Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikrobiální kontaminace a její eliminace při výrobě nápojů Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.
Vypracovala: Daniela Gajdíková Brno 2010
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma MIKROBIÁLNÍ KONTAMINACE A JEJÍ ELIMINACE PŘI VÝROBĚ NÁPOJŮ vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………………. podpis autora …………………………….
Poděkování
Chtěla bych tímto způsobem poděkovat panu Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za jeho cenné rady, připomínky, návrhy, pomoc a konzultační hodiny věnované dokončení mé bakalářské práce.
Abstrakt
Bakalářská práce je zaměřena na charakteristiku mikroorganismů vyskytujících se při výrobě nealkoholických nápojů, piva a vína. Poukazuje na nežádoucí účinky mikroorganismů v nápojařském průmyslu a na problémy při výrobě a následném skladování výše jmenovaných nápojů. Část práce je věnována obecnému popisu mikroorganismů, jejich nárokům na výživu, prostředí atd. Praktická část srovnává mikrobiální kontaminaci při velkovýrobě a malovýrobě vína. Z výsledků získáme představu o úrovni hygieny a čistoty při výrobě vína.
Klíčové slova: mikroorganismy, nealkoholické nápoje, pivo, víno
Abstract This bachelor thesis focuses on the characteristics of microorganisms occurring in the manufacture of soft drinks, beer and wine. It points out the adverse effects of microorganisms in the beverage industry, the problems in the manufacture and subsequent storage of the above-mentioned beverages. One part is devoted to a general description of micro-organisms demands on nutrition, environment, etc. Practical part compares the microbial contamination during large-scale and small-scale production of wine. The results give us an insight of the level of hygiene and cleanliness in wine-making process.
Key words: microorganisms, soft drinks, beer, wine
OBSAH 1
ÚVOD .................................................................................................................................. 6
2
CÍL PRÁCE ........................................................................................................................ 7
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................................................... 8 3.1 Bakterie ............................................................................................................................. 8 3.2 Kvasinky............................................................................................................................ 8 3.3 Plísně.................................................................................................................................. 9 3.4 Rozdělení mikroorganismů podle fyziologických vlastností....................................... 11 3.5 Ochrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů.................................................... 13 3.5.1 Vylučování mikroorganismů z prostředí ..................................................................... 13 3.6 Nealkoholické nápoje ..................................................................................................... 15 3.6.1 Suroviny....................................................................................................................... 15 3.6.2 Mikrobiologická stabilita nápojů ................................................................................. 15 3.6.3 Filtrace nealkoholických nápojů .................................................................................. 16 3.6.4 Zdroje mikrobiální kontaminace nealkoholických nápojů........................................... 16 3.6.5 Ukazatele jakosti pitné a teplé vody a jejich hygienické limity................................... 17 3.6.6 Mikrobiální vady nealkoholických nápojů .................................................................. 18 3.7 Pivo .................................................................................................................................. 19 3.7.1 Suroviny....................................................................................................................... 19 3.7.2 Vaření piva a chlazení mladiny ................................................................................... 19 3.7.3 Kontaminace hlavního kvašení a piva ......................................................................... 19 3.7.4 Pivní nebo-li kulturní kvasinky................................................................................... 20 3.7.5 Cizí kvasinky ............................................................................................................... 20 3.7.6 Bakterie........................................................................................................................ 20 3.7.7 Plísně ........................................................................................................................... 22 3.7.8 Kvašení piva ................................................................................................................ 22 3.7.9 Dokvašení, filtrace a stáčení piva ................................................................................ 23 3.7.10 Kažení piva.............................................................................................................. 23 3.7.11 Rozdělení nežádoucích mikroorganismů ................................................................ 24 3.8 Víno.................................................................................................................................. 25 3.8.1 Suroviny....................................................................................................................... 25 3.8.2 Složení přirozené kvasinkové mikroflóry .................................................................... 25 3.8.3 Množení kvasinek........................................................................................................ 26 3.8.4 Čisté kultury kvasinek ................................................................................................. 26 3.8.5 Kvašení vína ................................................................................................................ 27 3.8.6 Ošetřování vín.............................................................................................................. 28 3.8.7 Prostředí závodu .......................................................................................................... 29 3.8.8 Mikroflóra hotového výrobku...................................................................................... 29 3.8.9 Nedostatky a vady vín způsobené mikroorganismy .................................................... 30
4
PRAKTICKÁ ČÁST........................................................................................................ 34 4.1 Metodika ......................................................................................................................... 34 4.1.1 Stanovení mikroorganismů .......................................................................................... 34 4.1.2 Příprava laboratorních pomůcek .................................................................................. 34 4.2 Charakteristika materiálu ............................................................................................. 34 4.2.1 Příprava a zpracování vzorku ...................................................................................... 34 4.3 Živné půdy ...................................................................................................................... 35 4.3.1 Postup při vaření živných půd ..................................................................................... 35 4.4 Vyjádření výsledků zkoušky.......................................................................................... 36
5
VÝSLEDKY A DISKUZE............................................................................................... 37 5.1
Závěr................................................................................................................................ 37
6
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................................ 38
7
PŘÍLOHA ......................................................................................................................... 40
1
ÚVOD Dostatek tekutiny je základní podmínkou pro přežití všech živých organismů.
Denní příjem tekutin by se u člověka měl pohybovat v rozmezí 1500 ml až 3000 ml. Velkou část z denního příjmu tekutin tvoří nealkoholické nápoje především voda a slazené limonády. Dalšími velmi významnými i když alkoholickými nápoji jsou pivo a víno. V České republice jsou tyto nápoje velmi oblíbené. Pivo je nejkonzumovanější alkoholický nápoj na našem území. Je známé a vyhledávané po celém světě. Česká republika dokonce používá národně chráněné zeměpisné označení pro „české pivo“. Neméně oblíbeným alkoholickým nápojem je víno. Ke značnému rozšíření vinic došlo na našem území v období Velkomoravské říše, během 9. až 10. století našeho letopočtu. S Velkomoravskou říší jsou spjaty též počátky českého vinařství (KRAUS a kol., 2005). Z tohoto vyplývá, že pěstování révy a výroba vína má na našem území velmi dlouhou tradici a je hojně vyhledáváno konzumenty. S výše uvedenými nápoji se setkáváme na každém kroku a často je konzumujeme. Proto je tato práce věnována problematice mikrobiální kontaminace během výroby, skladování nápojů a nejběžnějším způsobům eliminace této kontaminace. Hlavními kontaminanty, které mohou znehodnotit tyto nápoje již během výroby a dále jako hotové výrobky, jsou mikroorganismy. Způsobují různé vady a nedostatky, jenž mohou být problémem nejen při výrobě, skladování ale i distribuci. Nápoje, které byly kontaminovány určitými mikroorganismy, nemohou být použity ke konzumaci kvůli nebezpečí vzniku alimentárního onemocnění u konzumentů.
6
2
CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo se zaměřit na mikroorganismy, které mohou
kontaminovat nealkoholické nápoje, pivo a víno v různých fázích výroby a znehodnotit je. Práce pojednává i o eliminaci těchto mikroorganismů během celého výrobního procesu a následném skladování nápojů.
7
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Bakterie Bakterie jsou jednobuněčné, prokaryotní mikroorganismy, které se vyznačují některými společnými znaky, ale mohou se lišit morfologicky (ŠILHÁNKOVÁ, 1995). V přírodě nalezneme bakterie v každém prostředí, kde jsou pro jejich přežití vhodné podmínky. Vyskytují se v aerobním i anaerobní prostředí, v půdě, ve sladké i slané vodě a v jiných organismech (BETINA a NEMEC, 1977). V potravinářském i kvasném průmyslu má činnost bakterií mimořádně vysoký negativní dopad. Je to způsobené především jejich obrovskou rychlostí rozmnožování a intenzitou metabolismu, které jim umožňují za vhodného pH, teploty a dostatečného množství vody rozložit – a tedy úplně znehodnotit – značné množství substrátu. Vzhledem k neobyčejně vysoké rychlosti rozmnožování vytlačují bakterie za vhodného pH (tj. kolem neutrálního bodu) a vhodné vlhkosti prostředí kvasinky a plísně, které se rozmnožují pomaleji. Eukaryotní mikroorganismy tedy mohou konkurovat bakteriím pouze v kyselých potravinách nebo za snížení vodní aktivity, případně za velmi nízkých teplot (-5 až -10 oC), kdy se činnost psychrofilních bakterií zastavuje (ŠROUBKOVÁ, 1996).
3.2 Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Rozeznáváme čtyři základní skupiny kvasinek: •
kvasinky patřící mezi askomycety, schopné tvořit askospory v tzv. asku
•
kvasinky patřící mezi bazidiomycety,
•
kvasinky zařazené do č. Sporobolomycetacea, které se speciálním způsobem „odstřelují“ spóry zvané balistospory
8
•
asporogenní kvasinky, neschopné tvořit askospory, balistospory a spory vůbec, protože u nich neznáme pohlavní rozmnožování zařazujeme je mezi Fungi imperfecti (BETINA a NEMEC, 1977) Kvasinky a kvasinkovité organismy jsou v přírodě velmi rozšířené. Šíří se
různými přenašeči, zvláště hmyzem, větrem apod. (ŠROUBKOVÁ, 1996). Na povrchu měkkého ovoce převládají hlavně kvasné typy (Saccharomyces, Saccharomycodes a Kloeckera) (ŠROUBKOVÁ, 1996). Rozmnožování kvasinek je podmíněno jejich fyziologickými vlastnostmi, tj. potřebou cukru, odolností ke kyselému prostředí, u některých druhů též tolerancí k vysokému osmotickému tlaku. Je omezeno jejich neschopností štěpit bílkoviny. Rovněž jejich nízká tepelná odolnost ovlivňuje výskyt kvasinek. Většina kvasinek je usmrcena již při 2 až 4 minutovém zahřívání na 56 oC. Rozmnožování většiny kvasinek je úplně potlačeno při teplotě 38 oC (ŠROUBKOVÁ, 1996). Kvasinky se rozmnožují mnohem pomaleji než bakterie, a proto s nimi mohou soupeřit jenom za podmínek, které jsou pro bakterie nepříznivé. Z těchto důvodů se kvasinky uplatňují hlavně při kažení ovocných moštů, slazených limonád a slazených kyselých minerálních vod. Kontaminace cizími kvasinkami má negativní vliv také v drožďárenství, kde nepříznivě ovlivňuje kvasné schopnosti a trvanlivost pekařského droždí, v pivovarnictví a vinařství, kde může nepříznivě ovlivňovat chuť výrobku. Hlavní průmyslový význam kvasinek spočívá v jejich využití pro výrobu alkoholických nápojů a pekařského a krmného droždí (ŠROUBKOVÁ, 1996).
3.3 Plísně Jako plísně označujeme mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Podle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování náleží technicky důležité plísně do těchto taxonomických jednotek (ŠILHÁNKOVÁ, 2008): •
do třídy Zygomycotina a je charakterizována jednobuněčným, tj. nepřehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním s tvorbou tzv. zygospor; nepohlavní rozmnožování se děje tzv. endosporami.
•
do podkmenu Ascomycotina, charakterizováno přehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním za tvorby askospor tvořených v asku; nepohlavní rozmnožování nastává exosporami. 9
•
do podkmenu Deuteromycota (Fungi imperfecti, tj. houby nedokonalé, přesněji nedokonale známé) s přehrádkovaným myceliem, avšak pouze s nepohlavním rozmnožováním (pomocí exospor) (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
Houby se v přírodě vyskytují na nejrozmanitějších substrátech. Některé jsou vodní a vyskytují se ve sladkých vodách nebo v mořích. Většina hub se vyskytuje na vlhkých místech na zemi, i když některé z nich snášejí i sušší podmínky. Všechny houby jsou chemoheterotrofní, tudíž nemůžou žít bez přítomnosti organických zdrojů uhlíku (BETINA a NEMEC, 1977). Význam plísní je dán jejich fyziologickými vlastnostmi. Vzhledem k přísně aerobní povaze se mohou rozmnožovat většinou jen na povrchu napadeného materiálu. Široké enzymové vybavení umožňuje plísním rozkládat nejrůznější organický materiál. Protože plísně mají schopnost využívat vzdušnou vlhkost, napadají různé materiály, jsou-li uložené ve vlhkém prostředí. Plísně jsou schopny se rozmnožovat také za poměrně nízké vlhkosti prostředí. Řada plísní se může v napadených potravinách nebo jejich surovinách rozvíjet ještě při 15 % obsahu vody, zatímco většina bakterií a kvasinek potřebuje pro svůj rozvoj alespoň 30 % obsah vody. Schopnost rozmnožovat se i za velmi nízkého pH umožňuje plísním se uplatňovat i tam, kde většina bakterií již není schopna metabolismu. Protože některé plísně rostou i za velmi nízké teploty (dokonce i při -10 oC) způsobují ztráty i při dlouhodobém skladování potravin a jejich surovin (ŠROUBKOVÁ, 1996). Mimořádně vysoký negativní význam mají plísně z hlediska tvorby mykotoxinů. Některé plísně, např. některé aspergily, jsou patogenní pro člověka nebo zvířata, jiné vyvolávají alergické reakce u citlivých jedinců (ŠROUBKOVÁ, 1996).
10
3.4 Rozdělení mikroorganismů podle fyziologických vlastností Podle nároků na výživu •
Autotrofní, kterým k výživě stačí pouze anorganické sloučeniny. Přítomnost organických
sloučenin
často
inhibuje
jejich
rozmnožování.
Tyto
mikroorganismy jsou schopny syntetizovat všechny složky své buněčné hmoty z anorganických sloučenin (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). •
Heterotrofní, které vyžadují přítomnost organických sloučenin v živném prostředí, ať už jako uhlíku, vodíku nebo energie; patří sem kvasinky, plísně a většina bakterií. Dále rozdělujeme na prototrofní, kterým stačí k výživě jednoduché organické uhlíkaté sloučeniny, a na auxotrofní, které kromě toho vyžadují některé složité sloučeniny (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
Podle nároků na kyslík •
Aerobní, které vyžadují vzdušný kyslík, neboť mají vyvinutý jenom aerobní metabolismus; patří sem např. plísně, octové bakterie (rod Acetobacter) některé hnilobné bakterie a některé kvasinky (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
•
Anaerobní, které nevyžadují vzdušný kyslík, neboť mají pouze anaerobní metabolismus; vzdušný kyslík na ně působí inhibičně nebo dokonce toxicky.
•
Mikroaerofilní, které mají anaerobní metabolismus, avšak nízké koncentrace kyslíku urychlují jejich rozmnožování; např. mléčné bakterie (rod Lactobacillus) (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
•
Fakultativně anaerobní, které mají schopnost aerobního a anaerobního metabolismu, takže mohou růst za přítomnosti i nepřítomnosti vzdušného kyslíku (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
Podle způsobu získávání energie a) Fototrofní mikroorganismy, jejichž zdrojem energie je přeměna světelné energie v energii chemickou, která je pak využitelná pro životní pochody buňky. Fototrofní mikroorganismy syntetizují buněčnou hmotu z anorganických živin a oxidu uhličitého, k jehož redukci používají různé sloučeniny (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
11
Podle toho rozeznáváme: •
Fotoautotrofní mikroorganismy, jimž vodík pro redukci oxidu uhličitého poskytují anorganické sloučeniny, takže jde o autotrofní mikroorganismy (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
•
Fotoheterotrofní mikroorganismy, jimž slouží organické sloučeniny jako zdroj vodíku pro redukci oxidu uhličitého a taky jako zdroj uhlíku (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
b) Chemotrofní mikroorganismy získávají energii oxidací chemických sloučenin. Rozdělujeme je do těchto skupin: •
Chemoautotrofní
mikroorganismy,
získávající
energii
oxidací
anorganických sloučenin. Jsou to většinou aerobní autotrofní bakterie (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). •
Chemoheterotrofní
mikroorganismy
získávající
energii
oxidací
organických sloučenin, jichž využívají také jako zdroje uhlíku, vodíku a většinou i kyslíku k syntéze své buněčné hmoty. Do této skupiny patří kvasinky, plísně a většina bakterii (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Podle vztahu k teplotě Podle vztahu k teplotě rozdělujeme mikroorganismy do tří hlavních skupin: •
Psychrofilní mikroorganismy mají optimální teplotu nižší než 20 oC a rostou ještě poměrně intenzivně při teplotě 0 oC až 5 oC. Některé z těchto mikroorganismů (např. některé plísně) jsou schopny pomalého růstu ještě při -10
o
C. Z potravinářského hlediska jsou důležité tzv. psychrotrofní
mikroorganismy, tj. takové, které se rozmnožují rychle při teplotách 0 oC až +10 oC bez ohledu na jejich optimální teplotu; k psychrotrofním bakteriím patří hlavně příslušníci rodu Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium aj. (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). •
Mezofilní mikroorganismy mají minimální teplotu vyšší než 5
o
C a
optimální teplotu nižší než 45 oC; představují většinu mikroorganismů. U bakterií se optimální teplota pohybuje nejčastěji kolem 37 oC, u kvasinek a plísní kolem 30 oC (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
12
•
Termofilní mikroorganismy mají optimální teplotu růstu 45 oC nebo vyšší; pro růst většiny z nich je optimální teplota 50 oC až 60 oC, pro některé dokonce ještě vyšší. Termofilní bakterie mají své zástupce mezi rody Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, mezi aktinomycetami i v některých jiných rodech (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
3.5 Ochrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů Intenzita nebo rychlost mikrobiálního kažení (R) přímo závisí na virulenci a počtu mikrobů a nepřímo na odolnosti prostředí (INGR, 2007).
Schematicky : R = Počet mikrobů * Virulence Odolnost prostředí
Je-li hodnota ve jmenovateli vyšší než v čitateli, může být rozklad pomalý, neznatelný nebo k němu nedojde (ŠROUBKOVÁ, 1996). Praktické konzervační metody pracují tak, že zmenšují nebo úplně potlačují činitele v čitateli, nebo naopak posilují činitele ve jmenovateli (ŠROUBKOVÁ, 1996). Praktické způsoby konzervace můžeme tedy rozdělit takto:
3.5.1
•
Vylučování mikrobů z prostředí
•
Přímá inaktivace mikrobů
•
Nepřímá inaktivace mikrobů (ŠROUBKOVÁ, 1996).
Vylučování mikroorganismů z prostředí
Omezování kontaminace potravin mikroby Začíná čistotou místností. Při dobrém hygienickém stavu po bílení, mělo by na 1 cm2 povrchu stěn a stropů být méně než 100 mikrobů (ŠROUBKOVÁ, 1996). Čistota nářadí vyžaduje omývání hygienicky nezávadnou vodou a přísadou činidel usnadňujících odplavování nečistot a desinfikujících. Pokud je to možné, žíháme kovové předměty, sterilujeme proudící párou a sklo myjeme horkou vodou (ŠROUBKOVÁ, 1996). Mikrobiologická čistota vzduchu je v potravinářském provozu technicky nejobtížněji kontrolovatelným činitelem. Je třeba zabránit proudění vzduchu a vzduch
13
udržovat pokud možno vlhký. Kde je to nutné nebo možné použít čistící filtry (ŠROUBKOVÁ, 1996). Voda používaná při zpracování potravin má být pitná. Voda se dezinfikuje chlorem, při menším množství nebo nouzově pomocí preparátů obsahujících koloidně rozptýlené stříbro (ŠROUBKOVÁ, 1996). Potraviny mohou kontaminovat i vedlejší suroviny, které se sami nekazí, ale mohou být nositely zvlášť odolných mikrobů (cukr, sůl, koření) (ŠROUBKOVÁ, 1996). Ochuzování potravin o mikroby během zpracování Dochází k němu při mechanickém způsobu odstraňování nečistot, kalů, a pevných částic, na nichž mikroby ulpívají (ŠROUBKOVÁ, 1996). Úplné vylučování mikrobů z potravin Uskutečňuje se u kapalin jako mikrobiální filtrace, nebo jako tzv. bactofugace. Zpracovávaná kapalina se vede filtrem, kde se zachytí mikroby a pak dále sterilním potrubím do sterilních nádob. Do lahví se filtrát stáčí teprve před expedicí. Expedovat se může až po inkubační době (ŠROUBKOVÁ, 1996). Odstředivá separace mikrobů – bactofugace, využívá rozdílů hustoty kapaliny a hustoty mikrobiálních spor v kapalině obsažených (ŠROUBKOVÁ, 1996). Chemická konzervace – chemoanabioza Přídavkem chemické látky potlačíme v potravině rozvoj mikroorganismů. Oxid siřičitý se používá ke konzervaci šťáv, moštů, marmelád, vín, kečupů a protlaků. Ethanol je nejúčinnější v koncentraci asi 76 %. Koncentrovanější alkohol vysušuje mikroby a činí je odolnějšími. Organické kyseliny, získané hlavně fermentační činností, kyselina citrónová, vinná, jablečná, octová a mléčná, mohou ochránit potraviny před rozkladem za určitých podmínek na určitou dobu (ŠROUBKOVÁ, 1996). Konzervace biologickými zásahy Běžně se uplatňují dva druhy biologické konzervace, a to konzervace alkoholovým (etanolovým) a mléčným kvašením (ŠROUBKOVÁ, 1996).
14
3.6 Nealkoholické nápoje 3.6.1
Suroviny Základní surovinou pro výrobu nápojů je voda, jejíž obsah u některých druhů
nealkoholických nápojů činí až 98 %. Zásadní podmínkou pro možnost použití určité vody k výrobě nealkoholických nápojů je její zdravotní nezávadnost, zajišťující, že voda nebude ani po delším požívání příčinou zdravotních poruch nebo onemocnění (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989). Před sycením se filtruje, aby se odstranily nečistoty z potrubí. Na používaný oxid uhličitý nejsou mikrobiologické požadavky, musí být bez chuti a zápachu. Cukr musí být mikrobiologicky vyhovující. Sirupy se připravují rozpuštěním cukru ve vroucí vodě a přidáním sukusu, tj. neslazené konzervované ovocné šťávy nebo extraktu. Sirup je pro mikroorganismy nevhodným prostředím, protože má vysoký osmotický tlak. Mohou se kontaminovat pouze ve dvou případech: pokud se nedostatečně převaří sirup a použijí se kontaminované suroviny. Potom se v sirupech mohou objevovat plísně, kvasinky i koliformní bakterie; druhý případ je sekundární kontaminace sirupů nečistými obaly. Sirupy většinou mikrobiologicky vyhovují. Mohou se vyskytovat slizotvorné mikroorganismy. Při dotyku očkem nebo jehlou se vytvářejí vlákna slizu, která se táhnou (ARPAI a BARTL, 1977). 3.6.2
Mikrobiologická stabilita nápojů Ovocné a zeleninové šťávy a výrobky z nich podléhají mikrobiálnímu kažení, a
proto je trvanlivost nealkoholických nápojů závislá na kvalitě a kvantitě přítomné mikroflóry. V nealkoholických nápojích, s výjimkou minerálních vod bez příchuti a sodové vody, se mohou vyskytovat, vzhled k nízkým hodnotám pH (2,5 – 3,8) pouze acidorezistetní mikroorganismy, zejména plísně, kvasinky, bakterie octového a mléčného kvašení. U nápojů syceným oxidem uhličitým je třeba počítat s kvasinkami a fakultativně anaerobními bakteriemi mléčného kvašení (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
15
3.6.3
Filtrace nealkoholických nápojů Při výrobě ovocných nebo révových moštů lze použít filtrace při čiření
vylisovaného moštu a při konečné úpravě moštu, popř. biologicky účinné filtrace, při plnění moštů za studena do sterilních nádob nebo lahví. Pokud se filtrují příliš kalné mošty, je nutné mošt nejprve zfiltrovat deskovými filtry s nižšími čísly desek nebo naplavovacími filtry, popř. používat stupňové filtrace (ŠAUER a KUTTELVAŠER, 1966). Výsledky biologicky účinné filtrace jsou u nealkoholických nápojů mnohem horších než při biologicky účinné filtraci vín, kde příznivě působí i vyšší obsah alkoholu (ŠAUER a KUTTELVAŠER, 1966). 3.6.4
Zdroje mikrobiální kontaminace nealkoholických nápojů Trvanlivost a mikrobiologická jakost hotových nápojů závisí do značné míry na
mikrobiologické jakosti použitých surovin. Jedním ze základní zdrojů kontaminace nápojů mikroorganismy jsou suroviny (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989): •
Voda musí být mikrobiologicky nezávadná a vyhovující normě pro pitnou vodu (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
•
Oxid uhličitý jako zdroj kontaminace nepřichází v úvahu (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
•
Krystalický cukr může obsahovat až 200 mikroorganismů v 1 g. Nesmí obsahovat koliformní mikroorganismy a mikroflóru, která by mohla způsobit škodlivě v nápojích, především termofilní sporotvorné aeroby i anaeroby a slizotvorné mikroorganismy, např. Leuconostoc a kvasinky (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
•
Ovocné šťávy pro jejichž kontaminaci připadají v úvahu plísně (Penicillium, Aspergillus, Cladosporium aj.), kvasinky rodu Saccharomyces a Candida a bakterie mléčného kvašení (Leuconostoc, Lactobacillus) a v případě zkvašení i bakterie octového kvašení (rod Acetobacter) (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
•
Sirupy připravované za horka svařením s cukrem mají počet mikroorganismů velmi nízký. Vzhledem k vysokému osmotickému tlaku jsou sirupy pro většinu mikroorganismů nevhodným prostředím, s výjimkou osmofilních druhů (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
16
3.6.5
Ukazatele jakosti pitné a teplé vody a jejich hygienické limity Pitné vody musí mít takové fyzikálně-chemické vlastnosti, které nepředstavují
ohrožení veřejného zdraví. Pitná a teplá voda nesmí obsahovat mikroorganismy, parazity a látky jakéhokoliv druhu v počtu nebo koncentraci, které by mohly ohrozit veřejné zdraví. Ukazatele jakosti pitné vody a hygienické limity jsou uvedeny v tabulce č. 1 (252/2004 Sb. hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost kontrol). Tab. 1 Mikrobiologické a biologické ukazatele (252/2004 Sb. hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost kontrol) Ukazatel
Jednotka
Limit
Typ limitu
Vysvětlivky
Clostridium
KJT/100 ml
0
MH
1
KJT/100 ml
0
NMH
KJT/250 ml
0
NMH
KJT/100 ml
0
NMH
KJT/250 ml
0
NMH
KJT/100 ml
0
MH
%
10
MH
3
Jedinci/ml
50
MH
3,4
Jedinci/ml
0
MH
3,4,5
Počty kolonií při KJT/ml
200
MH
6
22 oC
100
NMH
2
Počty kolonií při KJT/ml
20
MH
7
36 oC
20
NMH
2
perfringens Enterokoky
Escherichia coli
Koliformní
2
2
bakterie Mikroskopický obraz
–
abioseston Mikroskopický obraz – počet mikroorganismů Mikroskopický obraz
–
živé
organismy
KJT/ml
KJT/ml
Použité zkratky: KJT – kolonie tvořící jednotky
NMH – nejvyšší mezní hodnota
MH – mezní hodnota
Vysvětlivky k tabulkám: viz příloha č. 1
17
3.6.6
Mikrobiální vady nealkoholických nápojů
Vady nealkoholických nápojů způsobené kvasinkami Kvašení nápojů, vyvolanné kvasinkami, je spojeno se snížením obsahu cukru, zvýšením obsahu oxidu uhličitého a zvýšením obsahu ethanolu. Při rozvoji kvasinek mohou vznikat produkty nepříjemné chuti a pachu. Při pomnožení kvasinek může dojít ke vzniku zákalu a usazeniny. Kalné nápoje se mohou vyčířit. Nápoje se znaky kvašení jsou nepoživatelné, dodatečná možnost odstranění této vady neexistuje (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989). Vady nápojů způsobené bakteriemi mléčného a octového kvašení V oblasti nízkých hodnot pH, které jsou v nealkoholických nápojích, se mohou vyvíjet bakterie mléčného nebo octového kvašení, jenž jsou anaerobní. V nápoji dojde k nepříznivým chuťovým změnách v důsledku poklesu obsahu cukru a zvýšení kyselosti. Nebezpečným kontaminantem je Leuconostoc mesenteroides, jenž se vytváří slizové kolonie způsobující v důsledku tvorby slizu houstnutí nápojů (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989). Vady nápojů způsobené rozvojem plísní Spory plísní vypučí v krátká nebo delší vlákna, která lze v nápoji postřehnout. Mycelium plísní se v nápoji rozrůstá obvykle za anaerobních podmínek a dodává mu lékárenskou nebo fenolovou příchuť nebo pach (HRUDKOVÁ, MARKVART a kol., 1989).
18
3.7 Pivo 3.7.1
Suroviny Význam surovin používaných na vaření piva je z mikrobiologického hlediska
téměř nulový. Suroviny mají význam jen jako zdroj kontaminovaného prachu. Významnou pivovarskou surovinou je voda, která z mikrobiologického hlediska musí odpovídat požadavkům na pitnou vodu (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.2
Vaření piva a chlazení mladiny Při vaření se likviduje všechna mikroflóra přítomná v surovinách s výjimkou
sporulujících bakterií, např. Bacillus subtilus a Clostridium, jejichž spory mohou přežívat a dostat se až do mladiny. Tam však nenacházejí vhodné podmínky pro růst: navíc jejich vegetativní buňky jsou citlivé na chmelové látky. Čerstvě vyrobená mladina je prakticky sterilní. Dostatek cukru vytváří vhodné podmínky na rozmnožování nežádoucí mikroflóry. Při stáčení se může mladina kontaminovat. Technicky je nemožné dosáhnout sterility mladiny. Kontaminace se musí omezit na únosnou míru (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.3
Kontaminace hlavního kvašení a piva V mladině a pivě může růst několik druhů laktobacilů. Při vrchním kvašení se
vyskytuje zejména Lactobacillus pastorianus, kdež to L. brevis se vyskytuje převážně při spodním kvašení. Laktobacily rostou ve formě dlouhých grampozitivních tyčinek. V mladině a pivě se vyskytují laktobacily, které v podstatě patří ke stejným druhům jako ve víně, tj. Lactobacillus brevis, L. buchneri, L. plantarum (ARPAI a BARTL, 1977). Nežádoucí jsou tzv. pivní sarcíny, přesně Pediococcus cerevisiae. Jsou to původci změn, při kterých pivo dostává charakteristickou nepříjemnou chuť, případně i zákal. Pediococcus roste v neutrálním prostředí ve formě diplokoků, v kyselém prostředí v typických tetrádách nesprávně nazývané sarciny (ARPAI a BARTL, 1977). Mladina nebo pivo uložené v otevřených kádích nebo nádobách se kontaminuje octovými bakteriemi především Acetobacter pasterianus, případně i A. aceti, Gluconobacter oxydans subs. melanogenes. Octové bakterie jsou přítomny v každé
19
mladině před zakvašováním, postupující fermentační proces jim nedovoluje, aby se rozmnožovaly (ARPAI a BARTL, 1977). Kontaminace koliformními bakteriemi se objevuje v mladině už při chlazení. Během chlazení mladiny se mohou dále rozmnožovat. Mírná kontaminace koliformními bakteriemi je neškodná, ale velká může zapříčinit „celerovou“ nebo „fenolovou“ příchuť piva. Výskyt koliformních bakterií se omezuje hlavně přísným dodržováním sanitačních postupů, používání dezinfekčních prostředků a používáním čistých pivních kvasinek (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.4
Pivní nebo-li kulturní kvasinky Při výrobě piva se používají dva kvasničné druhy: Saccharomyces cerevisiae
(kvasinky svrchního kvašení) a Saccharomyces carlbergensis (dnes pouze S. cerevisiae subs. uvarum) (kvasinky spodního kvašení) (ŠAVEL, 1980). Čisté kultury pivních kvasinek Sacharomyces carlsbergensis jsou označovány jako kulturní kvasinky, všechny ostatní jako divoké. Kvasinky jsou velmi citlivé na kontaminaci. Příčinou kontaminace pivních kvasinek jsou nečistoty z prostředí a nádob. Je třeba se soustředit hlavně na koliformní bakterie jako hlavní ukazatel kontaminace (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.5
Cizí kvasinky Cizí kvasinky se vyskytují prakticky všude v pivovarnickém provozu.
Za nejnebezpečnější kvasinkovitou kontaminaci piva se považuje Saccharomyces diastaticus. Tvoří kulaté nebo oválné buňky, které se mohou zaměnit za kulturní kmeny. Tento mikroorganismus zkvašuje dextriny v pivě, a tudíž se může pomnožit i v pivě dobře prokvašeném. Kontaminované pivo se rychle kazí za tvorby hrubé nebo i jemné kvasničné sedliny na dně láhve (ŠAVEL, 1980). 3.7.6
Bakterie Pivo není příznivé prostředí pro množení bakterií. Nízké pH, anaerobní
podmínky, hořké látky a ethanol omezují růst mnoha bakterií. Vyskytují se bakterie rodu Micrococcus a Sarcina (ŠAVEL, 1980). Bakterie rodu Micrococcus jsou aerobní až fakultativně anaerobní koky, tvořící krátké řetízky a nepravidelné shluky. Tvoří hladké, lesklé kolonie (ŠAVEL, 1980). Rod Sarcina se vyznačuje tvorbou tzv. sarcin (balíčků); jsou to pravidelné skupiny osmi buněk, vznikající dělením ve třech rovinách na sebe kolmých. Jsou to 20
aerobní až mikroaerofilní bakterie, často tvořící na běžných půdách žluté, oranžové i červené pigmenty. Vyskytují se jako běžná kontaminace vzduchu (ŠAVEL, 1980). V pivě se tyto bakterie nemohou pomnožovat, jelikož většina z nich je citlivá na hořké látky. (ŠAVEL, 1980 ) Mladinové bakterie Názvem mladinové bakterie se souhrnně označuje skupina bakterií vyskytujících se většinou ve zchlazené mladině v hojném počtu. Jsou to gramnegativní tyčinky náležící do čeledi Enterobacteriaceae (ŠAVEL, 1980). Bakterie z čeledi Enterobacteriaceae jsou krátké, pohyblivé nebo nepohyblivé, nesporolující tyčinky. Jsou aerobní až fakultativně anaerobní, redukují dusičnany na dusitany a produkují katalázu. Zkvašují glukosu, ze které mohou tvořit plyn. Mohou produkovat indol a zkapalňovat želatinu. Některé rody zkvašují laktosu (ŠAVEL, 1980). Octové bakterie Octové bakterie mají v současné pivovarské praxi malý význam. Jsou to gramnegativní tyčinky různé délky, které se vyskytují jednotlivě nebo v řetízcích. Jsou nesporotvorné, pohyblivé i nepohyblivé. Dobře snáší vyšší obsah ethanolu (6 %) i nízké pH (3,2 – 4,5). Jejich charakteristickou vlastností je schopnost oxidovat ethanol na octovou kyselinu, popř. ještě na oxid uhličitý a vodu (ŠAVEL, 1980). Bakterie mléčného kvašení (BMK) BMK jsou nejobávanější kontaminací pivovarnického průmyslu. Vyskytují se ve všech fázích výroby piva. V pivě tvoří zákal a výrazně zhoršují senzorické vlastnosti piva. Mléčné bakterie vyskytující se v pivovarnické výrobě patří k rodům Lactobacillus a Pediococcus (ŠAVEL, 1980) Jejich společným znakem je tvorba mléčné kyseliny. Homofermentativní bakterie tvoří jako hlavní produkt kyselinu mléčnou, heterofermentativní bakterie produkují kromě kyseliny mléčné i kyselinu octovou, mravenčí, oxid uhličitý a neutrální produkty, jako ethanol a glycerol (ŠAVEL, 1980). Laktobacily jsou grampozitivní tyčinkovité bakterie různé délky. Laktobacily jsou nesporotvotné, nepohyblivé a fakultativně anaerobní bakterie. Prokazují značný pleomorfismus, tzn., že se mohou jejich morfologické vlastnosti (např. délka) měnit za různých podmínek (ŠAVEL, 1980).
21
Pediokoky jsou grampozitivní koky vyskytující se jednotlivě, v párech, v malých shlucích a tetrádách. Tvorba tetrád je pro pediokoky typická a nález tetrád ve zkažených pivech se může považovat za předběžný důkaz těchto bakterii. Jsou to nesporotvorné, nepohyblivé a anaerobní bakterie. Náleží mezi homofermentativní mléčné bakterie. Stejně jako laktobacily také znehodnocují pivo tvorbou zákalu, mléčné kyseliny i těkavých metabolitů. (ŠAVEL, 1980). 3.7.7
Plísně Plísně mají při výrobě ve srovnání s jinými
mikroorganismy (kvasinky,
bakterie) jen malý význam. Jsou častou kontaminací sladařské výroby. Na klíčícím ječmeni a zeleném sladu se vyskytují plísně rodu Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Podpora aj. (ŠAVEL, 1980). Ve vlastní výrobě mají plísně menší význam, protože se v mladině a pivě pomnožují pomaleji proti jiným mikroorganismům nebo vůbec ne. Přesto lze nalézt plísně i ve stočeném pivě. Fragner nalezl v našich pivech plísně rodu Penicillium, Rhizopus, Hormodendrum, Fusarium, Aspergillus aj. (ŠAVEL, 1980). Rozvoj plísní je podmíněn vlhkostí, proto lze snížením vlhkosti úspěšně potlačit jejich růst. K nátěrům na zdi se přidávají účinné fungicidní látky (ŠAVEL, 1980). 3.7.8
Kvašení piva Pivo se vyrábí dvojím kvašením: spodním a vrchním. Při vrchním kvašení se
mladina zaočkuje kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, při spodním kvašení, které se používá u nás, kvasinkami Saccharomyces carlsbergensis ( S. cerevisiae subs. uvarum) (ARPAI a BARTL, 1977). Vývin nežádoucí mikroflóry v mladině se urychluje: •
růstovými faktory a vitamíny z kvasničného autolyzátu
•
obsahem kyslíku v mladině
•
pohybem tekutiny
•
vhodnou teplotou na rozmnožování bakterií
•
nevhodným sladem
•
ztrátou oxidu uhličitého
Po prvních hodinách zakvášení se mikroflóra velmi rychle druhově ustálí (ARPAI a BARTL, 1977).
22
3.7.9
Dokvašení, filtrace a stáčení piva Během dokvášení se bakteriální kontaminace snižuje a spolu se sedimentujícími
kvasinkami klesá na dno. Většina bakterií zůstává po odčerpávání piva ve zbytcích (ARPAI a BARTL, 1977). Filtrace piva může mít kladný, ale i záporný vliv na mikrobiologický stav piva. Dobrou filtrací se zachytává podstatná část mikroflóry, špatnou filtrací se stav zhoršuje. Filtrace křemelinou je účinnější a odstraní téměř všechny mikroby (ARPAI a BARTL, 1977). Trvanlivost piva je přímo úměrná mikrobiologické čistotě piva, čistotě sudů a láhví. Kontaminace sudů bývá relativně malá. Mikroflóra láhví připravených na plnění piva závisí na mnoha faktorech. Láhve se kontaminují až během balení a dopravy. Láhve se umývají na umývacích strojích. Při umývání se musí dodržovat předepsané teploty a koncentrace mycích prostředků, aby umývání bylo účinné. V dobře vymyté láhvi se nemají vyskytovat koliformní bakterie, počet mikroorganismů nemá být vyšší jako 500 na láhev. V láhvi nemají být přítomny ty skupiny mikroorganismů, které se v pivě rozmnožují. Počet kvasinek nemá být vyšší jak 10 na láhev a pediokoky se nesmí vyskytovat vůbec (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.10 Kažení piva Hotové pivo obsahuje spoustu živin např. cukrů, aminokyselin a jiných dusíkatých látek, které umožňují rozvoj nežádoucí mikroflóry. Obsah alkoholu 1,6 až 4,0 % není tak velký, aby působil dostatečně inhibičně. Proto má pivo omezenou trvanlivost. Trvanlivost se zkouší při teplotě 20 až 25 oC (ARPAI a BARTL, 1977). Zákaly piva mohou zapříčinit kvasinky a bakterie. Kulturní kvasinky Sacchoromyces carlbergensis (S. cerevisiaoe subs. uvarum) tvoří hrubozrnné zákaly, které se lehko usazují na dně. Pivo přitom nemívá změnou chuť. Naproti tomu divoké kvasinky, hlavně Saccharomyces pastorianus, Sacch. oviformis a další tvoří jemné zákaly, které špatně sedimentují. Zástupci kvasinek Rhodotorula a Candida se vyskytují jen ve zvětralém pivě, kde je aerobní prostředí (ARPAI a BARTL, 1977). Bakteriální zákaly jsou v současnosti vzácné a poukazují na vážné nedostatky v sanitaci pivovaru. Mohou je tvořit laktobacily, např. L. brevis a jiné, které nejsou citlivé na hořké chmelové látky a málo citlivé na alkohol. V pivě se mohou vyskytovat i pediokoky (Pediococcus cerevisiae ), nesprávně nazývané „pivní sarcíny“, které dávají
23
pivu sladkou až „medicinální“ příchuť. Jsou obávanou kontaminací piva, která je velmi houževnatá a těžko se likviduje (ARPAI a BARTL, 1977). Pivo, které obsahuje i malé množství kyslíku může napadnout Gluconobacter, hlavně Gluconobacter oxydans, který může zvyšovat viskozitu piva. Octovatění se vyskytuje zřídka, protože aerobní Acetobacter nemá v pivě vhodné podmínky pro svůj rozvoj pokud není pivo zvětralé. Poté se může zapříčinit zkysnutí piva (ARPAI a BARTL, 1977). 3.7.11 Rozdělení nežádoucích mikroorganismů •
Latentní zárodky – v pivu se vyskytují vzácně. Jedná se o rody Bacillus, Clostridium, č. Enterobacteriaceae, Micrococcus a křísotvorné kvasinky. V pivu se nepomnožují. Některé produkty jejich metabolismu jsou toxické. Významné jsou mykotoxiny, které jsou produkty plísní pocházející z napadených surovin. Představitelem půdní mikroflóry jsou Fusaria. Plísně, prosazující se při skladování ječmene, jsou Aspergilus a Penicillium (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
•
Indikátorové mikroorganismy – nejsou škodlivé, pokud se nejedná o masivní kontaminaci. Jedná se např. o Acetobacter pasteurianus, Acinetobacter calcoaceticus, Klebseilla pneumonie, Debaryomyces hansenii, Saccharomyces chevalieri (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
•
Pivu nepřímo škodící mikroflóra – může škodit, ale v hotovém pivu se nepomnožuje. Jedná se např. o Enterobacter agglomerans, Obesumbacterium proteus, Candida kefír, Hansenula snímala (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
•
Pivu potenciálně škodící mikroflóra – k pomnožení v pivu dochází pouze za určitých podmínek. Jedná se o přítomnost kyslíku, zvýšení pH piva (nad 4,7), nižší chmelení. Do skupiny těchto mikroorganismů patří např. Lactobacilus plantarum, Lactobacilus lactis, Micrococcus kristinae, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae pastorianus (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
•
Pivu škodící mikroflóra (obligátně škodlivé mikroorganismy) – pomnožuje se v pivu za vzniku sedliny a zákalu. Současně dochází ke změně chuťových vlastností piva (vznik zápachu, tvorba diacetalu apod.). Hlavními představiteli jsou Lactobacillus brevis, L. lindneri, Pediococcus, Pectinatus cerevisiiphilus, Saccharomyces diastaticus (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
24
K primárním
kontaminantům,
vyskytujících
se
především
v kvasnicích
a
nefiltrovaném úseku, náleží především druhy Lactobacillus lindneri, L. brevisimilis, L. frigidus a Pediococcus damnosus. Jako sekundární kontaminanty vystupují většinou Lactobacillus casei, L. brevis, L. coryniformis, Pediococcus inopinatus, Megasphaera a Pectinatus (KOSAŘ, PROCHÁZKA a kol., 2000).
3.8 Víno Víno se produkuje díky etanolovému kvašení moštu z drcených a následně vylisovaných bobulí révy vinné (DRDÁK a kol., 1996). 3.8.1
Suroviny Bobule hroznů mají na svém povrchu nejrůznější mikroflóru, jejíž velký podíl
tvoří divoké kvasinky. Kulturních kvasinek je na bobulích málo, jejich počet se zvyšuje dozráváním; jejich množství je tím větší, čím je bobule zralejší a blíže zemi (ARPAI a BARTL, 1977). Na jedné bobulce se nachází až 8 milionů buněk, ovšem na prasknuté je
téměř 40 krát více než na bobuli neporušené (STEIDL a RENNER, 2004). V moštech se objevují ze slupek hroznů přirozené kvasinky podílející se na spontánním kvašení. K původcům tohoto kvašení jsou hlavně Kloeckera apiculata, Hanseniospora uvarum a Metschnikowia pulcherrima (MINÁRIK, 2005). Prostředí se stává anaerobním a dominující mikroflórou se stávají kvasinky (HRUBÝ, 1984). 3.8.2
Složení přirozené kvasinkové mikroflóry V závislosti na průběhu klimatických podmínek je složení kvasinek rozdílné a
z vinice přicházejí jen 1 až 3 % žádoucích kvasinek. V četných výzkumech byl druh kvasinek Saccharomyces cerevisiae, „pravá“ vinná kvasinka, nalézán ve zřetelné menšině. Ve spontánních podmínkách se rozvíjejí nejprve „divoké kvasinky“, jejichž podíl na počátku kvašení může činit 90 % i více procent. Teprve asi od 4 % obj. alkoholu mají převahu „pravé vinné kvasinky“, které nakonec dosáhnou průměrně 90 až 95 % podílu (STEIDL a RENNER, 2004).
25
Podle kvasného výkonu a vzhledu se rozlišují: •
Velmi dobře kvasící kvasinky: Tvoří hodně alkoholu a mnoho pozitivních vedlejších produktů. Tento druh kvasinek Saccharomyces cerevisiae se též označuje jako „pravé nebo ušlechtilé vinné kvasinky“ (STEIDL a RENNER, 2004).
•
Slabě kvasící kvasinky: Přirozeně se v moštu vyskytující kvasinky jsou označovány jako „kvasinky divoké“. Hlavními zástupci jako Kloeckera apiculata, Candida. Jejich tolerance k alkoholu je menší (STEIDL a RENNER, 2004).
•
Křísotvorné kvasinky: Často se množí v přítomnosti kyslíku na hladině vín, která mají nižší obsah alkoholu a škodí jim (STEIDL a RENNER, 2004).
•
Ojediněle se vyskytující kvasinky: Není jim přikládán žádný význam (STEIDL a RENNER, 2004).
3.8.3
Množení kvasinek V obvyklých podmínkách se kvasinky rozmnožují pučením. Tento děj se může
konat asi sedmkrát, přičemž na povrchu kvasinky zůstávají jizvy, které snižují intenzitu látkové výměny. Proto mají „služebně starší“ kvasinky s četnými jizvami nižší kvasnou schopnost (STEIDL a RENNER, 2004). 3.8.4
Čisté kultury kvasinek Pro rychlé zahájení kvašení je potřeba asi 2 – 4 milionů buněk kvasinek
v jednom mililitru (STEIDL a RENNER, 2004). S jistotou toho lze dnes obvykle dosáhnout použitím čisté kultury kvasinek. Požadované vlastnosti takové kultury jsou: -
rychlé rozkvašení
-
bezproblémové úplné prokvašení
-
kvašení v širokém teplotním rozmezí
-
nepatrná tvorba pěny
-
žádné vedlejší produkty nebo jejich minimum
-
dobrý výtěžek alkoholu
-
žádná tvorba oxidu siřičitého
-
snášenlivost alkoholu
-
snášenlivost cukru u přívlastkových vín
-
bez tvorby látek ztěžující filtraci
26
-
šetrnost k barvě u červených vín
-
bez zásadních vlivů na odrůdový charakter a místo původu (STEIDL a RENNER, 2004).
3.8.5
Kvašení vína Při kvašení vína probíhá alkoholové kvašení, kdy se spotřebovávají cukry, při
čemž vzniká oxid uhličitý a etylalkohol. Kvasí se při nízkých teplotách a v anaerobních podmínkách buď spontánním kvašením nebo přidání čisté kultury kvasinek (ARPAI a BARTL, 1977). Mošt, který je čerstvě vylisovaný, má hodně různých druhů mikroorganismů. V 1ml dobrého moštu je 30 000 až 7 400 000 apikulárních kvasinek a asi stejné množství divokých kvasinek. Kulturní kvasinky Saccharomyces cerevisiae dosahují až 500 000 v 1ml. Jiné mikroorganismy, mléčné a octové bakterie, jsou přítomné v tisících na ml. Počty plísní jsou velmi variabilní od 1 300 až do 9 200 000 spor plísní na ml. Pokud je mošt vylisovaný z poškozených, plesnivých nebo nahnilých bobulí počty divokých kvasinek, plísní a bakterií stoupají na úkor počtu kulturních kvasinek. Složení mikroflóry v moště nezáleží jen na stavu bobulí, ale i na počasí během dozrávání a sběru hroznů (ARPAI a BARTL, 1977). Ihned po vylisování začíná kvašení, kdy se mohutně rozrůstá nejrůznější mikroflóra. Brzy se prostředí stává anaerobní, tvoří se oxid uhličitý a objevuje se alkohol, čímž se likviduje nežádoucí mikroflóra. Začínají převládat divoké kvasinky, a to apikulární druhy, hlavně Kloeckera apiculata a
jiné druhy, např. rod Candida
(ARPAI a BARTL, 1977). Kloeckera apiculata jsou protáhlé, oválné, apikulátní, citrónovité buňky. Candida tvoří protáhlé buňky, často ve shluku nebo řetězci. Původce křísovatění vína
(FARKAŠ,1980). Stoupající množství alkoholu a tvorba oxidu
uhličitého umožňují vývoj kulturních kvasinek Saccharomyces cerevisiae (ARPAI a BARTL, 1977). Příznakem růstu kvasinek je zvýšení zákalu a tvorba bílého nebo šedého sedimentu. Se zvětšující se aktivitou kvasinek se intenzivně vyvíjí plyn, který mísí tekutinu a vytváří pěnu. V prvních dnech probíhá kvašení bouřlivě a vyvíjí se spousta tepla. Hlavní kvašení trvá 2 až 3 týdny. Po uplynutí této doby se cukr spotřebuje a rozmnožování i metabolismus kvasinek se zastaví. Asi po 4 až 6 týdnech je už 98 až 99 % kvasinek mrtvých (ARPAI a BARTL, 1977).
27
Kyselina jablečná se odbourává činností mléčných bakterii, které ji rozkládají na CO2 a kyselinu mléčnou. Jsou to hlavně Lactobacillus hilgardii, L. brevis, L. plantarum, L. delbrueckii, také Leuconostoc mesenteroides, a Pediococcus (ARPAI a BARTL, 1977). Lactobacillus hilgardii a L. brevis patří k heterofermentativním fakultativně anaerobním bacilům a produkují velké množství těkavých kyselin. Lactobacillus plantarum je heterofermentativní bacil a Pediococcus patří k heterofermentavním kokům. Optimální teplota pro růst je 25 ºC (FARKAŠ, 1980). 3.8.6
Ošetřování vín
Síření Síření je jedním z nejstarších způsobů ošetřování vína. Mezi hlavní vlastnosti oxidu siřičitého patří jeho antiseptické účinky, spočívající v odebírání kyslíku z prostředí za současného vázání na buněčné blány mikroorganismů, které narušuje (KRAUS a kol., 2008). Oxid siřičitý působí proti plísním, kvasinkám a aerobním bakteriím a je méně účinný proti anaerobním bakteriím (FARKAŠ, 1980). Kulturní kvasinky se inhibují koncentrací 125 až 250 mg SO2 na litr, divoké kvasinky, např. Kloeckera nebo Torulopsis, hynou při koncentraci 150 mg na litr. Mléčné bakterie jsou velmi citlivé na SO2, přestávají růst při koncentraci 75 až 100 mg na litr. I ostatní bakterie se sířením blokují (ARPAI a BARTL, 1977). Filtrace Mikrobiologicky významným procesem, zvyšující kvalitu vína, je filtrace. Správná finální filtrace odstraní z vína spolu se zákalem i doprovodnou mikroflóru, která se obvykle zachytává na částečkách tvořících zákal. Celkový počet mikrobů tak podstatně klesne, ale běžnou filtrací není možno dosáhnout sterility výrobky. Je třeba dbát na to, aby filtrační materiál byl čistý a filtry nebyly přetíženy, jinak je účinek o hodně menší (ARPAI a BARTL, 1977). Filtrování je nejběžnějším způsobem čištění mladých vín pomocí nejrůznějších filtrů. Odstraňuje z vína pevné částice tak, že víno protéká filtračním materiálem různé struktury a hustoty. Jako filtrační materiál se používají hlavně křemelina, celulózy a plastové membrány. Filtrace vína k dosažení jeho čistoty a stability je dnes běžná (KRAUS a kol., 2008).
28
•
Křemelinová filtrace Filtrace přes křemelinu slouží k filtrování kalných moštů a mladých vín. Křemelinová filtrace se může provádět i pomocí deskového filtru, vybaveného přídatnými rámky, které se vkládají mezi filtrační desky (KRAUS a kol., 2008).
•
Filtrace vložkovými filtry Hloubková filtrace, při které se kalící částečky zachytávají na povrchu i uvnitř pevné, předem zhotovené filtrační vložky. Filtrační vložky jsou vyráběny z buničiny, křemeliny a perlitu. Pro hrubou filtraci kalných vín slouží vložky s nejmenší hustotou, které odstraňují hlavně koloidní látky. Hustší vložky, které by se příliš rychle zanášely kalem, se používají k jemné filtraci. Pomocí nejhustších vložek můžeme dosáhnout mikrobiální filtrace, při níž se zachytí kvasinky, případně i bakterie (KRAUS a kol., 2008).
•
Membránová filtrace Působí jako síto s malou kapacitou pro kalové částice, proto se u ní musí předřadit vložkový filtr, který zachytí většinu kalů. Membrána má přesně definovanou velikost otvorů, která zaručuje neprůchodnost pro kvasinky, případně i bakterie (KRAUS a kol., 2008).
•
Cross-flow filtrace Cross-flow je druhem membránová filtrace. Filtrační jednotky jsou vytvořeny ze svazků dutých plastových vláken s póry (KRAUS a kol., 2008).
3.8.7
Prostředí závodu Na povrchu sudů, tanků a jinde ve zbytcích vína se velmi rychle rozvíjejí
kvasinky, octové bakterie nebo i plísně, např. Rhizopus, Mucor, Penicillium a Aspergillus. Penicillium a Aspergillus jsou schopné prorůstat do dřeva a víno má pak typickou „plesnivou“ příchuť (ARPAI a BARTL, 1977). 3.8.8
Mikroflóra hotového výrobku Víno v láhvích obsahuje v malých koncentracích vždy nějakou mikroflóru
kvasinky, bakterie nebo občas i plísně. Často nacházíme ve víně kulturní kvasinky. Zjistila se přítomnost Sacch. cerevisiae, Sacch. oviformis, Sacch. pastorianus, Sacch. carlsbergensis, Candida mycoderma, C. crusei, C. utilis, Brettanomyces, Pichia a jiné. Počet kvasinek ve víně má být malý, usuzuje se, že nemá přesahovat 100 na litr. Přesnou hranici biologické stability vína, však není lehké určit, protože záleží jen na
29
počtu kvasinek, ale i na druhu, případně na biologickém stavu (ARPAI a BARTL, 1977).
3.8.9
Nedostatky a vady vín způsobené mikroorganismy
Hnití hroznů Když se na počátku zrání hroznů dostaví delší období dešťů s nízkými denními teplotami a vysokou vzdušnou vlhkostí, dochází obvykle k praskání slupek bobulí a k jejich hnití. Při takovéto mokré neboli kyselé hnilobě se rozvíjí nejen ušlechtilá plíseň šedá ale i celá řada dalších nežádoucích houbových patogenů (např. Penicillium, Aspergillus ), popř. octové a mléčné bakterie (KRAUS a kol., 2008). Pelargoniová vůně Vyskytuje se většinou u stolních vín polosuchých nebo polosladkých. K výskytu pelargoniové vůně dochází u vín, která nebyla sterilně lahvována a výrobce spoléhal na konzervační účinky kyseliny sorbové. Tuto vůni je možné vnímat již při velkém zředění, a proto stačí nepatrné množství kyseliny sorbové, která byla napadena mléčnými bakteriemi (KRAUS a kol., 2008). Vůně a příchuť po sirovodíku Sirka Ve víně se projevuje zápachem po zkažených vejcích, spálené gumě, kapustě, cibuli nebo česneku. Vyskytuje se nejčastěji v mladých bílých i červených vínech. Způsobuje ji vývoj sirovodíku, který se vytváří činností kvasinek v moštech s vyšším obsahem síry (KRAUS a kol., 2008). Pachuť odstraníme zasířením vína (MUSIL a MENŠÍK, 1970). Křís Křísovatění vín se projevuje jako šedobílá blána plovoucí v neplné nádobě na hladině vína, tam, kde se víno nejvíc dostává do styku se vzduchem (KRAUS a kol., 2008). Nemoc je způsobena kvasinkovitým mikroorganismem Candida mycoderma. Množí se pučením, během 24 hodin vznikne další milion buněk. Kvasinky napadají především vína s nízkým obsahem alkoholu, nedostatečně zasířená nebo přechovávaná v neplných nádobách s přístupem vzduchu (KRAUS a kol., 2008).
30
Octovatění vín Napadení vína se pozná podle jeho zakalení, acetátové vůně a škrablavé chuti s pichlavou dochutí připomínající ocet. Tuto změnu vína způsobují octové bakterie, které ke svému vývoji potřebují kyslík a vyšší teploty. Optimální teploty pro jejich rozvoj se pohybují v rozmezí 30 až 35 oC. Napadají hlavně vína s nižším obsahem alkoholu se zbytkem cukru, a za přístupu vzduchu při teplotě vyšší než 10 oC (KRAUS a kol., 2008). Mohou se vyskytovat na hroznech, v moštu i víně (PAVLŮŠEK, 2009). Octové bakterie je možné zařadit do tří rodů: Acetobacter, Gluconobacter a Gluconoacetobacter. GUILLAMÓN a MAS (2009) uvádí druhy, které se mohou vyskytovat na hroznech, vinném octě a víně. Poškozené hrozny obsahují podstatně větší množství octových bakterii. Nejvíce jsou zastoupeny Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum (PAVLŮŠEK, 2009). GUILLAMÓN a MAS (2009) uvádí některé základní podmínky pro zabránění rozvoje octových bakterií při výrobě vína: •
Sklizeň zdravých hroznů a dodržení maximálních hygienických podmínek od sklizně po lahvování vína.
•
Výhodou jsou nižší hodnoty pH vín – kolem 3,0.
•
V podmínkách nižších hodnot pH je efektivnější rovněž účinnost volného oxidu siřičitého.
•
U poškozených – rizikových hroznů je důležitá aplikace oxidu siřičitého, udržování nízké teploty moštů a odkalení.
•
Oxid siřičitý dokáže rozvoj bakterií účinně brzdit.
•
Je vhodné rychlé nastartování kvašení, díky kterému se zvyšuje obsah alkoholu a tvorba oxidu uhličitého dokáže inhibovat velikost populace a rozvoj octových bakterií.
•
Optimální teploty pro rozvoj octových bakterií jsou 25 – 30 oC. V rizikových případech je proto třeba vyhnout se těmto teplotám (PAVLŮŠEK, 2009).
Octové bakterie jsou přítomné ve všech vínech, a proto je potřeba potlačit jejich rozmnožování udržením vína v anaerobních podmínkách a jeho sířením (ARPAI a BARTL, 1977).
31
Vláčkovatění vín Zvláčkovatěné víno je téměř vždy zakalené, při nalévání se táhne jako olej a obsahuje oxid uhličitý, jehož bublinky ve sklence stoupají velmi pomalu vzhůru. Nemoc se vyskytuje u vín, která byla po kvašení nedostatečně zasířená, nebo u brzy nalahvovaných mladých vín, v nichž proběhlo biologické odbourávání kyselin v láhvi. Nejvíce podléhají vláčkovatění lehká vína s nízkým obsahem alkoholu, která přišla málo do kontaktu se vzduchem a byla přechovávána na kvasničních kalech při teplotě kolem 20 oC. Mikrobiologický rozbor zvláčkovatěných vín ukáže přítomnost některých bakterii, které vytvářejí sliz. Mezi nejdůležitější patří Pediococcus damnosus, Leuconostoc mesenteroides a Leuconostoc dextranicum. Tyto bakterie se řadí mezi heterofermentativní mléčné bakterie, které vytvářejí kromě kyseliny mléčné také sliz (KRAUS a kol., 2008). Myšina Ve vůni se objevují nepříjemné tóny připomínající zápach myší moči. Silněji ovlivňuje myšina v chuti vína působí odporným, hořkým a vysušujícím pocitem. Nejčastěji se tato nemoc vyskytuje ve vínech s vysokým pH, nízkým obsahem kyselin, a zvláště pokud byla vína delší dobu ve styku se vzduchem. Myšina je pravděpodobně způsobena mléčnými bakteriemi Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus za současného spolupůsobení kvasinek Brettanomyces bruxelensis (KRAUS a kol., 2008). Brettanomyces Koňský pot Napadení vína se nejdříve projeví typickou vůní, která je popisována jako koňský pot, koňská stáj, dehet, mokrý pes a podobně. Vůně je ovlivněna působením kvasinek Brettanomyces, je rozšířena po celém světě, zvlášť v červených vínech skladovaných v sudech barrique (KRAUS a kol., 2008). Buňky jsou elipsoidní až protáhlé a vyznačují se produkcí netěkavých kyselin (FARKÁŠ, 1980). Kvasinky Brettanomyces dovedou zkvašovat i nejmenší zbytky cukrů, dokonce i jinými druhy nezkvasitelné polysacharidy jako je celobiosa, obsažená ve dřevě sudů barrique. Kromě toho dokážou tyto kvasinky vytvářet trvalé formy velmi malých rozměrů, které procházejí mikrobiálními filtry, a proto je obtížná jejich likvidace i obrana proti nim (KRAUS a kol., 2008).
32
Příchuť po plísni Nepříjemnou příchuť a pach po plísních mají vína, které přišly do styku a nárůstem plísní Penicillium a Aspergillus. Tyto plísně rostou v nečistých nedostatečně umytých nádobách. Jsou vitální, a plíseň, i pach se těžko odstraňují (ARPAI a BARTL, 1977). Tuto pachuť nelze z vína odstranit ani čiřením aktivním uhlím (MUSIL a MENŠÍK, 1970). Hořkost vína Mléčné bakterie jsou velmi důležité pro úspěšný průběh jablečno-mléčné fermentace, ale mohou také negativně ovlivňovat kvalitu vína ( PAVLŮŠEK, 2009). Mléčné bakterie, které se nachází v moštu a víně, je možné rozdělit do následujících rodů: Oenococcus, Leuconostoc, Lactobacillus a Pedicoccus ( PAVLŮŠEK, 2009). Bakterie rodu Pediococcus ovlivňují negativně aromatické a chuťové vlastnosti vína díky produkci „máslových“ tónů a hořkosti (produkcí diacetalu) ( PAVLŮŠEK, 2009). Mléčné bakterie jsou schopné tvořit kyselinu octovou. Tvorba kyseliny octové byla pozorována až když došlo k přeměně asi polovin kyseliny jablečné a bakterie začaly využívat kyselinu citronovou ( PAVLŮŠEK, 2009).
33
4
PRAKTICKÁ ČÁST
4.1 Metodika 4.1.1 •
Stanovení mikroorganismů celkový počet mikroorganismů (CPM) na živné půdě PCA. Kultivace v termostatu při teplotě 30 oC po dobu 72 hodin.
•
Kvasinky a plísně na agaru „Chloramphenicol Glukose Agar“. Kultivace v termostatu při teplotě 25 oC po dobu 120 hodin.
4.1.2
Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo používané při rozborech bylo sterilováno v horkovzdušném
sterilizátoru při 165 °C po dobu 60 minut. Erlenmayerovy baňky s půdami a zkumavky s fyziologickým roztokem byly sterilovány v parním sterilizátoru při 121 °C 20 minut.
4.2 Charakteristika materiálu •
vzorek 1 – Modrý portugal – Diana Moravia 2008 – Moravské vinařské závody Bzenec
•
vzorek 2 – Modrý portugal – malovýroba 2008
•
vzorek 3 – Müller Thurgau – Diana Moravia 2008 – Moravské vinařské závody Bzenec
• 4.2.1
vzorek 4 – Müller Thurgau – malovýroba 2008
Příprava a zpracování vzorku Na stanovení byla použita dvě po sobě jdoucí ředění. Na první Petriho misky byl
naočkován 1 ml inokula, jež nebylo ředěno. Na další Petriho misky bylo použito desítkové ředění. Poté se všechny misky zalily vychladlou živnou půdou a inokulum se pečlivě promíchalo s živnou půdou. Tato směs se nechala ztuhnout. Po zatuhnutí se nechaly Petriho misky kultivovat v termostatu při dané teplotě a čase. Na těchto plotnách byl stanoven celkový počet mikroorganismů (CPM), kvasinky a plísně.
34
4.3 Živné půdy PCA „ Plate count agar“ Výrobce: Biokar Diagnostics, France Složení: •
Trypton
5,0 g
•
Kvasničný extrakt
2,5 g
•
Glukóza
1,0 g
•
Agar
12,0 g
•
Sušené mléko
1,0 g
•
Voda
1000 m l
Navážka 20,5 g se rozpustí v 1000 ml destilované vody, upraví se pH 7 ± 0,2 při 25 oC. Živná půda se steriluje v autoklávu při 121 oC po dobu 15 minut.
Agar „Chloramphenicol Glukose Agar“ Výrobce: Himedia, Indie Složení: •
Kvasničný extrakt
5,0 g
•
Glukosa
20,0 g
•
Chloramfenikol
0,1 g
•
Agar
15,0 g
•
Voda
1000 ml
Navážka 40,1 g se rozpustí v 1000 ml destilované vody, upraví se pH 6,6 ± 0,2 při 25 oC. Půda se steriluje v autoklávu při 121 oC 15 minut. 4.3.1
Postup při vaření živných půd Agar v připravených živných půdách se nechal dostatečně nabobtnat při běžném
laboratorní teplotě. Poté byly živné půdy rozvařeny ve vodní lázni při teplotě 100 oC a tekutá půda byla rozlita do Erlenmayerových baněk o objemu 400 ml.V zápětí byla provedena sterilace v autoklávu při 121 oC po dobu 15 minut. Po zatuhnutí byly živné půdy ponechány v lednici. Před použitím na analýzu byly půdy vařeny 5 minut v autoklávu a následně ochlazeny na teplotu 35 – 45 oC. 35
4.4 Vyjádření výsledků zkoušky Po kultivaci byly spočítány kolonie tvořící jednotky (KTJ) na Petriho miskách. Byly prováděny vždy dvě opakování. Výsledné počty mikroorganismů byly vyjádřeny dle rovnice v KTJ na gram:
N=
Σc
a
V(n1+0,1n2)d Σc
Součet kolonií mikroorganismů na Petriho miskách
n1
počet použitých misek z prvního ředění
n2
počet požitých misek z druhého ředění
d
ředící faktor odpovídající prvnímu pro výpočet použitému ředění
V
objem inokula v ml očkovaného na každou plotnu
36
5
VÝSLEDKY A DISKUZE Úkolem praktické části bylo zjistit rozdíl v mikrobiální kontaminaci vína z
velkovýroby a malovýroby. Vzorky z velkovýroby byly zakoupeny v běžné obchodní síti a z malovýroby pocházely ze soukromého vinařství. Výsledky mikrobiologických analýz jsou uvedeny v tab. 2. Tab. 2: Počty mikroorganismů ve vzorcích vín v KJT/ml Skupiny mikroorganismů 1. vzorek 2. vzorek 3. vzorek 4. vzorek CPM
2
181
0
437
Kvasinky
0
164
0
208
U vzorků z velkovýroby (vzorek č. 1 a 3) byl zjištěn téměř nulový počet mikroorganismů oproti vzorkům z malovýroby (vzorek č. 2 a 4). Tyto výkyvy v počtu mikroorganismů lze vysvětlit především úrovní hygieny ve velkovýrobě, kde a většinu úkonů přebírají stroje, které se snadno desinfikují. Kontaminace
může
také
pocházet
ze
špatně
vymytých
lahví,
mikrobiálně
kontaminovaných korkových zátek nebo špatně provedená filtrace. Stejné závěry uvádí i BÍLEK. Při zpracování hroznů je nutný předpoklad, že co je čisté, nedává možnost k nežádoucím projevům mikroorganismů. Kvalita moštu je podporována chlazením, odkalováním, filtrací a používáním čistého zařízení. Fermentace, stáčení, čiření a filtrace jsou také ovlivňovány čistotou. Sanitace zabezpečuje mikrobiologickou čistotu např. u tanků, hadic a u filtrů. Důraz je kladen zvláště na čistotu u poslední filtrace a plnění do lahví. V tomto úseku mohou nastat změny v mikrobiologické stabilitě vína. Vše co přijde do styku s lahvovaným vínem musí být čisté, aby stabilita vína nebyla ohrožena (BÍLEK, 2009).
5.1 Závěr Z analýz vyplývá: V analyzovaných vzorcích z velkovýroby byly zjištěny minimální počty mikroorganismů. Ve 1. vzorku se vyskytovaly 2 mikroorganismy v 1 ml a počet kvasinek byl nulový. Vzorek č. 3 neobsahoval žádné mikroorganismy ani kvasinky. Ve vzorcích z malovýroby byl zjištěny vyšší počty mikroorganismů než u vzorků z velkovýroby. 2. vzorek obsahoval 181 mikroorganismů a 164 kvasinek v 1 ml. Ve 4. vzorek se vyskytovalo 437 mikroorganismů a 208 kvasinek. 37
6
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ARPAI, J. a BARRTL, V. (1977) : Potravinárská mikrobiológia, Alfa, Bratislava (269 s.)
BETINA, V. a NEMEC, P. (1977) : Všeobecná mikrobiológia, Alfa, Bratislava (464 s.)
BÍLEK, J. (2009) : Čistota a filtrace, Vinařský obzor 3/2009 (113 s.)
DRDÁK, M., STUDNICKÝ, J., MÓROVÁ, E., KAROVIČOVÁ, J. (1996) : Základy potravinárských technológií, Malé centrum, Bratislava, ISBN 80.967064-1-1 (s. 512)
EDER, R. a kol. (2006) : Vady vína, Radix, Valtice, ISBN 80-903201-6-3 (263 s.)
FARKAŠ, J. (1980) : Technologie a biochemie vína, Alfa, Praha (870 s.)
HRUBÝ, S., BARTL, V., EMBERGER, O., KORBELÁŘOVÁ, T., POLSTER, M., ŽEŽULKOVÁ, M. (1984) : Mikrobiologie v hygieně výživy. Avicenum Praha, (208 s)
HRUDKOVÁ, A., MARKVART, J. a kol. (1989) : Nealkoholické nápoje, STNL, Praha (560 s.)
INGR, I. (2007) : Základy konzervace potravin, MZLU, Brno (137 s.)
KOSAŘ, K., PROCHÁZKA, S. a kol. (2000) : Technologie výroby sladu a piva, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha, ISBN 80-902658-6-3 (393 s.)
KRAUS, V., V., FOFFOVÁ, Z., VURM, B., KRAUSOVÁ, D. (2005) : Nová encyklopedie českého a moravského vína 1. díl, Praga Mystica, Praha, ISBN 80-8676700-0 (306 s.)
KRAUS, V., FOFFOVÁ, Z., VURM, B. (2008) : Nová encyklopedie českého a moravského vína 2. díl, (s. 89, 119–123, 171–187) (311 s.)
38
MINÁRIK,
E.
(2005):
Aktivné
suché
vínne
kvasinky
versus
spontánna
fermentácia.Vinařský obzor 98/1 (29 s.)
MUSIL, S. a MENŠÍK, J. (1970) : Vinařství, Státní zemědělské nakladatelství, Praha (439 s.)
PAVLŮŠEK, P. (2005) : Bakterie a kvasinky negativně ovlivňující kvalitu vína, Vinařský obzor 5/2005 (s. 224 – 227)
STEIDL, R. a RENNER, W. (2004) : Problémy kvašení vín, Radix, Valtice, ISBN 80903201-3-9 (s74 s.)
ŠAUER, Z. a KUTTELVAŠER, Z. (1966): Filtrace nápojů, Státní nakladatelství technické literatury, Praha (181 s.)
ŠAVEL, J. (1980) : Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL, Praha, (180 s.)
ŠILHÁNKOVÁ, L. (1995): Mikrobiologie pro potravináře a technology, Victoria Publishing, Praha, ISBN 80-200-1024-6, (s. 365)
ŠILHÁNKOVÁ, L. (2008) : Mikrobiologie pro potravináře a technology, Academia, Praha, ISBN 80-200-1024-6 (263 s.)
ŠROUBKOVÁ, E. (1996) : Technická mikrobiologie, MZLU, Brno (148 s.)
252/2004 Sb. hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost kontrol
39
7
PŘÍLOHA
40
Příloha č. 1: 1.Stanovuje se u pitných vod upravovaných přímo z povrchových vod nebo u podzemních vod ovlivněných povrchovými vodami. Tam, kde hodnota tohoto ukazatele není dodržena, musí se prozkoumat daný vodní zdroj a technologii úpravy, aby se zjistilo, zda lidské zdraví není potenciálně ohroženo přítomností patogenních mikroorganismů. 2.Platí pouze pro balenou pitnou vodu. 3.Nedílnou součástí výsledku zkoušky jsou i další informace získané při mikroskopickém rozboru, které mohou přispět k interpretaci výsledků. Tento slovní popis obsahuje zejména složení přítomného abiosestonu (případně jeho možný původ), bližší zařazení přítomných organismů a jejich možný původ (surová voda, pomnožení v síti), jejich příslušnost k obtížně odstranitelným skupinám apod. V případě výskytu živých organismů u vod zabezpečených dezinfekcí je vždy nutné udat, o jaké organismy se jednalo. U podzemních vod se zaznamenává především přítomnost organismů vázaných na povrchové vody a organismů indikujících zhoršenou jakost vody. Podzemní voda s výskytem organismů vázaných na povrchové vody musí být považována za vodu podzemní ovlivněnou vodou povrchovou (viz vysvětlivka 1). 4.Organismy zahrnovanými pod tento ukazatel se pro účely vyhlášky rozumí sinice a všechny eukaryotní organismy (řasy, prvoci, mikromycéty, vířinící, hlístice, apod.). Bakterie (s výjimkou sinic) jsou uvedeny jen ve slovním popisu, ale nepočítají se do celkového počtu organismů. Mikroskopický nález masového výskytu organotrofních bakterií (více než 100 jedinců/ml) je třeba posuzovat jako překročení MH ukazatelů č. 6, popřípadě č. 7. Produkty metabolismu železitých bakterií řadíme k abiosestonu. 5.Mezní hodnota platí pouze u vod zabezpečených dezinfekcí. Živé organismy obsahující chlorofyl se odliší pomocí autoflurescence chlorofylu. Ostatní, pokud je to možné, podle dalších znaků (například pohyb, stav protoplastu). 6.Bez abnormálních změn. Pro náhradní zásobování, pro vodu dodávanou ve vzdušných vodních a dopravních prostředcích a pro vodu z malých nedezinfikovaných zdrojů, produkujících méně než 5 m3 za den, platí mezní hodnota 500 KTJ/ml. 7.Bez abnormálních změn. Pro náhradní zásobování, pro vodu dodávanou ve vzdušných vodních a dopravních prostředcích a pro vodu z malých nedezinfikovaných
zdrojů, produkujících méně než 5 m3 za den, platí mezní hodnota 100 KTJ/ml (252/2004 Sb. hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost kontrol, Příl.1 Mikrobiologické, biologické, fyzikální, chemické a organoleptické ukazatele pitné vody a jejich hygienické limity).
