Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
MIKBIOLOGICKÁ KONTROLA KVALITY PITNÝCH VOD Z WATERCOOLERŮ Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce
Vypracovala:
Prof. RNDr. Marta Tesařová, Csc.
Bc. Eliška Háková
Brno 2008
1
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Mikrobiologická kontrola kvality pitných vod z watercoolerů“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….
2
PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla zvláště poděkovat paní prof. RNDr. Martě Tesařové, Csc. za laskavý přístup, odborné vedení, cenné rady i připomínky, které mi pomohly při zpracování této diplomové práce. Dále můj dík patří panu Ing. Františku Kubíkovi, Csc., řediteli společnosti Šumavský pramen a.s., za možnost spolupráce s ním, poskytnutí materiálu k analýzám i za připomínky k této práci. Současně děkuji i dalším pracovníkům Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, jednak za jejich pomoc při analýzách, i za připomínky a rady a za vřelé přijetí. Velký dík patří i firmě Drinex s.r.o. za dovoz materiálu. Dále celému Ústavu techniky a automobilové dopravy (vedoucí doc. Ing. Miroslav Havlíček, Csc.) za možnost umístění přístrojů. Další dík patří i panu RNDr. Petru Marvanovi, Csc. a panu Ing. Radovanu Koppovi, Ph.D.
za
pomoc
při
identifikaci
řas.
Chtěla
bych
dále
ještě
poděkovat
paní Dr. Ing. Heleně Fišerové za možnost uskladnění materiálu použitého k mikrobiologickým analýzám. Zvláštní poděkování patří mé rodině za umožnění a podporu při studiu.
3
ABSTRAKT Cílem diplomové práce bylo posoudit mikroflóru balených vod, vliv různého způsobu skladování, dále zhodnotit kvalitu vody po průchodu watercoolerem a vliv způsobu sanitace na mikrobiální kvalitu čepované vody. Stanoveny byly počty KTJ rostoucích při 22 °C a 36 °C, koliformní bakterie, Pseudomonas aeruginosa, enterokoky, Clostridium perfringens, počty oligotrofních mikroorganismů, plísní a kvasinek. Skladování barelů v jiných podmínkách než „temno-chlad“, může mít negativní vliv na mikrobiologickou kvalitu balené vody. V žádném vzorku nebyly izolovány koliformní bakterie, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa ani Clostridium perfringens. Po měsíčním skladování barelů v podmínkách „chlad-světlo“ byl zjištěn masivní nárůst řas Pseudococcomyxa simplex a Chlorella ssp.. Nově byla prokázána sedimentace oligotrofních mikroorganismů na dno barelů (290 – 7250 KTJ/ml). U vzorků vod z watercoolerů jsou počty mikroorganismů, nejen po sanitaci, ale i po samotném načepování, mnohonásobně vyšší. Můžeme tedy uvažovat o vytvoření biofilmu na některé ze součástek, které nelze při běžné údržbě mechanicky vyčistit. Každá balená voda, pokud je nevhodně skladována nebo čepována přes nedostatečně
sanitovaný
watercooler,
může
obsahovat
mikroorganismů, hlavně KTJ při 22 °C. Klíčová slova: balená voda, watercooler, mikroorganismy
4
nadlimitní
počty
ABSTRACT The aim of this work was to detect bacteria in bottled water and to evaluate the influence of different storage. The quality of water from watercoolers and the influence of sanitation on microbial quality of this water was also studied. Cultivation of samples proceeded at 22 oC and 36 oC.
After cultivation CFU
of coliforms, Pseudomonas aeruginosa, enterococs, Clostridium perfringens, numbers of oligotrophs, fungi and yeasts were counted. Storaging barrels in different conditions than „dark and cold“ may have negative effects on microbial quality of bottled water. Coliforms, enterococs, Pseudomonas aeruginosa and Clostridium perfringens were not detected in any sample. After one month of storaging barrels in conditions „light and hot“ the massive growth of Pseudococcomyxa simplex and Chlorella ssp. was measured. Recently the sedimentation of oligotrophic microorganisms at the bottom of barrel was proved (290 – 7250 CFU/ml). Numbers of microorganisms in samples from watercoolers, not only after sanitation but also after tapping, were much more higher. We can think over formation of biofilm on some part of the watercooler which can not be machanical treated within ordinary maintaining. Every bottled water if it is unconveniently storaged or if it is taped through watercooler with bad sanitation may contain over limits of microorganisms especially CFU at 22 oC. Keywords: bottled water, watercooler, microorganisms
5
OBSAH 1. ÚVOD ................................................................................8 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED........................................................9 2.1 Historie výroby balených vod....................................................... 9 2.2 Spotřeba balených vod............................................................... 10 2.3 Legislativa a právní předpisy ..................................................... 11 2.4 Požadavky na balenou vodu ...................................................... 12 2.4.1 Obecné požadavky......................................................................................... 12 2.4.2 Fyzikální a chemické ukazatele: .................................................................. 13 2.4.3. Mikrobiologické ukazatele........................................................................... 13 2.4.3.1. Indikátorové mikroorganismy................................................................ 15 2.4.3.2. Neindikátorové mikroorganismy............................................................ 21 2.5 Mikrobiologie vody..................................................................... 24 2.6 Přehled balených vod a jejich označování................................. 26 2.7 Rizika kontaminace a kontrolní činnost .................................... 29 2.8 Watercoolery.............................................................................. 32
3. CÍL PRÁCE ......................................................................36 4. MATERIÁL A METODY .....................................................37 4.1 Materiál ...................................................................................... 37 4.1.1 Vliv podmínek skladování barelů na mikrobiologické změny vody ............ 37 4.1.2 Vliv watercoolerů na mikrobiologickou kvalitu........................................... 38 4.2 Metody........................................................................................ 38 4.2.1 Skladovací pokus........................................................................................... 38 4.2.2 Voda čepovaná přes WTC............................................................................. 38 4.2.3 Účinnost sanitace a sanitačních prostředků ................................................ 39 4.3 Příprava mikrobiologického rozboru ......................................... 41 4.3.1 Sterilizace laboratorního skla....................................................................... 41 4.3.2 Příprava kultivačních půd ............................................................................ 42 4.3.3 Způsob odběru vzorků vody .......................................................................... 44 4.3.4 Způsob očkování ........................................................................................... 44 4.3.5 Kultivace a hodnocení mikrobiologických výsledků.................................... 45 4.3.6 Způsob vyhodnocení výsledků ...................................................................... 46
5. VÝSLEDKY A DISKUSE ....................................................47 5.1 Vliv podmínek skladování na počty mikroorganismů v balené vodě.................................................................................................. 47 5.2 Rozbor dna barelů ...................................................................... 53 5.3 Watercoolery.............................................................................. 56 5.3.1 Vliv sanitace na mikrobiální osídlení vody prošlé přes watercooler ........... 56
6
5.3.2 Mikrobiální změny v balené vodě po průchodu WTC ................................. 59 5.3.3 Vliv prostředí ................................................................................................. 61 5.3.4 Vliv typu WTC ............................................................................................... 62
6. ZÁVĚR.............................................................................65 7. POUŽITÁ LITERATURA....................................................66 8. SEZNAM TABULEK ..........................................................71 9. SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ...........................................72 SEZNAM PŘÍLOH ................................................................73
7
1. ÚVOD Balené vody se řadí do skupiny, která tvoří rozhraní mezi hromadným a individuálním zásobováním. Voda jako taková není využita pouze k přímé spotřebě konzumentem, ale může být použita pro výrobu kojenecké výživy a dalších potravin, k ošetření pokožky, dále může tvořit náplň do zvlhčovačů vzduchu apod.. Patří k výrobkům, u kterých v posledních letech dochází k zvyšování odbytu. Při pohledu za posledními deseti lety zjistíme, že balená voda se stala náhradou vody „obyčejné“ z vodovodu. Řada spotřebitelů dává přednost balené vodě z důvodů, že jim voda z vodovodu buď nechutná nebo je cítit chlórem nebo si myslí, že není kvalitní, proto si raději koupí vodu balenou. Tyto vody podléhají přísné kontrole. Při stáčení, balení a distribuci balené vody je třeba dodržovat hygienické limity u mikrobiologických, biologických, fyzikálních, chemických a organoleptických ukazatelů, které jsou stanoveny vyhláškou č. 404/2006 Sb.. Z hlediska mikrobiologického nepředstavují balené vody ideální substrát pro rozmnožování mikroorganismů, ale i přesto se zde dá pozorovat řada mikroorganismů, které se zde úspěšně pomnožují. Tématem předložené diplomové práce je charakteristika mikrobiálního osídlení balené vody používané pro watercoolery.
8
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Historie výroby balených vod Výroba a prodej balených vod má u nás dlouhou tradici, kterou můžeme vystopovat až do 16. století. Původně šlo o vody léčivé (ať už se skutečným nebo domnělým
účinkem), stáčené do kameninových džbánů. K nim se později
(18.-19. století) přidaly i vody, které byly pro svou zvláštní chuť považovány za osvěžující nápoj. Jednalo se buď o minerální vody nebo o vody s vysokým obsahem CO2, ať původu přirozeného (kyselky) nebo uměle připravované (tzv. „seltzer“), stáčené převážně do skla. (KOŽÍŠEK, 2001) Výnosem c.k. místodržitelství markrabství moravského 3.VIII, č. 30.910. Ministerstvu vnitra bylo oznámeno, že v hostincích, restauracích a kavárnách minerální vody z velkých původních lahví do menších nádob se přelévají a v tomto tvaru do prodeje bývají uváděny. Manipulací touto, k docílení většího zisku prováděnou, nutně zhoršila by se původní jakost vody minerální ke škodě konsumentův. Vyzývá se tudíž pan c.k. okresní hejtman (rada městská), aby podal(a) zprávu, zda a v jakém rozsahu takového zacházení s minerálními vodami v podřízeném úředním okrese bylo pozorováno a zavdalo-li podnět k úřednímu zakročení. (Časopis pro veřejné zdravotnictví; říjen 1899) Výnosem c.k. místodržitelství království Českého 12. III. č 38.297. Prodej přirozených vod minerálních je povolen pouze v původních lahvích od správy léčivých pramenů podle předpisů naplněných a zátkovaných a od nich do obchodu odevzdaných. Přelévání jich do jiných lahví, jímž se jakost vod minerálních zhoršuje, je zakázáno. (Časopis pro veřejné zdravotnictví; duben 1900) (ANONYM, 2005) V Evropě v letech 1970 – 1980 došlo ke změnám, jednak skleněné obaly začaly být postupně vytlačovány plastickými (PVC, PE, PET, PC), jednak došlo ještě k jiné, mnohem revolučnější změně: balené vody začaly být používány též jako zdroj „obyčejné“ pitné vody nejen jako řešení havarijních situací, ale především jako náhrada za pitnou vodu distribuovanou veřejnými vodovody. Vedle vybraných druhů minerálních vod se tedy začaly stáčet i vody z kvalitních podzemních zdrojů, které nevykazovaly ani zvláštní chuť, ani nějaký farmakologický účinek. (KOŽÍŠEK, 2001)
9
2.2 Spotřeba balených vod Spotřeba balených vod v posledních letech zaznamenává stálý růst. Možnou příčinou může být nedůvěra ve vodu vodovodní, ale také zlepšující se ekonomická situace, která dovoluje, navzdory vyšším nákladům, připlatit si za lepší chuť vody bez desinfekčních přípravků. V poslední době také zaznamenáváme prudce se rozšiřující sortiment, ve kterém si dnes každý spotřebitel najde produkt, jenž mu vyhovuje. (ČEŘOVSKÁ, 2005) Zatímco v roce 1994 představovala průměrná spotřeba nealkoholických nápojů 60 litrů na osobu a rok, v roce 1997 to bylo už téměř 100 litrů na osobu a rok. Z tohoto množství v roce 1994 připadalo na minerální a stolní vodu 40,5%, kdežto o tři roky později to bylo již 61,7%. (ČEŘOVSKÁ, 2005) O spotřebě minerálních vod a nealkoholických nápojů lze najít více v každoročních zprávách Českého statistického úřadu o spotřebě potravin. Spotřebu balených vod v období od roku 1999 – 2006 uvádí tabulka Tab.1. (KOBEŠ, 2007) Tab. 1 Spotřeba balených vod v ČR v litrech na osobu a rok 1999 2000 2001 2002
2003
2004
2005
2006
Minerální vody
41,0
47,0
50,0
54,0
60,0
63,0
64,0
66,0
Sodové vody
22,0
26,0
26,0
30,0
33,4
35,0
35,0
36,0
Nealkoholické nápoje celkem
180,0 206,0 220,0 246,0 266,0 275,0 281,0 289,0
Poznámky k tabulce: 1) v tabulce není uvedena spotřeba limonád a ostatních nápojů 2) minerální vody: zahrnují přírodní minerální vody (neochucené), minerální vody ochucené a minerální vody léčivé 3) sodové vody: zahrnují pramenité, kojenecké a zřejmě i balené pitné vody
Z výše uvedené tabulky je zřejmé, že v roce 2006 činila spotřeba nealkoholických nápojů 289 litrů na osobu a rok. Nejvíce jsme pili limonády (107 litrů) a ostatní nápoje (80 litrů) jako džusy, sirupy apod.. Pokud sečteme spotřebu sodových vod a vod minerálních (ve kterých je zahrnuta i spotřeba minerálních vod ochucených) dostaneme se na číslo 102,0 litrů na osobu a rok. Pokud se však podíváme a kombinujeme výsledky společnosti Canadean a UNESDA (konfederace evropských asociací výrobců nealkoholických nápojů), zjistíme trochu odlišná čísla, kdy v roce 2006 byla celková spotřeba nealkoholických nápojů v ČR 270 litrů na osobu a rok.
10
Když nahlédneme do statistik evropských zemí, tak zjistíme, že ČR se pohybuje na předních příčkách spotřeby nealkoholických nápojů. Na jedné straně jsou země, kde je spotřeba podstatně vyšší jako Německo (317,5 litrů na osobu v roce 2006) a na straně druhé například v Lotyšsku a Litvě činí roční spotřeba balených vod okolo 110 litrů na osobu. V USA v roce 2005 se celkový objem výroby balených vod zvýšil na 7,5 mld. galonů (téměř 34 mld. l), což byl oproti roku 2004 nárůst o 10,7 %. V hodnotách spotřeby na hlavu v roce 2005 se vypilo 26,1 galonů (117 l) balených vod, což je oproti roku 2004 zvýšení o 2,3 galonů (o více než 10 l). (PERLÍN, 2006) V České republice se více než 90 % produkce balených vod stáčí do 1,5 litrových plastových lahví. Situace v ostatních Evropských státech liší, ale ve většině z nich dávají přednost plastovým obalům, např. ve Španělsku (87 %), Francie (70 %). Naproti tomu v Německu téměř většinu výroby stáčejí do skla (97 %), v Rakousku je to 60 %. Pouze malý podíl balených vod v Evropě se plní do kartónových krabic nebo do hliníkových plechovek. (ČEŘOVSKÁ, 2005) 2.3 Legislativa a právní předpisy Vstupem do Evropského společenství (ES) se Česká republika rozhodla respektovat veškeré závazky vyplývající z platných právních předpisů ES. Obecné zásady a požadavky potravinového práva jsou upraveny v Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 ze dne 28. ledna 2002. Balená voda odpovídá svých charakterem definici potraviny, proto se na ni vztahuje zákon č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích ve znění pozdějších novel (dále jen „zákon o potravinách“) a jeho prováděcími vyhláškami ministerstva zdravotnictví č. 252/2004 Sb., kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou vodu a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody, ale podstatná je vyhláška č. 275/2004 Sb., o požadavcích na jakost a zdravotní nezávadnost balených vod a o způsobu jejich úpravy. Obě vyhlášky nabyly účinnost vstupem České republiky do ES to je 1. května 2004. V současné době už jsou tyto právní předpisy novelizovány. V zákoně o potravinách přibyla provozovatelům potravinářského podniku další povinnost a to oznámit úpravu pomocí vzduchu obohaceného ozónem při výrobě balené pramenité vody příslušnému orgánu státního dozoru, v tomto případě se jedná o Státní zemědělskou a potravinářskou inspekci. 11
Vyhláškou č. 404/2006 Sb. (dále jen vyhláška) došlo ke změně vyhlášky č. 275/2004 Sb. a sice v označování mineralizace přírodních minerálních vod. Zjednodušilo se povinné označení celkové mineralizace, vypouští se odkaz na vyhlášku č. 423/2001 Sb. o zdrojích a lázních, která zahrnuje označování vzhledem k celkové mineralizaci. U doplňujícího označování přírodních minerálních vod se vkládá, že obsah minerálních látek se stanovuje „jako odparek při 180 °C“. Vyhláška č. 252/2004 má od své účinnosti dvě novely a to vyhlášku č. 187/2005 Sb., ve které je zásadní změna týkající limitních hodnot a to v ukazatelích kolonie při 22 °C kde je mezní hodnota (dále MH) 500 KTJ (kolonie tvořící jednotka)/ml a kolonie při 36 °C kde je HM 100 KTJ/ml, tyto limity platí po dobu minimální trvanlivosti, tzn. do otevření originálního obalu. Dříve se pro kolonie při 36 °C používal termín mezofilní mikroorganismy a jako psychrofilní mikroorganismy byly označovány současné kolonie při 22 °C. Dále v roce 2006 proběhla další novelizace vyhlášky č. 187/2006 Sb. a to vyhláškou č. 293/2006 Sb., která se týká mikrobiologických, biologických, fyzikálních, chemických a organoleptických ukazatelů teplé vody a jejich hygienických limitů. Všechny zmíněné právní předpisy jsou harmonizovány s legislativou ES.
2.4 Požadavky na balenou vodu Pro zajištění jakosti balených vod slouží výše zmíněné vyhlášky č. 293/2006 Sb. a č. 404/2006 Sb., ve kterých jsou zakotvené jednotlivé skupiny požadavků a to následovně:
2.4.1 Obecné požadavky Balené vody musí být čiré a bezbarvé, nesmějí obsahovat původce onemocnění nebo
organismy indikující
jejich
možnou
přítomnost
a nesmějí
vykazovat
organoleptické závady. Vody ze zdrojů vhodných k výrobě balených vod, s výjimkou balené pitné vody, lze k balení či jinému zpracování před balením přepravovat pouze potrubím, které ji chrání před poškozením její zdravotní nezávadnosti. K výrobě balené pramenité vody a balené kojenecké vody může být použit pouze chráněný zdroj podzemní vody, jehož vydatnost, složení, teplota a ostatní základní vlastnosti musí být ustálené v mezích přirozeného kolísání.
12
2.4.2 Fyzikální a chemické ukazatele: 1. zdravotně významné anorganické látky: antimon, arsen, baryum, berylium, chrom, měď, kyanidy celkové, fluoridy, olovo, mangan, rtuť, nikl, dusičnany, dusitany, selen. Jejich nejvyšší mezní hodnota (dále jen NMH) byla stanovena jednotkou mg/l. 2. zdravotně významné organické látky: 1,2-dichlorethan, benzen, benzopyren, chlorethen, pesticidní látky, polycyklické aromatické uhlovodíky, tetrachlorethen, trihalomethany, trichlorethen a trichlormethan. U všech těchto ukazatelů je limit v podobě NMH a MH v µg/l. 3. ukazatelé, jejichž vyšší obsah může mít vliv na jakost vody: Patři jsem např.: hliník, amonné ionty, chloridy, sodík, sírany, rozpuštěné látky, železo, barva, chuť, pach, zákal, vodivost, reakce vody a chemická spotřeba kyslíku manganistanem (není-li stanoven celkový organický uhlík). Jako typy limitu jsou MH v jednotkách mg/l, u vodivosti je to mS/m a u senzorických ukazatelů se jedná o stupnice. Do problematiky fyzikálních ukazatelů lze zahrnout i radionuklidy, které se mohou přirozeně vyskytovat ve zdrojích podzemních vod. Jedná se především o radionuklidy, které jsou součástí přírodních přeměnových řad – uranové, thoriové a aktinové. Vznikají postupnou radioaktivní přeměnou uranu nebo thoria obsaženého v horninách. Nejčastěji je v podzemní vodě zjišťována přítomnost radonu –
222
Rn, radia –
226
Ra a izotopů uranu –
238
U a
234
U. Uvedené
radionuklidy se vzájemně liší co do poločasu přeměny, druhu emitovaného záření nebo chování v organismu. (VLČEK, 2003)
2.4.3. Mikrobiologické ukazatele Porovnání
mikrobiologických
ukazatelů
balené
z vodovodního kohoutku, zachycuje následující Tab. 2.
13
vody
a
vody
pitné
Tab. 2 Mikrobiologické ukazatele balené vody a vody z veřejného vodovodu Ukazatel
Balená voda
Pitná voda
Escherichia coli
0 KTJ/250 ml (NMH)
0 KTJ/100 ml (NMH)
Koliformní bakterie
0 KTJ/250 ml (NMH)
0 KTJ/100 ml (MH)
Enterokoky
0 KTJ/250 ml (NMH)
0 KTJ/100 ml (NMH)
Pseudomonas aeruginosa
0 KTJ/250 ml (NMH)
Clostridium perfringens
0 KTJ/250 ml (NMH)
Siřičitany redukující střevní
0 KTJ/50 ml (NMH)
0 KTJ/100 ml (MH)3)
sporulující anaerobní bakterie Počet kolonií při 22 °C
100 KTJ/ml (MH) 1) 300 KTJ/ml (MH)
Počet kolonií při 36 °C
Mikroskopický obraz – živé
2)
200 KTJ/ml (MH) 100 KTJ/ml (NMH)5)
20 KTJ/ml (MH) 1)
20 KTJ/ml (MH)
20 KTJ/ml (MH) 2)
20 KTJ/ml (NMH) 5)
0 jedinců/ml (NMH)
0 jedinců/ml (MH)4)
organismy 50 jedinců/ml (MH) 4)
Mikroskopický obraz – počet organismů
10 % (MH) 4)
Mikroskopický obraz abioseston Poznámky k tabulce: 1)
platí pouze pro výrobek analyzovaný do 12 hodin po naplnění, během nichž musí být voda udržována
při teplotě 4 °C ± 1 °C. Balená kojenecká a pramenitá smí obsahovat pouze takové množení schopné druhy mikroorganismů, které nepoukazují na znečištění při explotaci zdroje nebo při výrobě (jakostní požadavek) 2)
platí pro kojenecké vody, přírodní minerální nebo pramenité vody uváděné do oběhu jako „vhodné
pro přípravu kojenecké a dětské stravy“, hodnota musí být dodržena až do okamžiku prodeje konečnému spotřebiteli 3)
stanovuje se u pitných vod upravovaných přímo z povrchových vod nebo u podzemních vod
ovlivněných povrchovými vodami 4)
stanovuje se v případě, je-li zdrojem povrchová voda. Je-li zdrojem podzemní voda, stanovuje se pouze
v případě ovlivnění podzemního zdroje povrchovou vodou a indikace pomnožování organismů v síti. 5)
platí pro balenou pitnou vodu při stáčení do obalů
KTJ = kolonie tvořící jednotka
14
2.4.3.1. Indikátorové mikroorganismy Pro mikrobiologické posouzení kvality balených vod je používáno určité vybrané spektrum tzv. indikátorových mikroorganismů. Obvykle v něm bývají zahrnuty indikátory fekálního znečištění, dále pak indikátory obecné kontaminace. Základní význam je kladen především na indikátory fekálního znečištění, což je ukazatel Escherichia coli, koliformní bakterie a enterokoky. Jiný význam pak mají indikátory obecné kontaminace, tedy KTJ při 22 °C a při 36 °C. Tento výčet je obvykle považován za standardní rozsah indikátorového spektra. Další indikátory již sice nejsou běžnou součástí tohoto spektra, ale jsou některými normami či směrnicemi uváděny, i když jejich indikátorový význam není jednoznačný,
např.
Clostridium
perfringens,
či
sulfidredukující
klostridie.
(ŠAŠEK, 1999) Jiná otázka je, zda indikátorový systém postihuje všechny faktory, jež rozhodují o zdravotní závadnosti či nezávadnosti vody. Bakteriologická nezávadnost, vztažená jen na střevní patogeny, zabezpečuje jen jednu oblast rizika a nic neříká o nezávadnosti po stránce virologické, protozoální, mykobakteriální, mycetické, helmintologické apod.. (ŠAŠEK, 1999) Platná vyhláška požaduje spektrum ukazatelů pro balené vody následovně: Escherichia coli, koliformní bakterie, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa, siřičitany redukující střevní sporulující anaerobní bakterie a ukazatele obecné kontaminace počty kolonií při 22 °C a počty kolonií při 36 °C. Koliformní bakterie Světová
zdravotnická
organizace
(WHO)
definovala koliformní bakterie jako jakékoliv tyčinkovité, nesporolující, gramnegativní bakterie se schopností růstu za přítomnosti žlučových solí a jiných povrchově aktivních
látek.
Dále
uvádí
negativní
reakci
na cytochromoxidázu a schopnost fermentace laktózy Obr. 1 Koliformní mikroorganismy
při 35 °C či 37 °C za produkce kyselin, plynu a aldehydu během 24 – 48 hodin. (AMBROŽOVÁ, 2004)
15
Tradičně se za skupinu koliformních bakterií považují rody Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Ne všechny druhy těchto rodů jsou správnými ukazateli. Některé se vyskytují ve vodním prostředí, ale ve fekáliích zřídka a jejich přítomnost nemusí
tedy
znamenat
fekální
původ
znečištění.
Je
kladen
větší
důraz
na termotolerantní koliformní bakterie, hlavně tedy na Escherichiu coli. (ŠAŠEK, 1999) Pro svoji chemolabilnost jsou koliformní bakterie indikátorem sanitace (čištění a dekontaminace) technologického zařízení a nářadí, či signalizací sekundární kontaminace. V pitné vodě jsou ukazatelem jakosti. (GÖRNER, VALÍK, 2004) Escherichia coli Nejlepším
koliformním
indikátorem
fekálního
znečištění (i podle směrnic WHO), pocházejícím z lidských a
zvířecích
fekálií,
je
Escherichia
coli.
V lidských
a zvířecích exkrementech představuje E. coli podíl 90 – 100 % celkových izolovaných bakterií. (AMBROŽOVÁ, 2004) Předběžně
určená
E.
coli
je
označena
jako
presumptivní, přímá a totální identifikace je uváděna jako přímé stanovení E .coli (ŠAŠEK, 1999).
Obr. 2 Escherichia coli
Enterokoky V roce 1946 byly tyto bakterie označeny jako
indikátory
nebezpečného
znečištění
charakteristické pro splašky a živočišné fekální odpady.
Běžně
se
vyskytují
v obsahu
intestinálního traktu, proto jsou používány jako indikátor fekálního znečištění. Převládající počet kmenů tzv. fekálních streptokoků náleží druhům Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium. Jsou citlivé vůči změnám Obr. 3 Enterokoky na membránovém filtru
vnějšího prostředí, proto se ve vodě velmi vzácně pomnožují a přežívají zde krátkou dobu. Jsou
považovány za indikátory čerstvého fekálního znečištění než např. koliformní bakterie.
16
Jsou odolné vůči dezinfekčním prostředkům např. chloru, proto dále indikují nedostatečnou dávku dezinfekčního prostředku (koliformní bakterie se chovají jinak, chlor je usmrcuje). (AMBROŽOVÁ, 2004) KUNC, OTTOVÁ (1997) uvádějí jejich indikační hodnotu velmí významnou, z důvodu značné odolnosti enterokoků vůči některým toxickým látkám. Enterokoky indikují i fekální znečištění v případech doznívajícího oligodynamického účinku stříbra (Sagen), které spolehlivě likviduje koliformní mikroorganismy i skupinu obecných indikátorů. Někteří autoři zastávají názor, že tím může být nepřímo indikováno i případné nebezpečí virových infekcí, neboť viry jsou vůči chlóru také odolnější (HÄUSLER,1995).
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas
aeruginosa
představuje
oportunní patogen s přímým zdravotním dopadem zejména pro kojence, ale i děti a starší osoby. Je původcem nozokomiálních chorob, kojenecký organismus je na něj mimořádně citlivý. Vždy indikuje znečištění ze zevního prostředí. Hojně se vyskytuje
v půdě
a
vodě,
kde
se
může
nekontrolovatelně pomnožovat. Je odolný vůči Obr. 4 Pseudomonas aeruginosa
zevním vlivům i běžným dávkám chloru. Vegetuje lépe při vyšších teplotách, než jaké jsou běžné
u čerpaných studených spodních vod, u termálních vod právě pseudomonády dominují. Jako ukazatel je vždy spojován s pitnou vodou pro kojence, balenou pramenitou i minerální vodou, ale i při sledování vod rekreačních, ve vybraných poživatinách, kosmetických a farmaceutických preparátech. (ŠAŠEK, 1999) Je považována za indikátor přítomnosti nevhodných organických látek a její výskyt indikuje hrubé hygienické závady (BAUDIŠOVÁ, 2007). Pseudomonas aeruginosa působí synergicky na přežití patogenních organismů jako salmonel, umožňuje jim přežít po více než 140 dní v dvakrát destilované vodě (WARBURTON ET AL. 1992a)
17
Siřičitany redukující střevní sporulující anaerobní bakterie Jedná se o indikátor fekálního znečištění, a to starého původu v důsledku dlouhodobého přežívání spor klostridií ve vodním prostředí. Tím se též ztrácí jakákoliv souvislost s původem kontaminace. Tento indikátor je poněkud rozporu plný ve své interpretaci a to z různých důvodů. Clostridium
perfringens
jsou
poměrně
citlivé
na různé vlivy prostředí, neexistuje jednotný názor na skutečnost, zda se mikrob ve vodě vyskytuje převážně ve formě spor či vegetativních buněk. Při stanovení tohoto ukazatele dochází k zachycení mnoha dalších druhů klostridií vedle C. perfringens. (ŠAŠEK, 1999) Obr. 5 Clostridium perfringens
Ve vodách se nejvíce vyskytuje druh Clostridium
perfringens.
Spory
se
vyskytují
v intestinálním traktu, exkrementech či odpadní vodě, ale nejsou tak hojné jako koliformní bakterie. Jelikož mají vysokou rezistenci vůči chlóru a jiným chemickým či fyzikálním faktorům, je vhodné využít je jako doplňkovou kontrolu vodárenského systému, rozvodů a pro kontrolu účinnosti dezinfekce vody. (AMBROŽOVÁ, 2004) Výzkum naznačoval, že by ukazatel Clostridium perfringens mohl být užitečným indikátorem parazitologické a virologické kvality vody, neboť byla prokázána statisticky významná korelace mezi počty Clostridium perfringens, enterovirů a cystami či oocystami parazitických prvoků. (BAUDIŠOVÁ, 2007) Obecné indikátory kontaminace (počty KTJ při 36 °C a KTJ při 22 °C ) Jedná se o umělou, značně rozsáhlou, taxonomicky nesourodou skupinu organotrofních bakterií, mikroflóry
které
představují
okolního
běžnou
prostředí.
součást
Energetické
a stavební potřeby čerpají pouze z dostupné organické hmoty ve vodě. Tím je dán i jejich vztah Obr. 6 Kolonie při 22 °C
a tedy i indikátorové možnosti ve vztahu k organickému znečištění.
18
Ve vzájemném srovnání mají významnější postavení kolonie při 36 °C než kolonie při 22 °C a to pro jejich těsnější vztah k teplokrevným organismům. Oba indikátory z hlediska hygienického nemají tak velký význam jako indikátory fekálního znečištění, neboť zdravotní riziko z jejich přítomnosti a metabolické činnosti je podstatně nižší. Jejich význam spočívá především v tom, že svou přítomností či zvýšenými počty signalizují průnik organického znečištění z vnějšího prostředí, nebo poruchy a nedostatky při úpravě vody, či neúčinnou dezinfekci. Přinášejí informaci o celkovém bakteriologickém osídlení vody, tedy o úrovni bakteriální kontaminace vody. U balených vod indikují též kromě úrovně bakteriální kontaminace i kvalitu a stabilitu vody a tím i „ trofický potenciál“. (ŠAŠEK, 1999) Běžně se vyskytují ve všech typech vodního prostředí a jsou považovány obecně za indikátory celkového znečištění vody. Stanovení těchto mikroorganismů umožňuje zaznamenávat změny bakteriální populaci při technologických procesech, např. při úpravě povrchové vody na vodu pitnou, znečištění pitné vody během jejího rozvodu, změny kvality balené vody během skladování, účinnost chlorace pitné vody atd.. (AMBROŽOVÁ, 2004) Hojně používaný termín „heterotrofní mikroorganismy“ je v současné době nahrazován termínem „organotrofní mikroorganismy“, což vystihuje skutečnost, že nejen zdrojem energie, ale i uhlíku a dusíku pro tyto mikroorganismy jsou organické sloučeniny (BAUDIŠOVÁ, 2007). Oportunně patogenní mikroorganismy Mezi oportunní patogeny lze zahrnout i řadu mikroorganismů, které patří fyziologicky do skupiny organotrofních (saprofytických bakterií), které se stanovují jako výše zmíněné kolonie při 22 °C a kolonie při 36 °C. Podmíněně patogenní (oportunně patogenní) mikroorganismy se vyznačují nízkou virulencí, takže proti jejich patogennímu působení středně vysoké infekční dávce postačí přirozené, nespecifické imunitní mechanismy. Podmíněná patogenita tedy vyžaduje vysoké denzity mikroorganismů (106 – 108 i více) a oslabení jedince. Do tak vysokých denzit se mohou mikroby pomnožovat zejména v potravinách. U balených vod ze skladovacích pokusů byly prokázány denzity 104 – 105/ml, výjimečně 106. Lze tedy konstatovat, že snížená odolnost a oslabení jedince zvyšuje vnímavost u malých dětí, starých osob, nemocných, osob v rekonvalescenci, při terapii
19
s antibiotiky, u osob vyčerpaných dlouhodobou fyzickou zátěží, při dismikrobii zažívacího traktu, osob s AIDS atd.. (ŠAŠEK, 2001) V této souvislosti je třeba si uvědomit, že lidské zdraví mohou ohrozit nejen mikroorganismy patogenní či podmíněně patogenní, ale i mikroorganismy saprofytické. Ty svou metabolickou činností, která je daná jejich enzymatickým vybavením, mohou změnit substrát a vzniklé metabolické štěpy nebo produkty mohou též způsobit zdravotní potíže nejrůznějšího charakteru. Situace v případě pitné či balené vody je však vzhledem k jejich nízkému energetickému a nutričnímu potenciálu jiná než u poživatin. Různé saprofytické (organotrofní) mikroorganismy mohou dále působit i senzorické změny, jenž nemusí vždy způsobit současně i zkažení výrobku, snížení jeho biologické hodnoty
popř.
vznik
meziproduktů,
ohrožující
zdraví
konzumenta.
Některé
meziprodukty (metabolické štěpy), vzniklé v důsledku enzymatické činnosti, mohou mít dopad jen na specifické skupiny populace (konzumentů), jako jsou děti, staré osoby, nemocní apod.. V popředí zájmu jsou tedy zejména mikroby s proteolytickou a lipolytickou aktivitou, tedy zejména zástupci pseudomonád, aeromonád, bacilů, serácií a jiných skupin. (ŠAŠEK, 2001) HUNTER (1993) uvádí, že není důkaz epidemiologického rizika onemocnění při konzumaci balených vod s vysokým výskytem oportunních (podmíněných) patogenů, tedy vysoké denzitě psychrofilní a mezofilní mikroflóry. Podobně HRUBÝ (1984) vysvětluje, že právě podmíněnost patogenity vyžaduje masivní kontaminaci (pomnožení mikroflóry) s určitým oslabením jedince, aby se mohla projevit. WARBURTON (1992) považuje vysoké celkové počty zárodků (saprofytické mikroflóry) za signál, ukazující na slabší GMP (good manufacture practice – dobrou výrobní praxi), jejich náhlé zvýšení ve zdroji za jeho možnou kontaminaci. Hodnota celkových počtů je dle WARBURTON (1992) užitečná dále při hodnocení účinnosti procesu úpravy pitné vody a její dezinfekce. U balené to platí samozřejmě omezeně. STELZ (1997) uvádí, že v případě oportunních patogenů se většinou jedná o neškodné komenzály, jež jsou nebo mohou být součástí normální mikroflóry člověka nebo se mohou vyskytovat ve vnějším prostředí. Pouhý jejich důkaz ve vodě nebo potravině neopravňuje klasifikovat je jako zdravotní závadu. Při posuzování zdravotní nezávadnosti by měl být rozhodující i okruh osob, pro něž je výrobek určen a také jejich denzita. POKORNÝ (1995) se odvolává na případný možný vliv rizikových látek z proteolýzy a lipolýzy některých saprofytických bakterií, což je dáno jejich enzymatickým vybavením. 20
Závažnost saprofytické mikroflóry balené vody a jejího vlivu na lidské zdraví je obtížně prokazatelná a musí být určena experimentálními a epidemiologickými šetřeními (ŠAŠEK, 2001). GRYGAROVÁ (2000) i ROZOVÁ (2001) se shodly na tom, že přítomnost oxidu uhličitého brzdí růst bakterií, a proto jsou obecně v sycených (perlivých) vodách nalézány nižší počty těchto bakterií. 2.4.3.2. Neindikátorové mikroorganismy Do mikroflóry balených vod musíme kromě indikátorových mikroorganismů, které jsou dány platnými legislativními předpisy, zahrnout i mikroorganismy, které jsou v balených vodách přítomny, ale zatím nejsou běžně stanovovány a jejich výskyt je opomíjen. Oligotrofní mikroorganismy Oligotrofní mikroorganismy jsou velice nenáročné na přítomnost živin a energie v substrátu, v tomto případě v balené vodě, s čímž souvisí i jejich pomalý růst a málo intenzivní
metabolismus.
S přihlédnutím
k faktu,
že neovlivňují hygienickou,
resp. spotřebitelskou jakost vody, nejsou zařazovány do běžného rozboru balené vody a jejich přítomnost je proto opomíjena. Odumřelé buňky oligotrofních mikroorganismů můžou být zdrojem živin a energie pro
skupinu
mikroorganismů
označovanou
jako
tzv.
kopiotrofní
mikroorganismy, můžeme sem zahrnout KTJ při 36 °C, KTJ při 22 °C a koliformní bakterie. GRYGAROVÁ (2000), DVOŘÁČKOVÁ (2003) a HÁKOVÁ (2006) se ve svých závěrečných pracích zabývaly těmito mikroorganismy a stanovily, že oligotrofní mikroorganismy v balených vodách přítomny jsou.
21
Plísně a kvasinky Kvasinky
jsou
heterotrofní
eukaryotní
mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název
dostaly podle
schopnosti
většiny druhů
zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý. Protože
mají
většinou
pouze
sacharolytické
schopnosti, vyskytují se především na materiálech Obr. 7 Kolonie kvasinek
obsahujících cukry, tj. ovoci, zvláště bobulovém
a peckovém (hrozny, švestky apod.), a na cukernatých potravinách. Dále jsou v květních nektarech, výronech stromů, v půdě, vzduchu, ve střevním traktu lidí, zvířat a některého hmyzu (např. včel). Šíří se různými přenašeči, hlavně hmyzem, větrem apod.. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Plísně patří spolu s kvasinkami
do skupiny
mikroskopických hub. Velká morfologická rozmanitost, adaptabilita a schopnost plísní přizpůsobit se nejrůznějším podmínkám, umožňuje jejich výskyt prakticky všude tam, kde existuje organická hmota. Balená voda pro své vlastnosti a nízký obsah organických látek tedy není nejvhodnějším prostředím pro výskyt plísní. Ty však pro svou vysokou adaptabilitu v balených vodách přítomny Obr. 8 Kolonie plísně
jsou. (KRMENČÍK, 2007)
Zdroj bývá nejčastěji v plnící lince či jejím okolí (nedostatečné čistění výrobních prostor nebo jejich otevřená komunikace s vnějším prostředím), ve špatně vymyté láhvi či v některých okolnostech manipulace se vzorkem. Většinou se jedná o klidová stádia či spory mikromycet, jsou neaktivní a na kvalitu vody nemají podstatný vliv. Pitné či balené přírodní neochucené vody obvykle nemají patřičné nutriční vlastnosti pro jejich růst a rozvoj a jejich nízký energetický potenciál neumožňuje ve většině případů germinaci spor, růst mycelia, reprodukci či tvorbu mykotoxinů nebo jiných metabolitů, nepříznivě ovlivňujících senzorické vlastnosti vody. (ŠAŠEK, 1997)
22
Cyanobakterie (sinice) Tyto mikroorganismy jsou prokaryota, což znamená, že nemají oddělenou jadernou hmotu od okolní cytoplasmy jadernou membránou. Jsou velmi rozmanité, neboť zahrnují jak jednobuněčné, tak i mnohobuněčné mikroorganismy. U některých rodů je šířka buněk méně než 1 µm, u jiných více než 100 µm. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Cyanobakterie dominují spolu s eukaryotními řasami v autotrofních médiích, tj. vodách, v povrchových vrstvách půdy, v nádobách s vodou a jinde. Vyskytují se v krápnících osvětlených jeskyň, v laboratorních roztocích aj. Vysoký výskyt cyanobakterií v povrchových vodách a mořích je vysvětlován tím, že některé z nich produkují látky inhibující rozvoj jiných mikroorganismů. Některé druhy se rozmnožují i v horkých pramenech poblíž výronů magmatu, jiné jsou schopny růst i v Antarktidě. Snášejí i opakované pomalé zmrazování a tání. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Řasy Řasy jsou součástí fytoplanktonu. Jejich rozvoj, jako je rozvoj vyšší vodní vegetace je projevem tzv. eutofizace vod, tj. přeměny vod chudých na živiny s vyrovnanou bilancí látek na vodu s vysokou produkcí organického materiálu, který představuje sekundární znečištění. (MARENDIAK ET AL., 1987) Mezi
podmínky
existence
řas
v balených vodách jsou řazeny světlo a živiny. Růst ve vodách lze předpokládat především u striktně autotrofních řas. Světlo je velice významný faktor, který ovlivňuje růst řas. Proto se doporučuje skladovat nádoby balených vod ve tmě. Tma zastaví nebo alespoň zpomalí Obr. 9 Řasy narostlé na pevné půdě
růst řas. Na inhibici růstu působí i teplota, proto se doporučuje skladovat v chladnu.
Přímé negativní zdravotní dopady na člověka po vypití balené vody se zvýšeným výskytem řas (vyvolané řasou samotnou nebo produkty jejího metabolismu) nelze předpokládat. Pro různé heterotrofní organismy (bakterie, mikromycety) mohou být zdrojem organické látky, které produkují řasy. Lze tedy předpokládat, že v balené vodě s výskytem řas budou i vyšší hodnoty bakteriálních indikátorů organického znečištění. (PUMANN, 2005) 23
2.5 Mikrobiologie vody Voda může obsahovat dva druhy mikroorganismů: autochtonní a allochtonní. Kdy autochtonní mikroorganismy, které našly ve vodě vhodné podmínky pro svou existenci, se staly přirozenou součástí vody. To znamená, že jsou vlastní danému zdroji. Je těžké je zjistit z důvodů možné kontaminace vody při čerpání. Allochtonní mikroorganismy se do vody dostaly z nejrozmanitějších zdrojů (komunálními odpady, z půdy,
deštěm,
ze
sněhu
i
ze
vzduchu)
a
většinou
čase
po
hynou.
(MARENDIAK ET AL., 1987) Podle MARENDIAK ET AL (1987) mezi autochtonní mikroorganismy ve vodě patří některé fluoreskující tyčinky jako jsou Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas eisenbergii,
Serratia
Achromobacter.
marcescens,
zástupci rodů Micrococcus, Chromobacter,
Z vláknitých železitých bakterií je častá Cladothrix, ze sirných
Sphaerotilus, z plísní příslušníci rodů Mucor, Saprolegnia, Fusarium aquaeductum. Z půdy a vzduchu se do vody dostává velká skupina většinou aerobních a sporulujících bakterií (Bacillus subtilis, Bacillus megatherium, Bacillus cereus a jiné), větší počet kvasinek a další houby. Bakterie z trávicího aparátu zastupují zejména enterobakterie, enterokoky a Clostridium perfringens. Ve vodě bývají příležitostně přítomny i patogenní druhy, zejména Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigela dysenterie, Mycobacterium tuberculosis a jiné. Jejich počet ve vodě nebývá veliký, ve vodě velice rychle hynou. Naproti tomu druhové složení autochtonní mikroflóry zdrojů balených vod ilustruje
práce
STELZE
(1997)
následovně:
Pseudomonas
ssp.,
Alcaligenes,
Acinetobacter, Moraxella, Xanthomonas, Aeromonas, Flexibacter, Chromobacterium, Enterobacter, koryneformní bakterie, Mircocylus, Hyphomicrobium, Plamctomyces, Caulobacter,
Gallionella,
Flavobacterium,
Agrobacterium,
Achromobacter,
Clostridium,
Micrococus,
Cytophaga,
Arthrobacter,
Nocardia,
Bacillus
ssp.,
aktinomycety, grampozitivní neidentifikované tyčinky a koky a gramnegativní bakterie. Aktinomycety jsou běžnou součástí mikroflóry vody, podílí se na rozkladu organických zbytků. Nejčastější jsou druhy rodu Streptomyces. Z mikromycet žijí ve vodách především vodní houby z tříd Oomycetes, Chytridiomycetes a Zygomycetes. Druhotně se pak dostávají do vody zástupci Ascomycetes a Deuteromycetes. (ŠROUBKOVÁ, 1991)
24
Pouze z vody byly izolovány tyto bakterie z čeledi Enterobactericeae: Buttiauxella agrestis, Budvicia aguatica, Pragia fontium, Rahnella aguatilis, Serratia fonticola (VEGER, BAUDIŠOVÁ 1996). Allochtonní mikroflóra ve vztahu k podzemní vodě zahrnuje všechny ostatní bakterie mimo původní, ve zdroji přítomné. Ty se dostanou do balené vody při čerpání, povolených úpravách vody, stáčení, popř. skladování a po čase hynou. Jedná se tedy o kontaminaci, která je již z hygienického hlediska závažnější než autochtonní mikroorganismy. Zahrnuje zástupce z čeledi Enterobacteriaceae, do které patří hlavně střevní bakterie. Dále enterokoky, stafylokoky, mykobakterie, legionely, další druhy bacilů a pseudomonád, aeromonád, klostridií, event. i Campylobacter a další možné hygienicky závažné kontaminanty. Při kontrole a sledování balených vod řada autorů prokázala přítomnost jak indikátorových bakterií mezi které patří: koliformní bakterie, Escherichia coli, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa a obecné indikátory kontaminace (kolonie při 22 °C a 36 °C), tak i přítomnost patogenů. (ŠAŠEK, 2001) STELZ (1997) uvádí, že při kontrole balených minerálních vod v SRN izolovali v 25 – 40 % případů stafylokoky a 35 % z nich byl Staphylococcus aureus. Zdravotní nebezpečí vzniká při jejich pomnožení a tvorbě toxinů v případě, že tuto vodu použijeme k přípravě např. kojenecké či jiné stravy, k mytí a oplachu kontaktních čoček, k přípravě medikamentů, kosmetických přípravků apod.. Podle ROSENBERGA (2003) jsou ve zdrojích vod nalézány Burkholderia ceparia a Stenotrophomonas maltophilia, stejně jako další pseudomonády, které způsobují nozokomiální nebo druhotné infekce. Mají schopnost okamžitého rozvoje z organické hmoty, které se vyluhuje např. z víčka. Podobné vlastnosti má i Acinetobacter ssp., který je také běžně izolován ze zdrojů vod. Při úpravách balené pramenité a přírodní minerální vody lze používat pouze postupy a technologie, které vymezuje příslušná vyhláška. Většinou se jedná o fyzikální, výjimečně chemické postupy. K zabezpečení biologické a mikrobiologické stability nelze užívat chlóru ani jeho sloučenin. V průběhu stáčení balených vod lze použít pouze stabilizaci oxidem uhličitým, vody nestabilizované představují totiž živý systém, který není konstantní v čase a mění se i denzita mikroorganismů. Mikrobiologická nezávadnost balené i nebalené pitné vody představuje základní předpoklad jejího použití pro lidskou spotřebu.
25
2.6 Přehled balených vod a jejich označování Na našem i zahraničním trhu je velká nabídka produktů a proto je velice důležité umět je od sebe vzájemně odlišit. Liší se nejen kvalitou, ale i způsobem použití.
Kojenecká voda – výrobek z kvalitní vody z chráněného podzemního zdroje, která nesmí být upravována žádným způsobem, s výjimkou ozařování UV zářením. Tato voda je vhodná pro přípravu kojenecké stravy a k trvalému přímému požívání všemi skupinami obyvatel. Nelze do ní přidávat jiné látky s výjimkou oxidu uhličitého. V případě sycení oxidem uhličitým nesmí být hodnota pH nižší než 5. Na obalu určeném pro spotřebitele musí být kromě údajů stanovených zákonem o potravinách uvedeno: „kojenecná voda“, charakterizace složení balené kojenecké vody udávající nejméně obsah rozpuštěných pevných látek, vápníku, hořčíku, sodíku, draslíku, dusičnanů, síranů, chloridů, fluoridů, hydrogenuhličitanů, s označením laboratoře a data analýzy (ne starší 3 let). Pokud je voda sycena oxidem uhličitým, je nutné na etiketě označit „kojenecká voda sycená“ s uvedením obsahu oxidu uhličitého v g/l a upozornění o odstranění oxidu uhličitého varem. (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.) Zatímco před rokem 2001 mohli výrobci uvádět, že výrobek byl schválen hlavním hygienikem, resp. Ministerstvem zdravotnictví ČR (toto schválení bylo tehdy podle zákona povinné a samotnému schválení předcházelo posouzení dostupné dokumentace), od roku 2001 již žádné takové schvalování neprobíhá a výrobce uvádí výrobek na trh (pokud odpovídá platným předpisům) na základě vlastního uvážení a rozhodnutí. (KOŽÍŠEK, 2005) Platí pro ni i přísnější požadavky co se týká mikrobiologických ukazatelů a to v počtu KTJ při 22 °C a KTJ při 36 °C (viz Tab. 2) a dále např. obsah dusičnanů (NMH 10 mg/l), dusitany (NMH 0,02 mg/l), rozpuštěné látky (MH 500 mg/l) atd.. Na etiketě musí být uvedena lokalita, zdroj vody a způsob skladování ve znění „Uchovávejte v chladu a chraňte před přímým slunečním světlem“. Kojenecká voda je druh, který není regulován předpisy EU. To znamená, že kritéria, limity a podmínky označování jsou specifické a platné pouze pro ČR (HAVLÍK, 2005).
Pramenitá voda – výrobek z kvalitní vody z chráněného podzemního zdroje, která může být upravována pouze filtrací, dekantací nebo pomocí vzduchu obohaceného
26
ozónem. Tato voda je vhodná k trvalému přímému požívání dětmi i dospělými. (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.) Od kojenecké vody se odlišuje i trochu mírnějšími požadavky např. na obsah dusičnanů (NMH 25 mg/l), rozpuštěné látky (MH 1g/l). Pokud je přidán oxid uhličitý musí být označeno „pramenitá voda sycená“ a obsah v g/l (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.). Na etiketě by mělo být kromě požadavků stanovených zákonem o potravinách uvedeno: „pramenitá voda“, provedené úpravy, lokalita, zdroj a způsob uchovávání. (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.) Když pramenitá voda splňuje požadavky shodné s kritérii na kojeneckou vodu, může být uvedeno „vhodná pro příprava kojenecké stravy“. V případě že je tato voda sycena oxidem uhličitým na hodnotu vyšší než 0,5 g/l, musí být na obalu pro spotřebitele upozornění na odstranění oxidu uhličitého varem, pokud je voda použita pro kojence.
Přírodní minerální voda – výrobek z přírodní minerální vody získané ze zdroje přírodní minerální vody, o kterém bylo vydáno osvědčení, popř. certifikát podle zvláštního právního předpisu (zákon č. 164/2001 Sb., o přírodních léčivých zdrojích, zdrojích přírodních minerálních vod, přírodních léčebných lázních a lázeňských místech ve znění pozdějších novel) nebo ze zdrojů uznaných odpovědným orgánem některého členského státu ES. (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.) Rozdíl od přírodní léčivé vody je v tom, že přírodní minerální voda má mít fyziologické účinky (voda obsahuje přirozeně nějaký prvek, který organismus potřebuje ke svému zdravému vývoji) a ne léčivé (FOLTINOVÁ, JEŽKOVÁ, 2004). Jsou povoleny úpravy filtrací, dekantací nebo pomocí vzduchu obohaceného ozónem. Použitím zmíněných úprav nebo přidáním oxidu uhličitého nesmí dojít ke změně skladby základních složek přírodní minerální vody, které ji propůjčují její vlastnosti. Z hlediska obsahu oxidu uhličitého je přírodní minerální voda rozdělena do několika kategorií: přírodní minerální voda přirozeně sycená – obohacená – sycená – dekarbonovaná - nesycená. Na obalu by mělo být označeno zařazení dle obsahu oxidu uhličitého a jeho obsah v g/l, údaj o analytickém složení s označením laboratoře, způsob proběhlé úpravy, doplňující označení podle přílohy č. 6 vyhlášky č. 404/2006 Sb., pokud tyto podmínky voda splňuje, dále lokalita, zdroj a způsob skladování. 27
Pitná voda – výrobek splňující požadavky na pitnou vodu podle vyhlášky č. 293/2006 Sb., kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody. Tuto vodu lze získávat z jakéhokoli vodárenského zdroje, upravovat ji stejně jako vodovodní vodu a rovněž požadavky na jakost jsou shodné s požadavky na vodovodní vodu. (KOŽÍŠEK, 2005a) Na spotřebitelském balení by mělo být označeno: „pitná voda“, obsah oxidu uhličitého v g/l pokud je voda sycená a způsob skladování. Pokud voda splňuje požadavky plynoucí z přílohy č. 7 vyhlášky č. 404/2006 Sb. lze je na etiketě uvést.
Sodová voda (VYHLÁŠKA
Č.
289/2004 Sb.) – nápoj vyrobený z pitné vody
a oxidu uhličitého, u kterého obsah oxidu uhličitého činí nejméně 4 g/l.
Přírodní léčivá voda – jedná se o balenou vodu z přírodních léčivých zdrojů. Nevztahuje se na ni vyhláška č. 404/2006 Sb.. Požadavky na jakost nejsou nikde stanoveny (existují jen požadavky na mikrobiologickou jakost zdrojů těchto vod). Výrobce nemusí povinně na etiketě uvádět návod k použití (indikace, doporučené množství a doba konzumace). Pokud už výrobce na etiketě jakékoli informace o léčivých vlastnostech a užívání této vody uvede, obsah této informace závisí čistě na jeho libovůli, protože nepodléhá žádnému nezávislému posouzení a schválení. (KOŽÍŠEK, 2005a)
Jiné druhy vod – na trhu jsou k dostání i další druhy vod, např. elektrickým proudem aktivovaná (tzv. mrtvá, živá) voda, destilovaná nebo deionizovaná voda atd. Tyto druhy vod však nemají charakter pitné vody, a proto nejsou určeny pro dlouhodobé užívání. Na trhu lze také dostat tzv. mineralizované vody, které jsou vyrobeny z pitné vody a obohaceny umělými minerály jako např. draslíkem, sodíkem, vápníkem a hořčík. Tyto prvky lze do pitné balené vody přidávat v podobě, kterou udává příloha č. 7 vyhlášky č. 404/2006 Sb., např. draslík – KHCO3, sodík – NaCl, vápník – CaCO3 a hořčík – MgCO3. Na obalu určeném pro spotřebitele musí být uveden výčet doplněných látek a jejich obsah ve vodě po doplnění a slovní označení „uměle doplněno minerálními látkami – mineralizovaná pitná voda“ (VYHLÁŠKA Č. 404/2006 Sb.).
28
Mezi balené vody nelze počítat limonády ani ochucené minerálky. Ty tvoří zcela odlišnou skupinu, která patří mezi nealkoholické nápoje. Na rozdíl od balených vod se do nich mohou přidávat sladidla, aromata a konzervační látky. Přidávat lze i různé potravní doplňky včetně vitamínů. (VEČERKOVÁ, 2005) Pro úplnost je nutné zmínit i z hlediska distribuce specifické druhy balených vod. Ve vratných barelech (19 l) je distribuována voda pro tzv. vodní ochlazovače (watercoolery), což jsou dávkovací zařízení s funkcí chladící a ohřívací, umísťované do domácností nebo úřadů. V barelech lze zakoupit i minerální vodu ochucenou, ovšem tato varianta má hnedka několik omezení. Nelze ji použít pro přípravu teplých nápojů a pokrmů, čaje a kávy. Při změně příchutě je vhodné nejprve přístroj propláchnout jedním barelem vody, aby nedošlo ke smísení chutí. Nakonec lze watercooler i poškodit pokud by se nevypnulo ohřívání, vytvořil by se povlak, které se velmi těžko odstraňuje. (ANONYM, 2006) Na pomezí mezi veřejným zásobováním vodou a balenými vodami jsou pak tzv. výdejní automaty, které již několik let fungují asi v 15 městech. Principem je výdejní automat s nádrží, plněný z cisterny vodou z kvalitního podzemního zdroje, umístěný na veřejném prostranství a vybavený mincovním dávkovačem, ke kterému si lidé chodí s vlastními láhvemi pro vodu. (KOŽÍŠEK, 2001)
2.7 Rizika kontaminace a kontrolní činnost Balené vody jsou potravinou, jejíž spotřeba stoupá, mají vyšší kvalitu než pitná voda z hromadného zásobování a široké využití. Všechny tyto faktory včetně epidemiologických aspektů (voda jako vehikulum přenosu střevních infekčních onemocnění) vedly postupně k zpřísnění kontroly kvality balených vod. Zdravotní rizika představuje především výskyt allochtonních mikroorganismů v balené vodě (střevní patogeny jako Campylobacter, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia, Pseudomonas nebo viry). Vysoké koncentrace saprofytní autochtonní mikroflóry dokládají především nevhodné či nedokonalé výrobní postupy či nízkou úroveň hygienického zabezpečení výroby, maskují přítomnost hygienicky významných mikroorganismů a mohou rušit jejich stanovení. (PEČKOVÁ, 1999) Zaměření se na biologickou stabilitu či nestabilitu vody, je hlavní, i když ne jedinou příčinnou pomnožování mikroorganismů při skladování balených vod.
29
Biologická nestabilita může být vedle průniku bakterií způsobena průnikem organické hmoty do zdroje, úpravou balené vody nebo kvalitou obalů. Rozvoj mikroorganismů je dám komplexem faktorů – koncentrací biodegradabilní organické hmoty, obsahem anorganických živin, koncentrací reziduálního dezinfekčního prostředku, teplotou, materiálem obalů, pH, redox potenciálem i velikostí a složením počátečního inokula mikroorganismů, event. složením přítomných organických látek ve zdroji i ve vodě po úpravě a jejich využitelnost přítomnou mikroflórou. (ŠAŠEK, 2005) V zájmu snížení zdravotních rizik pocházejících z potravin a tedy i balených vod se celosvětově zavedl systém Good manufacturing practices (GMP) či Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP). Kontrolní systémy si kladou za cíl zajistit co nejvyšší možné míře zdravotní nezávadnost potravin. Úkolem státu je především kontrolní činnost. Státní orgány dozoru pomocí inspektorů zjišťují, zda výrobní společnosti mají systém HACCP správně vypracovaný, zavedený a fungující. (PEČKOVÁ, 1999) Základem výroby kvalitních balených vod je jakostní zdroj stálých vlastností. Zdroje balených vod jsou charakterizovány především původem z čistého přírodního prostředí, mikrobiální čistotou a individuální vlastností. Komplex specifických vlastností tvoří přirozený režim zdroje. Některé vlastnosti mohou však působit jako rizikové faktory. Za vnitřní rizikové zdroje můžeme považovat stabilní vlastnosti jako je teplota, obsah CO2 apod.. Za vnější rizikové faktory můžeme označit ty parametry, které lze zčásti nebo zcela ovlivnit. Jako je umístění jímacích objektů (městská zástavba, zemědělská činnost) nebo pohyb odpadních vod v blízkosti jímacího prostoru. (PEČKOVÁ, 1999) Vlastní zdroje balené vody jsou obvykle kvalitní, problémem však mohou být všechny následující kroky výrobního procesu, spojené se sekundární kontaminací vody i celého výrobního zařízení. Tato sekundární kontaminace představuje vnos nejen mikroorganismů, ale i stop organických látek, jejíchž charakter lze těžko specifikovat, hlavně s ohledem na jejich možnou využitelnost bakteriemi. Je těžké určit druhové zastoupení, které je zodpovědné za schopnost či neschopnost dalšího využití vnesené organické hmoty sekundární kontaminací. Záleží pak na tom zda se ve vodě vyskytují právě ty druhy bakterií, které jsou schopny utilizovat přítomný substrát. Není-li tomu tak, pak je tato hmota nevyužitelná a k pomnožení mikrobů nedochází. (ŠAŠEK, 2005)
30
Podle ROSENBERGA (2003) je každá přítomná bakterie přichycená na stěnách a dně láhve se násobí přítomným organickým materiálem. Toto může kolísat v závislosti na značce a zdroji, ačkoli ve většině případech je úroveň organického materiálu nízká. Dalším logickým krokem je úprava vody před vlastním plněním do obalů. Ta by měla zajistit minimální počty mikroorganismů a minimální obsah lehce využitelné organické hmoty. Ta by pak mohla být zdrojem problémů, např. pomnožování mikrobů ve vodě krátce po naplnění do obalů (řádově dny) při skladování do doby spotřeby. Nutným předpokladem kvality balené vody je minimální denzita mikrobů ve všech rozvodech plnící linky, zejména od úpravy po plnící trysky. To předpokládá pravidelnou, účinnou sanitaci linky. Jinak může docházet k tvorbě ložisek či souvislejších biofilmů na vnitřních površích rozvodů vody a uvolňování mikroorganismů do volné vody při stáčení. (ŠAŠEK, 2005) Podobně záleží i na mikrobiologické čistotě obalů a jejich uzávěrů a na čistotě ovzduší ve výrobní hale a zejména v prostoru kolem plnící linky. Čistota vzduchu bude kolísat v důsledku různých manipulací ve vnitřních prostorech výroby a povětrnostní situace kolem výrobní haly. Čistotu vzduchu můžeme zabezpečit pomocí germicidních lamp, sanitací zařízení nebo úpravou režimu činností v provoze. Jako nejvhodnější pro mikrobiologickou čistotu obalů a uzávěrů je technologie výroby přímo sterilních obalů jdoucích na linku. (ŠAŠEK, 2005) K další
kontaminaci
balených
vod
může
dojít
v průběhu
skladování
v polymerním obalu. Obalové materiály na bázi polymerů nepředstavují pro transport látek absolutní
bariéru, jako tomu je například u skla nebo kovů. DOBIÁŠ (1999)
a ROSENBERG (2003) se shodují na tom, že všechny polymerní obalové materiály používané v obalové technice při balení vody mají v mnoha případech nezanedbatelnou propustnost pro vodní páru, permanetní plyny, ale i páry organických látek. Důsledkem propustnosti obalu tedy může být kontaminace balené vody látkami z okolí. Dalším typem kontaminace balené vody v průběhu skladování je uvolňování složek obalového materiálu do obsahu v důsledku vzájemné interakce vody a obalu. Pro sdílení hmoty v polymerním obalu a obsahem se využívá označení migrace. Ta je založena na difúzi, i když v praxi se na jejím průběhu mohou podílet i jiné děje, např. sorpce. Migrace je vždy proces dvoustranný, tj. složky obalů přecházejí do obalového produktu a současně látky baleného produktu pronikají do obalu a ovlivňují jeho
31
vlastnosti. To je také příčinnou obtížného modelování průběhu migrace pro většinu reálných systémů. (DOBIÁŠ, 1999) Pro praxi je významné, že z polymerních obalů jsou vymývány především nízkomolekulární složky. Proto jsou v technologii výroby plastových obalů využívány aditivní látky, které mají vyšší molekulovou hmotnost a u nichž je migrace z obalů výrazně pomalejší. Z uvedeného vyplývá, že voda balená v polymerním obalu bude vždy kontaminována složkami obalu, jejichž celkové množství však bude závislé především na typu materiálu, dále jeho kvalitě a tloušťce stěny obalu. (DOBIÁŠ, 1999)
2.8 Watercoolery Co to je watercooler? Watercooler – česky doslova „ochlazovač vody“– je zařízení pro čepování balené vody z velkoobjemových vratných plastových lahví (barelů). Voda může být podle typu přístroje ochlazována, ohřívána nebo čepována při pokojové teplotě. Podobné zařízení může být napojeno také přímo na vodovod, kdy pak
vodu
obvykle
navíc
upravuje
a
pak
či
ohřívá.
přístroj
vůbec
chladí
(CHLUPÁČOVÁ, KOŽÍŠEK, 2004) Jak funguje? na
Barel
narážecí
je
nasazen
a
dochází
trn
k naplnění vyrovnávací nádržky, ze
které
vedou
dva
otvory
do nádržek na teplou a studenou vodu.
V těchto
nádržkách
dochází k ohřátí pomocí topné spirály nebo naopak ke chlazení pomocí Z nádržek
chladicího
agregátu.
vedou
trubičky
k výpustním kohoutům, kde se
Obr. 10 Schéma watercooleru
načepuje
studená
nebo
teplá
voda. Na zádi přístroje jsou dva výpustní kohouty, kterými se vypustí všechna voda obsažená v přístroji. Watercooler musí splňovat určité hygienické a bezpečnostní požadavky. Nesmí být zdrojem mikrobiálního nebo jiného znečištění a při jeho používání nesmí docházet
32
k nežádoucím změnám ve složení čepované vody a k ovlivnění jejích senzorických vlastností. (CHLUPÁČOVÁ, KOŽÍŠEK, 2004) Distributor musí mít doklad o tom, že zařízení splňuje hygienické požadavky definované zákonem č. 258/2000 Sb., o ochraně veřejného zdraví ve znění pozdějších novel, konkrétně pak vyhláškou č. 38/2001 Sb., o hygienických požadavcích na výrobky určené pro styk s potravinami a pokrmy ve znění pozdějších novel (do roku 2004 mohla být tato zařízení posouzena rovněž podle vyhlášky č. 37/2001 Sb., o hygienických požadavcích pro výrobky přicházející do přímého styku s pitnou vodou a na úpravu vody). Zařízení nesmí uvolňovat své složky do potraviny (vody) v množství, které by mohlo ohrozit lidské zdraví. Dále tyto výrobky musí splňovat požadavky na bezpečné výrobky podle zákona č. 102/2001 Sb., o obecné bezpečnosti výrobků ve znění pozdějších novel a to po celou dobu svého setrvání na trhu. (CHLUPÁČOVÁ, 2005) Aby spotřebitel měl kvalitní vodu podle svých požadavků, neměl by zapomínat na řadu faktorů, které mohou ovlivnit kvalitu čepované vody. Jedná zejména o kvalitu dodávané balené vody, kvalitu a druh použitých konstrukčních materiálů přístroje, dále na čistitelnosti, umístění, správném návodu k použití a způsobu údržby. V souvislosti s problematikou watercoolerů je nutno především připomenout riziko tvorby biofilmu, který se může vytvořit na všech plochách, které jsou ve styku s vodou. Obecně je biofilm definován jako společenství mikroorganismů a jejich extracelulárních produktů vázaných k pevnému povrchu, často se jedná o vysoce organizovanou
uspořádanou
komunitu
složenou
z velkého
počtu
druhů
mikroorganismů. Uvnitř této komunity jsou propojené metabolické aktivity jednotlivých členů. Pokud se biofilm vytvoří, voda v zařízení může mít zatuchlou až plesnivou příchuť, problémy budou i s mikrobiologickou kvalitou. Odstraňování biofilmu představuje problém, neboť použití běžných dezinfekčních prostředků nebývá úspěšné a obvykle dojde pouze k zahubení mikroorganismů na povrchu biofilmu. V podstatě jedinou účinnou metodou k likvidaci biofilmu je mechanické vyčištění, proto je u watercoolerů kladen velký důraz na čistitelnost přístroje a pochopitelně na to, aby se přístroj skutečně pravidelně čistil. (CHLUPÁČOVÁ, KOŽÍŠEK, 2004)
33
Mikroby, které rostou v podobě biofilmu, se vyznačují zvýšenou odolností vůči obranným mechanismům lidského organismu, jakož i zvýšenou odolnost vůči působení antibiotik. (ANOMYM, 2007) Vody nejsou nikdy sterilní a mají vzhledem k různému složení pro bakterie různou „úživnost“ – to znamená, že ve dvou různých vodách uchovávaných za stejných podmínek se mohou bakterie pomnožovat velmi rozdílným způsobem. Proto podle uvedené vyhlášky musí výrobci balených vod v obalech větších než 5 litrů povinně na obalu (etiketě) uvést podmínky uchovávání a dobu spotřeby po otevření obalu (tj. zde po nasazení na watercooler). (CHLUPÁČOVÁ, KOŽÍŠEK, 2004) Dodržování následujících zásad doporučují CHLUPÁČOVÁ, KOŽÍŠEK (2004): Umístit přístroj na čistém a větratelném místě, chráněném před přímým slunečním zářením, kde nejsou přítomny těkavé organické látky (benzinové pumpy, tiskárny, práce s rozpouštědly), které mohou přispět k vytváření biofilmu nebo chuťově či pachově znehodnotit vodu. Voda by měla být spotřebována do 3 dnů od nasazení barelu na přístroj. Zařízení je třeba v intervalech doporučených výrobcem pravidelně čistit: nejdéle po třech měsících nebo dříve podle pokynu výrobce provést celkovou sanitaci zařízení. Sanitace představuje demontáž těch částí přístroje, které přicházejí do styku s dodávanou vodou, jejich mechanické vyčištění kartáčkem a detergentním přípravkem, ošetření a proplach vhodným dezinfekčním přípravkem. Následuje proplach vodou, a to minimálně v množství trojnásobného obsahu vnitřních nádob tak, aby došlo k odstranění zbytků dezinfekčního přípravku. Pravidelně, nejméně 1x ročně, ověřit kvalitu vody vstupující do přístroje a kvalitu vody vystupující z přístroje mikrobiologickým rozborem. V případě výskytu senzorických změn nebo existuje-li podezření, že byl přístroj kontaminován, okamžitě jej vyřadit z provozu, zajistit rozbor vody a provést celkovou sanitaci přístroje. Je nutné podotknout, že pokud voda projde watercoolerem, tak za ni výrobce či distributor neruší (pokud to není ošetřeno smluvním dodavatelských vztahem), zodpovědnost leží na spotřebiteli (v případě domácností) resp. provozovatel či uživatel objektu (v případě, že je voda nabízena zaměstnancům nebo veřejnosti) a nevztahuje se na ani platná legislativa pro balené vody. Pokud je přes přístroj čepovaná balená pitná voda musí odpovídat všem jakostním požadavkům podle vyhlášky č. 187/2005 Sb. 34
pro pitnou vodu. Nicméně je jisté, že voda čepovaná přes watercooler musí být pro spotřebitele bezpečná a provozovatel watercooleru nemůže veřejnosti nabízet vodu, která vykazuje známky mikrobiologické závadnosti. (CHLUPÁČOVÁ, 2005)
35
3. CÍL PRÁCE Cílem předložené diplomové práce bylo charakterizovat mikroflóru balených vod a vliv různých způsobů skladování na její změnu. Dále zhodnotit kvalitu vody po průchodu watercoolerem a vliv způsobu sanitace na mikrobiální kvalitu čepované vody. K hodnocení
byly
použity
indikátorové
mikroorganismy.
36
i
vybrané
neindikátorové
4. MATERIÁL A METODY 4.1 Materiál K analýzám byly použity barely pramenité balené vody z oblasti Šumavy s názvem Šumavský pramen. Výrobcem je firma Šumavský pramen a.s., provoz Bližná. Jednalo se o 18,9 litrové vratné barely. Tyto produkty jsou dostupné přímo u výrobce nebo přes distributora (v tomto případě Drinex s.r.o., Brno-Chrlice). Jednotlivé barely měly označeno jak datum výroby tak i datum spotřeby (výrobce udává 3 měsíční lhůtu na spotřebu, pokud je barel uzavřen). Na obalu byly uvedeny všechny údaje, které požaduje vyhláška č. 404/2006 Sb., navíc byl označen i výtah z chemické analýzy. Experimentální práce byly zaměřeny na: 4.1.1 Vliv podmínek skladování barelů na mikrobiologické změny vody Barely ze stejné šarže s datem výroby 29.5.2007 a spotřeby 27.8.2007 byly skladovány v počtu 6 kusů následovně: „Chlad-temno“ - barely byly uloženy v klimatizované tmavé místnosti s teplotou 19 °C. „Chlad-světlo“ se
–
jednalo
klimatizovanou
místnost
s teplotou 18 °C a režimem 12 hodin světlo a 12 hodin tma. „Teplo-světlo“ umístěny
-
barely
v laboratoři,
byly teplota
byla 22 °C ± 2 °C. „Teplo-temno“ - barely byly opět umístěny
Obr. 11 Vzhled použitých watercoolerů
v tmavé
s teplotou 22 °C ± 2 °C
37
místnosti
4.1.2 Vliv watercoolerů na mikrobiologickou kvalitu K testování
watercoolerů
(dále WTC) byly použity celkem 4 nové přístroje. Jednalo se o dva různé typy. Výrobní označení je typ 16L a typ 16 TD (viz Obr. 11). Před u
zahájením všech
pokusů
přístrojů
byla
provedena
sanitace (viz 4.2.3). WTC byly Obr. 12 Umístění watercoolerů v„nevhodném“ prostředí
umístěny po dvou (od každého po 1 ks) buď do „vhodného
(relativně čistého) prostředí“ (laboratoř s teplotou 22 °C ± 2 °C a přístupem slunečního světla) nebo do „nevhodného“ prostředí (prašná automobilová dílna Ústavu techniky a automobilové dopravy MZLU u radiátoru). (viz Obr. 12)
4.2 Metody 4.2.1 Skladovací pokus Odběry vzorků pro mikrobiologické analýzy byly prováděny zhruba v měsíčních intervalech od 5.6.2007 do 17.12.2007 (viz Tab. 3). Tab. 3 Datum mikrobiologických analýz v průběhu celého skladovacího pokusu Délka Kontrolní skladování barel Datum analýzy 5.6. Rozbory ze dna
Do záruční doby
10.7.
Po záruční době
14.8.
18.9.
23.10.
27.11.
17.12.
21.8.
19.9.
24.10.
28.11.
17.12.
4.2.2 Voda čepovaná přes WTC Odběry vzorků vody pro mikrobiologický rozbor byly prováděny v týdenních intervalech (viz Tab.4). Na začátku pokusu byla u přístrojů provedená řádná sanitace. Příslušný sanitační roztok (Dosyl-3-plus) byl naředěn na patřičnou koncentraci a nalit do přístrojů, pomocí otevřených kohoutů bylo ověřeno zda jsou přístroje naplněny. Roztok se nechal působit asi tři hodiny. Následně byly přístroje vypuštěny a WTC byly několikrát propláchnuty pitnou vodou a následně vodou destilovanou. Na takto
38
připravené přístroje byly nasazeny barely. V Tab. 4 je uvedeno datum nasazení barelů, datum jejich výroby, spotřeby a stáří barelů ve dnech. Rozbory probíhaly od 2.10.2007 do 18.12.2007. Na konci pokusu byl proveden stěr z vnitřního zásobníku na vodu a to 18.12.2007, ale pouze u přístrojů typu 16TD. Tab. 4 Datum mikrobiologického rozboru z vod prošlých přes WTC Datum odběru
Datum nasazení
Výroba
Spotřeba
Stáří barelu (dny)
2.10. 2007
27.9. 2007
4.9. 2007
3.12. 2007
23
9.10. 2007
5.10. 2007
27.9. 2007
26.12. 2007
8
16.10. 2007
12.10. 2007
26.9. 2007
25.12. 2007
16
24.10. 2007
19.10. 2007
10.10. 2007
8.1. 2008
9
30.10. 2007
26.10. 2007
10.10. 2007
8.1. 2008
16
-------
2.11. 2007
30.10. 2007
28.1. 2008
3
13.11. 2007
9.11. 2007
30.10. 2007
28.1. 2008
10
20.11. 2007
16.11. 2007
2.11. 2007
31.1. 2008
14
27.11. 2007
23.11. 2007
1.11. 2007
30.1. 2008
22
4.12. 2007
30.11. 2007
25.10. 2007
23.1. 2008
36
11.12. 2007
7.12. 2007
18.9. 2007
17.12. 2007
79
18.12. 2007
14.12. 2007
6.12. 2007
5.3. 2008
8
4.2.3 Účinnost sanitace a sanitačních prostředků Byla zkoušena na přístrojích po jejich asi tří měsíčním běžném používání. Sanitace byla provedena dvěma různými dezinfekčními prostředky, které jsou povoleny v potravinářství. Jejich popis uvádí Tab. 5. Vyčištění WTC bylo provedeno podle všeobecného doporučení, které se skládá z vyjmutí těch součástí přístroje, které přicházejí do styku s vodou (zásobní nádržka, kohouty a narážecí trn) a jejich důkladné mechanické vyčištění kartáčkem s detergentním přípravkem, následný oplach pitnou vodou a uložení do dezinfekčního roztoku. Dostupná místa na samotném přístroji byla též mechanicky vyčištěna a WTC se naplnil dezinfekčním roztokem a následně se roztok v přístroji na několik minut ohřál. Takto se nechal přístroj i vyjmuté součásti do druhého dne. Poté byl všechen dezinfekční roztok vypuštěn a přístroj se několikrát propláchnul pitnou vodou, následně i jeho součásti. Na takto vyčištěný WTC byl
39
nasazen nový barel a byla provedena analýza barelu před vstupem do WTC, po jeho průchodu a analýza pitné vody, aby došlo k vyloučení možné kontaminace. Tab. 5 Popis použitých sanitačních přípravků Název
DOSYL-3-plus
DILAC D
Skupina
4 - dezinfekce v potravinářství
4 - dezinfekce v potravinářství
Držitel
Johnson Diversey Česká
Johnson Diversey Česká
Rozhodnutí
republika, s.r.o., K hájům 1233/2 republika, s.r.o., K hájům 1233/2,
(DR)
155 00 Praha 5 - Stodůlky,
155 00 Praha 5 - Stodůlky,
Česká republika.
Česká republika.
Diversey Lever Divízió,
Johnson Diversey Magyarorszag
Maďarsko.
Kft., Hórváth M. u.2, 1158
Výrobce (V)
Budapest, Maďarsko, Cheport s.r.o., 763 12 Vizovice, Česká republika. Složení (S)
Popis
Kyselina fosforečná 15 -<30 %,
Kyselina fosforečná 45,0 %,
kyselina sírová 5 -<15%,
kyselina glykolová 2,0 %,
peroxid vodíku 1 -<5%,
kyselina monobromoctová 0,2 %,
neionické tenzidy 1-<5%
neionické tenzidy.
Nažloutlá kapalina.
Čirá, bezbarvá kapalina.
Koncentrovaný kyselý čistící a
Silně kyselý čistící a dezinfekční
dezinfekční prostředek pro
prostředek určený pro
zemědělskou prvovýrobu mléka
odstraňování úporných nečistot a
a potravinářský průmysl.
usazenin z tanků, nádrží a
přípravku (PP) Užití (U)
potrubních systémů v mlékárenském průmyslu. Způsob Použití Koncentrace 0,4-1 % roztok dle
Dle přiloženého návodu k použití,
(ZP)
stupně znečištění, teplota
v doporučených koncentracích:
50 - 80 °C, doba působení
0,4 -1,0 %, při teplotě 50-75°C,
15 - 20 minut. Optimální použití 5-30 minut. DILAC D má a dávkování stanoví na místě
baktericidní a fungicidní účinek
odborný poradce Diversey
v koncentraci 0,4 - 1,0 %
Lever.
za 30 min. při teplotě nad 50°C.
40
Optimální použití a dávkování stanoví na místě poradce Johnson Diversey. Bezpečnost
Bezpečnostní opatření pro práci
Bezpečnostní opatření pro práci
Práce (BP)
jsou uvedeny na etiketě
jsou uvedeny na etiketě.
schválené MZ ČR. Způsob
Skladovat v původních obalech
skladování (ZS) v chladu, odděleně od alkálií.
Skladujte v původních obalech, odděleně od silných alkálií, mimo extrémní teploty.
Doba
6 měsíců.
24 měsíců.
použitelnosti (PE)
Do analýzy skladovacího pokusu bylo zahrnuto stanovení KTJ při 36 °C, KTJ při 22 °C, koliformní bakterie, enterokoky, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, dále pak počty oligotrofních mikroorganismů, počet plísní a kvasinek. U vod čepovaných přes WTC, stěru ze dna zásobní nádržky a u přístrojů, které byly vysanitovány, byly sledovány pouze KTJ při 22 °C a KTJ při 36 °C.
4.3 Příprava mikrobiologického rozboru 4.3.1 Sterilizace laboratorního skla Ke sterilizaci byl použit horkovzdušný sterilizátor. Petriho misky o průměru 9 cm byly sterilizovány uzavřené, pipety s vatou ve svém horním konci a zabalené do alobalu. Na odběr vzorků vody byly použity Erlenmayerovy baňky o objemu 100 ml a kádinky o objemu 400 ml, vše se sterilovalo dokonale uzavřené alobalem. Na stěr byl použit alobal s vystřiženým okénkem o ploše 4 cm2, který byl sterilizován v Petriho misce, dále stěrová tyčinka, v podobě vaty natočené na špejli, byla vysterilizována v uzavřené zkumavce. Režim sterilizace skla byl při teplotě 160 °C po dobu 60 minut. Zkumavky s 9 ml vody byly autoklávovány, při 120 °C po dobu 20 minut.
41
4.3.2 Příprava kultivačních půd Příprava média pro stanovení kultivovatelných mikroorganismů (KTJ při 22 °C a při 36 °C) Pro stanovení KTJ při 22 °C a při 36 °C byl použit živný agar s tryptonem a kvasničným extraktem, který je předepsán normou ČSN EN ISO 6222 – Jakost vod – stanovení kultivovatelných mikroorganismů. Médium se skládá z tryptonu (6 g/l), dehydratovaného kvasničného extraktu (3 g/l) a agaru (15 g/l), vyráběný firmou Scharlau Microbiology. Na vlastní přípravu média se navážilo 24 g sušené živné půdy a 10 g peptonu, všechno se rozpustilo ve 1000 ml destilované vody. Poté byla půda rozlita do 500 ml Erlenmayerových baněk, uzavřené alobalem se autoklávovaly při 120 °C po dobu 20 minut. Pro vlastní použití bylo médium ochlazeno na teplotu 45 °C ± 5 °C.
Příprava média pro stanovení koliformních mikroorganismů Pro stanovení koliformních mikroorganismů byl použit Endo-agar. Médium se skládá z masového extraktu (8,55 g/l), peptonu z hovězího masa (10 g/l), laktózy (10 g/l), chloridu sodného (5 g/l), siřičitanu sodného bezvodého (1,2 g/l), bazického fuchsinu (0,25 g/l) a agaru (12 g/l), vyráběný firmou AGRO-LA spol. s.r.o.. Vlastní příprava spočívala v tom, že bylo naváženo 47 g smíšené půdy, navážka byla rozpuštěna ve 1000 ml destilované vody. Poté byla půda opět rozlita, autoklávována a ochlazena.
Příprava média na stanovení enterokoků Pro stanovení intestinálních enterokoků byl použit agar Slanetz-Bartley. Půda je složena z tryptonu (20 g/l), kvasničného extraktu (5 g/l), dextrózy (2 g/l), fosforečnanu draselného (4 g/l), azidu sodného (0,4 g/l), TTC (2,3,5 – trifenyltetrazoliumchlorid) a to v množství (0,1 g/l) a agar (12 g/l), vyráběná firmou Scharlau Microbiology. Navážka 43,5 g se rozpustila ve 1000 ml destilované vody, médium se neautoklávuje, bylo rozehřáto ve vodní lázni a ochlazeno. Siřičitany redukující střevní sporulující anaerobní bakterie Pro stanovení klostridií byl použit Trypton sulfite neomycin agar (TSN agar), který vyrábí firma Scharlau Microbiology. Médium má následující složení casein 42
peptone (15 g/l), sulfit sodný (1 g/l), neomycin sulfát (0,05 g/l), polymixin B (0,02 g/l), kvasničný extrakt (10 g), citrát železitý (0,5 g/l) a agar (13,5 g/l). Na vlastní přípravu se navážilo 40 g sušeného média a rozpustilo se v 1000 ml destilované vody, poté se půda autoklávovala a ochladila.
Příprava média pro stanovení Pseudomonas aeruginosa Pro stanovení Pseudomonas aeruginosa bylo použito kultivační dehydratované médium CN selective agar-base for Pseudomonas vyráběný firmou Scharlau Microbiology. Médium se skládá z želatinového peptonu (16 g/l), hydrolyzátu kaseinu (10 g/l), síranu draselného (10 g/l), chloridu hořečnatého (1,4 g/l), a CN suplement – cetiltrimethylamonium bromid (0,2 g/l) a agar (15 g/l). K vlastní přípravě půdy bylo naváženo 52,6 g půdy, navážka byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody a bylo při dáno 10 ml glycerolu. Půda se následně autoklávovala a ochladila.
Příprava média pro stanovení oligotrofních mikroorganismů Pro stanovení oligotrofních mikroorganismů se používá masopeptonový agar, který se skládá z masového peptonu (10 g/l), hovězího extraktu (10 g/l), chloridu sodného (5 g/l) a agaru (15 g/l). Pro vlastní stanovení se používá 100x ředěný agar, takže navážka byla 0,4 g na 1000 ml destilované vody, dále bylo přidáno 20 g agaru na utužení. Půda se autoklávovala a ochladila před vlastním použitím.
Příprava média pro stanovení plísní a kvasinek Pro stanovení plísní a kvasinek byla použit půda glukóza-chloramfenikol, která obsahuje širokospektrální antibiotikum, které potlačuje růst grampozitivních bakterií a tedy plísně a kvasinky mohou růst. Půda se skládá z kvasničného extraktu (5 g/l), glukózy (20 g/l), chloramfenikolu (0,1 g/l) a agaru (15 g/l). Jednotlivé složky byly naváženy a rozpuštěny ve 1000 ml destilované vody. Pak bylo médium autoklávováno a ochlazeno k vlastnímu použití.
43
4.3.3 Způsob odběru vzorků vody Vzorky vod přímo z barelů byly odebrány sterilní pipetou do sterilní Erlenmayerovy baňky, ze které byly následně vyočkovány do příslušně označené a sterilní Petriho misky. Pro analýzy vody ze dna barelu, byl velkoobjemový barel otevřen a pomalu se odlila voda, tak aby nedocházelo k promíchávání obsahu. Voda, která zůstala na dně se důkladně promíchala a odlil se vzorek do sterilní 400 ml kádinky. Při odběru vzorků vod z WTC se prováděly analýzy pouze u studené vody (na výstupu asi 11 °C) a to tak, že před odběrem se odpustila taková část vody, aby došlo k probublání barelu vzduchem, potom se vzorek odebral do 100 ml sterilní Erlenmayerovy baňky. Vzorky se nechaly vytemperovat na laboratorní teplotu a poté byly vyočkovány do označených sterilních Petriho misek. Vzorek vody z vodovodního kohoutku byl odebrán až po odpuštění dostatečného množství vody do 100 ml sterilní Erlenmayerovy baňky, ze které byl vzorek vyočkován na sterilní řádně označené Petriho misky. Stěr ze dna zásobních nádrží WTC se provedl tak, že vysterilizované okénko z alobalu se přiložilo na dno a sterilní stěrka se držela ve vodorovné poloze a otáčela se mezi prsty, poté se provedlo totéž, ale kolmo na předchozí stěr. Stěrka byl odlomena do sterilní zkumavky s 9 ml destilované vody a řádně uzavřena. Před očkováním byla zkumavka důkladně protřepána (asi 10 minut), aby došlo k uvolnění vláken vaty a také mikroorganismů.
4.3.4 Způsob očkování Pro všechna stanovení byla použita metoda přímého výsevu. Jedná se o napipetování 1 ml vzorku neředěného nebo ředěného (pokud bylo třeba) na dno sterilní a řádně označené Petriho misky (kód vzorku a značka mikroorganismu). Ředění spočívá v tom, že z důkladně promíchaného vzorku se odebral 1 ml a převedl se do zkumavky s 9 ml sterilní destilované vody, takto získáme ředění 10-1. Pro přípravu ředění 10-2 se postup opakuje, ale výchozím materiálem je ředění 10-1. Před očkováním příslušného ředění se provedlo promíchá a to několikanásobným nasátím a puštěním vzorku z pipety. Při pipetování vzorku se víčko je lehce nadzvedlo a obsah pipety se nechal samovolně vytéct , tímto je omezena možnost kontaminace z prostředí. Po napipetování vzorku byl do misky nalit příslušný sterilní asi 45 °C teplý agar tak,
44
aby po uzavření misky a následném opatrném a krouživém promíchání se vzorkem tvořil souvislou tenkou vrstvu. To odpovídá objemu asi 10-15 ml agaru. Po promíchání se nechal agar v misce dokonale zatuhnout. Všechna stanovení se prováděla ve třech opakováních. Byla rovněž provedena kontrola agaru, která ukazuje, zda je agar správně připraven a zda při manipulaci nedošlo ke kontaminaci. Usnadňuje nám posléze hodnocení výsledků, aby nedošlo k mylnému odečítání sraženin nebo bublinek (které mohou vzniknout nejčastěji při příliš prudkém promíchávání Petriho misek nebo promíchávání samotného agaru v nádobě ještě před zaléváním vzorku). Kultivace agarových kontrol proběhla stejně jako u ostatních mikroorganismů. V případě, že po kultivaci této kontroly by byl agar zakalený, případně na něm vyrostly jakékoliv kolonie, jednalo by se o agar špatně připravený nebo agar nesterilní, kontaminovaný.
4.3.5 Kultivace a hodnocení mikrobiologických výsledků Kultivovatelné mikroorganismy Kultivace byla provedena na agaru s tryptonem a kvasničním extraktem, kdy misky byly kultivovány v termostatu 37 °C a po dobu 48 hodin (mezofilní) a nebo při teplotě 22 °C po dobu 72 hodin (psychrofilní), po této době byly spočítány veškeré vyrostlé kolonie, u kolonií při 22 °C byla použita zvětšovací lupa. Koliformní bakterie Koliformní bakterie se kultivovaly na Endo-agaru v termostatu 48 hodin při 37 °C, poté se odečítaly veškeré vyrostlé kolonie.
Enterokoky Enterokoky se nechaly kultivovat na agaru Slanetz-Bartley po 48 hodin při 37 °C, počítají se typické kolonie zbarvené celé nebo ve středu červené, kaštanové nebo růžové
45
Pseudomonas aeruginosa Misky byly inkubovány při 37 °C po dobu 48 hodin. Za pozitivní se považují kolonie, které produkují modrozelený pigment.
Siřičitany redukující střevní sporulující anaerobní bakterie
Misky zalité TSN agarem byly kultivovány v anaerobních podmínkách, s pomocí anaerogenu a polyetylenového sáčku v termostatu po dobu 24 hodin při 37 °C. Oligotrofní mikroorganismy Kultivace probíhala 14 dní v termostatu při teplotě 30 °C na 100x zředěném MPA. Následně se, převážně pod lupou, počítaly kolonie. Oligotrofní bakterie tvoří drobné, málo výrazné kolonie bělavé barvy, nebo i větší žluté či růžové. Plísně a kvasinky Kultivace na glukóza - chloramfenikolovém agaru proběhla v termostatu při teplotě 25 °C a po 5-ti dnech se spočítaly narostlé kolonie. 4.3.6 Způsob vyhodnocení výsledků Stanovení byla provedena ve třech opakovácích, ze kterých byl vypočítán aritmetický průměr, pokud narostly kolonie na kontrolních miskách byly zohledněny. Veškeré uváděné údaje jsou prezentovány jako počet kolonie tvořících jednotek (KTJ) v 1 ml vody.
46
5. VÝSLEDKY A DISKUSE K mikrobiologickým analýzách byly použity vzorky vody uložené v různých skladovacích podmínkách odebrané přímo z barelu a jeho dna, dále vzorky vod načepované po projití WTC, vzorky ze stěru ze dna zásobní nádržky a vzorky vody po sanitaci přístroje. Z indikátorových mikroorganismů uvedených ve vyhlášce byly u vzorků vody z barelů a dna stanoveny KTJ při 22 °C, KTJ při 36 °C, koliformní mikroorganismy, enterokoky, siřičitany redukující střevní sporulující anaerobní bakterie (Clostridium) a Pseudomonas aeruginosa. Z mikroorganismů, které nepožaduje vyhláška byly stanoveny oligotrofní mikroorganismy, plísně a kvasinky. U vzorků vod z WTC, stěru ze dna zásobní nádržky a vzorky vody po vyčištění WTC, byly sledovány pouze KTJ při 22 °C a KTJ při 36 °C.
5.1 Vliv podmínek skladování na počty mikroorganismů v balené vodě Pro hodnocení byly použity průměrné hodnoty mikroorganismů stanovené v barelech uložených ve 4 odlišných skladovacích podmínkách a to „chlad-temno“, „chlad-světlo“, „teplo-světlo“ a „teplo-temno“. Základní data, která byla použita k následujícímu hodnocení, jsou uvedena v příloze. Na začátku sledování byl zanalyzován jeden barel šarže použité pro pokus jako tzv. „start“, jeho výsledky uvádí následující Tab. 6. Tab. 6 Výsledky mikrobiologického rozboru barelu na začátku skladovacího pokusu (KTJ/ml) KTJ při 22 °C
122,6
KTJ při 36 °C
2
Koliformní bakterie
0
Enterokoky
0
Pseudomonas aeruginosa
0
Clostridium perfringens
0
Kvasinky a plísně
3,3
Způsob skladování vody ve sledovaných podmínkách, se podle provedených mikrobiologických analýz, projevil následovně:
47
Pokud zhodnotíme počty KTJ při 22 °C při skladování do uplynutí záruční lhůty (tj. do 27.8.2007), jsou nejvhodnější podmínky skladování „chlad-temno“ (134,5 KTJ/ml). Naopak jako nejméně vhodné se jeví „teplo-světlo“ (479,3 KTJ/ml) (Tab. 6). Po prodloužení skladování na dobu 6. měsíců dochází u všech variant nejprve k mírnému poklesu a během 5. měsíce k masivnímu nárůstu mikroorganismů řádově 103 KTJ/ml a poté následuje opětovný pokles denzit. (viz Graf 1). Jako vhodné skladování po uplynutí záruční lhůty se paradoxně ukazuje „teplo-světlo“ (628 KTJ/ml) a naprosto nevhodné je „temno-teplo“ (1143,2 KTJ/ml) (Tab. 7). Mezní hodnoty stanovené vyhláškou v ukazateli kolonie při 22 °C tj. 100 KTJ/ml jsou požadovány pro vzorky balených vod odebraných do 12 hodin po naplnění a udržovaných při teplotě 4 °C ± 1 °C, takže spíše jde o kontrolu výroby a úpravy vody. Pokud bychom výsledky hodnotili podle tohoto limitu, všechny varianty by překračovaly stanovenou mezní hodnotu, čímž voda ztrácí vyhovující požadavek v ukazateli, ale není ještě vyloučena z oběhu. Z oběhu je balená voda vyloučena pokud by překročila NMH v některém s parametrů, pro které je tento typ limitu stanoven. Pro porovnání by bylo ještě vhodné zmínit se i o MH pro pitnou vodu, které jsou stanoveny vyhláškou č. 293/2006 Sb. (viz 2.3) a to pro KTJ při 22 °C, tj. 200 KTJ/ml. Zde je třeba připomenout, že voda dopravovaná vodovodním řádem od zdroje ke spotřebiteli je chemicky upravována (chlorace) z důvodu bezpečnosti a hodnoty lze jen obtížně srovnávat, protože při výrobě balené pramenité vody není povolena žádná chemická ani fyzikální úprava. V tomto případě byl prošly pouze barely uložené v podmínkách „chlad-temno“. Tab. 7 Průměrné počty mikroorganismů před záruční a po záruční době u barelů skladovaných v různých podmínkách Do záruční doby Podmínky skladování
Po záruční době
KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C KTJ při 22 °C
KTJ při 36 °C
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
„chlad-světlo“ (A)
289,8
1,3
754
0
„chlad-temno“ (B)
134,5
0,5
637,6
0,5
„teplo-světlo“ (C)
479,3
1,2
628
0,2
„temno-teplo“ (D)
262,2
0,7
1143,2
0,2
48
Graf 1 Počty KTJ při 22 °C (psychrofily) v balené vodě skladované v různých podmínkách (červená čára naznačuje zhruba konec záruční lhůty)
4500 4000 3500 3000 chlad-temno
KTJ/ml
2500
chlad-světlo
2000
teplo-temno
1500
teplo-světlo
1000 500 0 -500 0
1
2
3
4
5
6
měsíce
Při hodnocení počtu kolonií rostoucích při 36 °C jsou u všech způsobů skladování, i po záruční lhůtě, hodnoty velmi nízké. Řádově se pohybovaly za celé skladovací období 0 – 2,6 KTJ/ml. S prodlouženou dobou skladovaní docházelo ke snížení jejich počtu (Graf 2). Mezní hodnoty stanovené vyhláškou v ukazateli kolonie při 36 °C, tj. 20 KTJ/ml, jsou požadovány pro vzorky balených vod odebraných do 12 hodin po naplnění a udržovaných při teplotě 4 °C ± 1 °C. Pokud bychom hodnotili podle tohoto kritéria jsou všechny varianty způsobu skladování hluboko pod stanoveným limitem. Stejný limit v podobně mezní hodnoty je i u pitné vody.
49
Graf 2 Počty KTJ při 36 °C (mezofily) v balené vodě skladované v různých podmínkách (červená čára naznačuje konec záruční lhůty) 3 2,5 2 KTJ/ml
chlad-temno 1,5
chlad-světlo temno-teplo
1
teplo-světlo 0,5 0 0
1
2
3
4
5
6
-0,5 měsíce
Uvedené výsledky lze porovnat s řadou literárních údajů. ŠEFCOVÁ (1997, 1999) provedla jednoroční skladovací pokus s nesycenými balenými vodami, které byly skladované při kolísavé laboratorní teplotě a na světle. Počty KTJ při 36 °C dosáhly průběhu pokusu až na 4.102 KTJ/ml. U počtu KTJ při 22 °C byla hodnota za shodných podmínek 2.102 KTJ/ml. Podle GRYGAROVÉ (2000), která sledovala počty KTJ při 22 °C a při 36 °C během jednoletého skladování, byl výraznější nárůst mikrobů zaznamenán v průběhu prvních sedmi měsíců skladování, v další fázi skladovacího pokusu tj. 7 – 11 měsíců byl zaznamenán opětovný pokles. ŠAŠEK (2003) uvádí, že většina zástupců organotrofů (KTJ při 22 °C a při 36 °C) nemá nepříznivý dopad na zdraví, alespoň ne na zdravé jedince a ne v denzitách do 106/ml, jsou však mezi nimi i oportunní patogeny (viz 2.4.3.1). Jejich virulence je většinou nízká, takže by neměly ohrozit běžnou populaci. S rostoucím podílem osob se sníženou imunitou jejich význam však roste. Jestli je voda uložená při pokojové teplotě, jako je běžné v obchodech s potravinami a často i doma, netrvá více než pár dnů, než koncentrace mikroorganismů dosáhne počtu 104 – 105 KTJ/ml (ROSENBERG, 2003). Ve Spojených Arabských Emirátech sledovali účinky různé teploty skladování na růst mikroorganismů v balené vodě. Ukázalo se, že množení mikroorganismů probíhá nejlépe mezi 25 °C a 37 °C, naproti tomu chlazení nebo vysoké teploty (kolem 42 °C) redukují nebo udržují počáteční stav pro dobu nejméně třech dnů (NSANZE ET AL., 1999).
50
WARBURTON ET AL. (1992) stanovil, že v průměru u 40 % balených vod na kanadském trhu byl překročen limit pro počty aerobních kolonií. Výskyt plísní a kvasinek byl u všech variant skladování, jejich počet se v průměru pohyboval v rozmezí 0,2 – 2,3 KTJ/ml v záruční lhůtě a po záruce se obsah zvýšil na 0,7 – 3,5 KTJ/ml. (Tab. 8) Limit pro počet kolonií plísní a kvasinek zatím není u balené vody stanoven a ani nejsou tyto mikroorganismy běžně sledovány. V odborné literatuře však lze nalézt řadu důkazů o tom, že se tyto skupiny mikroorganismů v pitných a balených vodách vyskytují. Např. ŠIMORDOVÁ (1981) provedla testování 196 vzorků pitných vod na přítomnost mikromycet. Bylo izolováno 39 druhů nebo skupin vláknitých a 6 druhů kvasinkovitých mikromycet. Byly přítomny druhy produkující mykotoxiny nebo i druhy, které mohou vyvolat mykotické nebo alergické reakce. Při vyšetřování balených vod ŠAŠEK (1997) zjistil, že občas lze najít nízké počty mikromycet (vláknité houby, plísně) v denzitě kolem 102 kolonií/ml, výjimečně zjistil i počty řádově 103 kolonií/ml, konkrétně až 3000 kolonií/ml. Tisícové až desetitisícové nálezy v balených vodách byly známy i z hlášení některých krajských hygienických stanic. YAMAGUCHI minerálních
vod
v Brazílii
a
ET AL.
zjistili,
(2007) zkoumali 60 vzorků balených že
35
%
vzorků
bylo
pozitivních
na přítomnost vláknitých hub, v rozmezí 1 – 50 KTJ/ml a 36,6 % obsahovalo kvasinky 1 – 100 KTJ/ml. Z kvasinek byla nejčastěji stanovena Candida parapsilosis. Z dalších
skupin
stanovovaných
mikroorganismů,
tj.
koliformní
mikroorganismy, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa a Clostridium perfringens, se po celé skladovací období ve všech variantách uskladnění neobjevila ani jedna KTJ/ml. (Tab. 8) Tab. 8 Průměrné počty mikroorganismů za celou dobu skladování v různých podmínkách (A,B,C,D jsou podmínky skladování viz Tab. 6)(KTJ/ml) Do záruční doby
Po záruční době
Mikroorganismy
A
B
C
D
A
B
C
D
Koliformní mikroorganismy
0
0
0
0
0
0
0
0
Enterokoky
0
0
0
0
0
0
0
0
Pseudomonas aeruginosa
0
0
0
0
0
0
0
0
Clostridium perfringens
0
0
0
0
0
0
0
0
0,9
0,5
2,3
0,2
1,1
0,7
3,5
3,1
Kvasinky, plísně
51
U způsobu skladování „chlad-světlo“ byla voda, již po měsíci skladování, znehodnocena tvorbou zeleného povlaku na dně barelu (viz Obr. 13). Později se ukázalo, že se jedná o dvě zelené řasy, které identifikoval RNDr. Petr Marvan, Csc. (Limni s.r.o.), ze vzorku vody odebrané ze dna barelu. Konkrétně se jednalo o zelené řasy Chlorella ssp. (na obrázku v červeném kroužku) a Pseudococcomyxa simplex (Pseudococcomyxa adhaerens) (na obrázku ve žlutém kroužku). (viz Obr. 14) Životaschopné řasy se mohou do balené vody dostat
Obr. 13 Dno barelu
různými způsoby. Buďto přímo z vodního zdroje, při průběhu plnění ze vzduchu nebo z nedostatečně vyčištěného vratného barelu. V rámci experimentální zdravotního
činnosti
ústavu
Státního
v Praze
byly
zpracovány dva vzorky balené vody. V jedné
byly
zelených
řas
a
zástupce
masivní rodu
usazeniny
Stichococcus,
zelených
bičíkovců
pravděpodobně rodu Vitreochlamys (Sphaerellopsis). Ve druhém vzorku byly přítomny řasy zřejmě rodu Obr. 14 Zelené řasy izolované ze dna barelu
Chlorella. Byl k dispozici i barel s výrazným
zeleným
nánosem
na dně, jednalo se o zelené řasy s dominancí Pseudococcomyxa simplex. (PUMANN, 2005) V platné legislativě (viz 2.3) je uváděn ukazatel mikroskopický obraz – živé organismy s NHM rovnou nula jedinců/ml, ale není blíže specifikováno jaké organismy do tohoto ukazatele lze zařadit. Předpokladem mikrobiologické nezávadnosti balené vody je skladování v chladu a temnu. Ostatní způsoby skladování mohou mít nepříznivý vliv na mikroflóru v balené vodě.
52
5.2 Rozbor dna barelů Následně po analýze vody z barelu, byla provedena i analýza dna. S rozbory se začalo až 2. měsíc skladování. Kromě mikroorganismů vyjmenovaných výše, byly navíc stanoveny i oligotrofní mikroorganismy. V porovnání s výsledky z barelů jsou hodnoty stanovených KTJ při 22 °C ze dna většinou o řád vyšší. Podle výsledků ze dna barelů by bylo lépe skladovat barely v záruční době v podmínkách „teplo-světlo“ (213,3 KTJ/ml) nebo „temno-teplo“ (300 KTJ/ml). Naopak jako nevhodný způsob by byl „chlad-světlo“ (1263,3 KTJ/ml). Při překročení doporučené lhůty pokračuje nárůst počtu mikroorganismů a v 5. měsíci dochází ke kulminaci (stejně jako v předchozím případě) a následnému poklesu (Graf 3), po záruční době se
průměrné hodnoty pohybují v rozmezí 1014,5 - 2380 KTJ/ml
(Tab. 9). V porovnání s mezní hodnotou pro vzorky balené vody odebrané do 12 hodin po naplnění i pro mezní hodnoty pro pitnou vodu z vodovodu, ani jedna z variant by nesplnila stanovený limit, ale voda by ještě nemusela být vyloučena z oběhu. Pokud
budeme
uvažovat
promíchání
celého
objemu
barelu
(nasazení
na watercooler) tak podle počtu KTJ při 22 °C z barelu a dna barelu dojdeme k teoretickému číslu asi 107 KTJ v celém objemu barelu, tzn. v 18,9 litrech vody, takže v jednom mililitru může být obsaženo asi 520 KTJ/ml. I tato hodnota je vyšší než požadované limity stanovené vyhláškou. Tab. 9 Průměrné počty mikroorganismů ze dna barelu v různých skladovacích podmínkách Do záruční doby Podmínky
KTJ při 22°C KTJ při 36 °C
Po záruční době KTJ při 22 °C
KTJ při 36 °C
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
(KTJ/ml)
„chlad-světlo“ (A)
1160
3,3
2174,2
8,3
„chlad-temno“ (B)
1263,3
6,6
2380
1,7
„teplo-světlo“ (C)
213,3
3,3
1014,5
3,3
„temno-teplo“ (D)
300
3,3
2225,8
9,2
skladování
53
Graf 3 KTJ při 22 °C (psychrofily) ze dna barelů během celé doby skladování za různých podmínek (červená čára naznačuje konec záruční lhůty) 6000 5000
KTJ/ml
4000
chlad-temno chlad-světlo
3000
teplo-temno teplo-světlo
2000 1000 0 2
3
4
5
6
měsíce
Počty KTJ při 36 °C se do záruční lhůty průměrně pohybovaly v rozmezí 3,3 – 6,6 KTJ/ml (Tab. 9), při překročení doby spotřeby došlo v 5. měsíci k nárůstu, hlavně u vody skladované v podmínkách „teplo-temno“ (30 KTJ/ml) a „chlad-světlo“ (20 KTJ/ml) (Graf 4). Graf 4 KTJ při 36 °C(mezofily) ze dna barelů během celé doby skladování za různých podmínek (červená čára naznačuje konec záruční lhůty) 30 25
KTJ/ml
20
chlad-temno chlad-světlo
15
teplo-temno teplo-světlo
10 5 0 2
3
4
5
měsíce
54
6
Ve vzorcích vod ze dna barelu byly stanoveny také oligotrofní mikroorganismy, tato analýza byla provedena až po uplynutí záruční doby a pokračovala do konce skladovacího pokusu. Ve všech pokusných variantách jsou denzity mikroorganismů řádově
v tisících
KTJ/ml.
Nejvyšší
hodnoty
však
dosahuje
„teplo-temno“
a to 4276,6 KTJ/ml. V průběhu doby skladování opět dochází k nárůstu počtů v 5. měsíci skladování, nejvíce u „teplo-temno“ (7250 KTJ/ml)(Graf 5). Oligotrofní mikroorganismy rostou při minimální koncentraci živin v prostředí. Jejich počty výrazně převyšovaly počty všech stanovovaných skupin a druhů mikroorganismů. Stanovení oligotrofních mikroorganismů není požadováno platnou legislativou, i když mohou být zdrojem živin pro ostatní mikroorganismy i pro skupinu kopiotrofních mikroorganismů, která zahrnuje kolonie při 22 °C, kolonie při 36 °C a koliformní mikroorganismy. GRYGAROVÁ (200) prokázala, že oligotrofní mikroorganismy v balených vodách přítomny jsou řádově v hodnotách tisíců KTJ/ml a že dochází k jejich usazování na dně láhve. Tuto skutečnost potvrdila i DVOŘÁČKOVÁ (2003), neprokázala však vztah mezi tzv. kopiotrofními mikroorganismy a oligotrofními mikroorganismy. I HÁKOVÁ (2006) se zabývala těmito mikroorganismy. Nemohla však potvrdit usazování na dně láhve v důsledku protřepání před očkováním, ale prokázala jejich přítomnost jak u balených vod tak i u vod z watercoolerů. Graf 5 Oligotrofní mikroorganismy na dně barelu v průběhu skladování 8000 7000 6000
KTJ/ml
5000
chlad-temno chlad-světlo
4000
teplo-temno teplo-světlo
3000 2000 1000 0 3
4
5 měsíce
55
6
Počty plísní a kvasinek se pohybovaly v rozmezí 0-6,7 KTJ/ml. Nejvyšší hodnota byla u způsobu skladování „teplo-světlo“, ale až po záruční lhůtě. Naopak při stejném způsobu skladování do záruční lhůty nebyly přítomny (Tab. 10). Tab. 10 Průměrné počty mikroorganismů ze dna barelu v různých skladovacích podmínkách (A,B,C,D jsou podmínky skladování viz Tab. 9) (KTJ/ml) Do záruční doby
Po záruční době
Mikroorganismy
A
B
C
D
A
B
C
D
Koliformní mikroorganismy
0
0
0
0
0
0
0
0
Enterokoky
0
0
0
0
0
0
0
0
Pseudomonas aeruginosa
0
0
0
0
0
0
0
0
Clostridium perfringens
0
0
0
0
0
0
0
0
3222,5
2137,5
2089,1
4276,6
0,8
6,7
5
0,8
Oligotrofní mikroorganismy Kvasinky, plísně
Z dalších
3,3
skupin
0
0
stanovovaných
3,3
mikroorganismů,
tj.
koliformní
mikroorganismy, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa a Clostridium perfringens, se po celé skladovací období ve všech variantách uskladnění neobjevila ani jedna KTJ/ml. (Tab. 10)
5.3 Watercoolery 5.3.1 Vliv sanitace na mikrobiální osídlení vody prošlé přes watercooler Na začátku pokusu byla provedena sanitace nových přístrojů (viz 4.2.2) pomocí dezinfekčního prostředku Dosyl-3-plus. Jako tzv.“startovací“ hodnoty můžeme brát počty KTJ při 22 °C a při 36 °C, které byly stanoveny po 7 dnech používání watercooleru. Tyto hodnoty u jednotlivých typů přístrojů uvádí následující Tab. 11.
56
Tab. 11 Průměrné počty KTJ při 22 °C a při 36 °C po sedmi dnech používání watercooleru „vhodné“ prostředí WTC 1
WTC 2
(typ 16L) (typ 16TD)
„nevhodné“ prostředí WTC 3
WTC 4
(typ 16L)
(typ 16TD)
KTJ při 22 °C (KTJ/ml)
648,3
599
385
542,3
KTJ při 36 °C (KTJ/ml)
16
50
47
21,3
Poznámky: a) „vhodné“ prostředí – přístroj byl umístěn v takovém prostředí, aby odpovídalo doporučení Státního zdravotního ústavu v Praze, tj. na čistém, větratelném místě, chráněném před přímým slunečním světlem, bez zdroje organických látek (benzinové pumpy, tiskárny apod.) b) „nevhodné“ prostředí – umístění v rozporu s výše jmenovaných doporučením
Po tří měsíčním sledování počtů KTJ při 22 °C a při 36 °C (viz 5.3.2) byly přístroje 16L a 16TD umístěné ve „vhodném“ prostředí vysanitovány podle již výše popsaného postupu (viz 4.2.3). Při sanitaci byl opět použit prostředek označený jako Dosyl-3-plus. Byly provedeny analýzy vody v barelu a po průchodu oběma přístroji, odběr z přístrojů byl proveden 22.1. a 29.1.2008. Pro srovnání byl proveden i rozbor vody z vodovodního řádu, abychom vyloučili možné ovlivnění. Zjišťovali se jen mikroorganismy rostoucí při 22 °C a při 36 °C. Ze spočítaných kolonií je zřejmé, že jakost vody pro projití WTC se rapidně zhorší, i přesto, že byla u WTC provedena sanitace. Určitou roli může hrát již samotné mikrobiologické osídlení barelu a možný výskyt biofilmu na některé části přístroje i přesto, že byl watercooler mechanicky vyčištěn. Ovšem ne vždy jsou všechna místa přicházející do styku s vodou přístupná mechanickému vyčištění. Je zajímavé, že při dalším odběru vzorků z watercoolerů jsou hodnoty KTJ při 22 °C o polovinu nižší. Ovlivnění mikrobiologické kvality vody z watercooleru vodou z vodovodního řádu je vyloučeno, jak ukazuje Tab. 12 i přesto, že watercooler byl na konci sanitace propláchnut vodou z vodovodního řádu. Je doporučeno povrchové očištění narážecího trhu při každé výměně barelu, pak po asi 60 výměnách barelu nejdéle však po třech měsících provést sanitaci celého watercooleru. (ZIKL, 2001) V Kanadě doporučuje Quebéc asociace výrobců balených vod a Quebéc ministerstvo životního prostředí provádět sanitaci každé dva měsíce za použití
57
6% thiosíranu sodného. Pokud byla sanitace provedena podle doporučení byl kontaminován 1 z 12 watercoolerů. Při jiném způsobu byl počet kontaminovaných přístrojů několikrát vyšší. Bylo analyzováno i 100 barelů pramenité vody před vstupem do přístroje. Skoro 50 % mělo denzitu heterotrofních mikroorganismů 0 – 10 KTJ/ml. Toto může být způsobeno použitím ionizace nebo UV zářením, které výrobci v Kanadě používají k redukci počtu mikroorganismů. Vzorky vody po projití přístrojem měli ve většině případů 103 – 105 KTJ/ml. (LÉVESQUE ET AL., 1994) Tab. 12 Průměrné hodnoty počtu mikroorganismů po sanitaci přístrojů Barel
WTC 1 (16L)
WTC 2(16TD)
Vodovod
22.1.2008 29.1.2008 22.1.2008 29.1.2008 KTJ při 22 °C
881
16293,3
6980
14693,3
7926,6
12,3
KTJ při 36 °C
1
1,3
4,6
3,6
1,6
0,6
Dále byla porovnána účinnost dezinfekčních prostředků a to Dilac D a Dosyl-3plus. U přístroje typu 16TD umístěného ve „vhodném prostředí“ se provedla sanitace podle již zmíněného postupu (viz 4.2.3) a to nejprve pomocí jednoho (provedl se rozbor 18.2.2008) a poté druhé (26.2.2008) patřičně naředěného sanitačního roztoku. Na watercooler se nasadily barely stejné šarže a sledovány byly jenom KTJ při 22 °C a při 36 °C. I tentokráte jsme provedli rozbor vody z vodovodního kohoutku. (Tab. 13) Tab. 13 Porovnání počtu mikroorganismů ve vzorcích vody z watercoolerů sanitovaných rozdílnými prostředky DILAC D (18.2.2008)
DOSYL-3-PLUS (26.2.2008)
Barel
WTC
vodovod
Barel
WTC
vodovod
KTJ při 22 °C
813,3
23600
1,3
3026,6
30400
150,3
KTJ při 36 °C
0
8
0
0,3
119
4,3
Je zřejmé, že došlo k rapidnímu zhoršení vody po projití WTC, jak u KTJ při 36 °C tak i KTJ při 22 °C. Kvalita vody čepované z watercoolerů mohla být ovlivněna již vodou obsaženou v barelu. Z těchto výsledků opět můžeme uvažovat o přítomnosti biofilmu v některé části přístroje. Ionizací se zničí každá bakterie biofilmu, která je přítomna v nových nebo recyklovaných lahvích. Zahrnutím takového dezinfekčního kroku by mělo zlepšit celkovou kvalitu balené vody. (WARBURTON ET AL., 1998)
58
5.3.2 Mikrobiální změny v balené vodě po průchodu WTC Současně se skladovacím pokusem probíhaly i rozbory vod prošlých přes WTC. Byly sledovány pouze počty KTJ při 22 °C a při 36 °C. Následující Graf 6 ukazuje průměrné počty KTJ při 22 °C a při 36 °C u vod prošlých přes WTC bez ohledu na umístění a typ přístroje. U KTJ při 22 °C jsou již počáteční hodnoty relativně vysoké (viz Tab. 11). Jak se zřejmé, dochází k postupnému nárůstu počtu mikroorganismů s délkou používání přístroje. Kulminace je zřetelná v 63 den provozu a po té následuje pokles hodnot. Počty KTJ při 36 °C na začátku pokusu mají také vyšší hodnoty, ale během používání dochází k výkyvům, není patrných nárůst jako u KTJ při 22 °C. Protikladně počet v 63 dni provozu dochází k rapidnímu poklesu počtu a následnému nárůstu. Graf 6 Počty KTJ při 22 °C a při 36 °C bez ohledu na prostředí a přístroj 100000
10000
KTJ/ml
1000 KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C 100
10
1 7
14
21
28
35
49
56
63
70
77
84
dny
Časopis TEST si nechal testovat různé vzorky vod z watercoolerů. Celkem bylo odebráno 18 vzorků vod ze škol, nemocnic, lékáren atd.. Vzorky se posuzovaly podle vyhlášky na balenou vodu. V 67 % byla nalezena Pseudomonas aeruginosa (4 – 840 KTJ/ml), 33 % vzorků navíc obsahovalo koliformní bakterie (2 – 38 KTJ/ml). Pouze 5 vzorků vody odpovídalo požadavkům. Pokud se týká denzit KTJ při 22 °C tak se pohybovaly 25 – 5080 KTJ/ml. U KTJ při 36 °C jsou hodnoty řádově stejné v rozmezí 27 – 3150 KTJ/ml. (ANONYM, 2007) BAUMGARTNER, GRAND (2006) testovali mimo jiné vzorky vody z watercoolerů chlazené i nechlazené a vzorky pramenitých vod v 20 litrových barelech. Voda
59
z watercoolerů obsahovala od 103 až 105 KTJ/ml mezofilních aerobních bakterií naproti tomu voda v barelech asi 103 KTJ/ml. Pseudomonas aeruginosa byla identifikována ve třech (25 %) vzorcích pramenité vody v barelech, podobná četnost 24,1 % byla nalezena i u vzorků z watercoolerů. Prokázali též, že Pseudomonas aeruginosa z watercoolerů nepochází z prostředí, ale z balené vody v barelech. Výsledky na různých typech watercoolerů prokazují, že voda čepovaná z těchto zařízení nejpozději po 3 až 5 dnech přestává odpovídat mikrobiologickým požadavkům a to i přes pravidelnou dezinfekci přístroje. Pokud není watercooler mikrobiologicky znečištěn, vzorky v prvních dnech nevykazují mikrobiologickou kontaminaci. Ke zlomu však dochází právě po 3 až 5 dnech a nastává rychlé pomožení psychrofilních a mezofilních mikrobů. Tato kontaminace je zjišťována jak u čepované vody, tak i v barelu. (ZIKL, JOHNOVÁ, 1997) Během testování se potvrdilo, že na mikrobiologické parametry vody čepované pomocí watercooleru má rozhodující vliv čistota zařízení, druh použité vody a druh čepovacího zařízení. Také se ukázalo, že může docházet k pomnožování Pseudomonas aeruginosa a koliformních bakterií na čepovacím zařízení. (ZIKL, 1999) Ve Státním zdravotním ústavě v Praze dlouhodobě testovali watercooler. Byla sledována voda před a po průchodu watercoolerem. Sledovány byly počty KTJ při 22 °C a při 36 °C. Byly stanoveny i ukazatele Escherichia coli, koliformní baterie a Pseudomonas aeruginosa, hodnoty těchto ukazatelů byly vždy nulové. U první dodavatelské firmy byly počty KTJ vysoké, u KTJ při 22 °C (řádově tisíce KTJ/ml) a u KTJ při 36 °C (řádově stovky KTJ/ml), ve vzorcích vod po projití watercoolerem je jejich hodnota zvýšila až o dva řády. Po změně dodavatelské firmy došlo i ke změně počtu obecných indikátorů. Došlo k výraznému snížení počtů jak před vstupem tak i po výstupu z watercooleru. Nebyly prokázány výrazné rozdíly mezi vodou čepovanou z přístroje a vodou z barelu i přes to, že zařízení nebylo záměrně sanitováno. Z poznatků může být řečeno, že kvalita vody čepované z watercoolerů „bude dobrá“, pokud dodávaná balená voda bude splňovat limity stanovené vyhláškou až do okamžiku prodeje. (CHLUPÁČOVÁ, 2003) Státní zdravotní ústav v Praze opět testoval vzorky vod z watercoolerů odebraných na různých místech jako jsou základní školy, školní jídelny nebo nemocnice. Výsledky ukázaly, že ze 34 odebraných vzorků byla v 74 % voda závadná. (CHLUPÁČOVÁ, 2005)
60
Na VŠCHT v Praze testovala BEZDĚKOVÁ (2008) čtyři watercoolery různě umístěné. Ani jeden vzorek vody prošlý přes přístroje nevyhovoval požadavkům podle vyhlášky na balenou vodu. Rozmezí stanovených počtů mikroorganismů je následovné: KTJ při 22 °C (200 – 640 KTJ/ml), koliformní bakterie (4 – 265 KTJ/ml), E. coli (0 – 15 KTJ/ml), enterokoky (u všech vzorků byly negativní) a Pseudomonas aeruginosa (0 – 13 KTJ/ml). V Kanadě LÉVESQUE
ET AL.
(1994) analyzoval vzorky vod z watercoolerů
v domácnostech a na pracovištích. V 36 % a 28 % případech vzorků byla objevena kontaminace alespoň jednou koliformní bakterií nebo jednou patogenní bakterií. Podle zjištěných údajů v předkládané diplomové práci se můžeme přiklánět spíše k závěrům, ke kterým došli BAUMGARTNER, GRAND (2006), ZIKL, JOHNOVÁ (1997) a ZIKL (1999).
5.3.3 Vliv prostředí Graf 7 zachycuje průměrné počty mikroorganismů ve vodě prošlé WTC umístěnými
ve „vhodném“ a „nevhodném“ prostředí za celou dobu sledování
bez rozlišení typu přístroje. U počtu KTJ při 22 °C ve „vhodném“ prostředí je zřejmý vyšší obsah mikroorganismů
(4016,3 KTJ/ml) než v prostředí „nevhodném“
(3402,7 KTJ/ml). U počtů KTJ při 36 °C je tomu právě naopak, vyšší počet je v „nevhodném“ prostředí, i když rozdíl mezi oběma čísly je zanedbatelný. Graf 7 Vliv prostředí na počty KTJ při 22 °C a při 36 °C bez rozlišení přístroje Vliv prostředí 4500 4000 3500
KTJ/ml
3000 2500
kolonie 36 °C
2000
kolonie 22 °C
1500 1000 500 0 vhodné prostředí
nevhodné prostředí
61
Jiné výsledky však ukazují stěry provedené v zásobních nádržkách pouze u přístroje typu 16TD (Tab. 14). Podle stěru je zřejmé, že na dně zásobní nádržky u přístroje umístěného v „nevhodném“ prostředí jsou počty KTJ u obou skupin stanovovaných mikroorganismů vyšší než u přístroje umístěného ve „vhodném“ prostředí. Tab.14 Průměrné hodnoty mikroorganismů ze stěrů provedených u přístrojů 16TD
„vhodné“ prostředí „nevhodné“ prostředí
KTJ při 22 °C
KTJ při 36 °C
51
10
1007
124
Umístění přístroje hraje jednu z hlavních rolí u vlivu na mikrobiologickou kvalitu čepované vody. Možný vliv na zhoršení kvality vody pro průchodu watercoolerem mohl být přístup slunečního záření u přístrojů umístěných ve „vhodném“ prostředí. Ve většině kanceláří bývá takto přístroj umístěn, možným řešením by bylo umístění „poklopu“ na nasazený barel (toto se již v praxi začíná uplatňovat). U přístroje umístěné v „nevhodném“ prostředí se mohlo projevit jednak ovzduší automobilové dílny i je možný vliv působení tepla z radiátoru, v blízkosti kterého byl přístroj umístěn. Podle výsledků ze stěru ze dna zásobních nádržek můžeme říci, že se přes vzduchový filtr dostane více mikroorganismů v „nevhodném prostředí“, ale ty nejspíše zůstanou na dně této nádržky a ne do čepované vody, jak ukazují výsledky mikrobiologického rozboru vody po načepování. Z výsledků BEZDĚKOVÉ (2008) bylo očividné, že voda z watercooleru s nejnižší frekvencí odběru vody byla „lepší“ než z watercooleru, který měl největší frekvenci odběru vody. Asi to bylo způsobeno tím, že watercooler byl umístěn v chladnějším místě. Podle doporučení Státního zdravotního ústavu v Praze by měl být přístroj umístěn na čistém větratelném místě, chráněn před přímým slunečním světlem a v prostředí kde nejsou přítomny zdroje organických látek (benzinové pumpy, tiskárny atd.), které by mohly přispět k tvorbě biofilmu.
5.3.4 Vliv typu WTC Vliv použitého typu WTC na KTJ při 22 °C a při 36 °C zachycují grafy 8 a 9, není brán v potaz v jakém prostředí je přístroj umístěn. U KTJ při 22 °C převažují vyšší 62
hodnoty u přístroje typu 16 TD, naopak výsledky analýz KTJ při 36 °C ukazují že vyšší počty mikroorganismů jsou u vzorků z přístroje typu 16L. Vyšší počty KTJ při 36 °C u přístroje 16L mohou být způsobeny tím, že k chlazení je použit chladící agregát a tedy prostor okolo tohoto přístroje (tedy i zásobní nádržka) se může ohřívat a může docházet k množení přítomných mikroorganismů. Graf 8 Vliv typu WTC na změny v počtech bakterií v průběhu 3 měsíčního sledování 16000 14000 12000
KTJ/ml
10000 typ 16L
8000
typ 16TD
6000 4000 2000 0 7
14
21
28
35
49 dny
63
56
63
70
77
84
Graf 9 Vliv typu WTC na změny v počtech bakterií v průběhu 3 měsíčního sledování 160 140 120
KTJ/ml
100 typ 16L
80
typ 16TD
60 40 20 0 7
14
21
28
35
49
56
dny
64
63
70
77
84
6. ZÁVĚR Mikrobiologickými analýzami barelů skladovaných v různých podmínkách, vzorků vod z watercoolerů, a mikrobiologickými rozbory vzorků vod z watercoolerů po sanitaci se dospělo k těmto závěrům:
Skladování barelů v jiných podmínkách než „temno-chlad“ může mít negativní vliv na mikrobiologickou kvalitu balené vody. Ke změně mikrobiologické kvality docházelo hlavně po skočení záruční doby. (v 5. měsíci skladování) U žádného ze skladovaných barelů nebyly izolovány koliformní bakterie, enterokoky, Pseudomonas aeruginosa ani Clostridium perfringens Po měsíčním skladování barelů v podmínkách „chlad-světlo“ byl zjištěn masivní nárůst řas a to Psedococcomyxa simplex a Chlorella ssp. Mikrobiologickými analýzami se zjistilo, že denzita mikroorganismů na dně barelů je vyšší než ve svrchních vrstvách. Nově byla prokázána sedimentace oligotrofních mikroorganismů na dno barelů, jejich denzita dosahovala 290 – 7250 KTJ/ml U vzorků vod z watercoolerů jsou počty mikroorganismů, nejen po sanitaci, ale i po samotném načepování, mnohonásobně vyšší. Můžeme tedy uvažovat o vytvoření biofilmu na některé ze součástek, které nelze při běžné údržbě mechanicky vyčistit. Každá balená voda, pokud je špatně skladována nebo čepována přes nedostatečně sanitovaný watercooler, může obsahovat nadlimitní počty mikroorganismů, hlavně KTJ při 22 °C.
65
7. POUŽITÁ LITERATURA AMBROŽOVÁ, J. Mikrobiologie v technologii vod. 1. vydání. Praha: VŠCHT, 2004. 244 s. ISBN 80-7080-534-X ANONYM. Dobová zajímavost – prodej minerálních vod před sto lety [on-line]. Publikováno v prosinci 2005 [cit. 2008-02-13]. Dostupné na: http://www.szu.cz/chzp/voda/pitna-voda/dvhist.html ANONYM. Jaká je voda z watercoolerů? Dtest, 2007, roč. 16, č. 1, s. 4 – 8 ANONYM. Ochucená voda v barelech? [on-line]. [cit. 2007-11-6]. Dostupné z: voda.cz/informace/2006/10/30/ochucena-voda-v-barelech/
Publikováno 30.10.2006 http://www.stolni-
BAUDIŠOVÁ, D. Současné metody mikrobiologického rozboru vody. 1. vydání. Praha: Výzkumný ústav vodohospodářský T.G.Masaryka, 2007. 104 s. ISBN 978-80-85900-72-9 BAUMGARTNER, A. GRAND, M. Bacteriological quality of drinking water from dispensers (coolers) and possible control measures. Journal of food Protection. 2006, vol. 69, no. 12, p. 3043 – 3046 BEZDĚKOVÁ, E. Mikrobiální kontaminace zásobníků pitné vody. In Vodárenská biologie. Říhová-Ambrožová, J. (ed.). 1. vydání. Chrudim: Vodní zdroje EKOMONITOR spol. s.r.o., 2008. s. 33 – 36. ISBN 978-80-86832-31-9 ČEŘOVSKÁ, L. Spotřeba balených vod v České republice. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda - zdravotní a hygienická hlediska.. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005. s. 9 - 14. ISBN 80-02-01763-3 ČSN EN ISO 6222 (75 7821) Jakost vod – stanovení kultivovatelných mikroorganismů – stanovení počtu kolonií očkováním do živného agarového kultivačního média, 2000 DOBIÁŠ, J. Riziko kontaminace vody v polymerních obalech. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1999. s. 73 - 79. ISBN 80-02-01269-0 DVOŘÁČKOVÁ, H. Mikrobiologie balených pitných vod. Diplomová práce na MZLU v Brně, 2003, s. 50 FOLTINOVÁ, J. JEŽKOVÁ, J. Co přináší legislativa EU v oblasti balených vod? [on-line]. Publikováno 26.8.2004 [cit. 2007-11-6]. Dostupné z: http://www.svaz-mv.cz/d_legislativa.html
66
GÖRNER, F., VALÍK, L’. Aplikovaná mikrobiológia poživatin. 1. vydání. Bratislava: Malé centrum, 2004. 528 s. ISBN 80-967064-9-7 GRYGAROVÁ, P. Vliv podmínek skladování na bakteriální mikroflóru balených pitných vod. Diplomová práce na MZLU v Brně, 2000, s. 47 HÁKOVÁ, E. Mikrobiologická kontrola Bakalářská práce na MZLU v Brně, 2006, s. 47
kvality
balených
pitných
vod.
HÄUSLER, J. Mikrobiologické kultivační metody kontroly jakosti vod. Díl II. Mikrobiologický rozbor(zkrácená a upravená kapitola) In. Mikrobiologický Bulletin, č. 2, 1995, s. 110 - 118 HAVLÍK, B. Pitný režim. Potravinářské revue, 2005, roč. 2 č. 3, s. 12 – 18 HRUBÝ, S. Hygienická problematika podmíněně patogenních mikroorganismů. Hygiena, roč. 43, č. 3, 1998, s. 169 – 173. In ŠAŠEK, J. Balená voda a oportunní patogeny. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2001. s. 43-57. ISBN 80–02–01402–2. HUNTER, P.R. The microbiology of bottled natural mineral waters. Journal of Applied Bacteriology, 1993, vol. 74, no. 4, p. 345-352 CHLUPÁČOVÁ, M. Je voda z watercoolerů „dobrá“? In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2003. s. 58 - 68. ISBN 80-02-01553-3 CHLUPÁČOVÁ, M., KOŽÍŠEK, F. Pijete vodu z watercooleru? [on-line]. Publikováno září 2004 [cit. 2008-02-04]. Dostupné z: http://www.szu.cz/chzp/voda/pdf/cooler.pdf CHLUPÁČOVÁ, M. Watercoolery – realita a legislativa. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda – zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005. s. 63 - 71. ISBN 80-02-01763-3. KOBEŠ, Z. Spotřeba potravin a nealkoholických nápojů na 1 obyvatele v ČR v letech 1999 – 2006 [on-line]. Publikováno 1.12.2007 [cit. 2008-01-29]. Dostupné z: http://www.czso.cz/csu/2007edicniplan.nsf/t/A3002B6A5E/$File/300407_01.pdf KOŽÍŠEK, F. Malý průvodce spotřebitele balených vod. [on-line]. Vystaveno 10.3.2001[cit. 2007-11-13]. Dostupné z: http://www.narod sobe.cz/clovek/kultura/jidlo/voda/DRUHY_A_VYUZITI_BALENYCH_VOD.html KOŽÍŠEK, F. Osvědčování kojeneckých vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda – zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005. s. 45 - 51. ISBN 80-02-01763-3.
67
KOŽÍŠEK, F. Rady spotřebitelům balených vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005a. s. 133 - 146. ISBN 80-02-01763-3. KRMENČÍK, P. Mikromycety [online]. Vytvořeno: 2001-2007 [cit. 2007-11-01]. Dostupné z: http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/mikromycety.php KUNC, F. OTTOVÁ, V. Mikrobiologie pro posluchače studijního oboru technologie vody. 2. vydání. Praha: VŠCHT, 1997, 174 s. ISBN 80-7080-136-0 LÉVESQUE, B.; SIMARD, P.; GAUVIN, D.; GINGRAS, S.; DEWAILLY, E.; LETARTE, R. Comparison of the microbiolgical quality of water coolers and that of municipal water systems. Applied and Enviromental Microbiology, 1994, vol. 60, no. 4, p. 1174 - 1178 MARENDIAK, D., KOPÁČOVÁ, L'., LEITGEB, mikrobiológia. 1. vydání. Bratislava: Príroda, 1987. 432 s.
S.
Pol'nohospodárská
NSANZE, H.; BABARINDE, Z.; AL KOHALY, H. Microbiological quality of bottled drinking water in the UAE and the effect of storage at different temperatures. Environment International, 1999, vol. 25, no. 1, p. 53 – 57 PEČKOVÁ, M. Poznatky kontrolní činnosti v oblasti výroby přírodních minerálních vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1999. s. 69 - 72. ISBN 80-02-01269-0 PERLÍN, C. Pokračuje nárůst prodeje balených vod. Soft Drinks International, no. 6, 2006, p. 11 [on-line]. Vydáno 21.9.2006 [cit. 2007-02-16]. Dostupné z: http://www.agronavigator.cz/default.asp?ch=13&typ=1&val=51694&ids=173 POKORNÝ, J. Mikrobiologická problematika balených vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1995. s. 19 - 23. ISBN 80-02-01038-8. PUMANN, P. Řasy v balených vodách. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda - zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005. s. 93-100. ISBN 80-02-01763-3. ROSENBERG, F.A. The microbiology of bottled water. Clinical Microbiology Newsletter, 2003, vol. 25, no. 6, p. 41 – 44 ROZOVÁ, I. Kvalita balených vod – spotřebitelský test. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2001. s. 31 - 38. STELZ, A. Zur mikrobiologischen Beschaffenheit von abgeffülltem natürlichen Mineral-, Trink-, Tafel- und Quellwasser. Gesundh. – Wes., 59, p. 649 - 655
68
ŠAŠEK, J. Mikromycety v pitné a balené vodě. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1997. s. 43 - 46. ISBN 80-02-01134-1 ŠAŠEK, J. Význam základních mikrobiologických indikátorů. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1999. s. 51-60. ISBN 80-02-1269-0 ŠAŠEK, J. Balená voda a oportunní patogeny. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2001. s. 43-57. ISBN 80–02–01402–2. ŠAŠEK, J. Organotrofní bakterie a balené vody. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2003. s. 69 – 81. ISBN 80-02-01553-3 ŠAŠEK, J. Minimalizace zdrojů mikrobiální kontaminace při výrobě balené vody. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda - zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2005. s. 73 - 86. ISBN 80-02-01763-3 ŠEFCOVÁ, H. Skladování balené vody a jeho vliv na růst bakteriální mikroflóry. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1997. s. 49 - 57. ISBN 80-02-01134-1 ŠEFCOVÁ, H. Mikrobiologická stabilita nesycených balených vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1999. s. 61 - 68. ISBN 80-02-1269-0 ŠILHÁNKOVÁ, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 3. vydání. Praha: Akademie věd České republiky, 2002. 363 s. ISBN 80-200-1024-6 ŠIMORDOVÁ, M. Sledování výskytu mikromycet v pitných vodách. Acta Hygienica Epidemiologica Microbiologica, 1981, č. 2, s. 2 - 6 ŠROUBKOVÁ, E. Zemědělská mikrobiologie(speciální část pro fytotechnický obor). 1.vydání. Brno: Vysoká škola zemědělská, 1991. 73 s. VEČERKOVÁ, H. Balené vody mají nová pravidla [on-line]. Vystaveno 8.7.2005[cit. 2007-11-13]. Dostupné z:http://ekonomika.idnes.cz/test.asp?r=test&c=2005M158t02A VEGER, J., BAUDIŠOVÁ, D. Bakterie z čeledi Enterobacteriaceae ve vodním prostředí. 1.vydání. Praha: Výzkumný ústav vodohospodářský T.G.Masaryka, 1996. 100 s. ISBN 80-85900-11-4
69
VLČEK, J. Radiologické požadavky na kvalitu balených vod. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2003. s. 35-39. ISBN 80-02-01553-3 VYHLÁŠKA č. 289/2004 Sb., pro nealkoholické nápoje a koncentráty k přípravě nealkoholických nápojů, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny a ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droždí. VYHLÁŠKA č. 293/2006 Sb., kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody VYHLÁŠKA č. 404/2006 Sb., o požadavcích na jakost a zdravotní nezávadnost balených vod a o způsobu jejich úpravy WARBURTON, D.W.; DODDS, K.L.; BURKE, R.; JOHNSTON, M.A.; LAFFEY, P.J. A review of the microbiological quality of bottled water sold in Canada between 1981 and 1989. Canadian Journal of Microbiology, 1992, no. 38, p. 12 – 19 WARBURTON, D.W.; BOWEN, B.; KONKLE, A. The survival and recovery of Pseudomonas aeruginosa and its effect upon salmonellae in water: Methology to test bottled water in Canada. Canadian Journal of Microbiology 1992a, vol. 40,no. 12, p. 987 – 992 WARBURTON, D.; HARRISON, B.; CRAWFORD, C.; FOSTER, R.; FOX, C.; GOUR, L.; KROL, P. A further review of the microbiological quality of bottled water sold in Canada: 1992 – 1997 survey results. International Journal of Food Microbiology, 1998, no. 39, p. 221 - 226 YAMAGUCHI, M.U.; RAMPAZZO. R. de C.P; YAMADA-OGATTA, S.F.; NAKAMURA, C.V.; UEDA-NAKAMURA, T.; DIAS FILHO, B.P. Yeasts and filamentous fungi in bottled mineral water and tap water from municipal supplies. Brazilian Archives Of Biology and Technology, 2007, vol 50, no. 1, p. 1 – 9 ZIKL, P. Watercoolery – co nového. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1999. s. 95 - 96. ISBN 80-02-1269-0 ZIKL, P.; JOHNOVÁ, V. Nové poznatky o watercoolerech. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená vod zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 1997. s. 67 - 70. ISBN 80-02-01134-1 ZIKL, P. Watercoolery – co nového. In: Kožíšek, F. (ed.) Balená voda: zdravotní a hygienická hlediska. Praha: Česká vědeckotechnická vodohospodářská společnost a Státní zdravotní ústav, 2001. s. 87 - 89. ISBN 80–02–01402–2.
70
8. SEZNAM TABULEK Tab. 1
Spotřeba balené vody v ČR v litrech na osobu a rok
10
Tab. 2
Mikrobiologické ukazatele balené vody a vody z veřejného
14
vodovodu Tab. 3
Datum mikrobiologických analýz v průběhu celého skladovacího pokusu
38
Tab. 4
Datum mikrobiologických rozborů vod prošlých přes watercooler
39
Tab. 5
Popis použitých sanitačních přípravků
40
Tab. 6
Výsledky mikrobiologického rozboru barelu na začátku skladovacího pokusu
Tab. 7
47
Průměrné počty mikroorganismů před záruční a po záruční době u barelů skladovaných v různých podmínkách
Tab. 8
Průměrné počty mikroorganismů za celou dobu skladování v různých podmínkách
Tab. 9
48
51
Průměrné počty mikroorganismů ze dna barelů v různých skladovacích Podmínkách
53
Tab. 10 Průměrné počty mikroorganismů ze dna barelů v různých skladovacích Podmínkách
56
Tab. 11 Průměrné počty KTJ při 22 °C a při 36 °C po sedmi dnech používání Watercoolerů
57
Tab. 12 Průměrné hodnoty počtu mikroorganismů po sanitaci přístrojů
58
Tab. 13 Porovnání počtu mikroorganismů ve vzorcích vody z watercoolerů sanitovanými rozdílnými prostředky
58
Tab. 14 Průměrné hodnoty mikroorganismů ze stěrů provedených u přístrojů 16TD
62
71
9. SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ Obr. 1
Koliformní mikroorganismy
15
Obr. 2
Escherichia coli
16
Obr. 3
Enterokoky na membránovém filtru
16
Obr. 4
Pseudomonas aeruginosa
17
Obr. 5
Clostridium perfringens
18
Obr. 6
Kolonie při 22 °C
18
Obr. 7
Kolonie kvasinek
22
Obr. 8
Kolonie plísně
22
Obr. 9
Řasy narostlé na pevné půdě
23
Obr. 10
Schéma watercooleru
32
Obr. 11
Vzhled použitých watercoolerů
37
Obr. 12
Umístění watercoolerů v „nevhodném“ prostředí
38
Obr. 13
Dno barelu
52
Obr. 14
Zelené řasy izolované ze dna barelu
52
Graf 1
Počty KTJ při 22 °C (psychrofily) v balené vodě skladované v různých podmínkách
Graf 2
49
Počty KTJ při 36 °C (mezofily) v balené vodě skladované v různých podmínkách
Graf 3
50
KTJ při 22 °C (psychrofily) ze dna barelů během celé doby skladování za různých podmínek
Graf 4
54
KTJ při 36 °C (mezofily) ze dna barelů během celé doby skladování za různých podmínek
54
Graf 5
Oligotrofní mikroorganismy na dně barelů v průběhu skladování
55
Graf 6
Počty KTJ při 22 °C a při 36 °C bez ohledu na prostředí a přístroj
59
Graf 7
Vliv prostředí na počty KTJ při 22 °C a při 36 °C bez rozlišení přístroje
Graf 8
61
Vliv typu WTC na změny v počtech bakterií v průběhu 3 měsíčního sledování
Graf 9
63
Vliv typu WTC na změny v počtech bakterií v průběhu 3 měsíčního sledování
64
72
SEZNAM PŘÍLOH Tabulka 1:
Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „CHLAD – SVĚTLO“ (KTJ/ml) Tabulka 2: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „CHLAD – TEMNO“ (KTJ/ml) Tabulka 3: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „TEMNO - TEPLO“ (KTJ/ml) Tabulka 4: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „TEPLO – SVĚTLO“ (KTJ/ml) Tabulka 5: Počty mikroorganismů po sanitaci watercoolerů v odebraných vzorcích načepované vody v KTJ/ml Tabulka 6: Porovnání mikrobiologické kvality vzorků z watercoolerů sanitovaných odlišnými prostředky (KTJ/ml) Tabulka 7: Hodnoty ze stěru ze dna zásobní nádržky (provedeno 18.12.2007) (KTJ/ml) Tabulka 8: Počty kolonií při 22 °C a při 36 °C po projití watercoolery umístěnými v různém prostředí v KTJ/ml Tabulka 9: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „CHLAD – SVĚTLO“ (KTJ/ml) Tabulka 10: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „CHLAD - TEMNO“ (KTJ/ml) Tabulka 11: Mikrobiální charakteristika barelů skladovaných v podmínkách „TEMNO – TEPLO“ (KTJ/ml) Tabulka 12: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „TEPLO - SVĚTLO“ (KTJ/ml) Obr. 1 Obr. 2 Obr. 3 Obr. 4 Obr. 5 Obr. 6 – Obr. 10
Počty kolonií při 22 °C z watercooleru Kolonie při 22 °C ze dna barelu Řasy po měsíci skladování v „chladu-světlu“ Barel na konci skladovacího pokusu v podmínkách „chladu-světlu“ Watercoolery použité k pokusu a jejich parametry Různé kolonie plísní izolované z balené vody
73
Tabulka 1: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „CHLAD – SVĚTLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅ Oligotrofní mikroorganismy
∅
DO ZÁRUČNÍ DOBY 2. měsíc 21.8.2007 1500 860 1120 1160 10 0 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 3,3 -
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 3. měsíc 19.9.2007 1920 1900 1730 1850 0 10 20 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 430 250 190 290
74
4. měsíc 24.10.2007 2200 1950 2380 2176,6 10 0 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4380 4700 5640 4906,6
5. měsíc 28.11.2007 3510 3070 3530 3370 10 30 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4130 3110 3330 3523,3
6. měsíc 17.12.2007 1500 800 1600 1300 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 3,3 4120 4860 3530 4170
Tabulka 2: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „CHLAD – TEMNO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅ Oligotrofní mikroorganismy
∅
DO ZÁRUČNÍ DOBY 2. měsíc 21.8.2007 1060 1470 1260 1263,3 0 20 0 6,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 3. měsíc 19.9.2007 1510 1510 950 1323,3 0 10 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 20 10 370 110 450 310
75
4. měsíc 5. měsíc 6. měsíc 24.10.2007 28.11.2007 17.12.2007 2540 1980 3000 2610 2310 3000 2740 2410 4000 2630 2233,3 3333,3 10 0 0 0 0 0 0 0 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 0 10 0 10 10 0 3,3 10 3,3 2150 1990 2930 2570 2510 3170 2860 2750 3790 2526,6 2416,6 3296,6
Tabulka 3: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „TEMNO - TEPLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅ Oligotrofní mikroorganismy
∅
DO ZÁRUČNÍ DOBĚ 2. měsíc 21.8.2007 230 310 360 300 0 0 10 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 3,3 -
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 3. měsíc 19.9.2007 520 550 520 530 0 0 10 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 3,3 230 350 510 363,3
76
4. měsíc 5. měsíc 24.10.2007 28.11.2007 1280 3870 1150 3810 1360 3650 1263,3 3776,6 0 0 0 90 10 0 3,3 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4660 7090 4860 7560 4420 7100 4646,6 7250
6. měsíc 17.12.2007 1000 3000 6000 3333,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4810 4760 4970 4846,6
Tabulka 4: Mikrobiální charakteristika dna barelů skladovaných v podmínkách „TEPLO – SVĚTLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅ Oligotrofní mikroorganismy
∅
DO ZÁRUČNÍ DOBY 2. měsíc 21.8.2007 300 220 120 213,3 0 10 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 3. měsíc 19.9.2007 610 670 730 670 0 10 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 580 390 960 643,3
77
4. měsíc 5. měsíc 6. měsíc 24.10.2007 28.11.2007 17.12.2007 1080 1360 1004 980 1530 1132 930 1080 1068 996,6 5403,3 1068 0 0 0 10 10 10 0 0 0 3,3 3,3 3,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 10 0 10 10 10 3,3 13,3 3,3 1600 2780 3230 1580 1990 3830 1510 2410 4210 1563,3 2393,3 3756,6
Tabulka 5: Počty mikroorganismů po sanitaci watercoolerů v odebraných vzorcích načepované vody v KTJ/ml Barel KTJ při 22 °C ∅ KTJ při 36 °C ∅
896 884 863 881 1 1 1 1
WTC 1 (16L) 22.1.2008 29.1.2008 16400 7020 17840 6800 14640 7120 16293,3 6980 1 6 2 2 1 6 1,3 4,6
WTC 2(16TD) 22.1.2008 29.1.2008 13120 8180 16560 7060 14400 8540 14693,3 7926,6 4 1 3 1 4 3 3,6 1,6
Vodovod 14 11 12 12,3 1 1 0 0,6
Tabulka 6: Porovnání mikrobiologické kvality vzorků z watercoolerů sanitovaných odlišnými prostředky (KTJ/ml)
KTJ při 22 °C ∅ KTJ při 36 °C ∅
DILAC D (18.2.2008) Barel WTC vodovod 796 22880 1 808 24160 2 836 23760 1 813,3 23600 1,3 0 6 0 0 9 0 0 9 0 0 8 0
DOSYL-3-PLUS (26.2.2008) Barel WTC vodovod 3240 28100 6 2900 28600 0 2940 34500 7 3026,6 30400 4,3 1 128 166 0 111 132 0 118 153 0,3 119 150,3
Tabulka 7: Hodnoty ze stěru ze dna zásobní nádržky (provedeno 18.12.2007)(KTJ/ml) ředění 100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅
WTC 2 KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C 47 9 55 11 51 10 15 7 10 3 12,5 5 3 1 3 3 3 2 1 2 5 1 3 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
78
WTC 3 KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C 961 129 1053 119 1007 124 152 96 150 84 151 90 15 10 15 17 15 13,5 3 16 9 11 6 13,5 4 1 1 1 2,5 1 0 0 0 0 0 0
Tabulka 8: Počty kolonií při 22 °C a při 36 °C po projití watercoolery umístěnými v různém prostředí v KTJ/ml
Datum 2.10.07 ∅ 9.10.07 ∅ 16.10.07 ∅ 24.10.07 ∅ 30.10.07 ∅ 13.11.07 ∅
„VHODNÉ“ PROSTŘEDÍ WTC 1 (typ 16L) WTC 2 (typ 16TD) KTJ při 22°C KTJ při 36 °C KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C 547 15 710 59 604 10 617 51 794 23 470 40 648,3 16 599 50 1780 18 1500 40 1870 10 2250 30 1450 10 1850 40 1700 12,6 1866,6 36,6 1090 24 1740 15 1080 38 1450 27 400 36 1640 13 856,6 32,6 1610 18,3 2840 41 1680 31 2670 35 1570 23 2480 29 1710 15 2663,3 35 1653,3 23 4160 184 2630 39 3230 120 910 19 4370 63 3460 25 3920 122,3 2333,3 27,6 5300 26 4100 14 3400 0 3500 48 4500 10 3900 35 4400 12 3833,3 32,3
79
„NEVHODNÉ“ PROSTŘEDÍ WTC 3 (typ 16L) WTC 4 (typ 16TD) KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C KTJ při 22 °C KTJ při 36 °C 388 62 612 15 459 43 488 27 308 36 527 22 385 47 542,3 21,3 1440 190 2540 24 1970 170 2010 35 1340 120 1870 28 1583,3 160 2140 29 970 41 1780 47 710 10 1730 98 780 15 1450 10 820 22 1653,3 51,6 1100 20 2160 21 1630 15 2450 26 1430 18 2870 27 1386,6 17,6 2493,3 24,6 3320 107 2700 14 3780 121 2640 12 1320 238 2510 10 2806,6 155,3 2616,6 12 2900 34 2700 2 2800 107 3300 5 2800 34 3700 11 2833,3 58,3 3233,3 5
Pokračování Tab. 8 20.11.07 ∅ 27.11.07 ∅ 4.12.07 ∅ 11.12.07 ∅ 18.12.07 ∅
3500 2300 1400 2066 13500 10900 12100 12166,6 2400 6500 5200 4700 6400 6600 7900 6966,6 1900 3400 2700 2666,6
61 74 58 64,3 1 0 0 0,3 6 12 12 10 18 20 25 14,3 15 10 13 12,6
1600 2300 1400 1766 18100 13700 15800 15866,6 7400 10600 8600 8866,6 5600 5700 4200 5166,6 2400 1700 2800 2300
123 69 91 94,3 4 1 1 2 47 27 32 25,3 64 38 43 48,3 75 41 67 61
1600 1000 1600 1400 8300 11100 12300 10566,6 4700 3300 2500 3400 6200 4700 5800 5566,6 2200 1600 3100 2300
80
65 104 104 91 2 3 5 3,3 28 46 58 44 12 35 37 28 81 66 78 75
1600 1100 2100 1600 11900 10500 12600 11666,6 8300 7300 6300 7300 7100 8800 8400 8100 400 400 600 466,6
0 3 4 2,3 1 4 3 2,6 2 3 1 2 3 3 4 3,3 1 2 1 1,3
Tabulka 9: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „CHLAD – SVĚTLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅
Barel („start“) 5.6.2007 144 126 98 122,6 1 4 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 3 3,33
DO ZÁRUČNÍ DOBY 1. měsíc 2. měsíc 10.7.2007 14.8.2007 154 440 233 378 144 390 177 402,6 1 0 7 0 0 0 2,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 0 1 0 1,6
81
3. měsíc 18.9.2007 447 473 434 451,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 4. měsíc 5. měsíc 23.10.2007 27.11.2007 258 2240 293 2088 315 2280 288,6 2202,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 3 0 2 1 2,3
6. měsíc 17.12.2007 80 110 30 73,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabulka 10: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „CHLAD - TEMNO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅
Barel („start“) 5.6.2007 144 126 98 122,6 1 4 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 3 3,33
DO ZÁRUČNÍ DOBY 1. měsíc 2. měsíc 10.7.2007 14.8.2007 85 125 118 173 120 186 107,6 161,3 0 1 1 2 0 0 0,3 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1
82
3. měsíc 18.9.2007 104 128 118 116,6 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 2
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 4. měsíc 5. měsíc 23.10.2007 27.11.2007 256 2168 289 1888 328 1712 291 1922,6 0 0 1 0 1 1 0,6 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0,6 0
6. měsíc 17.12.2007 270 180 210 220 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3
Tabulka 11: Mikrobiální charakteristika barelů skladovaných v podmínkách „TEMNO – TEPLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅
Barel („start“) 5.6.2007 144 126 98 122,6 1 4 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 3 3,33
DO ZÁRUČNÍ DOBY 1. měsíc 2. měsíc 10.7.2007 14.8.2007 189 239 335 386 131 293 218,3 306 1 1 1 0 1 0 1 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0,3
83
3. měsíc 18.9.2007 67 54 58 59,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 4. měsíc 5. měsíc 23.10.2007 23.10.2007 186 4168 153 3912 181 3960 173,3 4013,3 0 0 1 0 1 0 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 3 9 1 10 1,33 10
6. měsíc 17.12.2007 420 350 210 326,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0,6
Tabulka 12: Mikrobiální charakteristika barelů ve skladovacích podmínkách „TEPLO - SVĚTLO“ (KTJ/ml)
Kolonie při 22 °C
∅ Kolonie při 36 °C
∅ Koliformní mikroorganismy
∅ Enterokoky
∅ Pseudomonas aeruginosa
∅ Clostridium perfringens
∅ Kvasinky, plísně
∅
Barel („start“) 5.6.2007 144 126 98 122,6 1 4 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 3 3,33
DO ZÁRUČNÍ DOBY 1. měsíc 2. měsíc 10.7.2007 14.8.2007 177 880 175 672 202 770 184,6 774 1 1 2 2 1 0 1,33 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 6 0 2 0 4,6
84
3. měsíc 18.9.2007 167 240 183 196,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0,6
PO ZÁRUČNÍ DOBĚ 4. měsíc 5. měsíc 23.10.2007 23.10.2007 69 2144 92 2512 92 1128 84,3 1928 0 0 0 0 0 2 0 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 0 9 0,3 4,3
6. měsíc 17.12.2007 360 290 260 303,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 5 11 8,6
Obr. 1 Počty kolonií při 22 °C z watercooleru
Obr. 2 Kolonie při 22 °C ze dna barelu
Obr. 3 Řasy po měsíci skladování v „chladu-světlu“
85
Obr. 4 Barel na konci skladovacího pokusu v podmínkách „chladu-světlu“
Obr. 5 Watercoolery použité k pokusu a jejich parametry
86
Obr. 6 – 10 Různé kolonie plísní izolované z balené vody Obr. 6
Obr. 7
Obr. 8
Obr. 9
Obr. 10
87
