MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Mikroflóra zeleninových a ovocných šťáv ošetřených vysokým tlakem Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce:

Vypracovala:

Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Bc. Nela Zagóra Brno 2008

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikroflóra zeleninových a ovocných šťáv ošetřených vysokým tlakem vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….

PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat vedoucímu diplomové práce Ing. Liboru Kalhotkovi Ph.D. za odborné vedení a Ing. Blance Kvasničkové za cenné rady při tvorbě diplomové práce i při mikrobiologických rozborech.

ABSTRACT The thesis themed Microflora of vegetable and fruit juices treated with high pressure refers to vegetable/fruit juices by Beskyd Fryčovice Inc. This company is the 1st vegetable/fruit juice processor who uses high pressure on the industrial level for its products treatment. The thesis describes the meaning of fruits and vegetables in nutrition of man as well as a probable microbiological contamination of vegetable/fruit juices. It also focuses on method of high pressure treatment (conservation) and influence of high pressure on particular nutritive elements. In a practical part of the thesis can be found a description of a given product and an experimentally determined microbiological contamination depending upon the time.

Key words: fruit, vegetable, microorganism

ABSTRAKT Diplomová práce na téma Mikroflóra zeleninových a ovocných šťáv ošetřených vysokým

tlakem

se

zaměřuje

na

zeleninovo-ovocné

šťávy

od

firmy

Beskyd Fryčovice, a.s. Tato firma je prvním zpracovatelem zeleninovo-ovocných šťáv, který využívá pro ošetření svých výrobků vysokého tlaku na průmyslové úrovni. Diplomová práce popisuje význam ovoce a zeleniny ve výživě člověka, ale také možné mikrobiologické znečištění zeleninovo-ovocných šťáv. Dále se zaměřuje na metodu konzervace vysokým tlakem a vliv vysokého tlaku na jednotlivé složky potravin. V praktické části této práce je popis daného výrobku a experimentálně stanovena mikrobiologická kontaminace v závislosti na čase.

Klíčová slova: ovoce, zelenina, mikroorganismus

OBSAH 1 Úvod.............................................................................................................................10 2 Literární přehled...........................................................................................................11 2.1 Výživa člověka..........................................................................................................11 2.1.1 Zásady racionální výživy........................................................................................11 2.1.2 Ovoce a zelenina ve výživě člověka.......................................................................12 2.2 Ovoce.........................................................................................................................13 2.3 Zelenina.....................................................................................................................13 2.4 Ovocné a zeleninové šťávy........................................................................................14 2.5 Mikroflóra ovoce a zeleniny......................................................................................14 2.5.1 Kažení ovoce..........................................................................................................15 2.5.2 Kažení zeleniny......................................................................................................15 2.6 Mikrobiální rozklad potravin.....................................................................................16 2.6.1 Bakterie a další mikroorganismy podílející se na kažení potravin.........................17 2.6.1.1 Gram-pozitivní sporulující bakterie.....................................................................17 2.6.1.2 Bakterie mléčného kysání....................................................................................17 2.6.1.3 Kvasinky a plísně.................................................................................................17 2.7 Viry............................................................................................................................18 2.7.1 Základní způsoby kontaminace potravin viry........................................................18 2.7.2 Prevence virových onemocnění..............................................................................19 2.7.3 Viry z čeledi Caliciviridae způsobující gastroenteritidy........................................19 2.7.4 Infekční virová hepatitida.......................................................................................20 2.8 Bakterie......................................................................................................................20 2.9 Významná onemocnění z potravin způsobená patogenními bakteriemi...................21 2.9.1 Nejvýznamnější alimentární bakteriální infekce....................................................21 2.9.1.1 Salmonelóza.........................................................................................................21 2.9.1.2 Onemocnění způsobená patogenními kmeny bakterie Escherichia coli.............21 2.9.1.3 Alimentární infekce vyvolané klostridii..............................................................22 2.9.1.4 Shigelóza.............................................................................................................22 2.9.1.5 Alimentární infekce vyvolané pseudomonádami................................................22 2.9.2 Významné alimentární bakteriální intoxikace........................................................23 2.9.2.1 Stafylokoková enterotoxikóza.............................................................................23 2.9.2.2 Onemocnění způsobená druhem Bacillus cereus................................................23

2.9.2.3 Botulizmus...........................................................................................................23 2.10 Opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům..............................................24 2.11 Konzervace..............................................................................................................24 2.12 Aplikace vysokého hydrostatického tlaku v potravinářství.....................................25 2.13 Historie používání vysokých tlaků..........................................................................26 2.14 Vliv vysokých tlaků na základní složky potravin....................................................27 2.14.1 Voda......................................................................................................................27 2.14.2 Tuky......................................................................................................................28 2.14.3 Proteiny.................................................................................................................29 2.14.3.1 Denaturace proteinů...........................................................................................29 2.14.3.2 Tvorba gelů........................................................................................................29 2.15 Vliv vysokých tlaků na reakce probíhající v potravinách.......................................30 2.15.1 Enzymy a enzymové reakce.................................................................................30 2.16 Vliv na senzorické a nutriční vlastnosti potravin....................................................31 2.17 Vliv vysokých tlaků na mikroorganismy.................................................................32 3 Cíl práce........................................................................................................................35 4 Materiál a metodika......................................................................................................36 4.1 Charakteristika podniku.............................................................................................36 4.2 Zeleninové a ovocné šťávy........................................................................................37 4.2.1 Mrkvová šťáva........................................................................................................37 4.2.2 Šťáva z červené řepy..............................................................................................38 4.2.3 Šťáva z brokolice a jablka......................................................................................38 4.2.4 Zelná šťáva.............................................................................................................38 4.3 Metodika....................................................................................................................39 4.3.1 Příprava laboratorního skla a pomůcek..................................................................39 4.3.2 Živné půdy..............................................................................................................39 4.3.3 Vlastní mikrobiologické analýzy............................................................................40 5 Výsledky a diskuse.......................................................................................................41 6 Závěr.............................................................................................................................47 7 Literatura......................................................................................................................48 8 Přílohy..........................................................................................................................50

Seznam tabulek a grafů

Tab. 1 Srovnání celkového počtu mikroorganismů (CPM) 0.den, 7. den a 30. den po otevření................................................................................................................41

Tab. 2 Srovnání počtů sporulujících mikroorganismů (Spor.MO) 0.den, 7. den a 30. den po otevření...........................................................................................42

Tab. 3 Srovnání počtů plísní a kvasinek (Pl/kv) 0.den, 7. den a 30. den po otevření..44

Tab. 4 Nárůst celkového počtu mikroorganismů. sporulujících mikroorganismů, plísní a kvasinek v závislosti na čase u šťávy z brokolice a jablka...............................45

Graf 1 Srovnání celkového počtu mikroorganismů (CPM) 0.den, 7. den a 30. den po otevření...........................................................................................................42

Graf 2 Srovnání počtů sporulujících mikroorganismů (Spor.MO) 0.den, 7. den a 30. den po otevření.....................................................................................................43

Graf 3 Srovnání počtů plísní a kvasinek (Pl/kv) 0.den, 7. den a 30. den po otevření..45

Graf 4 Nárůst celkového počtu mikroorganismů. sporulujících mikroorganismů, plísní a kvasinek v závislosti na čase u šťávy z brokolice a jablka...............................46

1 Úvod Ovoce a zelenina je jednou ze základních složek lidského jídelníčku. Obsahuje velké množství vlákniny a hlavně vitamínů hrajících v našem organismu řadu ochranných rolí. Jednou z těch nejdůležitějších je neutralizace procesů, při kterých vznikají škodlivé volné radikály. Tyto molekuly se významně podílejí na vzniku kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. Již během vegetace se dostává na ovoce a zeleninu prostřednictvím hmyzu, prachu i stykem se zemí, mnoho mikroorganismů. Typičtí saprofyti se však na povrchu živých a zdravých plodin nemnoží a čekají na příhodné podmínky (přezrálost, sklizeň, poranění, onemocnění pletiva aj.). Nekyselá zelenina je lepším hostitelem bakterií než kyselé ovoce, které je naopak příznivějším prostředím pro kvasinky a plísně. Při sklizni se počet mikroorganismů na ovoci a zelenině zvyšuje z mnoha příčin (dotyky rukou a nářadí, poranění plodů, menší odolnost plodů oddělených od mateřské rostliny). Význam kažení potravin je zřejmý ze skutečnosti, že pouze vlivem samotné mikrobiální aktivity je zničena nejméně jedna čtvrtina celkové světové produkce potravin. Jednou z metod ošetření potravin je technologie zpracování potravin velmi vysokým tlakem. Rozumí se tím použití izostatického tlaku řádově tisíců barů po dobu několika minut, čímž se dosáhne účinku podobného sterilaci, tj. účinné inaktivace nežádoucích mikroorganismů popřípadě i dalších efektů jako například ovlivnění funkčních vlastností bílkovin (např. koagulace), inaktivace enzymů, ovlivnění počátku a způsobu krystalizace lipidů apod., bez nutnosti potravinu zahřívat nebo v kombinaci s velmi šetrným záhřevem. Tím vzniká možnost vyrábět údržné potraviny o vysoké kvalitě, blížící se svými senzorickými vlastnostmi potravinám čerstvým, neboť při tomto procesu nedochází zpravidla k odbourání vitamínů, barvy a vůně. Úkolem předložené práce bylo zaměřit se na zeleninovo-ovocné šťávy vyrobené firmou Beskyd Fryčovice, a.s., která jako první v ČR využívá pro ošetření svých výrobků vysokého tlaku na průmyslové úrovni. Úkolem bylo stanovit u těchto výrobků významné skupiny mikroorganismů, které se podílejí na mikrobiální kontaminaci hotových výrobků.

10

2 Literární přehled 2.1 Výživa člověka

Výživa je základní potřeba člověka, jak uvádějí Sovjak a Reisnerová (2001), která zabezpečuje přívod energie a živin pro usměrňování a řízení životních pochodů, tj. dýchání, srdeční činnost, udržení tělesné teploty, svalový výkon atd. Vše, co slouží k výživě živých organismů, nazýváme potravou. Lidskou potravou jsou poživatiny, které dělíme na potraviny, pochutiny a patří k nim i voda a nápoje. Potraviny jsou poživatelné části rostlinných a živočišných těl nebo jejich produktů např. mléko, vejce nebo med. Mnohé nápoje (mléko, kakao, tekuté mléčné výrobky), ale i některé tekuté ovocné výrobky mají výživovou hodnotu a jsou tudíž potravinami. Systém, který příjmem živin, úpravou pokrmů i rytmem podávání stravy nejlépe odpovídá vědecky zdůvodněným zásadám zdravé výživy se nazývá racionální výživa. Za správnou výživu je podle Víta a Gottvaldové (2008) mnohdy zaměňováno držení různých typů diet či všelijakých zaručených speciálních stravovacích režimů.

2.1.1 Zásady racionální výživy

Podle Sovjaka a Reisnerové (2001) by člověk měl jíst pravidelně alespoň 5x denně, což je fyziologičtější než hromadit potřebný denní objem stravy ve 2-3 dávkách. Jíst stravu smíšenou a vedle tepelně upravených pokrmů zařazovat denně syrové ovoce a zeleninu. Denní spotřeba živin a energie musí odpovídat skutečné potřebě ve vztahu k věku, fyziologickému stavu organismu a fyzické zátěži (pracovní, sportovní apod.).

Stravu

sestavovat

z rozmanitých

potravinových

zdrojů,

vyhýbat

se

jednostrannosti potravin. Omezovat potraviny s rizikovými faktory, tj. vysokým obsahem tuku živočišného původu, hlavně cholesterolu, dále cukrů a soli. Preferovat zdroj bílkovin, který má nižší podíl energetických zdrojů, tj. tuků a sacharidů (ryby, drůbež, luštěniny). Zvýšit podíl vlákniny ve stravě (ovoce, zelenina, luštěniny, výrobky z celozrnného obilí). Zabezpečit dostatek vitamínu C, E, karotenoidů (vit A, selenu, vápníku, železa, zinku). Omezit konzumaci alkoholu. Při vlastní přípravě stravy volit šetrný způsob úpravy k zabránění ztrát nutričních látek a zachování

11

smyslových vlastností. Preferovat čerstvou zeleninu před zmrazenou a konzervovanou. Omezit tepelné úpravy, při kterých mohou vznikat zdraví škodlivé látky, např. smažení (přepalované tuky), přeuzování, rožnění, uzení. Udržovat si žádoucí tělesnou hmotnost. Pirnerová (2007) uvádí, že existuje zhruba čtyřicet pět základních živin, které jsou důležité pro lidské zdraví. Vedle bílkovin, tuků a cukrů potřebujeme nezbytně ještě vitamíny, minerály, antioxydanty, vlákninu, nenasycené mastné kyseliny a mnoho dalších látek. Některé z nich si náš organismus dokáže sám vytvořit, jiné dostává z potravy.

2.1.2 Ovoce a zelenina ve výživě člověka

Ovoce a zelenina jsou, jak uvádí Meng a Doyle (2002) základní složkou lidského jídelníčku. Během posledních dvou desetiletí můžeme pozorovat v lidské výživě ukázku dobře vyvážené stravy, bohaté na ovoce a zeleninu propagující dobré zdraví a možné snížení rizika některých nemocí. Ovoce a zelenina obsahují velké množství vlákniny, a hlavně vitamínů hrajících v našem organismu řadu ochranných rolí. Jednou z těch nejdůležitějších je neutralizace procesů, při kterých vznikají škodlivé volné radikály. Tyto molekuly se významně podílejí na vzniku kardiovaskulárních a nádorových onemocnění (Pirnerová, 2007). Všechny rostliny vyvíjejí své vlastní ochranné látky - proti volným radikálům, které vznikají např. působením slunečních paprsků, proti bakteriím a virům napadajícím rostlinné buňky, proti ohrožení zvířaty, jako jsou myši nebo ptáci. Produkují také flavonoidy, které mají speciální úkol chránit před vnitřním zničením proteiny, enzymy nebo vitaminy v kořenech, stvolech, listech nebo květech (Oberbeil a Lenzová 2003). Zvýšená konzumace syrového ovoce a zeleniny pomáhá tělu bojovat s infekcí a chrání proti některým druhům rakoviny. Vařením se ničí různé vitamíny a enzymy. Například vitamin C, který je velmi termolabilní, se vařením úplně zničí. Při tepelném zpracování potravin vzniká řada škodlivých látek – zejména při smažení, pečení, grilování, fritování a uzení. Čím vyšší je teplota, tím rychleji tyto látky vznikají a tím jsou nebezpečnější. Vědci, kteří zkoumali problém léčení pomocí syrové stravy, se domnívají, že existují i další důležité látky, jako jsou esenciální oleje v rostlinách, chlorofyl nebo saponiny, které jsou zdraví prospěšné a které se teplem mění nebo ničí (Bernkusová, 2007).

12

2.2 Ovoce

Havel (2007) uvádí, že stejně jako u řady dalších potravin, v případě ovoce možná ještě o trochu více platí, že nejvhodnější ke konzumaci jsou takové druhy, které se přirozeně vyskytují v prostředí, v němž žije i jejich konzument. Potíž je, že opravdu původních druhů ovoce v našich krajích příliš není – v zásadě jde především o lesní plody (jahody, maliny, borůvky) a různé plané příbuzné třešní. Ačkoli to není příliš známo, jablka, švestky, hrušky či meruňky se na naše území dostaly teprve před několika stovkami let. Ale to v zásadě k tomu, abychom je považovali za domácí, stačí. Minerální látky jsou v těle zastoupeny v relativně malém množství, jak uvádí Sovjak a Reisnerová (2001), pro organismus jsou však nezbytné. Jsou hlavními činiteli při udržení stálého vnitřního prostředí, jejich rovnováha zajišťuje normální tvorbu tkání, jsou součástí hormonů, enzymů, složených bílkovin tuků a dalších látek. Vlákniny obsahuje ovoce mnoho, a to většinou jemnější a tudíž lehčeji stravitelné, než jakou má zelenina. Mimo to obsahuje vlákninu spolu s aromatickými látkami, takže příjemně chutná. Vláknina podporuje také pohyb střev a zaručuje tím pravidelné vyprazdňování. V ovoci je převládajícím polysacharidem pektin, v menším množství se vyskytuje celulosa, hemicelulosy a lignin (Velíšek, 1999).

2.3 Zelenina

Čerstvá zelenina byla vždy důležitou skupinou ve stravě. Spotřebitelé si více uvědomují důležitost těchto produktů pro udržení dobrého zdravotního stavu. Proto nakupují a spotřebovávají více čerstvých produktů a dožadují se větší pestrosti těchto výrobků na trhu. Navzdory zlepšení metod udržujících kvalitu a dobu trvanlivosti čerstvých produktů, role mikroorganismů při kažení a bezpečí čerstvých produktů je pořád limitujícím faktorem. (Sumner a Peters, 1997) Požívání zeleniny je staré jako lidstvo samo. Sběrem listů, kořenů, cibulí, oddenků a planých plodů si doplňoval živočišnou potravu již pravěký člověk. Rostliny totiž poskytují člověku nejen základní živiny, jako jsou bílkoviny, tuky a cukry, ale i důležité vitamíny, nerostné látky, tzv. hrubou vlákninu, silice a mnoho ochranných a léčivých látek (Troníčková, 1985). 13

2.4 Ovocné a zeleninové šťávy

Ovocné šťávy jsou získávány mechanickými postupy z ovoce nebo koncentrátu z nich, s případným přídavkem cukrů, obsah ovocné sušiny ve šťávě musí po přepočtu odpovídat nejméně původnímu množství použité ovocné šťávy získané přímo z ovoce (Mottl, 1999). Tekuté výrobky z ovoce a zeleniny patří způsobem výroby spíše k výrobkům s rozmělněnými pletivy, protože jsou to vlastně jemné protlaky. Mají však tekutou konzistenci a tedy charakter nápoje. Minimální velikost buněk v rostlinných pletivech vylučuje rozrušení všech buněk a uvolnění jejich obsahu. Zpracování jemné drti komplikuje oddělování pevné a tekuté fáze. Šťáva obsahuje vyšší podíl makromolekulárních složek. Zpracování hrubé drti dává naopak velice nízké výtěžky. Pro každou výchozí surovinu je stanovena optimální velikost částic drti (např. pro jablka je to 2 až 3 mm). K výrobě zeleninových šťáv se používá pouze kvalitní zelenina. V zahraničí jsou v současné době nejrozšířenější mrkvové šťávy. Rozšiřuje se však i výroba jiných druhů zeleninových šťáv, jako např. rajčatová, zelná aj. Ve směsích se uplatňuje celerová šťáva, šťáva z červené řepy, reveňová šťáva, špenátová šťáva aj. (Maleř, 1996).

2.5 Mikroflóra ovoce a zeleniny

Mikrobiologii potravin musíme chápat, jak uvádí Doyle, Beuchat a Montville (2001), jako základní biofyzikální princip mikrobiologie. Již během vegetace se dostává na ovoce a zeleninu prostřednictvím hmyzu, prachu i stykem se zemí, mnoho mikroorganismů. Typičtí saprofyti se však na povrchu živých a zdravých plodin nemnoží a čekají na příhodné podmínky (přezrálost, sklizeň, poranění, onemocnění pletiva aj.). Nekyselá zelenina je lepším hostitelem bakterií než kyselé ovoce, které je naopak příznivějším prostředím pro kvasinky a plísně. Při sklizni se počet mikroorganismů na ovoci a zelenině zvyšuje z mnoha příčin (dotyky rukou a nářadí, poranění plodů, menší odolnost plodů oddělených od mateřské rostliny) (Ingr, 2007).

14

2.5.1 Kažení ovoce

Mikrobiologické kažení ovoce probíhá obyčejně od povrchu. Ovoce obsahuje mnoho vody a sacharidů a je proto velmi dobrým médiem pro mikroorganismy. Vysoký obsah organických kyselin snižuje hodnotu pH dužniny na takovou míru, která brání růstu většiny bakterií, ale toleruje růst plísní a kvasinek. Rezistence ovoce a zeleniny se během skladování neustále snižuje, proto se později vyskytují jako škůdci i takové mikroorganismy, vůči kterým je rostoucí plod relativně rezistentní. Jsou to, například, příslušníci rodů Botrytis a Rhizopus. Zdrojem nákazy ovoce může být půda, stromy, odumřelé části ovoce, nářadí na sběr, třídící stroj, obalový materiál, skladovací prostory, jednotlivé už napadnuté ovoce anebo vysušené (mumifikované) kusy ovoce. Spory a hyfy plísní pronikají do ovoce na místech poškození jeho povrchových struktur (poškození při sběru, kroupami během bouřek, hmyzem), přes přírodní otvory, dýchací buňky anebo přímo přes bezchybné povrchové pletivo. Eliminace skladových plísní ovoce začíná převážně už před jeho sběrem pomocí fungicidů, odstraňováním nahnilých anebo mumifikovaných plodů před jeho skladováním a dezinfekcí skladovacích prostor a obalového materiálu (Görner a Valík, 2004).

2.5.2 Kažení zeleniny

Pod pojmem zelenina se rozumí různé orgány anebo části rostlin odlišných čeledí, které se používají jako potraviny. Zelenina má poměrně vysoké hodnoty pH (rajčata 4,4 až 4,0 - nejnižší a kukuřičné zrna nejvyšší 6,1 až 6,5), proto se na jejím kažení vedle plísní a kvasinek podílí i bakterie. Významnou složkou přírodní mikroflóry zelenin jsou bakterie mléčného kvašení. Na zdravých rostlinách dominují příslušníci čeledi Leuconostocaceae (Leuconostoc) a druhy rodu Lactobacillus. Zelenina roste v bezprostřední blízkosti půdy, proto jsou vždy kontaminované půdní bakteriální a plísňovou mikroflórou. Mezi níž je řada potenciálních škůdců, plísní produkujících mykotoxiny a sporulujících bakterií Clostridium butulinum, C. perfringens a Bacillus cereus, které se řadí mezi toxinogenní organismy. Zelenina je vždy kontaminována mikroorganismy, za sucha prachem a za vlhka blátem.

15

Při vysoké vlhkosti a zvýšené skladovací teplotě rostou na zelenině velmi dobře fytopatogenní druhy bakterií rodu Erwinia a Xanthomonas. Při nižších skladovacích teplotách dominují plísně a kvasinky (Görner a Valík, 2004).

2.6 Mikrobiální rozklad potravin

Potraviny rostlinného původu mají rozmanité složení. Proto se zákonitosti mikrobiálního rozkladu podstatně liší. Rozklad produktů rostlinného původu může podle Doyle (2001) probíhat různými způsoby, které jsou závislé na specifitě produktu, životním prostředí a přítomných mikroorganismech. Ze všech změn, které vedou k rozkladu neúdržných potravinových surovin a potravin, jsou nejrozsáhlejší a nejzávažnější mikrobiální změny potravin. Mikrobiální rozklad potravin způsobují různé druhy mikroorganismů a je nejzávažnější formou nežádoucích změn neúdržných potravin. Mikrobiální rozklad potravin je provázen změnami senzorických vlastností vedoucích velmi rychle k nepřijatelnosti a tedy nepoživatelnosti potraviny, dále dochází k podstatným ztrátám živin a konečně může takový proces vyústit až ke zdravotní závadnosti potravin pomnožením patogenních mikroorganismů nebo obsahem toxických látek vytvořených mikroorganismy. U mikroorganismů musíme počítat s jejich vysokou schopností přizpůsobovat se novým podmínkám (tzv. adaptabilita), např. u salmonel bylo zjištěno již více než 2500 sérovarů. Znamená to, že člověk si nemůže být nikdy jist definitivou svého vítězství nad mikroorganismy. Adaptabilita jednotlivých druhů mikroorganismů je rozmanitá a je založena na selekci rezistentních mutantů. Ve vztahu k lidskému zdraví můžeme nežádoucí mikroorganismy členit na choroboplodné či patogenní (z nichž některé vyvolávají onemocnění přímo, např. salmonely, nebo produkcí toxinů, např. Clostridium botulinum), na podmíněně patogenní (jejich patogenní účinek se dostavuje jen za určitých podmínek) a na nepatogenní (tzv. banální či obecná mikroflóra), která škodí svým počtem tím, že rozkládá potraviny. Zdravotní nezávadnost potravin je z hlediska mikrobiálního dána nepřítomností patogenních mikroorganismů a jejich toxinů (Ingr, 2007).

16

2.6.1 Bakterie a další mikroorganismy podílející se na kažení potravin

Na kažení potravin se mohou podílet kvasinky, plísně i bakterie. Kažení potravin je možno popsat jako jakousi změnu, která má za následek, že daný produkt je nepřijatelný pro lidskou spotřebu. V tomto smyslu je zhodnocení stupně kažení potraviny vztaženo přímo nebo nepřímo k senzorickému posouzení. Význam kažení potravin je zřejmý ze skutečnosti, že pouze vlivem samotné mikrobiální aktivity je zničena nejméně jedna čtvrtina celkové světové produkce potravin (Komprda, 2007).

2.6.1.1 Gram-pozitivní sporulující bakterie

Tyto mikroorganismy, především příslušníci rodů Bacillus a Clostridium, jsou významné zvláště u potravin, které byly podrobeny tepelnému opracování (pasterace). G+ bakterie rostou v běžných podmínkách mnohem pomaleji než konkurující gramnegativní mikroflóra, ta je však tepelným zásahem eliminována, takže bacily a klostrídie se mohou následně nerušeně množit (Komprda, 2007).

2.6.1.2 Bakterie mléčného kysání

Bakterie mléčného kysání tvoří fermentací sacharidů kyselinu mléčnou, slizové látky a CO2. Nejvýznamnějšími rody jsou v tomto smyslu Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus (Komprda, 2007).

2.6.1.3 Kvasinky a plísně

Kvasinky a plísně podílející se na kažení potravin jsou v prostředí široce rozšířeny, nacházejí se v půdě, ve vodě, na povrchu hmyzu, na rostlinách, živočišných produktech. Tyto mikroorganismy jsou schopny utilizovat kromě sacharidů, proteinů a lipidů i méně přístupné substráty, jako pektiny nebo organické kyseliny. Kromě toho tolerují nízké pH, nízké hodnoty vodní aktivity, nízkou (chladírenskou) teplotu a přítomnost konzervačních látek. V současné době se kvasinky a plísně často podílejí na kažení čerstvých mořských produktů, čerstvé zeleniny, baleného masa a lahůdkových potravin (salátů). 17

Kažení potravin kvasinkami a plísněmi se projevuje produkcí slizových látek, kyselin (fermentací sacharidů), plynu, alkoholu a dále pigmentací povrchu potravin a změnami chuti a vůně. Kromě senzoricky postřehnutelných změn produkují některé druhy plísní nebezpečné toxiny (Komprda, 2007).

2.7 Viry

Ve srovnání s bakteriálními alimentárními onemocněními vykazují potravinami přenosná virová onemocnění následující odlišnosti. V mnoha případech nevede virová infekce k postižení trávicího traktu (infekční hepatitida), toto konstatování ovšem neplatí pro alimentární infekce způsobené viry čeledi Caliciviridae, kde dané onemocnění naopak probíhá pod obrazem „klasické“ gastroenteritidy. Virus se v potravině nemnoží a tedy ji nekazí. Potravina není pro virus živným médiem, ale pouze pasivním vektorem přenosu, přítomnost viru v potravině není indikována změnou její senzorické jakosti. Z důvodu nutnosti specifické interakce obalových virových proteinů s receptory hostitelské buňky (druhová specifičnost daného viru) je zoonotický přenos u alimentárních onemocnění velice nepravděpodobný (zoonóza je onemocnění přenosné ze zvířete na člověka). V epidemiologii onemocnění má rozhodující roli fekálně-orální přenos; možný je také přenos prostřednictvím zvratků a vektorů jako hmyz, voda, potraviny. Zhodnocení alimentárního rizika je ve srovnání s bakteriemi obtížnější (Komprda, 2007).

2.7.1 Základní způsoby kontaminace potravin viry

1. endogenní (primární) Primární biologická kontaminace se vyznačuje tím, že se virus pomnožil v jatečném zvířeti již před jeho poražením; vlivem předporážkového stresu může dojít k aktivaci inaparentní (ne zjevné) infekce. Příkladem mechanické kontaminace je kontaminace ryb nebo jiných vodních živočichů (mlžů) virem infekční hepatitidy vodou znečištěnou odpadními vodami. Při tomto způsobu kontaminace se ovšem virus ve svalovině uvedených živočichů nemnoží.

18

2. exogenní (sekundární) Dochází pouze k mechanické kontaminaci, potravina je pouze vektorem přenosu viru, nedochází v ní k jeho množení (Komprda, 2007).

2.7.2 Prevence virových onemocnění

Základem prevence virových alimentárních onemocnění je zábrana kontaminace potravin částicemi lidských fekálií přenesených špinavýma rukama, tedy důsledná osobní hygiena: při mytí rukou se má použít mimo jiné kartáček pro odstranění špíny z nehtů. V případě předpokládané kontaminace potraviny je možno přítomný virus inaktivovat důkladným tepelným ošetřením potraviny nebo působením silných oxidačních činidel (ozon, chlor). Neúčinné je naopak použití ionizujícího záření nebo snížení pH (okyselení). Ani vysoušení, mražení nebo solení nevede zpravidla k devitalizaci viru, nýbrž naopak k jeho konzervaci (Komprda, 2007).

2.7.3 Viry z čeledi Caliciviridae způsobující gastroenteritidy

Kaliciviry jsou v současnosti v některých zemích hlavní příčinou lidské gastroenteritidy. Lidské kaliciviry, jak uvádí Komprda (2007), se řadí do dvou rodů: Norwalk-like viry (NLV) a Sapporo-like viry (SLV). Jedná se o sférické částice velikosti asi 30 nm, bez vnějšího obalu. Jednovláknitá +RNA je obalena proteinovou kapsidou. Virus se nedá kultivovat na tkáňových kulturách. Inkubační doba závisí na počtu částic v potravině (resp. vodě), v průměru je asi 36 hodin. Klinicky se onemocnění projevuje jako samoodeznívající gastroenteritida trvající v průměru 24 - 72 hodin. Z epidemiologických šetření plyne, že virus se přenáší zvratky, potravinami a vodou, vzplanutí epidemií je náhlé. Celosvětově jsou NLV příčinou nejdůležitějších epidemií nebakteriální gastroenteritidy. Hlavním zdrojem kontaminace potravin jsou lidské fekálie. K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří vodní živočichové, dále pekárenské produkty, zeleninové, ovocné nebo masové saláty, předvařené masné výrobky, syrové ovoce a zelenina. Častým zdrojem infekce je voda: studny, povrchové vody, komerčně vyráběný led, plavecké bazény.

19

Nejdůležitější preventivní opatření jsou dvě: -

přísná osobní hygiena všech zpracovatelů potravin,

-

zabránění kontaminace vod lidskými fekáliemi.

(Komprda, 2007)

2.7.4 Infekční virová hepatitida

Původcem jsou viry infekční hepatitidy z čeledi Picornaviridae. Nejběžněji se jedná o virus (a následně o hepatitidu) typu A. Jediným zdrojem nákazy je člověk - virus je v něm přítomen v krvi, moči a stolici - odtud je vylučován do vnějšího prostředí, včetně vody - kontaminace rukou člověka - kontaminace potravin ze znečištěných rukou nebo vody. Základem prevence alimentární infekční hepatitidy je zamezení sekundární kontaminace potravin především dodržováním zásad přísné osobní hygieny a zabezpečení hygienických podmínek výroby, zpracování a distribuce potravin (Komprda, 2007).

2.8 Bakterie

Alimentárně přenosná bakteriální onemocnění je možno rozdělit na alimentární infekce a alimentární intoxikace. Alimentární infekce je důsledkem konzumace potraviny infikované bakterií - tato bakterie se v trávicím traktu množí - poškozuje strukturu buněk (tkání) hostitele např. produkcí toxinu. Intoxikace je způsobena konzumací potraviny s preferovaným (předem vytvořeným) toxinem: potravina je kontaminována bakterií - bakterie se množí v potravině - produkuje toxin - potravina s toxinem je zkonzumována (v tomto okamžiku již sama bakterie nemusí být v potravině vůbec přítomna). Potraviny

mohou

být

kontaminovány

mikroorganismy

primárně

nebo

sekundárně. Při primární kontaminaci jsou mikroorganismy přítomny v hospodářském zvířeti již před jeho porážkou, jinými slovy jsou v surovině (maso, mléko, vejce) již před započetím vlastní výroby dané potraviny; při nastolení vhodných podmínek se mikroorganismy mohou následně v potravině pomnožit. K sekundární kontaminaci potraviny dochází až v průběhu vlastního výrobního procesu (v domácnosti při kulinární úpravě), a to zejména z prostředí, půdy, z divoce 20

žijících živočichů, z rostlin, vody, z organických odpadů, z rukou pracovníků nebo ze strojů a zařízení (Komprda, 2007).

2.9 Významná onemocnění z potravin způsobená patogenními bakteriemi

2.9.1 Nejvýznamnější alimentární bakteriální infekce

2.9.1.1 Salmonelóza

Rod Salmonella je významným zástupcem čeledi Enterobacteriaceae, což jsou gramnegativní, fakultativně anaerobní nesporulující krátké tyčinky. Salmonely fermentují glukózu s produkcí kyseliny a plynu, nejsou však schopny metabolizovat laktózu. Pokud jde o rezistenci salmonel vůči podmínkám vnějšího prostředí, optimální teplota pro růst je 37 ºC s rozsahem 5 - 46 ºC, teplota 60 ºC po dobu 20 minut salmonely ničí. Druhy primárně patogenní pro člověka: S. typhi, S. paratyphi Druhy patogenní jak pro člověka, tak pro zvíře: S. typhimurium, S. enteritidis Nejzávažnější onemocnění člověka způsobují S. typhi a S. paratyphi, avšak kvantitativně největší význam mají dnes S. typhimurium a S. enteritidis. Posledně jmenované serotypy salmonel se vyskytují ve střevním traktu zvířat i lidí, v odpadních i povrchových vodách, v půdě a stájových produktech (hnůj). Přenos na člověka se děje převážně kontaminovanými potravinami. Na šíření salmonel se významně podílí také člověk, a to zjevně nemocný nebo asymptomatický bacilonosič (bez klinických příznaků), dále hlodavci, volně žijící ptáci a hmyz. Potraviny rostlinného původu mohou být kontaminovány znečištěnou zavlažovací vodou (Komprda, 2007).

2.9.1.2 Onemocnění způsobená patogenními kmeny bakterie Escherichia coli

Primárně se E. coli vyskytuje ve střevním traktu člověka a ostatních teplokrevných živočichů. Infekce se přenáší ze zvířat, kontaktem mezi lidmi nebo potravinami. Zdrojem šíření infekce je také fekální kontaminace přírodního prostředí (půda, voda) prostřednictvím hospodářských nebo divoce žijících zvířat, a domácí

21

zvířata (psi, kočky). V prostředí, kde se vyrábí nebo zpracovávají potraviny, je nebezpečná přítomnost bacilonosičů. V rámci identifikovaných epidemií způsobených E. coli byly nejčastějšími příčinami potraviny bovinního původu (vyrobené z masa, mléka, orgánů skotu), přímý kontakt mezi lidmi, ovoce a zelenina a voda (Komprda, 2007).

2.9.1.3 Alimentární infekce vyvolané klostridii

Původce, Clostridium perfringens, je anaerobní, grampozitivní sporogenní tyčinka. Vegetativní formy se běžně nacházejí ve střevě živočichů i člověka. Spory perzistují v půdě, sedimentech, a to především v oblastech znečišťovaných živočišnými nebo lidskými exkrementy. Nejčastějším zdrojem infekce pro člověka je lidský nebo zvířecí střevní trakt. Potraviny se mohou kontaminovat přímým kontaktem s exkrementy nebo prostřednictvím infikovaného prachu nebo znečištěné vody (Komprda, 2007).

2.9.1.4 Shigelóza

Původcem je Shigella dysenteriae. V potravinách se shigely prakticky nepomnožují. Shigely nejsou patogeny hospodářských zvířat, hlavním zdrojem onemocnění je nemocný člověk nebo bacilonosič. Potraviny tedy mohou být kontaminovány pouze sekundárně, a to z výše uvedeného zdroje (Komprda, 2007).

2.9.1.5 Alimentární infekce vyvolané pseudomonádami

Původcem onemocnění je gramnegativní aerobní bakterie druhu Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa se nachází v prachu, vodě, na pokožce lidí i zvířat. Odtud se může dostávat do potravin. Častými cestami přenosu P. aeruginosa jsou sekundární kontaminace potravin infikovanými nástroji, vodou nebo nečistotami (Komprda, 2007).

22

2.9.2 Významné alimentární bakteriální intoxikace

2.9.2.1 Stafylokoková enterotoxikóza

Bezprostřední příčinou onemocnění je konzumace potraviny obsahující stafylokokový enterotoxin vytvořený toxinogenními kmeny patogenní bakterií Staphylococcus aureus. Stafylokoky se vyskytují ubikvitárně: ve vzduchu, vodě, prachu, splašcích, na povrchu zařízení a pracovních ploch, na potravinách, na kůži živočichů i člověka a v jejich dutině ústní a nosní. Právě lidé a zvířata jsou primárními rezervoáry stafylokoka (Komprda, 2007).

2.9.2.2 Onemocnění způsobená druhem Bacillus cereus

Původce se řadí mezi grampozitivní sporogenní bakterie. B. cereus se vyskytuje ubikvitárně v prostředí, bývá izolován z půdy, vegetace, vody, srsti živočichů. V potravinách se vyskytuje běžně, ovšem v množství < 102 KTJ/gram, což je považováno za hodnotu přijatelnou z hlediska zdravotní nezávadnosti. Naopak v případě chybné manipulace s potravinou, především pokud se jedná o nedodržení správného teplotního režimu, může dojít k pomnožení patogena na hodnota > 105 KTJ/gram, což již stačí k intoxikaci (Komprda, 2007).

2.9.2.3 Botulizmus

Toto

smrtelné

onemocnění

vyvoláno

konzumací

potraviny

obsahující

neurotoxický protein botulotoxin. Botulotoxin je pro člověka jeden z nejúčinnějších známých jedů. Producentem uvedeného toxinu je Clostridium botulinum, grampozitivní sporogenní peritrichinózní tyčinka, striktní anaerob. Cl. botulinum je v přírodě ubikvitární (všudypřítomné). Spory Cl. botulina se vyskytují v půdě, bahně, ve vodě a na kořenové ( i jiné) zelenině. Vegetativní formy se nacházejí v trávicím traktu zvířat, odkud mohou být vylučovány do prostředí. Botulizmus je obecně asociován s konzervovanými potravinami o nízké kyselosti (především připravovanými v domácnosti). Konkrétně se nejčastěji jedná o zeleninu, ryby a masné výrobky (Komprda, 2007).

23

2.10 Opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům

Stále častěji je zmiňován pojem bezpečnost potravin a krmiv. Je to téma, které se dotýká všech obyvatel a má přímý dopad na zdravotní stav obyvatel a zvířat. Zmíněná bezpečnost v sobě zahrnuje nejen požadavky na zdravotní nezávadnost konečného produktu, ale vztahuje se na všechny fáze výroby, zpracování a distribuci potravin a krmiv (Sládek, 2007). Pro zajištění zdravotní nezávadnosti a biologické hodnoty potravin a zabránění ekonomickým ztrátám vlivem kažení potravin působením mikroorganismů je možno použít následující postupy: - mytí, čištění: redukce počtu mikroorganismů, - chladírenské skladování (teplota < 8 ºC): zábrana růstu většiny patogenních bakterií, zpomalení růstu mikroorganismů kazících potraviny, - zmrazování (teplota <-10 ºC): zábrana růstu všech mikroorganismů, - pasterizace: snižuje počty většiny nesporulujících bakterií, kvasinek a plísní, - blanšírování (teplota 95 - 110 ºC): snižuje počet vegetativních forem bakterií uchycených na povrchu potraviny, kvasinek a plísní, - sterilizace (teplota > 100 ºC): dosažení tzv. obchodní sterility potravin, usmrcení všech patogenních bakterií, - sušení: zábrana růstu všech mikroorganismů při dosažení aw < 0,60, - solení: zábrana růstu většiny mikroorganismů při dosažení koncentrace soli nad 10 %, - prosolování: inhibice růstu při aw < 0,70, - okyselení: inhibice růstu většiny bakterií (ne však kvasinek a plísní). (Komprda, 2007)

.2.11 Konzervace

Tradiční pohled na konzervaci potravin, který dělí konzervační metody na zákroky usmrcující (abiotické) a neusmrcující (anabiotické) se postupně rozšiřuje do další roviny, jak uvádí Voldřich (2006). Dochází k poklesu objemu produkce tradičních výrobků, rozšiřuje se podíl tzv. minimálně opracovaných produktů bez použití některé z absolutních konzervačních metod. I u těchto výrobků pokračuje tlak na zvyšování jejich údržnosti a stále více je uplatňován princip tzv. bariérové teorie. 24

Podle Ingra (2007) konzervace potravin znamená v obecném smyslu prodloužení jejich údržnosti nad obvyklou mez. Moderní konzervační postupy se přitom snaží co nejvíce respektovat zachování typických smyslových vlastností potravin i jejich nutričně významných složek. Často se volí kompromisy mezi zmíněnými požadavky, přičemž výraz konzervace

se většinou vztahuje na metody vedoucí k možnostem

dlouhodobé úchovy potravin. V řadě případů se spokojujeme se zákroky, které vedou jen k potřebnému krátkodobému prodloužení uchovatelnosti potravin. Současná civilizace je provázena koncentrovanou produkcí potravin a jejich rozsáhlou a složitou distribucí uvnitř regionů, celých států a v mezinárodním měřítku. Poněvadž se většina druhů potravin řadí svými vlastnostmi mezi potraviny neúdržné, tedy snadno podléhající zkáze, je aplikace metod pro jejich uchovávání (konzervaci) naprosto nezbytná. Jednotlivé potravinářské technologie, zabývající se neúdržnými potravinami, jsou vždy založeny na principu prodloužení jejich údržnosti různými metodami a vesměs je tento aspekt zcela prvořadý, pokládá se za samozřejmost a běžný spotřebitel jej ani nemusí vnímat. Více se zajímá o chuť, vůni a další senzorické vlastnosti potravin, stále častěji se zajímá o obsah výživově cenných složek a o energetickou hodnotu potravin, přitažlivě na něj působí lákavý vzhled potravin včetně obalů a nechává se ovlivnit atraktivní reklamou. Zcela předpokládá zdravotní nezávadnost prodávaných potravin, ale také poznává, že na ni nesmí zcela spoléhat. Spotřebitel je ovšem zklamán, jestliže se mu potravina zkazí ať již vinou výrobce (špatný výrobek), vinou prodejce (špatné skladování, prošlá skladovací lhůta aj.) nebo i vinou vlastní (nedodržení podmínek a doby skladování). Příčiny kažení neúdržných potravin jsou různé, nejčastější jsou vlivy a následky mikrobiálního působení a oxidačních změn potravin. Velmi záleží na druhu potraviny, na jejím látkovém složení a na jejích vlastnostech (Ingr 2007).

2.12 Aplikace vysokého isostatického tlaku v potravinářství

Technologií zpracování potravin velmi vysokým tlakem se rozumí použití izostatického tlaku řádově tisíců barů po dobu několika minut, čímž se dosáhne účinku podobného sterilaci, tj. účinné inaktivace nežádoucích mikroorganismů nebo i dalších efektů jako například ovlivnění funkčních vlastností bílkovin (např. koagulace), inaktivace enzymů, ovlivnění počátku a způsobu krystalizace lipidů apod., bez nutnosti 25

potravinu zahřívat nebo v kombinaci s velmi šetrným záhřevem. Tím vzniká možnost vyrábět údržné potraviny o vysoké kvalitě, blížící se svými senzorickými vlastnostmi potravinám čerstvým, neboť při tomto procesu nedochází zpravidla k odbourání vitamínů, barvy a vůně. Tato technologie ovlivňuje i počátek mrznutí vody v potravinách, takže lze za jistých podmínek provádět prakticky mžikové zmrazování a rozmrazování. To má opět vliv na kvalitu takto připravených produktů, neboť takto vzniklé velmi malé krystaly vody neporuší buněčnou membránu a nedochází tedy ke ztrátám šťávy známým při klasickém pomalém zmrazování (maso, ovoce, zelenina) (Houška, 1998).

2.13 Historie používání vysokých tlaků

Podle Brůny, Istenesové, Voldřicha a Čerovského (1998) jsou aplikace vysokého izostatického tlaku známy jako potenciální konzervační koncovka pro potraviny a složky potravin již více než století a nedávný komerční úspěch tohoto procesu v Japonsku stimuloval významnou výzkumnou aktivitu v této oblasti v mnoha dalších zemích. Počátky používání vysokých tlaků sahají více než 1 000 let do minulosti a souvisejí s objevením střelného prachu v Číně. Většího rozvoje bylo však dosaženo s objevením použití střelného prachu jako hnacího elementu pro vystřelování zpočátku kamenných koulí a s následným rozvojem dělostřelectví. Kdy k tomu přesně došlo není známo, nejstarší známé dochované zprávy hovořící o použití děla jsou z 1. poloviny 14. století. První vědecké práce týkající se vysokého tlaku se datují do 20. let 19. století, kdy Perkins zkoumal vliv tlaku na stlačitelnost vody. Ve 2. polovině 19. století udělali významný příspěvek, zvláště ve tvaru zařízení a měření vysokého tlaku, Cailletet a Amagat. Přelom století znamenal velký nárůst zájmu o výzkum vysokého tlaku a jeho průmyslové využití. Jednou z nejvýznamnějších osobností tohoto období byl laureát Nobelovy ceny P. W. Bridgman, jehož vědecká práce zahrnovala zkoumání vlastností materiálů pod vysokým tlakem, návrhy tvarů pro zařízení schopná pracovat s tlakem do 3 000 MPa, v některých případech i 10 000 MPa. Po 2. světové válce nastal velký nárůst v komerčním využití vysokotlakých procesů, jako např. výroba rozvětveného polyethylenu,

izostatické

lisování,

izostatické

stlačování

za

horka

vysokorychlostní proudové řezání (Brůna, Istenesová, Voldřich a Čerovský 1998). 26

nebo

Jay et al. (2005) uvádí, že používání vysokotlakých procesů v paskalizaci pro redukci nebo zničení mikroorganismů v potravinářství se datuje od roku 1884. Vliv isostatického vysokého tlaku (1 až 10 kbar tj. 100 až 1000 MPa) na mikroorganismy a enzymy je znám již od počátku století. Většina autorů cituje v historických úvodech Hiteho, který roku 1899 popsal použití tlaku 4 až 5 kbar, působícího 30 až 60 min při pasteraci mléka a Bridgemana, který v roce 1914 sledoval vliv vysokých tlaků na koagulaci albuminu. Širšího praktického uplatnění však vzhledem ke stupni vývoje potřebné technologie použití vysokých tlaků v potravinářství nedosáhlo. Teprve v polovině 80. let se začal probouzet zájem o případné potravinářské, farmaceutické, biotechnologické a další „bio“ aplikace vysokých tlaků. Díky jiným odvětvím jako jsou výroba umělých diamantů, organická syntéza za vysokých tlaků apod. se stupeň teoretických znalostí a zejména technické možnosti v oblasti vysokých tlaků rozvinuly natolik, že v současnosti již umožňují rozšíření technologie i v dalších oborech včetně potravinářství. Do základního i aplikovaného výzkumu, jak uvádí Jay et al. (2005), investovali v posledních pěti letech zatím nejvíce v Japonsku, kde systematický výzkum potravinářských, farmaceutických a biotechnologických společností podporovaný jap. Ministerstvem zemědělství přinesl první potravinářské výrobky ošetřené vysokým tlakem na spotřebitelský trh - džem, ovocné jogurty, ovocné želé, salátové zálivky (dressings) a ovocné šťávy (fy Meidi-Ya). Další výrobce Pokka and Wakayama instaloval polokontinuální zařízení pro vysokotlakou pasteraci citrusové šťávy o kapacitě 6 až 4 000 litrů za hodinu. Japonský zájem vyvolal rozběhnutí výzkumných programů v Evropě a USA, aplikace vysokých tlaků je studována zejména ve Francii, Německu, Anglii a dalších zemích. Projekt základního výzkumu v rámci výzkumných programů EC koordinovaný prof. Knorrem z TU Berlín je řešen od roku 2005. Zároveň řada evropských výrobců potravin začíná s vlastními výzkumnými programy (Voldřich, 2006).

2.14 Vliv vysokých tlaků na základní složky potravin

2.14.1 Voda

Voda jako nízkostlačitelná kapalina, nepodléhá významným změnám, redukce objemu činí kolem 4 % při tlaku 1 kbar a kolem 15 % při 6 kbar (při 22 ºC). Potraviny 27

s nízkým obsahem plynů a sušiny se chovají stejně jako voda, úměrně redukci objemu vzrůstá hustota a klesá hodnota difúzních koeficientů. Adiabatická komprese způsobí také mírný nárůst teploty, který v případě vody o teplotě 30 ºC činí 8 až 18 ºC při tlacích 3 až 6 kbar. Tlak ovlivňuje krystalizaci vody, působí proti vzrůstu objemu při změně skupenství. Z fázového diagramu vody je zřejmé, že působením tlaku do 2,1 bar je možné udržet kapalné skupenství ještě při - 22 ºC. Tato skutečnost má dva základní praktické důsledky: 1) Zmražené potraviny mohou být v tlakových zařízeních rozmrazovány při teplotách 0 až - 22 ºC, z praktických výsledků je zřejmé, že rozmrazení není okamžité, ale vhodným zvyšováním působícího tlaku je možné dosáhnout prakticky současné změny skupenství v celém objemu potraviny. Rychlost rozmrazování tlakem je zvýšena přítomností solí a cukru. Po rozmrazení je nutné dodat teplo, aby po přerušení tlaku nedošlo k opětné tvorbě ledu. 2) Za působení tlaku mohou být potraviny skladovány při teplotách 0 až - 22 ºC bez tvorby ledu, např. velmi citlivé potraviny nebo biotechnologické produkty by mohly být skladovány při - 5 ºC a 610 bar bez rizika porušení struktury. Přerušení tlaku po vychlazení potraviny také umožní prakticky okamžité zmrazení s malými krystaly ledu (Voldřich, 2006).

2.14.2 Tuky

Tuk v tuhém skupenství zaujímá menší objem než ve skupenství kapalném, proto bod tání tuků se vzrůstajícím tlakem roste. Krystalizace tuku za vyšších tlaků v souladu s Le Chatelierovým principem vede k tvorbě krystalů s nižší energií a vyššími body tání. Brůna, Istenesová, Voldřich a Čerovský (1998) uvádějí, že vysoký tlak podporuje tvorbu nejstabilnějších krystalů (s nejnižší hodnotou energie a nejvyšším bodem tání). Za zmínku také stojí, že krystalové změny ve fosfolipidové dvojvrstvě buněčné membrány přispívají k inaktivaci různých druhů mikroorganismů vysokým tlakem (Voldřich, 2006).

28

2.14.3 Proteiny

Formálně mohou být u proteinů uvažovány čtyři úrovně organizace. První úroveň (tzv. primární struktura) je sekvence aminokyselin v polypeptidovém řetězci. V literatuře dosud nebyl popsán vliv tlaku na kovalentní vazby. Druhou úroveň (sekundární struktura) tvoří peptidové řetězce propojené mezi sebou i uvnitř sebe vodíkovými vazbami. Obecně lze očekávat stabilizaci těchto struktur tlakem. Třetí úroveň (terciální struktura) je tvořena specifickým zabalením sekundárních struktur do více nebo méně globulárního tvaru. Tato úroveň je stabilizována nekovalentními interakcemi. Lze očekávat, že tlak bude tyto struktury ovlivňovat. Různé kompaktní celky mohou tvořit kvartérní struktury, které jsou stabilizovány opět nekovalentními interakcemi, což předpovídá jejich citlivost vůči působení tlaku. Při obecném pohledu na vliv tlaku na proteinové makromolekuly lze říci, že působením vysokých tlaků dochází ke vzniku vodíkových můstků, k potlačení hydrofobních interakcí a iontových vazeb. Tlak také podporuje disociaci karboxylových skupin v postranních řetězcích (Voldřich, 2006).

2.14.3.1 Denaturace proteinů

Již na začátku tohoto století pozoroval Bridgeman, že vaječný bílek je působením vysokého tlaku koagulován obdobně jako zvýšenou teplotou. Současně zjistil, že při nižší teplotě je potřeba k dosažení stejného efektu nižší tlak. Pozdější výzkumy ukázaly, že tyto jevy mohou být vysvětleny z fázových diagramů pro denaturaci proteinů. Při vysoké teplotě stabilizuje tlak proteiny proti teplotní denaturaci (Voldřich, 2006).

2.14.3.2 Tvorba gelů

Tlak pomáhá vytvářet struktury podobné gelům tvořeným teplotně indukovanou denaturací. Proces tvorby gelu je makroskopickým důsledkem denaturace (na molekulární úrovni) proteinů nebo dalších biomakromolekul, jako např. polysacharidů. Obecně mohou být uvažovány dva typy proteinových gelů. První typ gelů je tvořen z původně globulárních proteinů, např. z β-laktoglobulinu. Struktura vznikajícího gelu má mnoho společného s koagulací koloidů a emulzí. Existují dvě cesty tvorby gelu: 29

denaturace je následována agregací (nativní struktura → denaturace → agregace) nebo denaturace následuje agregaci (nativní struktura → agregace → denaturace). Pro zmíněný β-laktoglobulin je druhý mechanismus převládající při neutrálním pH pro teplotně indukovanou tvorbu gelu. Druhý typ gelu lze znázornit na příkladu želatiny. Mechanismus tvorby gelu je zde podobný těm, ke kterým dochází u syntetických polymerů. Gel vzniká z nestrukturních proteinů. Ve všech případech hrají β-struktury důležitou roli u teplotně indukované tvorby gelu. U teplotně a tlakově indukovaných gelů mohou být očekávány různé mechanické vlastnosti. Některé japonské práce ukázaly, že vysokotlaké gely potravinářských proteinů (vaječný bílek, sojové proteiny, atd.) jsou méně pevné, ale více elastické a roztažitelné. Barva a původní aroma jsou lépe zachovány než u vysokoteplotních gelů (Voldřich, 2006).

2.15 Vliv vysokých tlaků na reakce probíhající v potravinách

2.15.1 Enzymy a enzymové reakce

Obecně můžeme schéma enzymové reakce vyjádřit následovně: enzym + substrát → (enzym-substrátový komplex) → enzym + produkt. Tlak působí především na enzym-substrátový komplex, jehož aktivační objem určuje, zda bude daná enzymová reakce tlakem aktivována nebo inhibována. Ovlivněn může být i samotný substrát. Pokud je jím makromolekula, mlže tlak působit na její konformaci, což může vést ke snazší nebo naopak obtížnější reakci s enzymem. Pro působení vysokých tlaků na enzymy platí to, co bylo uvedeno v souvislosti s proteiny. Působení tlaku za normální teploty může vést ke změnám v konformaci, které mohou vyústit, v závislosti na podmínkách a typu enzymu, v jeho částečnou nebo úplnou inaktivaci (Voldřich, 2006). Z potravinářsky významných enzymů lze jmenovat např. aminopeptidasy a karboxypeptidasy masa, které jsou tlakem 400 - 500 MPa během 10 min úplně inaktivovány, zatímco kyselé proteasy zůstávají za stejných podmínek částečně aktivní. Glukosaoxidasa a askorbátoxidasa byly tlakem 500 MPa téměř inaktivovány, zatímco superoxiddismutasa nebyla kompletně inaktivována ani při 700 MPa po dobu 20 min. Dalším poměrně tlakově rezistentním enzymem je pektinesterasa. Je významná 30

především u ovocných šťáv, kde může mít vliv na tvorbu zákalu, proto někdy bývá její aktivita uvažována jako kriterium účinnosti vysokotlaké pasterace těchto materiálů, kdy kvasinky a plísně vzhledem k vyšší citlivosti vůči tlaku nepředstavují hlavní problém. Obecně jsou enzymové reakce pokládány za jeden z limitujících faktorů ovlivňujících uplatnění vysokých tlaků při zpracování potravin. Působení tlaku na buněčné struktury má totiž za následek porušení membrán a kontakt intracelulárních enzymů s extracelulárními substráty. To může být výhodné, např. pro uvolnění katepsinů ze svalových lysozomů při zpracování masa, ale také nevýhodné např. pro změny senzorických vlastností v důsledku enzymového hnědnutí a dalších reakcí doprovázejících porušení buněčných struktur při zpracování ovoce a zeleniny (Voldřich, 2006).

2.16 Vliv na senzorické a nutriční vlastnosti potravin

Hlavním cílem ošetřování potravin vysokým tlakem je podle Voldřicha (2006) jejich zpracování bez vystavení účinkům vyšších teplot a tím udržení senzorických a nutričních vlastností prakticky beze změn oproti výchozí surovině. Přes uvedenou šetrnost většiny zákroků může vysokotlaké zpracování potravin vést ke změnám jejich senzorických a nutričních vlastností. Ošetření masa sardinek tlakem 100 - 400 MPa při 4 - 20 ºC po dobu 30 min bylo účinné při inaktivaci lipas, a tak zabránilo akumulaci volných mastných kyselin. Oxidace lipidů však byla urychlena, pravděpodobně změnami v katalytických vlastnostech proteinů, protože aplikace tlaku na extrakt sardinkových lipidů nezvýšila jejich oxidaci. Tlakem může být ovlivněna i barva potravin. Barviva jako karotenoidy, chlorofyl a anthokyany jsou vůči tlaku poměrně rezistentní. Myoglobin je citlivější, proto maso může při stlačení nad 300 MPa ztratit svou jasně červenou barvu. Maillardovy reakce jsou tlakem potlačovány, přičemž proces hnědnutí spolu s tvorbou melanoidinu

je

tlakem

potlačován

více

než

počáteční

kondenzační

reakce

aminosloučenin s karbonylovými sloučeninami. Reakce enzymového hnědnutí jsou tlakem naopak urychlovány. Konzistence a textura je tlakem významně ovlivňována. U produktů obsahujících plyny uvnitř pletiv, jako např. celé ovoce nebo zelenina, může stlačení vyvolat nevratné poškození struktury a uvolnění dalších procesů, zejména enzymových 31

reakcí. Negativní důsledky je možné omezit ošetřováním děleného ovoce, příp. ve vodném nálevu. Aplikace tlaku na produkty jako jsou gely a emulze s mléčným základem mohou vést k novým a žádoucím texturám, nemluvě o snížení počtu bakterií a lepší skladovatelnosti těchto výrobků. V současnosti probíhají pokusy s kombinovanou tlakově - teplotní pasterací hotových pokrmů, kdy mohou být očekávány u některých složek jídla i nežádoucí texturní změny (Voldřich, 2006).

2.17 Vliv vysokých tlaků na mikroorganismy

Jak již bylo zmíněno je ošetření potravin vysokým tlakem šetrnější než tradičně používané způsoby konzervace, potravina si uchovává svou nutriční hodnotu, nedochází u ní k poškození teplem nebo mrazem. Současně existuje i snaha najít takové podmínky, za kterých se sníží odolnost mikroorganismů vůči tlaku a které umožní využití nižších tlaků, levnějších zařízení a tím i výraznější rozšíření této metody v potravinářském průmyslu. Účinek vysokého tlaku na mikroorganismy závisí především na velikosti a době expozice, druhu mikroorganismu, teplotě procesu a prostředí, v němž se daný mikroorganismus vyskytuje. Tyto faktory se musí uvážit předem, aby celý proces mohl být optimalizován a výsledkem byly kvalitní, zdravotně nezávadné potraviny. Citlivost mikroorganismů k účinkům vysokého tlaku je různá. Zatímco pro inaktivaci většiny gramnegativních bakterií postačí tlaky okolo 300 MPa, pro kvasinky a plísně tlaky okolo 400 MPa a pro grampozitivní baktérie tlaky okolo 600 MPa, bakteriální spory snesou působení velmi vysokých tlaků, dokonce vyšších než 1000 MPa. Také viry jsou velmi odolné vůči účinkům vysokého tlaku. Smrtící účinek vysokého tlaku na mikroorganismy je založen zejména na inaktiaci klíčových enzymů, poškození DNA, RNA, ribosomů a na destrukci membrán a buněčné stěny. Destrukce je způsobena především náhlými změnami objemu buňky a také denaturací proteinů membrán a buněčné stěny. Účinek na spory bakterií je nejvyšší v okamžiku, kdy po stlačení dojde k rychlému snížení tlaku, což má za následek expanzi vody v buňce. Tohoto jevu se využívá především při inaktivaci spor rychlým střídáním vysokých a nízkých tlaků, což je efektivnější, než prodloužení expozice nebo zvýšení teploty (Voldřich 2006).

32

Tlaková tolerance spor různých rodů je podle Voldřicha (2006) různá K nejodolnějším patří např. spory Clostridium botulinum. Odolnost spor vůči chemickým a fyzikálním činitelům je způsobena především nízkým obsahem vody a výhodným umístěním protoplastu. Bylo zjištěno, že relativně nízké tlaky, nižší než 150 MPa, mohou indukovat klíčení spor, které jsou potom k tlaku stejně citlivé jako vegetativní buňky. Tlak ovšem nemusí indukovat klíčení u všech spor a některé rezistentnější typy ve stlačeném materiálu přežívají. Je proto nutné, zejména u nekyselých potravin, použít některých doplňkových metod jako např. teplo, ultrazvuk, ionizující záření, elektrické pole, atd. Při použití dostatečně vysokých tlaků lze sice spory inaktivovat přímo, ale s přihlédnutím k ostatním složkám potraviny, se zdá výhodnější užít nižší tlaky spolu s doplňkovou metodou. Citlivost k tlaku se mění s rodem, pravděpodobně i s kmenem stejného druhu a také záleží na fázi růstového cyklu, v níž se vegetativní buňky nacházejí. Buňky v exponenciální fázi růstu jsou citlivější než buňky v lag fázi nebo ve stacionární fázi růstu. Rychle rostoucí buňky mají rychlejší metabolismus, na rozdíl od buněk ve stacionární fázi růstu, kdy se metabolity hromadí a snižují vliv tlaku na buňku. Stejně jako ostatní fyzikální konzervační metody, ani tlak neinaktivuje úplně všechny (ze 100 %) mikrobiální vegetativní buňky. Dokáže ale poškodit poměrně vysokou část populace. Další osud tlakem poškozených buněk závisí na podmínkách prostředí. Nedostatek potřebných živin nebo přítomnost některých činidel (např. NaCl) zabraňuje jejich regeneraci a dalšímu růstu. Významným faktorem ovlivňujícím účinek vysokého tlaku je i teplota. Se zvyšováním teploty od záporných hodnot odolnost mikroorganismů nejprve vzrůstá, dosahuje maxima a s dalším zvyšováním teploty klesá. Tento jev se vysvětluje změnami ve složení membrány buňky při teplotě okolo 30 ºC. Chemické složení prostředí může významně ovlivnit citlivost mikroorganismu vůči tlaku. Velký vliv má zejména koncentrace soli, obsah vody a pH. Některé složky potraviny jako např. bílkoviny, cukry nebo tuky mohou chránit mikroorganismy vůči účinkům vysokého tlaku. Uvádí se, že glukosa v koncentracích vyšších než 55 % poskytuje účinnou ochranu kvasinkám a plísním. Tento jev byl pozorován i u médií obohacených esenciálními aminokyselinami a vitamíny. U médií obsahujících nevýživný roztok solí bylo naopak zaznamenáno snižování tlakové tolerance mikroorganismů (Voldřich, 2006).

33

Vysoký tlak lze kombinovat s dalšími konzervačními technikami, což vede ke zvýšení konzervačního účinku a zároveň ke zmírnění tvrdosti, která by byla třeba při použití jednotlivých konzervačních technik samostatně. Značně široké využití může mít kombinace vysokého tlaku s mírným záhřevem. Výhodné je i střídání (cyklování) vysokých a nízkých tlaků. Silný synergický efekt byl popsán v případě kombinace tlaku a oxidu uhličitého, který umožňoval významné snížení pracovních tlaků (pod 50 MPa). Oxid uhličitý se rozpustí ve vodné fázi na kyselinu uhličitou a při uvolnění tlaku je vypuzen. Vysoký tlak lze použít k inaktivaci mikroorganismů, včetně vegetativních patogenů. Tato technologie může být použita pro zvýšení zdravotní nezávadnosti a kvality potravin, včetně modifikace jejich fyzikálních vlastností. Kombinace vysokého tlaku s dalšími aplikacemi může být zvláště výhodná při produkci vysoce kvalitních produktů. Nicméně je třeba brát v úvahu, že řada složek potraviny slouží jako ochrana mikroorganismů před účinky vysokého tlaku. Konečný úspěch technologie bude záviset na ekonomice procesu a na míře zlepšení kvality potravin (Voldřich, 2006).

34

3 Cíl práce Cílem diplomové práce na téma Mikroflóra zeleninových a ovocných šťáv ošetřených vysokým tlakem bylo:


Popsat výrobek firmy Beskyd Fryčovice, a.s. - zeleninové šťávy,
Stanovit významné skupiny mikroorganismů zeleninových šťáv,
Stanovit mikrobiologickou kvalitu výrobku,
Zhodnotit účinnost ošetření šťáv vysokým tlakem.

35

4 Materiál a metodika 4.1 Charakteristika podniku

Beskyd Fryčovice, a. s. je společnost působící přes 30 let na obchodním a potravinářském trhu produkující sortiment balených brambor a výrobky ze zpracovaných brambor, jednodruhové a vícedruhové chlazené zeleninové směsi, ovocné saláty a bylinky. Výrobky distribuuje jak do maloobchodních tak velkoobchodních řetězců, do zařízení veřejného, podnikového, školního a zdravotnického stravování. Beskyd Fryčovice, a. s. je prvním zpracovatelem zeleninovo-ovocných šťáv, který využívá pro ošetření svých výrobků vysokého tlaku na průmyslové úrovni. Hlavním cílem zavádění technologie vysokých tlaků do potravinářství je zpracování potravin bez jejich vystavení účinkům vyšších teplot a snaha udržet senzorické a nutriční vlastnosti co nejvíce srovnatelné s výchozí surovinou. Použitím této technologie je v potravinách uchována většina přírodních látek včetně vitaminů a antimutagenů, produkt má vzhled, barvu a chuť čerstvého výrobku z ovoce či zeleniny. Přítomné živé plísně a kvasinky jsou spolehlivě inaktivovány tlakem 500 MPa. Jedná se o velmi moderní technologii, která je také nazývána „technologií 3. tisíciletí“. Pro tuto technologii je charakteristické, že se výrobky tlakují přímo v obalu (ty musí být elastické, aby došlo k přenesení tlaku na obsah v obalu; musí mít vhodné složení, aby nedošlo k reakci s upravovanou surovinou), technologie je čistá a šetrná k životnímu prostředí, přenos tlaku zajišťují nízko-stlačitelné kapaliny (-voda). Zařízení k vysokotlaké pasteraci bylo vyvinuto a vyrobeno firmou Žďárské strojírny, a.s. Jde tedy o české produkty vyrobené na českém zařízení. Naše země se tak zařadila ke skupině technologicky vyspělých států (Japonsko, USA, Francie, Německo, Španělsko, Velká Británie, Itálie), kde se tento způsob pasterace začal komerčně využívat.

36

4.2 Zeleninové a ovocné šťávy

Čerstvé ovoce a zelenina jsou nezbytnou součástí jídelníčku. Poskytují lidskému tělu mnoho vitamínů a minerálů, které pomáhají ke správné funkci celého organismu. Výbornou alternativou pro zvýšení spotřeby čerstvého ovoce a zeleniny je konzumace šťáv vyrobených z kvalitního ovoce a zeleniny. Hlavní výhodou šťáv je jejich snadná stravitelnost pro lidský organismus. Z čerstvé šťávy dokáže naše tělo vstřebat více vitaminů a ostatních užitečných látek než je tomu při konzumaci tuhé stravy. Zeleninové a ovocné šťávy mohou být vhodným doplňkem výživy u oslabených lidí, u dětí, u pacientů, při rekonvalescenci po operačních zákrocích, u sportovců anebo při detoxikaci. Mohou být také součástí jídelníčku zdravých lidí, ale neměly by být náhradou za zeleninu a ovoce. Zeleninovo-ovocné šťávy jsou plněné do plastových obalů v množství 0,33 l a následně po uzavření jsou přímo v obalu ošetřeny tlakem 500 MPa pro zajištění mikrobiální čistoty. Plastové obaly zabezpečují mikrobiální čistotu po celou dobu trvanlivosti výrobku. Chrání také produkt před paprsky světla a dávají možnost konzumace šťávy přímo z obalu. Výrobce garantuje trvanlivost výrobku 10 dnů od data výroby, za předpokladu, že je výrobek skladován při teplotě 2 – 5 ºC. V sortimentu výrobce se nachází mrkvová šťáva a šťáva z červené řepy, připravované bez jakýchkoli přísad. Šťávy se distribuují v chlazeném stavu, aby nedocházelo k destrukci přírodních látek.

4.2.1 Mrkvová šťáva

Syrová karotka obsahuje všechny vitamíny a prvky, které lidské tělo potřebuje. Karotková šťáva vyniká mezi ostatními zeleninovými šťávami za předpokladu, že je čerstvá a byla správně připravená. Je vynikajícím čistícím prostředkem pro žlučník a játra. Karotka v syrovém stavu obsahuje ten nejlepší vitamin A, který tělo může přijmout. Jestliže se tento vitamin vystaví horku nebo jinému zpracování, koncentruje se nebo izoluje, zmenší se jeho hodnota, pokud se úplně neztratí. Čerstvá karotka obsahuje víc než 87 % vody. Asi 37 % všech minerálií tvoří draslík. Mimoto obsahuje velké

37

množství sodíku, vápníku, ale i železa, síry a chlóru. Obsah fosforu, potravy pro náš mozek, tvoří 13 %. Výrobek obsahuje 100 % mrkvové šťávy bez jakýchkoli přísad.

4.2.2 Šťáva z červené řepy

Červená řepa patří mezi nejléčivější potraviny, prospívá celému krevnímu systému a celkově posiluje organismus. Například normalizuje sedimentaci, čistí krev a především zvyšuje počet červených krvinek. Obsahuje úžasné množství blahodárných látek: vitaminy C, betakaroten, kyselinu listovou, dále draslík, hořčík, křemík, chróm, selen a železo. Výrobek obsahuje 100 % šťávy z červené řepy bez jakýchkoli přísad.

4.2.3 Šťáva z brokolice a jablka

Brokolice se stala během několika let běžnou součástí mnohých jídelníčků. Její přínos pro naše zdraví je velký. Brokolice obsahuje velké množství minerálních látek i vitamínů. Je po červené paprice druhou zeleninou s nejvyšším obsahem vitamínu C, ve srovnání s citrusy má jeho množství více než trojnásobné. Dále podporuje látkovou výměnu, zlepšuje práci srdce, svalů a nervů. Je bohatým zdrojem železa, betakarotenu a vitamínu E, dále draslíku, vápníku a fosforu. Brokolice obsahuje 90 % vody a velice málo sacharidů a tuků. Šťáva z brokolice vykazuje antimutagenní a antigenotoxické účinky (zabraňuje chemicky indukované mutagenezi). Při její přípravě vzniká účinná látka, sulforafan, která se vysokotlakou pasterací neodbourává. Dále bylo zjištěno, že alergeny obsažené v jablku jsou po ošetření vysokým tlakem odbourány. Výrobek obsahuje:

70 % jablečné šťávy 30 % šťávy z brokolice

4.2.4 Zelná šťáva

V roce 2007 firma Beskyd Fryčovice, a. s. rošířila svůj sortiment zeleninovoovocných šťáv o nový produkt. Jedná se o šťávu vyrobenou ze zelí a jablka. Tato šťáva obsahuje:

64 % jablečné šťávy 32 % zelné šťávy 4 % citrónové šťávy 38

Čerstvá zelná šťáva příznivě ovlivňuje činnost žaludku a jater. Syrové zelí obsahuje vitamíny skupiny A, B, C a minerály jako vápník, hořčík, draslík a další. Podílí se také optimalizací krevních cukrů a snižuje hladinu cholesterolu. Šťáva ze zelí je účinná i při vředech a ke zmírnění zácpy.

4.3 Metodika

4.3.1 Příprava laboratorního skla a pomůcek

Mytí laboratorního skla bylo provedeno ve vodě s přídavkem mycího prostředku, opláchnuto vodovodní a destilovanou vodou. Po osušení v sušárně při teplotě okolo 100 °C bylo veškeré laboratorní sklo sterilizováno po dobu 1h při 160 °C v horkovzdušném sterilizátoru. Petriho misky byly při sterilizaci uzavřené. Pipety se sterilizovaly v kovových pouzdrech nebo zabalené do hliníkové folie.

4.3.2 Živné půdy

Při stanovení počtu významných skupin mikroorganismů bylo použito následujících živných půd: agar PCA (Plate Count Agar) pro stanovení CPM a sporulujících mikroorganismů (po pasteraci 10 min při 80 °C) a GCA (Glukose Chloramphenicol Agar) pro stanovení počtu kvasinek a plísní. PCA (Plate Count Agar – Biokar Diagnostics, Francie) Pro stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM) a sporulujících mikroorganismů (spor. MO) Složení půdy: trypton........................................................................................................….....

5,00 g

kvasničný extrakt sušený.........................................................................…........

2,50 g

glukóza.............................................................................................…...............

1,00 g

agar.......................................................................................................…….......

12,0 g

destilovaná voda (doplnit do).............................................................................. 1000 ml pH (po rozpuštění)..............................................................................................

39

7,0 - 0,2

GCA (Glukose Chloramphenicol Agar - Biokar Diagnostics, Francie) Stanovení počtu kvasinek a plísní. Složení: kvasničný extrakt................................................................................................ 5,00 g glukóza............................................................................................................... 20,00 g chloramfenikol.................................................................................................... 0,10 g agar................................................................................................................…. 15,00 g destilovaná voda (doplnit do)........................................................................…1000 ml pH (po rozpuštění)............................................................................................6,6 + 0,2

4.3.3 Vlastní mikrobiologické analýzy

V analyzovaných vzorcích šťáv byly stanoveny tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM) počty sporulujících mikroorganismů (spor. MO) a počty plísní a kvasinek (pl a kv). Ke stanovení byla použita plotnová metoda kultivace na pevných živných půdách. Na dno sterilních Petriho misek byl napipetován 1 ml příslušného desetinného ředění vzorku. Inokulum bylo zalito rozehřátou a zchlazenou živnou půdou a po promíchání a zatuhnutí byly Petriho misky inkubovány dnem vzhůru po danou dobu při příslušných teplotách. Teploty a doby inkubace: Celkové počty mikroorganismů na PCA při 30 ºC 72 hod Kvasinky a plísně na GCA při 25 ºC 125 hod Sporulující mikroorganismy na PCA (po pasteraci 10 min při 80 °C) při 30 ºC 72 hod Mikrobiologické analýzy zeleninovo-ovocných šťáv byly provedeny v den ošetření vysokým tlakem, 7. den po ošetření a po 1 měsíci od ošetření. Šťávy byly uchovávány po celou dobu při chladírenských teplotách (2 ºC), které zajišťují splnění podmínek doporučených výrobcem pro skladování.

40

5 Výsledky a diskuse

U vybraných zelenino-ovocných šťáv byly v průběhu skladování (v den ošetření tj. 0. den, 7. a 30. den od otevření) stanovovány tyto celkové počty mikroorganismů, sporulujících mikroorganismů a počty plísní a kvasinek. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v tab. 1., 2. a 3.

Tab. 1 Srovnání celkového počtu mikroorganismů (CPM) 0.den, 7. den a 30. den po otevření CPM

0. den

7. den

30. den

Mrkvová šťáva

35

2,13.10

Šťáva z červené řepy

388

1,69.10

Šťáva z brokolice a jablka

18

3,01.10

4

4,5.10

5

4

2,45.10

2

4,3.10

5

4

Z tabulky č. 1 a grafu č. 1 je zřejmé, že zeleninové šťávy ošetřené vysokým tlakem nejsou úplně prosté mikroorganismů. Obsahují jich ale velmi malé množství, které neznehodnocuje výrobek. Po sedmi dnech můžeme pozorovat vzestup celkového počtu mikroorganismů. Po 30 dnech skladování dosahují počty této skupiny mikroorganismů řádově hodnot 104 resp. 105 KTJ v 1 ml. Největší kontaminaci jsme zaznamenali

u

mrkvové

šťávy.

Takto

vysoké

počty

mikroorganismů

jsou

pravděpodobně důsledkem nedokonalého očištění vstupní suroviny (mrkve). Naopak nejnižší počty byly zjištěny u šťávy z brokolice a jablka. Vysokotlaké zpracování eliminuje nutnost tepelné pasterace šťáv. Tyto šťávy mohou konkurovat čerstvě vylisované šťávě pokud jde o výživovou hodnotu, texturu, barvu i zákal.

41

Graf 1 Srovnání celkového počtu mikroorganismů (CPM) 1.den, 7. den a 30. den

KTJ/ml

po otevření 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 0. den Mrkvová šťáva

7. den

30. den

Šťáva z červené řepy

Šťáva z brokolice a jablka

Tab. 2 Srovnání počtů sporulujících mikroorganismů (Spor.MO) 0.den, 7. den a 30. den po otevření Spor.MO

0. den

7. den

30. den

75,5

60

1,31.10

Šťáva z červené řepy

63

1,1.10

Šťáva z brokolice a jablka

2,5

4,58.10

Mrkvová šťáva

2

2

2

2

4,1.10

3

2,21.10

Z výsledků uvedených v tab. č. 2 je patrné, že výrobek obsahuje malé množství sporulujících mikroorganismů v 0. dni v rozmezí od 2,5 do 75 KTJ v 1 ml vzorku. Během skladování (po 7 a po 30 dnech) můžeme pozorovat logicky vzestup počtů těchto mikroorganismů.

42

Dlouhodobě (30 dnů) skladované šťávy ve správných podmínkách (chlad, tma), které určuje výrobce, nepředstavují riziko z nadměrné mikrobiální kontaminace. Počty mikroorganismů mírně stoupají, ale při nedodržení chladícího řetězce může dojít k vyklíčení spor a pomnožení buněk sporulujících mikroorganismů. Největší výskyt sporulujících mikroorganismů byl zjištěn u šťávy z brokolice a jablka. U této šťávy jsme zaznamenali nárůst počtů těchto mikroorganismů o tři řády. Naproti tomu u mrkvové šťávy, u které byl počáteční počet nejvyšší můžeme pozorovat nejmenší nárůst.

Graf 2 Srovnání počtů sporulujících mikroorganismů (Spor.MO) 0.den, 7. den a 30. den po otevření 2500

KTJ/ml

2000 1500 1000 500 0 0. den Mrkvová šťáva

7. den Šťáva z červené řepy

43

30. den Šťáva z brokolice a jablka

Plísně a kvasinky jsou mikroskopické houby patřící mezi heterotrofní organismy, z nichž některé jsou ubiqitárně rozšířené. Přítomnost mikroskopických hub v potravinách je ukazatelem hygienické a zdravotní nezávadnosti potravin.

Tab. 3 Srovnání počtů plísní a kvasinek (Pl/kv) 0.den, 7. den a 30. den po otevření Pl/kv

0. den

7. den

30. den

Mrkvová šťáva

0

0

35

Šťáva z červené řepy

7

4,42.10

2,1.10

Šťáva z brokolice a jablka

0

12

6,01.10

3

4

3

Největší nárůst počtů plísní a kvasinek je zaznamenán u šťávy z červené řepy, u které bylo naměřeno v 0. dni 700 KTJ v 1ml a po 30 dnech 2,1 . 104 KTJ v 1 ml vzorku. U ostatních šťáv (mrkvové a šťávy z brokolice a jablka) nebyla přítomnost plísní a kvasinek v 0. dni pozorována. Přesto si u šťávy z brokolice a jablka můžeme všimnout poměrně velkého nárůstu těchto mikroorganismů ( po 30 dnech 6,01 . 103 KTJ v 1 ml), je to nejspíš dáno tím, že plísně a kvasinky vegetují spíše na ovoci, než na zelenině, proto přídavek jablečné šťávy pravděpodobně ovlivnil mikrobiologickou kontaminaci této šťávy.

44

Graf 3 Srovnání počtů plísní a kvasinek (Pl/kv) 0.den, 7. den a 30. den po otevření 25000

KTJ/ml

20000 15000 10000 5000 0 0. den Mrkvová šťáva

7. den

30. den

Šťáva z červené řepy

Šťáva z brokolice a jablka

Tab. 4 Nárůst celkového počtu mikroorganismů. sporulujících mikroorganismů, plísní a kvasinek v závislosti na čase u šťávy z brokolice a jablka 0. den

7. den

30. den

CPM

18

3,01.10

Spor. MO

2,5

Pl/kv

0

2

4,3.10

4

4,58.10

2

2,21.10

12

6,01.10

3

3

U vzorků šťávy z brokolice a jablka (tab. 4) můžeme vidět nárůst počtů jednotlivých skupin mikroorganismů během 30 dní. Zatímco výskyt plísní a kvasinek byl v 0. dni zcela negativní, objevily se ve vzorku celkové počty mikroorganismů v množství 18 KTJ v 1 ml šťávy. Byla zaznamenána také přítomnost sporulujících mikroorganismů v množství 2,5 KTJ v 1 ml šťávy. Z grafu č. 4 je pak patrný nárůst počtů mikroorganismů během 30 dnů skladování a to především celkových počtu jejichž hodnota překračuje 104/ml.

45

Graf 4 Nárůst celkového počtu mikroorganismů. sporulujících mikroorganismů, plísní

KTJ/ml

a kvasinek v závislosti na čase u šťávy z brokolice a jablka 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0. den

7. den CPM

Spor. MO

30. den Pl/kv

Mrkvová šťáva je i 5 dní po ošetření vysokým tlakem prakticky sterilní, jak uvádí Kvasničková (2005). Z tabulky č. 1 je zřejmé, že celkový počet mikroorganismů byl v den ošetření vysokým tlakem 35 KTJ v 1 ml vzorku a po 7 dnech dokonce 2,13 . 104. Podle Kvasničkové (2005) je počet plísní a kvasinek po paskalizaci nulový. Byl zaznamenám pouze mírný nárůst počtu kvasinek 60. den po zákroku (9 KTJ v 1 g). Přítomnost plísní a kvasinek v mrkvové šťávě (tab. 3) byla zaznamenána až 30. den po ošetření vysokým tlakem a to 35 KTJ v 1 ml vzorku. 0. a 7. den jejich přítomnost nebyla prokázána.

46

6 Závěr Cílem předložené práce bylo zhodnotit účinnost ošetření šťáv vysokým tlakem a stanovit mikrobiologickou kvalitu výrobku v závislosti na čase skladování. Z výsledků provedených mikrobiologických analýz zeleninových šťáv v době minimální trvanlivosti i po uplynutí této doby byly zjištěny tyto poznatky: •

Senzorické vlastnosti se v tlakem ošetřených šťávách nemění, nebo jen neznatelně.

•

Tlak je velmi účinný při inaktivaci nesporulujících mikroorganismů.

•

Tlakem se urychlují některé enzymatické reakce, vedoucí u šťáv k sedimentaci.

•

U zeleninových šťáv otevřených v den ošetření vysokým tlakem byly zjištěny celkové počty mikroorganismů v řádech desítek KTJ v 1 ml vzorku.

•

V průběhu skladování můžeme pozorovat velký nárůst celkového počtu mikroorganismů (o 3 řády). Výrobce však garantuje dobu trvanlivosti výrobku 10 dní. Po tuto dobu je nárůst mikroorganismů akceptovatelný. I po uplynutí doby trvanlivosti, tedy po 30 dnech, výrobek nepřekračuje přípustné hodnoty dané vyhláškou č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení. Vyhláška stanoví u čerstvých ovocných a zeleninových šťáv – tepelně neošetřených, bez konzervačních látek přípustnou hodnotu do 106 celkového počtu mikroorganismů v 1 g nebo 1 ml vzorku. Naše vzorky dosáhly maximální počet mikroorganismů 4,5 . 105 v 1 ml.

47

7 Literatura BERNKUSOVÁ B.: Někdo to rád syrové. Zdraví, 55, 2007, č.11, s. 56 – 58

BRŮNA D., ISTENESOVÁ L., VOLDŘICH M., ČEROVSKÝ M.: Composition changes of strawberry purre during high pressure pasterurisation. Food Science, 7, 1998, č. 8

DOYLE M. P., BEUCHAT L. R., MONTVILLE T. J.: Food Microbiology.Washington, ASM Press 2001, 563 s.

DOYLE M. P. et al.: Preservatives and Preservation Methods. Washington, ASM Press 2001, 137 s.

GÖRNER F., VALÍK Ľ.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava, Malé centrum 2004, 528 s.

HAVEL. P.: www.dtest.cz, Nezapomínejme na ovoce

HOUŠKA M.: Porovnání spotřeby energie a analýza nákladů při aseptické pasteraci ovocných šťáv, VÚPP – tech. zpráva č. 2/360/98, únor 1998

INGR. I.: Základy konzervace potravin. Brno, MZLU 2002, 130 s.

JAY J. M. at al., Modern food microbiology. Food science text series 2005, 790 s.

KOMPRDA. T.: Obecná hygiena potravin, Brno, MZLU 2007, 148 s.

MALEŘ J.: Výroba nápojů. Praha, ISBN 1996, 41 s.

MENG J., DOYLE M.P.: Mircobes and Infection 4. University of Maryland 2002, s. 395 - 397

48

MOTTL J.: Nápoje – Výroba, ošetřování, podávání. Praha, Grada 1999, 116 s.

OBERBEIL. K., LENTZOVÁ. CH.: Léčba ovocem a zeleninou. Praha, Fortuna Print 2003, 294 s.

PIRNEROVÁ D.: Ještě zdravěji. Zdraví, 55, 2007, č.5, s. 12 – 14

PIRNEROVÁ D.: Máte dostatek vitamínů?. Zdraví, 55, 2007, č.12, s. 10 – 12

SLÁDEK F.: Úloha Úřadu pro potraviny při zajištění bezpečnosti potravin v ČR. Potravinářská revue 2007, č.2, s. 3 – 5

SOVJAK. R., REISNEROVÁ. H.: Hygiena a zdravotní nezávadnost potravin. Praha, ISBN 2001, 192 s.

SUMNER S. S., PETERS D. L.: Microbiology of vegetables. USA, Technomic Publishing 1997, 87 s.

TRONÍČKOVÁ E.: Zelenina. Praha, Artia 1985, 223 s.

VELÍŠEK J.: Chemie potravin 1. Tábor, Ossis 1999, 352 s.

VÍT M., GOTTVALDOVÁ E.: Zamyšlení hygienika nad výživou a zdravím. Potravinářská revue 2008, č.1, s. 15 – 19

VOLDŘICH M.: Metody konzervace potravin. Kvalita potravin, 6, 2006, č.1, s. 10 - 12

VOLDŘICH M., DOBIÁŠ J., PHILIPPON J.: Použití vysokých tlaků v potravinářské technologii. Průmysl potravin, 44, 1993, 251 - 254

Vyhláška 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení

49

8 Přílohy

Vyhláška č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení

Čerstvé ovocné a zeleninové šťávy (tepelně neošetřené, bez konzervačních látek) Celkový počet mikroorganismů

PH 6 10

Escherichia coli

10

2

Kvasinky

5.10

4

PH – přípustná hodnota ( přípustné množství mikroorganismů v 1 g nebo 1 ml vzorku)

50

Vyhláška č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení Nejvyšší mezní hodnoty počtu mikroorganismů Bakteriální původci onemocnění z potravin Mikroorganismus Kategorie potravin Bacillus cereus

Termotolerantní Campylobacter

Nejvyšší mezní hodnota na g(ml)

potraviny neurčené k přímé spotřebě

105

potraviny určené k přímé spotřebě

104

potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu

102

potraviny určené k přímé spotřebě

Clostridium perfringens potraviny neurčené k přímé spotřebě

negat/25 105

potraviny určené k přímé spotřebě

104

potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu

102

Escherichia coli O 157 všechny druhy potravin a další verocytotoxin produkující E.coli (VTEC)

negat/25

Listeria monocytogenes potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu potraviny určené k přímé spotřebě (kromě níže uvedených)

Salmonella spp.

negat/25 negat/25

masné výrobky o aw nižší než 0,92

102

mražené krémy, zmrzliny apod.

102

ryby uzené studeným kouřem

102

potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu

negat/50

potraviny určené k přímé spotřebě

negat/25

Shigella spp.

potraviny určené k přímé spotřebě

negat/25

Koagulázopozitivní

potraviny neurčené k přímé spotřebě

105

stafylokoky

potraviny určené k přímé spotřebě

104

(Staphylococcus aureus potraviny pro kojeneckou a dětskou výživu a další druhy)

- neurčené k přímé spotřebě

103

- určené k přímé spotřebě

102

Vibrio parahaemolyticus

ryby, měkkýši, korýši a hlavonožci z vod tropických a subtropických pásem určené k přímé spotřebě

negat/25

Yersinia enterocolitica (suspektní patogenní kmeny)

Potraviny určené k přímé spotřebě

negat/25

51

REFIT - ZELENINOVÉ ŠŤÁVY Brokolice a jablko

Červená řepa

Mrkev

52