čína, která vždy používala a dosud ve výrazné míře používá terapeutické prostředky na rostlinném a minerálním základě. Extrakty z koření a bylin se dají použít také k ošetření osiva, jde v podstatě o biologické přípravky, které můžeme takto využít místo běžně používaných mořidel. Význam těchto látek roste zejména s rozvojem ekologického zemědělství (Anonym 1).

8

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je: 1. Zpracovat literaturu formou rešerše na zadané téma. 2. Charakterizovat mikroflóru provázející koření a způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům. 3. Charakterizovat nežádoucí mikroorganismy. 4. Charakterizovat účinné látky obsažené ve vybraném koření a popsat jejich vliv na mikroorganismy. 5. Experimentálně stanovit vliv vybraných účinných látek na modelové mikroorganismy.

9

3 SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ 3.1 Koření 3.1.1

Definice koření

Definicí koření je hned několik, jsou si však velmi podobné. Zde jsou interpretace několika z nich. Americká asociace obchodu s kořením definuje koření jako „jakýkoli sušený rostlinný produkt užívaný primárně jako ochucovadlo“. Tato široká definice zahrnuje tropické plodiny jako pepř, skořici a hřebíček, byliny mírného pásu používané pro listy (dobromysl, bazalka a pelyněk), koření − semena, jako jsou sezam, kmín a hořčice, a dokonce i jako koření užívanou sušenou zeleninu (cibule, česnek) (Small, 2006). Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO), založená v Ženevě, definuje koření a přísady, jako jsou − rostlinné přípravky nebo jejich směsi (bez cizích látek), jako produkt používaný k ochucení, kořenění a vštěpování aromatu potravinám. Webster popisuje koření jako jakýkoli produkt z různých aromatických rostlin, jako je pepř, skořice, muškátový oříšek, muškátový květ, nové koření, zázvor, hřebíček atd., používaný při vaření, na ochucování omáček, nakládání zeleniny atd. Jako ochucovadlo se používá i sušená zelenina, obvykle ve formě prášku nebo také ve směsi s ostatním kořením. Slavný autor koření Rosengarten definuje koření jako výrobek, který obohacuje nebo mění kvalitu věcí, například změnu chuti jídla, plnost a ostrost, pikantnost nebo aroma jídla (Peter, 2001). Oxford English Dictionary definuje koření jako "silně vonné nebo aromatické látky rostlinného původu, získané z tropických rostlin, běžně používaných jako koření" (Weiss, 2002). Valíček (2005) uvádí další využití koření, a to pro podporu trávení, konzervaci potravin, neboť brzdí rozklad potravin. Je možné ho použít prakticky ve všech odvětvích potravinářského průmyslu, zejména při úpravě a konzervaci masa a uzenin, v cukrářství, při konzervování zeleniny a ovoce i v likérnictví. Své nezastupitelné místo má i ve farmaceutickém průmyslu, v parfumerii a kosmetice. Vedle starších domácích kořenících bylinek se i u nás začínají prosazovat ve velké míře tropická koření. Jsou to zejména sušené květy, semena, listy, kůra nebo kořeny

10

aromatických rostlin. Kdysi měly cenu zlata a byly určeny jen pro privilegovanou panskou kuchyni, dnes jsou obecně dostupné pro každého (Braunová-Bernhartová, 2005). Světové dějiny by byly podstatně chudší, kdyby nebylo koření. Krvavé války, budování obchodních cest, objevení Ameriky, papežské edikty, lékařské léčebné postupy, zkrášlující prostředky, náboženské rituály a charakteristický ráz kuchyní jednotlivých zemí − to vše má podle Craze (2002) jednoho společného jmenovatele, jímž je právě koření a jeho ceněné vlastnosti. 3.1.2

Koření v legislativě ČR

Koření je legislativně charakterizováno v prováděcí vyhlášce k zákonu o potravinách a tabákových výrobcích č. 331/1997 Sb. následovně: a) kořením se rozumí části rostlin jako kořeny, oddenky, kůra, listy, nať, květy, plody, semena nebo jejich části, v nezbytné míře technologicky zpracované a užívané k ovlivňování chutě a vůně potravin; u mletých koření se připouští přídavek protispékavých látek nejvýše do jednoho procenta hmotnosti, b) směsí koření se rozumí směs jednotlivých koření uvedených pod písmenem a), bez použití přídatných látek, u mletých a drcených směsí koření se připouští přídavek protispékavých látek nejvýše do jednoho procenta hmotnosti, c) kořenícím přípravkem se rozumí směs jednotlivých koření uvedených pod písmenem a), přídatných látek, zeleniny, soli nebo hub, případně dalších složek, d) vlastními organickými příměsmi se rozumí příměsi pocházející z vlastní rostliny koření, zejména zlomky stonků, lodyh, větviček, bobulí, plodů, listů a plody prázdné, e) cizími organickými příměsmi se rozumí části rostlin, plody a semena pocházející z jiné rostliny, f) anorganickými příměsmi se rozumí příměsi jiného než rostlinného původu, zejména hrudky hlíny, kaménky nebo písek (Vyhláška č. 331/1997 Sb.). 3.1.3

Klasifikace koření

Pro posuzování koření se nejčastěji používá takzvaná organografická metoda, tedy rozdělení podle používaných částí rostliny. Podle Valíčka (2005) se tak vytváří následujících pět základních skupin: I.

podzemní části rostlin (oddenky, kořeny, cibule, hlízy)

II.

kůra kmenů 11

III.

nať a listy

IV.

poupata a části květů

V.

plody a semena

Tab.1: Rozdělení orgánů rotlin, které slouží jako koření (Peter 2001). Orgány rostlin

Koření

květenství lusky bobule pupeny cibule pestík jádra listy

muškátový květ kassia, skořice nové koření, černý pepř a chilli hřebíček cibule, česnek, pór šafrán muškátový oříšek bazalka, bobkový list (vavřín), majoránka, máta, šalvěj, kari list zázvor, kurkuma asafoetida angelika, křen ajowan, anýz, kmín, celer, koriandr, kopr, fenykl, pískavice řecké seno, hořčice, vlčí mák

oddenky latex z oddenku kořeny semena

Běžně se z jedné rostliny používá více rostlinných orgánů, ačkoli se většinou jednomu z nich dává přednost (Small, 2006). Něco více ke každému z orgánů podle Smalla (2006): Podzemní orgány. Kořeny a oddenky (což jsou vlastně stonky) dvouletých a vytrvalých rostlin, jsou zásobními orgány umožňujícími rostlině přezimovat a na jaře znovu vyrůst. To je případ většiny kořenové zeleniny. Chuť některých rostlin používaných pro podzemní orgány je ale příliš koncentrovaná (zázvor, křen, lékořice). To může být důsledkem evolučního tlaku, kdy rostliny syntetizují takové chemické látky, které odrazují herbivory od toho, aby je konzumovali. Dalšími rostlinami používanými pro jejich aromatické kořeny (jako náhražka kávy) jsou čekanka a pampeliška. Listy, stonky a hlízy. Z mnoha rostlin se používají listy. Většinou se tyto rostliny používají přímo (např. v salátech): bazalka, pažitka, kopr, fenykl, celer, petržel a mnoho dalších. Jiné byliny se používají spíše na dochucování jídel nebo nápojů (bobkový list, šanta, yzop, máta a jiné). U některých druhů rostlin jsou konzumovanými částmi listové řapíky (reveň), u jiných se používají stonky. Česnek a mnoho jiných druhů rodu Allium je zástupcem rostlin přednostně konzumovaných pro jedlé hlízy nebo cibule.

12

Plody a semena. Sem patří především zástupci čeledi miříkovitých (viz níže). Další možná rozdělení koření uvádějí Shylaja a Peter (2004), a to sice klasifikaci podle botanické čeledi na: • Miříkovité (Apiaceae), - kam patří například kopr, celer, fenykl, libeček, petržel atd. • Hluchavkovité (Lamiaceae), - kde má své místo yzop, máta, bazalka, oregáno, majoránka, rozmarýn, tymián, šalvěj a další. • Liliovité (Liliaceae), - kam spadá pór a pažitka Weiss (2002) ve své publikaci detailně popisuje jednotlivé čeledi a jejich zástupce z řad rostlin klasifikovaných jako koření. Konkrétně zde z čeledí uvádí: • Vavřínovité (Lauraceae), - v rámci této čeledi se věnuje skořici a bobkovému listu (vavřínu). • Muškátovníkovité (Myristicaceae), - kde uvádí především muškátový oříšek a muškátový květ. • Myrtovité (Myrtaceae), - kam zahrnuje hřebíček, nové koření. • Pepřovníkovité (Piperaceae), - kde najdeme z řady koření černý pepř, a exotičtější druhy jako pepř „kubéba“, indiánský dlouhý pepř, javanský dlouhý pepř, pepř „betel“, meleguetský pepř. • Lilkovité (Solanaceae), - kde Weiss (2002) uvádí papriku a chilli. • Okoličnaté (Umbelliferae), - se zástupci jako je anýz, badyán, kmín, koriandr, římský kmín, kopr, fenykl. • Zázvorníkovité (Zingiberaceae), - kde najdeme zázvor a kurkumu. Small (2006) v rámci koření a bylin mírného pásu zmiňuje ještě čeleď hvězdnicovitých (Asteraceae), jejíž zástupci mají obvykle malé, suché a tvrdé plody, často s chmýrem. Patří sem například čekanka nebo pelyněk. A brukvovité (Brassicaceae), kam řadíme brukev řepku olejku nebo křen selský.

13

Konvenční klasifikace koření je založena na intenzitě chuťového vjemu, koření je tak děleno na: • ostré koření, • jemné koření, • aromatické koření, • bylinky a aromatická zelenina, (Peter, 2001). Shylaja a Peter (2004) uvádějí také klasifikaci podle možnosti sklizně, a to na koření: • jednoleté

bazalka, koriandr, kopr atd.,

• dvouleté

kmín, pór, petržel atd.,

• trvalky

šalvěj, bobkový list (vavřín), nové koření, kari lístky, pažitka, máta, oregáno, estragon, tymián.

Nebo také podle výšky a typu vzrůstu aromatických rostlin: • byliny

kmín, koriandr, máta, oregáno, majoránka,

• keře

rozmarýn, šalvěj, tymián,

• stromy

nové koření, lístky kari, vavřín (bobkový list),

(Shylaja, Peter, 2004). Sortiment rostlin, které slouží jako koření, je poměrně rozsáhlý. Uvádí se, že jako koření se využívá přes 200 druhů rostlin z různých částí světa (Valíček, 2005). 3.1.4

Chemické složení

3.1.4.1 Základní látky Rostliny syntetizují mnoho chemických sloučenin nutných k zajištění jejich vlastní existence. Ty se nazývají primární metabolity (Small, 2006). Jde o vysokomolekulární látky, zejména o sacharidy a z nich vznikající mastné kyseliny a tuky, dále potom aminokyseliny, které jsou základem bílkovin a enzymů (Valíček, 2005). Tyto látky jsou důležité především pro výživu a reprodukci (Small, 2006). ◦ Sacharidy jsou hlavními produkty primárního metabolismu v pravém slova smyslu a vznikají z anorganických látek pomocí fotosyntézy. Svým chemickým složením

a

fyzikálními

vlastnostmi

tvoří

velmi

různorodou

skupinu.

Dělí

se na monosacharidy neboli jednoduché cukry, například ribosu, glukosu, fruktosu a další, disacharidy, kterým je například fruktosa, a polysacharidy, z nichž nejznámější 14

jsou glukosany (škrob, celulosa, dextrin) a hexosany (například inulin). Více sacharidů obsahují kromě koření z oddenků také kůra skořice a semena pepře nebo fenyklu. Sacharidy mají rozhodující roli v zásobování organismu energií a známý je také jejich účinek při zánětech (Valíček, 2005). ◦ Bílkoviny, jde o makromolekulární látky tvořené řetězci aminokyselin. Vedle vody jsou podstatnou složkou živé hmoty s velmi různorodou funkcí. Existují například bílkoviny stavební (kolagen), transportní (albuminy, globuliny), enzymy (pepsin) a jiné. Poměrně vysoký obsah bílkovin je v semenech pískavice (Valíček, 2005). Na molekuly bílkovin jsou vázány soli a voda, případně jiné organické sloučeniny (lipidy, cukry, nukleové kyseliny, aj.). V potravinářských surovinách jsou pletiva, tkáně a buňky poškozeny. Projevuje se žádoucí nebo nežádoucí aktivita enzymů. Tepelným zpracováním probíhá denaturace bílkovin. Organismy využívají bílkoviny jako zdroj aminokyselin, dusíku, případně energie (Velíšek, 1999). ◦ Tuky neboli lipidy jsou produktem druhotné látkové výměny rostlin. Skládají se ze dvou složek, z glycerolu a vyšších mastných kyselin. Větší obsah tuku se nachází v semenech hořčice a muškátového oříšku, ale také v pískavici, badyánu a pepři (Valíček, 2005). Estery glycerolu s mastnými kyselinami tvoří 95−98 %, zbytek tzv. nezmýdelnitelný podíl je tvořen fosfolipidy, steroly, vosky, vitaminy, uhlovodíky. V rostlinných olejích je na sekundárním hydroxylu vázána obvykle nenasycená mastná kyselina s kratším řetězcem (do C18), další dvě kyseliny, nasycené i nenasycené, mají delší řetězec. V živočišných tucích se i v poloze 2 váže nasycená mastná kyselina. Vyšší obsah nenasycených kyselin vede k tekuté konzistenci (olej), naopak tuky mají vyšší podíl nasycených kyselin. Tuky a oleje se vyskytují ve všech rostlinných orgánech, ve vyšších koncentracích se jako rezervní látky ukládají zejména v plodech a semenech. Většina tuků a olejů nemá specifické farmakologické účinky, jsou indiferentní. Při aplikaci na kůži a sliznice působí jako krycí a dráždění mírnící prostředek, omezují odpařování vody, udržují vlhkost, měkkost a elasticitu kůže. Vnitřně působí projímavě. Zvláštní význam mají oleje, které jsou nositelem účinku tzv. vitaminu F. Vyskytují se zejména v klíčkových olejích (lněný, podzemnicový) a obsahují tzv. esenciální (nenahraditelné) mastné kyseliny, které nejsou savci schopni produkovat, ale musejí být dodávány potravou. Jejich dalším významným zdrojem je rybí tuk a oleje isolované např. z jater ryb. Při jejich nedostatku je narušena syntéza bílkovin, dochází k poruchám 15

metabolismu a narušuje se získávání energie. Polyenové kyseliny snižují hladinu cholesterolu v krvi, kyselina arachidonová je prekursorem biosyntézy prostaglandinů (Moravcová, 2006). ◦ Enzymy, jde o specifické látky, které se podílejí na stavbě rostliny a zprostředkovávají různé procesy látkové výměny. Skládají se z bílkoviny a koenzymu a bez jejich účasti by v organismu nevznikaly životně důležité reakce (Valíček, 2005). ◦ Organické kyseliny, nejvýznamnějšími z nich je kyselina šťavelová, citronová, jantarová, jablečná a vinná, neboť se uvádí, že právě tyto kyseliny působí v trávící soustavě dekontaminačně a regulačně. Vyskytují se především v plodech a semenech ovoce (Valíček, 2005). Některé rostlinné šťávy mohou díky těmto kyselinám dosahovat velice nízkého pH (až 2) (Small, 2006). ◦ Vláknina, jde o soubor vedlejších vysokomolekulárních (balastních) látek, které se vyskytují především ve stěnách rostlinných pletiv. Nejčastěji ji tvoří neškrobové polysacharidy a několik dalších složek rostlin jako je celulosa, lignin, odolávající hydrolytickému

účinku

trávících

šťáv,

vosky,

chitiny,

pektiny,

betaglukany

a oligosacharidy. U vyšších rostlin zpravidla plní funkci stavebního materiálu, případně zásobních látek (Valíček, 2005). Nejrozšířenějším stavebním polysacharidem je u rostlin zmiňovaná celulosa. Je nerozpustná ve vodě, zředěných kyselinách, zásadách a většině rozpouštědel. Rozpouštědly bobtná, koncentrovanými kyselinami se hydrolyzuje na kratší fragmenty, cellobiosu a až na D-glukosu. V kyselém prostředí při vyšší teplotě dochází k její oxidaci (Velíšek, 1999). ◦ Minerální látky, rozdělujeme podle množství výskytu a nezbytnosti na makroprvky a mikroprvky. Mezi prvně zmíněné patří především draslík, vápník, sodík, železo, fosfor a hořčík. Do mikroprvků neboli stopových prvků řadíme také poměrně širokou škálu prvků, ale tyto prvky nejsou pro život nezbytné, stačí jich jen malé množství. Síra, draslík a železo jsou například přítomny v česneku a cibuli, křen obsahuje vápník a draslík, mangan je v brutnáku apod. (Valíček, 2005). Minerální látky interagují s vodou, s přítomnými organickými látkami i navzájem mezi sebou. Řada složek potravin jako aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, sacharidy, organické kyseliny, fytová kyselina, fenolové látky a jiné sloučeniny, může vázat minerální látky a tím ovlivňovat jejich biologickou využitelnost (Velíšek, 1999).

16

3.1.4.2 Aktivní látky Kromě zmíněných základních látek primárního metabolismu produkují rostliny také velké množství sloučenin nazývaných sekundární metabolity. O jejich funkci se stále diskutuje. Některé z nich mohou být odpadními produkty pro rostlinu dále neužitečnými, jiné mohou být něčím, jako je naše slepé střevo, čímsi, co sloužilo rostlinám někdy v minulosti, ale dnes je pouze neužitečným rudimentem. Některé sekundární metabolity působí jako atraktanty hmyzích opylovačů. Mnohé mají antibiotické účinky v nejširším slova smyslu, působí proti plísním, bakteriím, živočichům a dokonce i proti jiným rostlinám. Každý rostlinný druh obsahuje nějaké látky, které jsou takto účinné, což podporuje teorii, že sekundární metabolity hrají důležitou roli v boji rostlin proti chorobám a herbivorům. Velká diverzita rostlinných sekundárních metabolitů vysvětluje, proč je tak velké množství rostlinných druhů v porovnání s živočichy užíváno jako dochucovadlo (ačkoli druhů živočichů je asi stokrát víc než rostlin) (Small, 2006). Sekundární metabolity jsou látky nízkomolekulárního charakteru, které vznikly druhotně. Pocházejí z původních metabolitů a nejsou pro život rostliny bezpodmínečně nutné. Často se vyskytují jen v některých rostlinných taxonech. Navíc je jejich množství a kvalita ovlivněna jak genetickým základem rostliny, tak i podmínkami prostředí. Právě tyto sloučeniny ovlivňují chuť, vůni, barvu a kvalitu koření. Na prvním místě jsou to především silice následované alkaloidy, glykosidy, barvivy, hořčinami a dalšími látkami (Valíček, 2005). ◦ Silice, známé také jako éterické nebo těkavé oleje, jsou koncentrované aromatické látky rostlin. Nacházejí se ve zvláštních buňkách v květech, listech, semenech, oplodích, kořenech, v kůře, pryskyřici a ve dřevě. Pokud se éterické oleje nacházejí v buňkách s pevnou stěnou, jako je tomu u dřeva nebo kořenů, drží si své vlastnosti i po několik let a lze je skladovat ve formě prášku (Bremness, 2000). Asi 2000 až 250000 druhů kvetoucích rostlin obsahuje silice. Čerstvé silice jsou bezbarvé. Obvykle jsou směsí uhlovodíků nebo jejich kyslíkatých derivátů, často mají charakter terpenů nebo seskviterpenů, alkoholů, esterů, aldehydů, ketonů, fenolů, etherů nebo peroxidů. Silice často vznikají v určitých tkáních rostlinného orgánu, nebo jsou koncentrovány v lysigenních nádržkách, které vznikají rozpadem buněčných stěn několika buněk. Různé čeledi rostlin často mají charakteristická místa, kde jsou silice syntetizovány (Small, 2006). 17

Silice se vytvářejí v protoplazmě buněk a hromadí se ve zvláštních buňkách, kanálcích nebo i chlupech. Jejich obsah se v průběhu růstu a vývoje rostliny mění. V současnosti známe přes 3000 silic, které se skládají z více než 1000 látek. U koření jde o nejrozšířenější obsahovou látku, a to především u čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae), zázvorovitých (Zingiberaceae) a miříkovitých (Apiaceae). Silice jsou však přítomny i u jiných druhů, a to např. v křenu, bobkovém listu, badyánu, pepři, vanilce a dalších (Valíček, 2005). Průmyslově se silice získávají destilací (tj. zahřátím a následným zchlazením směsi látek, které se tím oddělí podle jejich těkavosti). Čerstvý rostlinný materiál se zpracovává parní destilací (pára projde přes sklizené rostliny a přitom absorbuje silice, které pak kondenzují a jsou odváděny). Někdy má destilace za následek přítomnost nežádoucích příměsí, takže se může výsledný produkt svými vlastnostmi od přírodní silice lišit. Sušené rostliny bývají zahřívány ve vodě, dokud se směs páry a silic nevypaří. Silice, které jsou za vyšších teplot nestálé, se získávají mechanickým lisováním (Small, 2006). Rozhodování o kvalitě a čistotě esenciálních olejů čelí podobným obtížím jako stanovení kvality surového koření, s ohledem na přijatelné změny vzniklé při míchání odrůd určitého koření. Existuje však několik vlastností, které mohou být použity ke stanovení norem kvality. Mezi ně patří především fyzikální vlastnosti jako: - specifická hmotnost - molekulární index lomu - optická rotace - rozpustnost Jako měřítko kvality je také možné použít chemické vlastnosti. Patří mezi ně stanovení kyselin, esterů, alkoholů, aldehydů a ketonů, fenolů a jodového čísla. Některé specifické aroma testy pro halogeny lze také k nastavení standardů použít (Singhal, Kulkarni, Rege, 2001). ◦ Alkaloidy jsou dusíkaté, bazické sloučeniny, většinou přítomné ve formě solí s organickými kyselinami, jejich role v rostlinách není doposud známá, většina z nich je pro člověka prudkým jedem (Moravcová, 2006). Vznikají v rostlinném metabolismu z aminokyselin. Zatímco vlastní alkaloidy se rozpouštějí v organických rozpouštědlech, například v éteru, jejich soli jsou rozpustné ve vodě. Zásadním způsobem ovlivňují některé životní funkce organismu, neboť působí na centrální nervovou soustavu a mají buď bolest zmírňující, nebo dráždivý účinek. Často jsou vysoce toxické, ale na druhou 18

stranu jsou to velice účinné látky. Z koření je obsahuje například pepř, pískavice, černucha, paprika a další (Valíček, 2005). Alkaloidy jsou obecně obsaženy v 5−10 % nebo až ve 20 % rostlinných druhů (Small, 2006). ◦ Glykosidy, jde o sloučeniny sacharidů s látkami majícími necukernou povahu, takzvanými aglykony. Enzymy je rozkládají na cukr a rozličné organické sloučeniny, které podporují mimo jiné chuť. Často však bývají hořké a mnohdy i jedovaté. Glykosidy však podporují proces vstřebávání potravy, zklidňují dýchání a regulují srdeční činnost. Jsou obsaženy ve skořici, hřebíčku, zázvoru, muškátu, badyánu a dalších (Valíček, 2005). Ke glykosidům patří například flavonoidy, jako jsou hesperidin, kvercetin a rutin, antokyany a srdeční glykosidy, jako jsou strofantin a digitoxin. Z antibiotik k nim patří např. streptomycin (Hlava, Valíček, 2005). Jsou zásobními a ochrannými látkami rostlin. Tvorba glykosidů má pro rostlinu pravděpodobně detoxikační význam, neboť se na jejich cukernou složku váží lipofilní toxické látky a stávají se ve vodě rozpustnými a mohou být takto transportovány. Podle aglykonu se dělí na několik skupin, např. flavanoidní, steroidní, antrachinové a další (Moravcová, 2006). ◦ Saponiny jsou velmi podobné glykosidům. Jejich necukerná složka molekuly se nazývá sapogenin. Ve vodě značně pění. Ve větší koncentraci značně rozrušují červené krvinky, jsou tedy krevním jedem. Podporují však vstřebávání jiných složek léku. Působí močopudně, rozpouštějí hlen a mají mírný laxativní účinek. V léčivech působí saponiny dobře i proti houbovým a plísňovým chorobám (Hlava, Valíček, 2005). Jejich cukerná část bývá tvořena disacharidy. Saponiny se nevstřebávají sliznicí střev a žaludku. Pokud dochází v organismu ke vstřebání, jde o toxsaponiny, které jsou právě tím výše zmiňovaným krevním jedem. Některé ze saponinů působí proti křehkosti cév, jiné mají protizánětlivé účinky a některé zlepšují vykašlávání. Jsou přítomny v pískavici, tymiánu, černuše a dalších (Valíček, 2005). ◦ Hořčiny, jsou to nejedovaté bezdusíkaté látky rozmanitého chemického složení. Jsou souborem obsahových látek rostlinného původu s výrazně hořkou chutí (Hlava, Valíček, 2005). Patří rovněž převážně do skupiny glykosidů. Podporují tvorbu slin, žaludečních šťáv, peristaltiku střev a zlepšují chuť k jídlu a také vstřebávání bílkovin. Jsou zastoupeny například v zázvoru, routě, majoránce a puškvorci (Valíček, 2005). ◦ Flavonoidy, okrajově zmiňované už v souvislosti s glykosidy, jsou velmi časté sloučeniny obsažené v rostlinách. Jsou špatně rozpustné ve vodě a mají významné 19

biologické účinky, proto jsou rovněž známy jako bioflavonoidy. Působí mimo jiné proti lomivosti kapilár, hypertenzi a ateroskleróze. Velké množství těchto látek obsahuje routa, ale také albedo citrusů (Valíček, 2005). Je známo, že jsou syntetizovány rostlinami v reakci na mikrobiální infekce a nemělo by tedy být překvapivé, že byly nalezeny in vitro, aby mohly být účinně použity jako antimikrobiální látky proti širokému spektru mikroorganismů. Jejich činnost je pravděpodobně založená na jejich schopnosti vytvářet komplex s extracelulárními a rozpustnými proteiny a také komplex s bakteriální buněčnou stěnou. Flavonoidy s lipofilní povahou mohou také narušit mikrobiální membránu (Cowan, 1999). ◦ Barviva, po chemické stránce jde podle Valíčka (2005) o velmi rozdílné látky, z nichž některé mají antimikrobiální, dezodorační a léčebné účinky. Antokyany jsou červená nebo modrá barviva; karoten, lykopen a xantofyl jsou žlutá nebo oranžová barviva, některá jsou provitaminem A. Velmi rozšířeným barvivem podmiňujícím zelenou barvu je chlorofyl, který má baktericidní účinky. Kromě chuťových a aromatických látek jsou to rovněž barviva, která zlepšují vzhled potravin a tím podporují chuť k jídlu. ◦ Třísloviny, jde o bezdusíkaté látky s fenolickou povahou, uložené v buněčné šťávě nebo vakuolách. Ve vodě jsou rozpustné a mají svíravou chuť. Působí proti průjmům, krvácení, nadměrnému pocení, mají antibakteriální a antivirový účinek. Příznivě ovlivňují hnilobné procesy zažívacího traktu a záněty. Obsahuje je dobromysl, bazalka, tymián, rozmarýn a další. Do této skupiny patří i polyfenoly, které jsou příbuzné přírodním barvivům flavonoidům. Mají antioxidační a antimutagenní účinky a jsou zastoupeny například katechinem a resveratrolem (Valíček, 2005). Třísloviny neboli taniny se nalézají v téměř každé části rostlin, a to hlavně v kůře, dřevu, listech, plodech a kořenech. Jsou rozděleny do dvou skupin, na hydrolyzovatelné a kondenzované taniny. Hydrolyzovatelné taniny obsahují galovou kyselinu, vyskytující se obvykle jako ester s D-glukosou, zatímco častější kondenzované taniny (nazývané i proantokyanidy) jsou odvozeny od monomerů flavonoidu. Tato skupina látek získala v posledních letech velkou pozornost, protože je usuzováno, že příjem taninu, který je obsažen v nápojích jako je zelený čaj a červené víno, může léčit nebo předcházet řadě onemocnění. Jednou z jejich molekulárních reakcí je vytvoření komplexu s proteiny prostřednictvím tzv. nespecifické síly, tedy vytvořením vodíkové vazby a hydrofobního 20

účinku, stejně jako kovalentní vazebné formace. Způsob jejich antimikrobiální aktivity může souviset s jejich schopností inaktivovat mikrobiální adhesiny, enzymy, buněčné proteiny, buněčnou stěnu, transport látek atd. Jsou schopny také tvořit komplex s polysacharidy. Antimikrobiální význam této skutečnosti zatím nebyl prozkoumán. V rostlinách taniny inhibují růst hmyzu. Scalbert přezkoumal antimikrobiální vlastnosti tříslovin v roce 1991. Uvedl 33 studií, které dokumentují inhibiční aktivitu tříslovin. Podle těchto studií mohou být třísloviny toxické pro vláknité houby, kvasinky a bakterie. Kondenzované taniny byly testovány na buněčné stěně bachorových bakterií, kde zabraňovaly růstu a aktivitě proteas (Cowan, 1999). ◦ Fytoncidy, jde o látky, které v nepatrném množství ničí některé choroboplodné zárodky, ať už se jedná o bakterie, viry, plísně, nebo střevní parazity. Valíček (2005) ve své knize uvádí, že jsou obsaženy hlavně v cibuli, česneku a křenu, ale také v koriandru, rozmarýnu, tymiánu a dalších druzích koření. ◦ Vitamíny, jsou to specificky biologicky účinné látky, organické sloučeniny různého chemického složení, někdy také nazývané biokatalyzátory. Jsou účinné již v nepatrném množství. V drogách jejich obsah sušením značně klesá. Jejich význam jako exogenních katalyzátorů látkové přeměny je mimořádný jak v racionální výživě člověka, tak i v lékařství (Hlava, Valíček, 2005). ◦ Terpenoidy jsou početné sloučeniny lišící se ve svých chemických a fyzikálních vlastnostech. Jsou tvořeny skupinami pěti atomů uhlíku, nazývanými izoprenové jednotky, které se spolu mohou dále spojovat. Terpenoidy složené ze dvou izoprenových jednotek bývají velice těkavé a jsou často zodpovědné za vůni, která se u dané rostliny jeví jako dominantní. Terpenoidy s třemi jednotkami jsou méně těkavé, ale často modifikují aroma rostliny. Ty obsahují například šalvěj, bazalka a dobromysl. Některé větší netěkavé terpenoidy přispívají k chuťovým vlastnostem rostliny (Small, 2006). Chemicky jde o terpeny, které obsahují ještě další prvky, obvykle kyslík. Terpenoidy jsou methanol a kafr (monoterpen), farnesol a artemisin (seskviterpenoid). Artemisin a jeho derivát arteether, také známý pod názvem qinghaosu, se aktuálně používají jako antimalarika. V roce 1985 se ředitelka výboru vědecké pracovní skupiny Světové zdravotnické organizace rozhodla vytvořit na podkladu těchto látek lék pro léčbu mozkové malárie. Terpenoidy a terpeny obecně působí proti bakteriím, houbám, virům, a prvokům. V roce 1977 bylo oznámeno, že 60 % základních esenciálních olejů, které byly 21

zkoumány, inhibovalo houby, zatímco 30 % z nich inhibovalo bakterie. Mechanismus účinku terpenů není zcela znám, ale spekuluje se o jejich zapojení do membrány buňky skrze lipofilní látky a následné narušení buňky. Potravinářští odborníci zjistili, že mohou být terpenoidy vyskytující se v esenciálních olejích rostlin užitečné při kontrole Listeria monocytogenes v potravinách. U oleje z bazalky, získaného z komerčně dostupné byliny, bylo zjištěno, že je stejně účinný jako množství 125 ppm chloru použitého při dezinfekci salátových listů (Cowan, 1999). ◦ Steroidy jsou látky příbuzné terpenoidům a jsou syntetizovány jak rostlinami (většinou),

tak

živočichy.

Obecně

nejznámějším

steroidem

je

cholesterol.

Nejvýznamnější steroidy jsou produkovány zvířaty v nadledvinkách a v pohlavních žlázách, jsou to zejména pohlavní hormony. Pískavice řecké seno se komerčně využívá pro získávání prekurzorů pohlavních hormonů. Těch obsahuje tolik, že konzumace této rostliny ve velkém množství někdy vzbuzuje obavy z předávkování (Small, 2006). ◦ Chinony jsou v přírodě všudypřítomné a jsou charakteristicky vysoce reaktivní. Jsou to barevné sloučeniny a jsou odpovědné za zhnědnutí na řezu nebo při poranění dužniny ovoce a zeleniny. Přechodem mezi difenolem (neboli hydrochinonem) a diketonem (neboli chinonem) dochází snadno k oxidačně-redukčním reakcím. Jednotlivé redox potenciály daných přechodů chinon-hydrochinon jsou velmi důležité v mnoha biologických systémech. Kromě poskytování stabilních volných radikálů jsou chinony

známy

i

svým

nevratným

vytvářením

komplexů

s

nukleofilními

aminokyselinami v bílkovinách, což často vede k inaktivaci proteinu a ztrátě jeho funkce. Z tohoto důvodu je zde skvělý potenciál antimikrobiálních účinků těchto látek. Pravděpodobnými cíli v mikrobiální buňce jsou adhesiny, polypeptidy buněčné stěny a membránově vázané enzymy. Stejně jako u všech rostlinami produkovaných antimikrobiálních látek, musí být možné toxické účinky chinonů důkladně prozkoumány (Cowan, 1999). ◦ Antrachinony jsou hořké, dráždivé a projímavé látky, které někdy rovněž působí jako barviva (Peter, 2004). ◦ Kumariny jsou antibakteriální a antikoagulační látky, obvykle vonící jako čerstvě posečené seno (Peter, 2004). U hydroxyskořicové kyseliny, řadící se ke kumarinům, se zdá být patrný inhibiční účinek na grampozitivní bakterie (Cowan, 1999). ◦ Gumy a slizy jsou nevýrazné, lepkavé nebo slizké látky, které mají především zklidňující a zvláčňující účinek (Peter, 2004). Rostlinné gumy jsou amorfní látky, 22

opticky aktivní, ve vodě tvoří koloidní lepivé roztoky, reagují kysele. Vznikají přeměnou látek v rostlinných membránách. Chemicky jsou to převážně polysacharidy tvořené arabinosou, rhamnosou a galaktosou zakončené nejčastěji glukuronovou kyselinou, zpravidla se vyskytují ve formě solí vápníku, draslíku a hořčíku. Příčina tvoření rostlinných gum není zcela jasná, mohou vznikat i patologickými pochody. Používají se jako emulgátory nebo pro stabilizaci suspenzí (Moravcová, 2006). Slizy jsou polysacharidy, které vodou silně bobtnají. Pokrývají a chrání sliznice a jsou součástí projímadel. Najdeme je i v odtučňovacích čajích, čeřících prostředcích, v pivovarnictví a vinařství, nebo jako emulgátory v potravinářství (Moravcová, 2006). ◦ Pryskyřice se často nachází jako oleopryskyřice. Jsou štiplavé, adstringentní, antiseptické, s hojivými účinky (Peter, 2004).

3.2 Mikroorganismy 3.2.1

Mikroflóra provázející koření

Koření a bylinky jsou zemědělské produkty, které jsou pěstovány a sklizeny podobně

jako

ostatní

zemědělské

produkty.

Mohou

být

kontaminovány

mikroorganismy, které jsou běžně přítomné v prostředí. Kromě toho mohou být kontaminovány i jinými kontaminanty životního prostředí, jako je hmyz, výkaly hlodavců a ptáků, prach a jiné cizí materiály. Voda, která se používá pro zavlažování nebo praní, může být také zdrojem kontaminace. Koření a bylinky jsou často pěstovány v oblastech, které přispívají k růstu mikroorganismů. Nejčastěji je nalézáme v tropických a subtropických oblastech světa. Navíc jsou mnohé kroky při sklizni, manipulaci a přepravě koření a bylin velkou příležitostí pro kontaminaci (Ito, 2009). Kontaminace se zvyšuje u koření falšovaného příměsí nečistého písku (Hampl, 1968). Mnohé koření importované z méně vyvinutých zemí bývá někdy pěstované, sklízené, opracované a balené za velmi nehygienických podmínek. Z hygienického hlediska je mimořádně rizikové hnojení rostlin fekáliemi a také jejich nechráněné sušení na volném vzduchu (Görner a Valík, 2004). Studie mikrobiologie bylin a koření v různých zemích demonstrovaly přítomnost možných bakterií a toxinogenních plísní přenášených jídlem, včetně rodu Salmonella, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Bacillus cereus a aflatoxigenního Aspergillu (Ito, 2009). Stejné druhy mikroorganismů a ještě výskyt rodu C. botulinum u koření 23

uvádí i Görner a Valík (2004). Uvádějí také, že přírodní neopracované koření obsahuje obvykle velké množství sporotvorných bakterií, ale i jiné mikroorganismy (laktobacily, kvasinky a plísně). Může obsahovat patogenní bakterie (jako již zmíněné salmonely, ale také např. Listeria monocytogenes). Z uvedených příčin se v moderní výrobě potravin obvykle používají extrakty koření, které jsou zpravidla mikrobiologicky bezchybné. Pro přírodní koření se u schváleného výrobku připouští stanovitelný obsah plísní až 106 KTJ.g-1. Toto je však aplikovatelné pouze tam, kde se produkt podrobuje dostatečné tepelné úpravě. Do majonéz tedy neopracované koření není vhodné. Pokud nejsou k dispozici extrakty koření, musí se přírodní koření nejprve povařit v octu a spolu s octem následně použít (Görner a Valík, 2004). Tepelnou úpravou kořeněných potravin a jídel se podle Görnera a Valíka (2004) vegetativní formy mikroorganismů devitalizují, ale přežívají termorezistentní spóry, které opět vyklíčí a mohou způsobit vážná onemocnění a kažení připravených jídel. Mikroorganismy málo kontaminované koření je možné získat pěstováním a sběrem za přísných hygienických podmínek. Většinou však spotřebitel na způsob, jakým je koření získáváno, nemá vliv. Jak již bylo uvedeno, koření je importované z rozvojových zemí, proto jsou povolené určité technologické postupy na jeho dekontaminaci (viz kap. „Způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům“). Kontaminované koření představuje v mnohých potravinářských výrobcích (uzeniny, hotová jídla) značné hygienické a technické riziko. Určitým východiskem jsou proto již zmiňované extrakty koření. Ve státech EU jsou vypracované doporučené limity pro mikroorganismy přicházející do úvahy v rámci kontaminace koření, jídel bez další tepelné úpravy a koření určeného na přímý prodej spotřebiteli.

24

Tab. 2: Mikrobiologické limity pro koření (Görner, Valík, 2004) Mikroorganismus

Doporučený limit

Výstražný limit

−

neg. v 25g

Staphylococcus aureus

103 KTJ.g-1

103 KTJ.g-1

Bacillus cereus

104 KTJ.g-1

105 KTJ.g-1

Escherichia coli

104 KTJ.g-1

−

Sulfidredukující klostrídie

104 KTJ.g-1

105 KTJ.g-1

Plísně

105 KTJ.g-1

106 KTJ.g-1

Salmonely

Byliny a koření tak mohou zavést mikroorganismy do potravin, a tím jich řadu znehodnotit (Ito, 2009). Příznivé vlastnosti koření jsou často potlačeny nepříznivými vlivy koření na potraviny, zejména na uzenářské výrobky, k nimž se přidávají. Je pochopitelné, že silně kontaminované koření může působit nejrůznější vady i kažení uzenářských výrobků, neboť do díla zanáší početnou a nejrůznější mikroflóru. Takže například při přidání 2,3 kg mletého koření (směsi), při průměrné kontaminaci 106 mikrobů v 1 g koření se dílo jen přidaným kořením obohatí na každý gram výrobku o 2,3 . 103 mikrobů, což nemůže zůstat bez vlivu na výrobek (Hampl, 1968). Houby jsou převládající kontaminanty v koření, ale jako mikrobiální populace jsou pravděpodobně považovány za komenzální kmen, který přežil sušení a skladování. Koření může obsahovat podle druhu a způsobu opracování až 106 KTJ.g-1 spór plísní. Pokud je koření suché, tak by na něm nemělo docházet k růstu plísní a tvorbě mykotoxinů. Ve vlhkých a tepelně neupravených potravinách může být koření vážným zdrojem kontaminace mykotoxických plísní (Görner a Valík, 2004). Koření je často kontaminováno mykotoxiny. Z různých mykotoxinů uvádí Ito (2009) jako nejčastější kontaminující látku koření aflatoxin. Kontaminace aflatoxiny mleté červené papriky byla zaznamenána v několika zemích, jako je Etiopie, Itálie, Korea, Turecko a Portugalsko, kde mělo 5 až 43 % vzorků koncentraci aflatoxinu v rozmezí 0,8 až 525 µg/kg. Mikrobiální kolonie se mohou měnit v širokém rozmezí, v závislosti na koření, na tom, kde je sklizeno a jak je s ním nakládáno při sklizni, zpracování a na dopravě. V době užívání koření je mikrobiální zátěž závislá na původním mikrobiálním zatížení, schopnosti ovlivňovat růst mikroorganismů během manipulace, a na všech procesech, k nimž došlo v průběhu zpracování. Každý typ koření nebo byliny může mít různé 25

spektrum mikroorganismů (Ito, 2009). Nejvíc kontaminovaný je pepř (počet mikroorganismů v jednom gramu mletého pepře může dosahovat hodnoty až 5650000), paprika, zázvor, nejmíň hřebíček (obsahuje do 1300 mikroorganismů na gram), muškátový oříšek a muškátový květ (Arpa, Bartl, 1977). Burnett a Beuchat (2001) srovnávali metody přípravy vzorků na regeneraci rodu Salmonella ze syrového ovoce, zeleniny a bylin. Zjistili, že postup přípravy neměl na počet znovuoživení Salmonelly vliv. Bez ohledu na přípravu, byla rekonvalescence Salmonelly z bylin vždy menší než z ovoce a zeleniny. Burnett a Beuchat (2001) částečně přisuzovali tento výsledek antimikrobiálním látkám uvolněným z bylin v průběhu zpracování (Ito, 2009). US Food and Drug Administration dokončila a zveřejnila přehled dovážených výrobků. Průzkum, který začal v roce 1999, obsahoval řadu položek s čerstvými produkty. Mezi odebranými vzorky byly některé čerstvé bylinky. Průzkum určil přítomnost určitých patogenů, včetně E. coli 0157:H7, Salmonella a Shigella. Také se začala v roce 2000 prozkoumávat domácí produkce. Částečné výsledky této studie jsou k dispozici. Výsledky ukazují, že se patogeny vyskytují na čerstvých produktech v malém, ale významném množství. Kontaminace byla prokázána na domácích i dovážených produktech (Ito, 2009). 3.2.2

Charakteristika mikroorganismů kontaminujících koření

3.2.2.1 Bakterie 3.2.2.1.1 Čeleď Enterobacteriaceae Zahrnuje gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinkovité bakterie o průměru 0,5 až 1,5 µm a délce 2 až 4 µm. Enterobacteriaceae mohou být pohyblivé (peritrichní bičíky) nebo nepohyblivé; netvoří spory a dělí se podle odlišné antigenní struktury a biochemických vlastností na skupiny, rody, druhy a sérotypy (Görner a Valík, 2004). Mají velký význam z hygienického hlediska, a proto je jim v potravinářství věnována mimořádná pozornost. Mají respirační a kvasný metabolismus a většinou jsou prototrofní (Šilhánková, 1995). Čeleď zahrnuje mnoho živočišných i rostlinných parazitů, vedle toho i saprofytů rozkládajících rostlinný materiál s obsahem sacharidů. Dobře rostou na umělých živných půdách, zkvašují glukosu za tvorby kyseliny nebo

26

kyseliny a plynu (Hampl, 1968). Patří sem koření kontaminující rod Escherichia, rod Salmonella a rod Shigella.

Rod Escherichia, jeho jednotlivé druhy jsou obyvateli střevního traktu různých živočichů. Nejdůležitější je Escherichia coli, která se nachází ve spodní části střevního traktu člověka a teplokrevných zvířat, a vyskytuje se tedy i ve výkalech. Jeho přítomnost ve vodách nebo potravinách je tedy ukazatelem, že zde došlo ke znečištění fekáliemi. Pravidelně se vyskytuje v potravinářských surovinách, které byly nutně v kontaktu s hnojenou půdou. Je nejprozkoumanějším mikrobiálním druhem, neboť slouží jako modelový organismus pro biochemické, genetické i fyziologické studie. Zkvašuje cukry (např. glukosu, laktosu, některé pentosy a alkoholické cukry) za intenzivní tvorby kyselin a plynu. Tvoří z těchto cukrů hlavně kyseliny, a to především mléčnou, pyrohroznovou, octovou a mravenčí, přičemž část kyseliny mravenčí rozkládá na oxid uhličitý a vodík (Šilhánková, 1995). Patogenní kmeny E. coli mohou růst v rozmezí teplot 7−46 °C, pH 4,4−9,0 a aw nad 0,96. Naopak však nejsou nějak výjimečně odolné proti vyšší teplotě (Komprda, 2004).

Rod Salmonella, mnohé jeho kmeny dobře rostou na živných půdách, a to bez speciálních růstových faktorů, a rozmnožují se dobře také v potravinách. Některé kmeny jsou aerogenní (ze sacharidů tvoří plyny). Na polotuhých médiích vytvářejí pravidelné kolonie o průměru 2 až 3 mm, někdy i menší (Görner a Valík, 2004). Většina příslušníků uvedeného rodu (s výjimkou S. gallinarium) je peritrichinózní (tedy opatřená bičíky po celém povrchu těla), což jim propůjčuje motilitu. Optimální teplota pro růst je u tohoto rodu 37 °C s rozsahem 5−46 °C, teplota 60 °C po dobu 20 minut salmonely ničí. Inhibičně působí také pH nižší než 4, respektive vyšší než 8. Relativně odolné jsou salmonely vůči solení, vysoušení, uzení, mrazení (Komprda, 2004). Tento rod obsahuje podle nejnovějších taxonomických studií pouze 4 druhy, z nichž některé byly dříve označované jako podrody. Tyto druhy zahrnují přes 2000 sérotypů (čili sérovarů) a všechny jsou patogenní (Šilhánková, 1995). Komprda (2004) uvádí, že se rozeznává až 2500 serotypů. Wildfür (1977) shrnul druhy a sérotypy rodu Salmonella do společné skupiny tyfus − paratyfus – enteritidis (TPE). Všechny salmonely v této skupině mají určité 27

kultivační, biochemické a sérologické vlastnosti společné, ale nemají stejného hostitele a u lidí nezpůsobují stejné onemocnění. Část skupiny TPE, tyfus a paratyfus, obsahuje obligátně patogenní druhy salmonel, které jsou původci tyfových onemocnění lidí, provázených bakteriemi: Salmonella typhi, S. paratyphi A, S. schottmuelleri (syn. S. paratyphi B), S. sendai (syn. S. paratyphi K) a jiné. Tyfus a paratyfus se u lidí šíří buď přímo kontaktem, nebo jsou nejčastějšími bacilonosiči kontaminované potraviny. Významnou úlohu při přenášení těchto zárodků má i kontaminovaná pitná voda. Druhá část skupiny TPE, enteritidis, obsahuje zárodky gastroentritid (alimentárních toxikoinfekcí): Salmonella enteritidis, S. typhimurium, S. panama a další sérotypy. Pokud se rozmnoží v potravinách a překročí MID (obvykle 104 KTJ.g-1), způsobí lidem prostřednictvím endotoxinů akutní gastroentritidy (Görner a Valík, 2004).

Rod Shigella, bakterie z rodu Shigella jsou nepohyblivé gramnegativní tyčinky nefermentující laktosu. Jsou původci tzv. bakteriální dyzentérie, šigelózy a úplavice. Rod Shigella má 4 druhy: Shigella sonnei, S. flexneri (10 sérotypů), S. boydii (15 sérotypů) a S. dysenteriae (10 sérotypů). V Evropě převládají druhy S. sonnei (u nás 80 až 90 % onemocnění) a S. flexneri, méně často S. boydii. S. dysenteriae (typ 1), původce nejtěžší formy dyzentérie, se vyskytuje jen v mimoevropských zemích (Görner a Valík, 2004). Tento rod je blízce

příbuzný s E. coli, odlišujícím diagnostickým znakem

je, že u shigely chybí produkce plynu při utilizaci sacharidů a tato bakterie je laktosanegativní. Rezistence shigel je relativně nízká, pasterací je tato bakterie spolehlivě

devitalizována.

V

potravinách

se

shigely prakticky

nepomnožují

(Komprda, 2004). 3.2.2.1.2 Čeleď Staphylococcaceae Rod Staphylococcus, jedná se o grampozitivní koky o průměrné velikosti 0,5−1,5 µm. Buňky jsou sférické, uspořádané po jedné, ve dvojicích, čtveřicích, v nepravidelných shlucích, v krátkých řetízcích nejčastěji o třech buňkách či v typickém uskupení trsu hroznů. Jsou nepohyblivé, nesporulující, poměrně odolné vůči podmínkám

zevního

prostředí.

Obecně

jsou

stafylokoky

schopny

tolerovat

5−15 % NaCl v prostředí, čehož se často v praxi využívá při jejich kultivaci

28

na selektivních médiích obohacených o NaCl. Rostou v širokém rozmezí teplot, udává se rozpětí 18−40 °C, přičemž existují rozdíly mezi jednotlivými druhy. Schopnost růstu při dané teplotě je ovlivňována také původem izolovaného kmene (Anonym 2). Görner a Valík (2004) uvádějí, že stafylokoky rostou v intervalu teplot 6,5−46 °C, s optimální teplotou v rozmezí 35 až 37 °C. Kokovité buňky tohoto rodu někdy tvoří i diploformy. Stafylokoky jsou vůči dekontaminačním látkám značně odolné, snášejí záhřev na 60 °C po dobu 30 minut a dobře se rozmnožují i v potravinách s vysokým obsahem soli a cukru do hodnoty aw=0,86. Z potravinářsko-mikrobiologického hlediska jsou nebezpečné zejména hnisavé onemocnění rukou a zvýšený výskyt stafylokoků v nosohltanu. Mohou se tak dostat do potravin při manipulaci s nimi, rozmnožit se tam a produkovat stafylokokové enterotoxiny. Od předchozích rodů se liší hlavně tím, že vedle aerobního metabolismu mají i metabolismus anaerobní, takže jsou schopni zkvašovat cukry za tvorby kyselin. Tvoří žluté až oranžové kolonie, některé kmeny však tvoří i kolonie bílé. Nejdůležitější je patogenní druh Staphylococcus aureus. Dostane-li se do potravin, produkuje v nich enterotoxiny bílkovinné povahy, které mohou způsobit vážné až smrtelné otravy. K otravě dochází obyčejně tehdy, je-li koncentrace buněk Staphylococcus aureus v potravině v řádu 105 až 107/g. Původcem otravy však nejsou živé buňky, nýbrž jimi vytvořené enterotoxiny. Staphylococcus aureus rozeznáme od zbývajících druhů, které netvoří

toxiny,

na

základě

jeho

schopnosti

koagulovat

krevní

plazmu

(Šilhánková, 1995). 3.2.2.1.3 Čeleď Bacillaceae Je jen málo bakterií, které jsou odolné vůči vysušení a zvýšeným teplotám, všechny jsou členy čeledi Bacillaceae. V této čeledi jsou grampozitivní tyčinky, které se vyznačují výjimečnou vlastností, kterou nemají ostatní bakterie. Její členové tvoří za nepříznivých podmínek termo- a chemorezistentní spory. Tato vlastnost si vyžaduje v potravinářské a kulinářské technologii zvláštní pozornost. Spory jsou v buňce umístěné centrálně, terminálně nebo subterminálně. Pokud jsou spory širší jak matečná buňka, při sporulaci se v místě spory rozšíří. Rod Bacillus, je velmi rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Tvoří ho většinou grampozitivní peritrichní tyčinky, které mají bohaté enzymové vybavení, takže mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny. Většina druhů má velmi aktivní

29

amylolytické enzymy, které štěpí škrob, řada druhů má pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny, a většina druhů má velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin. Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy, z nichž některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově (např. bacitracin). Jiné druhy tvoří slizovitá pouzdra polysacharidové povahy (levany a dextrany) (Šilhánková, 1995). Bacillus cereus je aerobní a fakultativně anaerobní grampozitivní tyčinka. Její průměr je 1,0 až 1,2 µm a délka je 3,0 až 5,0 µm. Oválné spory jsou v buňce umístěné centrálně nebo subterminálně bez jejího ztloustnutí. B. cereus roste v rozmezí 10 až 48 °C, s optimem mezi 28 a 35 °C. Některé kmeny tohoto mikroba tvoří velmi odolné spory snášející velmi vysoké teploty a dávky ionizujícího záření. Častý výskyt B. cereus v masných produktech se dává do souvislosti s používáním koření při jejich přípravě. Koření bývá značně znečištěno prachem a půdou. Na vyvolání chorobných příznaků je potřeba velkého počtu buněk B. cereus (105 až 106 KTJ.g-1) v konzumované potravině. Tento počet se však dosahuje až sekundární kontaminací, t. j. po jejich rozmnožení v potravině (Görner a Valík, 2004). Šilhánková (1995) uvádí, že k otravám iniciovaným B. cereus, dochází při pomnožení této bakterie v potravině na koncentraci buněk 107 g-1 potraviny (u dětí stačí již koncentrace 105 g-1). 3.2.2.1.4 Čeleď Clostridiaceae Rod Clostridium, jeho druhy tvoří peritrichní tyčinky, které jsou grampozitivní (alespoň v mladé kultuře). Spora je obvykle širší než vegetativní buňka. Rod Clostridium je obligátně anaerobní. Kyslík inhibuje jeho růst a po 5 až 10 minutách působení usmrcuje vegetativní buňky většiny druhů. Některé druhy jsou ke kyslíku méně citlivé, a jsou proto schopny pomalého rozmnožování i za omezeného přístupu vzduchu.

Některé

druhy

mají

silné

proteolytické

schopnosti

a

uplatňují

se při anaerobním rozkladu bílkovin (např. C. sporogenes), jiné mají silné sacharolytické schopnosti. Některé druhy mají obě zmiňované vlastnosti a jiné fixují vzdušný dusík (Šilhánková, 1995). Clostridium botulinum je ubikvitárně se vyskytující bakterie v potravinách živočišného a rostlinného původu. Tvoří jedovatý exotoxin u lidí způsobující onemocnění zvané botulismus (lat. botulus = klobása). C. botulinum je tyčinkovitá,

30

pohyblivá, mírně ohnutá buňka s průměrem 0,5 až 1,0 µm a délkou 2 až 10 µm; je to striktní anaerob (Görner a Valík, 2004). Pokud jde o nároky na prostředí, vegetativní forma roste v rozmezí teplot 10−50 °C, přestává se množit při pH menším než 4,5. Klostridia jsou relativně citlivá na obsah soli. Účinnou zábranu množení klostridií v potravinách proto představuje dusitan (Komprda, 2004). Oválné spory jsou v buňce umístěné zpravidla subterminálně a obyčejně buňku v místě spory rozšiřují, obvykle do tvaru tenisové rakety. Na základě tvorby sérologicky rozlišitelných enterotoxinů s různými molekulovými hmotnostmi a aminokyselinovými sekvencemi, rozeznávají se u tohoto mikroba typy A až G. Pro člověka jsou nejvýznamnější typy A a B, případně E. Typ A tvoří nejnebezpečnější toxin. Clostridium

perfringens

je

nepohyblivá

grampozitivní

tyčinkovitá

buňka

s průměrem 0,9 až 1,3 µm a délkou 3 až 9 µm. Řadíme ji sice mezi anaerobní klostridie, ale pro její růst je postačující i snížená přítomnost kyslíku. Při sporulaci nebývá buňka v místě spory ztlustlá. Původním stanovištěm C. perfringens je tlusté střevo lidí a zvířat, ale pravidelně ho můžeme dokázat i v půdě. Podle tvorby různých toxinů se rozeznávají typy C. perfringens A až E, přičemž typy A a C jsou pro lidi nejvíce patogenní (Görner a Valík, 2004). Clostridium perfringens je mezofil, roste v rozmezí teplot 20−50 °C, s optimem kolem 40 °C; toleruje rozmezí pH 5−8,5. Jeho spory přežívají i teplotu 100 °C po dobu jedné hodiny (Komprda, 2004). 3.2.2.1.5 Čeleď Listeriaceae Rod Listeria, kde je hlavním patogenním zástupcem Listeria monocytogenes, grampozitivní, aerobní, nesporulující tyčinka. Tato bakterie se vyskytuje ve střevním traktu zvířat i člověka, v půdě, v povrchových vodách, na povrchu rostlin apod. Rezistence listérií vůči podmínkám vnějšího prostředí je značná. Listérie běžně roste v rozmezí teplot 5−45 °C, její růst není stoprocentně inhibován ani při teplotě kolem 0 °C. Snáší rozmezí hodnot pH 5−10 a velmi vysoké koncentrace soli, a to až do 10 % NaCl (Komprda, 2004). Inkubační doba (doba od požití po nástup příznaků) je při rozšíření Listeria od 3 do 70 dnů; v průměru 21 dní. U osoby s listeriózou se může rozvinout horečka, bolesti svalů a někdy i gastrointestinální příznaky, jako nevolnost nebo průjem. Pokud

31

se infekce rozšíří do nervového systému, mohou se vyskytnout symptomy, jako je bolest hlavy, ztuhlý krk, zmatenost, ztráta rovnováhy nebo křeče. U jedinců s imunitním deficitem může Listeria napadnout centrální nervovou soustavu a způsobit meningitidu nebo encefalitidu. Infekce během těhotenství může vést v horším případě k potratu, infekci novorozence, nebo dokonce k narození mrtvého dítěte (Clark, 2010). 3.2.2.2 Plísně Rod Aspergillus, druhy tohoto rodu se často vyskytují v teplejších subtropických a tropických oblastech, rostou při teplotách mezi 4 až 50 °C a jejich teplotní optimum je mezi 25 až 40 °C. Což odpovídá zemi původu většiny druhů koření. Dolní hranice tvorby aflatoxinu je podle druhu mezi 5 až 12 °C a horní hranice je 45 °C, teplotní optimum tvorby je mezi 20 až 30 °C (28 °C). Optimální aktivita vody (aw) pro růst aspergilů a tvorbu toxinů je podobně, jako u většiny ostatních plísní, při aw větším než 0,95. Některé druhy rodu Aspergillus, v porovnání s ostatními producenty aflatoxinů, jsou poměrně rezistentní vůči vysušení. Aspergllus flavus má spodní hranici růstu při aw=0,78 a tvorbu aflatoxinů při aw, které je v rozmezí 0,82 až 0,84. Hodnota pH má na tvorbu aflatoxinů jen nepřímý vliv, a to cestou přes ovlivnění růstu samotné plísně. A. flavus a A. parasiticus rostou v rozmezí pH 2 až 9, ve kterém se mohou rovněž tvořit i aflatoxiny. Maximální tvorba toxinu je mezi hodnotami pH 2,5 a 6,0 (Görner a Valík, 2004). Görner a Valík (2004) rovněž uvádějí, že A. flavus může růst i při velmi nízkém obsahu kyslíku a fermentovat může i za nepřítomnosti kyslíku. Významná inhibice růstu plísně se projevuje až při koncentraci kyslíku menší než 1 %. Skladování poživatin v řízené atmosféře (CA) se zvýšeným obsahem CO2 (více jak 20 %) a sníženým obsahem O2, sice neovlivňuje růst samotného A. flavus, ale snižuje zřetelně tvorbu toxinu. A. flavus a A. parasiticus jsou v půdě, v prachu, na rostlinách a jiných plodech.

32

Tab. 3: Výskyt zástupců rodu Aspergillus v koření podle Malíře, Ostrého a kol. (2003). Druh

Druh kontaminovaného koření

Emericella nidulans

pepř, koření (obecně)

Eurotium amstelodami

pepř

Eurotium chevalieri

koření (obecně)

Eurotium repens

červený pepř

Aspergillus clavatus

paprika, peř

Aspergillus flavipes

koriandr

Aspergillus flavus

pepř, černý pepř, koriandr

Aspergillus fumigatus

koření (obecně)

Aspergillus niger

koření (obecně), pepř, koriandr

Aspergillus ochraceus

pepř, koření (obecně)

Aspergillus penicillioides

koření (obecně), černý pepř, sušené chilli

Aspergillus restrictus

koření (obecně), černý pepř, pepř

Aspergillus sydowii

paprika, pepř, koriandr

Aspergillus tamarii

koření (obecně), pepř

Aspergillus terreus

pepř, koriandr

Aspergillus versicolor

koření (obecně), pepř, koriandr

Aspergillus wentii

pepř, koriandr

Mezi aflatoxiny, produkovanými rodem Aspergillus, je nejnebezpečnější aflatoxin B1, za ním následuje aflatoxin M1, G1, M2, B2 a G2. Podle zdravotních předpisů nesmí poživatiny obsahovat v 1 kg spolu více jak 10 µg aflatoxinů B1, B2, G1 a G2, přitom obsah samotného aflatoxinu B1 nesmí překročit 5 µg.kg-1 (Görner a Valík, 2004). Görner a Valík (2004) také uvádějí, že různými druhy rodu Aspergillus je tvořený i ochratoxin A. Kontrola kontaminace potravin tímto toxinem (místně uváděn pod zkratkou OTA) je řešena i legislativně, a to v Nařízení komise (EU) č. 105/2010 ze dne 5. února 2010, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o ochratoxin A. Evropská komise přijala toto nařízení vzhledem k důvodům, jako je velmi vysoké množství OTA, které bylo několikrát zjištěno v koření a lékořici. Pro koření a lékořici je tedy vhodné stanovit maximální limity. Existují nejnovější důkazy o tom, že v některých zemích, jež jsou hlavními výrobci koření dováženého 33

do Unie, nejsou zavedena preventivní opatření a úřední kontroly s cílem kontrolovat přítomnost ochratoxinu A v koření. Z důvodu ochrany veřejného zdraví je vhodné neprodleně stanovit maximální limit ochratoxinu A v koření. Aby mohly země vyrábějící koření zavést preventivní opatření a aby nedošlo k narušení obchodu v nepřijatelném měřítku, byl na omezenou dobu stanoven vyšší maximální limit použitelný v krátkodobém horizontu, dokud nevstoupí v platnost maximální limit, který odráží limit dosažitelný používáním osvědčených postupů. Před zavedením přísnějších limitů je vhodné posoudit, zda je v různých světových regionech vyrábějících koření možné používáním osvědčených postupů dosáhnout dodržení limitů ochratoxinu A (Nařízení komise (EU) č. 105/2010). Při determinaci aspergilů ze sekce Flavi v rámci mykologie potravin jsou vedle morfologických a biochemických znaků (produkce pigmentů vzniklých reakcí aspergilových kyselin s ionty železa [Fe3+] na AFPA agaru nebo ADMB médiu) využity i znaky fyziologické (růst na Czapkově agaru při 42 °C), kdy má např. Aspergillus nomius omezenou schopnost růstu při této teplotě. K největšímu rozvoji dochází v posledním období u molekulárně biologických metod pro identifikaci druhů rodu Aspergillus

v

potravinách

a

zjištění

jejich

toxinogenity

(PCR

metody)

(Malíř, Ostrý a kol., 2003).

Rod Penicillium, jeho příslušníci patří podle Malíře, Ostrého a kol. (2003) k nejrozšířenějším vláknitým mikromycetům teplého a mírného klimatu. Jejich spory jsou prakticky všudypřítomné, a proto jsou tyto mikromycety také velmi častými kontaminanty potravin, životního a pracovního prostředí člověka.

Tab. 4: Výskyt zástupců rodu Penicillium v koření (Malíř, Ostrý a kol., 2003). Druh

Druh kontaminovaného koření

Eupenicillium cinnamopurpureum

černý pepř

Penicillium aurantiogriseum

koření (obecně)

Penicillium brevicompactum

pepř

Penicillium citreonigrum

koření (obecně)

Penicillium citrinum

skořice, pepř, koriandr

Penicillium crustosum

pepř

34

Penicillium funiculosum

koření (obecně)

Penicillium chrysogenum

koření (obecně)

Penicillium viridicatum

koření (obecně), černý pepř

3.2.3

Způsoby boje proti nežádoucím mikroorganismům

Hampl (1968) rozděluje způsoby boje s mikroorganismy na sterilaci, dezinfekci a konzervaci. Sterilace je výkon, jímž se médium zbavuje všech živých mikrobů na něm nebo v něm přítomných. Sterilace může být absolutní, kdy jde o zbavení média všech živých mikroorganismů, nebo relativní (částečná, parciální), kdy se zbavuje médium jen části nebo určité skupiny mikrobů. Relativní sterilací je pak dezinfekce a dekontaminace, která v potravinářské mikrobiologii znamená zničení nebo odstranění choroboplodných mikrobů. Relativní sterilací je i konzervace potravin, což je tzv. praktická sterilace. V technologické praxi je veden boj proti nežádoucím mikroorganismům, tedy i proti patogenním, různými prostředky, které je možno dělit na mechanické, fyzikální, chemické a biologické.

• Mechanické prostředky. Důležitým mechanickým prostředkem je náležitá ventilace provozních místností za účelem odstranění zvířeného prachu i nadbytečné páry, která může být po vysrážení v podobě vodních kapek na stěnách, stropech a zařízení zdrojem nové kontaminace, zvláště plísní. Hampl (1968) doporučuje použití umělé klimatizace v provozech. V potravinářských závodech pracujících se surovinou znečištěnou půdou je nutno oddělit příjem suroviny a její čištění od vlastního provozu, neboť je zvířený půdní prach nositelem obrovského množství mikrobů, které pak škodí ve výrobě. • Fyzikální prostředky. Z této skupiny prostředků se používá k boji proti mikrobům tepla, filtrace, usazování, odstřeďování, různého záření, ultrazvuku a takové úpravy prostředí, aby rozmnožování a život mikrobů byly znemožněny (vysušování, zvýšení osmotického tlaku, chlazení, mražení apod.). - teplo je nejpoužívanějším prostředkem jak sterilačním, tak dezinfekčním. Suché teplo (neboli horkovzdušná sterilace) má-li být podle Hampla (1968) účinné, vyžaduje teploty nejméně 160 °C a 2 hodiny působení, takže i sporotvorné bakterie jsou spolehlivě zničeny. Suché teplo však vytváří

35

na povrchu bakterií, zvláště jsou-li v bílkovinném protředí, ochrannou vrstvu, kterou teplo velmi těžko proniká. Vlhké teplo je mnohem účinnější než teplo suché. Širší použití než vyvařování má ovšem pára. - v proudící páře se v laboratoři frakcionovaně sterilují živné půdy, které nevydrží bez změny složení sterilaci při vyšší teplotě. Tato frakcionovaná sterilace, zvaná také tyndallizací, probíhá v proudící páře při 100 °C opakovaně po dobu průměrně 30 minut vždy ve třech po sobě následujících dnech. Účinější než proudící pára je pára tlaková, jejíž teplota odpovídá dosaženému přetlaku. Sterilace tlakovou párou se provádí v autoklávech. Tlaková pára po určité době spolehlivě ničí i sporotvorné mikroby (20 až 30 minut při 1,5 at). - filtrace se uplatňuje při získávání mikrobiologicky čistého vzduchu pro citlivé výroby nebo výrobní části. Pro některé provozní místnosti se nasává vzduch jedině přes čistící filtry různého systému, kde na plátěných vložkách napuštěných olejem nebo v labyrintu tvořeném Raschigovými kroužky se zachycují ve vzduchu suspendované částečky prachu spolu s mikroby. - sterilace vzduchu elektrostatickým srážením obsažených částeček prachu a s ním i mikrobů. Vystaví-li se aerosol vlivu silného elektrického pole, což je možno dosáhnout nejen stejnosměrným, ale i střídavým proudem dostatečně vysokého napětí, ionisuje se plynné prostředí a tím se elektricky (obvykle negativně) nabíjejí i částice nasávaného aerosolu, pohybují se ke stěnám přístroje opačně nabitým, kde se vybíjejí, usazují a klesají ke dnu. Elektrostatického srážení se v praxi už hojně používá. - ultrafialové záření se v praxi používá k dezinfekci vzduchu pomocí „germicidních“ lamp, které tvoří vstupní clony do čistých místností nebo jsou ve výrobnách umístěny tak, aby se záření odráželo od stropu a neničilo tak přímými paprsky zrak pracovníků (Hampl, 1968). K ošetření potravin a surovin ultrafialovými paprsky lze používat pouze zdroje: gama záření radionuklidů 60Co nebo 137Cs (Vyhláška č. 133/2004 Sb.). - infračervené paprsky o délce vlny 7000 Å působí sterilačně jen svými tepelnými účinky, protože jsou prostředím silně absorbovány, používá se jich jen k sušení. - vysokofrekvenční proudy o délce až 0,1 mm působí svým tepelným účinkem na potlačování mikroorganismů. Průměrná účinnost převodu elektrické 36

energie na tepelnou je však nejvýše 56 %, což neúměrně zvyšuje náklady (Hampl, 1968). - ozařování ionizujícím zářením. Ozářit lze pouze potraviny a suroviny jen do výše nejvyšší celkové průměrné přípustné absorbované dávky. Pro sušené byliny, koření a kořenící přípravky je NPD 10,0 kGy. V době ozáření musí potravina a surovina splňovat požadavky na zdravotní nezávadnost potraviny s výjimkou ukazatele, pro který je ozařování prováděno. Potraviny a suroviny lze ionizujícím zářením ozářit, jen pokud: a) pro to existuje dostatečná technologická nutnost, b) nevznikne zdravotní riziko pro spotřebitele a ozáření je provedeno za dodržení podmínek stanovených vyhláškou, c) je to příznivé pro spotřebitele, d) není ozáření použito jako náhrada hygienických a zdravotních opatření nebo správné výrobní a zemědělské praxe. Ionizující záření může být použito pouze ke: a) zničení patogenních organismů, a tím snížení nebezpečí nákazy přenášené potravinami, b) omezení kažení potravin zpomalením nebo zastavením rozkladných procesů a zničením organismů přispívajících k těmto rozkladným procesům, c) redukci ztrát vznikajících předčasným zráním, rašením nebo klíčením, nebo d) zničení škodlivých organismů obsažených v rostlinných produktech a rostlinách. Maximální celková průměrná přípustná absorbovaná dávka ionizujícího záření může být aplikována jednorázově nebo v opakovaných dílčích dávkách až do výše stanovené pro danou potravinu či surovinu. A dále nesmí být ionizující záření použito v kombinaci s chemickým ošetřením, které má stejný účel. K ošetření potravin a surovin ionizujícím zářením lze použít pouze tyto druhy ionizujícího záření: a) gama záření radionuklidů 60Co nebo 137Cs, b) rentgenové záření o energii nepřevyšující 5 MeV, nebo c) urychlené elektrony o energii nepřevyšující 10 MeV (Vyhláška 133/2004 Sb.). 37

- použití ultrazvuku snižuje množství mikroorganismů až na 4 % původního počtu. Vysvětluje se to tím, že ničivý účinek ultrazvuku závisí na hmotě mikroorganismu, který má být zasažen. Hampl (1968) uvádí, že až dosažením rezonance se tělísko rozpadne. Jestliže však ozvučujeme směs různých mikrobů, pak nelze dosáhnout rezonance se všemi velikostmi mikrobů a dosáhnout sterilace nebo dezinfekce.

• Chemické prostředky. Většina dezinfekčních prostředků jsou plasmatické jedy a působí podle citlivosti mikrobů na různé části mikrobiální buňky, s nimiž se spojují. Brzdí v činnosti především mikrobiální enzymy, reagují s bílkovinami protoplasmy a tvoří s nimi sloučeniny. Povrchově účinné látky mohou působit i na lipidy buněčné membrány. Mohou měnit podmínky prostředí ve směru nepříznivém pro rozmnožování mikrobů. Jiné látky působí adsorpčně apod. (Hampl, 1968). Některé z nich (např. slabé kyseliny) vstupují do buňky volnou difuzí, jiné (např. analogy bází, aminokyselin a vitaminů) vstupují do buňky transportním systémem, kterým jsou transportovány sloučeniny o podobné chemické struktuře, tj. purinové a pyrimidinové báze, aminokyseliny nebo vitaminy. Důkaz o tom přinesly mutanty, jež mají poškozený příslušný transportní systém, a jsou proto rezistentní k inhibičnímu účinku těchto analogů. Řada antimikrobiálních látek působí však především tím, že poškozují buněčnou stěnu nebo její syntézu, další (např. silná oxidační

činidla)

poškozují

cytoplazmatickou

membránu

nebo

její

funkce

(Šilhánková, 1995). U některých mikrobů byl zjištěn návyk (adaptace) vůči účinnosti některých dezinfekčních prostředků, takže potom vznikají rezistentní kmeny, které přežívají i vyšší koncentrace těchto látek, proto je nutné dezinfekční prostředky střídat. Účinek dezinfekčního prostředku dosti kolísá a závisí na řadě faktorů: a) biologické vlastnosti mikroorganismů, b) prostředí, v němž se stýká dezinfekční činidlo s mikrobem, c) četnost mikrobů v prostředí, d) koncentrace vodíkových iontů v prostředí, e) teplota prostředí, f) koncentrace činidel, g) doba působení neboli expozice dezinfekčního prostředku. 38

Oxidační prostředky jsou nejběžnějšími dezinfekčními činidly. Používáme: - ozón, získaný elektrickým výbojem. Je dobrým oxidačním činidlem s baktericidním účinkem. Při rozkladu nezanechává obtěžující zplodiny, avšak jeho málo rentabilní výroba a nebezpečná manipulace při vyšších koncentracích způsobují, že se ho používá jen ve zředěné podobě a v menším měřítku. - ethylenoxid se zavedl k dezinfekci i sterilaci především koření a obalů. Protože je jeho bod varu 10,7 °C, musí se pracovat při nízkých teplotách (kolem 0 °C) a vzhledem k jedovatosti prostředku se musí jeho zbytky odstranit odpařením při vyšší teplotě (Hampl, 1968). Dnes už se kvůli tomu nepoužívá.

3.2.4

Kontrolní systémy

Byliny a koření jsou zemědělské produkty, které jsou konzumovány s minimálním zpracováním a často jsou konzumovány v čerstvém stavu. Vzhledem k tomu, že je důležité

kontrolovat

možné

znečištění

produktu

na

cestě

od

farmy

až ke spotřebiteli, měly by všechny subjekty v celém potravinovém řetězci přispět svým dílem k minimalizaci kontaminace potravin. Jedním ze způsobů, jak toho dosáhnout, je zavedení zásad správné zemědělské praxe. V létě roku 1997 byl v zemědělském sektoru z těchto důvodů vydán dokument s přesnými pokyny pro provádění praxe. Ten byl v roce 1998 následován dobrovolnými pokyny Americké asociace pro potraviny a léčiva. Pokyny měly za cíl napomoci zvýšení bezpečnosti potravin na cestě od farmy až ke spotřebiteli. Pokyny byly založeny na sedmi základních principech: 1. Předcházet kontaminaci, spíše než řešit její následné odstranění. 2. Minimalizovat rizika při dodržování bezpečnosti potravin, dobré zemědělské praxe a postupů řízení. 3. Čerstvé produkty mohou být kontaminovány kdekoli v potravinovém řetězci. 4. Kvalita vody ovlivňuje potenciál kontaminace. 5. Chlévské mrvy a organická hnojiva by měla být používána s opatrností. 6. Hygiena pracovníků a sanitační praktiky jsou velmi důležité. 7. Dodržování všech platných zákonů a předpisů. Kromě toho je potřeba dobré vedení záznamů o tom, kde byl produkt vypěstován a veškeré informace o jeho distribuci. Pokud by tyto informace nebyly dostatečné, byla by obtížná dohledatelnost produktu v případě způsobení onemocnění (Ito, 2009).

39

Systémy zajištění kvality surovin by měly být plánovány a dokumentovány pomocí analýzy rizik a kritických kontrolních bodů (HACCP). Jakýkoli systém zabezpečování jakosti by měl začínat komplexní specifikací surovin od dodavatelem, pokud je to možné. Specifikace musí být doloženy při auditu dodavatele za účelem ověření, že dodavatel má odborné znalosti, technologie a systém zabezpečování jakosti pro splnění dohodnutých specifikací. V mnoha případech, i vzhledem k nedostatku infrastruktury a zdrojů v rámci mnoha dodavatelských zemí, musí být dodavatelé schopni splnit všechny aspekty specifikace. Za těchto okolností musí firma při nákupu materiálu

spoléhat

na

účinnost

systémů

zajišťujících

kvalitu

surovin.

Muggeridge a Clay (2001) také uvádějí, že úspěch většiny těchto systémů je založen především na zkušeném personálu. První kontrola by měla spočívat v celkové kontrole produktu. Základem první kontroly je hledat napadení plísní ve velkém měřítku, použití nepřijatelných obalů, hlodavci zamořený nebo nevhodný kontejner, např. dříve používaný pro chemikálie, které kontaminovaly koření nebo byliny apod. Systém řízení jakosti pak dále zahrnuje odběr vzorků a vyšetření suroviny. Testy by měly být zpočátku fyzikální, tedy mělo by se prozkoumat množství prachu (pomocí sít nebo podle potřeby), přítomnost a množství cizorodých látek atd. Potom je potřeba zkontrolovat barvu, chuť a celkový vzhled suroviny. Tyto vzorky by měly být poté zálohovány pro zkoušky významné pro charakter výsledného produktu. Jedná se o zkoušky na obsah těkavých olejů, vlhkosti, množství popela, popela rozpustného kyselinou atd. Veškeré testy specifické pro daný materiál by měly být rovněž provedeny v tomto okamžiku. Mikrobiologická vyšetření by měla být v této fázi prováděna na přítomnost bakterií Salmonella a E. Coli a produkt následně propuštěn při dosažení požadovaných parametrů (zpravidla Salmonella ND/25g, E. Coli ≤100 KTJ/g). Během tohoto období by měla být testovaná surovina pozastavena. Nepřijatelný materiál by měl být zamítnut, nebo v některých případech může být repasován, tedy přečištěn, sušen apod., tak, aby spadal do rámce požadovaných parametrů. Mikrobiologicky nevyhovující materiál může být v této fázi ošetřen buď plynem, nebo tepelně. Rovněž by měly být do systému začleněny postupy pro detekci kovů všeho druhu s využitím detekce kovů magnety v příslušných fázích zpracování a jejich povinné používání bezprostředně před balením. Používání analýzy rizik a kritických kontrolních bodů (HACCP) je důležité, aby byla možnost vyhodnotit potenciální bezpečnostní rizika vyskytující se v průběhu mnoha kroků v produkci 40

výrobku. Používání zásad HACCP umožňuje hodnotit oblasti, které jsou kritické pro bezpečnost potravin. Analýza rizik je důležitým krokem v tomto procesu. Důležité kroky musí být provozovány v rámci známých limitů. Jakmile jsou stanoveny limity, postupy musí být zvoleny tak, aby šlo provoz kontrolovat a ověřovat. Limity musí být rovněž pravidelně aktualizovány. Pokud nejsou limity plněny, došlo k odchylce, kterou je třeba opravit. Pokud si tato oprava vyžaduje změnu v celém plánu, tak potom musí být

taková

změna

dokumentována

a

doložena

odpovídajícím

způsobem

(Muggeridge, Clay, 2001).

3.3 Antimikrobiální účinky koření 3.3.1

Mechanismus působení esenciálních olejů na mikroorganismy

Jen málo studií se zaměřuje na mechanismus, kterým koření nebo jeho éterické oleje brzdí mikroorganismy v jejich růstu. I vzhledem k tomuto zjištění se došlo k závěru, že jsou terpeny v esenciálních olejích koření primárními antimikrobiálními látkami, a celý mechanismus s největší pravděpodobností iniciují právě tyto sloučeniny. Mnoho z nejaktivnějších terpenů, např. eugenol, thymol a karvakrol, jsou fenolické povahy. Proto bychom mohli považovat za odůvodněné, že mohou být jejich způsoby reakcí spojovány s jinými fenolickými sloučeninami, míní Davidson (2001). Obecně platí, že míra účinku silic je do značné míry závislá na jejich koncentraci. Silice v nízkých koncentracích inhibují enzymy spojené s výrobou energie, zatímco ve vyšších koncentracích mohou srážet bílkoviny. Je však nejisté, zda poškození membrány souvisí s kvantitativním množstvím účinné antimikrobiální sloučeniny, kterému je buňka vystavena, nebo je účinek takový, že poté, co vzniknou malá poškození buňky, jsou postupně následována zánikem celé buňky. V tomto případě by tedy podle Tassou, Nychas, Skandamis (2004) nerozhodovalo množství účinné antimikrobiální látky. Esenciální oleje poškozují strukturální a funkční vlastnosti membrány buněk a to se odráží i v rozptýlení dvou složek proton-motivní síly, a to na pH gradientu a elektrickém potenciálu. U karvakrolu, aktivní součásti mnoha esenciálních olejů, bylo prokázáno, že destabilizuje cytoplazmatické a vnější membrány a působí jako odnímatel protonů, což vede ke snížení pH gradientu přes cytoplazmatickou membránu. Zhroucení proton-motivní síly a vyčerpání zásob ATP nakonec vedlo k buněčné smrti. Stejně jako 41

mnoho jiných konzervačních látek, éterické oleje způsobují únik iontů, ATP, nukleových kyselin a aminokyselin. Stejně jako karvakrol, tak i éterické oleje z máty a čaje způsobují únik buněčného materiálu, včetně iontů draslíku. Syntéza živin, nukleových kyselin a syntéza ATPázy mohou být také ovlivněny, což vede k dalšímu poškození buňky. Několik zpráv rovněž ukázalo, že většina éterických olejů (při koncentraci

100 mg/l)

narušuje

respirační

aktivitu

bakterií

a

kvasinek

(např. Saccharomyces cerevisiae) (Tassou, Nychas, Skandamis, 2004). Na rozdíl od mnoha antibiotik, jsou esenciální oleje schopné získat přístup k periplasmě gramnegativních bakterií prostřednictvím porinových bílkovin vnější membrány. Propustnost buněčných membrán je závislá na jejich složení a hydrofobicitě rozpuštěných látek, které přes ni procházejí. Nízké teploty snižují rozpustnost silic a brání jim v pronikání lipidovou fází membrány. Rozdělovací koeficient silic v buněčných membránách je rozhodujícím determinantem antimikrobiální účinnosti. Rozpustnost základních stopových prvků, jako je železo, je éterickými oleji negativně ovlivněna. V důsledku toho by mohla snížená dostupnost železa brzdit růst bakterií. Kromě toho mohou reakce iontů železa s fenolickými sloučeninami nepřímo poškozovat buňky tím, že způsobí oxidační stres. Vysoce reaktivní aldehydové skupiny některých

antimikrobiálních

látek

rostlinného

původu

tvoří

Schiffovy

báze

s membránovými proteiny a tím zabraňují biosyntéze buněčné stěny. Fenoly, éterické oleje a fytoalexiny obecně mají spíše statické než přímé toxické účinky vůči buněčným membránám. Jejich působení nemusí nutně vést k buněčné smrti, ale bude s největší pravděpodobností příčinou zpomalení metabolických procesů, jako je buněčné dělení (Tassou, Nychas, Skandamis, 2004). Antibiotika a související drogy podstatně snížily hrozbu, kterou byly infekční choroby v minulém století. Nicméně, Tassou, Nychas a Skandamis (2004) poukazují na to, že se šíření rezistence bakterií vůči antibiotikům v poslední době stává velkým problémem. Tato schopnost se rozšířila na všechny mikroorganismy vystavené antimikrobiálním látkám, včetně takzvaných "přírodních" látek. Je tu však poměrně málo informací o mechanismech rezistence mikroorganismů vůči antimikrobiálním látkám rostlinného původu. Podle Tassou, Nychas a Skandamis (2004) Deans a Ritchie (1987), kteří studovali vliv 50 rostlinných silic proti 25 rodům bakterií, došli k závěru, že grampozitivní a gramnegativní organismy byly na účinek antimikrobiálních silic stejně citlivé. Nicméně, tento závěr je nyní sporný. Obecně platí, že grampozitivní 42

bakterie jsou citlivější než gramnegativní bakterie na antimikrobiální látky v koření. Avšak, změna v rychlosti a rozsahu inhibice je patrná i napříč gramnegativními bakteriemi. Například, E. coli by měla být vůči éterickým olejům ze šalvěje, rozmarýnu, kmínu, hřebíčku a tymiánu méně odolná, než Pseudomonas fluorescens nebo Serratia marcescens. Salmonella enteritidis a typhymurium byly na šalvěj méně citlivé než P. fragi, zatímco Salmonella typhimurium byla na éterické oleje z oregána a tymiánu více citlivá než P. aeruginosa. Pseudomonas putida a P. aeruginosa byly shledány jako poměrně tolerantní vůči esenciálním olejům. Odtokové systémy mikroorganismu, které se nacházejí ve vnější membráně buňky, byly navrženy jako možné mechanismy rezistence. Mutanti E. coli a subpopulace Staphylococcus aureus byli vůči olejům z borovice a tea-tree čaje rezistentní, respektive, bylo to takto publikováno (Tassou, Nychas, Skandamis, 2004). 3.3.2

Způsoby měření antibakteriální aktivity

Antimikrobiální aktivita sloučenin rostlinného původu proti mnoha různým mikroorganismům, zkoušená jednotlivě a metodami in vitro, je v literatuře dobře zdokumentována. Nicméně, výsledky publikované v různých studiích lze přímo jen obtížně srovnávat. O účinku stejných antimikrobiálních látek byly od různých autorů zaznamenány rozporuplné údaje. Také není z dostupných informací vždy zřejmé, zda jde o postupy ověřující bakteriostatickou nebo baktericidní aktivitu, nebo kombinaci obou. Antimikrobiální zkoušky popsané v literatuře zahrnují měření: • poloměru nebo průměru zóny inhibice růstu bakterie kolem papírových disků napuštěných (nebo jamek obsahujících) antimikrobiální sloučeninou, umístěných na agarových nosičích; • inhibice růstu bakterií na agaru s antimikrobiální sloučeninou rozptýlenou přímo v agaru; • minimální inhibiční koncentrace (MIC) antimikrobiální látky v kapalném médiu; • změny optické hustoty nebo celkového odporu v kapalném růstovém médium obsahujícím antimikrobiální látku. Tři hlavní faktory, které mohou ovlivnit výsledek výše popsaných metod s použitím éterických olejů z rostlin: a) složení testovaného vzorku (druh rostliny, zeměpisná poloha a roční doba), b) mikroorganismus (kmen, podmínky pro růst, zvolené inokulum atd.),

43

c) metoda používaná pro růst a výčet přežívajících bakterií (Tassou, Nychas, Skandamis, 2004). 3.3.3

Některé z provedených výzkumů v této oblasti

Hlavní antimikrobiální složkou hřebíčku a skořice je eugenol [2-methoxy-4-(2propenyl)-fenol], cinnamikaldehyd (3-fenyl-2-propenal), karvakrol a thymol. Skořice obsahuje od 0,5 až do 10 % těkavých olejů, z nichž 75 % tvoří cinnamikaldehyd a 8 % eugenol. Hřebíček obsahuje 14 až 21 % těkavého oleje, z 95 % je to eugenol. Davidson (2001) cituje některé ze studií ostatních odborníků v oboru. Jejich shrnutí bude v následujícím textu. Fabian et al. (1939) zkoušel 10% výtažky skořice a hřebíčku proti B. subtilis a S. aureus a zjistil, že skořice má pouze mírné inhibiční účinky, zatímco extrakt z hřebíčku byl při ředění 1:100 proti B. subtilis a 1:800 proti S. aureus velmi inhibiční. Zaika a Kissinger (1981) ukázali, že hřebíček při 0,4% obsahu ve složení Lebanon bologni (masném výrobku s danou recepturou) inhibuje růst bakteriální startovací kultury a produkci kyseliny mléčné, zatímco skořice při 0,8% zastoupení brzdí její růst jen mírně. Obě koření stimulují produkci kyseliny v nízkých koncentracích. Vodný výluh hřebíčku (0,1% až 1,0% [hm/V]) a eugenol (0,06%), inhibují klíčící spory B. subtilis na živném agaru (Al-Khayat, Blank 1985). Stecchini et al. (1993) prokázali, že esenciální olej z hřebíčku při 500 µg/ml inhibuje růst Aeromonas hydrophila na mikrobiologickém médiu, u vakuově a normálně baleného vařeného vepřového. Smith-Palmer et al. (1998) stanovil na agaru ředícím testem, že 24-hodinová MIC éterických olejů skořice a hřebíčku proti C. jejuni, E. coli, Salmonella sérovar Enteritidis, L. monocytogenes a S. aureus je podle pořadí uvedených mikroorganismů 0,05; 0,04−0,05; 0,04−0,05; 0,03 a 0,04 %. Azzouz a Bullerman (1982) hodnotili 16 mletých bylin a koření, v zastoupení 2 % (hm/V) v roztoku, proti devíti druhům Aspergillus a Penicillium, které produkují mykotoxiny. Jako nejúčinnější hodnotili hřebíček, který inhibuje růst iniciovaný při 25 °C pro všechny druhy, po více než 21 dnů. Skořice je podle nich dalším nejúčinnějším kořením, brání v růstu třem druhům Penicillium po více než 21 dnů. Bullerman (1974) uvádí mimo jiné, že 1,0% zastoupení skořice v biskupském chlebíčku inhibuje růst a produkci aflatoxinu u A. parasiticus. Antimikrobiální aktivita oregána a tymiánu je přičítána jejich éterickým olejům, které obsahují terpeny - karvakrol [2-methyl-5-(1-methylethyl)fenol] a thymol

44

[5-methyl-2-(1-methylethyl)fenol]. Firouzi et al. (1998) uvádí, že byl éterický olej tymiánu, ve srovnání s řadou dalších koření a bylinných extraktů, nejvíce efektivním antimikrobním prostředkem proti růstu L. monocytogenes 4b. Stejně tak byl nejúčinnější antimikrobiální látkou, mezi 15 esenciálními oleji, éterický olej tymiánu, který zkoušeli Smith-Palmer et al. (1998) proti C. jejuni, E. coli, Salmonella sérovar Enteritidis, L. monocytogenes

a

S.

aureus.

MIC

esenciálního

oleje

byla

v

rozmezí

0,02 až 0,05 % a minimální baktericidní koncentrace byla od 0,03 do 0,1 %. Tyto sloučeniny mají inhibiční aktivitu proti řadě bakterií, plísní, kvasinek, včetně B. subtilis, E. coli, L. plantarum, P. cerevisiae, P. aeruginosa, Proteus druhům, Salmonella sérovar Enteritidis, S.aureus, V. parahaemolyticus a A. parasiticus. Ultee et al. (1999) stanovil při své práci, že byla po aplikaci karvakrolu k antimikrobiálním účelům vyčerpána intracelulární ATP, snížil se membránový potenciál a zvýšila se propustnost cytoplazmatické membrány B. cerea, což vedlo následně k inhibici a nakonec ke smrti buňky. Šalvěj a rozmarýn jsou také antimikrobiálně aktivní. Aktivními frakcemi šalvěje a rozmarýnu mohou být terpenové frakce silic. Rozmarýn obsahuje především borneol (endo-1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-ol),

spolu

s

pinenem,

camphenem

a kafrem, zatímco šalvěj obsahuje thujon {4-methyl-1-(1-methylethyl)bicyklo[3.1.0.]hexan-3-one}. Při 2% obsahu v růstovém médiu jsou šalvěj a rozmarýn více účinné proti grampozitivním než gramnegativním bakteriálním kmenům. Inhibiční účinek těchto dvou koření je při 0,3% obsahu bakteriostatický, zatímco při 0,5% obsahu působí na grampozitivní kmeny baktericidně. Při testování 18 druhů koření proti L. monocytogenes

v

kultivačním

médiu,

Pandit

a

Shelef

(1994)

shledali,

že nejefektivnější sloučeninu obsahoval rozmarýn. Inhibiční složkou s nějvětším účinkem se v rozmarýnu jevil α-pinen. Smith-Palmer et al. (1998) prokázali, že rozmarýn (0,02 do 0,05 %) a šalvěj (0,02 až 0,075 %) inhibovali grampozitivní L. monocytogenes

a

S.

aureus,

ale

ne

gramnegativní

bakterie.

Dále,

Pandit a Shelef (1994) ukázali, že růst L. monocytogenes Scott A v chlazené čerstvé vepřové klobáse byl zpomalen 0,5% obsahem mletého rozmarýnu nebo 1% obsahem rozmarýnového esenciálního oleje. V kontrastu, Mangena a Muyima (1999) uvedli malou antimikrobiální aktivitu esenciálního oleje z rozmarýnu proti bakteriím a kvasinkám při použití agar-difúzní metody. Nedostatečná účinnost by mohla být v tomto případě zapříčiněna typem zvoleného testu. Citlivost B. cereus, S. aureus 45

a Pseudomonas sp. na šalvěj je největší v mikrobiologickém prostředí a je významně snížena přítomností rýže, kuřecího masa a nudlí. Ztráta aktivity může být způsobena solubilizací antimikrobiálních frakcí v lipidech potravin. Hefnawy et al. (1993) hodnotil 10 druhů bylin a koření na dvou kmenech L. monocytogenes v tryptózovém bujónu. Nejúčinnějším kořením byla při jeho pokusu šalvěj, která při 1% obsahu zapříčinila pokles životaschopnosti L. monocytogenes o 5 až 7 řádů za 1 den při 4 °C. Nové koření bylo dalším nejúčinnějším kořením při zneškodňování mikroorganismů v průběhu 4 dnů. Bazalka (Ocimum basilicum L.), její éterický olej má omezenou antimikrobiální aktivitu, spolu s linaloolem a methyl chavikolem, primárními antimikrobiálními látkami. Éterický olej z bazalky, ve formě extraktu, působí proti některým plísním, včetně Mucor a Penicillium druhů, ale má malý účinek proti bakteriím (Lachowicz et al., 1998). Kmeny B. cereus a Salmonella sérovar Typhimurium byly na bazalku citlivé nejvíce. Wan et al. (1998) použil esenciální olej bazalky, linalool a methyl chavikol proti 35 kmenům bakterií, kvasinek a plísní. Opět se potvrdila omezená účinnost těchto látek proti většině mikroorganismů s výjimkou Mucor a Penicillium spp. V kontrastu k uvedenému Wan et al. (1998) zjistil, že methyl chavikol (0,1%) ve filtračně-sterilizovaném supernatantu z čerstvého hlávkového salátu snížil životaschopnost A. hydrophila o 5 řádů, směs byla stejně účinná jako 125 µg chloru na ml. Smith-Palmer et al. (1998) uveřejnil se svým týmem MIC bazalkového esenciálního oleje o obsahu 0,25; 0,25; 0,1; 0,05 a 0,1 % u C. jejuni, E. coli, Salmonella sérovar Enteritidis, L. monocytogenes a S. aureus, mikroorganismy jsou uvedeny v pořadí odpovídajícím použitému procentu oleje na jejich inhibici. Yin a Cheng (1998) zjistili v testu s papírovými disky, že vodné výluhy z bazalky nebo zázvoru nevykazují žádnou antifugalní aktivitu proti A. flavus nebo A. niger. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd) je hlavní složka vanilkového lusku, tobolky orchideje (Vanilla planifola, Vanilla pompona nebo Vanilla tahitensis). Vanilin je nejvíce účinný proti plísním a grampozitivním bakteriím nevykazujícím mléčné kvašení (Jay et al., 1984). López-Malo et al. (1995) připravili agary na ovocném základu, obsahující mango, papáju, ananas, jablko a banán, a obsahem 2000 µg vanilinu na ml a naočkovali každý z nich s A. flavus, A. niger, A. ochraceus nebo A. parasiticus. Vanilin v zastoupení 1500 µg/ml významně inhiboval všechny kmeny Aspergillus, ve všech médiích. Cerrutti a Alzamora (1996) demonstrovali úplnou inhibici růstu 46

po dobu 40 dnů při teplotě 27 °C u Debaryomyces hansenii, S. cerevisiae, Z. bailii a Zygosaccharomyces rouxii v laboratorním médiu a jablečném pyré s aktivitou vody 0,99 a 0,95 a obsahu 2000 µg vanilinu na ml. Pro porovnání, dávka 2000 µg/ml vanilinu nebyla účinná proti kvasinkám v banánovém pyré. Výzkumy přičítají tuto ztrátu aktivity navázání fenolického vanilinu bílkovinami nebo tuky v banánu a mangu, tento jev byl prokázán i pro jiné antimikrobiální fenolické sloučeniny. López-Malo et al. (1997, 1998) studovali vliv koncentrace vanilinu, pH a teploty inkubace na A. flavus, A. niger, A. ochraceus a A. parasiticus rostoucích na agaru z bramborové dextrosy. V závislosti na druhu, měl vanilin na růst plísní, v kombinaci se sníženým pH, buď aditivní, nebo synergický účinek. Nejcitlivější byl A. ochraceus (MIC=500 µg/ml při pH 3,0 a teplotě ≤25 °C nebo při pH 4,0 a teplotě ≤15°C) a nejodolnější byl A. niger (MIC=1000 µg/ml, pH 3,0; 15 °C). Cerrutti et al. (1997) využil právě vanilinu k produkci jahodového pyré, které je skladovatelné při pokojové teplotě a nemusí být uchováváno v chladu. Zkombinoval 3000 µg/ml vanilinu, 1000 µg/ml laktátu vápníku a 500 µg/ml kyseliny askorbové, aby zamezil u jahodového pyré, okyseleného kyselinou citronovou na pH 3,0 a upraveného sacharosou tak, aby aktivita vody byla 0,95, po dobu delší než 60 dnů růstu přirozené mikroflóry a naočkovaných kvasinek (Davidson, 2001). Davidson (2001) však také uvádí, že mnohé druhy koření sice byly testovány, ale ukázalo se, že mají antimikrobiální aktivitu omezenou nebo dokonce žádnou. Patří k nim anýz, bobkový list (vavřín), černý pepř, kardamon, cayenský pepř, celerové semeno, chilli prášek, koriandr, kmín, kari koření, kopr, pískavice řecké seno, zázvor, jalovcový olej, muškátový květ, majoránka, muškátový oříšek, fialkový kořínek, paprika, sezam, máta, estragon a bílý pepř, na čemž se shodlo hned několik týmů autorů, a to Davidson, Naidu (2000); Fabian, Krehl, Little (1939); Marth (1966). 3.3.4

Aspekty použití do budoucnosti

Rostlinné éterické oleje dávají potravinám výraznou chuť a aroma, do budoucna jejich použití jako konzervačních látek spočívá v pečlivém výběru a hodnocení jejich účinnosti při nízkých koncentracích, v kombinaci s jinými chemickými konzervanty nebo konzervačními procesy. Synergické kombinace byly zjištěny mezi výtažky z česneku a nisinu, karvakrolu a nisinu, vanilinu nebo citralu a sorbanu, tymiánového

47

oleje a cinnamaldehydu, a nízkými dávkami gama záření a výtažky z rozmarýnu a tymiánu (Tassou, Nychas, Skandamis, 2004).

48

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika materiálu Pro tento pokus byly zvoleny běžně dostupné druhy koření. Právě takové koření, které je spotřebiteli v maloobchodním měřítku hojně využíváno, s cílem zjistit, zda si i po delší dobu uchovávané koření dokáže podržet své antimikrobiální vlastnosti. Jednotlivá koření jsou uvedena v následující tabulce:

Tab. 5: Jednotlivé druhy koření a jejich množství použité pro pokus. Vodný výluh

Druh koření

Latinský název

Hřebíček

Syzygium aromaticum

5

Skořice

Cinnamonum verum

5

Oregáno

Origanum vulgare

5

Tymián

Thymus vulgaris

5

Zázvor

Zingiber officinale

5

[g]/50ml

Z mikroorganismů byli použiti pro srovnání antimikrobiálního účinku koření jak grampozitivní, tak i gramnegativní zástupci, a to konkrétně: -

Bacillus cereus,

který je grampozitivní (G+) aerobní sporulující bakterií; s optimem růstu při 30 °C -

Micrococcus luteus,

který je taktéž grampozitivní (G+) aerobní bakterií; optimum růstu má v rozmezí 25−37 °C -

Bacillus megatherium,

je grampozitivní (G+) sporulující bakterií; optimální růst vykazuje při 30 °C; bujónová kultura toho mikroorganismu byla použita pouze u stanovení inhibičního účinku zázvoru (Zingiber officinale). -

Serratia marescens,

je gramnegativní (G-) bakterií s optimem růstu při 37 °C

49

-

rod Pseudomonas,

je také gramnegativní (G- ); optimální růst vykazuje při 30 °C; bujónová kultura toho mikroorganismu byla použita pouze u stanovení inhibičního účinku zázvoru (Zingiber officinale).

Pro stanovení antimikrobiální aktivity koření byla zvolena disková difuzní metoda. Růstovým médiem byl pro všechny mikroorganismy MPA (masopeptonový agar).

4.2 Příprava vzorků Bylo

naváženo 5

g od každého druhu

koření a jednotlivě vpraveno

do Erlenmayerových baněk s 50 ml sterilní destilované vody o teplotě 90−100 °C. Koření bylo v baňce ponecháno 30 minut na louhování. Pro účely stanovení inhibičního účinku koření byly použity předem připravené 24h bujónové kultury zmiňovaných mikroorganismů. Složení živného bujónu: - hovězí odvar koncentrovaný (sušina)

5,00 g

- pepton pro bakteriologii

5,00 g

- živný základ č.1

6,25 g

- živný základ č. 2

6,25 g

- chlorid sodný

2,50 g

- pH

7,0 ± 0,2

Příprava bujónu probíhala dle přesného návodu na obalu: 25 g živného bujónu se rozpustí za tepla ve 1000 ml purifikované vody; po úplném rozpuštění se rozplní do zkumavek a sterilizuje se 20 minut při 115 °C.

Složení živného média - Masopeptonový agar (MPA); složení [g/l]: - masový pepton

10,0

- hovězí extrakt

10,0

- chlorid sodný

5,0

50

- agar

15,0

- konečné pH (při 25 °C)

7,2 ± 0,2

Příprava živného média: V 1000 ml destilované vody bylo rozpuštěno 40 g MPA. Směs byla zahřívána do úplného rozpuštění a následně vysterilizována v autoklávu při 121 °C po dobu 15 minut.

4.3 Pracovní postup Do předem vysterilizovaných Petriho misek bylo nalito živné médium o teplotě 45 °C do výšky 4−5 mm. Agar se nechal ztuhnout. A poté byl aplikován pomocí mikropipety 0,1 ml bujónové kultury jednotlivých mikroorganismů. Kultura byla za použití skleněné tyčinky rozetřena po celém povrchu živné půdy v Petriho misce. Po zaschnutí inokula byly na povrch umístěny vždy 3 terčíky (papírové disky) o průměru 13 mm, které byly předtím namočeny do výluhů z jednotlivých koření. Každý z výluhů koření byl aplikován třikrát. Pro každý druh koření byla každá bujónová kultura mikroorganismů zaočkována dvakrát. Petriho misky zaočkované s Bacillus cereus, Bacillus megatherium a rodem Pseudomonas byly inkubovány při 30 °C a ostatní misky, které byly zaočkovány s Micrococcus luteus a Serratia marescens se nechaly inkubovat odděleně, a to při 37 °C. V obou případech byly Petriho misky se vzorky inkubovány po dobu 72 hodin. Po uplynutí této doby byly proměřeny průměry vzniklých inhibičních zón.

51

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Výsledky stanovení Cílem pokusu bylo praktické zjištění inhibičního účinku koření na mikroorganismy, s rozlišením míry vlivu na zástupce grampozitivních bakterií (Bacillus cereus, Bacillus megatherium, Micrococcus luteus) a gramnegativních bakterií (Serratia marescens, rod Pseudomonas). Výsledky práce, tedy naměřené průměry inhibičních zón, jsou shrnuty v následující tabulce:

Tab. 6: Průměry inhibičních zón při prvním zaočkování mikroorganismů (mm). Druh koření

Bacillus cereus (G+) 17;

hřebíček

skořice

oregáno

tymián

zázvor

14;

Micrococ.

B.

luteus

megater.

(G+)

(G+)

20; Ø=16,3

13;

Serratia marescens (G-)

Ø=19

-

13;

24

14

13;

14;

13;

Ø=13

13;

Ø=13,3

-

13;

13

13

13

14;

14;

13;

14;

Ø=13,6

13;

Ø=14

-

13;

13

15

13

13;

18;

13;

13;

Ø=13

17;

13

17

15;

15;

13; 13

Ø=13,6

15; 13

Pseudomonas (G-)

13;

18

13;

rod

Ø=17,3

-

13;

Ø=13,3

-

Ø=13

-

Ø=13

-

Ø=13

-

13 13; Ø=14,3

13; 13

15; Ø=13

14; 16

52

16; Ø=15

16; 15

Ø=15,6

Tab. 7: Průměry inhibičních zón při druhém zaočkování mikroorganismů (mm). Druh koření

Bacillus cereus (G+) 15;

hřebíček

skořice

oregáno

tymián

zázvor

19;

Micrococ.

B.

luteus

megater.

+

+

(G )

(G )

14; Ø=17

20;

Serratia marescens (G-)

Ø=17,6

-

14;

19

13

13;

13;

13;

Ø=13

13;

Ø=13

-

13;

13

13

13

13;

13;

13;

14;

Ø=13,6

14;

Ø=13,3

-

13;

14

13

13

13;

17;

13;

13;

Ø=13

16;

13

18

15;

15;

15; 13

Ø=14,3

13; 14

Pseudomonas (G-)

13;

17

13;

rod

Ø=17

-

13;

Ø=13,3

-

Ø=13

-

Ø=13

-

Ø=13

-

13 13; Ø=14

13;

14; Ø=13

13

13; 15

18; Ø=14

20;

Ø=18,3

17

Z uvedených tabulek je patrné, že má velmi dobrý inhibiční účinek hřebíček (Syzygium aromaticum), který působí nejlépe na Micrococcus luteus a o něco méně na Bacillus cereus, tedy na zástupce grampozitivních bakterií. Na gramnegativní bakterie, jako je Serratia marescens, nereaguje inhibičně téměř vůbec nebo jen minimálně. Což potvrzuje výrok Azzouze a Bullermana (1982), kteří hodnotili hřebíček jako nejúčinnější. Při jejich pokusu inhiboval růst iniciovaný při 25 °C všech zkoušených druhů, po více než 21 dnů. U zázvoru (Zingiber officinale) je podle našich výsledků situace opačná. Výluhy z toho koření lépe působily na gramnegativního mikroba z rodu Pseudomonas, a to s poměrně značným inhibičním účinkem oproti ostatním druhům koření. Na grampozitivní Micrococcus luteus a Bacillus cereus zázvor působil minimální až zanedbatelnou inhibicí. Grampozitivní Bacillus megatherium byl v obou očkováních vůči zázvoru naprosto imunní. U ostatních druhů koření jsme zaznamenali vyšší inhibiční aktivitu pouze u tymiánu (Thymus vulgaris), a to pouze vůči grampozitivnímu Micrococcus luteus. Skořice (Cinnamonum verum) svoji antimikrobiální aktivitu v našem pokusu neprokázala, měla 53

ve všech případech skoro nulovou účinnost. Což je způsobeno pravděpodobně tím, že je mnohem účinnější na některé rody plísní, jejichž zástupce jsme netestovali. Skořice je totiž podle Azzouze a Bullermana (1982) dalším nejúčinnějším kořením, brání v růstu třem druhům Penicillium po více než 21 dnů. Pro srovnání, in vitro studie, kterou prováděli Prabuseenivasan, Jayakumar a Savarimuthuthu (2006) odhalila, že skořicový olej ukázal maximální aktivitu s MIC hodnotami v rozmezí 0,8−3,2 mg/ml a hřebíčkový olej s MIC hodnotami v rozmezí od 1,6−6,4 mg/ml proti všem testovaným kmenům, kterými byly čtyři kmeny gramnegativních bakterií Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris a dva kmeny grampozitivních bakterií Bacillus subtilis a Staphylococcus aureus. Oregáno (Origanum vulgare) se projevilo inhibičně velice mírně, s průměry naměřených zón v rozmezí 13,3−14 mm, vůči

grampozitivním

zástupcům

bakterií,

konkrétně

vůči

Bacillus

cereus

a Micrococcus luteus. Z uvedeného vyplývá, že některá koření mají určité měřitelné antimikrobiální vlastnosti, jedná se především o hřebíček (Syzygium aromaticum) a zázvor (Zingiber officinale). Menší aktivita ostatních druhů koření může být způsobena jiným zastoupením a poměrem účinných chemických látek, stářím a délkou skladování daného koření. Tassou, Nychas, Skandamis (2004) dokonce přišli se třemi hlavními faktory, které mohou ovlivnit výsledek metody, ve které byly použity éterické oleje z rostlin. Je to složení testovaného vzorku (druh rostliny, zeměpisná poloha a roční doba), mikroorganismus (kmen, podmínky pro růst, zvolené inokulum atd.), metoda používaná pro růst a výčet přežívajících bakterií.

54

6 ZÁVĚR Z dosavadních literárních poznatků je zřejmé, že antimikrobiální aktivita je u koření známá a využívaná už odnepaměti. Ale díky nové technice a moderním metodám ji můžeme lépe analyzovat, objasnit a na tomto základě ji i potom zúročit v odvětvích, kde to bylo dříve nemyslitelné nebo těžko praktikovatelné. Extrakty koření se v současné době používají v lidovém léčitelství, některé přístupy zavádí použití rostlinných účinných látek i do klasické medicíny, i když to není zatím příliš obvyklé. Koření díky své inhibiční aktivitě vůči celé řadě mikroorganismů nachází uplatnění i v kosmetice, v prostředcích ústní hygieny nebo doplňcích stravy. V širší míře je využíváno i v biologickém zemědělství jako prostředek pro ošetření osiva nebo pro zajištění delší trvanlivosti již vypěstovaných uskladněných produktů. Trend používání přírodních zdrojů stoupá, a je tady velká šance právě pro koření se uplatnit ještě ve větším měřítku než doposud. Zajímavý vývoj se pro koření naskýtá i v krmivářství, kde začínají být rostlinné extrakty přidávané ve větší či menší míře do krmiv, jak je naznačeno v úvodu práce. Chovatelé tak mohou i touto cestou jednak zajistit tzv. welfare pro zvířata, ale také zúročit přidávané rostlinné extrakty v lepší konverzi krmiva a následně i v lepší kvalitě produktů, ať už jde o maso, mléko, sýry apod. Co se týče konzervace potravin, může mít koření velkou konkurenci v podobě synteticky připravovaných konzervačních látek, které jsou obvykle navrženy tak, aby byly co nejúčinnější, a to i v malých koncentracích, a co nejméně ovlivňovaly organoleptické vlastnosti potraviny. U koření je totiž jistou nevýhodou, že se jeho antimikrobiální účinek obvykle projevuje až při vyšší koncentraci silic, tedy při vyšší dávce koření, což nemusí být příznivé pro senzorické vlastnosti dané potraviny či suroviny v konečném důsledku. Další vývoj v této oblasti je pro koření poměrně pozitivní. Pravděpodobně se ale nebude používat jako dominantní přírodní konzervační prostředek. Spíše bude pro tyto účely využito v kombinaci s dalšími látkami a metodami. A nesmí být opomenuto, že pro lepší a častější uplatnění koření na trhu nahrává i současná situace stále se zvyšující rezistence mikroorganismů vůči antibiotikům. V praktické části této práce byl jistý antimikrobiální účinek koření na mikroorganismy potvrzen. 55

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ANONYM 1: Obměna osiva – nejefektivnějšá agrotechnický zásah. Online [cit. 201003-10]. Dostupné na: . ANONYM 2: Úvod-Charakteristika rodu Staphylococcus. Online [cit. 2010-03-15]. Dostupné na: . ARPA, J.; BARTL, V., 1977: Potravinárska mikrobilógia. 1. vyd., Alfa, Bratislava, SNTL, Praha, 280 s. ISBN 78-375-034. BRAUNOVÁ-BERNHARTOVÁ, U., 2005: Bylinky a koření. České vydání první, Jan Vašut s.r.o., Praha, 138 s. ISBN 80-7236-398-0. BREMNESS, L., 2005: Herbs. 1. vydání, Ikar, Praha, 304 s. ISBN 80-242-1301-X. CLARK, M., 2010: About Listeria. Online [cit. 2010-04-20]. Dostupné na: . COWAN, M. M., 1999: Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, p. 564−582, Vol. 12, No. 4. Online [cit. 2010-03-15]. Dostupné na: . CRAZE, R., 2002: Koření. 1. vydání, Fortuna Print, 192 s. ISBN 80-7321-010-X. DAVIDSON, M. P., 2001: Chemical Preservatives and Natural Antimicrobial Compounds, s. 593−627. In: DOYLE, M. P.; BEUCHAT, L. R. ; MONTVILLE, T. J.(ed.): Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. 2nd ed., ASM Press, Washington, D.C., s. 767. ISBN 978-1-55581-407-6. GÖRNER, F.; VALÍK, L., 2004: Aplikovaná mikrobiología požívatin. Malé centrum, Bratislava, 582 s. ISBN 80-967064-9-7. HAMPL, B., 1968: Potravinářská mikrobiologie. 1. vydání, SNTL, Praha, 276 s. ISBN04-806-68. HLAVA, B.; VALÍČEK, P., 2005: Léčivé byliny (rady pěstitelům). 2. vydání, Aventinum, Praha, 191 s. ISBN 80-7151-249-4. ITO, K. A., 2009: Food safety issues and the microbiology of spices and herbs, s. 337−352. In: HEREDIA, N. L.; WESLEY, I. V.; GARCÍA, J. S. (ed.): Microbiologically Safe Foods. Wiley, New Jersey, 667 s. ISBN 978-0-470-05333-1. KOMPRDA, T., 2004: Obecná hygiena potravin. 1. vydání, MZLU, Brno, 146 s. ISBN 80-7157-757-X.

56

MALÍŘ, F.; OSTRÝ, V., a kol., 2003: Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1. vydání, NCO NZO, Brno, 349 s. ISBN 80-7013-395-3. MORAVCOVÁ, J., 2006: Biologicky aktivní přírodní látky. Vysoká škola chemickotechnologická v Praze; studijní příručka. Online [cit. 2010-03-11]. Dostupné na: . MUGGERIDGE, M.; CLAY, M., 2001: Quality specifications for herbs and spices, s.13−21. In: PETER, K. V. (ed.): Handbook of Herbs and Spices. Volume 1, Woodhead Publishing, Cambridge, 319 s. ISBN 1-85573-562-0. NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 105/2010, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o ochratoxin A. OPLETAL, L.; ŠIMERDA, B., 2009: Přírodní látky a jejich metabolická aktivita. 3. Metabolity rostlin využitelné pro zlepšení potravin živočišného původu. Online [cit. 2010-03-15]. Dostupné na: . PETER, K.V., 2001: Introduction, s.1−7. In: PETER, K. V. (ed.): Handbook of Herbs and Spices. Volume 1, Woodhead Publishing, Cambridge, 319 s. ISBN 1-85573-562-0. PRABUSEENIVASAN, S.; JAYAKUMAR, M.; IGNACIMUTHU, S., 2006: In vitro antibacterial activity of some plant essential oils. BMC Complementary and Alternative Medicine 2006, 6:39. Online [cit. 2010-03-20]. Dostupné na: . SHYLAJA, M. R.; PETER, K. V., 2004: The functional role of herbal spices, s. 11−21. In: PETER, K. V. (ed.): Handbook of Herbs and Spices. Volume 2, Woodhead Publishing, Cambridge, 355 s. ISBN 1-85573-721-3. SINGHAL, R. S.; KULKARNI, P. R.; REGE, D. V., 2001: Quality indices for spice essential oils., s.22−29. In: PETER, K. V. (ed.): Handbook of Herbs and Spices. Volume 1, Woodhead Publishing, Cambridge, 319 s. ISBN 1-85573-562-0. SMALL, E., 2006: Velká kniha koření, bylin a aromatických rostlin. 1.vydání, Volvox Globator, Praha, 1021 s.. ISBN 80-7207-462-8. ŠILHÁNKOVÁ, L., 1995: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 2. vydání, Victoria Publishing, Praha, 361 s. ISBN 80-85605-71-6. TASSOU, C. C.; NYCHAS, G.-J. E.; SKANDAMIS, P. N., 2004: Herbs and spices and antimicrobials, s. 22−40. In: PETER, K. V. (ed.): Handbook of Herbs and Spices. Volume 2, Woodhead Publishing, Cambridge, 355 s. ISBN 1-85573-721-3. VALÍČEK, P., 2005: Koření a jeho léčivé účinky. První vydání, Start, Benešov, 135 s. ISBN 80-86231-34-8.

57

VELÍŠEK, J., 1999: Chemie potravin. 1. vydání, OSSIS, Tábor, 328 s. ISBN 80902391-4-5. VYHLÁŠKA Ministerstva zemědělství č. 133/2004 Sb., o podmínkách ozařování potravin a surovin, ve znění pozdějších předpisů. VYHLÁŠKA Ministerstva zemědělství č. 331/1997 Sb., prováděcí vyhláška k zákonu o potravinách a tabákových výrobcích, ve znění pozdějších předpisů. WEISS, E. A., 2002: Spice crops. CABI publishing, New York, 432 s. ISBN 0-85199605-1.

58

8 SEZNAM TABULEK Tab. 1: Rozdělení orgánů rotlin, které slouží jako koření (Peter 2001). .................................... 12 Tab. 2: Mikrobiologické limity pro koření (Görner, Valík, 2004)............................................. 25 Tab. 3: Výskyt zástupců rodu Aspergillus v koření podle Malíře, Ostrého a kol. (2003).......... 33 Tab. 4: Výskyt zástupců rodu Penicillium v koření (Malíř, Ostrý a kol., 2003)........................ 34 Tab. 5: Jednotlivé druhy koření a jejich množství použité pro pokus........................................ 49 Tab. 6: Průměry inhibičních zón při prvním zaočkování mikroorganismů (mm)...................... 52 Tab. 7: Průměry inhibičních zón při druhém zaočkování mikroorganismů (mm). .................... 53

59