Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Vliv koncentrace CO2 na mikrobiální osídlení ovoce Diplomová práce
Vedoucí práce Prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc.
Brno 2007
Vypracovala: Šárka Miketová
Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Vliv koncentrace CO2 na mikrobiální osídlení ovoce“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
V Brně dne 28. 5. 2007 podpis diplomantky ………………….
2
Poděkování Děkuji Prof. RNDr. Martě Tesařové, Csc. za odborné vedení a cenné rady a Dr. Ing. Heleně Fišerové za ochotu, vstřícné jednání a poskytnutou pomoc při stanovování koncentrací měřených plynů.
3
Abstrakt V dnešní době je kladen velký důraz na zdravotní nezávadnost veškerých potravin, samozřejmě i na ovoce. Proto vznikají stále nové metody, jak zabránit rozvoji nežádoucí mikroflóry přirozeně se vyskytující na ovoci a také jak zabránit sekundární mikrobiální kontaminaci ať už při přepravě, skladování či zpracování. V této diplomové práci je zjišťován vliv různé koncentrace oxidu uhličitého (v přítomnosti i nepřítomnosti ethylenu a při snížené koncentraci kyslíku) na mikrobiální osídlení ovoce. Byly prováděny mikrobiální analýzy stěrovou metodou před a po vložení jablek do atmosféry o rozdílné koncentraci oxidu uhličitého (0,03%, 0,8349%, 1,5105%, 2,5428%, 9,2160%, 8-10%). Výsledky ukázaly, že vyšší obsah CO2 v atmosféře inhibuje růst i množení mikroorganismů. Přítomnost ethylenu v atmosféře neměla na rozvoj mikroorganismů žádný vliv.
Klíčová slova: koncentrace CO2, ovoce, mikroorganismy, jablka
4
Abstract Nowadays is placed big emphasis on health state of all foodstaff, naturally also on fruit. Therefore there are always rising new methods how prevent development of undiserable microflora naturally occured on fruit and also how prevent secondary microbial contamination at transpontation, storage or processing. In this diploma work is investigated influence of different concentration of carbon dioxide (in presence and absence of ethylene and by haemodilution of oxygen) on microbial settlement on fruit. There were made microbial analyses by skimming method before and after insertion of apples to the atmosphere at different concentration of carbon dioxide (0,03%, 0,8349%, 1,5105%, 2,5428%, 9,2160%, 8-10%). The results showed that higher content of carbon dioxide in atmosphere inhibits the growth and multiplication of microorganisms. Presence of ethylene in atmosphere didn’t have any influence on development of microorganisms.
Keywords: contentration of CO2, fruit, microorganisms, apples
5
OBSAH 1. ÚVOD........................................................................................................................... 9 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED ......................................................................................... 10 2.1 CHARAKTERISTIKA OVOCE A JEHO VÝZNAM VE VÝŽIVĚ ......................................... 10 2.1.1 Jakost ovoce.................................................................................................. 10 2.1.1.1 Definice jakosti ....................................................................................... 10 2.1.1.2 Požadavky na jakost................................................................................ 11 2.2 PŮDA JAKO PROSTŘEDÍ MIKROORGANISMŮ ............................................................ 12 2.2.1 Fylosférní mikroflóra rostlin ...................................................................... 12 2.3 MIKROBIOLOGICKÁ CHARAKTERISTIKA VZDUCHU ................................................. 13 2.3.1 Kvalitativní zastoupení mikroorganismů ve vzduchu.............................. 13 2.3.2 Kvantitativní zastoupení mikroorganismů ve vzduchu ........................... 15 2.4 MIKROFLÓRA OVOCE ............................................................................................. 16 2.4.1 Charakteristika kvasinek ............................................................................ 16 2.4.2 Charakteristika plísní.................................................................................. 17 2.4.3 Charakteristika bakterií.............................................................................. 18 2.4.3.1 Aktinomycety.......................................................................................... 19 2.5 VLIV SLOŽENÍ OKOLNÍ ATMOSFÉRY NA KVALITU PLODŮ ........................................ 20 2.5.1 Oxid uhličitý ................................................................................................. 20 2.5.2 Vliv oxidu uhličitého na mikroorganismy ................................................. 21 2.5.2.1.Primární účinky CO2 na mikroorganismy .............................................. 22 2.5.2.2 Mechanismus působení CO2 ................................................................... 23 2.6 SKLADOVÁNÍ OVOCE .............................................................................................. 24 2.6.1 Podmínky skladování .................................................................................. 25 2.6.2 Řízená atmosféra.......................................................................................... 25 2.6.2.1 Účinek obohacení oxidem uhličitým ...................................................... 28 2.6.2.2 Pravděpodobné závislosti oxidu uhličitého a kyslíku............................. 30 2.6.3 Skladování jablek......................................................................................... 31 2.7 KAŽENÍ OVOCE....................................................................................................... 35 2.7.1 Choroby ovoce.............................................................................................. 36 3. CÍL PRÁCE............................................................................................................... 39 4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ ........................................................... 40
6
4.1 MATERIÁL.............................................................................................................. 40 4.2 MIKROBIOLOGICKÉ ANALÝZY ................................................................................ 40 4.2.1 Příprava mikrobiologických rozborů ........................................................ 40 4.2.2 Postup mikrobiologických rozborů............................................................ 43 4.3 PŘÍPRAVA PROSTŘEDÍ O RŮZNÉ KONCENTRACI CO2 ............................................... 45 4.3.1 Prostředí CO2 + ethylen .............................................................................. 45 4.3.2 Prostředí 0,8349% CO2 se sorbentem ethylenu ........................................ 46 4.3.3 Prostředí se sníženým obsahem O2............................................................. 48 5. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE ......................................................................... 49 5.1 MIKROBIÁLNÍ OSÍDLENÍ POVRCHU JABLEK – VZDUŠNÁ ATMOSFÉRA (0,03% CO2). 49 5.2 MIKROBIÁLNÍ OSÍDLENÍ POVRCHU JABLEK PO EXPOZICI V ATMOSFÉŘE RŮZNÝCH KONCENTRACÍ CO2 ...................................................................................................... 50
5.3 MIKROBIÁLNÍ OSÍDLENÍ POVRCHU JABLEK PO EXPOZICI V ATMOSFÉŘE 0,8349% CO2 SE SNÍŽENÝM OBSAHEM ETHYLENU .............................................................................. 56
5.4 MIKROBIÁLNÍ OSÍDLENÍ POVRCHU JABLEK V ATMOSFÉŘE SE SNÍŽENÝM OBSAHEM O2 .................................................................................................................................... 57 5.5 MIKROBIÁLNÍ ANALÝZA S POUŽITÍM SYSTÉMU BIOLOG ......................................... 60 6. ZÁVĚR ...................................................................................................................... 61 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY..................................................................... 62 8. PŘÍLOHY…………………………………………………………………………...66
7
Seznam tabulek a grafů Tab. 1 Běžné plísně způsobující kažení ovoce Tab. 2 Bakterie znehodnocující ovoce Tab. 3 Vliv oxidu uhličitého na bakterie Tab. 4 Citlivost mikroorganismů k CO2 Tab. 5 Doporučené plynné směsi Tab. 6 Orientační hodnoty pro denně uvolňované množství CO2 na začátku CA skladování Tab. 7 Požadavky ovoce na skladování (vlhkost ve skladu ovoce cca 90%) Tab. 8 Procentické složení běžných druhů ovoce Tab. 9 Mikrobiální osídlení povrchu tří odrůd jablek Tab. 10 Mikrobiální osídlení povrchu jablek v atmosféře s rozdílnou koncentraci CO2 Tab. 11 Srovnání kvantitativního zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek dle tří různých odrůd Tab. 12 Mikrobiální osídlení povrchu jablek ponechané šest dnů v atmosféře 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu Tab. 13 Mikrobiální osídlení jablek v atmosféře 8 – 10% CO2 a 5 – 7% O2 Graf 1 Kvantitativní zastoupení CPM na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 Graf 2 Kvantitativní zastoupení plísní na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 Graf 3 Kvantitativní zastoupení aktinomycet na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 Graf 4 Kvantitativní zastoupení Azotobacter na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 Graf 5 Kvantitativní zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek v atmosféře 0,03% CO2 a 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu Graf 6 Kvantitativní zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek v atmosféře se sníženým obsahem kyslíku Graf 7 Srovnání počtu mikroorganismů na povrchu jablek v podobných podmínkách (9,2160% CO2 versus 8 – 10% CO2 → anaerostat)
8
1. ÚVOD Ovoce je pro zdraví člověka nezbytnou součástí stravy, neboť je hlavním zdrojem vitamínů, minerálů a vlákniny. Sortiment ovoce nabízený v ČR je dnes velmi rozmanitý. Dnešní spotřebitelé již nehodnotí nabízené produkty pouze podle jejich ceny, ale kladou důraz i na kvalitu produkt, zejména na jeho senzorickou jakost a zdravotní nezávadnost. Mikrobiální kontaminace ovoce je významným faktorem jakosti. Na povrchu plodin je vždy velké množství mikrobů, většinou neškodných, některé jsou dokonce užitečnou střevní mikroflórou. Při nedovoleném hnojení fekáliemi a v období epidemií se však mohou vyskytnout i choroboplodné bakterie. Toxické zplodiny mikrobiálních patogenů mohou být také zdraví škodlivé. Jsou produkovány zejména některými plísněmi (Penicillium, Aspergillus, Fusarium) a v lidském těle se mohou měnit na mutagenní nebo karcinogenní (KOPEC, 1998). Proto problematika skladování ovoce je velmi aktuální. Jde o to, aby hmotnostní ztráty těchto zásob byly co nejnižší, při současném zachování jejich kvality a užitkové hodnoty. Proto je naší snahou uchovat jeho nutriční hodnotu co nejdéle, to znamená, najít takové způsoby skladování, při kterých se venkovními podmínkami prostředí zpomalí vnitřní enzymatické pochody v plodu, dozrávání a inhibují se nežádoucí mikroorganismy na povrchu ovoce (KOSEK, 1998). Vyšší koncentrace CO2 v prostředí zpomalují dýchací pochody zrání a snižují hmotnostní ztráty rozpuštěné sušiny, ovlivňují mechanické vlastnosti dužiny ovoce. Zvýšený obsah CO2 do určité míry také omezuje rozvoj mikroorganismů, především plísní. Nevhodné vysoké koncentrace CO2 do určité míry však mohou způsobit i některé fyziologické poruchy. Náchylnost na poruchy je různá podle druhu, odrůdy, stupně zralosti a vegetačních podmínek, a proto je velice důležité určení optimální koncentrace CO2 (KOSEK, 1998).
9
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Charakteristika ovoce a jeho význam ve výživě
Čerstvé ovoce Čerstvým ovocem se rozumí jedlé plody a semena stromů, keřů nebo bylin, uváděné do oběhu bezprostředně po sklizni nebo po určité době skladování v původním syrovém stavu. Čerstvé ovoce se člení na tyto skupiny: jádrové ovoce, peckové ovoce, bobulové ovoce, skořápkové ovoce, plody tropů a subtropů (Vyhláška Mze č. 157/2003 Sb. Pro čerstvé ovoce a čerstvou zeleninu, zpracované ovoce a zpracovanou zeleninu, suché skořápkové plody, houby, brambory a výrobky z nich).
Význam ovoce ve výživě lidí Ovoce a zelenina jsou významným zdrojem snadno stravitelných glycidů, organických kyselin, vitamínů, minerálních sloučenin, chuťových a aromatických látek (ŠAPIRO et al., 1988). Obsahují rovněž rostlinná antibiotika, alkaloidy, glykosidy a emodiny, které mají i zvláštní léčivé účinky a z nichž některé příznivě ovlivňují trávicí pochody (WOLF, 1985). Biologickou hodnotu ovoce a zeleniny do značné míry ovlivňuje způsob jejich zpracování a skladování. Především se projevují na stálosti vitamínů jako nejlabilnější součásti potravin (ŠAPIRO et al., 1988).
2.1.1 Jakost ovoce 2.1.1.1 Definice jakosti
Podle zákona o potravinách jakost dané potraviny představuje soubor charakteristických vlastností příslušného druhu, skupiny, resp. podskupiny potravin. Jakostní limity udává jednak vlastní zákon o potravinách a dále příslušné prováděcí vyhlášky Ministerstva zemědělství k tomuto zákonu – viz vyhláška Ministerstva zemědělství č. 157/2003 Sb., která se týká čerstvého ovoce a čerstvé zeleniny, zpracovaného ovoce a zpracované zeleniny, suchých skořápkových plodů, hub, brambor
10
a výrobků z nich; vyhláška č. 298/1997 Sb. Rozdělující potraviny na dvě skupiny: A, B a stanovující mimo jiné i množství a druhy kontaminujících, toxikologicky významných látek (mykotoxiny). Potraviny s označením A jsou potraviny běžně používané, jako je chléb, mléko, maso, zelenina, brambory, nealkoholické nápoje a dětská a kojenecká výživa. Potraviny s označením B jsou ostatní, např. tuky, mastné výrobky, ovoce a ovocné výrobky, pochutiny atd. Z hlediska spotřebitele je možno jakost potravinářského výrobku definovat jako souhrn vlastností, které danému výrobku propůjčují určitou míru schopnosti uspokojovat potřeby uživatele (předem stanovené nebo předpokládané) (KOMPRDA, 1999).
2.1.1.2 Požadavky na jakost
Čerstvé ovoce a čerstvá zelenina se třídí dle vyhlášky Mze 157/2003 Sb. Podle smyslových a fyzikálních požadavků do tříd jakosti, které jsou stanoveny technickou normou. Definice jakosti tržních druhů ovoce a zeleniny je dána technickými normami jakosti ČSN třídy 46, skupiny 30 a 31. Normy jsou v současnosti již sjednoceny s normami
mezinárodními.
Normy
EHK
zásadně
nedovolují
obchodovat
s nestandardním zbožím. Dovolené odchylky norem EHK v jakosti jsou 5 % pro výběrovou třídu a 10 % pro I. a II. jakostní třídu. V Evropské unii platí právní názor, že ovoce a zelenina jsou specifické tržní druhy s vysokou variabilitou jakosti a proto normy pro ně stanovují jednoznačné ukazatele jakosti a trvá se na jejich dodržování (KOPEC, 1998). Minimální požadavky norem na jakost ovoce a zeleniny jsou: celistvost, zdravotnost, čerstvost, čistota, povrchová suchost, nepřítomnost cizí chuti a vůně, nepřekročení limitů zdravotně závadných složek (dusičnany, cizorodé látky, mykotoxiny, mikrobiologická kontaminace) (KOPEC, 1998). Jakost ovoce a zeleniny se prověřuje výběrovou kontrolou. Znaky
jakosti
stanovené normami se zkoušejí na vzorcích náhodně vybraných z různých míst prověřované dávky, a to z rohů obalů, zespodu, svrchu a ze středu; výsledek rozboru se vztahuje na celou dávku. Před odběrem vzorku se dávka posoudí zrakem nebo jinými smyslovými posouzeními a podle převládajících vad se určí, zda bude odebrán základní, speciální nebo oba druhy vzorků. U základního vzorku se prověřují vnější znaky, 11
zjistitelné bez poškození výrobku. Zjišťuje se zda výrobky dodané odpovídají deklarované jakosti, zda deklarovaná jakost odpovídá sjednaným podmínkám a zda jsou obaly opatřeny štítky s povinnými údaji. U speciálního vzorku se prověřují vlastnosti zjistitelné zejména destrukcí, např. cizí pachy a chutě, vlhkost, poškození mrazem, poškození chorobami a škůdci, vlastnosti dužniny. Dále se na speciálních vzorcích prověřují vlastnosti zjistitelné jen laboratorním rozborem (ČSN 46 3000).
2.2 Půda jako prostředí mikroorganismů Hustota osídlení půdy mikroorganismy a jejich jednotlivými složkami (bakteriocenozy, mykocenozy) je udávána obvykle počtem mikrobů v 1 g suché zeminy. Stanovení počtu mikrobů je však značně problematické. Je to způsobeno proměnlivostí počtu mikrobů v závislosti na měnících se podmínkách prostředí a nedokonalostí existujících metod (ŠROUBKOVÁ 1990). Pro informaci jsou uvedeny průměrné údaje získané metodou přímého počítání v 1 g sušiny zeminy: bakterie
108 - 1010
aktinomycety 105 - 106 houby
105 - 106
V půdách můžeme najít asi 300 dosud známých druhů bakterií, z nichž 150 se v půdě nachází často. Nejpočetnější je rod Arthrobacter. Z různých půd se nejčastěji izolují druhy rodů Pseudomonas, Agrobacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Azobacter, Nitrozomonas a Nitrobacter. Ze sporulujících bakterií zástupci rodů Bacillus a Clostridium (ŠROUBKOVÁ 1990).
2.2.1 Fylosférní mikroflóra rostlin
Nadzemní orgány rostlin jsou bohaté na mikroorganismy. Na klíčící rostlině jsou mikroby pocházející jednak z povrchu semene, jednak z půdy. Při dalším růstu rostliny mikrobů přibývá (s prachem, hmyzem, vodou atd.). Jsou na obou stranách listů, na spodní straně ve větším počtu (menší intenzita záření). Jsou závislé na vodě, a proto se objevují ve velkém počtu v místech, kde se drží voda déle a vymývá živiny z listů (ŠROUBKOVÁ, 1990).
12
Kvantitativně je mikroflóra fylosféry velmi bohatá. I když množství epifytů úzce souvisí
s fyziologickými
projevy
rostliny,
především
s exudací
a
vlhkostí
(ŠROUBKOVÁ, 1990). Dominující postavení mezi epifytní mikroflórou mají bakterie. Stálou skupinu, přizpůsobenou k životu na povrchu rostlin, tvoří aerobní, gramnegativní, pohyblivé tyčinky rodů Pseudomonas, Xantomonas, Achromobacter, aerobakter, Flavobakterium a Spirillum. Z grampozitivních bakterií jsou to rody Bacillus, Arthrobacter, Nocardia, Lactobacillus a Micrococcus. Z fakultativních anaerobů se vyskytují druhy rodu Clostridium. Aktinomycety se normálně ve fylosféře nevyskytují. Z mikromycet jsou to druhy rodů Penicillium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus, kvasinky a kvasinkové organismy (Cryptococcus, Rhodorula) (ŠROUBKOVÁ, 1990). Součástí epifytní mikroflóry mohou být i fytopatogenní mikroby, příležitostnými parazity, pak i běžní zástupci epifytní mikroflóry, kteří se poraněním mohou dostat do
rostliny. Fylosférové mikroorganismy rodu Pseudomonas (Ps. fluorescens,
Ps. herbicola) potlačují rozvoj některých patogenů (ŠROUBKOVÁ, 1990). Výzkum epifytní mikroflóry se soustřeďuje především na její využití a význam z hlediska různých řízených procesů, jako je konzervace krmiv (silážování, senážování), ovoce a zeleniny fermentací, uvolňování přadných vláken (máčení a rosení přadných rostlin), fermentace tabáku apod. (ŠROUBKOVÁ, 1990).
2.3 Mikrobiologická charakteristika vzduchu 2.3.1 Kvalitativní zastoupení mikroorganismů ve vzduchu
Kvalitativně je složení mikroorganismů ve vzduchu velmi kolísavé a závisí na lokalitě, vždy jsou přítomny však určité druhy. Pravidelně se ve vzduchu vyskytují kvasinky, aktinomycety, plísně a na některých místech zcela převládají bakterie (ARPAI, BARTL, 1977). Z bakterií jsou ve vzduchu nejvíce zastoupeny rody Bacillus, jejichž spory jsou schopny dlouho odolávat nepříznivým životním podmínkám, a Micrococcus, jehož přísně aerobní druhy tvoří balíčky nebo shluky buněk. V menší míře se mohou ve vzduchu vyskytnout i některé druhy rodu Acetobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Brevibacterium,
Clostridium,
Corynebacterium,
13
Flavobacterium,
Lactobacillus,
Leuconostoc, Pseudomonas, Sarcina, Streptomyces, a koliformní bakterie (ARPAI, BARTL, 1977). Dále se ve vzduchu často vyskytují i bakterie rodu Staphylococcus zejména druh S. aureus a zárodky rodu Proteus. Oba tyto mikroorganismy mají dobrou schopnost udržovat se v aerosolu. Do aerosolu přechází často i Mycobacterium tuberculosis a viry. Ostatní patogenní bakterie přecházejí do aerosolu méně často (ARPAI, BARTL, 1977). Z kvasinek se jako velmi častá vzdušná kontaminace vyskytuje rod Rhodotorula, neboť karotenoidní barvivo chrání jejich buňky před smrtícími účinky ultrafialové složky slunečních paprsků (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Velké rozšíření plísní Cladosporium herbanum a Aspergillus niger ve vzduchu se přičítá hnědému, popřípadě černému zbarvení konidií, které je činí odolnými vůči působení slunečního světla. Velmi často se ve vzduchu vyskytují i příslušníci rodu Penicillium a Rhizopus (HAMPL, 1968).
Ze saprofytů majících vztah a význam v potravinářství jsou ve vzduchu především tyto druhy: Acetobacter aceti Acetobacter xylium Aerobacter aerogenes Bacillus mesentericus Bacillus polymyxa Escherichia coli Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis Leuconostoc mesenteroides Micrococcus albus Micrococcus roseus Proteus vulgaris Pseudomonas herbicola Sarcina flava Sarcina lutea Sarcina rubra
14
Z plísní se ve vzduchu nejčastěji vyskytují spory rodu Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Rhizopus Z kvasinek rody Saccharomyces a Torulopsis Mikroorganismy
patogenní:
Corynebacterium,
Neisseria
meningitidis,
Streptococcus pyogenes (VAJDÍK, 1978)
2.3.2 Kvantitativní zastoupení mikroorganismů ve vzduchu
Prach s mikroorganismy se roznáší prouděním vzduchu a usazuje se na všech předmětech, zařízeních i na potravinách, kde nastává nežádoucí kontaminace. V uzavřených prostorách s velkým počtem lidí připadá na 1 m3 vzduchu 500 – 300 000 bakterií. V zimním období se v uzavřených místnostech počet bakterií zvyšuje následkem méně častého větrání a zviřování prachu topením (VAJDÍK, 1978). Proto je v potravinářských provozovnách velmi důležité zabudování klimatizace pro odstranění zvířeného prachu nebo páry, která by jinak kondenzovala na stěnách, stropech i zařízeních a poskytovala rozvoje mikroorganismů, zejména plísní. Nejvhodnější je klimatizace, při níž do provozu přichází mikrobiologicky čistý vzduch, upravený na žádanou teplotu a vlhkost, za současného odsávání vzduchu znečištěného parami a prachem (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). V potravinářských prodejnách je důležité kvantitativní a kvalitativní zjištění vzdušné mikroflóry, ovzduší obsahuje jednak vlastní mikroflóru pocházející z potravin, a jednak i mikroflóru přenášenou vnějším vzduchem. Důležité je pak zjištění, zda kontaminace šířená vzduchem pochází přímo z provozovny nebo z vnějšího ovzduší, jeli poměr počtu mikrobů uvnitř prodejny k počtu mikrobů vně prodejny roven jedné, je mikrobiologické osídlení vnějšího a vnitřního prostředí stejné. Při stoupající hodnotě tohoto poměru je nutno hledat zdroje znečištění uvnitř provozoven a učinit příslušná dezinfekční opatření (HAMPL, 1968). Vnitřním zdrojem znečištění jsou nejčastěji zanesené filtry čistících zařízení, potrubí vzduchotechnických zařízení či nárůst mikroorganismů ve vodních nádržkách zvlhčovačů nebo nádržích zdrojů vody pro zvlhčení vzduchu klimatizačních zařízení (KLÁNOVÁ, 2002).
15
2.4 Mikroflóra ovoce Již během vegetace se dostává na ovoce prostřednictvím hmyzu, prachu i stykem se zemí, mnoho mikroorganismů. Typičtí saprofyti se však na povrchu živých a zdravých plodin nemnoží a čekají na příhodné podmínky (přezrálost, sklizeň, poranění, onemocnění pletiv aj.). Nekyselá zelenina je lepším hostitelem bakterií než kyselé ovoce, které je naopak příznivějším prostředím pro kvasinky a plísně. Při sklizni se počet mikroorganismů na ovoci a zelenině zvyšuje z mnoha příčin (dotyky rukou a nářadí, poranění plodů, menší odolností plodů oddělených od mateřské rostliny) (INGR, 2002). Dokud jsou ovoce a zelenina součástmi normálně vegetující rostliny, má ovšem význam hlavně jejich infekce výtrusy rostlinných parazitů, které dovedou žít jak paraziticky, tak saprofyticky. Jedině tyto organismy mohou vegetovat na živých plodinách, které ještě nebyly odděleny od mateřských rostlin, nebo jsou po sklizni skladovány ve stavu „dožívání“. Způsobují jejich onemocnění, jako skvrnitost, hniloby aj. Tím, že rozrušují a umrtvují tkáně, připravují vegetační podmínky pro saprofyty. I paraziti však pronikají zpravidla jen do tkání, které jsou oslabeny buď špatnou výživou, poraněním, nebo fyziologickými chorobami. Jinak jim – a samozřejmě všem saprofytům – klade živá tkáň značný odpor, který se u ovoce zmenšuje s dozráváním (KYZLINK, 1980). Čerstvé ovoce má poměrně vysoké hodnoty aw, které podporují růst mnoha xerofilních
a
osmofilních
plísní.
Další
vlastností,
která
podporuje
výskyt
mikroorganismů je vyšší obsah cukrů (BRACKETT, 2001). Kontaminující mikroflórou ovoce jsou kvasinky a plísně, ačkoliv kvasinky jsou mnohem významnější (DEAK, BEUCHAT, 1996).
2.4.1 Charakteristika kvasinek
Kvasinky jsou jednobuněčné organismy patřící do tříd Ascomyteces, Basidiomycetes a Deuteromycetes. Buňky kvasinek se skládají z polopropustné stěny, tvořené polysacharidy a z cytoplasmatické membrány, která obklopuje cytoplasmu s jádrem. Velikost buněk kolísá od 2 do 10 µm. Kvasinky aerobních druhů se shlukují na povrchu substrátů jako kožky, mázdra a křís. Kvasinky se množí pučením, dělením
16
nebo sporulací. Kvasinky jsou na vegetační podmínky náročnější než plísně. Vyžadují kyselé prostředí s obsahem alespoň malého množství kyslíku, různé růstové látky, amoniakální dusík a také fosfor, draslík, hořčík a síru. Kvasinky jsou velmi přizpůsobivé organismy, tentýž druh si může navyknout na různá prostředí a na odlišné funkce (KYZLINK, 1980).
2.4.2 Charakteristika plísní
Jako plísně označujeme mikroskopické vláknité eukaryotní organismy, náležející mezi mikroskopické houby. Plísně jsou vícebuněčné, eukaryotní, heterotrofní, saprofytické nebo parazitické mikroorganismy. Některé druhy plísní jsou rozšířeny po celém světě. Velká morfologická rozmanitost a schopnost přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt všude tam, kde existuje organická hmota. Spory plísní jsou jednobuněčné nebo vícebuněčné výtrusy sloužící k jejich rozmnožování a přežívání. Jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, na různých předmětech, v krmivech apod. Velmi vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování plísní jsou potraviny (OSTRÝ, 2000). Stélku plísní tvoří vlákna (hyfy), která jsou buď jednobuněčná (třída Zygomycetes), nebo vícebuněčná čili septovaná. V každé buňce je jedno nebo více jader haploidní
povahy.
Cytoplasma
buněk
obsahuje
endoplasmatické
retikulum,
mitochondrie, vakuoly, zrníčka polyfosfátů a kapénky tuku. Hyfy plísní se větví přibližně v pravém úhlu a jejich spleť se nazývá mycelium. Tvrdý polokruhovitý útvar tvořený hustou spletí hyf se nazývá sklerocium. Sklerocium má většinou tmavou barvu, průměr až několik milimetrů a je odolný vůči nepříznivým podmínkám. Kožovitá spleť hyf se nazývá stroma a často se nalézá u plísní parazitujících na ovoci a jiném rostlinném materiálu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Plísně patří mezi aerobní organismy, které ke svému množení a růstu vyžadují přítomnost molekulárního kyslíku. Naopak nahromadění oxidu uhličitého vede k zastavení množení plísní (TICHÁ, 1988). Existují mikromycety, které jsou schopny se rozvíjet v anaerobním prostředí (např. vláknité mikromycety rodu Bassochlamys, které produkují termolabilní askospóry). Koncentrace kyslíku nižší než 1 % a zvýšení koncentrace oxidu uhličitého je velmi účinné v prevenci rozvoje růstu vláknitých mikromycetů a tvorby mykotoxinů. 17
Některé práce pak uvádějí, že citlivost vláknitých mikromycetů na kyslík je ovlivněna aktivitou vody a teplotou (MALÍŘ et al., 2003).
Tab. 1 Běžné plísně způsobující kažení ovoce dle JAYE et al. (2005)
Druh mikroorganismu
Napadené plody
Alternaria tenius
Citrusové plody
Colletotrichum musae
Banány
Colletotrichum lagenarium
Vodní melouny
Penicillium digitatum
Citrusové plody
Monilia fructicola
Broskve, třešně
Phytophthora spp.
Citrusové plody
Cladosporium herbarum
Třešně, broskve
Colletotrichum musae
Banány
Plasmapara viticola, Bremia ssp.
Hrozny
Botrytis cinerea
Hrozny
Penicillium digitatum
Citrusové plody
Cryptosporiopsis malicorticis
Jablka, hrušky
Ceratocystis paradoxa
Ananas
Aspergillus niger
Broskve, meruňky
Geotrichum candidum
Citrusové plody
Phomopsis citri, Alternaria citri
Citrusové plody
2.4.3 Charakteristika bakterií
Bakterie jsou prokaryotické organismy se širokým morfologickým spektrem. Obecně se vyznačují těmito znaky a vlastnostmi: • jsou to organismy jednobuněčné; nikdy netvoří funkčně a morfologicky diferencované tkáně. Vnitřní prostor buňky vyplňuje cytoplazma. • jádro prokaryotické buňky není od cytoplazmy odděleno jadernou membránou. Je uloženo přímo v cytoplazmě a sestává se z jedné velké molekuly deoxyribonukleové kyseliny (DNA), která tvoří chromozóm, podobající se kružnici
18
• většina prokaryotických buněk je obalena pevnou blanou – tzv. buněčnou stěnou. Pevnost a neohebnost propůjčují buněčné stěně přítomné peptidoglykany, zvané mukopeptidy nebo mureiny. Buněčná stěna umožňuje zachovávat tvar svým buňkám. • prokaryotické buňky neobsahují typické organely jako např. mitochondrie, Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum atd. Obsahují však ribozomy, ve kterých dochází k syntéze bílkovin. • rozmnožují se příčným dělením. Nejdříve se rozdělí jejich kružnicový chromozom a potom se postupně příčně rozdělí dospělá buňka na dvě buňky dceřinné. • výživa prokaryotických organismů je velmi rozmanitá a podle způsobu výživy je lze dělit na autotrofní, pro které je základní živinou CO2, který slouží jako zdroj uhlíku pro syntézu všech látek, z nichž se skládají jejich buňky. Heterotrofní prokaryota získávají uhlík z různých organických látek, jako např. sacharidy, bílkoviny, soli organických sloučenin, alkoholy aj. (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997).
2.4.3.1 Aktinomycety
Aktinomycety jsou prokaryotické organismy, tj. nemají jadernou membránu. Řadí se mezi bakterie vláknitého tvaru, které se větví. Tím, že jsou schopné tvořit mycelium a rozmnožovat se sporami, připomínají houby. Organismus aktinomycet je diferencováno na substrátové a vzdušné (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). Kultury aktinomycet jsou buď bezbarvé, nebo pigmentované (celá škála barev). Aktinomycety jsou většinou grampozitivní, mikroaerofilní a mezofilní. Dobře rostou v neutrálním až slabě zásaditém prostředí. Většina aktinomycet je saprofytická, ale mnohé se přizpůsobily parazitickému životu na rostlinách, zvířatech i člověku. Většina aktinomycet má proteolytické schopnosti. Aktinomycety jsou především typické půdní bakterie (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997).
19
Tab. 2 Bakterie znehodnocující ovoce (ATLAS, BARTHA, 1987) Druh mikroorganismu
Druh ovoce
Psedomonas solanacearum
Banány
Mycoplasma sp.
Broskve
Spiroplasma sp.
Citrusy
Xanthomonas citri
Citrusy
Erwinia amylovora
Jablka, hrušky
Agrobacterium rhizogenes
Jablka
Agrobacterium rubi
Maliny
2.5 Vliv složení okolní atmosféry na kvalitu plodů K činitelům, kteří ovlivňují, v mezích daných druhovými, ale i odrůdovými vlastnostmi, stupněm zralosti a zdravotním stavem, intenzitu dýchání plodů, je třeba uvážit především obsah O2 a CO2 v pletivech a okolní atmosféře. Každá plynná složka samostatně, v koncentraci odlišné od normálního složení vzduchu, a nebo při jejich souběžném účinku, ovlivňuje proces dýchání a látkové výměny. K tomu, aby plod dozrál, potřebuje konstantní množství kyslíku, ať zraje pomalu či rychle. Sníží-li se v předklimakterickém období umělým zákrokem příjem kyslíku (uložením plodů v atmosféře , která je obohacena CO2), může se bod počínajícího se stárnutí, tak i bod maximální respirační aktivity oddálit a skladovatelnost plodů prodloužit. Úpravou okolní atmosféry, snížením obsahu O2 a snížením koncentrace CO2 se pomaleji spotřebovávají zásobní substráty. Úprava každé plynné složky však nemůže být libovolně volena, musí se brát v úvahu vlastnosti druhu, popř. odrůdy (BRECHT et al., 1982).
2.5.1 Oxid uhličitý
Hutnost plynu, tj. poměr jeho specifické hmotnosti a specifické hmotnosti vzduchu, za týž podmínek tlaku a teploty činí 1,529. Jde tedy o plyn těžší než vzduch. Aby byl oxid uhličitý vhodný k použití v potravinářství, musí být bez zápachu, prostý
20
oxidu siřičitého, oxidu dusíku, sirovodíku, sloučenin arsenu a těkavých organických látek (KYZLINK, 1980). Oxid uhličitý je nedýchatelný plyn, který se hromadí, vlivem poměrně vysoké specifické hmotnosti, u dna nádob a při podlahách místností. Protože jej člověk smysly nepozná, je nebezpečný; kdyby jeho hladina v místnosti sahala výše, než kam dosahují vnější dýchací orgány člověka, mohl by být příčinou zákeřného udušení (KYZLINK, 1980). Účinku oxidu uhličitého na mikroorganismy se využívá ke konzervaci potravin spolu se současným působením nízkých teplot (sycení ovocných šťáv CO2, ukládání masa, drůbeže, ovoce v chladírnách s 10 % CO2 apod.). Nutno zdůraznit, že oxid uhličitý nezabrání rozvoji mnohých anaerobních bakterií, a proto potraviny nejsou tímto způsobem dobře konzervovány, nýbrž se prodlužuje jen jejich uchovatelnost (HAMPL, 1968).
2.5.2 Vliv oxidu uhličitého na mikroorganismy
Mnohé chemické sloučeniny v prostředí mají nepříznivý vliv na živé mikroorganismy. Tyto látky působí na protoplazmu (protoplazmatické jedy) nebo na enzymy (enzymové jedy) nebo konečně na protoplazmu i enzymy (HAMPL, 1968). Silně působí na mikroorganismy oxid uhličitý, jehož účinek kolísá podle druhu mikrobů v širokých mezích: přítomnost 20 až 30% CO2 v atmosféře značně brzdí vývoj mnohých mikroorganismů, ale při delším působení ještě vyšších koncentrací CO2 (50 – 80%) se rozvoj mikrobů úplně zastavuje, popřípadě některé druhy jsou i zničeny. Intenzita růstu různých plísní, působících zkázu potravin, se sníží při koncentraci 20% CO2 na 50 až 80% vzhledem ke kontrole, při koncentraci 50% CO2 byl růst většiny plísní zastaven; koncentrace CO2 nad 5% zastavuje růst Aspergillus niger. Bakterie jsou odolnější vůči působení oxidu uhličitého, většina zkoušených bakterií (zvláště hnilobných) neroste při koncentraci 50 % CO2. Některé bakterie naopak jsou málo citlivé na oxid uhličitý a dobře rostou i při koncentraci 60 až 80 % CO2 i výše. Je známo, že nepatrné množství oxidu uhličitého, nepatrně vyšší než v ovzduší, je nezbytné pro normální růst mikroorganismů, zvláště v počátečních stádiích vývoje, takže oxid uhličitý má pravděpodobně úlohu růstového faktoru (HAMPL, 1968).
21
Tab. 3 Vliv oxidu uhličitého na bakterie (HAMPL, 1968)
Druh
Rozmnožování bakterií (v % ke kontrole) v atmosféře CO2 za 24 hod.
Escherichia coli
0,6 – 1,5
Aerobacter aerogenes
1,0 – 1,3
Proteus vulgaris
0 – 1,2
Pseudomonas fluorescens
0
Micrococcus candicans
0
Micrococcus sulfureus
0
Bacillus subtilis
0
Bacillus mycoides
0,3
Clostridium botulinum
26 – 53
CL. perfringens
100
Cl. lentoputrescens
100
2.5.2.1.Primární účinky CO2 na mikroorganismy
Následující údaje jsou založeny na výsledcích pokusů při dlouhodobém působení CO2 v koncentraci 10% a více na mikroorganismy. • Zpomalení aktivity způsobuje snížení inkubační nebo skladovací teploty. Rozpustnost CO2 ve vodě se v nižších teplotách zvyšuje. • Ačkoli koncentrace od 5% do 100% nemají žádné výhodné účinky, koncentrace 20 – 30% CO2 se jeví jako optimální. • Působení CO2 se snižuje se snižujícím se pH do kyselé oblasti. • Všeobecně, gramnegativní bakterie jsou citlivější než grampozitivní, pseudomonády se řadí mezi nejcitlivější a klostridie mezi nejodolnější (Tab. 4). • Jak lag fáze, tak i logaritmická fáze růstu mikroorganismů se zastavuje. • CO2 a vyšší tlak má značně větší antimikrobiální účinky, než když CO2 pod tlakem není. Tlak 6 – 3 MPa může zničit bakterie i plísně (JAY et al., 2005).
22
2.5.2.2 Mechanismus působení CO2
Pro vysvětlení účinku CO2 na mikroorganismy, můžeme využít dvou názorů. Oxid uhličitý blokuje metabolismus bakterie Pseudomonas earuginosa a má silné účinky na enzymatickou dekarboxylaci. SEARS, EISENBERG (1961) objevili, že CO2 působí na propustnost buněčných membrán. ENFORS, MOLIN (1978) využili jejich poznatků k pozdější hypotézi o klíčení endospor bakterií Clostridium sporogenes a C. perfringens, 1 atm byly inhibovány. Jak bylo ukázáno později, CO2 je více stimulován v nižším než vyšším pH. Při 55 atm bylo klíčení omezeno na 4%. Tito autoři uvedli, že působením CO2 se tento plyn kumuluje ve dvojvrstvě lipidů buněčné membrány a stejně tak roste rozpustnost. CO2 v rozpustné formě HCO3-, jako produkt štěpení, způsobuje změny v propustnosti buňky.Pokud je rozpuštěn ve vodě, produkty CO2 jsou následující: CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-↔ 2H + CO32Antimikrobiální účinky CO2 a uhličitanového aniontu jsou zcela srovnatelné, ikdyž samo o sobě nemají shodný mechanismus působení. Uhličitanový aniont je antagonista argininu a jeho mechanismus působení je diskutovatelný stejně jako další α-diuhličité sloučeniny. Citlivější gram – negativní bakterie na α-diuhličité inhibitory díky své kapacitě inaktivují vázání aminokyselin bílkovin v buněčné periplazmě, zvláště arginin v bílkovinách. Je to nepochopitelné, že místo působení CO2 je v periplazmě, kde se normálně odehrává vázání aminokyselin na bílkoviny (JAY et al., 2005).
Tab. 4 Citlivost mikroorganismů k CO2 (JAY et al., 2005) Pseudomonas spp.
(Nejcitlivější)
Aeromonas spp. Bacillus spp. Plísně Enterobacteriaceae Enterococcus spp. Brochothrix Lactobacillus spp. Clostridium spp.
(Nejodolnější)
23
ARPAI, BARTL (1977) uvádí, že balení potravin do obalů nepropustných pro vodní páru a některé plyny jako je umělá regulace atmosféry ve skladovacích prostorách, může mít na růst určitých fyziologických skupin mikroorganismů pozitivní ale i negativní vliv. Vzduch v blízkosti půdy obsahuje průměrně (v obj. %) 78% dusíku, 21% kyslíku, < 1% vzácných plynů, 0,03% oxidu uhličitého a různé množství vodní páry. Mnohé aerobní a anaerobní bakterie svými nespecificky působícími enzymy obsahující flavin a za přítomnosti vzdušného kyslíku katalyzují tvorbu toxického peroxidu vodíku; řada oxidáz katalyzuje také vznik pro mikroorganismy stejně toxických superoxidových radikálů (ARPAI, BARTL, 1977). Aerobní mikroorganismy můžou naopak
za
pomoci superoxiddismutázy
a katalázy rozrušit vzniklé superoxidové ionty jako je peroxid vodíku, čímž se chrání proti jejich toxickému účinku (ARPAI, BARTL, 1977). Tento ochranný detoxikační mechanismus spočívá na obou enzymech a mají ho také fakultativně anaerobní bakterie (např. čeleď Enterobakteriaceae). Aerotolerantní anaerobní bakterie (např. rodu Streptococcus a Lactococcus) obvykle syntetizují pouze jeden ochranný enzym superoxiddismutázu, ale ne katalázu. Striktně anaerobní bakterie (z rodu Clostridium) nesyntetizují žádný z těchto ochranných enzymů. Proto za přítomnosti vzdušného kyslíku nerostou a rychle odumírají (ARPAI, BARTL, 1977). Při vakuovém balení potravin do nepropustných folií pro kyslík nebo při balení v inertní atmosféře dusíku jsou v baleném produktu potlačeny aerobní mikroorganismy (rody Pseudomonas, Bacillus, plísně aj.). Bez přístupu kyslíku dobře rostou mikroorganismy anaerobní, mikroaerofilní (fakultativně anaerobní). Některé druhy rodu Bacillus můžou dobře růst i při velmi nízkým parciálním tlaku kyslíku nebo až dokonce za anaerobních podmínek (Bacillus cereus, Bacillus (Paenibacillus) polymyxa, Bacillus macerans) (ARPAI, BARTL, 1977).
2.6 Skladování ovoce Skladování ovoce a zeleniny je dílčím, i když významným, úsekem posklizňové technologie. Jejím cílem je udržet anebo zvýšit jakost sklizených plodin do okamžiku prodeje. Jakost ovoce a zeleniny je ohrožována nepříznivými vnějšími podmínkami (teplota, vlhkost, složení a pohyb vzduchu, kontaminace aj.), vnitřními procesy, které
24
v plodinách probíhají (transpirace, respirace, dozrávání, vyrůstání, stresové reakce apod.). Životní procesy v nich se musí zpomalit, nesmí se však zcela zastavit, aby plodiny zůstaly živé (KOPEC, 2003). Požadavky na enviromentální podmínky musí být přesně definovány a vyjádřeny v příslušných jednotkách. kromě teploty a vlhkosti vzduchu se věnuje pozornost složení atmosféry skladu. Snížením obsahu O2 a zvýšením obsahu CO2 se výrazně prodlužuje skladovatelnost plodin. Současně je nutno omezit obsah etylénu, který zhoršuje jakost mnohých produktů (KOPEC, 2003).
2.6.1 Podmínky skladování
Podmínky skladování ovoce a zeleniny jsou většinou kompromisem mezi požadavky na jejich mikrobiologickou a všeobecnou jakost. Vysoká vlhkost vzduchu zabraňuje vysušení, podporuje ale mikrobiologické kažení. Na druhé straně i nízká teplota skladování zpomalující růst mikroorganismů někdy koreluje s celkovou trvanlivostí, protože pletivo mnohých druhů zeleniny a jižního ovoce nesnáší nízké teploty (ARPAI, BARTL, 1977). Skladování bez regulace faktorů prostředí dobře snášejí jen některé odolné odrůdy jablek (ARPAI, BARTL, 1977). Skladování ve skladech s nucenou úpravou složení atmosféry, její teploty a vlhkosti, v tzv. CA skladech (controlled atmosphere – řízená atmosféra) umožňuje zvýšení koncentrace CO2 a snížení koncentrace O2. Tyto úpravy umožňují skladování ovoce na delší dobu. Tento způsob skladování se osvědčil u jádrového, peckového i bobulového ovoce. Snížení skladovací teploty a úprava složení atmosféry způsobuje odbourávání rezervních látek (zpomalení zrání) a též i zpomalení kažení ovoce způsobené mikroorganismy (ARPAI, BARTL, 1977).
2.6.2 Řízená atmosféra
Uměle vytvořená plynná směs (tzv. upravená atmosféra, někdy označována také jako kontrolovaná, modifikovaná atmosféra) je výsledkem optimalizace kumulativní inhibice obou plynných složek na metabolismus plodu, kdy ještě nejsou příznivé důsledky snížené intenzity dýchání rušeny nebo dokonce znehodnocovány produkcí ochromujících zplodin. Proto pro jednotlivé druhy ovoce a zeleniny (u mnohých druhů 25
také odrůdy) musí být prospěšné účinky upravené atmosféry rámcově známy, zejména limitní přípustné hodnoty (dokonce pro tytéž odrůdy jablek, pěstovaných v odlišných klimatických podmínkách – ve smyslu zeměpisné šířky – mohou na stejnou plynnou směs reagovat diferencovaně; tyto dílčí odlišnosti nás ovšem nemohou svádět k empirii a k opomíjení zásadních fyziologických projevů živé tkáně a souvisejících kauzálních vazeb) (GOLIÁŠ, 1996). Vychází se z poznatků, že mikrobiální kažení potravin začínají velmi často aerobní mikroorganismy, které lze potlačit zavedením dokonale anaerobních podmínek, zejména je-li v potravině zároveň uměle zvýšena koncentrace oxidu uhličitého jako hlavního metabolitu většiny mikrobiálních druhů. Zároveň musí být zajištěny podmínky nevhodné i pro rozvoj anaerobů (dostatečnou kyselostí, sníženou teplotou aj.) (INGR, 2002). Úprava skladovací atmosféry pro skladování zahradnických plodin navazuje na účinek principu hemibiózy a zpomaluje dozrávání. Skladovací atmosféra se ochuzuje o kyslík a obohacuje o oxid uhličitý a dusík, poměr jednotlivých plynů se upravuje uměle (INGR, 2002). Přestože řízená atmosféra je známa více než 70 let, stále jsou předkládány nové koncepty na optimalizaci koncentrace plynů, jež souvisí s inovací účinných technologií, umožňující dlouhodobé nastavení a udržení nízké koncentrace kyslíku. Obsah oxidu uhličitého je odvozován až druhotně, rovněž v koncentracích, které se snadno mohou odstraňovat v dekarbonizátorech (technologické jednotky v systému úpravy atmosféry, v nichž se oxid uhličitý nevratně váže). Obvyklá skladba obou fyziologických plynů, která je dlouhodobě známá a obsahuje 2% kyslíku a 2 až 5% oxidu uhličitého, umožňuje prodloužení skladovatelnosti, ale současně nepřináší výrazné přednosti, protože obsah kyslíku je stále vysoce nad očekávaným fyziologickým limitem (GOLIÁŠ, 2003). Obě hodnoty jsou optimální pro ovocné druhy a jejich odrůdy, pokud budou udrženy nezbytné mikroklimatické podmínky jako je teplota, relativní vzdušná vlhkost a vnitřní cirkulace vzduchu, která je nezbytná pro odvod dýchacího tepla na výparník (GOLIÁŠ, 2004). Bude-li vysoký obsah CO2 v řízené atmosféře, je možné výrazně snížit produkci ethylenu ve skladované plodině, výrazně omezit mikrobní napadení, zejména plísněmi, avšak zároveň se vyvolá anaerobní respirace a výrazná tvorba fenolických látek. Zavedením precizní indikace plynného složení lze kombinovat krátkodobé účinky 26
převládajícího plynu v ambientní atmosféře s relativně neznatelným biochemickým poškozením pletiva. Tvorba těkavých produktů je v přímém vztahu ke skladovatelnosti. Monitorování obsahu volatilních látek ve skladovací atmosféře a z toho odvozené záměrné snižování jejich koncentrace, vede ve svém důsledku k prodloužení uchovatelnosti (GOLIÁŠ, 2004).
Tab. 5 Doporučené plynné směsi (GOLIÁŠ, 1996)
t°C
CO2%
O2%
Borůvky
0
jednorázově 40
1-2
Broskve
-1-0
2-3
2
Hrozny
-2-0
3
2
Jahody
0-2
Do 10
1-2
Maliny
-1-0
Do 16
5
Meruňky
-1-0
2-5
2-3
Třešně
0-2
5-10
2-3
Višně
-1-0
5
3
Druh
Plody přijímají kyslík (O2) a vydechují oxid uhličitý (CO2). Ve vzduchotěsném prostoru tedy klesá hladina O2 a stoupá hladina CO2. U některých odrůd např. Golden Delicious, není třeba větrat, dokud není dosažena hranice 10% CO2 a 11% O2. Jiné např. Jonathan nebo Coxova reneta, nesnesou více než 5% CO2. Za normálních podmínek pak snášejí 16 % O2. Výměna látková je zde bržděna jen vysokým obsahem CO2. Tak došlo postupně k vývoji přístrojů, které vymývají CO2 (scrubbery, absorbéry) nebo adsorbéry; zbývající kyslík je vydýchán, vzniklý CO2 opět odstraňován, dokud není dosažena hodnota 3% CO2 a 3% O2 a pro určité odrůdy konečně 0,5% CO2 a 2 až 3% O2. Takto upravené složení vzduchu nazýváme dvoustranně upravenou atmosféru, tzn. každá složka má své přesné množství v celkové atmosféře (JELEN, 1976). V závislosti na pěstitelských a klimatických podmínkách a především na stupni zralosti se vyskytují u stejných odrůd ovoce nebo zeleniny značné rozdíly v produkci CO2. V tab. 6 jsou uvedeny hodnoty, které se vztahují na období bezprostředně po naskladnění zboží (JELEN, 1976).
27
Tab. 6 Orientační hodnoty pro denně uvolňované množství CO2 na začátku CA skladování (JELEN, 1976)
Teplota v CA prostoru
CO2 (g/t)
G.Delicious
2 – 3°C
100
Coxova reneta
3 – 4°C
180 – 200
Boskoopské
3 – 4°C
110 – 130
Jonathan
3 – 4°C
150
Zvonkové
1 – 2°C
50 – 80
Morgenduft
1 – 2°C
50 – 60
Conference
0°C
80 – 120
Vinné hrozny
0°C
60 – 80
Jahody
0°C
300 – 400
Třešně
0°C
150 – 180
Švestky pozdní
0°C
110
Broskve
0°C
140 – 160
Švestky
0°C
150
Skladování v dvojstranně řízené atmosféře je ve srovnání s jednostranně řízenou atmosférou jednoznačně lepší. U dvojstranně řízené atmosféry je především po dlouhodobém skladování jakost zboží lepší, což má mimořádný význam pro odbyt zboží v poměrně teplých prodejnách. Lepší udržení jakosti ve srovnání s jednostranně řízenou atmosférou se projevuje zejména v nižším odbourávání kyselin a nižším výskytu typických škod z příliš dlouhého skladování, jako je hnědnutí slupky, žloutnutí, napadení hnilobami atd. (JELEN, 1976).
2.6.2.1 Účinek obohacení oxidem uhličitým
Zdravé a hodnotné ovoce (právě před klimakterickým stadiem nebo nanejvýš na jeho začátku) se ukládá do hermeticky uzavíratelných komor s možností řízeného větrání. Ovzduší v komoře se nechá obohatit vydýchaným CO2 asi na 5 - 15%, obsah O2 přitom nesmí klesnout pod 2 – 3% obj. Ve skladu se udržuje teplota +1 až +3°C (INGR, 2002).
28
Potřebná koncentrace CO2 se řídí hlavně druhem a odrůdou ovoce a skladovací teplotou. Překročí-li potřebnou míru, dochází ve tkáních skladovaného ovoce k poruchám z naprostého nedostatku kyslíku, zejména k intramolekulárnímu dýchání, které nepříznivě ovlivňuje jakost. Složení ovzduší proto musí být kontrolováno a poměr plynů v čas potřeby upravován opatrným větráním (KYZLINK, 1980). Zvýšený obsah oxidu uhličitého v atmosféře skladů má ochranný účinek proti růstu mnohých plísní a kvasinek a také některých bakterií. Vyšší koncentrace CO2 už inhibují i klíčení spor plísní. Tyto podmínky se s výhodou využívají při skladování ovoce a zeleniny. Přesné složení atmosféry závisí na druhu a odrůdy skladovaného ovoce a zeleniny (ARPAI, BARTL, 1977). Obohacení ovzduší ve skladu o CO2 má někdy za následek žádoucí a někdy nežádoucí vlivy. Žádoucí vlivy: • dýchací činnost zpomalena • skladovací doba prodloužena • dozrávací proces zpomalen • odbourávání chlorofylu zpomaleno u zeleniny, Golden Delicious • měknutí zpomaleno • ztráty dýcháním sníženy • kyselina lépe udržena • tvoření plísně zpomaleno (zabráněno teprve při 25 – 50% CO2) • zabráněno vzniku Jonathanových skrn • sníženo hnědnutí slupky následkem stárnutí • lepší trvanlivost v prodejních skladech
Nežádoucí vlivy: ( v případě, že koncentrace CO2 přestoupí dovolenou hranici) • zvýšení citlivosti tkání na škody chladu • hnědnutí jádřince zesíleno • měknutí, zmodravění a zmoučnění u některých odrůd zesíleno • hnědnutí slupky u jablek zesíleno • hnědnutí dužniny plodu • dutiny v dužnině plodu
29
• změny chutě (mdlé, nesouladné) • blokování odbourávání chlorofylu (na sotva dozrálých jablkách) (STOLL, MARCELLIN, 1980)
2.6.2.2 Pravděpodobné závislosti oxidu uhličitého a kyslíku
Obě složky skladovacího ovzduší a to CO2 a O2 se nesmí v žádném případě posuzovat samostatně. Je nutno brát v úvahu jak jejich vzájemnou závislost, tak i souvislost s teplotou, relativní vlhkostí, způsobem proudění vzduchu, stupněm čistoty vzduchu (STOLL, MARCELLIN, 1980). Jeden a týž druh v různých pěstitelských oblastech nemusí být vždy stejně odolný na zatížení extrémních hodnot skladové teploty, relativní vlhkosti, CO2 a O2. Tyto otázky je nutno předem v malých pokusech místně, než se přikročí ke komerčnímu skladování zboží ve velkých množstvích (STOLL, MARCELLIN, 1980). Všechny faktory dozrávání a to nízká skladovací teplota, zvýšená hladina CO2 a snížená hladina O2, působí často v součinnosti. Kdo klade důraz na co možno nejdelší skladovací dobu a disponuje dobře odolným zbožím, může si dovolit s těmito třemi skladovacími prvky jít až na mez krajnosti (STOLL, MARCELLIN, 1980). Jelikož dochází ke vzájemné citlivosti, je nutné při skladování jablek v řízené atmosféře teplotu chlazení nastavit o jeden stupeň vyšší, než je u příslušného druhu obyčejně zvykem (např. u odrůdy Jonathan na + 4°C místo + 3°C) (STOLL, MARCELLIN, 1980). Tam, kde při skladování jablek je kladen větší důraz na harmonickou chuť plodu než na delší dobu skladování, nebude se skladovat při teplotě na nejnižší hranici, taktéž se nenechá hladina CO2 vystoupit příliš vysoko, ale naproti tomu se hladina O2 udržuje poměrně nízká (STOLL, MARCELLIN, 1980). U jablek je snížení hladiny kyslíku teprve pod 6% na redukci dýchací činnosti a zpomalení procesu stárnutí. U druhu Boskoop hladiny kyslíku 6 – 8% (při 3% CO2) dokonce podporují tvorbu hnědnutí slupky, nízké hladiny kyslíku, jako třeba 3% O2 naopak zabraňují tvorbu hnědnutí slupky (STOLL, MARCELLIN, 1980). Spodní hranice hladiny kyslíku je jednak otázkou příslušného druhu a jednak otázkou teploty. U některých druhů jablek je možno vystačit s 1% O2 (červený
30
Delicious), jiné vystačí s 2% (Golden delicious), kdežto většina druhů jablek musí být skladována při 3% kyslíku (STOLL, MARCELLIN, 1980).
2.6.3 Skladování jablek
Různé odrůdy jablek mají rozdílné nároky na podmínky skladování. I u jedné odrůdy může být skladovací optimum podmíněno stanovištěm. Jonathany z jižnějších pěstitelských oblastí (Madˇarsko) mohou být skladovány při nižších teplotách než z většiny středoevropských oblastí (JELEN, 1976). Údaje v tab. 7 je třeba brát jen jako orientační. Hodnoty pro teplotu (°C) a kyslík (% O2) představují dolní hranici, hodnoty pro oxid uhličitý (% CO2) horní hranici jistoty. U většiny odrůd se snažíme týdně snižovat teplotu o méně než 1°C. U odrůdy Golden Delicious a některých dalších odrůd může být teplota snižována až o 1°C týdně (JELEN, 1976).
31
Tab. 7 Požadavky ovoce na skladování (vlhkost ve skladu ovoce cca 90%) (JELEN, 1976) Stupňové chlazení
Konečná teplota
Složení vzduchu CO2
Doba skladování O2
chladírna
CA
A. Jablka tuzemská James Grieve
3 – 4°C
Normální
4 – 6 týd.
Normální
2 – 3 měs.
Parména zlatá
ano
5°C
Coxova reneta
ano
3 – 5°C
2 – 3%
2,5 – 3%
2 – 3 měs.
4 – 5 měs.
* Jonathan
ano
3 – 4°C
3 – 5%
2,5 – 3% nebo 16%
4 – 5 měs.
6 – 7 měs.
Boskoopské
ano
3 – 4°C
2 – 3%
2,5 – 3%
4 – 5 měs.
5 – 6 měs.
Berlepschova reneta
0 – 2°C
Normální
5 měs.
Ontario
4 – 5°C
Normální
6 – 7 měs.
** Golden delicious
0 – 2°C
3 – 5% až 7%
Zvonkové
ano
0 – 2°C
3%
Mc Intosh
ano
4°C
3%
0 – 2°C
2%
*** Spartan
* Jonathan v CA jen do začátku dubna ** Golden Delicious v CA do konce června *** Spartan – doporučení pro skladování v CA zatím podle předběžných výsledků
32
Normální
3 – 14%
5 – 6 měs.
6 – 7 měs.
2,5 – 3%
6 měs.
7 měs.
3% Normální
3%
5 měs 5 měs.
6 – 7 měs.
Konečná teplota
Složení vzduchu CO2
Doba skladování O2
chladírna
CA
B. Hrušky tuzemské Clappova
-1 – 0°C
Williamsova
-1 – 0°C
normální
6 týd.
4 – 5%
6 týd.
6 – 8 týd.
2,5 – 3%
3 – 4 měs.
6 měs.
2,5 – 3% nebo 16%
4 měs.
4 –5 měs.
nebo 10% Boscova lahvice
-1 – 0°C
normální
(včas sklidit) Konference
-1 – 0°C
2% nebo 3%
Lucasova
-1 – 0°C
1%
2,5 – 3%
4 měs.
zkoušky
Pomeranče
6 – 8°C
0%
15%
2 – 3 měs.
4 – 5 měs.
Mandarinky
4 – 7°C
3 – 6 týd.
Grapefruit
8 – 10°C
3 měs.
Citrony
14 – 15°C
5 měs.
0 – 2°C
3 měs.
(citlivá na CO2) C. Citrusové ovoce
D. Kdoule tuzemská
33
Konečná teplota
Složení vzduchu CO2
Doba skladování O2
chladírna
CA
E. Měkké ovoce 1. Švestky Rané švestky
-1 - + 1°C
normální
1 – 2 týd.
Renklody
-1 - + 1°C
normální
1 – 2 týd.
Pozdní švestky
0°C
3 – 5%
3%
2 – 5 týd.
2. Třešně Srdcovky
0 – 2°C
normální
až 1 týd.
Chrupky
0 – 2°C
5 – 10%
2 – 3%
2 týd.
2 – 3 týd.
3. Višně (se stopkou)
-1 - 0°C
5%
3%
5 dnů
3 týd.
4. Broskve
-1 - 0°C
2 - 3%
2%
4 týd.
až 6 týd.
5. Meruňky
-1 - 0°C
6. Jahody
0 – 2°C
až 10%
1 - 2%
5 dnů
7. Maliny a ostružiny
0°C
40%
cca 10%
max. 3 dny
8. Angrešt
0°C
normální
5 dnů – 3 týd.
Rybíz
0°C
normální
5 dnů – 3 týd.
9. Brusinky
3 – 4°C
normální
2 – 3 týd.
10. Borůvky
- 1 – 0°C
až 16%
5%
1 měs.
2 měs.
11. Stolní hrozny
- 2 - - 1°C
3%
2%
3 týd. – 6
5 měs.
normální
34
3 týd. 8 – 10 dnů
2.7 Kažení ovoce Kažení ovoce a zeleniny může mít mikrobiologické a nemikrobiologické příčiny. Z mikrobiologického hlediska jsou ovoce a zelenina chráněné přírodními obrannými mechanismy a faktory, které jsou druhově specifické a chrání na různě dlouhou dobu. Významnou úlohu mají přitom povrchová pletiva a tvorba antimikrobiálních látek, které můžou ve významné míře zabránit mikrobiální infekci a jejímu šíření. Organické kyseliny, jako kyselina citronová a kyselina jablečná, snižují hodnotu pH ovocných plodů a můžou působit mikrobistaticky (hrušky – hodnoty pH 4,6 až 3,8; citrony – hodnoty pH 2,4 až 2,2). Další látky, jako kyselina benzoová v brusinkách, kyselina salicylová v hroznech, éterické oleje v citrusových plodech nebo třísloviny v nezralých plodech, mají přímý mikrobicidní účinek (ARPAI, BARTL, 1977). Na ovoci mohou být nalezeny rozmanité druhy kvasinek a tyto organismy způsobují kažení ovocných produktů, zvláště na poli. Mnoho druhů kvasinek jsou schopny napadat cukry obsažené v ovoci a způsobovat fermentaci s produkcí alkoholu a oxidu uhličitého. V důsledku toho je růst kvasinek rychlejší než růst plísní. Není jasné, zda některé druhy plísní jsou závislé na počáteční činnosti kvasinek v procesu kažení ovoce a zeleniny. Spotřebování nebo zánik vysokomolekulárních látek ovoce způsobují více plísně než kvasinky. Mnoho druhů plísní jsou schopny využít alkohol jako zdroj energie a když tyto a ostatní jednoduché sloučeniny jsou vyčerpány, tyto organismy pokračují v ničení zbylých částí ovoce (JAY et al., 2005). Obecné složení osmnácti běžných druhů ovoce je uvedeno v tab. 8, která udává, že průměrný obsah vody je okolo 85% a průměrný obsah sacharidů je kolem 13%. Ovoce se liší od zeleniny nižším obsahem vody, ale vyšším obsahem sacharidů. Průměrný obsah bílkovin, tuků a popela v ovoci je v tomto pořadí 0,9%, 0,5% a 0,5% poněkud nižší jsou hodnoty u zeleniny s výjimkou obsahu popela. Ovoce obsahuje vitamíny a další organické látky stejně jako zelenina. Na základě obsahu těchto živin, mohou být tyto látky schopny podpořit růst bakterií, kvasinek a plísní. Ale pH ovoce je pod hranicí umožňující bakteriální růst. Tento fakt je dostatečný k vysvětlení absence bakterií při počátcích kažení. S výjimkou hrušek, které někdy podléhají hnilobě způsobené bakteriemi rodu Erwinia, nejsou bakterie známy jako počáteční činitelé způsobující kažení ovoce. Právě to, proč hrušky podléhají bakteriálnímu kažení, není
35
jasné, když se uvádí rozmezí pH 3,8 – 4,6. Je možné, že Erwinia a Pectobacterium začínají svůj růst na povrchu ovoce, kde pH je pravděpodobně vyšší než uvnitř (JAY et al., 2005).
Tab. 8 Procentické složení běžných druhů ovoce (JAY et al., 2005)
Ovoce
Voda
Sacharidy
Bílkoviny
Tuk
Popel
Jablka
84,1
14,9
0,3
0,3
0,4
Meruňky
85,4
12,9
1,0
0,6
0,1
Banány
74,8
23,0
1,2
0,8
0,2
Ostružiny
84,8
12,5
1,2
0,5
1,0
Třešně, višně
83,0
14,8
1,1
0,6
0,5
Fíky
78,0
19,6
1,4
0,6
0,4
Grapefruit
88,8
10,1
0,5
0,4
0,2
Hrozny
81,9
14,9
1,4
0,4
1,4
Citróny
89,3
8,7
0,9
0,5
0,6
Limetky
86,0
12,3
0,8
0,8
0,1
Pomeranče
87,2
11,2
0,9
0,5
0,2
Broskve
86,9
12,0
0,5
0,5
0,1
Hrušky
82,7
15,8
0,7
0,4
0,4
Ananas
85,3
13,7
0,4
0,4
0,2
Švestky
85,7
12,9
0,7
0,5
0,2
Maliny
80,6
15,7
1,5
0,6
1,6
Rebarbora
94,9
3,8
0,5
0,7
0,1
Jahody
89,9
8,3
0,8
0,5
0,5
2.7.1 Choroby ovoce Pramenem nákazy ovoce může být půda, stromy, odumřelé části ovoce, nářadí, třídicí stroj, obalový materiál, skladové prostory, jednotlivé už napadnuté ovoce nebo vysušené kusy ovoce. Spory a hyfy plísní pronikají do ovoce na místech poškození jeho povrchových ochranných struktur (poškození při sběru, kroupami, hmyzem), přes přirozené otvory, dýchací buňky nebo přímo přes nepoškozené pletivo. Napomáhají jim přitom penetrační hyfy (ARPAI, BARTL, 1977).
36
Eliminace skladových plísní ovoce se začíná převážně už před jeho sběrem pomocí fungicidů, odstraňováním nahnilých nebo vysušených plodů před jeho skladováním a dezinfekcí skladových prostor a obalového materiálu (ARPAI, BARTL, 1977). Na ovoci skladovaném při pokojové teplotě se může na jeho kažení podílet nejrůznější plísně. Při chladírenských teplotách nastane určitá selekce a uplatňují se psychrotrofní plísně rodu Botrytis a Gleosporium, v menší míře také Sclerotinia, které rostou i při teplotách blízkých 0°C (ARPAI, BARTL, 1977). Sivá hniloba (botrytis-hniloba) vzniká působením plísně Botrytis cynerea. Ta napadá plody už na stromech. Pramenem kontaminace bývá převážně odumřelý rostlinný materiál na povrchu půdy. Nákaza začíná už v době kvetení stromů na odumřelých květech a přenáší se na plod. Mimořádně náchylné jsou jahody a hrozny, ale i jádrové a peckové ovoce. Nepříznivé povětrnostní podmínky, jako je vlhkost a chlad, růst těchto plísní podporují. Na uskladněném ovoci se plísně snadno přenášejí z plodu na plod kontaktem. Jejich růst se projevuje i při chladírenských teplotách, až –1°C (ARPAI, BARTL, 1977). Hnědá hniloba (gleosporium-hniloba) působením plísně Gleosporium album rostoucí na povrchu plodů. Plody bývají nakažené touto plísní už před jejich sběrem. Plíseň proniká přes dýchací buňky do plodu a způsobuje v něm hořkou chuť jeho dužniny. Tato plíseň roste i při chladírenských teplotách. Nejvíce napadá ovoce. Ve skladech se většinou objevuje až po delší době skladování a projevuje se okrouhlými, ostře ohraničenými hnilobnými místami. V jejich středu můžeme rozpoznat jednu dýchací buňku (ARPAI, BARTL, 1977). Monilia-hniloba (skarotinia-hniloba) vzniká nejvíce na peckovém ovoci (švestky, třešně, broskve), méně často na jádrovém. Tento druh hniloby způsobují druhy rodu Sclerotinia, nejčastěji S. fructigena (konidiová forma Monilia fructigena) a S. laxa (Monilia cinerea). Tato hniloba se vytváří při sporulaci plísní Monilia. Současně vzniká hnědá mokrá hniloba, když Monilia nesporuluje, vzniká černá hniloba, která vede přes suchou hnilobu až k vysušení plodů. Plody jsou těmito plísněmi kontaminované už na stromech, přes poškozená pletiva se dostanou do dužniny. Kontakty zdravých plodů s vysušenými už na stromě nebo ve skladě mají za následek rychlé šíření těchto škodlivých plísní (ARPAI, BARTL, 1977). Zelená a modrá hniloba (peniciliová hniloba) vzniká působením plísně Penicillium expansum, která je odpovědná za produkci mykotoxinu patulin. Způsobuje 37
kažení především jádrového ovoce (jablek). Penicillium digitatum a P. italicum jsou původci zelené a modré hniloby citrusových plodů. Napadená místa se nejprve vyznačují malými hnědými změnami slupky, později se objeví sivobílá plesnivá místa s modrozelenými kolonami konidií. Konidie penicilií se běžně nacházejí na samotném ovoci, ve skladech a na obalovém materiálu. Do dřeně pronikají přes poškozenou slupku, ale i přes dýchací buňky (ARPAI, BARTL, 1977). Skladová prašivina vzniká působením zástupců plísní rodu Venturia (konidiová forma Fusicladum); na jablkách vlivem Venturia inaequalis, na hruškách a peckovém ovoci je příčinou Venturia perina. Tyto mikromycety už v době vegetační periody způsobují prašivku i na listech. Skladová infekce konidiemi a askosporami vyniká obvykle krátce před sběrem a přenáší se větrem, deštěm a kontaktem (ARPAI, BARTL, 1977). Kromě uvedených nejvýznamnějších plísní se na kažení ovoce může podílet řada dalších méně rozšířených druhů. Phytophthora cactorum způsobuje nemoci jádrového ovoce, jahod a jiného ovoce. Druhy rodu Aspergillus, např. Aspergillus ze skupiny niger způsobuje černou hnilobu hroznů a broskví. Druhy rodu Rhizopus, jako R. nigrificans způsobuje měkkou hnilobu jahod. Na vzniku některých chorob se podílí více rodů plísní navzájem (ARPAI, BARTL, 1977). Choroby ovoce způsobené plísněmi se velice podobají chorobám způsobené jiným mechanismem. Příčinou může být nevhodný přívod živin v době růstu, nedostatek kyslíku, vysoký obsah CO2 v atmosféře skladu a nízká teplota (ARPAI, BARTL, 1977).
38
3. CÍL PRÁCE Hlavním cílem této diplomové práce bylo posouzení mikrobiálního osídlení vybraných odrůd jablek v závislosti na obsahu vzdušného CO2 v prostředí. Byly vytyčeny následující cíle: • běžnými postupy analyticky vyhodnotit počty významných systematických a funkčních skupin mikroorganismů vybraných druhů ovoce • charakterizovat jejich změny při zvyšující se koncentraci vzdušného CO2 • získané výsledky porovnat s údaji v odborné literatuře
39
4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Materiál Tato diplomová práce je věnována posouzení vztahů mezi koncentrací CO2 a mikrobiálnímu osídlení ovoce a zároveň určení koncentrace CO2, která inhibuje růst nežádoucích mikroorganismů. Analyzovaný materiál tvoří 3 vybrané odrůdy jablek, zakoupené na Zelném trhu v Brně. Zvolené odrůdy:
1.Golden delicious 2. Ontario 3. Idared
Analýzy byly
provedeny v laboratoři na ústavě agrochemie, půdoznalství,
mikrobiologie a výživy rostlin, MZLU v Brně.
4.2 Mikrobiologické analýzy
4.2.1 Příprava mikrobiologických rozborů
Sterilizace laboratorního skla Veškeré laboratorní sklo bylo sterilováno v horkovzdušném sterilizátoru typu HS 62 A – výrobce Chirana. Sterilizace trvala 1 hod při teplotě 160 °C. Petriho misky se sterilovaly zavřené. Ústí pipet (1 a 2 ml) se zazátkovaly vatovým tampónem a sterilovaly se zabalené v hliníkové folii.
Sterilizace zkumavek, stěrových pomůcek, baněk a destilované vody Zkumavky s 9 ml destilované vody byly uzavřeny kovovými víčky, vloženy do kádinek a zakryty hliníkovou folií. Po naplnění Erlenmayerových baněk 90 ml destilované vody, byla hrdla baněk překryta taktéž hliníkovou folií, která plnila úkol víček. Stěrové vatové tampóny (navinutá vata na potravinářské špejli) byly uzavřeny do skleněného obalu a uzavřeny hliníkovou folií. Ke sterilizaci byl použit autokláv typu PS 20 A – výrobce Chirana. Vlastní sterilizace probíhala po dobu 20 min při teplotě 121 °C.
40
Příprava a sterilizace živných půd Vzhledem k předpokládanému výskytu různých skupin mikroorganismů vyskytující se na ovoci a vzhledem k jejich požadavkům na živiny, byly k analýze použity tyto druhy živných půd: • Masopeptonový agar (MPA) pro kultivaci bakterií a stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM) • Czapek – Doxův agar (CZ) pro kultivaci plísní • Škrobový agar (SK) pro kultivaci aktinomycet • Ashbyho agar (ASH) pro kultivaci bakterií rodu Azotobacter • Endo agar (EA) pro kultivaci koliformních mikroorganismů
Masopeptonový agar (MPA) Složení:
hovězí odvar
5,0 g
pepton pro bakteriologii
5,0 g
živný základ č.1
6,25 g
živný základ č.2
6,25 g
chlorid sodný
2,5 g
agar
15,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Bylo naváženo 40 g živné půdy MPA – výrobce Imuna, Šarišské Michalany, SR.
Czapek – Doxův agar (CZ) Složení:
dusičnan sodný
3,0 g
sacharóza
30,0 g
dihydrogenfosforečnan sodný
1,0 g
chlorid draselný
0,5 g
síran hořečnatý
0,5 g
síran železnatý
0,01 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Bylo naváženo 55 g sušené živné půdy CZ – výrobce Imuna, Šarišské Michalany, SR. 41
Škrobový agar (SK) Složení:
škrob
10,0 g
síran amonný
1,0 g
síran hořečnatý
1,0 g
chlorid sodný
1,0 g
uhličitan vápenatý
3,0 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Živná půda byla připravena v laboratoři smísením uvedených komponent.
Ashbyho agar (ASH) Složení:
manit (nebo glukóza)
20,0 g
hydrogenfosforečnan draselný
0,2 g
síran hořečnatý
0,2 g
chlorid sodný
0,2 g
síran draselný
0,1 g
uhličitan vápenatý
5,0 g
agar
20,0 g
destilovaná voda
1000 ml
Živná půda byla připravena v laboratoři smísením uvedených komponent.
Endo agar (EA) Složení:
masový extrakt
8,55 g
pepton z hovězího masa
10,0 g
laktóza
10,0 g
chlorid sodný
5,0 g
siřičitan sodný bezvodý
1,2 g
fuchsin bazický
0,25 g
agar
12,0 g
destilovaná voda
1000 ml
42
Jednotlivé navážené složky (navažuje se s přesností 1%) byly ve všech uvedených případech rozpuštěny v polovině objemu destilované vody, následně přidaný agar byl ponechán při laboratorní teplotě nabobtnat. Zbytek vody byl nalit po stěnách, aby došlo ke spláchnutí ulpělého množství přidaných látek. Poté bylo v proudící páře po dobu asi 30 min. (Kochův hrnec nebo nenatlakovaný autokláv) vše dokonale rozpuštěno a směs se doplnila destilovanou vodou do 1000 ml. Po úplném rozpuštění všech látek se medium vychladilo na teplotu 24 – 26°C, změřilo se pH a upravilo pomocí 4% roztoku NaOH a 3,5% roztoku HCl. Poté byla živná půda rozlita do 400 ml Erlenmeyerových baněk a po zavíčkování hliníkovou folií sterilizována v autoklávu typu PS 20 A (výrobce Chirana) za zvýšeného tlaku (0,1 MPa) ve vodní páře při 121°C 20 min.
4.2.2 Postup mikrobiologických rozborů
U vybraných vzorků byly sledovány tyto skupiny mikroorganismů: • CPM – celkový počet mikroorganismů • Plísně • Koliformní bakterie • Aktinomycety • Azotobacter
Analýza byla provedena u všech tří odrůd jablek (Golden delicious, Ontario, Idared) ještě týž den, ve který byla zakoupena a dále po 6 dnech expozice v prostředí o dané koncentraci CO2. K vyšetření povrchové mikroflóry byla použita ve všech případech stěrová metoda.
Stěrová metoda
Přípravná fáze V laboratoři byly vysterilizovány Erlenmeyerovy baňky s 90 ml destilované vody a pro přípravu dalších ředění i mikrobiologické zkumavky s 9 ml destilované vody. Z hliníkové fólie byly vystříhány šablony s čtvercovým otvorem o ploše 4 cm2, dále byly navinutím vaty na potravinářské špejle zhotoveny stěrové vatové tampóny. Vše bylo uzavřeno do vhodného skleněného obalu a sterilizováno.
43
Postup zkoušky Za stálého otáčení byla tampónem důkladně setřena na sebe kolmými tahy část vyšetřované plochy ohraničené šablonou. Na odběrový tampón by měl být při odběru vyvinut tlak 0,1 kg/cm2. Po provedení stěru byl vatový tampón umístěn do příslušné Erlenmeyerovy baňky se sterilní destilovanou vodou. Po uzavření Erlemeyerovy baňky následovalo důkladné protřepání. Aby byly vyrostlé kolonie dobře počitatelné, bylo použito desítkového ředění.
Očkování vzorků Při dalším postupu bylo využito metody kultivace a pevných půdách tj. plotnové metody zalití do půdy. Na dno Petriho misky byl napipetován sterilní pipetou 1 ml získané suspenze mikroorganismů. Co nejdříve bylo do těchto misek nalito potřebné množství (cca 10 ml) rozehřáté a na 45°C chlazené živné půdy. Krouživými pohyby uzavřenou miskou po desce stolu bylo dosaženo potřebné homogenity. Po zatuhnutí agaru byly misky inkubovány v termostatu při požadované teplotě dnem vzhůru. Z jednoho ředění byly souběžně očkovány tři Petriho misky. U každé živné půdy byla provedena kontrola na mikrobiální čistotu.
Inkubace vzorků • Při stanovení bakterií byl použit masopeptonový agar. Plotny byly inkubovány dnem vzhůru při teplotě 25 - 28°C po dobu 5 dnů. • Plísně byly kultivovány na Czapek – Doxově agaru, inkubace probíhala dnem vzhůru při teplotě 24°C po dobu 7 dnů. • Koliformní bakterie byly kultivovány na Endo agaru a inkubovány dnem vzhůru při teplotě 37°C p dobu 5 dnů. • Aktinomycety byly kultivovány na škrobovém agaru, inkubace probíhala při teplotě 28°C po dobu 7 dnů. • Bakterie rodu Azotobacter byly kultivovány na Ashbyho agaru a inkubovány při teplotě 28°C po dobu 7 dnů.
Vyhodnocení výsledků Kolonie byly počítány pouhým okem nebo pomocí lupy o šestinásobném zvětšení. Při větším počtu vyrostlých kolonií byly spočítány kolonie na části plotny 44
s průměrným počtem mikroorganismů a zjištěný počet byl přepočítán na celou plochu Petriho misky. Metodika stanovení nezachycuje počet všech metabolicky aktivních buněk, ale pouze počet tzv. kolonie tvořících jednotek (KTJ). KTJ jsou útvary, které v agarové půdě dají vznik jednotlivým koloniím. Mohou to být jednotlivé buňky, dvojice nebo shluky buněk. Kultivací zjištěné počty kolonií byly přepočítány podle stupně ředění a jeho objemu naočkovaného do půd a podle velikosti setřeného povrchu na plochu 10 cm2 vyšetřovaného jablka.
V případě mikrobiálního znečištění kontrol byly vyskytující se mikroorganismy odečteny od průměrných hodnot výsledků jednotlivých rozborů, čímž byla zohledněna případná sekundární kontaminace. Pro přepočet průměrných počtů mikroorganismů na plochu 10 cm2 byla použita trojčlenka: Průměrný počet mikroorganismů x 10 Velikost plochy použité šablony (tj. 4)
Zjištěné počty mikroorganismů byly využity pro
vytvoření
grafických
a tabelizovaných vyjádření charakterizující mikrobiální osídlení ovoce.
4.3 Příprava prostředí o různé koncentraci CO2 Jablka byla umístěna ve skleněných lahvích, kde byla vytvořena různá koncentrace CO2, po dobu šesti dnů. Poté byl proveden stěr a následně mikrobiologický rozbor již zmíněným postupem.
4.3.1 Prostředí CO2 + ethylen Příprava laboratorního skla K pokusu byly použity 5 l lahve (9 ks),
které byly omyty teplou vodou
a dezinfikovány lihem. Dále byly použity 250 ml odměrné válce (9 ks), ošetřeny stejným způsobem. 45
Příprava roztoku uvolňující plynný CO2 Do připravených odměrných válců se aplikovalo dané množství uhličitanu sodného a nasyceného roztoku kyseliny citrónové. Pro vytvoření 1,5105% CO2 prostředí: • 0,024 g Na2CO3 se přelilo 50 ml nasyceného roztoku kys. citrónové Pro vytvoření 2,5428% CO2 prostředí: • 0,24 g Na2CO3 se přelilo 50 ml nasyceného roztoku kys. citrónové Pro vytvoření 9,2160% CO2 prostředí: • 2,4 g Na2CO3 se přelilo 50 ml nasyceného roztoku kys. citrónové Do každé 5 l lahve (ozn. koncentrací CO2 a odrůdou) bylo vloženo vždy po jednom kusu jablka od všech tří odrůd a odměrný válec s daným roztokem. Ihned po vložení odměrného válce se sklenice uzavřely pryžovou membránou. Poté se v určených intervalech (po 3 hod., 24 hod., 48 hod., 72 hod. a 144 hod.) měřila koncentrace CO2 a protože se uvolňovalo také velké množství ethylenu, byly zaznamenány i tyto hodnoty.
Stanovení množství vzniklého CO2 a ethylenu Oxid uhličitý byl stanoven v 1 ml sledovaného ovzduší odebraného tuberkulinovou stříkačkou na plynovém chromatografu CHROM 5 s katharometrem s 1,5 m dlouhou náplňovou kolonou plněnou PORAPAKem Q. Ethylen
byl
stanoven
na
plynovém
chromatografu
firmy
FISSONS
INSTRUMENT s kapilární 24 m dlouhou kolonou HP-PLOT/Al2O3. Teplota detektoru byla 200°C, nástřiku 230°C a kolony 40°C (PROKEŠ et al., 2006).
4.3.2 Prostředí 0,8349% CO2 se sorbentem ethylenu Příprava laboratorního skla K pokusu byly použity rovněž 5 l lahve (3 ks), dále odměrné válce 250 ml (3 ks) a kádinky 75 ml (3 ks).
46
Příprava roztoku uvolňující plynný CO2 Do připravených odměrných válců se aplikovalo 0,24 g uhličitanu sodného (Na2CO3) a 50 ml nasyceného roztoku kyseliny citrónové. V kádince se přidalo 50 ml sorbentu ethylenu. Každá láhev tedy obsahovala 1 kus jablka, odměrný válec s roztokem uvolňující CO2 a kádinku se sorbentem ethylenu. Lahve se ihned po aplikaci těchto látek uzavíraly pryžovou membránou. Poté se opět měřily koncentrace vzniklých plynů. Protože se neustále uvolňovalo velké množství ethylenu, muselo se aplikovat více sorbentu ethylenu spolu s filtračním papírem. Přídavky sorbentu + měření koncentrace CO2 a ethylenu: • po 24 hod. od založení pokusu – měření + výměna sorbentu a vložen filtrační papír • měření koncentrace15 min. po výměně • měření koncentrace 30 min. po výměně • měření koncentrace 45 min. po výměně • měření koncentrace 60 min. po výměně • měření koncentrace po 24 hod. + přídavek 20 ml sorbentu ethylenu s filtračním papírem • měření koncentrace 15 min. po přídavku sorbentu • měření koncentrace po 48 hod. + výměna sorbentu • měření koncentrace 15 min. po výměně • měření koncentrace 30 min. po výměně • měření koncentrace 1 hod. po výměně • měření koncentrace 3 hod. po výměně • měření koncentrace 5 hod. po výměně • měření koncentrace 24 hod. po výměně
Stanovení množství vzniklého CO2 a ethylenu Oxid uhličitý byl stanoven v 1 ml sledovaného ovzduší odebraného tuberkulinovou stříkačkou na plynovém chromatografu CHROM 5 s katharometrem s 1,5 m dlouhou náplňovou kolonou plněnou PORAPAKem Q. Ethylen
byl
stanoven
na
plynovém
chromatografu
firmy
FISSONS
INSTRUMENT s kapilární 24 m dlouhou kolonou HP-PLOT/Al2O3. Teplota detektoru byla 200°C, nástřiku 230°C a kolony 40°C. (PROKEŠ et al., 2006) 47
4.3.3 Prostředí se sníženým obsahem O2 Jablka, z každé odrůdy jeden kus, byla uložena po dobu šesti dnů v anaerostatu vyrobeném firmou MERCK. Výrobce uvádí změnu ve složení atmosféry, a to zvýšení koncentrace CO2 na 8 – 10 % a snížení koncentrace O2 na 5 – 7 %. Poté byl proveden stěr a mikrobiální analýza.
48
5. VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE Základní analytická data z mikrobiologických analýz všech zpracovaných vzorků ve všech rozdílných prostředích jsou uvedeny v tabulkách 14 – 19 (viz přílohy). Rovněž výsledky z měření koncentrací a produkcí CO2 a ethylenu (z důvodu uvolňování velkého množství ethylenu, byly zaznamenány i tyto hodnoty) jsou uvedeny v tabulkách (20 - 23, přílohy). Hodnoty koncentrací a produkcí jsou znázorněny i graficky pro lepší orientaci (grafy 8 - 23, přílohy).
5.1 Mikrobiální osídlení povrchu jablek – vzdušná atmosféra (0,03% CO2) K pokusu byly zakoupeny tři odrůdy jablek na Zelném trhu v Brně– Golden delicouis, Ontario a Idared. Ještě týž den byla provedena mikrobiologická analýza stěrovou metodou. Výsledky jsou uvedeny jako průměry ze tří opakování a z 1. a 2. ředění, přepočteno na 10 cm2 povrchu jablka. Tyto hodnoty přibližně odpovídají hodnotám zjišťované BAĎUROVOU (2004) a HRDLIČKOVOU (2004). Jak je vidět z tab. 9, na povrchu jablka se vyskytují nejvíce plísně (v průměru 65,66 x 102 KTJ/10 cm2) a aktinomycety (průměrně 80,61 x 102 KTJ/10 cm2). Dle POLSTERA (1971) se na jádrovém ovoci nejvíce vyskytují plísně rodu Aspergillus, Mucor, Alternaria a Rhizopus. Tyto druhy zde mohou při poškození způsobovat plísňové hniloby. Hnědou hnilobu (gleosporium-hniloba) způsobují plísně Gleosporium album rostoucí na povrchu plodů. Plody bývají nakažené touto plísní už před jejich sběrem. Zelená a modrá hniloba (peniciliová hniloba) vzniká působením plísně Penicillium expansum, která je odpovědná za produkci mykotoxinu patulin. (ARPAI, BARTL, 1977). Z námi vybraných odrůd, měla odrůda Golden delicious největší zastoupení všech sledovaných skupin mikroorganismů. V půdě se dle DOMSCHE et al. (1993) plísně vyskytují zcela běžně a odtud se dostávají na povrch ovoce a zeleniny. Největším zdrojem plísní rostlin je tedy půda.
49
Tab. 9 Mikrobiální osídlení povrchu tří odrůd jablek. Údaje v KTJ/10 cm2 x 102.
Odrůda
CPM
Plísně
Aktinomycety
Azotobacter
68,95
Koliformní bakterie 0,00
Golden delicious Ontario
87,92
122,01
4,89
32,58
0,00
58,72
44,66
6,03
Idared
39,78
0,00
50,34
75,15
4,89
Dle JAYE et al. (2005) je Cryptosporiopsis malicorticis jedna z běžných plísní vyskytující se na povrchu jablek. Plísně patří mezi aerobní organismy, které ke svému množení a růstu vyžadují přítomnost molekulárního kyslíku. Naopak nahromadění oxidu uhličitého vede k zastavení množení plísní (TICHÁ, 1988) Z běžně vyskytujících se bakterií na povrchu jablek je Erwinia amylovora a Agrobacterium rhizogenes.
5.2 Mikrobiální osídlení povrchu jablek po expozici v atmosféře různých koncentrací CO2 Mikrobiální analýza stěrovou metodou byla provedena po šestidenní expozici tří odrůd jablek v koncentracích 1,5105%, 2,5428% a 9,2160% CO2. Koncentrace CO2 v inkubačním prostředí jsou uvedeny jako průměry za šest dní, z důvodu poměrně velkého kolísání koncentrace CO2 v průběhu inkubace. Pro porovnání jsou uvedeny zároveň výsledky z mikrobiologických analýz povrchu jablek ponechaných při běžné koncentraci CO2 ve vzduchu (0,03%). Koliformní bakterie se nevyskytly u žádného sledovaného vzorku. Ze zjištěných výsledků v tab. 10 vyplývá, že se zvyšující se koncentrací CO2 počet mikroorganismů klesá. Dle HAMPLA (1968) přítomnost 20 až 30% CO2 v atmosféře značně brzdí vývoj mnohých mikroorganismů, ale při delším působení ještě vyšších koncentrací CO2 (50 – 80%) se rozvoj mikrobů úplně zastavuje, popřípadě některé druhy jsou i zničeny. Výsledky tohoto pokusu ovšem ukazují, že hodnoty CO2 nemusí být tak vysoké, aby zabránily rozvoji mikroorganismů.
50
Tab. 10 Mikrobiální osídlení povrchu jablek v atmosféře s rozdílnou koncentraci CO2 v přítomnosti ethylenu (mimo běžné atmosféry).Údaje v KTJ/10 cm2 x 102.
Prostředí
Výchozí CO2
Odrůda
-
1,5105% CO2
2,5428% CO2
9,2160% CO
0,03%
CPM
Golden delicious Ontario
68,95
Koliformní bakterie 0,00
32,58
Idared
Plísně
Aktinomycety
Azotobacter
87,92
122,01
4,89
0,00
58,72
44,66
6,03
39,78
0,00
50,34
75,15
4,89
Golden delicious Ontario
21,42
0,00
14,32
11,58
0,19
5,09
0,00
35,23
0,95
0,19
Idared
10,63
0,00
11,96
9,27
0,00
Golden delicious Ontario
0,38
0,00
9,51
0,00
0,00
4,89
0,00
23,91
0,38
0,38
Idared
0,38
0,00
14,01
0,00
0,00
Golden delicious Ontario
0,38
0,00
0,38
0,38
0,00
4,50
0,00
0,76
0,38
0,00
Idared
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Skladování ve skladech s nucenou úpravou složení atmosféry, její teploty a vlhkosti, v tzv. CA skladech (controlled atmosphere – řízená atmosféra) umožňuje zvýšení koncentrace CO2 a snížení koncentrace O2. Úprava složení atmosféry způsobuje také zpomalení kažení ovoce způsobené mikroorganismy (ARPAI, BARTL, 1977). Obvyklá skladba obou fyziologických plynů je dlouhodobě známá a obsahuje 2% kyslíku a 2 až 5% oxidu uhličitého (GOLIÁŠ, 2003). Při těchto pokusech se uvolňovalo velké množství ethylenu. Do okolního prostředí je plynný ethylen uvolňován z mezibuněčných prostorů, kde je jeho koncentrace
v rovnováze
s množstvím
ethylenu
rozpuštěným
v cytoplazmě.
Z aminokyseliny L-methioninu vzniká kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová (AAC), která je považována za bezprostřední prekurzor ethylenu (ADAMS, YANG, 1979).
51
Prostředí 1,5105% CO2 V průběhu šestidenního pokusu se obsah CO2 pohyboval v průměrné koncentraci 1,5105% a průměrný obsah ethylenu činil 125 966,7729 nl/l. U Ontaria počet CPM klesl oproti výchozím hodnotám šestkrát, u odrůdy Golden delicious a Idared asi třikrát. Ovšem v počtu plísní odrůda Ontario vykazovala nejmenší úbytek (z 58,72 x 102 na 35,23 x 102 KTJ/10 cm2). U aktinomycet byl naopak úbytek největší. Azotobacter je na zvýšení koncentrace CO2 v ovzduší poměrně citlivý, již při zvýšení z 0,03% na 1,1501% CO2 se vyskytoval je v minimálním množství. ARPAI, BARTL (1977) uvádí, že zvýšený obsah oxidu uhličitého v atmosféře skladů má ochranný účinek proti růstu mnohých plísní a kvasinek a také některých bakterií. Vyšší koncentrace CO2 už inhibují i klíčení spor plísní. Tyto podmínky se s výhodou využívají při skladování ovoce a zeleniny. Přesné složení atmosféry závisí na druhu a odrůdy skladovaného ovoce a zeleniny.
Prostředí 2,5428% CO2 Při zvýšení koncentrace o další procento oxidu uhličitého, došlo opět ke snížení mikroorganismů a také ke snížení obsahu ethylenu na hodnotu 108 198,5940 nl/l. Počet bakterií rodu Azotobacter klesl téměř na nulu, taktéž tomu bylo u aktinomycet. Množství plísní se snížilo jen nepatrně, nejvíce se nacházelo u odrůdy Ontario, ikdyž před založením pokusu se nejvíce plísní vyskytovalo na povrchu jablka odrůdy Golden delicious. Tato odrůda měla po ukončení pokusu nejmenší osídlení povrchu plísněmi. U odrůdy Golden delicious a Idared byl celkový počet mikroorganismů totožný (0,38 x 102 KTJ/10 cm2) a na povrchu Ontaria byl celkový počet mikroorganismů poněkud vyšší (4,89 x 102 KTJ/10 cm2). JELEN (1976) uvádí koncentraci CO2 skladovací atmosféry pro Golden delicious 3 – 5% (někdy až 7% CO2).
Prostředí 9,2160% CO2 V tomto prostředí došlo ke snížení obsahu ethylenu na hodnotu 63 514,2436 nl/l a ke značnému úbytku plísní. To znamená, že tato koncentrace CO2 inhibuje již prozatím
odolné
plísně. Bakterie rodu
Azotobacter
se
už
nevyskytovaly
žádné a aktinomycety a CPM se přiblížily nulovým hodnotám. Bude-li vysoký obsah CO2 v řízené atmosféře, je možné výrazně snížit produkci ethylenu ve skladované plodině, výrazně omezit mikrobní napadení, zejména plísněmi, 52
avšak zároveň se vyvolá anaerobní respirace a výrazná tvorba fenolických látek GOLIÁŠ, 2004). Proto pro jednotlivé druhy ovoce a zeleniny (u mnohých druhů také odrůdy) musí být prospěšné účinky upravené atmosféry rámcově známy, zejména limitní přípustné hodnoty (dokonce pro tytéž odrůdy jablek, pěstovaných v odlišných klimatických podmínkách – ve smyslu zeměpisné šířky – mohou na stejnou plynnou směs reagovat diferencovaně) (GOLIÁŠ, 1996). Tab. 11 srovnává množství mikroorganismů na zkoumaných odrůdách. Na začátku pokusu se nejvíce mikroorganismů vyskytovalo na povrchu jablka Golden delicious, ale nejvyšší hodnoty na konci pokusu měla jablka odrůdy Ontario. Ikdyž se zvyšující se koncentrací CO2, klesal obsah ethylenu, počty mikroorganismů se stále snižovaly. Lze usoudit, že ethylen nemá na rozvoj mikroorganismů vliv.
Tab. 11 Srovnání kvantitativního zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek dle tří různých odrůd. Údaje v KTJ/10 cm2 x 102. odrůdy
CPM
Plísně
Aktinomycety
Azotobacter
Prostředí
Golden delicious
Ontario
Idared
Výchozí - 0,03% CO2
68,95
32,58
39,78
1,5105% CO2
21,42
5,09
10,63
2,5428% CO2
0,38
4,89
0,38
9,2160%CO2
0,38
4,50
0,00
Výchozí - 0,03% CO2
87,92
58,72
50,34
1,5105% CO2
14,32
35,23
11,96
2,5428% CO2
9,51
23,91
14,01
9,2160%CO2
0,38
0,76
0,00
Výchozí - 0,03% CO2
122,01
44,66
75,15
1,5105% CO2
11,58
0,95
9,27
2,5428% CO2
0,00
0,38
0,00
9,2160%CO2
0,38
0,38
0,00
Výchozí - 0,03% CO2
4,89
6,03
4,89
1,5105% CO2
0,19
0,19
0,00
2,5428% CO2
0,00
0,38
0,00
9,2160%CO2
0,00
0,00
0,00
53
Graf 1 Kvantitativní zastoupení CPM na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 2
Počet CPM/10 cm v z ávislosti na koncentraci CO2 70,00 x 10 2
40,00
KTJ/10 cm
50,00
2
60,00
30,00 20,00 10,00 0,00
0,03
1,51
2,54
9,22
Koncentrace CO 2 (%) Golden delicious
Ontario
Idared
Graf 2 Kvantitativní zastoupení plísní na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentrací CO2 2
Počet plísní/10 cm v závislosti na koncentraci CO2
KTJ/10 cm 2 x 10 2
90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
0,03
1,51
2,54
Koncentrace CO 2 (%)
Golden delicious
Ontario
54
Idared
9,22
Graf 3 Kvantitativní zastoupení aktinomycet na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2 2
Počet aktinomycet/10 cm v závislosti na koncentraci CO2 140,00
KTJ/10 cm 2 x 10 2
120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00
0,03
1,51
2,54
9,22
Koncentrace CO2 (%)
Golden delicious
Ontario
Idared
Graf 4 Kvantitativní zastoupení Azotobacter na povrchu tří odrůd jablek v uvedených koncentracích CO2
2
Počet Azotobacter/10 cm v závislosti na koncentraci CO2 7,00
KTJ/10 cm 2 x 10 2
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
0,03
1,51
2,54
Koncentrace CO2 (%)
Golden delicious
Ontario
55
Idared
9,22
5.3 Mikrobiální osídlení povrchu jablek po expozici v atmosféře 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu Protože na rozvoj mikroorganismů působil ve výše zmíněných pokusech vedle oxidu uhličitého i ethylen (viz 5.2), bylo v další pokusné sérii sledováno mikrobiální osídlení jablek v atmosféře se zvýšenou koncentrací CO2 a se sníženým obsahem ethylenu (3 942,7577 nl/l). Uvedená hodnota atmosféry (0,8349% CO2) vyjadřuje průměr z řady měření (tab. 21 – přílohy). Výsledky mikrobiologických analýz jsou uvedeny v tab. 12. Průběh vyvíjení a produkce CO2 a ethylenu jsou uvedeny v tabulkách 22 a 23 a grafech 20 – 23 (viz přílohy). Po šesti dnech od založení pokusu byla provedena mikrobiologická analýza. Jak uvádí KOPEC (2003), při skladování ovoce je nutno omezit obsah ethylenu, který zhoršuje jakost mnohých produktů. Ethylen vzniká za přístupu kyslíku (LIEBERMAN, 1979) uvolněním oxidu uhličitého a kyanovodíku (YANG, HOFFMAN, 1984). Tyto látky stejně jako vyšší hladina ethylenu mohou ovlivňovat růst a vývoj rostlin.
Tab. 12 Mikrobiální osídlení povrchu jablek ponechané šest dnů v atmosféře 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu. Údaje v KTJ/10 cm2 x 102.
Odrůda
CPM
Plísně
Aktinomycety
Azotobacter
47,10
Koliformní bakterie 0,00
Výchozí hodnoty
65,66
80,61
5,27
Golden delicious
55,73
0,00
32,20
12,84
5,64
Ontario
51,18
0,00
80,99
49,24
9,89
Idared
39,35
0,00
76,14
121,22
0,38
V grafu 5 jsou srovnány průměrné hodnoty počtu mikroorganismů na povrchu tří odrůd jablek v prostředí 0,03% CO2 s průměrnými počty mikroorganismů na povrchu jablek v prostředí 0,8349% CO2 . Je vidět, že úbytek mikroorganismů byl malý. Počty mikroorganismů jsou obdobné jako počty u výchozích hodnot. Jen u aktinomycet se počet zvýšil. Malý úbytek mikroorganismů zřejmě způsobilo mírné navýšení koncentrace CO2.
56
Graf 5: Kvantitativní zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek v atmosféře 0,03% CO2 a 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu
Srovnání počtu KTJ - 0,03% CO2 versus 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu) 90,00 počet KTJ/10 cm2 x 102
80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
CPM
Koliformní bakterie
Plísně
Aktinomycety Azotobacter
KTJ
0,03% CO2
0,8349% CO2
5.4 Mikrobiální osídlení povrchu jablek v atmosféře se sníženým obsahem O2 Hodnoty uvedené v tab. 13 jsou získány po provedení mikrobiologické analýzy jablek ponechané šest dnů v anaerostatu, pro srovnání jsou zde uvedeny také výchozí hodnoty (0,03% CO2). Dle výrobce (fa MERCK), anaerostat zajišťuje prostředí postupné snížení obsahu kyslíku na koncentraci 5 – 7% a zvýšení koncentrace oxidu uhličitého na hodnotu 8 – 10%. Jak je vidět z tab. 13, počty všech sledovaných skupin mikroorganismů se výrazně snížily. Aktinomycety (2,76 x 102 KTJ/10 cm2) a Azotobacter (2,40 x 102 KTJ/10 cm2) byly v největším zastoupení u odrůdy Ontario. Jablka odrůdy Golden delicious se vyznačovala nejčetnějším osídlením plísněmi (6,40 x 102 KTJ/10 cm2) a na jablkách odrůdy Idared bylo nejvíce CPM (9,51 x 102 KTJ/10 cm2).
57
Podobná atmosféra, která vznikla v anaerostatu se používá při skladování jablek, ale hodnoty kyslíku jsou ještě nižší, jak uvádí STOLL, MARCELLIN (1980). Spodní hranice hladiny kyslíku je jednak otázkou příslušného druhu ovoce a jednak otázkou teploty. U některých druhů jablek je možno vystačit s 1% O2 (červený Delicious), jiné vystačí s 2% (Golden delicious), kdežto většina druhů jablek musí být skladována při 3% kyslíku. Plody přijímají kyslík (O2) a vydechují oxid uhličitý (CO2). Ve vzduchotěsném prostoru tedy klesá hladina O2 a stoupá hladina CO2. U některých odrůd např. Golden Delicious, není třeba větrat, dokud není dosažena hranice 10% CO2 a 11% 02. Jiné např. Jonathan nebo Coxova reneta, nesnesou více než 5% CO2. Za normálních podmínek pak snášejí 16 % O2. Výměna látková je zde bržděna jen vysokým obsahem CO2 (JELEN, 1976). INGR (2002) uvádí, že mikrobiální kažení potravin začínají velmi často aerobní mikroorganismy, které lze potlačit zavedením dokonale anaerobních podmínek, zejména je-li v potravině zároveň uměle zvýšena koncentrace oxidu uhličitého jako hlavního metabolitu většiny mikrobiálních druhů.
Tab. 13 Mikrobiální osídlení jablek v atmosféře anaerostatu (8 – 10% CO2, 5 – 7% O2). Údaje v KTJ/10 cm2 x 102. Odrůda
CPM
Plísně
Aktinomycety
Azotobacter
47,10
Koliformní bakterie 0,00
Výchozí hodnoty Golden delicious Ontario
65,66
80,61
5,27
5,13
0,00
6,40
0,77
1,40
5,57
0,00
4,32
2,76
2,40
Idared
9,51
0,00
2,76
0,76
0,56
58
Graf 6 Kvantitativní zastoupení mikroorganismů na povrchu jablek v atmosféře se sníženým obsahem kyslíku Počet KTJ na povrchu jablek po šesti dnech v anaerostatu
počet KTJ/10 cm 2 x 102
10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
CPM
Koliformní bakterie
Plísně
Aktinomycety Azotobacter
KTJ
Golden delicious
Ontario
Idared
Graf 7 Srovnání počtu mikroorganismů na povrchu jablek v podobných podmínkách (9,2160% CO2 versus anaerostat – 8-10% CO2) Srovnání KTJ v podobných podmínkách 7,00
KTJ/10 cm2 x 102
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
CPM
Koliformní bakterie
Plísně
Aktinomycety Azotobacter
KTJ
prostředí 9,2160% CO2
59
anaerostat
5.5 Mikrobiální analýza s použitím systému Biolog Mikrobiální analýzy s použitím živného agaru (MPA) ukázaly, že se zvyšující se koncentrací
CO2,
se
počty
mikroorganismů
výrazně
snížily.
Při
analýze
mikroorganismů s použitím systému Biolog (KRCHŇÁK, 2007), bylo zjištěno, které substráty využívají mikroorganismy na povrchu jablek v běžné atmosféře (0,03% CO2). Jsou to tyto: • karbohydráty → L-arabinóza, L-rhamnóza, D-manitóza, D-maltóza, D-gkukóza, sacharóza, D-fruktóza • organické kyseliny → citrónová kyselina, propionová kyselina, malonová kyselina, mléčná kyselina • aminokyseliny → histidin, alanin, asparagin, lyzin, glutamová kyselina, arginin • škrob
Také bylo zjištěno, že při vyšší koncentraci CO2 (2,5428%) zůstává na povrchu jablek fyziologicky různorodá mikroflóra využívající tyto substráty : • karbohydráty → m-inosit, L-arabinóza, L-rhamnóza, sacharóza, D-fruktóza • organické kyseliny → asparagová kyselina, sukcinát, maleinová kyselina, malonová kyselina • aminokyseliny → L-cystein, histidin, alanin, serin, glutamová kyselina, arginin
60
6. ZÁVĚR Ze
zkoumání
účinku
zvyšující
se
koncentrace
oxidu
uhličitého
na
mikroorganismy osídlující povrch jablek, je možné učinit tyto závěry: • se zvyšující se koncentrací CO2 se počty všech zkoumaných skupin mikroorganismů snižovaly • již při koncentraci 1,5105% CO2 (obsah ethylenu 125 966,7729 nl/l) se výrazně snížil počet aktinomycet a Azotobacteru, při této koncentraci se ještě poměrně často vyskytovaly plísně ( v průměru 20,50 x 102 KTJ/10 cm2) a CPM (průměrně 12,38 x 102 KTJ/10 cm2) • v prostředí o koncentraci 2,5428% CO2 (obsah ethylenu 108 198,5940 nl/l) se již podstatně snížil počet CPM, počet plísní klesl jen minimálně (průměrné množství 15,81 x 102 KTJ/10 cm2) • výrazný úbytek plísní bylo možné sledovat až při koncentraci 9,2160% CO2 (obsah ethylenu 63 514,2436 nl/l), Azotobacter se již nevyskytoval, CPM a aktinomycety jen výjimečně • se zvyšující se koncentrací CO2 klesal obsah ethylenu. Lze usoudit, že ethylen zřejmě neměl na mikroorganismy žádný účinek • při koncentraci 0,8349% CO2 se sníženým obsahem ethylenu (3942,7577 nl/l) byl počet mikroorganismů mírně nižší než u výchozích hodnot, tento úbytek byl zřejmě způsoben mírným navýšením koncentrace CO2 z 0,03% na 0,8349% CO2 • na mikroorganismy na povrchu jablek ponechaných šest dnů v anaerostatu působila nejenom zvýšená koncentrace CO2 (8-10%), ale také snížený obsah O2 (5-7%) oproti běžné atmosféře (0,03% CO2, 21% O2) – počet mikroorganismů se snížil v porovnání s běžnou atmosférou takto: CPM z 47,10 x 102 na 6,74 x 102 KTJ/10 cm2 plísně z 65,66 x 102 na 4,49 x 102 KTJ/10 cm2 aktinomycety z 80,61 x 102 na 1,43 x 102 KTJ/10 cm2 Azotobacter z 5,27 x 102 na 1,45 x 102 KTJ/10 cm2
61
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Adams,
D. O., Yang, S. F. Ethylene biosynthesis.
Identification of 1-
aminocyclopropane-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of methione to ethylene. Proc. Natl. Acad. Sci 1979. 170 – 174 s. Arpai, J., Bartl, V. Potravinárska mikrobiológia. Alfa Bratislava. 1977. 280 s. Atlas, R., Bartha, R. Microbial ecology. Benjamin/cummings Publishing. California 1987. 533 s. ISBN 0-201-00300-7 Baďurová, L. Mikroflóra vzduchu, ovoce a zeleniny ve velkoprodejnách potravin. Dipl. práce. MZLU Brno 2004. 104 s. Brecht, J. K., Kader, A. A., Heintz, C. M. Controlled atmosphere and ethylene effects on quality of California canning apricots. Univ. of California 1982. Brackett, R. E. Fruits, Vegetables and Grains, In: Doyle, P. M., Beuchat, R. L., Montville, T. J. Food microbiology, ASM Press, Washington D. C. 2001. 127 – 128 s. ISBN 3-9803083-8-3 Cempírková, R., Lukášová, J., Hejlová, Š. Mikrobiologie potravin Jihočeská univerzita České Budějovice 1997. 165 s. Deak, T., Beuchat, R. L. Yeasts in specific type of food In Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press Boca Raton 1996. Domsch, K. H., Gams, W., Anderson, T. H. Compendium of Soil Fungi. IHW – Verlag 1993. 859 s. Enfors, S.-O., Molin, G. The influence of high concentrations of carbon dioxide on the germination of bacterial spores. J. Appl. Bacteriol 1978. 279 – 285 s. Goliáš, J. Skladování a zpracování ovoce a zeleniny I. Základy chladírenství. MZLU Brno 1996. 158 s. ISBN 80-7157-229-2 Goliáš, J. Technické a technologické uplatnění plynné směsi při skladování ovoce. Zahradnictví. 2003. č. 11. 8 – 9 s. Goliáš, J. Skladování ovoce ve velmi nízkém obsahu kyslíku. Agromagazín. 2004. č. 9. 32 – 34 s. Hampl, B. Potravinářská mikrobiologie. SNTL Praha 1968. 276 s. Hrdličková, L. Zdroje mikrobiální kontaminace vzduchu ve velkoprodejnách ovoce a zeleniny. Dipl. práce. MZLU Brno 2004. 69 s. Ingr, I. Základy konzervace potravin. MZLU Brno 2002. 130 s.
62
Jay, J. M., Loessner, M. J., Golden, D. A. Modern food microbiology, seventh edition. Springer 2005. Jelen, V. Moderní skladování a jakost ovoce. Merkur Praha 1976. 124 s. Klánová, K. Standardní operační postupy pro vyšetřování mikroorganismů v ovzduší a pro hodnocení mikrobiologického znečištění ovzduší ve vnitřním prostředí. Státní zdravotní ústav Praha 2002. 21 s. Komprda, T. Legislativa a kontrola potravin. MZLU Brno 1999. 172 s. ISBN 80-7157360-4 Kopec, K. Tabulky nutričních hodnot ovoce a zeleniny. ÚZPI Praha 1998. 72 s. ISBN 80-86153-64-9 Kopec, K. Požadavky na skladování ovoce a zeleniny. Zahradnictví. 2003. č. 11. 9 s. Kosek, R. Využití ošetření vyšší koncentrací CO2 při skladování ovoce. Dipl. práce. MZLU Brno 1998. 56 s Krchňák, J. Využítí systému BIOLOG pro charakteristiku fyziologické diversity mikroflóry ovoce a zeleniny. Dipl. práce. MZLU Brno 2007. 60 s. Kyzlink, V. Základy konzervace potravin. SNTL Praha 1980. 516 s. Lieberman, M. Biosynthesis and action of ethylene. Annual Rev. Plant Physiology. 1979. 533 – 591 s. Malíř, F., Ostrý, V. a kolektiv autorů. Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Národní centrum ošetřovatelství a nelelékařských zdravotnických oborů v Brně 2003. 345 s. ISBN 80-7013-395-3 Ostrý, V. Mikroskopické vláknité houby. Účinky mykotoxinů na lidské zdraví. Vesmír 79. 2000.20 s. Polster, M. Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách. Ústav pro vzdělání středních zdravotnických pracovníků. Brno 1971. Prokeš, J.,Fišerová, H., Helánová, A., Hartmann, J. Význam oxidu uhličitého a ethylenu v procesu sladování. Kvasný průmysl. 52, 2006, 11-12, 349 s. Sears, D. F., Eisenberg, R. M. A model representing a physiological role of CO2 at the cell membrane. J. Gen. Physiol 1961. 869 – 887 s. Stoll, K., Marcellin, P. Skladování ovoce a zeleniny v řízené atmosféře. 1980. 195 s. Šapiro, D. K. a kolektiv. Ovoce a zelenina ve výživě člověka. Státní zemědělské nakladatelství Praha 1988. 227 s. Šilhánková, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Victoria publishing, a.s. Praha 2002. 363 s. 63
Šroubková, E. Zemědělská mikrobiologie (speciální část pro fytotechnický obor). Vysoká škola zemědělská Brno 1990. 73 s. Tichá, J. Mikroorganismy a jiní škůdci v mlýnskopekárenském průmyslu a ochrana proti nim. Nakladatelství technické literatury Praha 1988 . Vajdík, J. Biologie pro 4. ročník SPŠ konzervárenské. Státní nakladatelství technické literatury Praha. 1978 188 s. Wolf, A. Hygiena výživy. Avicenum – zdravotnické nakladatelství Praha 1985. 384 s. Yang, S. F., Hoffman, N. E. Ethylene biosynthesis and regulation in higher plants. Annual Rev. Plant Physiology. 1984. 155 – 189 s.
Vyhlášky: Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 157/2003 Sb., kterou se provádí zákon č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro čerstvé ovoce a čerstvou zeleninu, zpracované ovoce a zpracovanou zeleninu, suché skořápkové plody, houby, brambory a výrobky z nich
Normy: ČSN 46 3000 – Společná ustanovení pro ovoce a zeleninu
64
