Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mikroorganismy jako kontaminanty zeleninových a ovocných šťáv Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Eva Dojčarová Brno 2009

Zde bude vloženo zadání

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Mikroorganismy jako kontaminanty zeleninových a ovocných šťáv“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne ………………………………………

podpis autora …………............................................

PODĚKOVÁNÍ

Tímto způsobem bych chtěla poděkovat Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení při zpracování této bakalářské práce, za cenné připomínky a rady. V neposlední řadě pak za ochotu ke konzultacím a trpělivost po celou dobu.

V Brně dne ………………………

…………............................... (podpis autora)

Abstrakt Dojčarová E. Mikroorganismy jako kontaminanty zeleninových a ovocných šťáv. Bakalářská práce. Brno 2009 Bakalářská práce se zabývá mikroorganismy, které kontaminují ovocné a zeleninové šťávy. Jsou zde nastíněny možné zdroje mikrobiální kontaminace. Hlavní podíl této práce tvoří charakteristika patogenních plísní, kvasinek, bakterií koliformních, octového kvašení a bakterií mléčného kvašení. V dalším oddílu se práce zabývá mykotoxiny. V práci se objevuje stručný přehled alimentárních nákaz. Taktéž uvádí souhrn faktorů, které mají vliv na růst mikroorganismů. Tato práce dále popisuje způsoby ochrany nebo boje proti mikrobiálním kontaminantům, zvláště pak způsoby konzervace ovocných a zeleninových šťáv. Na závěr se tato práce zabývá experimentálním stanovením různých skupin mikroorganismů ve dvou typech zeleninových šťáv.

Klíčová slova mikroorganismy, mikrobiální kontaminace, mykotoxiny, alimentární nákazy, konzervace, celkový počet mikroorganismů

Abstract Dojčarová E. Microbial contamination of vegetebly and fruit juice. Bachelor´s thesis. Brno 2009 The bachelor thesis drala with microorganisms which contamination sherbet and vegetables sparks. There are state source microbial contamination. The main part of bachelor thesis is characteristics pathogenic fungus yeasts, bakteria, eel. Next part of the Bachelor thesis drala with mycotoxins. In the Bachelor thesis is summary survey foodborne illness and totality factors influencing grow microorganisms. This Bachelor thesis below description process wardships or fight with microbial contamination and process conservation sherbet and vegetables sparks.. In conclusion these Bachelor thesis is experimental assesment groups microorganisms in two tips vegetables sparks.

Keywords

microorganisms, microbial contamination, mycotoxins, alimentary infections, consevation, total number of microorganisms

OBSAH 1 ÚVOD........................................................................................................................... 9 2 CÍL PRÁCE ................................................................................................................ 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................ 11 3.1 Ovocné a zeleninové šťávy a jejich význam....................................................... 11 3.2 Základní suroviny ovocných a zeleninových šťáv a požadavky na ně ............... 12 3.3 Sortiment ovocných a zeleninových šťáv ........................................................... 13 3.3.1 Ovocné šťávy ................................................................................................ 14 3.3.2 Zeleninové šťávy .......................................................................................... 15 3.4 Technologie výroby ovocných a zeleninových šťáv .......................................... 15 3.5 Možné zdroje mikrobiální kontaminace.............................................................. 18 3.5.1 Bakterie koliformní ..................................................................................... 21 3.5.2 Bakterie octového kvašení ............................................................................ 21 3.5.3 Bakterie mléčného kvašení ........................................................................... 22 3.5.4 Plísně ............................................................................................................. 22 3.5.5 Kvasinky ....................................................................................................... 26 3.6 Alimentární nákazy ............................................................................................. 28 3.7 Mykotoxiny ......................................................................................................... 30 3.7.1 Aflatoxiny ..................................................................................................... 31 3.7.2 Patulin ........................................................................................................... 32 3.7.3 Alternáriové mykotoxiny ............................................................................ 33 3.7.4 Další mykotoxiny v ovocných a zeleninových šťávách ............................... 34 3.7.5 Likvidace mykotoxinů z potravin ................................................................ 34

3.7.6 Platné normy pro výskyt mykotoxinů .......................................................... 35 3.7.6.1 Nařízení ES č. 1881/2006 ........................................................................ 35 3.8 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů ........................................................... 36 3.8.1 Vliv aktivity vody (aW)................................................................................. 36 3.8.2 Vliv pH na trvanlivost ovocných a zeleninových šťáv ................................ 37 3.8.3 Redoxní potenciál ......................................................................................... 38 3.8.4 Teplota........................................................................................................... 39 3.9 Prevence mikrobiální kontaminace .................................................................... 40 3.10 Konzervace ovocných a zeleninových šťáv ..................................................... 41 3.10.1 Vylučování mikrobů z prostředí ................................................................. 41 3.10.2 Přímá inaktivace mikroorganismů .............................................................. 42 3.10.2.1 Využití hydrostatického tlaku v konzervárenství ................................ 43 3.10.3 Nepřímá inaktivace mikroorganismů ......................................................... 44 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ .............................................................. 46 4.1

Charakteristika výrobku .................................................................................... 46

4.2 Příprava laboratorních pomůcek ........................................................................ 46 4.3 Zpracování vzorku ............................................................................................. 47 4.4 Stanovení mikroorganismů ................................................................................ 48 4.5 Složení a příprava použitých živných půd ......................................................... 48 4.6 Vyjádření výsledků ............................................................................................ 49 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE .......................................................................... 50 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 53 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ........................................................................ 54

7.1 Legislativní zdroje............................................................................................... 59 8 PŘÍLOHY ................................................................................................................... 61

1

ÚVOD Ovoce a zelenina, jako potravina nebo surovina pro výrobu různých potravin, jsou

nedílnou součástí jídelníčku zdravě se stravujícího člověka. Ovoce a zelenina se konzumují jak v čerstvém tak v tepelně upraveném stavu. Současným trendem je jíst čerstvé ovoce a čerstvou zeleninu v tekutém stavu, tedy ve formě džusů, nektarů a různých šťáv. Nejlépe však ve formě stoprocentních šťáv, bez konzervantů a barviv, které jsou konzervované co nejšetrnějším způsobem, aby nedocházelo k negativním senzorickým, nutričním a hlavně mikrobiálním změnám. Ovocné a zeleninové šťávy jsou díky vysokému podílu vody vhodným prostředím pro rozvoj a činnost mikroorganismů. Mikroorganismy jako mikrobiální kontaminanty se do potravin dostávají neúmyslně během výroby, zpracování, balení, přepravy nebo skladování. Jejich činnost vede k nepříznivým změnám šťáv, především k senzorickým změnám, které vedou k jejich nepoživatelnosti. K senzorickým změnám patří změna barvy, vůně a chuti. Dále můžou senzorické změny vést ke ztrátě živin a tím ovlivňovat nutriční hodnotu šťáv. Senzorické změny ale nepředstavují zdravotní riziko. Některé mikroorganismy vedou ke zdravotní závadnosti ovocných a zeleninových šťáv, a to zejména jejich pomnožením nebo produkcí toxických metabolitů. Tyto toxiny mohou vyvolat buď akutní otravy, které mohou vést až ke smrti, nebo kulminují v lidském organismu a vyvolávají pak chronické otravy či mohou být karcinogenní.

10

2

CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo shrnout poznatky o výrobě zeleninových a ovocných šťáv se

zaměřením na využití moderních konzervačních technologií z prostudované literatury, zaměřit se na mikroorganismy, které mohou kontaminovat zpracovávané suroviny a finální výrobky, charakterizovat mikroorganismy negativně ovlivňující kvalitu výrobků a lidské zdraví a charakterizovat opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům. Ve

vybraných

výrobcích

bylo

cílem

mikroorganismů.

11

experimentálně

stanovit

skupiny

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1

Ovocné a zeleninové šťávy a jejich význam

Ovocná a zeleninová šťáva je definována podle Vyhlášky č.335/1997 Sb. jako zkvasitelný, ale nezkvašený výrobek získaný z přiměřeně zralého a zdravého, čerstvého nebo chlazeného ovoce nebo zeleniny, a to jednoho nebo více druhů, s charakteristickou barvou, vůní a chutí, které jsou typické pro šťávu pocházející z příslušného ovoce nebo zeleniny; aroma, dužnina a buňky ze šťávy, které jsou odděleny v průběhu zpracování, mohou být do téže šťávy vráceny; rajčata se považují za zeleninu. Podle ČSN 56 0010 se považuje jako přírodní šťáva získaná z čerstvých surovin (ovoce, zeleniny, bylin, aj.) neupravená zředěním ani přídavkem chuťových látek a chemických konzervačních prostředků. Tato norma byla však zrušena bez náhrady. Ovocnou nebo zeleninovou šťávou se rozumí též šťáva získaná z koncentrované ovocné nebo zeleninové šťávy opětovným doplněním podílu vody, která byla odstraněna při koncentraci šťávy a obnovením aroma pomocí těkavých látek, které byly zachyceny v průběhu koncentrace příslušné ovocné nebo zeleninové šťávy; musí mít rovnocenné organoleptické a analytické vlastnosti průměrné šťávy téhož druhu ovoce a zeleniny. Pod pojmem šťávy se rozumí tekuté potraviny, které obsahují čistou, organickou vodu nejlepší kvality. (Walker, 1993). Ovocné a zeleninové šťávy se používají po vhodné technologické úpravě k přímé spotřebě a dále se používají ve formě polotovarů k výrobě limonádových a konzumních sirupů. Kromě toho jsou cennou surovinou pro výrobu přírodních aromat a základních látek pro přípravu nealkoholických nápojů. (Hrudková a kol., 1989) Ovocné a zeleninové šťávy obsahují průměrně 85 až 92 % vody a 8 až 15 % sušiny. Převážnou část sušiny tvoří cukry, především glukosa, fruktosa, v menším množství i sacharosa. Některé ovocné šťávy obsahují i jiné sladké látky, např. sorbit. Obsah bílkovin je v těchto šťávách velmi nízký. Ovocné a zeleninové šťávy téměř neobsahují tuk, což je z hlediska zásad správné výživy, při současné nadměrné spotřebě

12

potravin a nápojů s vysokým energetickým obsahem, příznivé. Z nutričního hlediska jsou ovocné a zeleninové šťávy důležité pro svůj obsah vitaminů a minerálních látek. Velký význam při pití ovocných a zeleninových šťáv má odstranění vlákniny, která zatěžuje zažívací ústrojí více než konzumace ovoce a zeleniny vcelku, a tím šetří organismus. Ovocné a zeleninové šťávy tak poskytují více koncentrovaných živin než celé ovoce a zelenina. Životně důležité látky, jako jsou vitaminy a enzymy, se rychle dostanou do krve a jsou doprovázeny do míst, kde jsou nezbytné. (Zacker, 2003) „Zeleninové šťávy jsou stavitelné a ovocné šťávy ideální čisticí prostředek pro lidské tělo.“ (Walker, 1993) Otázkou je, kolik může člověk vypít šťáv za den. Podle Walkera (1993) se mohou ovocné a zeleninové šťávy pít v neomezeném množství. Ale protiklad klade Zackerová (2003), která bere ovocné a zeleninové šťávy jako léčivo, tudíž jako doplněk „normální stravy“.

3.2

Základní suroviny ovocných a zeleninových šťáv a požadavky

na ně Základní surovinou je voda, která musí vyhovovat požadavkům na pitnou vodu. Vodu z vlastního zdroje je třeba denně mikrobiologicky kontrolovat. Další surovinou jsou cukry. Používá se cukr sypký nebo tekutý. Nesmí obsahovat kvasinky a plísně a hlavně nesmí být přítomna slizotvorná mikroflóra (Leuconostoc mesenteroides). Cukr nemá obsahovat ani koliformní mikroby, a to v navážce jednoho gramu. Větší riziko je u tekutého cukru. Ten má sice nízkou aktivitu vody (při obsahu 6 % cukru činí aW 0,86), ale přesto může být napaden vysokými kvanty kvasinek, slizotvorné mikroflóry a plísní. (Hrubý, 1984) Kvalita ovocných a zeleninových šťáv závisí především na kvalitě použité technologie výroby a kvalitě použitých druhů ovoce a zeleniny. Ovoce a zelenina by měla být vždy čerstvá, zdravá a mechanicky nepoškozená. Musí být správnými technologiemi očištěna, aby se snížila možnost kontaminace budoucích šťáv nejen různými mikroorganismy, ale i rezidui pesticidů a hnojiv, dále se mohou kontaminovat mechanicky, například půdou nebo drobnými kamínky.

13

3.3

Sortiment ovocných a zeleninových šťáv

Mezi ovocné a zeleninové šťávy určené k přímé konzumaci patří ovocné mošty, ovocné džusy, zeleninové šťávy, ovocné a zeleninové nápoje, džusy z více druhů ovoce a zeleniny. Džusem se značí kalné nealkoholické nápoje, připravené z ovocného nebo zeleninového protlaku, upravené vodou, cukrem, kyselinou L-askorbovou zajišťující antioxidační účinek do řídké konzistence vhodné k pití. Dle vyhlášky č. 335/1997 Sb. se nektarem rozumí jako nezkvašený, ale kvasitelný výrobek získaný přídavkem vody, příp. přírodních sladidel k ovocné, zeleninové šťávě, nebo jejich koncentrátům, koncentrované ovocné nebo zeleninové šťávě, sušené ovocné nebo zeleninové šťávě, k ovocné dřeni nebo ke směsi těchto výrobků. Z fyzikálních a chemických požadavků pro ovocné a zeleninové nektary je stanoven minimální obsah šťávy, dřeně nebo jejich směsi v procentech objemu hotového výrobku. Obsah se pohybuje v rozmezí od 25 % (např. citrony) až po 50 % (jablka, hrušky). U těchto nápojů lze přidávat kyselinu L-askorbovou v množství 5 g/l, která zajišťuje antioxidační účinek. Obsah přidaných přírodních sladidel nebo medu může dosahovat maximálního množství 20 % z celkové hmotnosti konečného výrobku. (Komár, 2005) Ochucený nealkoholický nápoj vyrobený z ovocných a zeleninových šťáv nebo jejich koncentrátů a dalších surovin (vody, minerální vody přírodních nebo sladidel, medu aj., popř. sycený oxidem uhličitým), u kterých je obsah sušiny minimálně 25 %, se nazývá ovocný nebo zeleninový nápoj. Zvlášť je oddělena ovocná šťáva z citrusových plodů, která je získaná z endokarpu jejich vnitřní části. Limetková šťáva může být získávána z celého plodu, použije-li se vhodný výrobní postup, který omezí podíl složek z vnější části plodu na minimum. (Vyhláška č.335/1997 Sb.) Zvláštní typ ovocných šťáv je mošt, který se sestává z čisté šťávy z ovoce a přidaného cukru. Šťávy obsahující vlákninu patří k protlakům. Protlaky mohou být jak ovocné tak i zeleninové. Existují ovocné a zeleninové šťávy ve formě polotovarů k výrobě limonádových a konzumních sirupů. Konzumní sirup je vlastně koncentrovaná ovocná šťáva. Mezi ně patří ovocné šťávy – polotovary, čerstvé; ovocné šťávy – polotovary, pasterované; šťávy konzervované oxidem uhličitým; ovocné koncentráty (zahuštěné ovocné šťávy). 14

3.3.1 Ovocné šťávy Ovocné šťávy můžeme dále rozdělit na šťávy z citrusových plodů a na šťávy ze zahradního ovoce. K prvnímu typu šťáv patří například ananasová šťáva, která obsahuje 90 % vody. Významnou složkou je vysoký obsah draslíku, vápníku a sodíku. Ananasová šťáva je výborná pro své čistící schopnosti díky obsahu síry a chlóru. Také je vhodná při redukci váhy, protože obsahuje bromelein, který napomáhá urychlovat metabolismus a tím i spalování tuků. Tato šťáva obsahuje ovocné kyseliny, kterými jsou citrónová a maleinová. Díky tartarinové kyselině má ananasová šťáva močopudné účinky. Nejčastěji konzumovaná šťáva je samozřejmě pomerančový džus s obsahem vody 87 %. Obsahuje též mnoho minerálních látek. Má vysoký obsah draslíku, vápníku hořčíku, patrný obsah je i křemíku. Kromě vitaminu C obsahuje pomerančová šťáva i vitamin rozpustný v tucích A a vitamin rozpustný ve vodě B. Tato šťáva je vhodná při překyselení, neboť má zásaditý účinek. Jako čerstvě vymačkaná šťáva se musí ihned vypít, neboť podléhá oxidaci vzdušným kyslíkem. (Walker, 1993) Obsahu vitaminu C je dvakrát vyšší u citrónové šťávy než u pomerančové. Citrónová šťáva obsahuje 90 % vody. Je vhodná pro své antiseptické účinky a ke snižování nadváhy. Při dlouhodobém užívání ale může dojít k poruchám látkové výměny. (Zacker, 2003) K citrusovým šťávám patří i grepová šťáva, která díky obsahu kyseliny salicylové napomáhá odstranit anorganický vápník, který je uložen v kostech při artritidě v nadbytku. (Walker, 1993) Mezi nejkonzumovanější šťávy ze zahradního ovoce patří zajisté jablečná šťáva. Jablko má obsah vody 85 %. Díky obsahu pektinu a vitaminu C snižuje hladinu cholesterolu. Dále obsahuje minerální látky, zejména vysoký obsah draslíku. Jablečná šťáva způsobuje na lačno zvýšenou činnost střev. Nejkoncentrovanější šťáva je šťáva z hrušek, i když obsah vody činí 85 %. Obsahuje vitaminy skupiny B a vitamin K, který je prospěšný pro diabetiky. Tato šťáva má močopudné, a tím i detoxikační účinky.

15

Velmi významné jsou rybízové šťávy. Podporují sekreci různých žláz. Mají močopudný účinek a snižují zahlenění zažívacího ústrojí. Nejvíce konzumovaná je šťáva z černého rybízu s vysokým obsahem vitaminu C, který je výborný antioxidant. Pro doslazování ovocných šťáv je vhodné používat med, nikoliv cukr, protože cukr způsobuje kvašení. 3.3.2 Zeleninové šťávy K nejvíce konzumovaným zeleninovým šťávám patří pro svoje zdravotně prospěšné látky karotková a rajčatová šťáva. Karotková šťáva je obohacena zejména vitaminy rozpustnými v tucích, a to vitaminem A (retinol), dále vitaminem D a K. Aby byly tyto vitaminy v těle využity, je potřeba tuku, proto je vhodné do této šťávy přidat pár kapek oleje. Kromě vitaminů rozpustných v tucích obsahuje i vitaminy rozpustné ve vodě, mezi něž patří vitamin B a C. Obsahem minerálních látek (jód, sodík, draslík, vápník, hořčík, železo) povzbuzuje chuť k jídlu a napomáhá trávení. Karotková šťáva je výborná pro detoxikaci jater. Je vhodná pro matky v období kojení, neboť zlepšuje kvalitu mateřského mléka. Zjistilo se, že 0,5 litru karotkové šťávy má lepší účinek než tabletky vápníku. (Walker, 1993) Rajčatová šťáva je bohatá na vitamin C, dále pak na β karoten a vitamin E. Italský výzkum zjistil, že denní příjem rajčatové šťávy díky obsahu karotenoidů snížil markery zánětu až o 30 %, ale na imunitní systém neměl žádný vliv. Díky lykopenu je rajčatová šťáva výborná při prevenci rakoviny, zejména rakoviny prostaty. Kromě lykopenu jsou v této šťávě i jiné látky, které jsou podle australského výzkumu účinné ke snížení tvorby krevních sraženin u osob s diabetem 2. typu. (ANONYM 2; Hrudková a kol., 1989; Daniells, 2006) Méně konzumovaná je šťáva z červené řepy, která obsahuje kvalitní železo, dále sodík a draslík. Proto je vhodná k pití během klimakteria. Někdy může vyvolat po jednorázové konzumaci 0,2 litru nauseu (nevolnost) a závrať, jedná se pouze o reakci jater. (Walker, 1993)

3.4

Technologie výroby ovocných a zeleninových šťáv

Ovocné a zeleninové šťávy se mohou prakticky vyrábět ze všech druhů ovoce a zeleniny lisováním čisté suroviny. Výjimkou je karotka, která se musí nejdříve 16

blanžírovat a pak se pasíruje přes síto. Čiré šťávy se zbavují zbytků dužiny odstřeďováním, čeřením a filtrací, dřeňové šťávy se homogenizují. Mohou se získávat jak za syrova, tak za tepla. Získávání šťáv za tepla patří k tradičnímu způsobu odšťavování. Ovoce se vloží do hrnce s trochou vody a vaří se tak dlouho, až ovoce popraská (rybíz) nebo změkne (jablka). Šťáva se pak oddělí od ovoce přefiltrováním přes tkaninu. Získaná šťáva se svaří s cukrem, a ještě horká se plní do lahví, které se ihned uzavřou. Někdy je nutné se zbavit pěny před vychladnutím. (Bayer, 2002) Podle tržního druhu se pak různě upravují, například se mohou ředit pitnou vodou nebo se ochucují a aromatizují. Po zhotovení finálního výrobku se musí konzervovat pasterací, aby se dosáhlo delší trvanlivosti. (Komár, 2005) Zahuštěné ovocné a zeleninové šťávy neboli koncentráty jsou přírodní ovocné, zeleninové šťávy upravené snížením původního obsahu vody. Technologicky se vylisovaná šťáva rychle zahušťuje na vakuových odparkách, a to několik vteřin při vysokém vakuu a teplotě do 45 °C, aby se nepoškodila jakost. Vyznačují se sedimentem. (Komár, 2005) Vysoce kvalitní ovocné a zeleninové šťávy se získávají manuálním způsobem, a to nastrouháním ovoce či zeleniny na kaši, kdy dochází k rozmělnění vlákniny za účelem uvolnění živých účinných látek a následným vylisováním v hydraulickém lisu. K nejpoužívanějšímu způsobu získání těchto šťáv patří automatizované odšťavování odšťavovačem, který strouhá a lisuje současně. Odšťavováním se rozumí získání šťávy z ovoce a zeleniny, jehož výsledkem jsou lahodné a výživné nápoje a zbavení se většiny vlákniny plodů. Nevýhodou je nejen vysoká cena, ale i způsob odšťavování. V odšťavovači se totiž vláknina jen rozmačká, nikoli rozmělní, tím se uvolní jen malá část účinných látek z ovoce či zeleniny. Díky odstředivé síle, která vysokou rychlostí rozruší část účinných enzymů a vitaminů, se snižuje výživová hodnota zhotovených šťáv. Existuje i ruční odšťavovač, který se využívá na zhotovení marmelád. K třetímu způsobu získání ovocných a zeleninových šťáv patří odstřeďování pomocí centrifugy, kde se šťáva oddělí od kaše. Nevýhodou je rychlé kažení, neboť dochází k oxidaci teplem, které vzniká při výrobě, proto se musí šťávy touto technologií po zhotovení ihned vypít.

17

Výroba šťáv z ovoce z jižních zemí se provádí způsobem koncentrátů ze 100 % šťáv. V těchto zemích se z vylisovaných šťáv, například z pomerančů, odpaří voda v poměru 7:1, tím vznikne koncentrát, který se doveze do České republiky ve zmrazeném stavu. Koncentrátu se vrátí odebraná voda ve stejném poměru - tzv. požadovaná refrakce, která je dle Hrudkové (1989) minimálně 65 %. Tímto vznikne opět 100 % šťáva v tekutém stavu a plní se do příslušných obalů a podstoupí pasterizaci. Nejčastější způsob je několikavteřinové zahřátí při teplotě pod 100 °C. Jakostnější koncentrát se získá vymrazováním. Principem je postupné snižování bodu tuhnutí kapaliny obsahující rozpustné látky. K tomu se používají krystalizátory - nepřímo chlazené nebo přímo chlazené. (Hrudková, 1989). Podle schématu 1 procházejí zralé, čerstvě sklizené pomeranče kontrolním pásem (1), kde jsou vyřazeny všechny nezralé nebo nahnilé plody. Odtud pokračují tříděné pomeranče do kartáčové pračky (2), kde se krátce ponoří do mycího roztoku, omyjí a osprchují čistou vodou. Škrabky poté opatrně obrousí část slupky obsahující silice. V extraktorech (3) je z plodů vymačkána šťáva. Na sítech (4) zůstanou zbytky slupek, kusy dužniny a pecky. Tyto zbytky slouží ke krmení zvířat. Vylisovaná šťáva se pak pasteruje teplotou pod 100 °C (5), aby se v ní zničily bakterie. Ještě za horka se pasterovaná šťáva plní do obalů. Tím vzniká přímo lisovaná šťáva, někdy označovaná jako prémium, která je nejkvalitnější a také nejdražší, u nás se však neprodává. (ANONYM 1) Schéma 1: Postup výroby pomerančového džusu (ANONYM 1) (1) třídění
(2) mytí (sprchování)  (3) první lisování v extraktorech  zbytky na sítu (dužnina)





šťáva


(4) pasírování


(5) pasterace (pod 100°C)
prémium
plnění a expedice

18

krmivo pro zvířata

Všechny džusy jsou v ČR vyrobeny z koncentrátu, který vzniká odpařováním vylisované a pasterované šťávy (schéma 2). Ve vakuových odparkách se šťáva zahustí na čtyř až šestinásobnou koncentraci (a) a poté zamrazí (b). Tento koncentrát se dopraví v cisternách do ČR do stáčíren (c). Zde se ke koncentrátu přidá tolik vody, kolik z ní bylo původně odebráno (d). Šťáva se musí před plněním do obalů opět pasterovat (e). Někteří výrobci vylisovanou dužninu, jež zbyla na sítech, lisují ještě jednou, čímž získají ředěnou, méně kvalitní a hořkou šťávu zvanou „pulp wash“. Ta se musí dochutit přídavkem cukru, případně kyselinou citronovou. Používá se při míchání levnějších šťáv nižší kvality. (ANONYM 1) Schéma 2: Postup výroby džusu z koncentrátu (ANONYM 1) Pomerančová šťáva  (a) zahuštění  (b) zamrazení
(c) doprava v cisterně do ČR
(d) hydratace koncentrátu
(e) pasterace  plnění  expedice

3.5

Možné zdroje mikrobiální kontaminace

Ke kontaminaci může dojít buď primárně nebo sekundárně. V prvním případě se jedná o kontaminaci surovin jako jsou voda, cukr, čerstvé ovoce a zelenina. V druhém případě dochází ke kontaminaci v průběhu výrobního procesu, a to z prostředí, z rukou pracovníků, ze strojů a zařízení. (Komprda, 2000) Zdrojem kontaminace ovocných a zeleninových šťáv může být použitá voda, která nesplňuje mikrobiální požadavky. V potravinářském průmyslu se používá voda s výbornou jakostí jak po stránce mikrobiologické, tak po stránce chemické. Vždy musí být splněny požadavky na pitnou vodu, i když se v některých případech používá jako voda užitková. K obávaným kontaminantům pitné vody se řadí bakterie čeledi Enterobacteriaceae, zejména pak bakterie E. coli, a to sérovar O157. E. coli je gramnegativní aerobní bakterie osídlující střevní trakt člověka a zvířat, vyskytuje se 19

tedy i ve výkalech. Její přítomnost ve vodě a v potravinách je ukazatelem fekálního znečištění. Stejným způsobem se mohou dostat do vody či do potravin i rody Salmonella nebo Shigella. (Hampl, 1956; Šroubková, 1996) Vždy se musí počítat s tím, že i vzduch může být zdrojem mikrobiální kontaminace, protože se vzduchem přicházejí do styku suroviny, meziprodukty ale i hotové výrobky. Vzduch totiž obsahuje různé bakterie, kvasinky a spory plísní. Do vzduchu jsou mikroorganismy zaneseny s prachem, který se pohybem vzduchu víří. (Kocková – Kratochvílová, 1980) Kontaminované mohou být i vlastní plody ovoce a zeleniny. Zejména u zeleniny, která většinou roste v půdě, kde mohou přežívat spory některých bakterií (Clostridium, Bacillus), je větší pozornost upřena na čištění a mytí. Je třeba počítat s tím, že i čerstvá dobře vypadající zelenina může obsahovat mikroorganismy. Velké množství bakterií, kvasinek a spor plísní se vyskytuje na povrchu zeleniny a samozřejmě také v půdě, která ulpívá na hlízách a kořenech. Obsah mikrobů dosahuje hodnot 107. g-1 i více, a je závislý na době a způsobu sklizně, dopravy a skladování. Mytím je možno odstranit až 90 % mikroflóry. Pro hygienické posouzení zdravotní nezávadnosti se stanovuje počet E. coli a nepřítomnost Salmonelly. (Hrubý, 1984) Další kontaminace může nastat během sklizně, a to mechanickým poškozením sklízeného ovoce a zeleniny. Toto mechanické poškození vzniká i neopatrnou dopravou. Mechanickým poškozením se sníží odolnost zdravého ovoce a zeleniny, a tím se zvýší riziko průniku a následné pomnožení různých mikroorganismů. Posklizňový rozvoj povrchové mikroflóry je závislý na stupni poškození, na specifické odolnosti plodů a taktéž na skladovací teplotě. (Kyzlink, 1980; Hrubý, 1984) Rozsah mikrobiální kontaminace závisí na způsobu skladování ovoce a zeleniny. Při větší vlhkosti a vyšší teplotě se pomnožují zejména plísně, které dobře pronikají do pletiv, i když jsou poměrně kyselé. Některé plísně jsou schopny tvořit sekundární metabolity – mykotoxiny. Ty jsou velmi nebezpečné pro zdraví člověka, neboť většina z nich má karcinogenní účinek. Vlastní ovocná a zeleninová šťáva je výborným růstovým prostředím pro plísně a kvasinky a některé druhy bakterii. Proto se musí dodržovat přísná sanitace obalových materiálů a nástrojů a přístrojů (plnící přístroj, plnící jehla, zavírač). Z obalových 20

materiálů se nejčastěji používají speciální papírové krabice, které se skládají z několika vrstev, Tetra pack. Tyto obaly chrání před UV zářením a před mikrobiální kontaminaci díky hliníkové vrstvě. Aseptičnost při plnění do těchto papírových obalů je zajištěna díky použitému peroxidu vodíku, který se potom vypaří. Méně používané obaly jsou plastové a skleněné lahve. U skleněných vratných lahví je ale vyšší riziko kontaminace zbytky sanitačních prostředků nebo láhve nemusí být dostatečně umyty a sterilní, a proto může dojít k pomnožení přítomných mikroorganismů. Při vlastní výrobě ovocných a zeleninových šťáv je potřeba chránit je před kontaminací koliformními bakteriemi, kvasinkami a bakterií Leuconostoc. Zejména bakterie Leuconostoc je velmi nebezpečná, vytváří během svého růstu velké množství slizu. Může dojít až k tomu, že výsledný nápoj nelze z láhve vylít. Kvasinky se usazují ve výrobních a plnících strojích, na plnících jehlách, dopravních pásech a podobně. Její vyšší výskyt může znamenat nedostatečnou čistotu ve výrobně a současně je ukazatelem snížené trvanlivosti výrobku. Koliformní bakterie jsou kontaminací zejména vody nebo mohou být humánního původu. (Arpai, 1977) Asi

nejzávažnějšími

kontaminanty

ovocných

a

zeleninových

šťáv

jsou

mikroorganismy, které mohou způsobovat kažení nebo vyvolávat alimentární onemocnění. Kažení ovocných a zeleninových šťáv je výsledkem mikrobiální aktivity různých druhů mikroorganismů. Je závislé na vnitřních charakteristikách šťáv (aktivita, vody, pH, redox potenciál, přítomnost antimikrobních látek a přítomnost živin potřebných pro rozvoj různých mikroorganismů) a vnějších podmínkách (teplota, vlhkost, složení atmosférického vzduchu, přístup světla, obalový materiál). Dalšími faktory ovlivňující kažení potravin jsou způsoby zpracování a konzervace ovocných a zeleninových šťáv. (Komprda, 2000) Mezi nejčastější mikroorganismy způsobující kontaminaci šťáv patří plísně rodu Aspergillus, Penicillium, Mucor, Cladosporium a Byssochlamys. Kvasinky se objevují zřídka. Jako kontaminanty mohou být všechny acidotolerantní druhy kvasinek. Nejčastěji se jedná o rod Saccharomyces, dalšími kontaminanty můžou být kvasinky rodu Candida, Pichia, Hansenula a Toluropsis, rovněž rod Rhodotorula a Kloeckera.

21

Kvasinky a plísně jsou původci kažení ovocných a zeleninových šťáv. To se projevuje produkcí slizových látek, kyselin (fermentace sacharidů), plynu, alkoholu, změnami chutě, vůně a barvy. Některé plísně jsou producenty toxických metabolitů (mykotoxinů), které jsou hygienicky a zdravotně závadné. K bakteriální kontaminaci přispívají koliformní bakterie z čeledi Enterobacteriaceae, které jsou ukazatelem fekálního znečištění. Další bakterie, které mohou kontaminovat ovocné a zeleninové šťávy jsou bakterie octového kvašení rodu Acetobacter, které vedou k oxidaci etanolu na kyselinu octovou. V zahuštěných ovocných šťávách se můžou pomnožit bakterie mléčného kvašení rodu Leuconostoc a Lactobacillus, dále Pseudomonas a Salmonella. Zvláštní druh teplomilné bakterie je Alicyclobacillus, která se do šťáv dostává s ovocem kontaminovaným při kontaktu s půdou, způsobující kažení projevující se nepříjemným pachem a chutí, která ale není zdravotně závadná. (Kopáčová, 2007) 3.5.1 Bakterie koliformní Obecně patří koliformní bakterie k bakteriím fekálního znečištění a špatné hygieny. Vyskytují se zejména v půdě a ve vodě. Jako zdroje kontaminace vody při výrobě ovocných a zeleninových šťáv se počítá s čeledí Enterobacteriaceae, zahrnující gramnegativní fakultativně anaerobní střevní tyčinky. K nim se řadí rody Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Schigella a Enterobacter. (Šilhánková, 2002) Rod Citrobacter využívá citrát jako zdroj uhlíku a energie. Tyto bakterie se pohybují pomocí bičíků.

Nejvýznamnější je Citrobacter freundii, která vyvolává průjmy.

(ANONYM 6) Rod Enterobacter (dříve jako Aerobacter) se považuje za nepatogenní. Pouze Enterobacter aerogens, který se vyskytuje ve střevním traktu a v půdě. Spolu s E. coli se často vyskytuje na polní zelenině. (Šroubková, 1996) 3.5.2 Bakterie octového kvašení Z bakterií octového kvašení jsou významné druhy Gluconobacter oxydans, Acetobacter

aceti

subsp.

liquefaciens

a

gramnegativní, aerobní tyčinky.

22

Acetobacter

pasteurianus.

Jsou

to

Striktně aerobní rod Acetobacter dovede oxidovat ethanol na kyselinu octovou, toho se využívá při výrobě octa. Acetobacter aceti oxiduje i řadu cukrů (glukosu, manosu, galaktosu a některé pentosy) na příslušné kyseliny s karboxylovou skupinou na prvním uhlíku. Tyto bakterie mohou být přítomny v kazícím se ovoci a zelenině, ale nevyvolávají alimentární onemocnění. (Šroubková, 1996; Klaban, 1999) Rod Gluconobacter neohrožuje zdraví člověka ani zvířat, ale jako kontaminanty ohrožují kvalitu alkoholických i nealkoholických nápojů. Způsobuje i kažení jablek a hrušek. (Vařejka, 1990; Šilhánková 2002) 3.5.3 Bakterie mléčného kvašení Nejvýznamnější kontaminant této skupiny je Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides patřící k tzv. bakteriím „viskózního“ kvašení. Tvoří dextranový sliz. Pokud rostou tyto bakterie v prostředí s fruktózou, produkují sliz složený z levulanu. Kontaminuje sirupy a ovocné šťávy, které byly doslazovány kontaminovaným cukrem. Rod Leuconostoc patří do čeledi Lactobacillaceae a řadí se mezi grampozitivní koky sférického nebo ovoidního tvaru seskupené do dvojic nebo řetízků. Buňky se slizovým pouzdrem jsou relativně termostabilní, snáší zahřátí až na 80 – 85 °C po dobu 30 minut. (Vařejka, 1990; Klaban, 1999) 3.5.4 Plísně Plísněmi se rozumí mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy náležející mezi houby (Fungi). Tvoří mycelium, které je složené z jednotlivých vláken (hyf). Plísně jsou heterotrofní organismy, proto potřebují ke své výživě organické látky. Některé plísně produkují toxiny (tzv. mykotoxiny), které jsou velmi nebezpečné pro člověka. Další vlastností plísní je ovlivnění enzymové aktivity (indukce nebo syntéza enzymů). Většina plísní je zdravotně nezávadná, pouze mění organoleptické vlastnosti potravin (změna vůně, chuti, konzistence, rozklad některých živin). Naopak mohou mít i různé příznivé fyziologické účinky, v horším případě působí patogenně až toxikologicky (například

karcinogenní

účinky některých

mykotoxinů).

Tímto

nepříznivým způsobem se uplatňují rod Mucor, Aspergillus, Penicillium, dále rod Fusarium, Oodium a Cladosporium. Pro růst a rozvoj plísní musí být vytvořeny optimální podmínky, především vhodná teplota (25 - 35 °C) a vlhkost (60 - 90 % relativní vlhkost), dále pohyb vzduchu 23

a množství kyslíku. Inhibiční účinky na růst má nižší teplota, stejně tak i nižší vlhkost. Plísně v potravinách jsou schopny růst při teplotě -12 až + 55 °C, a při pH v rozmezí 1,7 až 10. Existují však plísně, které jsou schopné růstu i při vlhkosti 15 - 20 %. Některé plísně rodu Cladosporium a Fusarium jsou schopné tvorby toxických metabolitů i při teplotách nižších než 0 až 5 °C. (Polster, 1971; Šroubková, 1996; Malíř, 2003) Většina plísní je likvidována již po několikaminutovém zahřívání na teplotu 70 až 75 °C, ale některé druhy přežijí i pěti minutové zahřívání při 85 °C. Druhy Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri, Talaromyces flavus a Talaromyces macrosporus patří k nejznámějším představitelům termorezistentních mikromycetů, které jsou schopné přežít tepelnou konzervaci běžnou při výrobě ovocných šťáv a kompotů. Jsou to saprofytické mikroorganismy, jež se vyskytují v přírodě především v půdě. Ovoce díky své kyselosti a vysokému obsahu sacharidů potlačuje růst bakteriální flóry, tím se ale stává prostředím vhodným pro mikromycety. (Piecková, 1998) Plísně jsou schopny nejen porůstat povrch potraviny, ale i prorůstání do celé potraviny, v případě ovocných a zeleninových šťáv je to prorůstání pod hladinu. Typické pro plísně je tvorba bělavých povlaků, které časem mění barvu na šedozelenou až černou. To je provázeno typickým zápachem. Někdy je vidět plíseň jen na povrchu potraviny, tady je důležité vědět, že po odstranění viditelné části plísně je možný výskyt plísní i v hlubší vrstvě potraviny nebo nápoje. Typické je to u marmelád a kompotů. Opakovaná konzumace zaplísněných potravin může přispět ke vzniku rakoviny. Plísně lze rozdělit do čtyř tříd, a to do třídy Ascomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes (Fungi imperfecti) a Basidiomycetes. Třída Ascomycetes tvoří pupence nebo vegetativní tělíska složené z hyf. Nejpočetnějším rodem této třídy je rod rod Penicillium, který zahrnuje asi 150 druhů. Tvoří kolonie s velkým množstvím žlutozelených až modrozelených konidií, které jsou na různých potravinách a jiném materiálu patrné jako zelené, sametové až moučené povlaky. Nejdůležitější plísní je Penicillium expansum (dříve Coremium glaucum nebo Coremium vulgare), která je hlavní příčinou ztrát při skladování ovoce (jablek, hrušek, hroznů, třešní) a jejich zelené hniloby. Zraněné plody nejprve zapáchají, dužina ovoce měkne a přechází ve světlehnědou až šedohnědou slizkou hmotu. Někdy může dojít až ke svraštění povrchu ovoce, který je pokryt zelenomodrými výtrusovými polštářky. 24

U přezrálých nebo nedozrálých plodů jsou napadeny vnitřní části jádřincovou chorobou, která znehodnocuje ovoce jak chuťově, tak pachově. Jsou schopny produkovat celulolytické enzymy podporující destruktivní činnost této plísně. Kolonie jsou buď zrnité, nebo vytvářejí zřetelné drobné svazky konidioforů. (Polster, 1971; Müller, 1983; Šroubková 1996; Klaban, 1999). Skladované ovoce a zelenina (jablka, hrušky, vinná réva, rajčata) mohou být napadeny plísní Penicillium aurantiogriseum a Penicillium brevicompactum. Mezi kontaminanty citrusových a ovocných džusů patří Penicillium crustosum a Penicillium italicum. (Malíř, 2003) Druhou nejpočetnější skupinou třídy Ascomycetes, řádu Eurotiales, je rod Aspergillus. Nejznámější je Aspergillus niger, který se může nalézt jako kontaminant jablek, hrušek, broskví, jahod ale i citrusů nebo čerstvé zeleniny. Aspergillus flavus, který je schopný produkovat mykotoxiny, se může objevit na čerstvém ovoci, rajčatech, citrusech a ananasu. Z rodu Aspergillus se může vyskytovat v pasterovaném ovocném džusu, v sirupu i v čerstvém ovoci (jahody) Neosartorya fischeri. Rajčata mohou být napadena plísní Aspergillus aculeatus. Zelenina může být kontaminována plísní Aspergillus fumigatus. A. ochraceus roste dobře při teplotách kolem 25 °C a tvoří žluté až hnědé povlaky. (Šroubková, 1996; Klaban, 1999; Malíř, 2003) Z řádu Eurotiales je neméně významný rod Byssochlamys, jehož kmeny jsou obzvláště odolné tepelným změnám a často přežijí i proces pasterace, tím způsobují kažení kompotů. Zvláště askospory Byssochlamys fulva jsou rezistentní vůči teplu i oxidu siřičitému (SO2).

V bývalém Československu byl zaznamenán hromadný

výskyt plísní Byssochlamys fulva a Byssochlamys nivea v slazených jahodových a broskvových džusech v plechovkách. Tyto termorezistentní plísně způsobily cizorodý chemický zápach po styrenu nebo benzenu. Do toho řádu patří rod Talaromyces. Talaromyces

bacillisporus

může

kontaminovat

pasterovaný

džus.

Podobným

kontaminantem tepelně ošetřených džusů je Talaromyces macrosporus. Plíseň Talaromyces flavus se objevila v různých ovocných šťávách, ale i v syrovém ovoci těsně po sběru. Talaromyces avellaneus byl izolován z jahodových kompotů. (Polster, 1971; Piecková, 1998; Malíř, 2003)

25

Do třídy Ascomycetes patří řád Leotiales, do něhož se řadí psychrofilní plíseň Botrytis cinerea, která způsobuje šedou hnilobu ovoce i zeleniny skladovaného při nízkých teplotách. Tato hniloba se projevuje nakyslou chutí, hnědnutím dužiny, která neměkne a porůstá na povrchu šedým myceliem s černými tvrdými sclerocii. Tento rod se vyznačuje stromečkovitě větvenými konidiofory, na jejichž koncích se tvoří konidie připomínající hrozen. (Polster, 1971; Šroubková, 1996; Klaban, 1999) Z třídy Deuteromycetes (houby nedokonalé) se může objevit v ovocných džusech rod Fusarium, který způsobuje i kažení ovoce (jablka, banány, ananas, citrusy). Například F. acuminatum, F. equiseti, F. oxysporum, F. semitectum nebo F. moniliforme. (Šilhánková, 2002; Malíř, 2003). Nejčastěji jsou napadena jablka. Červenou moniliózu způsobuje Monilia frutigena nebo méně často Monilia laxa. Hnilobu jablek můžou vyvolávat Nectria sp., Trichothecium sp., Botrytis sp., Alternaria a Penicillium. Zatímco strupovitost jablek je zapříčiněna plísní Venturia inequalis. Jablka mohou být infikována Cladosporium herbarum nebo Alternaria alternata. U jablečného džusu a kyselých produktů z ovoce (jablka, višně) se může vyskytnout Cladosporium herbarum, u které ale není doložena produkce mykotoxinů. Zejména u jablek způsobuje tzv. melanózu (čerň), tím je znehodnocuje i jako materiál pro výrobu moštů. (Jesenská, 1993; Klaban, 1999; Malíř, 2003) Příčinou černé hniloby mrkve je rod Alternaria, zejména jeho spory. Větší význam však mají sekundární metabolity - alternáriové mykotoxiny. (Šroubková, 1996) Hnědou hnilobu ovoce způsobují plísně Gloeosporium fructigennum a Trichothecium rosem. Hniloba se projevuje extrémně hořkou chutí dužiny napadeného ovoce. Gloeosporium album způsobuje sládkovou hnilobu jablek. Další druh Gloeosporium ribis je původcem antraknózy rybízu. Hořkou hnilobu jablek způsobuje Glomerella cingulata. (Polster, 1971; Klaban 1999) Rod Aureobasidium patřící k tzv. černým kvasinkám (dříve Dematium) tvoří černozelené mycelium. V cukernatých tekutinách se množí kvasnicovitě a vytváří sliz. (Klaban, 1999) Třída Zygomycetes zahrnuje tři řády: Mucorales, Entomophtorales a Zoopagales. Nepočetnější skupinou řádu Mucorales, který má asi 30 rodů, je rod Mucor zahrnující 26

přes 100 druhů. Tvoří na ovoci a zelenině či jiné potravině volně vláknitý, většinou bělavý povlak s kulovitými našedlými nebo nahnědlými sporangii. V hyfách tvoří tmavě zbarvené (do zelena) chlamydospory. Zejména M. piriformis a M. plumbeus se mohou vyskytnout v jablečném džusu, dále v jahodách a hruškách. Mucor mucedo a jsou schopny růst na zralém měkkém ovoci v relativně širokém rozmezí teplot, a to od 0 do 25 °C. Totéž platí i pro jejich spory, které jsou schopny klíčit v tomto rozmezí. Kažení ovoce a jiných potravin způsobují rod Rhizopus (R. stolonifer = R. nigricans, R. oryzae). Tento rod tvoří některé druhy mykotoxiny. (Müller, 1983; Jesenská, 1993; Šroubková, 1996). Přehled nejčastějších plísní v ovoci a zelenině a v produktech z nich vyrobených je uveden v následující tabulce. Tab.1 Výskyt plísní v potravinách (Polster, 1971) Výskyt

Druh plísně

Neslazené ovocné šťávy

Penicillium, Aspergillus,Cladosporium,

Mošty

nepatrně Penicillium, Peacilomyces, Phytophtora

Ovoce

Peacilomyces

Ovoce a zelenina

Rhizopus, Botrytis, Alternaria

Ovocné šťávy, mošty

Dematium

Konzervované ovoce

Byssochlamys = askosporové stádium (odolné vůči teplu, roste za snížené tence kyslíku a snáší oxid siřičitý v koncentraci 0,05 = 0,4 %

3.5.5 Kvasinky Kvasinky patří mezi heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Tyto mikroorganismy mají schopnost zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý. Jedná se o saprofytické organismy, které se vyskytují často na cukerných substrátech, na ovoci. (Šilhánková, 2002; Klaban, 2005) 27

Rozmnožování kvasinek je podmíněno potřebou cukru a odolností ke kyselému prostředí. Některé druhy jsou tolerantní k vysokému osmotickému tlaku. Pozitivní je, že jsou termolabilní. Většina kvasinek je likvidována při teplotě 56 °C během 2 až 4 minut, spory kvasinek jsou tepelně odolnější. Rozmnožování většiny kvasinek je inhibováno při teplotě 38 °C, u některých dokonce i při teplotách nad 25 °C. (Šroubková, 1996) Kvasinky se rozdělují podle způsobu rozmnožování na tři hlavní skupiny. První skupinu zahrnují rody tvořící askospory, které se řadí mezi Ascomycotina. Sem patří nejvýznamnější kontaminant ovocných a zeleninových šťáv způsobující jejich kažení rod Saccharomyces, který zkvašuje cukry. Tento rod nikdy nevyužívá laktózu jako zdroj uhlíku ani dusičnany jako zdroj dusíku. Tvoří většinou elipsoidní nebo protáhlé buňky. Nejdůležitější je Saccharomyces cerevisiae uplatňující se jako pekařská, lihovarská, vinařská nebo tzv. „svrchní“ pivovarská kvasinka. Zkvašuje glukosu, sacharosu, maltosu a galaktosu. Může tvořit pseudomycelium, ne však pravé mycelium. Ovocné mošty zkvašují Sacch. vini a Sacch. pomorum. (Kocková-Kratochvílová, 1990, Šroubková, 1996) V koncentrovaných šťávách se může vyskytnout Sacch. bailii var. osmophilus, která roste v prostředí s 60 % sacharózy. Dobře snáší konzervační prostředky, jako je kyselina askorbová. V koncentrovaných ovocných šťávách s vysokým obsahem cukru mnohé kvasinky nerostou. Ale zředěné šťávy s obsahem cukru 30 % mohou rychle zkvasit a vytvořit 10 až 13 obj. % alkoholu. Proto by se tyto šťávy měly rychle zpracovat. (Kocková – Kratochvílová, 1980) Do této skupiny patří i rod Pichia, má nízké kvasné schopnosti, neboť jeho druhy zkvašují buď jen glukosu nebo nezkvašují žádný cukr. Tvoří velmi protáhlé vegetativní buňky a pseudomycelium. Tvoří křís (křehkou vzlínavou blanku na povrchu kapaliny, proto patří mezi křísovité druhy. Mezi tyto druhy se řadí i rod Hansenula, který na rozdíl od rodu Pichia využívá dusičnany jako zdroj dusíku. (Šilhánková, 2002) Kromě rodu Saccharomyces byly nalezeny v nealkoholických nápojích i rody Endomycopsis a Debaryomyces. (Jesenská, 1993) Do druhé skupiny kvasinek patří rody tvořící bazidiospory neboli bazidiomycetní kvasinky. Ty se řadí mezi Basidiomycotina. Z této skupiny je možným kontaminantem rod Rhodotorula, který nemá žádné kvasné schopnosti. (Jesenská, 1993) 28

Třetí skupinu uzavírají rody, u nichž není známá tvorba pohlavních spor. Tato skupina patří mezi Deuteromycotina. Sem patří zejména rod Candida, jenž se taxonomicky řadí mezi ascomycety. Počáteční spontánní mikroflóru moštu tvoří Kloeckera apiculata (nesporulující forma rodu Hanseniospora), jehož význam spočívá v rychlém rozkvašení samovolně kvasících moštů. Rod Kloeckera snáší velmi kyselé prostředí, tudíž se vyskytuje na nezralých hroznech. (Klaban, 2002) Kromě rodu Candida a Kloeckera byly izolovány z nealkoholických nápojích i rody Trichosporon, Rhodotorula a Bretanomyces. (Jesenská, 1993)

3.6

Alimentární nákazy

Alimentárními nákazami se rozumí onemocnění z potravin. Mohou se rozdělit na alimentární infekce (infekci z potravin) a na alimentární intoxikace. Za infekci z potravin se považuje onemocnění způsobené mikroorganismy, které byly přítomné v konzumované potravině. Alimentární intoxikace neboli intoxikace z potravin není vyvolána samotnými mikroorganismy, ale jejich toxickými metabolity, například mykotoxiny. Intoxikace může být vyvolána i jinými toxiny, které vzniknou při výrobě či skladování navozením takových podmínek, které umožní množení příslušného mikroorganismu a tím i produkci toxinů. Alimentární nebezpečí je však závislé především na patogenitě. Pod pojmem patogenita se rozumí schopnost mikroorganismu nebo jeho metabolitu vyvolat onemocnění. Stupeň patogenity se nazývá virulence. Dále závisí na schopnosti mikroorganismu vstoupit do organismu hostitele a šířit se do tkání, tj. na invazivitě. Neméně důležitým faktorem je toxinogenita, která se vyznačuje schopností mikroorganismu produkovat toxiny, které působí na organismus patogenně. Také se musí pamatovat na infekční dávku, což je dávka, která vyvolá onemocnění. (například u rodu Salmonella je infekční dávka ve výši 101 – 106. (Arpai, 1977; Komprda, 2000) Do čeledi Enterobacteriaceae patří gramnegativní bakterie rodu Salmonella. Existuje přes 2200 serotypů. Z hlediska epidemiologického lze rozdělit salmonely do tří skupin. První skupinu tvoří druhy Salmonella typhi a paratyphi, které jsou patogenní pouze pro člověka a šíří se kontaminovanou vodou a potravinami. Do druhé skupiny patří serotypy salmonel, které se adaptovaly na jednotlivé druhy zvířat, jsou tedy patogenní jen pro tyto druhy zvířat. Ale mnohé z nich jsou patogenní i pro člověka. Třetí skupinu

29

uzavírají ty serotypy, které nemají specifického hostitele a mohou vyvolat onemocnění člověka i zvířat. (Burdychová, 2007) Nejčastější alimentární nákaza je bezprostředně salmonelóza, jejímž původcem je bakterie rodu Salmonella, zejména Salmonella enteritidis. Její výskyt je zejména v syrovém nebo nedostatečně tepelně opracovaném mase, dále se může vyskytovat v majonézách a zmrzlinách či v kontaminované pitné vodě. Použitá kontaminovaná voda může vést i ke kontaminaci ovocných a zeleninových šťáv. Při nedostatečné hygieně pracovníků se může Salmonella dostat během výroby do těchto šťáv. Inkubační doba je od 6 až 48 hodin. Typickým projevem salmonelózy je průjem, který je způsoben enterotoxinem, který je produktem pomnožených salmonel ve střevě. Působením enterotoxinu dochází k hypersekreci vody a iontů z buněk střevního epitelu. Další projevy tohoto onemocnění jsou nevolnost, zvracení, bolest hlavy, zimnice a horečka. (Komprda, 2000) Druhy Salmonella typhi

a Salmonella typhimurium způsobují velmi vážné

onemocnění, břišní tyf, které může vést až ke smrti. Tato nemoc se projevuje silnými bolestmi hlavy a břicha, malátností a vysokými teplotami spojenými s blouzněním. Bakterie jsou vylučovány výkaly, to může vést při špatné hygieně až k epidemii. Optimální růst je při teplotě 37 °C. Pasteračními teplotami je rod Salmonella bezpečně devitalizována. Tento rod je relativně odolný i vůči solení, vysoušení, uzení, resp. mražení. (Šroubková, 1996; Komprda, 2000; Šilhánková 2002) Do stejné čeledi jako rod Salmonella patří také gramnegativní fakultativně anaerobně tyčinky E. coli. E. coli je součásti trávicího traktu většiny teplomilných zvířat i člověka. E. coli se dělí do čtyř skupin. První skupinu zahrnují enteropatogenní E. coli, které způsobují průjmy novorozenců a kojenců. Do druhé skupiny se řadí enteroinvazivní kmeny poškozující sliznici tlustého střeva. Ve třetí skupině jsou enterotoxické kmeny, jejichž výskyt je hlavně v tropických a rozvojových zemích. Poslední skupinu uzavírají verotoxinogenní E. coli produkující verotoxin, které způsobují závažné střevní onemocnění hlavně u dětí. (Burdychová, 2007) Původcem hemoragické kolitidy je koliformní bakterie E. coli 0157:H7, označovaná VTEC (E. coli produkující vero – cytotoxin). První příznaky se projevují 1 – 2 dny po požití kontaminované potravy nekrvavým průjmem. Během dalších 24 – 48 hodin se objevuje krvavý průjem, obvykle bez horečky, jíž předchází bolesti v břiše a vodnatý 30

průjem s následnou dehydratací. Život ohrožující komplikací může být hemoragický uremický syndrom (HUS), který se objevuje i dětí do 10 let. HUS končí 3 až 15 % smrtí. Polovina pacientů je odkázána na dialýzu. Toto onemocnění můžou vyvolat jiné enterohemoragické E. coli produkující enterotoxin. (Greenwood, 2002; Hudecová, 2002) Ovocné a zeleninové šťávy jsou rizikové z hlediska možné kontaminace aerobními bakteriemi rodu Pseudomonas. Tyto bakterie se přirozeně vyskytují v prachu, ve vodě a na pokožce lidí a zvířat, odtud mohou kontaminovat různé potraviny. Alimentární infekci vyvolává zejména Pseudomonas aeruginosa. Průběh infekce je v podstatě mírný. U dospělých se to projevuje nevolností, křečemi, průjmy a zvracením. U dětí hrozí dehydratace organismu, která vede k šoku a oběhovému selhání. (Komprda, 2000)

3.7

Mykotoxiny

Mykotoxiny jako nízkomolekulární sekundární metabolity mikromycetů (vláknitých hub, plísní) nebílkovinné povahy, patří mezi významné naturální (přírodní) toxiny v potravinách a jsou původci mykotoxikóz. V současné době existuje přes 400 mykotoxinů, které produkuje asi 150 druhů hub. Neustále jsou objevovány a chemicky charakterizovány další a další mykotoxiny. Dle výskytu se mohou dělit na exomykotoxiny a endomykotoxiny. Exomykotoxiny patří k většině mykotoxinů, které pronikají do potraviny a zůstávají v ní i po odstranění myceliální části plísně. Endomykotoxiny zůstávají přímo v plísni nebo v jejich sporách. Dále je lze rozdělit dle toxicity k cílovým orgánům (hepatotoxiny, nefrotoxiny, toxiny GIT, neurotoxiny, dermatotoxiny, estrogeny, imunotoxiny, hematotoxiny, genotoxiny). Toxigenní plísně mohou produkovat jeden i více mykotoxinů. Naopak je možná produkce jednoho mykotoxinu více druhy toxigenních plísní. Existují substráty, ve kterých toxigenní plísně netvoří mykotoxiny. Mykotoxiny u většiny plísní nezůstávají v myceliu nebo sporách, ale difundují do substrátu, který plíseň kontaminuje. (Polster, 1971; Ostrý, 1998; Malíř 2003) Produkce mykotoxinů v prostředí je závislá na přítomnosti toxigenní houby, dále na vhodném substrátu pro její růst a v neposlední řadě na prostředí vhodné pro produkci mykotoxinu touto houbou. (Šroubková, 1996)

31

Optimální podmínky pro produkci mykotoxinů v potravinách jsou teplota od 4 do 40 °C a pH 2,5 až 8 (optimum 5 až 7). Dále je zde důležitá hodnota vodní aktivity (aW) mezi 0,8 až 0,85. Optimální vlhkost substrátu je minimálně 14 % a vlhkost vzduchu minimálně 65 %. Produkce mykotoxinů je také ovlivněna obsahem soli (do 14 % NaCl) a obsahem cukru v potravině (do 50 % sacharosy – platí pro Aspergillu flavus). Inhibiční účinky na produkci mykotoxinů mají i některé složky koření (eugenol, tymol, anetol). Mykotoxiny jsou často odolné vůči vyšším teplotám a kuchyňským úpravám. (Malíř, 2003) Mykotoxiny se nejčastěji nacházejí v zaplísněných potravinách, které mohou být viditelné pouhým okem nebo skryté. Alimentární otravy z mykotoxinů jsou mykotoxikózy, které lze rozdělit na akutní a chronické. Akutní mykotoxikóza vzniká při jednorázovém požití vysoké dávky toxinu a způsobuje specifický akutní chorobný syndrom nebo smrt. Chronická mykotoxikóza je způsobena dlouhodobým požíváním nízkých hladin toxinu a projevuje se sníženou produktivitou. To vede ke zpomalenému růstu nebo snížené schopnosti rozmnožování. (Šroubková, 1996) 3.7.1 Aflatoxiny Nejnebezpečnějším a nejjedovatějším druhem mykotoxinů jsou aflatoxiny, které se nejčastěji vyskytují v surovinách dovážených z tropických oblastí. V těchto oblastech jsou optimální podmínky pro růst plísní a produkci těchto mykotoxinů (vyšší teplota, vyšší vlhkost, nedostatečná hygiena). Aflatoxiny jsou produkované toxigenními kmeny Aspergillus flavus (asi 35 % kmenů produkuje aflatoxiny řady B), A. parasiticus (téměř 100 % kmenů je schopno produkovat aflatoxiny řady B i G), A. argeninicus a A. nomius. (ANONYM 5) Aflatoxiny jsou produkovány i dalšími příslušníky rodu Aspergillus: A. clavatus, A. fumigatus, A. mangini, A.niger, A. ochrancens, A. ostianus, A. ruber, A. wentii. Z přibližně 20 druhů aflatoxinů jen čtyři byly objeveny v potravinách (B1, B2, G1 a G2). Vedle základních aflatoxinů byly identifikovány i její metabolity, a to GM, B2a, G2a a Ro. V České republice byl objeven aflatoxin M1 v mléce. Aflatoxiny B jsou odvozeny od začátečního písmene anglického slova blue = modrý, protože pod UV světlem (světlo o vlnové délce 365 nm) fluoreskují modře o koncentraci od 1 – 10 ppb. Aflatoxiny G mají označení podle anglického slova green = zelený, fluoreskují pod UV světlem zeleně při koncentraci 20 – 40 ppb. Aflatoxiny byly nalezeny i u celé řady 32

plísní rodu Penicillium (P. expansum, P. frequentans, P. puberulum, P. variabile), dokonce i u rodu Rhizopus a Mucor. (Polster, 1971; Klaban, 1999) Po chemické stránce jsou aflatoxiny difuroylkumariny. Chemická struktura je zobrazena v příloze 1. Jejich toxicita spočívá pravděpodobně, jak uvádí Voldřich (2000), v blokádě syntézy DNA a RNA. Při dlouhodobém příjmu aflatoxinů dochází k poškození jater vedoucímu až k jaterním karcinomům. Pozdní toxické účinky se projevují mutagenitou, karcinogenitou, teratogenitou nebo imunotoxicitou. Nejtoxičtější aflatoxin je G2, jehož LD50 je 3,45 mg.kg-1. K nejméně toxickým aflatoxinům patří B1, G1.. Avšak aflatoxin B1 je nesilnější známý přírodní karcinogen (hepatokarcinogen), který se vyskytuje zejména v arašídech, kukuřici, v různých druzích ořechů nebo v česneku. Jako LD50 (letální dávka) se uvádí hodnoty od 0,3 – 0,9 mg.kg-1, která vedou do tří dnů až ke smrti. Aflatoxiny se hromadí v játrech, kde jsou ukládány nebo vylučovány močí a stolicí. (Polster, 1971, Malíř, 2003) Nejčastější výskyt aflatoxinů je u obilnin a výrobků z nich, z ostatních semen (ořechů) a výrobků z nich, a v ostatních produktech (brambory, víno, koření, marmelády). Mimo to byly aflatoxiny nalezeny v uměle infikovaných potravinách, a to v ovocných šťávách, rajské šťávě a protlaku. Aflatoxin G2 byl identifikován v pomerančích a citronech. (Polster, 1971; Malíř, 2003) 3.7.2 Patulin V hnijícím ovoci (jablka), následně i v moštu či šťávě se vyskytuje mykotoxin patulin, jehož producenti jsou Aspergillus clavatus, ale především rod Penicillium (P. epxansum, P. cyclopium, P. patulum. P. claviforme). Podle Polstra (1971) je patulin produkován i plísněmi A. terreus, A. gigantus a P. claviforme. (Šroubková, 1996; Šimůnek, 2004) Patulin

jsou

schopné

produkovat

i

některé

kmeny

Byssochlamys

fulva

a Byssochlamys nivea a Paecilomyces varioti. Patulin má imunosupresivní účinky a po opakovaném příjmu organismem může vyvolat poškození jater a sleziny. Dále byly popsány neurotoxické a mutagenní účinky. Původně byl používán jako antibiotikum. (Klaban, 1999 Malíř, 2003) U průmyslově vyrobeného jablečného moštu z předem netříděných jablek byla nalezena koncentrace patulinu až 45 mg.l-1: Příležitostně byl patulin zjištěn v ovoci 33

s přirozenou hnědou hnilobou, zejména v banánech, meruňkách, plesnivých kompotech, hruškovém džusu, ale i v malinách. Patulin je považován jako indikátor špatných výrobních procesů. Je termostabilní a relativně stabilní v kyselém prostředí, proto je nejdůležitější prevencí třídění ovoce a jeho dokonalé očištění a omytí před zpracováním. Vitamin C obsažený v ovoci částečně brání rozkladu patulinu při tepleném opracování kompotů, dření i moštů (čistý patulin podléhá rozkladu při 80 °C). Obsah patulinu v jablečné šťávě je redukován z 99 % během alkoholického kvašení. Hygienický limit pro patulin je 0,02 mg.kg-1 v kojenecké výživě. (Jesenská, 1993; Malíř 2003; Šimůnek, 2004) Chemicky příbuzná látka patulinu je kyselina penicillová. Má podobné biologické účinky jako patulin a často se nalézá za podobných podmínek jako patulin, někdy i společně. (Šimůnek, 2004) 3.7.3 Alternáriové mykotoxiny Producentem těchto mykotoxinů jsou plísně rodu Alternaria (Al. alternata, Al. tenuis, Al. tenuissima, Al. dauci, Al. cucumerina, Al. mali, Al. solani). Rod Alternaria produkuje nejčastěji kyselinu tenuazonovou, alternariol metyleter a alternariol. Méně často se vyskytují altenuen, izoaltenuen a altertoxiny I – III. Optimálními podmínkami pro tvorbu většiny alternáriových mykotoxinů představuje teplota 2 °C a aktivita vody (aW) 0,98. V ČR nejsou stanoveny hygienické limity těchto mykotoxinů. (Malíř, 2003) Nejvíce akutně toxický alternáriový mykotoxin je kyselina tenuazonová, která inhibuje syntézu proteinů. Může vést k salivaci (slinění), anorexii (odmítání potravy) nebo až ke kardiovaskulárnímu kolapsu. (ANONYM 13) Zejména v jablečném moštu a rajčatovém protlaku byly nalezeny poměrně vysoké koncentrace alternariolu, alternariolu etyléteru a kyseliny tenuazonové. V jablkách byla zjištěna během růstu přirozená kontaminace alternariolem ve výši 5,88 mg na 100 g. (Jesenská, 1993; Malíř, 2003) Dále se tyto mykotoxiny mohou vyskytovat v citrusových plodech (mandarinky, pomeranč, citrón), melounech a jahodách. Alternariol byl stanoven v hroznové šťávě, brusinkovém a švestkovém nektaru, malinovém džusu. (ANONYM 13)

34

3.7.4 Další mykotoxiny v ovocných a zeleninových šťávách K méně toxických mykotoxinů patří kyselina byssochlaminová, která je metabolitem velmi častého škůdce ovocných a zeleninových šťáv, kompotů a zavařenin, plísně Paecilomyces varioti a jejího askosporového stádia – Byssochlamys fulva. (Polster, 1971) V zelenině se vyskytuje hlavně ochratoxin A, který je produkován určitými kmeny plísní Aspergillus ochraceus, také i vzácnějšími druhy Aspergillus melleus a Aspergillus sulphureus. Tento mykotoxin jsou schopny produkovat i plísně Penicillium variabile a Penicillium viridicatum. Výskyt ochratoxinu A byl potvrzen v grepové šťávě. (Arpai, 1977; Klaban, 1999; Malíř, 2003) Hořkou chuť jablek může způsobovat mykotoxin trichothecin a jiné mykotoxiny, které produkuje Trichothecium roseum. (Jesenská, 1993) V hroznovém a grepovém moštu byl nalezen mykotoxin sterigmatocystin, který je meziproduktem biosyntézy aflatoxinu B1. Jeho toxické účinky jsou stejné, ale méně akutně toxické. Sterigmatocystin vykazuje hepatotoxický, nefrotoxický, karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinek. (Malíř, 2003) 3.7.5

Likvidace mykotoxinů z potravin

Nejzávažnější z mykotoxinů jsou zajisté aflatoxiny, které jsou velmi termostabilní. Degradace aflatoxinů je částečně nebo úplně možná zářením, případně teplem, nebo silnými kyselinami a zásadami, oxidačními látkami nebo bisulfitem. Na jeho degradaci se zřejmě podílí enzym peroxidáza. Částečně se likviduje jejich toxicita po 4 hodinovém autoklávování při 160 °C a 60 % vlhkosti. Existují bakterie, které jsou schopny biologické detoxikace aflatoxinů. Tuto schopnost mají Flavobacterium aurantiacum a Tetrahymena pyriformis. (Arpai, 1977; Šroubková, 1996) Možnosti odstraňování aflatoxinů z potravin jsou uvedeny v příloze 2. Detoxikace aflatoxinů se nejčastěji provádí promýváním substrátu kapalným čpavkem. Zkoušela se detoxikace i pomocí kyseliny octové. U napadených kapalných a rosolovitých substrátů (kompot, džus) rychle difundují mykotoxiny (patulin) do celého objemu, proto je nejlepší napadený substrát zcela zlikvidovat. (Šimůnek, 2004)

35

U nápojů se mohou fyzikálně odstranit pomocí bentonitu nebo aktivního uhlí aflatoxiny a patulin. Patulin je možné likvidovat vyšším obsahem vitaminu C nebo bisulfitu. (Arpai, 1977; Šroubková, 1996) 3.7.6 Platné normy pro výskyt mykotoxinů Vzhledem k vysoké toxicitě jsou pro aflatoxiny v obilovinách, arašídech, skořápkových plodech, mléku, koření a kojenecké a dětské výživě stanoveny nejvyšší přípustné limity. V USA je v současnosti stanovena maximální hladina pro celkové aflatoxiny 20 µg.kg-1 v potravě a krmivech. Maximální hladina 0,5 µg.kg-1 platí pro AFM1 vzhledem k potenciálnímu riziku u dětí konzumujících větší množství mléčných výrobků. V České republice se stanovené koncentrace aflatoxinů v potravinách pohybují okolo desítek až stovek µg.kg-1 (data z Národního referenčního centra pro mikroskopické houby, Centra hygieny potravinových řetězců z 90. let). 3.7.6.1 Nařízení ES č. 1881/2006 Nařízení 1881/2006/ES nahrazuje nařízení 466/2001/ES, které bylo vícekrát podstatně změněno. Cílem nařízení je chránit před škodlivinami v potravinách tím, že jsou stanoveny maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, které lze rozumně dosáhnout při dodržování správné zemědělské, rybářské a výrobní praxe. Pro zvlášť nebezpečné látky jsou stanoveny limity „na co nejnižší dosažitelné úrovni“ („ALARA“). Pro aplikaci limitů u sušených, koncentrovaných a směsných potravin musí být uváděny zvláštní faktory koncentrace a ředění. Zvláštní pozornost je věnována aflatoxinům (především v kojenecké výživě), ochratoxinu, patulinu a fusariovým toxinům. Pokud se jedná o patulin, byl od roku 2000 schválen prozatímní maximální tolerovatelný denní příjem (PMTDI) patulinu 0,4 µg.kg-1 tělesné hmotnosti. U ochratoxinu A (OTA) byl stanoven tolerovaný týdenní příjem (TWI) na 120 ng.kg-1 tělesné hmotnosti. Přehled maximálních limitů mykotoxinů v potravinách je uveden v příloze 3. Toto nařízení se zabývá nejen mykotoxiny, ale i dalšími látkami, které jsou pro zdraví člověka nebezpečné. Jedná se zejména o těžké kovy (olovo, rtuť, kadmium, cín), dále 36

dusičnany, dioxiny a PCB (polychlorované bifenyly) a mnoho dalších možných kontaminantů.

3.8

Faktory ovlivňující růst mikroorganismů

3.8.1 Vliv aktivity vody (aW) Aktivita vody je měřítkem využitelnosti vody pro nežádoucí procesy mikrobního i nemikrobního kažení. Aktivita vody je dána podílem parciálního tlaku par nacházejících se nad roztokem při určité teplotě a parciálního tlaku par čisté destilované vody při téže teplotě. Voda má tedy aktivitu vody 1. Aktivita vody klesá s nárůstem koncentrace rozpuštěných látek v roztoku. Různé mikroorganismy potřebují pro svůj rozvoj a činnost určitou minimální aktivitu vody, jehož přehled je v tab. 2. (Hrudková, 1989; Šilhánková, 2002) Využití snížení aktivity vody má význam pro snížení činnosti mikroorganismů. Toho lze dosáhnout buď odstraněním vody sušením nebo odpařením nebo zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí přídavkem vhodných látek. Oba způsoby se využívají zejména při sušení ovoce, zeleniny, hub, masa, také mléka a ovocných šťáv. Nejčastější látkou pro snížení vodní aktivity se používá sacharosa o konečné koncentraci 50 až 70 % nebo chlorid sodný o konečné koncentraci 10 až 15 %. (Šilhánková, 2002)

aW =

p p0

Tab. 2 Aktivita vody různých mikroorganizmů Druh mikroorganismu

Aktivita vody

Aktivita vody

(Hrudková, 1989)

(Šilhánková, 2002)

Plísně

< 0,65

dolní limit 0,60

Kvasinky

< 0,78

0,91 – 0,88

Bakterie

< 0,86

0,99 – 0,93

37

3.8.2 Vliv pH na trvanlivost ovocných a zeleninových šťáv V ovocných a zeleninových šťávách je mnoho volných kyselin, proto mají šťávy nízkou hodnotu pH, která se pohybuje v rozmezí 2,6 – 3,8. Většina mikroorganismů roste spíše v neutrálním prostředí, slabě kyselém prostředí nebo slabě alkalickém prostředí. Jejich biochemická činnost je ovlivněna koncentrací vodíkových iontů v prostředí. Extrémní pH může mít smrtící účinek na mikroorganismy. V kyselém prostředí se rozmnožují pouze acidotolerantní a acidofilní mikroorganismy. V tomto prostředí přežívají i mikroorganismy, které tvoří kyseliny jako hlavní produkty metabolismu (octové, propionové nebo mléčné bakterie). V následující tab. 3 jsou uvedeny limitní hodnoty pH pro skupiny mikroorganismů. (Hrudková, 1989; Šilhánková, 2002) Velký vliv má pH na spory, proto se využívá kyselého pH, které zabraňuje klíčení spor a jejich přeměně na vegetativní formu, zejména u rodu Bacillus, Clostridium a Desulfotomaculum. Tato skutečnost má význam u teplem sterilovaných potravin: kyselé potraviny (ovocné kompoty a šťávy). Kvasinky rostou nejlépe v kyselém prostředí (optimální pH kolísá mezi 4,2 a 5,5), ale naproti tomu již slabě alkalické prostředí (o pH kolem 7,5) vede k inhibici růstu. Plísně optimálně rostou při neutrálním pH, jsou ale schopny růst i v rozmezí pH 1,2 až 11,0. V kyselém prostředí se rozmnožují plísně, které produkují organické kyseliny, například penicilia a aspergily. (Šilhánková, 2002) Tab. 3 Acidotolerance některých mikroorganismů (Hrudková, 1989) Mikroorganismus

Schopnost růstu při pH

Bacillus

4,5 – 8,5

koliformní bakterie

3,5 – 9,5

Lactobacillus

3,5 – 9,5

Leuconostoc

2,9 – 7,5

Gluconobacter

2,4 – 7,0 38

Kvasinky

1,5 – 8,5

Plísně

1,5 – 9,0

Pseudomonas

4,5 – 11,0

Stafylococcus

4,5 – 8,5

3.8.3 Redoxní potenciál Podmínky pro růst mikroorganismů jsou závislé i na redoxním potenciálu, který je definovaný jako záporný logaritmus tlaku vodíku (pH2), jímž by musela být nasycena platinová elektroda, aby byla stejně redukčně účinná jako zkoumané prostředí. rH = − log PH 2 Vliv prostředí, které vykazuje určitý oxidačně redukční potenciál, je dán přítomností oxidačních nebo redukčních činidel. K nejdůležitějším oxidačním činidlům patří kyslík a peroxidy. Mezi nejčastější redukující činidla se řadí železnaté ionty a vodík. Aerobní mikroorganismy potřebují ke svému růstu přítomnost rozpuštěného kyslíku, a tedy pozitivní oxidačně redukční potenciál. Rozpustnost kyslíku v kapalinách je poměrně nízká a klesá se stoupající teplotou. Naopak na anaerobní mikroorganismy působí kyslík a pozitivní oxidačně redukční potenciál škodlivě, v některých případech má smrtící účinek. Proto je nutné vytvořit vhodné anaerobní podmínky snížením redox potenciálu, a to například odstraněním kyslíku varem nebo odstraněním redukčních látek).

Čím vyšší je hodnota redoxního potenciálu, tím stoupá oxidační schopnost roztoku. Výše redoxního potenciálu ovlivňuje průběh metabolismu, neboť v kultivačním prostředí se vyrovnává vnitřní potenciál buněk s potenciálem okolního roztoku. Stabilní nápoje jsou s nízkým rH (při rH vyšším než 15 se pomnožují kvasinky) Nepřímý vliv na potlačení růstu kvasinek má dostatečný přídavek kyseliny askorbové, která váže přítomný kyslík v nápoji.

39

Cílem je minimalizovat přístup kyslíku při plnění. Obecně platí maximální obsah 1 mg.l-1 rozpuštěného kyslíku a maximální obsah plynného kyslíku 1 mg v hrdle láhve. (Hrudková, 1989; Šilhánková, 2002)

3.8.4 Teplota Teplota je jeden z důležitých faktorů, které ovlivňují růst mikroorganismů. Rozlišuje se teplotní minimum a teplotní maximum. Za teplotní minimum se považuje nejnižší teplota, při které se mikroorganismus rozmnožuje zjistitelnou rychlostí. Teplotní maximum je nevyšší teplota, při které je mikroorganismus schopen se ještě rozmnožovat zjistitelnou rychlostí. Teplota, při které se mikroorganismus množí nejvyšší rychlostí, se označuje jako teplotní optimum. Podle teploty potřebné k růstu a rozvoji se mikroorganismy dělí na psychrofilní, psychrotrofní, mezofilní a termofilní. Psychrofilní mikroorganismy jsou označovány takové mikroorganismy, jejichž teplotní optimum je nižší než 20 °C. Jsou však schopny poměrně intenzivního růstu ještě při teplotě 0 až 5 °C. Některé plísně jsou schopny pomalého růstu ještě při teplotách -10 °C díky vnitrobuněčné vodě, která je za těchto podmínek

v kapalném

stavu

(díky

vnitrobuněčnému

osmotickému

tlaku).

Z potravinářského hlediska jsou významné psychrotrofní mikroorganismy, které jsou schopny rychlého růstu ještě při teplotách 0 až +10 °C. Většina mikroorganismů patří k mezofilním mikroorganismům, které rostou v rozmezí teplot od 5

do 45 °C.

Optimální teplota se u bakterií pohybuje nejčastěji kolem 37 °C, u kvasinek a plísní kolem 30 °C.

Pro potravinářství jsou negativní termofilní mikroorganismy, které

přežívají běžnou pasterační teplotu. Jejich optimální teplota se pohybuje různě, nejčastěji mezi 50 až 60 °C. Některé extrémní termofily rostou i při sterilačních teplotách (nad 100 °C). Mezi nejrizikovější termofilní mikroorganismy patří sporulující bakterie rodu Bacillus a Clostridium, které produkují toxiny. (Šilhánková, 2002) Vysoké teploty se využívá zejména ke konzervaci potravin, kdy dochází k usmrcení většiny mikroorganismů nebo k inaktivaci jejich enzymů. Účinné jsou i nízké teploty, které ale spíše potlačují činnost mikroorganismů. Při nízkých teplotách přežívají zejména spory.

40

3.9

Prevence mikrobiální kontaminace

Zeleninové a ovocné šťávy jsou vhodnými živnými půdami pro mikroorganismy, proto musí být šťávy během zpracování, skladování a distribuce chráněny před kontaminací. Primární prevencí je však šetrný sběr čerstvého ovoce a zeleniny, dále přeprava, rychlé a důkladné třídění s následným skladováním a zpracování dle správné výrobní praxe. (Piecková,1998) Obecně se může zbrzdit kažení surovin (ovoce a zelenina) změnami vnějších podmínek skladování (např. chlazením), kdy působením nízké teploty dojde k potlačení růstu většiny mikroorganismů, tím se ale někdy může jen oddálit proces kažení. (Komprda, 2000) Dalším preventivním opatření před mikrobiální kontaminací je oddělení zpracování ovoce a zeleniny od vlastního provozu výroby šťáv. V boji proti činnosti nežádoucích mikroorganismů se používají fyzikální a chemické metody a jejich kombinace. V případě eliminace mykotoxinů se používají i biologické metody s využitím mikroorganismů. Hlavní zásadou prevence je však dodržení podmínek tepelného ošetření surovin a produktů. Neméně důležité je dodržování hygieny pracovníků a dokonalá sanitace nástrojů, přístrojů a jiného veškerého vybavení využívané při výrobě ovocných a zeleninových šťáv. (Šilhánková, 2002) K preventivnímu opatření patří i dodržování skladovacích podmínek při skladování ovoce a zeleniny. Ovoce a zelenina by měly být uloženy při mírně zvýšené teplotě ve spodní části chladničky. Obecně se tyto suroviny skladují při nižších teplotách, v dobře větratelném prostoru, v temnu a suchu. (Gaman, 1979) Také mechanicky lze snížit obsah mikroorganismů na plodech ovoce a zeleniny. Mezi mechanické úkony patří odstraňování organických zbytků, a to hlíny, prachu a jiných nečistot. Pro povrchovou sterilaci a sterilaci prostorů se využívá ultrafialového záření, které se používá zejména na sterilaci prostorů aseptického balení potravin, například plnění moštů sterilovaných mimo obal. (Šilhánková, 2002)

41

K chemickým metodám ochrany před mikrobiální kontaminací patří oxid uhličitý, který ve vysokých koncentracích potlačuje rozmnožování mikroorganismů, proto je vhodný při uchování ovocných šťáv v tancích za sklepních teplot (15 °C). Pro sterilaci korunkových uzávěrů a obalů z plastů se využívá peroxid vodíku v 30 % koncentraci. Dočasně se ovocné šťávy konzervují kyselinou mravenčí, která je účinná v kyselém prostředí hlavně proti plísním a kvasinkám. Proti plísním se v kyselém prostředí využívá kyselina sorbová. (Šilhánková 2002). Důležité je také odvětrávání v provozních místnostech. Nejefektivnější způsob ventilace je klimatizace, při níž do provozní místnosti přichází mikrobiologicky čistý vzduch, upravený na žádanou teplotu a vlhkost, za současného odsávání vzduchu, který je znečištěný parami a prachem z okolí. (Šilhánková, 2002) Neméně důležitá je čistota tlakového vzduchu, který se používá například při stáčení šťáv do lahví a jiných obalů. K tomu se používají různé filtry, které se pravidelně mění. (Kocková – Kratochvílová, 1980)

3.10 Konzervace ovocných a zeleninových šťáv Pro zvýšení biologické stability a prodloužení trvanlivosti ovocných a zeleninových šťáv se používají různé druhy konzervace. Konzervace slouží i jako obrana proti rozkladné činnosti mikroorganismů. Pod pojmem konzervace se rozumí každý úmyslný zákrok, kterým je dosaženo prodloužení údržnosti potravin déle, než je její přirozenost. Rozlišují se tři typy konzervací, a to vylučování mikrobů z prostředí, přímá inaktivace mikrobů a nepřímá inaktivace mikrobů.

3.10.1 Vylučování mikrobů z prostředí Do prvního typu se zahrnuje praní ovoce a zeleniny před dalším zpracováním, tím se odstraní mechanické nečistoty a část mikrobiálních nečistot. Získané ovocné a zeleninové šťávy mohou být filtrovány azbestocelulosovými nebo kaolinovými filtry. Tyto filtry spolehlivě zachytí mikroorganismy i spory. Před filtrací se musí šťávy odkalit a zbavit makromolekulárních koloidně rozpuštěných látek, zejména pektinu a vlákniny. Po filtraci postupují šťávy asepticky do sterilních nádob bez možnosti jejich rekontaminace. Druhým možným způsobem vylučování mikrobů z prostředí je tzv. baktofugace. Jedná se odstředivou separaci mikroorganismů zvláštní centrifugou, 42

baktofugou. Princip je založen na rozdílu hustoty kapaliny a hustoty mikrobiálních spor obsažených v dané kapalině a jejich rychlé kontinuální vyloučení odstředivou silou. Nevýhodou těchto metod konzervace je aktivita přítomných enzymů a ochuzování o nutričně cenné látky v odfiltrovaných nebo odstředěných kalech z ovocných šťáv. (Ingr, 2007)

3.10.2 Přímá inaktivace mikroorganismů Přímá inaktivace mikroorganismů zahrnuje fyzikální a chemické metody. Z fyzikálních metod se nejvíce používá pro konzervaci ovocných a zeleninových šťáv termosterilace neboli konzervace zahříváním. Tímto způsobem může být u šťáv dosaženo pasteračního nebo sterilačního účinku. Pasteračním účinkem se inaktivuje pouze vegetativní stádia mikroorganismů, spory však přežívají. Sterilačním účinkem se rozumí inaktivace všech mikroorganismů včetně spor. Výsledný produkt je teoreticky neomezeně trvanlivý. (Ingr, 2007) Nejčastěji se používá pasterace na principu UHT (ultra - high temperature processing). Jedná se několikavteřinové zahřátí při teplotě pod 100 °C. K tomuto účelu se používá vlhké teplo, které slouží jak k pasteraci, tak i ke konzervaci kyselých potravin. (Šilhánková, 2002) Alternativou tepelné pasterace je použití VF technologie (vysokofrekvenční technologie). V tomto případě se jedná o využití radiových vln ke zvýšení bezpečnosti/nezávadnosti ovocných a zeleninových šťáv. K tomu se používá technologie RFEF (vysokofrekvenční elektrické pole), která úspěšně inaktivuje bakterie zejména v ovocných šťávách bez použití tepla. (ANONYM 4) Šetrnou netermální metodou konzervace tekutých potravin je využití pulzního elektrického pole (PEF), které vede k usmrcování mikroorganismů v potravinách, zatímco chuť, vůně, barva a nutriční hodnota potravin zůstávají zachovány. V porovnání s tepelným opracováním způsobuje PEF nižší denaturaci bílkovin, více se zachovává vitamin C v pomerančové šťávě, chuťové a vonné složky. (ANONYM 7) Dále se může využívat ke konzervaci ionizující záření gama (max. 10 kGy). (Piecková, 1998)

43

Existuje i možnost sterilace odporovým ohřevem. To se děje v elektrosterilátoru. Jedná se o přenosný přístroj se 2 až 3 uhlíkovými elektrodami, které se zavěsí blízko dna nádoby (nevodivá, termorezistentní a hermeticky uzavíratelná). Šťáva, která se předem zhruba odkalí a zfiltruje, se při průchodu střídavého proudu (stejnosměrný proud vede k rozkladu šťáv) mezi elektrodami zahřívá, stoupá vzhůru, čímž se samovolně promíchává. Šťáva se většinou ukládá v sudech nebo menších jímkách, které jsou hermeticky uzavíratelné. Nevýhodou je působení teplot 30 až 60 °C na oxidační enzymy šťáv, které jsou při této teplotě nejaktivnější, a proto mohou vyvolat různé senzorické i nutriční změny. Působením této teploty hrozí i nebezpečí přehřátí šťávy. (Ingr, 2007) Při průtokové sterilaci ovocných šťáv by mohla být použita sterilace ultrazvukem. Destruktivní účinky ultrazvuku na mikroorganismy jsou v kapalném prostředí vyvolány tzv. kavitací. Jedná se o porušení soudržnosti molekul kapalného prostředí mikroorganismů. Vliv elementárních částic prostředí a plynu rozpuštěných v kapalině se podílí na mechanické destrukci mikroorganismů. Nevýhodou tohoto způsobu sterilace je působení ultrazvuku na enzymy, čímž může dojít k nutričním a senzorickým změnám sterilovaného produktu. (Ingr, 2007)

3.10.2.1

Využití hydrostatického tlaku v konzervárenství

V současné době je nejaktuálnější konzervace vysokým hydrostatickým tlakem. Jedná se o sterilaci izostatickým tlakem, tzv. paskalizací. (Ingr, 2007) Praktické využití vysokých tlaků v potravinářství vychází ze dvou základních principů. První se nazývá Le Chatelierův princip, který říká, že všechny jevy (například fázové změny, chemické reakce, změny konfirmace molekul) doprovázené zmenšením objemu jsou urychleny zvýšením tlaku. Podle druhého principu, zákona o šíření tlaku v kapalinách, se tlak šíří konstantně všemi směry v celém zpracovávaném vzorku. (Voldřich, 2000) Potravina může být buď v přímém kontaktu s tlakovým médiem, nebo hermeticky uzavřená v obalu, který přenáší tlak. (Voldřich, 2000) Potraviny, které jsou již zabalené, se umístí do vysokotlaké nádoby, která je naplněna médiem přenášející tlak, většinou vodou. V této nádobě je krátkodobě vynaložen tlak o 100 až 1 000 MPa. Působením

44

vysokého tlaku dochází k inaktivaci enzymů, vegetativních forem mikroorganismů. Ovšem endospory jsou schopné přežít i vyšší tlaky než 1 000 MPa. (Ingr, 2007) Významným faktorem, který ovlivňuje účinnost vysokého tlaku, je teplota. Se zvyšováním teploty od záporných hodnot odolnost mikroorganismů nejprve vzrůstá, až dosáhne maxima. Ale s dalším zvyšováním teploty jejich odolnost klesá. V kombinaci s vyššími teplotami umožňuje inaktivovat i bakteriální spory. Její předností je zachování nutričních a senzorických vlastností, dále úspora energie a rovnoměrné působení na produkt. Účinek vysokého tlaku vede k inaktivaci klíčových enzymů, poškození DNA a RNA a ribozomů. Dále se vysoký tlak podílí na destrukci membrán a buněčné stěny. Působením vysokých tlaků může docházet k částečné nebo úplné inaktivaci enzymů. V ovocných šťávách je poměrně tlakově rezistentní enzym pektinesterasa, který může mít vliv na tvorbu zákalů. Jeho aktivita někdy slouží jako kritérium účinnosti vysokotlaké pasterace těchto produktů. Dalšími významnými enzymy jsou peroxidasa a polyfenoloxidasa. Působením tlaku v rozmezí od 100 do 400 MPa v mandarínkové a citrusové šťávě si zachovaly pektinesterasa a peroxidasa aktivitu. K 90 % snížení jejich aktivity došlo až při tlaku 600 MPa během 10 minut při teplotě 23 °C. úplná inaktivace peroxidázy byla pozorována u mrkvové a jablečné šťávy působením tlaku 900 MPa. Aplikace vysokotlaké pasterace ovocných šťáv spočívá v inaktivaci enzymu pektinesterasy a mikroorganismů bez senzorických a nutričních změn. (Brůna a kol., 1999)

3.10.3 Nepřímá inaktivace mikroorganismů Sem patří fyzikální, chemické a biologické metody. Chemická ani biologická konzervace ovocných a zeleninových šťáv se nepoužívá. K fyzikálním metodám patří uchování čerstvých šťáv při nízké teplotě, dále snížení aktivity vody v surovinách sušením nebo odpařováním, zejména u koncentrátů při výrobě pomerančových džusů. (Šilhánková, 2002) Princip odnímání vlhkosti je odstranění takového množství vody z potraviny, jejíž zbytek již neumožňuje rozvoj mikroorganismů. Typická je konzervace zahušťováním 45

odpařováním vody ovocné šťávy na vakuových odparkách za sníženého tlaku, kde se bod varu pohybuje mezi 40 až 70 °C. (Ingr, 2007) Sušení pomocí neredukujícího disacharidu trehalosy se může použít u koncentrátu pomerančové šťávy obsahující 7,5 % hmotnostních pevných pomerančových částic. Do tohoto koncentrátu se přidá 15 % hmotností trehalózy a suší se rozprašováním. Teplota vzduchu na přívodu 170 °C, teplota vzduchu u vývodu 80 až 84 °C a rychlost rozprašování 40 000 otáček za minutu. (ANONYM 16) Kryokoncentrace je metoda konzervace, která je šetrná vůči aromatickým složkám. Jedná se o koncentraci ovocných šťáv pozvolným zmrazováním, při kterém voda vymrzá ve formě velkých ledových krystalů. Tyto ledové krystaly se oddělí od matečného roztoku centrifugací. Šťávy lze koncentrovat i membránovými procesy. Tato koncentrace je založena na vyrovnání

koncentrace

látek

mezi

dvěma

roztoky

oddělených

navzájem

semipermeabilní (polopropustnou) membránou. Voda se postupně dostává z méně koncentrovaného roztokou do koncentrovanějšího, dokud se koncentrace v obou roztocích nevyrovnají. (Ingr, 2007) Mezi účinnou koncentraci membránovými filtry patří ultrafiltrace ovocných šťáv, která je účinná zejména na termorezistentní mikromycety. Jedná o separační metodu, kde jsou 2 membrány, a to semipermeabilní polymerní (acetát celulosy) a anorganická (keramika). Membrány jsou schopny zadržet částice o velikosti 2 - 200 nm. Tlak působící během ultrafiltrace je od 0,1 do 2 MPa. K ultrafiltraci se používají deskové, spirálovité nebo tabulární moduly. (ANONYM 15)

46

4

MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ

4.1

Charakteristika výrobku

Vzorek č. 1: Čerstvě vylisovaná šťáva z mrkve. Datum výroby 6. 4. 2009. Vzorek č. 2: Tesco Mrkvová šťáva od firmy Beskyd Fryčovice, a.s. Skládá se ze 100 % dřeňové šťávy z mrkve, lisované za studena, bez konzervačních látek. Zpracováno vysokým tlakem za studena. Datum spotřeby: 9. 4. 2009, cena: 30 Kč, objem: 0,33 l Vzorky byly analyzovány před datem spotřeby, kdy byly uchovávány při teplotě do 8 °C.

4.2

Příprava laboratorních pomůcek

Laboratorní sklo muselo projít sterilací, aby se zabránilo sekundární kontaminaci. Skleněné pipety se zavatovaly a vysterilizovaly se při 160 °C po dobu 60 minut v horkovzdušném sterilizátoru. Zkumavky s 9 ml destilované vody se uzavřely a nechaly se sterilizovat při 121 °C po dobu 20 minut v parním sterilizátoru.

K mikrobiální analýze byly použity následující pomůcky: -

Petriho misky

-

zkumavky

-

skleněné pipety

-

kádinka

-

uzávěry

-

odšťavovač

47

4.3

Zpracování vzorku

Vzorek č. 1: Omytá a očištěná mrkev se vložila do elektrického odšťavovače. 1 ml vzorku šťáv případně jejich desetinného ředění byl inokulován do sterilních Petriho misek a zalit rozehřátým a na 40 – 45 °C zchlazeným živným médiem. Zchladlé misky byly umístěny do termostatu, kde proběhla inkubace za daných podmínek. Tab. 4 Inokulace metodou zalití do živné půdy pro vzorek č.1

Ředění ve zkumavce

Objem inokula

10-3

1 ml

2 Petriho misky pro CPM

10-4

1 ml

2 Petriho misky pro CPM

10-1

1 ml

10-2

1 ml

10-1 (pasterace při 80 °C/10 min.)

1 ml

2 Petriho misky pro plísně a kvasinky

10-2

1 ml

2 Petriho misky pro plísně a kvasinky

2 Petriho misky pro sporulující bakterie 2 Petriho misky pro sporulující bakterie

Tab. 5 Inokulace metodou zalití do živné půdy pro vzorek č. 2

Ředění ve zkumavce

Objem inokula

10-1

1 ml

2 Petriho misky pro CPM

10-2

1 ml

2 Petriho misky pro CPM

10-1

1 ml

10-2

1 ml

48

2 Petriho misky pro sporulující bakterie 2 Petriho misky pro sporulující

bakterie 10-1 (pasterace při

80 °C/10 min.)

10-2

4.4

1 ml

2 Petriho misky pro plísně a kvasinky

1 ml

2 Petriho misky pro plísně a kvasinky

Stanovení mikroorganismů

V obou vzorcích byly stanoveny tyto skupiny mikroorganismů: -

celkový počet mikroorganismů (CPM) – inkubace na živné půdě PCA v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin

-

sporulující bakterie (SP) – inkubace na živné půdě PCA v termostatu při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin (po záhřevu 10 min. při 80 – 85 °C)

-

plísně a kvasinky (PL/KV) – inkubace na živné půdě YGC agar v termostatu při teplotě 25 °C po dobu 72 – 120 hodin

4.5

Složení a příprava použitých živných půd

PCA (Plate-Count-Agar) – caseinpepton-glucose-hefeextrakt-agar (Merck, Německo) = agar pro celkový počet mikroorganismů Složení: pepton z kaseinu 5 g kvasničný exktakt 2,5 g glukóza 1 g agar 14 g Příprava: 22,5 g prášku se rozpustí v 1 l destilované vody, poté se vloží do autoklávu na 15 minut při 121 °C. pH – 7,0 ± 0,02 při 25 °C

49

YGC – agar – hefeextrakt – glucose – chloramphenicol –agar (Merck, Německo) = agra s kvasničným extraktem, glukózou, a chloramfenikolem podle FIL – IDF Složení: kvasničný extrakt 5 g glukóza 20 g chloramfenikol 0,1 g agar 14,9 g Příprava: 40 g prášku se rozpustí v 1 l destilované vody, poté se vloží do autoklávu na 15 minut při 121 °C. pH – 6,6 ± 0,2 při 25 °C

4.6

Vyjádření výsledků

Po uplynutí doby, která byla potřebná k inkubaci, byl z Petriho misek odečten počet jednotlivých skupin mikroorganismů. Zjištěné hodnoty byly dosazeny do níže uvedeného vzorce a vypočítané hodnoty byly vyjádřeny v KTJ/ml. N=

∑c V * d * (n1 + 0,1n 2 )

∑c ………….. součet kolonií spočítaných na Petriho miskách V …………… objem inokula d ……………. faktor prvního použitého ředění n1 …………… počet Petriho misek pro první ředění n2 …………… počet Petriho misek pro druhé ředění

50

5

VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Ve vzorcích mrkvové šťávy domácí výroby a zakoupené v obchodní síti byly

stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM), sporulující bakterie (SP) a plísně a kvasinky (PL/KV). Výsledky analýz jsou uvedeny v následující tabulce a znázorněny v grafu 1., 2. a 3. Tab. 6 Přepočet mikroorganismů na 1 ml

CPM

SP

PL

106

maximální limit

KV 5 . 104

vzorek 1

8,2 . 105

205

40

275

vzorek 2

1,54 . 105

20

10

0

Graf. 1: Obsah celkového počtu mikroorganismů (CPM) ve vzorcích v KTJ/ml

CPM

1 000 000 900 000 800 000 700 000 600 000 počet MO/1m l 500 000 400 000 300 000 200 000 100 000 0 maximální limit

vzorek 1

51

vzorek 2

Graf. 2: Obsah sporulujících bakterií, plísní a kvasinek ve vzorcích v KTJ/ml

300 250 200 vzorek 1

počet MO/1m l 150

vzorek 2

100 50 0 SP

PL

KV

Graf. 3: Porovnání obsahu kvasinek ve vzorcích s jejich maximálním limitem v KTJ/ml

50000 40000 maximální limit

30000

vzorek 1

počet MO/1m l 20000

vzorek 2

10000 0 KV

Vyhláška č. 132/2004 říká, že v čerstvých ovocných a zeleninových šťávách (tepelně neošetřených, bez konzervačních látek) je možné maximální přípustné množství celkového počtu mikroorganismů (CPM) ve výši 106. Počet kvasinek může dosáhnout maximálně 5 . 104. Tato vyhláška ale byla zrušena a nahrazena Nařízením komise

č.1441/2007 do potravinářské mikrobiologie v ČR. ČSN 56 9609 02/2008 udává hodnoty pro CPM v ovocných a zeleninových šťávách hodnoty 107 u 5 zkoumaných vzorků (resp. 5.107 u 2 z pěti vzorků). Podle této normy se Salmonella nesmí vyskytovat v žádném z 5 vzorků o objemu 25 ml. E. coli může dosahovat hodnot v 5 vzorcích 102 (resp. 103 ve 2 z pěti vzorků) Z grafu je vidět, že CPM u mrkvové šťávy domácí výroby se blíží maximálnímu limitu stanovenému vyhláškou. Z toho lze usoudit, že mrkev na výrobu této šťávy 52

nebyla dostatečně očištěna a omyta. Pro okamžitou konzumaci čerstvé šťávy vyrobené domácím způsobem tento vyšší obsah CPM nevyvolá zdravotní újmu. Lze uvažovat, že při dlouhodobějším skladování této šťávy může obsah CPM stoupnout přes maximální limit. Poté by byla šťáva považována za zdravotně závadnou. Naopak u komerčně vyrobené mrkvové šťávy je obsah CPM téměř o 80 % nižší, než je jeho maximální limit. Tato šťáva je tedy zdravotně nezávadná. Obsah plísní a kvasinek je podle grafu 2. vyšší u mrkvové šťávy domácí výroby. U koupené šťávy nebyly detekovány žádné kvasinky. Z grafu 3. je patrné, že obsah kvasinek zdaleka nedosahuje maximálnímu limitu stanovené vyhláškou. Z tab. 6 lze vyčíst, že obsah sporulujících bakterií, i po předchozím záhřevu šťáv při 80 – 85 °C po dobu 10 minut, je u prvního vzorku 10 x vyšší než u vzorku druhého. Hranice pro celkový počet plísní a sporulujících bakterií pro čerstvé ovocné a zeleninové šťávy nejnovější vyhlášky neuvádějí.

53

6

ZÁVĚR Ovocné a zeleninové šťávy jsou vhodným živným prostředím pro růst a rozvoj

mikroorganismů díky vysokému obsahu vody. Ovoce a zelenina jako suroviny pro výrobu šťáv jsou také dobrým prostředím pro rozvoj mikroorganismů, a proto mohou být kontaminovány různými mikroorganismy, které pak přetrvávají ve vyrobených šťávách. Šťávy mohou být kontaminovány i během výroby, distribuce a skladování. Mikrobiální kontaminace pak mohou vést k alimentárním nákazám, a to k alimentárním infekcím (infekcí z potravin) nebo k alimentárním intoxikacím (toxické metabolity mikroorganismů). K nejčastějším alimentárním nákazám patří salmonelózy vyvolané rodem Salmonella a bakterie E. coli, která vyvolává různé zažívací potíže. Podle nařízení ES č. 1441/2007 musí být Salmonella negativní v 25 ml nepasterované ovocné a zeleninové šťávy. V experimentálním stanovení různých skupin mikroorganismů ve dvou vzorcích mrkvových šťáv nebyly zjištěny vyšší počty mikroorganismů, než udává Nařízení komise č. 1441/2007 do potravinářské mikrobiologie v ČR a ČSN 56 9609 02/2008. Obě tyto šťávy lze považovat za zdravotně nezávadné.

54

7

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

[1]

ARPAI, Ján: Potravinárska mikrobiológia, Praha: SNTL, 1977, 280 stran

[2]

BALAŠTÍK, Jaroslav: Konzervování v domácnosti, Velehrad Ottobre 12, 2001, 229 stran, ISBN 80-86524-32-9

[3]

BAYER, Caroline: Domácí výroba sirupů a šťáv, Český Těšín: Víkend, 2002, 96 stran, ISBN 80-7222-273-2

[4]

BURDYCHOVÁ, Radka; SLÁDKOVÁ, Pavla: Mikrobiologická analýza potravin. 1.vydání, Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2007, 218 stran, ISBN 978-80-7375-116-6

[5]

BRŮNA, Dušan; ISTENESOVÁ, Lýdie; VOLDŘICH, Michal: Aplikace vysokého hydrostatického tlaku v potravinářství: Přehled, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha, 1999

[6]

FRAZIER, Willam C., Food mikrobiology, 4. vydání, United States of America: McGraw-Hill Book, 1988, 539 stran, ISBN 0-07-02192-4

[7]

GAMAN, P.M. and SHERRINGTON, K.B.: The Science of Food an introduction to food science, nutrition and microbiology, Oxford: Pergamon Press, 1979, 300 stran, ISBN 0-08-019948-8

[8]

GREENWOOD, David a kolektiv: Lékařská mikrobiologie, Praha: Grada Publisching, 1999, 690 stran, ISBN 80-7169-365-0

[9]

HAMPL, Bohuš: Mikrobiologická zkoumání potravin, Praha: VŠCHT, 1956, 104 stran,

[10] HRUBÝ, Stanislav a spolupracovníci: Mikrobiologie v hygieně výživy, Avicenum Praha 1984, 208 stran. ISBN 08-083-84 [11] HRUDKOVÁ, Alena; MARKVART, Josef, a kolektiv: Nealkoholické nápoje, 1. vydání, SNP Praha 1989, 560 stran, ISBN 80 – 200 – 1024 – 6

55

[12] HUDECOVÁ, Daniela; MAJTÁN, Viktor: Mikrobiológia I, STU Bratislava 2002, 189 stran, ISBN 80-227-1663-4 [13] INGR, Ivo: Základy konzervace potravin, 3. vydání, Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2007, 137 stran, ISBN 978.80-7375-110-4 [14] JESENSKÁ, Zdenka: Micromycetes in foodstuffs and feedstuffs, Amsterdam: Elsevier, 1993, ISBN 0-444-98684-7 [15] KLABAN, Vladimír: Svět mikrobů – Malý mikrobiologický slovník, 1. vydání, Hradec Králové: Gaudeamus, 1999, 303 stran, ISBN 80-7041-639-4 [16] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, Anna: Biologická kontrola výroby piva a nealkoholických nápojov, 1. vydání, Alfa Bratislava 1980, 336 stran, ISBN [17] KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, Anna: Taxónomia kvasiniek a kvasinkovitých mikroorganizmov, Alfa Bratislava 1990, 699stran, ISBN 80-05-00644-6 [18] KOMÁR, Aleš a kol.: Technologie, zbožíznalství a hygiena potravin, Brno, 2005, 142 stran, ISBN 80-7231-032-1 [19] KOMPRDA, Tomáš: Hygiena potravin, Brno : Mendelova zemědělská a lesnická fakulta, 2000, 180 stran, ISBN 80-7157-276-4 [20] KYZLINK, Vladimír: Základy konzervace potravin, 2. vydání, Praha: SNTL, 1980 [21] MALÍŘ, František, OSTRÝ, Vladimír a kolektiv: Vláknité mikromycetů (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka, 1. vydání, Brno 2003, 349 stran, ISBN 80-7013395-3 [22] MILLIDGE, Judith: Džusy, Frýdek-Místek Alpress 2005, 256 stran, ISBN 807362-080-4 [23] MÜLLER, Gunther: Grundlagen der Lebensmittelmikrobiologie, 5. vydání, Liepzig: Fachbuchverlag, 1983, 332 stran,

56

[24] OSTRÝ, Vladimír: Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví

člověka, 1. vydání, SZÚ Praha 1998, 20 stran, ISBN 80-7071-102-7 [25] POLSTER, Miroslav: Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách, Brno, 1971 [26] ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology, 3. vydání, Praha: Academia, 2002, 363 stran, ISBN 80-200-1024-6 [27] ŠROUBKOVÁ, Eva: Technická mikrobiologie, 1. vydání, Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 1996, 150 stran, ISBN 80-7157-226-8 [28] VAŘEJKA, František: Mikrobiologie pro veterinární hygieniky, 1. vydání, Praha: SPN, 1990, 232 stran, ISBN 80-85114-02-X [29] VOLDŘICH, Michal: Použití vysokých tlaků v potravinářské technologii, Praha: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze , 2000 [30] WALKER, Norman: Čerstvé ovocné a zeleninové šťávy, 1. vydání, Olomouc: Fin, 1993, 174 STRAN, ISBN 80-85572-63-X [31] ZACKER, Christiana: Domácí výroba sirupů a šťáv, Víkend 2003, 96 stran, ISBN 80-7222-273-2

¨

57

ANONYM 1. Mladá fronta dnes [online] [cit.28-10-2008] Dostupný z WWW: ANONYM 2. Ústav zemědělské ekonomiky a informací [online] [cit.29-11-2008] Dostupný z WWW: 3. KOPÁČOVÁ, O: Bakteriální test pro ovocné a zeleninové šťávy, Ústav zemědělské ekonomiky a informací, [online] 2007 [cit.29-11-2008]

Dostupný z WWW: ANONYM 4. Ústav zemědělské ekonomiky a informací [online]

[cit.29-11-2008]

Dostupný z WWW: ANONYM 5. Toxikon [online] [cit.26-01-2009] Dostupný z WWW: ANONYM 6. Neoficiální dokumentový server MZLU [online] [cit.26-01-2008] Dostupný z WWW: ANONYM 7. Ústav zemědělské ekonomiky a informací [online] [cit.26-01-2008] Dostupný z WWW: ANONYM 8. [online] [cit.23-02-2009] Dostupný z WWW: ANONYM 9. The University of Sydney [online] [cit.23-02-2009] Dostupný

z WWW:


xins/toxinTypes.html> 58

10. PIECKOVÁ,E.: Termorezistentní mikromycety a požívatiny [online] 1998 [cit.2302-2009] Dostupný z WWW: ANONYM 11. Ministerstvo zemědělství [online] [cit.27-02-2009] Dostupný z WWW: ANONYM 12. Ministerstvo zemědělství [online] [cit.27-02-2009] Dostupný z WWW: 13. OSTRÝ, V., RUPRICH, J., MALÍŘ, F.: Alternáriové mykotoxiny: toxikologické informace a výskyt v potravinách [online]. 2008 [cit.27-02-2009]

Dostupný

z WWW:


2007_24_deklas_ALT.pdf> 14. ŠIMŮNEK, J.: Plísně a mykotoxiny [online]. 2004[cit.27-02-2009] Dostupný z WWW: ANONYM 15

Univerzita Pardubice, katedra analytické chemie: Konzervárenství

[online]. 2007 [cit.02-03-2009] Dostupný z WWW: < http://kalch.upce.cz/add_on/potech4.pdf> ANONYM 16 Úřad průmyslového vlastnictví, Patentový spis: Způsob sušení vodu obsahujících potravin nebo nápojů [online]. 2005 [cit.03-03-2009]

Dostupný z WWW: 17. DANIELLS, S.: Tomato juice could lower inflammation [online]. 2006 [cit.05-05-2009] Dostupný z WWW:

59

7.1

Legislativní zdroje

Vyhláška MZd č. 53/2002 Sb. kterou se stanoví chemické požadavky na zdravotní nezávadnost jednotlivých druhů potravin a potravinových surovin, podmínky použití látek přídatných, pomocných a potravních doplňků

Vyhláška MZ č. 335/1997 Sb. pro nealkoholické nápoje, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny, ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droždí, ve znění vyhlášky 289/2004 Sb.

Vyhláška Mze č. 45/2000 Sb. kterou se mění vyhláška Ministerstva zemědělství č. 335/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. A), d), h), i), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů pro nealkoholické nápoje a koncentráty k přípravě nealkoholických nápojů, ovocná vína, ostatní vína a medovinu, pivo, konzumní líh, lihoviny a ostatní alkoholické nápoje, kvasný ocet a droždí účinnost 1. 4. 2000, vybraná ustanovení

Vyhláška č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení

Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách

Nařízení Komise (ES) o mikrobiologických kritériích pro potraviny č.2073/2005 Nařízení komise č.1441/2007 do potravinářské mikrobiologie v ČR ČSN 56 9609 02/2008 Pravidla správné hygienické praxe a výrobní praxe Mikrobiologická kriteria pro potraviny.Principy stanoveni a aplikace

60