Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Využití kvasinek rodu Kluyveromyces při zpracovaní mléka Bakalářská práce
Brno 2006
Vedoucí bakalářské práce Prof. RNDr.Tesařová Marta, CSc
Vypracovala Putyerová Lenka
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma “Využití kvasinek rodu Kluyveromyces při zpracovaní mléka“ vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
V Brně ………………… Podpis diplomanta ………………….
Poděkování: Touto cestou děkuji paní Prof. Tesařové za odborné vedení, cenné rady a připomínky při řešení mé bakalářské práce, které mi vždy ochotně poskytovala. Dále bych chtěla poděkovat panu Ing. Kalhotkovi za pomoc při experimentální časti mé práce.
ANNOTATION: Lenka Putyerová: Yeasts´ utilisation of genus Kluyveromyces in milk processing
The aim of the bachelor thesis is to analyze the newest information about the yeasts, their occurrence in nature, usage in food processing industry and their systematic classification. The author’s goal was to characterise the genus Kluyveromyces and its representatives with usage in milk processing industry at the production of acid products. The microbiological analysis of the kefir seeds was performed in the experimental part in order to verify the symbiosis between the yeasts of genus Kluyveromyces and the milk bacteria.
Obsah: 1
Úvod.......................................................................................................................... 7
2
Literární přehled........................................................................................................ 8 2.1
Obecná charakteristika kvasinek....................................................................... 8
2.1.1
Systematické třídění kvasinek................................................................... 9
2.1.2
Identifikace kasinek ................................................................................ 13
2.1.3
Vzájemný vztah kvasinek s bakteriemi................................................... 14
2.1.4
Faktory ovlivňující metabolismus kvasinek ........................................... 14
2.2
Výskyt kvasinek v přírodě .............................................................................. 16
2.2.1
Pedosféra................................................................................................. 16
2.2.2
Hydrosféra............................................................................................... 16
2.2.3
Atmosféra................................................................................................ 17
2.2.4
Biosféra ................................................................................................... 17
2.2.4.1
Rostliny a jejich společenstva............................................................. 17
2.2.4.2
Živočichové......................................................................................... 18
2.3
Průmyslové využití kvasinek .......................................................................... 18
2.4
Kvasinky rodu Kluyveromyces a jejich využití v potravinářství .................... 20
2.4.1
Druh Kluyveromyces marxianus var. lactis ............................................ 21
2.4.2
Druh Kluyveromyces marxianus var. marxianus.................................... 22
2.4.3
Druh Kluyveromyces fragilis .................................................................. 24
2.4.4
Kefír ........................................................................................................ 24
2.4.5
Původ kefíru............................................................................................ 26
2.4.6
Vlastnosti kefíru...................................................................................... 26
2.4.6.1
Účinnost kefíru.................................................................................... 26
3
Cíl práce .................................................................................................................. 30
4
Mikrobiologická analýza kefírových zrn ................................................................ 31 4.1 4.1.1 4.2
Izolace kvasinek rodu Kluyveromyces ............................................................ 31 Složení živných agarů ............................................................................. 31 Vyhodnocení ................................................................................................... 32
5
Závěr ....................................................................................................................... 34
6
Použitá literatura ..................................................................................................... 35
1 Úvod Kvasinky v potravinářském průmyslu mají význam jako technologicky využívané mikroorganismy. Vlastnosti kvasinek a především symbiózu kvasinek s bakteriemi využívají různá potravinářská odvětví např. kvasný průmyslu pro výrobu alkoholických nápojů, pekařský průmysl pro výrobu pekařského droždí a mlékárenský průmysl pro výrobu mléčných výrobků. Tato bakalářská práce je zaměřena na charakterizaci kvasinek rodu Kluyveromyces.
-7-
2 Literární přehled 2.1 Obecná charakteristika kvasinek Kvasinky (Saccharomycetales) jsou jednobuněčné a vícebuněčné heterotrofní mikroorganismy patřící do řádu houbových organismů ze skupiny Endomycetes z třídy vřeckovýtrusých hub (Ascomycetes). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a přítomné disacharidy na ethanol a oxid uhličitý (MARENDIAK, 1987, ŠILHÁNKOVÁ, 2003). Tvar buněk kvasinek souvisí se způsobem vegetativního množení. Nejčastější tvar je elipsoidní, případně vejčitý až kulovitý (viz.obr.č.1). Některé rody tvoří dlouhé protáhlé buňky, vyskytuje se však i tvar citrónkovitý, trojúhelníkovitý a válcový. Tvar a velikost buněk jsou do určité míry ovlivněny kultivačními podmínkami a stářím buněk. Avšak i v téže kultuře jednoho kmene kvasinek se vyskytuje určitá variabilita tvaru a velikost buněk. Šířka buněk většiny kvasinek je v rozmezí 3- 6 µm. (ŠILHÁNKOVÁ, 2003)
Obr.č. 1 Tvar kvasinky druhu Saccharomyces cerevisiae. Zdroj: www.wikipedia.org/wiki/Kvasinky
Buněčná hmota kvasinek obsahuje 65 až 83 % vody. Obsah vody závisí na druhu kvasinek, stáří buněk a kultivačních podmínkách. Hlavní podíl sušiny kvasinek tvoří bílkoviny (obyčejně kolem 50%) a dále glykogen. Nukleové kyseliny představují 10% sušiny, strukturní polysacharidy kolem 5% a popeloviny kolem 8%. Z organických sloučenin vyskytujících se v nízkých koncentracích mají význam především vitamíny skupiny B (B1, B2, B6) provitamín D (ergosterol) a u některých rodů např. Rhodotorula také provitamin A (tj. β – karoten). Na vitamíny skupiny B jsou bohaté především pivovarské kvasinky. Hlavní složkou popelovin je oxid fosforečný. Z iontů kovů je v největším množství zastoupen K+, zatímco Mg
2+
, Ca
2+
a Na+ je mnohem méně,
ostatní prvky se vyskytují jen ve zlomcích procenta. (ŠILHÁNKOVÁ, 2003) -8-
Kvasinka rostoucí v optimálních podmínkách se rozmnožuje jen vegetativně. Typický způsob vegetativního rozmnožování je pučení. Pupen vyrůstá z mateřské buňky a dorůstá do její velikosti. Některé rody kvasinek tvoří jen jeden pupen, jiné zase vytváří současně i několik. V průběhu pučení se jádro dělí mitoticky. Dceřiné buňky se buď oddělují od mateřské buňky, na které zůstává typická jizva a nebo s ní zůstává dočasně spojené a tvoří trsy. Jiné rody pučí tak, že nová buňka zůstává spojena širokou základnou s mateřskou buňkou a oddělí se od ní přehrádkou. V průběhu pučení může vzniknout nepravé mycelium, a to tak, že se buňka začne prodlužovat a rozmnožovat ve směru delší osy. Na koncích řetězce buněk se tvoří shluky kulatých nebo elipsoidních buněk tzv. blastospóry. Podle seskupení se potom rozdělují na chumáčovité nebo nepravidelně rozvětvené pseudomycelium. (MARENDIAK, 1987) Vedle vegetativního rozmnožování je u většiny kvasinek znám pohlavní způsob rozmnožování. Výsledkem pohlavního rozmnožovaní jsou pohlavní spóry. Většina kvasinek tvoří jako pohlavní spóry askospóry, což jsou endospóry, umístěny ve vřecku neboli asku. Tyto kvasinky proto řadíme mezi Ascomycotina. Některé rody kvasinek však tvoří pohlavní spóry exospóry, tj spóry umístěné vně sporotvorných buněk. Tyto rody řadíme mezi Basidiomycotina. Pohlavní rozmnožovaní je obecně charakterizováno spájením dvou haploidních buněk čili konjugací a spájením jejich jader za vzniku diploidního jádra. Pak se diploidní jádro rozdělí meiozou nebo se dělí další mitózou a pak teprve vznikají spóry. (ŠILHÁNKOVÁ, 2003) Kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy jsou v přírodě velmi rozšířené. Vyskytují se především na ovoci, cukernatých potravinách, v květových nektarech, v půdě, ve vzduch, ve střevním ústrojí lidí a zvířat, i v některém hmyze (např. včela) (MARENDIAK, 1987).
2.1.1 Systematické třídění kvasinek Zařazování a třídění mikroorganismů do systému se provádí na základě podobných nebo shodných znaků a vlastností např. morfologické, kultivační a biochemické vlastnosti. Kvasinky se rozdělují do 3 skupin podle způsobu pohlavního rozmnožování: 1. rody tvořící askospóry, jsou zařazovány mezi Ascomycotina 2. rody
tvořící
bazidiospóry
nebo
sporodie
a
heterokaryotní
s přehrádkami, jsou zařazovány mezi Basidiomycotina
-9-
mycelium
3. rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spór, jsou zařazovány mezi Deuteromycotina, dříve byly označovány také jako nepravé kvasinky (ŠILHÁNKOVÁ, 2003)
Rod Saccharomyces Rod Saccharomyces je nejdůležitějším rodem v potravinářském průmyslu. Rod Saccharomyces má silné kvasné schopnosti. Jeho druhy jsou schopny zkvašovat většinou několik cukrů, ale nevyužívají laktosu jako zdroj uhlíku ani dusičnany jako zdroj dusíku. (ŠROUBKOVÁ, 1996) Pro rod Saccharomyces je charakteristický vegetativní způsob rozmnožování probíhající multilaterálním pučením, buňky jsou sférické, elipsoidní, cylindrické nebo protáhlé. Velký počet kmenů je využíván pro výrobu alkoholických nápojů a fermentovaných potravin (líh, pivo, víno, cider, kefír, pulque, saké), pro výrobu droždí, sterolů, enzymů a dalších produktů. Velmi významné je rovněž využití těchto kvasinek v genetickém výzkumu. (GÖRNER, VALÍK, 2004) Druh Saccharomyces cerevisiae Tato kvasinka je využívána zejména pro svoji schopnost zkvašovat cukry na etanol a oxid uhličitý (GÖRNER,VALÍK, 2004). Uplatňuje se jako pekařská, lihovarská, vinařská nebo tzv. svrchní pivovarská kvasinka. Zkvašuje glukosu, sacharosu, maltosu a galaktosu. Slouží jako modelový mikroorganismus pro biochemické a genetické práce. (ŠROUBKOVÁ, 1996) Druh Saccharomyces carlsbergensis Fermentují glukózu, sacharózu, maltózu a rafinózu. Laktózu a dusičnany neasimiluje. Tvar buněk je kulatý až oválný, se zřetelnou ostrou ohraničenou vakuolou, což je charakteristické pro starší buňky. Buňky mají rozměr 6 až 7 x 7,5 až 8,5 µm. Rozmnožují se pučením, za krátký čas se v kapalině usadí na dně nádoby. Z fyziologických vlastností má největší praktický význam schopnost anaerobního zkvašování hexózy na ethanol a CO2 (GÖRNER, VALÍK, 2004)
Rod Zygosaccharomyces Tento rod je nejvýznamnější zástupcem osmotolerantních kvasinek. Buňky mají různou velikost, můžou tvořit pseudomycelium. Fermentují glukózu, maltózu, sacharózu. Morfologie podobná jako rod Saccharomyces.
- 10 -
Druh Zygosaccharomyces rouxii Osmofilní kvasinka, tvoří buňky různé velikosti může tvořit pseudomycelium. Zúčastňuje se při kažení slazených a zahuštěných ovocných šťáv (GÖRNER, VALÍK, 2004).
Rod Debaryomyces Je typický častým heterogamním spájením i když izogamní spájení se zde také vyskytuje. Kulovité až oválné spóry mají bradavčitý povrch. Kvasné schopnosti jsou velmi slabé, některé druhy dokonce cukry ani nezkvašují. Většina druhů tohoto rodu roste dobře v přítomnosti 50% glukosy. (ŠILHÁNKOVÁ, 2003) Druh Debaryomyces hansenii Buňky kulovité až krátko oválné, netvoří pseudomycelium. Na tekutých produktech často vytváří bílou blanku po splynutí mateřské a dceřinné buňky v mateřském asku nejčastěji s jednou bradavkovitou spórou. Fermentuje jen slabě Vyskytuje se v mléčných produktech, na mase, majonéze, na pokožce lidí, zvířat, na fermentovaném tabáku. (GÖRNER, VALÍK, 2004)
Rod Candida Rod Candida je nejrozsáhlejší a po biochemické stránce nejrozmanitější rod kvasinek, obsahuje 81 druhů. Rozmnožuje se multilaterálním pučením. Na vhodných půdách tvoří pseudomyscelium. Některé druhy rodu Candida kvasí, ale slabě než jako rod Saccharomyces. Druh Candida kefyr dř. C. pseudotropicalis Využívá také laktózu, je imperfektním stadiem druh Kluyveromyces marxianus. Některé kmeny mohou být podmíněné patogeny. (ŠROUBKOVÁ, 1996)
Rod Torulopsis Netvoří mycelium ani pseudomycelium. Protože tento morfologický znak je poměrně nestálý, někteří taxonomové rod Torulopsis neuznávají a příslušné rody zařazují do rodu Candida (ŠROUBKOVÁ, 1996). Druh Torulopsis holmii Buňky mají mírně oválný tvar. Netvoří pseudomycelium. V některých buňkách vidíme polárně umístěné kapičky tuku. Buňky se rozmnožují pučením. (TVRDOŇ, 1963)
- 11 -
Rod Kluyveromyces Rod
Kluyveromyces
se
taxonomicky
řadí
do
Ascomycetes,
třída
Hemiascomycetes, řád Endomycetales. Druhy rodu Kluyveromyces se původně zařaďovali do rodu Saccharomyces. Podrobnějším zkoumáním se však dokázalo, že rod Saccharomyces je velmi heterogenní a hovořilo se o rodě Saccharomyces in sensu stricto a o Saccharomyces in sensu lato. Rod Kluyveromyces se od rodu Saccharomyces odlišuje více vlastnostmi: V druzích rodu Kluyveromyces se vytvářejí spóry různých tvarů (kulovité, ledvinovité atd.). Aska mají křehkou stěnu, ve zralosti lehce pukají a uvolňují spóry. Oxidativně utilizují více sacharidů než druhy rodu Saccharomyces. Buňky jsou menší a jemnější a snáze vytvářejí pseudomycelium. Druhy rodu Kluyveromyces neprokvašují roztoky sacharidů tak hluboko jako druhy rodu Saccharomyces. Vytvářejí jen 4-4,5% ethanolu. Druhy rodu Kluyveromyces produkují ethylacetát, zatímco druhy rodu Saccharomyces ne. Biomasa druhů rodu Kluyveromyces obsahuje často heminové hnědočervené barvivo. Imunologické precipitační reakce se sérem proti S. cerevisiae jsou pozitivní s některými druhy rodu Kluyveromyces, ale hybridy se S. cerevisiae tyto reakce nedávají. Oba dva rody se odlišují i haploidním genomem,
odlišují
se
i
počtem
chromozómů
v haploidech.
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1990)
Podrod Pichia Buňky jsou oválné až podlouhlé, množí se multilaterálním pučením Tvoří pseudomycelium. Askospóry jsou gelovité někdy kloboukovité, rychle opouští askus. Na tekutých produktech vytváří vrasčitou bílou blanku moučného vzhledu. Podrod Pichia zkvašuje cukry za vzniku kyseliny octové. Organické kyseliny tvoří s alkoholickými estery, které můžou způsobit v kvasícím produktu nepříjemnou chuť a vůni. Fermentují pentózy. Vyskytují se ve fermentovaných nápojích, ovocných šťávách, majonéze. (GÖRNER, VALÍK, 2004)
Podrod Hansenula Tyto kvasinky tvoří buňky různých tvarů, menší kulaté až oválné anebo i velmi protáhlé. Uvnitř buněk vznikají kulaté, polokulaté a kloboukovité spóry často prstencovitě uspořádané, podle toho se nazývají saturnovité. Lehce sporulují i v blance. Asimilují dusičnan, tvoří kyseliny a estery. Dobře fermentují cukry. V přírodě jsou
- 12 -
velmi rozšířené a vyskytují se převážně jako kontaminanty v různých potravinářských závodech. V pivovarnictví způsobují zákaly piva. Podrod Hansenula oxiduje ethanol, z alkoholu a kyselin vznikají estery, které zapříčiní nežádoucí chuťové změny (GÖRNER, VALÍK, 2004).
2.1.2 Identifikace kasinek Při hodnocení kvasinek, které popsali ŽÍŽKA, KORBELOVÁ (1992) je třeba v případě pochybností, zda jde o kolonie kvasinek nebo bakterií, provést mikroskopické vyšetření. Pokud chceme zjistit kvasinky provádíme určování, neboli identifikaci. Při určovaní kvasinek nejprve provedeme izolaci. Při izolaci získáváme monokulturu kvasinek. Získáme-li kvasinky z prostředí, kde byly v menšině, hovoříme o nahromaďovaní, nebo pomnožení. Kultivaci pak provádíme tak, aby se kvasinky přednostně pomnožili. Poté provedeme mikroskopické vyšetření kde stanovujeme: a) Morfologické vlastnosti: zjišťujeme nativními nebo orientačními barevnými preparáty kvasinek vyrostlých na sladinovém agaru nebo ve sladině. Provádíme roztěr z různých částí kolonie. b) Tvorba pseudomycelia je pozorovatelná u mnoha druhů kvasinek v závislosti na životních
podmínkách
(nedostatek
uhlíku,
aminokyselin
apod.).
Pseudomycelium můžeme pozorovat pouhým okem nebo lupou jako jemná vlákna kolem kolonie. Dokonalejší způsob hodnocení spočívá ve fixaci, obarvení a mikroskopovaní sklíčkové kultury. c) Rozmnožovací vlastnosti. Tvorba askospory bývá často potlačena, zejména u kulturních kvasinek. Většinou je třeba tvorbu kvasinek indukovat. Při indukci spór se postupuje tak, že kvasinky se nejprve kultivují v tekuté živné půdě, která je bohatá na živiny tzv. presporulační agar. Pak následuje kultivace na agarové spolurační půdě např. Fowellově agaru nebo na Gorodkovové agaru. d) Nepohlavní dělení. Zjišťujeme, zda-li kvasinky vznikají pučením či dělením. Objektivní výsledky získáme přímým pozorováním procesu. Dále provedeme kultivační vyšetření kde hodnotíme způsob růstu na agarových a tekutých živných půdách. Zjišťujeme morfologii kolonií: velikost, morfologické typy kolonií: hladká, drsná, slizovitá. Kolonie rozlišujeme na jednobuněčná a vícebuněčná. V tekutých půdách hodnotíme sediment, zákal a blanku na povrchu. Na konce provedeme biochemické vyšetření které je u kvasinek velmi důležité. Zjišťujeme ve zkumavkách s plynovkami. Tekutá živná půda obsahuje zkoušený cukr. Po zaočkování - 13 -
kultivujeme a podle změny barvy a plynu v plynovce usuzujeme na pozitivní a negativní reakci. Biochemické vlastnosti zjišťujeme pomocí identifikačních testů a skríningů. Skríningy se používají tehdy, když z velkého souboru kmenů vybíráme kmen určitých vlastností. Musí to být metody jednoduché, rychlé a citlivé.
2.1.3 Vzájemný vztah kvasinek s bakteriemi Příznivý vliv určitých druhů organismů na jiné druhy organismů se projevuje při tzv. syntrofismu, který umožňuje žít určitým mikroorganizmům v daném prostředí. Příkladem syntrofismu jsou kefírové kultury, které se skládají z kvasinek a mléčných bakterií (ŠILHÁNKOVÁ, 2003). Typická mikroflóra kefírových zrn je složena z mléčných kvasinek a mléčných streptokoků-laktokoky a laktobacily typické pro kefírové zrna. Z laktokoků jsou to převážně Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris. Z laktobacilů jsou to Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei a Lactobacillus kefir a z mléčných kvasinek jsou to Kluyveromyces fragilis a Torulopsis kefir. Kefírové laktobacily samotné v mléku špatně rostou, naproti tomu spolu s kefírovými kvasinkami tvoří symbiózu a v jejich společnosti dobře rostou. Tvoří více kyseliny mléčné než laktokoky, ale až v pozdějších fázích fermentace mléka. Jejich další významnou úlohou v kefírových zrnech je tvorba spojiva, které zůstávají z nerozpuštěných polymerů vznikajících při extracelulární syntéze. Mléčné kvasinky fermentují laktózu za tvorby menšího množství ethanolu a CO2. Fermentující kefírové zrna se vyplaví v důsledku produkce CO2 na povrch mléka. Po koagulaci kaseinu se napoutají na povrch a v tomto kaseinovém povlaku se mikroorganismy dále množí a metabolizují. Kefírová zrna se při dobré manipulaci s nimi za týden zvětší o 30-50% Bakterie mají vyšší optimální teplotu než kvasinky, proto při teplotách 26-30oC kefír začne rychleji kysnout a tvoří se koagulát. (GÖRNER, VALÍK, 2004)
2.1.4 Faktory ovlivňující metabolismus kvasinek Činnost mikroorganismů a často jejich existence je závislá na vnějších podmínkách a životaschopná je jen tehdy, když tyto podmínky jsou optimální. Trvají-li nevhodné podmínky delší dobu, buď mikroorganizmy zhynou, nebo se mohou u některých jedinců vyskytnout nové vlastnosti, vhodné pro uchování jedince, který se přizpůsobuje novým vnějším podmínkám. (OLŠANSKÝ, 1958, ŠILHÁNKOVÁ, 2003, GÖRNER, VALÍK, 2004) - 14 -
Faktory vnějšího prostředí, které mají vliv na kvasinky, je možné rozdělit na:
1) Faktory chemické, ke kterým v první řadě patří: a) Podmínky výživy. Přítomnost živin má největší význam, z kterých kvasinky kryjí svou látkovou a energetickou spotřebu. Nacházejí-li se v prostředí živné látky, mohou kvasinky růst a rozmnožovat se, bez nich brzy hynou. b) Reakce prostředí. Každý druh mikroorganismu má svoje optimální pH, při kterém jsou veškeré životní projevy nejlepší. Kvasinky rostou v širokém rozmezí pH od 3 po maximální hodnotu mezi pH 8–9. Kvasinky mají optimum kolem pH 4,5–5. c) Oxido-redukční potenciál. Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík, ale mají i schopnost přeměnit svůj metabolizmus za anaerobní podmínek na fermentační a při silně omezeném růstu buněčné hmoty produkovat ethanol a CO2. d) Jedovaté látky nacházející se v prostředí. Většina jedovatých látek má na mikroorganismy nepříznivý protoplazmatický vliv, který působí na protoplazmu mikroorganismu. Mezi jedovaté látky můžeme řadit těžké kovy např. olovo, stříbro, rtuť, které působí toxicky již při velmi slabých dávkách.
2) Faktory fyzikální: a) Teplota. Teplota prostředí má pro mikroorganismy velký význam, neboť umožňuje jejich vývoj a ovlivňuje jejich růst. Životní činnost každého druhu mikroorganismu je omezena určitými hranicemi. Hranice se vyjadřují třemi hlavními hodnotami: teplotní optimum, teplotní minimum, teplotní maximum. Mezi teplotním minimem a teplotním optimem nedochází k poškození buňky, ale v hranici mezi teplotním optimem a maximem dochází ke změnám, které mají škodlivý účinek. Kvasinky rostou v širokém rozmezí teplot a to od 0 až po 45oC. Určité druhy rostou i při teplotě -10 oC, jejich optimální teplota je 28oC. b) Vodní aktivita aw. Snižování obsahu vody v buňce způsobuje zpomalení růstu. Citlivější mikroorganismy za těchto podmínek hynou. Optimální hodnota aw je pro většinu mikroorganismů aw > 0,98. Při snížení hodnoty aw z prostředí (odnímáním vody sušením, přídavkem soli, cukru) se množství využitelné vody snižuje a růst kvasinek je částečně nebo úplně inhibován. Odolnost vůči nízké aw mají nejvíce plísně a pak kvasinky. Interval minimálních hodnot aw u kvasinek je 0,94-0,87. Schopnost přežívat při vysokých koncentracích soli a cukru, nebo při vysokém osmotickém tlaku je u
- 15 -
mnohých osmofilních kvasinek. U osmofilních a osmotolerantních kvasinek je aw 0,650,61. c) Vliv světla. Světlo působí na mikroorganismy škodlivě. V přírodě jsou chráněny před přímým slunečním zářením různými látkami, které světelné paprsky pohlcují. Škodlivý účinek světelných paprsků je závislý na vlnové délce. Nejvíce škodlivé pro mikroorganismy je ultrafialové a ionizační záření.
2.2 Výskyt kvasinek v přírodě Kvasinky a kvasinkovité organismy jsou v přírodě velmi rozšířené. Protože mají většinou pouze sacharolytické schopnosti, vyskytují se především na materiálech obsahující cukry, tj. na ovoci, zvláště bobulovém a peckovém a na cukernatých potravinách (ŠROUBKOVÁ, 1996). Výskytem organizmů v přírodě a v průmyslově-hospodářských podmínkách se zaobírá ekologie, která je předmětem vztahu mezi organizmem a prostředím. Kvasinky a jejich činnost jsou tedy malým zlomkem ze všech činitelů vytvářející životní prostředí člověka (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990). Výskyt kvasinek je omezen různými faktory. Kromě přítomnosti cukrů, je to např. teplota. Většina kvasinek se při teplotách nad 40oC nerozmnožuje, teploty nad 60 oC je ničí. Spóry kvasinek snáší vyšší záhřev, než vegetativní buňky, někdy mohou přežit i terminaci (ŽIŽKA, KORBELOVÁ, 1992).
2.2.1 Pedosféra Kvasinky z půdy izolujeme zpravidla v místech, kde je rostlinný porost, v oblasti kořenů anebo v jejich blízkosti. V rizosféře se vyskytují různé druhy rodů Lipomyces, Williopsis, Mastigomyces a jiných. Nachází se tu často sporotvorné druhy a jejich anamorfní formy. Z těchto vrchnějších vrstev půdy se potom dostávají na rostliny, odkud je hmyz rozšiřuje dále. (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990) Přestože je na Antarktidě velmi extrémní prostředí, byly zde nalezeny kvasinky v půdě (VISCHNIACOVÁ, 1983).
2.2.2 Hydrosféra Kvasinky a kvasinkovité mikroorganizmy se vyskytují i ve vodách oceánu, menších moří, v jezerech, v sladkých vodách řek, rybníků a jezer. Velký podíl na jejích
- 16 -
výskytu ve vodách má člověk, který vypouští hospodářské a průmyslové odpady do kanálů a řek. Izolované kvasinky z moří je možno zařadit do dvou skupin : 1. Kvasinky s vlastnostmi terestrických kvasinek, které se do moře dostali řekami, do kterých byli spláchnuté z pevniny (z organických substancí, z květů a živočichů) 2. Kvasinky, které pocházejí z otevřeného moře Terestrické kvasinky nemají v moři dobré podmínky na život, protože oceány se vyznačují nízkým obsahem kyslíku, organických živin, změnami teploty od nulové do 30oC, alkalickou reakcí, vysokou slaností a hydrostatickým tlakem dosahující až několik sto atmosfér. Nejčastěji se však zkoumají společenstva v řekách a v jezerech, kam přicházejí hospodářské a průmyslové odpady. Hospodářské odpady zvyšují počet kvasinkových buněk až na 27 000 v litru, což je desetkrát víc, než se najde v mořských zátokách. (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990)
2.2.3 Atmosféra Atmosféra není přirozeným prostředím pro kvasinky. Kvasinky se dostávají do vzduchu prouděním vzduchu, který odnáší částice prachu. Atmosféra je faktorem, který kvasinky potlačuje tím, že obsahuje dýmové plyny, různé aerosoly a jiné produkty přetechnizovaného světa. Ale vzhledem na to, že se do atmosféry může dostat jakýkoliv mikroorganizmus, dělají se velmi často mikrobiologické průzkumy atmosféry v zájmu hygieny a nebo průmyslu (DART, STRETTON 1980).
2.2.4 Biosféra Kvasinky a kvasinkovité organizmy se velmi často vyskytují na materiálech rostlinného nebo živočišného původu. Když kvasinky žijí na úkor rostliny a nebo živočicha, rozmnožují se v těle hostitele. Jakmile parazitické kvasinkové kmeny zapříčiní
onemocnění
člověka
nebo
zvířete,
jsou
patogenní
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1990). 2.2.4.1 Rostliny a jejich společenstva Kvasinky se často izolují z listů krytosemenných a z jehličí nahosemenných rostlin. Zde se často vyskytují kožkotvorné kvasinky, jako Pichia, Debaryomyces a jiné. Zpravidla dovedou štěpit dlouhé řetězce mastných kyselin, které jsou součástí vosků na povrchu jehličí a listů. Pro tuto vlastnost můžeme z rostlin izolovat kvasinky schopné štěpit mikromycety, které můžou na listech i parazitovat. Kvasinky se často nacházejí - 17 -
v kalichu květů jako nektarové kvasinky, ale najdeme je i na okvětních lístcích a jiných částí květů. U Baltského moře, kde je silné ultrafialové záření převládají na květech kvasinky
s
karotenoidy
(Rhodotorula,
Sporobolomyces)
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ A KOL., 1972 a, b). 2.2.4.2 Živočichové Tak jako rostliny i živočichové jsou bohatým zdrojem kvasinek. Kvasinky, které se vykytují na živočiších, můžeme rozdělit do skupin podle jejich účinku na makroorganizmus: 1. Patogenní kvasinkovité organizmy, které způsobují choroby lidí a zvířat 2. Ostatní, které makroorganizmus nepoškozují a nebo dokonce jsou pro něho potřebné. Podmínky v jakých se můžou tyto mikroorganizmy na člověka zhoubně projevit, nejsou dobře známy. U živočichů způsobují mykózy různého charakteru. Velmi důležitou složkou biotopu, v které se vykytují kvasinky je hmyz. Hmyz rozšiřuje kvasinky z půdy, stromů, květů, vody na jiné místo žijících a nebo odumírajících rostlin (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1990). LAVIE, GRASE (1945)(viz. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990) nalezl kvasinky u včel napadnutými roztoči. Zjistil u nich Kloeckera apiculata, kterou označil jako variate apis. Tato kvasinka neškodí včelám ani člověku, ale ničí roztoče, proto ji označil jako Acaromyces, co se však neujalo.
2.3 Průmyslové využití kvasinek Kvasinky mají v potravinářské technologii dvojí význam, jako technologicky využívané mikroorganizmy ve fermentačním průmyslu při výrobě piva, ethanolu, kvasnic a při výrobě pekařských produktů. Ale také jsou škůdci masa, ryb, výrobků studené kuchyně, mléčných produktů, fermentovaných potravin a výrobků s vysokým obsahem cukru (GÖRNER, VALÍK 2004). Velmi perspektivní je využití kvasinek v tzv. bezodpadových technologiích. Zajímavým příkladem z ekologického hlediska je využití kvasinek Candida utilis v celulózkách. V odpadních vodách, které obsahují sulfitové výluhy, se kvasinky pěstují. Získaná hmota nových buněk kvasinek tzv. biomasa se suší. Označuje se jako krmné droždí a používá se ke krmení hospodářských zvířat. Hodnota krmného droždí - 18 -
spočívá ve vysokém obsahu proteinů. Využívá se k tomu tradičních substrátů jako je melasa, sulfitové výluhy a výpalky, lihovarské výpalky, odpady při výrobě kyseliny citrónové apod., ale i netradičních substrátů (petrochemických surovin). Droždí se pro svůj vysoký obsah proteinů, aminokyselin a vitamínů používá také při přípravě léčivých výživných preparátů. Autolyzáty a extrakty droždí nebo odhořčených pivovarských kvasnic se dávají jako přísady do potravin (hlavně do polévek, omáček a polévkového koření). Jsou rovněž důležitou složkou živných půd v mikrobiologických laboratořích. (ŽIŽKA, KORBELOVÁ 1992, ŠROUBKOVÁ, 1996) Průmyslový význam kvasinek, který spočívá ve využití kvasinek pro výrobu alkoholických nápojů, výrobu pekařského a krmného droždí. Ethanol pro technické účely se však dnes většinou vyrábí synteticky neboť tento způsob je v současné době levnější než zkvašování hodnotných surovin. Proto se pro lihové kvašení používají pouze některé odpady, jakými jsou např. sulfitové louhy. Značné produkce ethanolu se ovšem dosahuje i při výrobě pekařského droždí, jehož roční světová produkce představuje přes milion tun. Přiboudlina, tj. vyšší alkoholy, které se získávají při rafinaci kvasného lihu, se používá hlavně jako rozpouštědlo laků. Kvasinky se využívají občas i také při výrobě glycerolu, hlavně pro vojenské účely. Stoupající cena ropy však vedla k tomu, že se v některých státech začíná vyrábět kvasný ethanol jako částečná náhražka benzínu. Z buněk kvasinek se izoluje pro komerční účely také řada látek a sloučenin, používaných v biochemických laboratořích, např. enzymů, koenzymů, nukleotidů, nukleotidů (ADP, ATP) apod. Speciální kmeny Saccharomyces cerevisiae se používají pro výrobu ergosterolu (provitaminu D), který po ozáření ultrafialovým světlem poskytuje vitamin D. Ergosterol se izoluje z buněk kvasinek. Některé rodotoruly se používají pro produkci karotenoidů a tuků. Někteří příslušníci rodů Saccharomyces a Kluyveromyces slouží jako zdroj enzymů používaných v průmyslu. Přítomnost kvasinek v potravinách může ale někdy způsobit i jejich znehodnocení. Kvasinky společně s plísněmi mohou kazit řadu mléčných výrobků, protože jsou schopny růstu při nízkém pH. Tvrdé sýry obsahují velmi nízké množství laktózy, což limituje růst kvasinek. Fermentované mléčné výrobky (jogurty, čerstvé sýry) však naopak obsahují vyšší koncentraci laktózy a jsou tedy náchylné ke zkažení. Nejvíce se vyskytují na mléčných výrobcích druhy kvasinek Kluyveromyces marxianus, Debaryomyces hansenii, Candida tamara, Candida kefyr a jiné druhy rodu Candida. Kvasinky mohou také kazit hotové víno, které je vystaveno vzduchu. - 19 -
Tvoří velmi vhodné prostředí pro rozvoj kvasinek hlavně rody Candida, Pichia, Hansenula a ve sklepích druh Zygosaccharomyces bailli (DOYLE et. al., 2001).
2.4 Kvasinky rodu v potravinářství
Kluyveromyces
a
jejich
využití
Rod Kluyveromyces se množí multilaterálním pučením a tvoří pseudomycelium. Kvasinky rodu Kluyveromyces nemají hexosovou respiraci, ve vegetační fázi je převážně haploidní. Rod Kluyveromyces obsahuje homothalické i heterothalické kmeny. Druh Kluyveromyces marxianus se svými dvěma variantami a to var. marxianus (dř. Kluyveromyces marxianus a Kluyveromyces fragilis) a var. lactis (dř. Kluyveromyces lactis) zkvašují laktózu a jsou součástí tzv. kefírových zrn, používaných při výrobě kefíru. Jednotlivé varianty se liší tvarem askospór. (http://www.vscht.cz/Kch/galerie/kvasinky.htm)
Van der Walt a Johannsenová (1984) řadí druh Kluyveromyces lactis do druhu Kluyveromyces marxianus jako Kluyveromyces marxianus var. lactis, ale KockováKratochvílová s tím nesouhlasí a nechává jej samostatně. Výše zmíněným autorům vytýká, že při popisu Kluyveromyces marxianus var. lactis, se vůbec nezmínili, že se jedná o heterothalický druh, ve vegetativní fázi v haploidním stavu, že se opačné párovací typy musí nejprve zkřížit, aby vznikly diploidní buňky, zygoty, asky a askospóry. Využití kvasinek rodu Kluyveromyces: jsou součástí kefírových zrn tj. konglomerátu kvasinek a bakterií, používaného při výrobě kefíru. Také se používají při výrobě sýrů s plísní uvnitř. Produkuje β-galaktosidasu, pomocí níž může utilizovat laktosu
z
odpadní
suroviny
mlékárenského
(http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm)
- 20 -
průmyslu-syrovátky.
2.4.1 Druh Kluyveromyces marxianus var. lactis Kultivace: Optimální teplota: 30°C, doba kultivace 24 až 48 hod., doporučená kultivační média: sladinový agar. Morfologické znaky: Tvar a velikost vegetativních buněk [µm]: Vegetativní buňky jsou kulovité nebo elipsoidní až cylindrické s rozměry (2-6,5)x(3-8). Vyskytují se jednotlivě, v párech i v malých shlucích. Vzhled a konzistence kolonií: Nátěr je hnědokrémový nebo krémovošedý, často kombinovaný s růžovým, povrch hladký i bradavičnatý, slizký i matný. Vytváří se jen rudimentární pseudomycelium. Charakter nárůstu v kapalném mediu: V kapalinách vytvářejí sediment a prstenec, ale zpravidla i tenkou kožku na povrchu. Způsob rozmnožování: Vegetativní rozmnožování: Ve vegetativní fázi růstu převládá haploidní stav. Rozmnožuje se pučením. Pohlavní rozmnožování - Jedná se o jediný heterothalický druh v rodu Kluyveromyces. Po smíchání opačných párovacích typů se za 12 - 14 hodin tvoří zygoty, které zpravidla ihned potom vytvářejí spóry. Diploidní stav v životním cyklu této kvasinky je jen přechodný. Zygoty se lépe tvoří v méně výživném prostředí, v plnohodnotném médiu převládá vegetativní růst. Vegetativní diploidní buňky se mohou přímo měnit na askus. Vytvářejí se 1-4 askospóry, které jsou kulovité, hladké, z asku se snadno uvolňují a aglutinují.
- 21 -
Obr. č. 2 Nárůst kvasinky Kluyveromyces marxianus var. lactic po 48 hodinách na sladinovém agaru. Zdroj: (www.vscht.cz/Kch/galerie/kvasinky.htm)
2.4.2 Druh Kluyveromyces marxianus var. marxianus Kultivace: Optimální teplota 30°C, doba kultivace 24 až 48 hod., doporučená kultivační média: sladinový agar Podle Van der Walta a Johannsenové (1984) se mezi synonyma Kluyveromyces marxianus zařazuje i Kluyveromyces fragilis. Tito autoři sem zařadili i jiné druhy, např. i Kluyveromyces lactis bez ohledu na to, jaké spóry vytváří. Morfologické znaky: Tvar a velikost vegetativních buněk [µm]: Buňky jsou elipsoidní nebo cylindrické s rozměry (2-6 )x (3-10), samotné nebo v párech či řetízcích. Pseudomycelium se vytváří dobře, pravé mycelium ne. Vzhled a konzistence kolonií: Nátěr na tuhých půdách je těstovitý, krémový až světle hnědý, plochý, ve středu vyvýšený, lesklý, někdy i matný. Charakter nárůstu v kapalném mediu: Na kapalinách vytváří mázdru nebo kožku.
- 22 -
Způsob rozmnožování: Vegetativní rozmnožování - Vegetativně se rozmnožuje pučením. Pohlavní rozmnožování - Tvorbě asků předchází konjugace rovnocenných buněk, nebo se diploidní buňky přímo mění na asky. V ascích jsou 1-4 ledvinovité spóry. Jedná se o homothalický kmen. (http://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm)
Obr. č. 3 Nárůst kvasinky Kluyveromyces marxianus var. lactic po 48 hodinách na sladinovém agaru. Zdroj: (www.vscht.cz/Kch/galerie/kvasinky.htm)
Obr. č. 4 Nárůst kvasinky Kluyveromyces marxianus var. marxianus po 48 hodinách na sladinovém agaru. Zdroj: (www.vscht.cz/Kch/galerie/kvasinky.htm)
- 23 -
2.4.3 Druh Kluyveromyces fragilis (v imperfektním stadiu Candida pseudotropicalis) Mezi Kluyveromyces fragilis a Kluyveromyces marxianus není celkem přesný rozdíl, dají se však odlišit několika znaky. Kluyveromyces fragilis zkvašuje dobře laktózu. Kluyveromyces marxianus laktózu zkvašovat nemusí. Do druhu Kluyveromyces marxianus teda řadíme kmeny nezkvašující laktózu. Kluyveromyces fragilis má α–glukosidásu. Patří mezi nejteplomilnější kvasinky, snáší teplotu až 47oC. Způsobuje kontaminaci na hroznovém vínu a v moštu. Na rozdíl od Kluyveromyces marxianus může
žít
na
teplokrevných
živočiších
a
způsobit
choroby.
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1990) Je to homothalická askosporogenní kvasinka. Je fermentativní, za anaerobních podmínek často tvoří pseudomycelium. Vzhledem ke schopnosti zkvašovat laktosu je využívána pro kvašení syrovátky, dále jako producent enzymů (polygalakturonidasa, invertasa, β-galaktosidása) (GÖRNER, VALÍK, 2004).
2.4.4 Kefír Kvasinky rodu Kluyveromyces se využívají převážně v mlékárenském průmyslu na výrobu kefíru. Kefírem se obecně myslí nápoj, který je vyrobený kvašením pomocí kefírové kultury. Kefírová zrna vznikají symbiotickou činností mikroorganismů. Kefírové kultury se skládají z kvasinek a mléčných bakterií, kde bakterie okyselují prostředí na pH vhodné pro kvasinky a kvasinky pravděpodobně dodávají do prostředí určité růstové látky. Nápoje, které se kvasným procesem vyrábějí, obsahují velmi vzácné a zajímavé látky, které se v běžné potravě téměř nevyskytují. Existují dva druhy kefírové kultury. Jeden druh žije a rozmnožuje se v mléce, má mazlavou gelovitou konzistenci bílé barvy (vypadá jako malé měkké růžičky květáku ) a vyživuje se laktózou, zatímco „krystalky“ toho druhého, žijícího ve sladké vodě, jsou pružné, průsvitné a křehké.
Obr. č. 5 Kefírová kultura Zdroj: (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm) - 24 -
V podstatě známe pouze dva druhy pravých "kefir grains" (mateřské kultury) a to kavkazská a tibetská. Kavkazská roste do větších "karfiolků", tibetská má menší velikost, ale v zásadě jsou stejné, i když zde mohou být patrné drobné rozdíly ve složení biomasy. Kefírovou kulturu je vhodné získat z co nejbližší vzdálenosti nebo od nějakého zkušeného zasilatele, který umí zpomalit růst kefírové kultury. Kefírové zrna nikdy nesmí přijít do styku ani s kapičkou chlórované vody, s žádným kovem atd., jinak uhynou. (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm) Podle toho, jak dlouho se kefír sráží, rozeznává se jednodenní, dvoudenní a třídenní. Jednodenní kefír je slabý, málo kyselý a slabě šumí. Dvoudenní je středně kyselý a dobře šumí, třídenní je silně kyselý a silně šumí. Podle toho, jak kefír dlouho zraje, proběhnou v něm biochemické procesy do různé hloubky a šíře a podle toho má kefír různé složení. Šumivý kefír se vyznačuje vysokým obsahem CO2 a mírným zvýšením obsahu ethanolu. Zvýšený obsah CO2 se získá fermentací mléka z 3-10% kefírové kultury v uzavřených obalech. Kultivuje se při teplotě 20oC po dobu 24 až 48 hod. při občasném protřepáním. Z vad kefíru se nejčastěji vyskytuje zesliznutí kefíru, které bývá způsobeno degenerací bakterií mléčného kysaní. Nepříjemnou chuť po kvašení máselném má kefír tehdy, když se v něm silně rozmnoží bakterie druhu Clostridium esterificans a Clostridium kefír. (OLŠANSKÝ, 1958, GÖRNER, VALÍK, 2004)
Obr.č.6 Srovnání mléčných a vodních kefírových zrn. Zdroj: (www.fisar.net/tibi/tibi-priprava.htm)
- 25 -
2.4.5 Původ kefíru Kefírová kultura pochází jednak z Kavkazských hor a taky z opatství v Tibetu (zdejší obyvatelé kefírová zrna nazývají Tibetská houba) a je stará asi 5000 let. Co se Kavkazu týká, tak podle legendy daroval kefír příslušníkům ortodoxní církve Alláhův prorok, Mohamed. Kvůli pověře, že „Prorokova zrna“ ztratí svoji moc a sílu, pokud by se ho zmocnili nevěřící, byl přísně střežen před cizinci a byl předáván z generace na generaci a pokládán za součást kmenového bohatství. Cizinci občas dostali ochutnat hotový nápoj, ale samotná kefírová kultura zůstávala tajemstvím.V devatenáctém století začali kefír zkoumat ruští lékaři a začali publikovat vědecké studie o pozitivních účincích kefíru. K získání kefírových zrn prý použili krásnou ženu, která měla obměkčit srdce kavkazského knížete, která pak jako první přivezla do Moskvy hrnek "chrchlíků". Obyvatelé Kavkazu používali kefír pro uchování kozího, koňského nebo kravského mléka bez ledniček. (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm)
2.4.6 Vlastnosti kefíru Nápoj ať už mléčný nebo vodní zamezuje hnití látek ve střevech, odkyseluje organismus i když je chuťově kyselý, vyvolává zásaditou reakci organismu, produkuje enzymy, které pomáhají uvolnit ve vodě nerozpustné látky, rozkládá těžce stravitelné látky proto například ti, pro koho je mléko těžce stravitelné, nemívají s mléčným kefírem problémy. Některé vlastnosti pravého kefíru, jsou zaznamenané podle zkušenosti mnoha generací.
2.4.6.1 Účinnost kefíru Uspořádá imunitní systém a zvyšuje odolnost těla vůči nemocem. Reguluje krevní tlak, krevní cukr a léčí cukrovku. Léčí plíce, záněty průdušek, tuberkulózu, astma, alergie a migrénu. Má příznivý vliv na srdce a krev, léčí problémy krevního oběhu. Hojí různé ekzémy a všechna onemocnění pleti, vede k vyléčení trudovitosti. Léčí ledviny, močový trakt a chrání prostatu. Má přímý vliv na hladinu cholesterolu, osteroporézu a revmatismus. Podporuje produkci enzymů a léčí slinivku břišní. Zlepšuje činnost jater a žlučníku, upravuje produkci žluči, má pozitivní vliv na zánět jater.
- 26 -
Přizpůsobuje látkovou výměnu, trávení, a léčí onemocnění tlustého střeva. Léčí záněty tlustého střeva, průjmy, katary, výtoky, syndrom netěsného vratníku, canditidu a jiné nemoci. Obnovuje rovnováhu střevní mikroflóry a žaludečních kyselin, léčí vředy ve dvanácterníku. Produkuje vlastní antibiotika, ničí nepřátelské baktérie, léčí vnitřní a vnější záněty. Léčí alergii na laktózu a zajišťuje úplné trávení mléčných produktů. Vyrábí vlastní protirakovinové složky, předchází metastázám a vede k jejich vyléčení. Zpomaluje proces stárnutí, vyhlazuje a vylepšuje pleť, vlasy a uvolňuje svalové napětí. Snižuje neklid a deprese, zvyšuje energii a pocit spokojenosti. (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm)
- 27 -
Tabulka č. 1 Mikroorganismy, které se mohou vyskytnout v mléčném kefíru Lactobacillus
Streptococcus/Lactococcus Kvasinky
Acetobakterie
Lb. acidophilus
Lactococci lactis subsp.
Candida kefir
Acetobacter
Lb. brevis
lactis
C. pseudotropicalis
aceti
Lb. casei
Lc. lactis var. diacetylactis
C. rancens
A. rasens
Lb. casei subsp.
Lc. lactis subsp. cremoris
C. tenuis
rhamnosus
Streptococci salivarius
Kluyveromyces
Lb. casei subsp.
subsp. thermophilus
lactis
pseudoplantarum Strep. lactis
Kluyveromyces
Lb. paracasei
Enterococcus durans
marxianus var.
subsp. paracasei
Leuconostoc cremoris
marxianus
Lb. cellobiosus
Leuc. mesenteroides
K. bulgaricus
Lb. delbrueckii
K. fragilis /
subsp. bulgaricus
marxianus
Lb. delbrueckii
Saccharomyces
subsp. lactis
subsp.
Lb. fructivorans
Torulopsis holmii
Lb. helveticus
Saccharomyces
subsp. lactis
lactis
Lb. hilgardii
Sacc. carlsbergensis
Lb. kefiri
Sacc. unisporus
Lb.
Debaryomyces
kefiranofaciens
hansenii
Lb. kefirgranum
Zygosaccharomyces
sp. nov
rouxii
Lb. parakefir sp. nov Lb. lactis Lb. plantarum Zdroj: (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm)
- 28 -
Tabulka č. 2 Mikroorganismy, které se mohou vyskytnout ve vodním kefíru: Lactobacillus
Streptococcus/Lactococcus Kvasinky
Lb. alactosus
Streptococcus cremeris
Saccharomyces cerevisiae
Lb. brevis
Str. faecalis
S. florentinus
Lb. casei subsp. casei
Str. lactis
S. pretoriensis
Lb. casei subsp.
Leuconostoc mesenteroides Candida valida
pseudoplantarum
Pediococcus damnosus
C. lambica
Lb. casei subsp.
Kloeckera apiculata
rhamnosus
Hansenula yalbensis
Lb. casei subsp. tolerans Lb. coryneformis subsp. torquens Lb. fructosus Lb. hilgardii Lb. homohiochi Lb. plantarum Lb. pseudoplantarum Lb. yamanashiensis Zdroj: (www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm)
- 29 -
3 Cíl práce Cílem práce bylo shromáždit informace o kvasinkách, způsobu identifikace, jejich vzájemný vztah s bakteriemi. Dále popsat výskyt kvasinek v přírodě a využití v potravinářském průmyslu. Zjistit faktory ovlivňující metabolismus kvasinek. Zhodnotit kvasinky rodu Kluyveromyces a jejich uplatnění při zpracování mléka.
- 30 -
4 Mikrobiologická analýza kefírových zrn 4.1 Izolace kvasinek rodu Kluyveromyces K analýze kefírových zrn byl použit vodní kefír získaný z mlékárny (viz.obr.č.7). Pro izolaci kvasinek byl použit speciální živný agar pro kvasinky a plísně s chloramfenikolem (antibiotikum zamezující rozvoj bakterií). Kvasinky spolu s mléčnými bakteriemi byly kultivovány na masopeptonovém agaru.
Obr.č.7 Kefírová zrna ve vodném prostředí
4.1.1 Složení živných agarů Masopeptonový agar K přípravě MPA bylo použito komerčně vyráběného dehydratovaného média.
Chloramfenikol-glukózový agar Tato půda byla použita pro stanovení kvasinek. Složení: kvasničný extrakt……………………………………………………………5,00 g glukóza…………………………………………………………………….20,00 g chloramfenikol……………………………………………………………...0,10 g agar………………………………………………………………………..15,00 g destilovaná voda………………………………………………………..1000 ml pH (po rozpuštění)……………………………………………………….…6,6 + 0,2 Bylo naváženo x g sušené živné půdy (CHL, výrobce: NOACK, s.r.o.,Praha) na1 l destilované vody do Erlenmayerovy baňky.
Živné agary byly rozlity do sterilních Petriho misek. Poté byla kefírová zrna desintegrována pomocí kličky a skalpelu. Vzniklá hmota byla rozetřena po povrchu živné půdy. Petriho misky pak byly umístěny do termostatu (t = 28oC). - 31 -
4.2 Vyhodnocení Po 5-7 dnech, kdy kvasinky vytvořily na chloramfenikol-glukózovém agaru výraznou biomasu (viz obr.č.8), byly provedeny mikroskopické analýzy. Preparát pro mikroskopování byl připraven následovně: sterilní kličkou byla kultura převedena do kapky destilované vody na podložní sklíčko a rozetřena. Sušena na vzduchu a barvena icholicionovou červení, která se nechala pár sekund působit a pak spláchnuta. Obarvený a osušený preparát se mikroskopuje při zvětšení 40 x 10 (viz.obr.č.9). Pokud byl roztěr kefírových zrn proveden na masopeptonovém agaru, vytvořily kvasinky rodu
Kluyveromyces spolu s mléčnými bakteriemi značnou biomasu už po 4 dnech (viz.obr.č.10). Porovnání obr.č.8 a obr.č.10 dokumentuje, že kvasinky rodu
Kluyveromyces, zbavené mléčných bakterií rostou mnohem pomaleji, než v jejich přítomnosti. .
Obr.č. 8 Nárůst biomasy za 5-7 dnů na chloramfenikol-glukózovém agaru
Obr.č. 9 Mikroskopický preparát z biomasy vyrostlé na chloramfenikol-glukózovém agaru
- 32 -
Obr.č. 10 Nárůst biomasy za 4 dny na masopeptonovém agaru
- 33 -
5 Závěr Byly shromážděny literární údaje o kvasinkách, jejich výskytu v přírodě, způsobu identifikace a využití v potravinářství. Speciální pozornost byla věnována kvasinkám rodu Kluyveromyces a jejich významu pro zpracování mléka. Z vlastních analýz kefírových zrn vyplynulo, že kvasinky rodu Kluyveromyces zbavené mléčných bakterií rostou mnohem pomaleji, než v jejich přítomnosti.
- 34 -
6 Použitá literatura 1. DART, R.K., STRETTON, R.J. MICROBIOLOGICAL ASPECT OF POLLUTIN
CONTROL. AMSTERDAM, OXFORD.NEW YORK, 1980.
2. DOYLE, P., et al. FOOD MICROBIOLOGY. FUNDAMENTALS AND FRONTIER. WASHINGTON, DC, ASM PRESS, 2001. 872 s. ISBN 1-55581-208-2.
3. GÖRNER, F., VALÍK, L. APLIKOVANÁ MIKROBIOLÓGIA POŽIVATÍN. BRATISLAVA, MALÉ CENTRUM, 2004. 528 s. ISBN 80-967064-9-7.
4.
KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ,
A.
TAXONÓMIA
KVASINEK
A
KVASINKOVÝCH MIKROORGANIZMOV. BRATISLAVA, ALFA, 1990. 704 s. ISBN 80-05-00644-6.
5. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A. YESTS, MODELS IN SCIENCE AND
TECHNIC. BRATISLAVA. 1972. 297-303 s.
6.
MARENDIAK,
D.,
et
al.
POLNOHOSPODÁRSKÁ
MIKROBIOLÓGIA.
BRATISLAVA, PRÍRODA, 1987. 433 s.
7. OLŠANSKÝ, Č. VŠEOBECNÁ A MLÉKAŘSKÁ MIKROBIOLOGIE PRO
PRŮMYSLOVÉ ŠKOLY MLÉKAŘSKÉ. PRAHA, SPN, 1958. 513 s.
8.
ŠILHÁNKOVÁ,
L.
MIKROBIOLOGIE
PRO
POTRAVINÁŘE.
PRAHA,
ACADEMIA, 2003. 363 s. ISBN 8-85605-71-6-2.
9. ŠROUBKOVÁ, E. TECHNICKÁ MIKROBIOLOGIE. MZLU, 1996. 194 s. ISBN 807157-226-8.
10. TVRDOŇ, M. ATLAS UŽITEČNÝCH A ŠKODLIVÝCH MIKROORGANISMŮ V
POTRAVINÁŘSKÉM PRŮMYSLU. PRAHA, SPN, 1963. 213 s.
11.VISHNIAC, H.S., CANAD, J. MICROBIOL.,29, 1983. 90-95 s. - 35 -
12. VAN DER WALT, J.P., JOHANNSEN, E. V KREGER-VAN RIJ: 1984.
13. ŽIŽKA, B, KORBELOVÁ, M. MIKROBIOLOGIE 1. PRAHA, 1992. 117-123 s.
INTERNETOVÉ ODKAZY: www.mbm.dotnet11.hostbasket.com/iis/kefir/milkkefir.htm www.fisar.net/tibi/tibi-priprava.htm www.vscht.cz/Kch/galerie/kvasinky.htm www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm www.wikipedia.org/wiki/Kvasinky
- 36 -
