Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Sledování obsahu fumonisinů ve vzorcích kukuřice Diplomová práce
Vedoucí práce: Mgr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. Brno 2009
Vypracoval: Bc. Andrea Lolková
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Sledování obsahu fumonisinů ve vzorcích kukuřice vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….
PODĚKOVÁNÍ
Ráda bych na tomto místě poděkovala panu Mgr. Vlastimilu Dohnalovi, Ph.D. a paní Ing. Aleně Ježkové za vedení této diplomové práce, věcné připomínky, cenné rady a průběžné konzultace při psaní tohoto textu.
ABSTRAKT Do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti se stále více posouvá problematika mykotoxinů, spojená především s potenciálním ohrožením zdraví lidí a hospodářských zvířat. Mykotoxiny patří mezi významné toxiny přírodního původu. Často jsou členěny na tři základní skupiny podle hlavních producentů, kterými jsou plísně rodů Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp. Mezi poměrně novou skupinu fusariových mykotoxinů patří fumonisiny, nejčastěji izolované z kukuřice a kukuřičných výrobků. Fumonisiny bývají spojovány s výskytem karcinomu jícnu v Jižní Africe a v Číně a byly klasifikovány jako potenciální lidské karcinogeny. Proto byla na Ústavu technologie potravin vyvinuta a validována nová metoda pro stanovení fumonisinů ve vzorcích
kukuřice.
Mykotoxiny
byly
extrahovány
ze
vzorku
směsí
acetonitril/methanol/voda a stanoveny na kapalinovém chromatografu s hmotnostní detekcí.
Klíčová slova: Fumonisiny, mykotoxiny, kapalinová chromatografie, extrakce, kukuřice
ABSTRACT The problems of mycotoxins as gaining ground of the interest of experts and laic public. The mycotoxins are connected especially with potential risk to the health of people and of agricultural animals. Mycotoxins belong to the significant toxins of natural origin. They are sectioned into three basic groups by main producers, which are funguses genus Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp. Between young group of fusarium mycotoxins belong fuminosins. They are the most often izolated from corn and corny products. Fuminosins are connected with the appearance of carcinoma of gullet in South Africa and in China and they were clasified as a potentional human carcinogens. That´s why at the Department of Food Technology were developed and validated new method of assesment of fuminomins in samples of corn. Mycotoxins were extracted from sample of mixture acetonitril/methanol/water and assesed on liquid chromatography with weight detection.
Key words: Fumonisins, mycotoxins, liquid chromatography, extraction, maize
OBSAH
1
ÚVOD ................................................................................................................................................ 7
2
CÍL PRÁCE ...................................................................................................................................... 8
3
MYKOTOXINY OBECNĚ ............................................................................................................. 9 3.1
4
CHARAKTERISTIKA MIKROMYCETŮ ........................................................................................... 9
3.1.1
Historie mikromycetů........................................................................................................... 9
3.1.2
Charakteristika vláknitých mikromycetů............................................................................ 10
3.2
CHARAKTERISTIKA MYKOTOXINŮ ........................................................................................... 10
3.3
TOXINOGENITA ........................................................................................................................ 11
3.4
ROZDĚLENÍ MYKOTOXINŮ ....................................................................................................... 13
PRODUCENTI MYKOTOXINŮ ................................................................................................. 17 4.1
ROD ASPERGILLUS ................................................................................................................... 17
4.1.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Aspergillus.................................................................... 18
4.1.1.1
Aflatoxiny ............................................................................................................................... 18
4.1.1.2
Ochratoxiny ............................................................................................................................ 19
4.2
ROD PENICILLIUM .................................................................................................................... 20
4.2.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Penicillium.................................................................... 21
4.2.1.1
Patulin ..................................................................................................................................... 21
4.2.1.2
Kyselina cyklopiazonová ........................................................................................................ 22
4.3
ROD FUSARIUM ........................................................................................................................ 22
4.3.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Fusarium ...................................................................... 26
4.3.1.1
T-2 toxin ................................................................................................................................. 26
4.3.1.2
Deoxynivalenol (DON)........................................................................................................... 28
4.3.1.3
Zearalenon (ZEA) ................................................................................................................... 29
4.3.1.4
Fumonisiny ............................................................................................................................. 30
5
PREVENCE VÝSKYTU MYKOTOXINŮ V POTRAVINÁCH ............................................... 31
6
FUMONISINY................................................................................................................................ 33 6.1
TOXICKÉ ÚČINKY..................................................................................................................... 34
6.2
VÝSKYT V POTRAVINÁCH ........................................................................................................ 36
6.2.1
Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva (RASFF) ............................................. 37
6.3
LEGISLATIVA ........................................................................................................................... 39
6.4
STANOVENÍ FUMONISINŮ ......................................................................................................... 40
6.4.1
Příprava vzorku ................................................................................................................. 40
6.4.2
Metody stanovení ............................................................................................................... 42
6.4.2.1
Plynová chromatografie (GC) ................................................................................................. 42
6.4.2.2
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ................................................................ 42
6.4.2.3
ELISA ..................................................................................................................................... 43
6.4.2.4
7
VÝVOJ METODIKY PRO STANOVENÍ FUMONISINŮ V KUKUŘICI .............................. 44 7.1
MATERIÁL A METODIKA .......................................................................................................... 45
7.1.1
Chemikálie a činidla .......................................................................................................... 45
7.1.2
Chromatografické vybavení ............................................................................................... 45
7.1.3
Extrakce ............................................................................................................................. 45
7.1.4
Analýza pomocí HPLC/MS ................................................................................................ 46
7.1.5
Příprava standardních roztoků a vzorků kukuřice ............................................................. 46
7.2
VÝSLEDKY A DISKUZE ............................................................................................................. 47
7.2.1
Optimalizace HPLC/MS..................................................................................................... 47
7.2.2
Výsledky optimalizace MS.................................................................................................. 50
7.2.3
Vliv octanu amonného........................................................................................................ 51
7.2.4
Kalibrační křivka pro čistý standard – linearita a limit detekce/kvantifikace ................... 52
7.2.5
Extrakce ............................................................................................................................. 53
7.2.6
Vývoj extrakce.................................................................................................................... 54
7.2.7
Správnost, přesnost a výtěžnost metody ............................................................................. 55
7.2.8
FAPAS – kruhový test ........................................................................................................ 56
7.3
8
Ostatní metody stanovení........................................................................................................ 44
ANALÝZA REÁLNÝCH VZORKŮ KUKUŘICE ............................................................................... 57
7.3.1
Charakteristika jednotlivých hybridů................................................................................. 58
7.3.2
Výsledky měření reálných vzorků....................................................................................... 59
ZÁVĚR............................................................................................................................................ 61
1
ÚVOD Do života každého člověka patří zcela neodmyslitelně potrava. V dnešní době již
nestojí v popředí kvantita potravy, poněvadž, pomineme-li rozvojové země, je výroba potravin dostatečná, ale na její místo se dostává kvalita a zdravotní nezávadnost potravin. Což je způsobeno jednak rozšiřujícím se mezinárodním obchodem jednak zvyšující se vzdělaností lidí a jejich větším zájmem o zdraví a zdravý styl života. Tím jsou kladeny vyšší nároky na výrobu, produkci a distribuci potravin, které se projevují zejména ve zpřísňujících se hygienických požadavcích, kdy tyto požadavky mají zajistit zdravotní nezávadnost a biologickou hodnotu potravin. A právě se zvyšujícími se požadavky na bezpečnost a zdravotní nezávadnost potravin a krmiv se stále více posouvá do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti problematika mykotoxinů, spojená především s potenciálním ohrožením zdraví lidí a hospodářských
zvířat.
Mykotoxiny
jsou
sekundárními
metabolity
vláknitých
mikromycetů. Poměrně novou skupinou mykotoxinů jsou fumonisiny. Jsou produkovány toxinogenními kmeny rodu Fusarim (nejčastěji se jedná o Fusarium moniliforme) a údajným producentem je i Alternaria alternata. Z chemického hlediska patří mezi diestery propan-1,2,3-trikarboxylové kyseliny, které mají na 19 a 20 uhlíku aminopolyhydroxyalkylový
řetězec,
který
je
pro
tuto
skupinu
mykotoxinů
charakteristický. Jedná se o patogeny nejčastěji izolované z kukuřice a kukuřičných výrobků. Fumonisiny bývají spojovány s výskytem karcinomu jícnu v Jižní Africe a v Číně jako následek spotřeby kontaminované kukuřice. V roce 1993 byly klasifikovány Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) jako potenciální lidské karcinogeny (třída 2B). Tyto skutečnosti byly impulsem k vývoji a zavedení metodiky pro stanovování fumonisinů v kukuřici na Ústavu technologie potravin. V této práci byla provedena inovace standardních postupů pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. A to kombinací vysoce účinné extrakce směsí methanol/acetonitril/voda za použití mixéru UltraTurrax a vysokotlaké kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Byly porovnány dva typy extrakce fumonisinů ze vzorků kukuřice. Došlo k optimalizaci HPLC/MS metody a k validaci této metodiky. K ověření metodiky jsme poté použili kruhový test – FAPAS. Následně tato inovovaná metoda byla využita k analýze reálných vzorků, zejména kukuřice.
7
2
CÍL PRÁCE Vypracování literární rešerše o mykotoxinech. Vývoj a zvládnutí metodiky pro
stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice. Měřením vzorků kukuřice a následným vyhodnocením a zpracováním výsledků ověřit funkčnost metodiky.
8
3
MYKOTOXINY OBECNĚ
3.1 Charakteristika mikromycetů 3.1.1
Historie mikromycetů
Lidstvo od prvopočátku své existence sdílí své prostředí s řadou jiných organismů a mikroorganismů, které ho provázejí ve všech etapách vývoje. Mezi takové organismy patří rozmanité skupiny hmyzu, červů, hlodavců a jiných živočichů, ale především mikroorganismy reprezentované nesčetnými skupinami bakterií, prvoků, řas a mikroskopických hub. Mikromycety (mikroskopické houby) se staly neoddělitelnou součástí životního a pracovního prostředí člověka. Soužití s nimi zabezpečuje lidstvu už od nepaměti zdroje pro jeho výživu. Jsou využívány k produkci nejrůznějších druhů a typů potravin (mléčné
výrobky, alkoholické nápoje, droždí, aj.) a organických látek (enzymy,
kyseliny, vitaminy), včetně antibiotik (např.: peniciliny, cefalosporiny). Na druhé straně je člověk nucen se potýkat s negativními dopady působení hub, zejména pokud jde o degradaci dřeva a jiných surovin, potravin, krmiv, rozmanitých chorob zemědělsky využívaných rostlin, ale také zvířat. V neposlední řadě se jedná o nepříjemné zdravotní dopady na člověka, ať už formou infekčních onemocnění, alergií nebo otrav, včetně znehodnocení potravin mykotoxiny, které se ukazuje jako závažný celosvětový problém (Malíř, Ostrý aj., 2003). Mikromycety jsou rozšířeny po celém světě. Z praktického hlediska je dělíme na vláknité mikromycety (mikroskopické vláknité houby, plísně), kvasinky a kvasinkovité (yeast-like) mikroorganismy. S mikroskopickými houbami, které jsou pouhým okem nerozlišitelné, se mohl člověk blíže seznámit až s objevem mikroskopu a rozvojem mikroskopických metod pro jejich sledování. Vědci si v té době všímali nejen mikroskopických hub, které způsobovaly choroby rostlin (padlí, sněti, rzi apod.), ale i mikroskopických hub fermentujících rozličné substráty. V druhé polovině 19. století a počátkem 20. století se ke klasické mykologii, která se zabývala zejména popisem a systematikou hub, připojili další disciplíny jako fyziologie, biochemie a genetika hub. Došlo k rozvoji technické, půdní, lékařské a později environmentální mykologie. Neustále je zdokonalována systematika hub
9
s využitím
nejmodernějších
mikroskopických,
biochemických,
genetických,
statistických a později i molekulárně biologických metod. 3.1.2
Charakteristika vláknitých mikromycetů
Mikromycety jsou vícebuněčné nebo jednobuněčné (kvasinky) eukaryotní organismy s heterotrofní výživou. Živiny získávají absorpcí z okolního prostředí. Jedná se v převážné většině o saprotrofické organismy, které plní v ekosystémech nenahraditelnou roli destruentů a podílí se tak významně na koloběhu látek a energie v přírodě. Jen nepatrná část hub se přizpůsobila k parazitismu (paratrofii) jiných organismů, včetně člověka. Velká morfologická a fyziologická rozmanitost a adaptabilita mikromycetů k nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje jejich výskyt prakticky všude tam, kde existuje organická hmota. To jim umožňuje osídlit řadu rozdílných biotopů. Spóry mikromycetů jsou jednobuněčné či vícebuněčné výtrusy sloužící k jejich rozmnožování, šíření a přežívání v nepříznivých podmínkách. V případě mnoha patogenních hub hrají spóry rovněž významnou úlohu v patogenezi myotických onemocnění (mykózy, mykotoxikózy, mykoalergie). V životním a. pracovním prostředí člověka jsou přítomny v ovzduší, půdě, vodě, na povrchu živých a odumřelých organismů, předmětů, na plochách, v krmivu, v potravinových surovinách rostlinného původu a potravinách. Zvýšený výskyt spór či fragmentů hyf (houbových vláken) v ovzduší závisí mimo jiné i na klimatických podmínkách a na stupni narušení biologické rovnováhy životního prostředí. Zvláště potraviny jsou z hlediska zdraví člověka velmi vhodným a potenciálně rizikovým substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování toxinogenních mikromycetů a následně pro produkci mykotoxinů (Malíř, Ostrý aj., 2003).
3.2 Charakteristika mykotoxinů Mykotoxiny jsou sekundární metabolity vláknitých mikromycetů. Mykotoxiny patří mezi významné toxiny přírodního původu. Sekundární metabolity proto, že nejsou nezbytné při rozvoji vláknitých mikromycetů jako například aminokyseliny, nukleové a mastné kyseliny nebo proteiny. Sekundární metabolismus se na rozdíl od esenciálního metabolismu primárního vyznačuje některými specifickými rysy, které lze v případě plísní (mikromycet) shrnout takto: •
Sekundární metabolity vznikají jen u určité skupiny druhů či kmenů.
10
•
Maximum produkce sekundárního metabolitu často nastává až po fázi vyrovnaného růstu, běžně je spojeno s morfogenetickými změnami, jako je sporulace (Velíšek, 2002).
Název mykotoxiny byl poprvé použit Forgaczem a Carllem v roce 1955. Mykotoxiny jsou strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (až na výjimky nižší než 700 g/mol). Jsou nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a živé organismy. Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány, je vysvětlován tím, že jsou prostředkem vláknitých mikromycetů v boji o potravu a v boji o přežití (Malíř, Ostrý aj., 2003). O problému vymezení mykotoxinů bylo jednáno obcí československých mykologů a hygieniků na odborném semináři ČSVSM v Praze, roku 1983, kdy byla konsensem přijata následující definice (tato je pouze mírně stylisticky upravena): Mykotoxiny jsou toxické látky mikroskopických hub nebílkovinné povahy, toxické vůči člověku a (nebo) hospodářským zvířatům a k expozici jimi dochází proti vůli a zájmům člověka (Šimůnek, 2004). V současné době je známo 400 druhů mykotoxinů. I nadále jsou objevovány a chemicky charakterizovány další nové mykotoxiny. Základní toxikologický výzkum stávajících ani nově objevených mykotoxinů nebyl zatím ukončen a nadále probíhá (Nedělník, Moravcová, 2005).
3.3 Toxinogenita Toxinogenitou se nazývá schopnost organismu tvořit toxiny. Aplikováno na mikroskopické houby – jde o schopnost tvorby mykotoxinů. Všechny kmeny druhů mikroskopických hub, u nichž byla zjištěna produkce určitého mykotoxinu, považujeme za potenciálně toxinogenní pro daný mykotoxin. Pozitivní toxinogenita znamená, že daný kmen je za určitých podmínek schopen produkovat daný mykotoxin. Vyšetření konkrétního kmene má tedy vždy vyšší výpovědní hodnotu než pouhé konstatování jeho příslušnosti ke druhu, který je schopen v některých případech produkovat mykotoxiny. Jak již bylo uvedeno výše, mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jedná se o sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na souhře enzymatických aktivit v buňce Na druhé straně ovšem neexistence genů pro klíčové enzymy této tvorby je spojena s naprostou neschopností kultury tvořit daný mykotoxin (skupinu mykotoxinů). Z hlediska druhových či genetických podmínek toxinogenity jde o schopnost houby produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně 11
prekursoru, zpravidla přes meziprodukty, na mykotoxin. Některé prekursory mohou být samy o sobě rovněž mykotoxiny. Nalézáme je u některých druhů, které jsou neschopné jejich další přeměny. U druhů, kde biochemická přeměna pokračuje k dalším látkám, je často nacházíme pouze ve stopových koncentracích. V některých případech je popsána schopnost produkovat více konečných sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Převahy určité konkrétní sloučeniny v kultuře lze potom dosáhnout např. změnou teploty nebo specifickými inhibitory některých enzymů (Šimůnek, 2003). Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu. Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, uvnitř kterého mohou být mykotoxiny vytvářeny, přičemž od optima směrem k limitům klesá jednak množství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné množství mykotoxinu. Důležité jsou také osmotické vlastnosti substrátu, charakterizované nejlépe tzv. vodní aktivitou (aw). I zde existuje zpravidla rozmezí hodnot, uvnitř kterého lze zaznamenat produkci mykotoxinů. Je nutno zdůraznit, že posun aw mimo optimální hodnoty neznamená usmrcení kultury. Dochází k přežívání spor a za určitých okolností i myceliálních buněk. Jako fyzikální veličinu musíme rovněž chápat čas. I na něm závisí obsah mykotoxinů. Mycelium začne produkovat měřitelná množství mykotoxinů až po určité době a po vyčerpání zdrojů se produkce zastaví. Z chemických faktorů je důležitý přísun energie a nezbytných chemických látek, které buňky mikroskopických hub (mikromycet) potřebují jako vstup do svého metabolismu. Důležitý je přísun kyslíku. Při jeho nedostatku dochází k poklesu produkce mykotoxinů a posléze k zástavě růstu kultury. (Šimůnek, 2003) Významné jsou i faktory biologické. Je popsán prudký pokles produkce mykotoxinů ve směsných kulturách. Silný pokles produkce lze vysvětlit tím, že při pasážování kultury vznikají netoxinogenní mutanty. Jejich přibývání ve směsné kultuře poté vede k rychlé ztrátě tvorby mykotoxinů. Toxinogenita je stanovována zpravidla kultivací izolovaného kmene za standardních podmínek, které se podle autora metody blíží optimálním podmínkám produkce mykotoxinu. Stanovená toxinogenita by v případě negativního výsledku měla zaručit vysokou pravděpodobnost toho, že testovaný kmen nebude produkovat daný mykotoxin. Pozitivní výsledek znamená pouze to, že zachycený kmen je za jistých 12
okolností schopen stanovovaný mykotoxin tvořit. Je důležité podotknout, že přítomnost spor toxinogenního kmene neznamená zdaleka ještě výskyt mykotoxinů. V naprosté většině případů jsou samy o sobě prosty mykotoxinů, jen několik málo druhů plísní obsahuje významné množství svých mykotoxinů ve sporách (Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum). Znamená však, že jakmile nastanou vhodné podmínky pro růst mycelia a produkci mykotoxinů, pak k této produkci s vysokou mírou pravděpodobnosti také dojde (Šimůnek, 2003).
3.4 Rozdělení mykotoxinů Mykotoxiny lze rozdělit podle velkého množství kritérií. Stejně jako je tomu i v případě jiných sekundárních metabolitů, nelze mykotoxiny jednoduše klasifikovat do jednotlivých skupin pouze na základě chemické struktury bez současného zohlednění jejich výskytu, producentů či charakteru a intenzity vyvolávaných účinků. Jako přirozené kritérium klasifikace mykotoxinů lze použít mechanismus biosyntézy základního skeletu jejich molekuly. Řada významných mykotoxinů vzniká tzv. polyketidovou cestou, kde je intermediátem podílejícím se bezprostředně na výstavbě příslušného polyketidu acetylkoenzym A, jenž se v primárním metabolismu podílí na výstavbě mastných kyselin a jiných sloučenin. Druhý nejvýznamnější způsob biosyntézy
vychází
z mevalonové
kyseliny.
Z tohoto
meziproduktu
vznikají
trichothecenové mykotoxiny, které obsahují ve své molekule seskviterpenový skelet. Pro úplnost je třeba zmínit existenci dalších metabolických cest, které se uplatňují při vzniku některých méně běžných mykotoxinů. Výchozím intermediátem cyklických polypeptidů, např.: malforminu C, jsou aminokyseliny. Reakcí aminokyselin s mevalonátem vznikají tzv. tremorgenní mykotoxiny. A reakcemi obdomnými pochodům Krebsova cyklu vznikají nonadridy (Velíšek, 2002). Členění mykotoxinů podle způsobu jejich biosyntézy je uvedeno v tabulce 1. Jak již bylo zmíněno, nelze mykotoxiny dělit jen podle jednoho kritéria. Ale jedním z nejčastěji používaných a nejjednodušších dělení je dělení dle chemické struktury. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Toto rozdělení je ukázáno v tabulce 2 (Šimůnek, 2004). V současnosti je však také věnována pozornost vázaným neboli konjugovaným mykotoxinům, které mohou být vázány ve formě glykosidů. Tyto konjugované mykotoxiny byly přítomny ve vysokých koncentracích v mnoho produktech na bázi cereálií. Přitom vázané mykotoxiny nelze běžnými analytickými postupy používanými
13
v kontrolních laboratořích stanovit. Existuje předpoklad, že tyto „maskované“ formy jsou též toxické a představují riziko pro konzumenty (současné maximální limity jsou stanoveny jen pro volné mykotoxiny). V trávicím traktu člověka (obdobně i u hospodářských zvířat) může pravděpodobně docházet k uvolňování mykotoxinů z vazeb na více molekulární komponenty matrice a tak, de facto k navýšení toxické zátěže organismu (Kubíček, 2008). Tab. 1 Členění mykotoxinů podle způsobu jejich biosyntézy (Malíř, Ostrý aj., 2003) Kategorie biosyntézy Zástupce Decaketidy
Aflatoxiny, erytroskyrin
Diketidy
Moniliformin
Diketopiperaziny jednoduché
Kyselina aspergilová, echinuliny
Diketopiperaziny modifikované
Brevianamidy, fumitremorgeny, roguefortin
Diterpeny
Aflatrem, lolitremy, paspalin, penitremy
Heptaketidy
Rugulosin, viriditoxin, xanthomegnin
Hexaketidy
Maltoryzin
Monoterpeny
Viridikatumtoxin
Nonaketidy
Citreoviridin, fumonisiny, zearalenon
Octaketidy
Luteoskyrin
Pentaketidy
Citrinin, ochratoxiny
Peptidy
Ergotamin, phomopsiny, rhizonin
Seskviterpeny
Trichotheceny
Tetraketidy
Patulin, kyselina penicilinová
Tetramická kyselina
Kyselina cyklopiazonová, kyselina tenuazonová
Dále můžeme dělit mykotoxiny podle nejvýznamnějších toxických účinků. Toto dělení není ovšem zcela výstižné, poněvadž některé mykotoxiny mohou být zařazeny do více skupin (např.: trichotheceny mají účinky dermotoxické, neurotoxické i vůči zažívacímu traktu). V podobných případech bývá toxin často zařazen podle historického aspektu, které účinky byly objeveny jako první a více se vžily. Kvalitativní Austvickovo schéma, pro dělení mykotoxinů dle toxicity, z roku 1976 rozšířené z praktických důvodů o dvě poslední skupiny, je znázorněno v tabulce 3.
14
Tab. 2 Členění mykotoxinů podle chemické struktury Skupina
Příklady
Furanofurany
Aflatoxiny, sterigmatocystin aj.
Substituované pyreny a hydroxypyreny
Kyselina kojová, sekalonové kyseliny aj.
Substituované chinony
Luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin aj.
Nenasycené laktony
Patulin, kyselina penicilinová, ochratoxiny, citreoviridin, rubratoxin aj.
Griseofulviny
Griseofulvin
Epoxytrichotheceny
T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, vomitoxin (=deoxynivalenol), nivalenol, verrucariny, fusarenon, satratoxiny aj.
Polycyklické substituované indolové
Kyselina cyklopiazonová, paspaliny,
deriváty
penitremy aj.
Cyklické dipeptidy
Gliotoxin, sporidesminy, roquefortin aj.
Mykotoxiny jiné struktury
Zearalenon, curvularin, citrinin, fumonisiny, moniliformin aj.
Tab. 3 Dělení mykotoxinů podle toxicity – kvalitativní Druh účinku Hepatotoxiny
Zástupce
Aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatocystin aj.
Nefrotoxiny
Ochratoxin A, citrinin aj.
Toxiny zažívacího traktu
T-2 toxin, další trichotheceny
Neurotoxiny a mykotoxiny
Tremorgeny, citreoviridin, fumonisiny
Dermotoxiny
Verrucariny, sporidesminy, trichotheceny aj.
Toxiny dýchacího traktu
Patulin
Genitotoxiny
Zearalenony
Imunotoxiny
Aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny aj.
Toxiny nezařaditelné nebo málo prozkoumané
15
Mykotoxiny jsou často členěny na tři základní skupiny podle hlavních producentů, kterými jsou plísně rodů Fusarium ssp., Aspergillus ssp., Penicillium ssp.. Tito producenti se dělí podle výskytu na plísně polní, skladištní, polní i skladištní (viz níže). Okrajově se lze ještě zmínit o méně používaných děleních, kdy mykotoxiny dělíme podle toxicity na silně, středně a slabě toxické nebo podle účinku na buňku na: •
Inhibitory tvorby energie (moniliformin)
•
Inhibitory proteosyntézy (trichotheceny)
•
Modifikátory cytoskeletu
•
Estrogenní mykotoxiny (např.: zearalenon)
•
Tremorgeny
•
Karcinogenní mykotoxiny
Je nutné znovu upozornit na fakt, že žádné z doposud používaných členění nelze považovat za univerzálně použitelné a že tato členění budou nadále obměňována a rozšiřována (Šimůnek, 2004).
16
4
PRODUCENTI MYKOTOXINŮ Mezi nejdůležitější rody, jejichž druhy produkují významné mykotoxiny, patří
rody Aspergillus, Penicillium a Fusarium, přičemž rod Fusarium bude rozebrán podrobněji.
Zároveň
bude
naznačena
stručná
charakteristika
nejdůležitějších
mykotoxinů jednotlivých druhů. Zvláštní důraz bude kladen především na fuzáriové mykotoxiny, konkrétně pak na fumonisiny. Těm bude věnována samostatná kapitola.
4.1 Rod Aspergillus Plísně rodu Aspergillus řadíme mezi plísně „skladištní“. Několik druhů rodu Aspergillus produkuje mykotoxiny, které mohou být toxické, mutagenické nebo karcinogenní. Některé druhy tohoto rodu jsou často půdní houby nebo saprofyté. Mohou napadat uskladněné plodiny, způsobovat choroby rostlin nebo mohou být lidskými čí zvířecími patogeny. Tyto houby je těžké kontrolovat. Rozšiřují se účinně prostřednictvím produkce asexuálních spór zvaných konidie. Existují druhy, které mohou přežívat v období nepříznivých podmínek tak, že vytváří ochranné struktury tzv. sklerocia. Kolonizace může být uskutečněna ještě před sklizní nebo až po ní. K napadení dochází v závislosti na podmínkách skladování a na životním prostředí (Dabrowski, 2005). Skladištní plísně jsou oproti polním plísním méně náročné na vlhkost prostředí. Jejich výskyt není vázaný na množství srážek v konkrétním roce, ale je ovlivněn zejména způsobem skladování, jak již bylo zmíněno. Zdrojem kontaminace zrn těmito houbami jsou nejčastěji zaplísněné rostlinné zbytky ve skladových prostorách a silech (Chloupek aj., 2005). Skladištím plísním nejlépe vyhovuje teplota prostředí v rozmezí od 5 do 45 ºC. Optimální pro jejich růst jsou teploty 25-30 ºC a vlhkost zrna mezi 13-17 %. Během skladování se mohou šířit další houby, pokud je zrno vlhké. V napadených partiích se proto může obsah mykotoxinů ještě zvyšovat. Také zrno s obsahem vody 15 % je jen omezeně skladovatelné, protože je hydroskopické a přijímá vlhkost ze vzduchu o vlhkosti vyšší než 65 %. Již za několik týdnů po uskladnění se proto mění druhové spektrum hub na uskladněném zrnu. Klesá podíl polních a zvyšuje se podíl skladištních druhů, avšak dosušením zrna na vlhkost pod 13 % a skladování při teplotě v rozpětí 4-9 ºC lze růst skladovaných plísní a produkci jejich metabolitů eliminovat (Nedělník, Bácová, 2000).
17
Zemědělské komodity, které mohou být kolonizovány nebo napadeny touto houbou, zahrnují obilí, rýži, cereálie (Dabrowski, 2005) Dále pak podzemici olejnou a další druhy ořechů, kakaové a sojové boby. Z obilovin se nejčastěji vyskytují právě na kukuřici (Zedníková aj., 2006). Ovlivněny a zasaženy mohou být i jiné spotřební výrobky, protože při strávení kontaminovaného jídla zvířaty přechází mykotoxiny do masa, mléka a vajec. Mezi druhy rodu Aspergillus, které produkují mykotoxiny představující vážné zdravotní a ekonomické riziko, jsou: Aspergillus flavus (viz obrázek 1), Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus a Aspergillus fumigatus. Mykotoxiny produkované těmito druhy zahrnují: aflatoxiny, sterigmatocystin, kyselinu
cyklopiazoniovou,
ochratoxin,
patulin,
citrinin,
glyotoxin,
kyselinu
penicilinovou a další (Dabrowski, 2005).
Obr. 1 Aspergillus flavus 4.1.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Aspergillus
4.1.1.1 Aflatoxiny Aflatoxiny jsou velmi stabilní chemické sloučeniny. Nedegradují je vysoké teploty a jsou stálé i během zpracování surovin. Dlouhodobým skladováním zrn obilovin se sice hladina mykotoxinů mírně snižuje, ale nalezeny byly i v obilovinách po sedmi letech skladování (Zedníková aj., 2006).
18
Celkem byly popsány aflatoxiny B1, B2, G1, G2. Jejich označení pochází od barvy fluorescence v UV oblasti: AFB1 a AFB2 poskytují modrou fluorescenci (Blue), AFG1 a AFG2 žlutozelenou (yellow-Green). Později bylo popsáno i minoritní zastoupení aflatoxinů M1, M2 v mléce (Milk) krav krmených kontaminovanými pícninami. AFM1 a AFM2 jsou hydroxy deriváty AFB1 a AFB2. Neenzymovým působením především nízkého pH na AFB1 a AFG1 vznikají aflatoxiny B2A a G2A. Po metabolické přeměně se v intoxikovaném organismu mohou objevit i další aflatoxiny jako např. P1 a Q1 (Pohanka, 2008). Díky schopnosti poškozovat strukturu nukleové kyseliny jsou schopné indukovat mutace a mají karcinogenní efekt (Zedníková aj., 2006). Bylo dokázáno, že za 24 hodin od konzumace, dojnice přijímající B1 v krmivu v dávce 300 mg.g-1, produkovala mléko obsahující 11 ng.ml-1 M1. Analyzovatelné množství M1 mizí za 4-5 dní od posledního kontaktu s krmivem (Nedělník, Moravcová, 2006). Působením aflatoxinů dochází k různému stupni poškození jater, snížení hmotnosti a k narušení obranných mechanismů organismu. Vnímavé jsou všechny druhy hospodářských zvířat, především drůbež, mláďata a březí samice. Nejčastějšími příznaky intoxikace jsou nechutenství, gastroenteritidy, podkožní krvácení, krvácení z tělních otvorů a úhyny (Zeman aj., 2006). 4.1.1.2 Ochratoxiny Ochratoxiny jsou skupinou mykotoxinů zahrnující sedm izokumarinových derivátů vždy spojených s fenylalaninem, které produkují druhy rodu Aspergillus nebo také Penicillium.
Obr. 2 Aspergillus ochraceus V současné době jsou známy tři typy ochratoxinů, které se od sebe liší svou toxicitou. Ochratoxin A, B, a C. Nejtoxičtější je ochratoxin A, který působí na vyvíjející se centrální nervový systém, poškozuje ledviny a potlačuje imunitní reakce organismu (Hrdina aj., 2004). Mechanismus jejich toxicity spočívá v tom, že fenylalaninová část molekuly je zaměněná t-RNA za fenylalanin. Ten je však v ochratoxinu navázán na
19
kumarinovou část, která brání jeho navázání do proteinového řetězce. Tím dojde k zastavení syntézy proteinů s fenylalaninem (Chloupek aj., 2005). (chemická struktura jednotlivých ochratoxinů je naznačena na obrázku 3) Je produkován během skladování zrn plísní Aspergillus ochraceus (viz obrázek 2). Vzniká již od 16 % vlhkosti zrna a při teplotě 20-25 ºC, takže bývá častější než aflatoxin. Ochratoxin B a ochratoxin C jsou méně toxické. Krmivo obsahující ochratoxin A v množství 200 ng.g-1 způsobuje otoky ledvin charakterizované atrofií proximálních tubulů. Biologický poločas ochratoxinu A v tkáních prasete je 4,5 dne. Úplná eliminace mykotoxinu vyžaduje několik týdnů od expozice (Hrdina aj., 2004).
Obr. 3 Chemická struktura ochratoxinu A, B a C
4.2 Rod Penicillium Tento rod je příbuzný předcházejícímu, existuje dokonce i skupina druhů na jejich pomezí. Považuje se za fylogeneticky mladší, což se mj. projevuje velmi malými rozdíly v utváření rozmnožovacích orgánů jednotlivých druhů. Nepohlavní orgány jsou rovněž tvořeny konidioforem, palidami a konidiemi. Palidy jsou však na neztlustlém konidioforu sestaveny do tvaru štětičky, odtud i český název štětičkovec (Šimůnek, 2004). 20
Příslušníci rodu Penicillium patří k nejrozšířenějším vláknitým mikromycetům teplého a mírného klimatu. Jejich spóry jsou prakticky všudy přítomné, a proto jsou tyto mikromycety také velmi častými kontaminanty potravin, životního a pracovního prostředí. Jediný pravidelný patogen rodu Penicillium je dimorfní druh Penicillium marneffei, který způsobuje systémové infekce u pacientů s AIDS, a to převážně v endemických oblastech jihovýchodní Asie (Thajsko, Vietnam, Čína) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Mezi významné druhy tohoto rodu patří: Penicillium expansum (viz obrázek 4), Penicillium viridicatum, Penicillium commune atd. Jejichž mykotoxiny jsou: xantomegnin, viomellein, vioxanthin, patulin, citrinin, cyklopiazonová kyselina apod. (Šimůnek, 2004).
Obr. 4 Penicillium expansum 4.2.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Penicillium
4.2.1.1 Patulin Patulin byl původně popsán jako antibiotikum a dokonce po krátký čas léčebně využíván. Po objevení karcinogenity vůči zvířatům byl stažen a dnes je považován za významný mykotoxin. Mezi další producenty tohoto mykotoxinu patří ještě rody Aspergillus a Byssochlamys. V přírodě je poměrně rozšířen, důležitá je zejména jeho produkce na kazícím se ovoci, velice často v jablkách. Jsou rovněž popsány otravy dobytka ze zaplesnivělých siláží. V ovoci se vyskytují ochranné látky (např. vitamin C), které zabraňují rozkladu patulinu při tepelném opracování kompotů, dření i moštů (čistý patulin se rozkládá při 80 ºC). Závažnou je zejména kontaminace ovocných dření, určených pro dětskou a
21
kojeneckou výživu. Důležitým faktorem je výrobní praxe, při níž dochází k mechanickému poškozování ovoce. Akutní otravy jsou popsány u dobytka, většinou dominuje poškození plic s edémem. Patulin je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů (Šimůnek, 2004). 4.2.1.2 Kyselina cyklopiazonová Je produkována jak rodem Penicillium tak rodem Aspergillus. Byly popsány zejména změny v transportu iontů vápníku, vedoucí k osmotické smrti buněk. Při podání per os dochází především k postižení trávicí trubice a jater. V současné době se uvažuje o účasti kyseliny cyklopiazonové při turkey Х disease (náhlé úmrtí více jak 100 000 krůťat v roce 1960 v Anglii), vedoucí k objevu aflatoxinů. V menším množství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem Penicillium camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech, plísňových salámech apod. Nedodržení klasické technologie camembertských sýrů může vést k mohutnému vzestupu její koncentrace v plísňovém pokryvu (Šimůnek, 2004). Toxicita kyseliny cyklopiazonové se projevuje různými příznaky u různých organismů, např. se jedná o nekrotické účinky na gastrointestinální trakt, ledviny, játra, kosterní svaly a další orgány. Byly také pozorovány degenerativní změny myokardu. Nejčastěji je kyselina cyklopiazonová označována jako gastroenterotoxin, hepatotoxin a nefrotoxin. Bylo zjištěno, že po aplikaci kyseliny cyklopiazonové došlo k ovlivnění neurotransmiterů v CNS (centrální nervový systém) (Malíř, Ostrý aj., 2003).
4.3 Rod Fusarium Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitizmu rostlin, část za určitých podmínek může být patogenní pro člověka i zvířata. Rod Fusarium náleží k významným potenciálně toxinogenním „polním“ mikromycetům (Malíř, Ostrý aj., 2003). Z těchto „polních plísní“ se v našich klimatických podmínkách vyskytuje tento rod nejčastěji (Ostrý, 2006). Historicky první záznam popisu mikromycetů rodu Fusarium je spojen se jménem německého botanika Johanna H. F. Linka. Další řadu druhů rodu Fusarium popsali Elias Magnus Fries a Pier Andrea Saccardo. Fusarium moniliforme Sheldon, významný
22
producent fumonisinů, byl poprvé popsán Saccardem v roce 1882 jako Oospora verticillioides Sacc. a později přejmenován na Fusarium verticillioides. Mikromycety rodu Fusarium byly v minulosti známy také u nás, o tom svědčí český název „srpovnička“ pro makrokonidie fusarií. Při určování tohoto rodu sledujeme makrohabitus na sladinovém nebo bramboro – glukózovém agaru, kde vytváří dobře vyvinuté vegetativní mycelium a konidiální aparát. Konidiální stádium vytváří buď volné jednotlivé konidiofory, na nichž se vytvářejí konidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářkovitých útvarů, zvaných sporodochia. V některých případech se vytvářejí souvislé konidionosné porosty – pionéry. K typickému vytváření sporodochií a pionotů však dochází spíše na přirozeném substrátu. V kulturách se obvykle setkáváme pouze s volně rozmístěnými konidiofory ve vzdušném myceliu. Konidiofory jsou větvené málo nebo hojněji. Na ose konidioforu se tvoří vstřícné nebo přeslenité protáhlé fialidy, které plodí konidie, nebo se nejdříve vytvoří větévky, které nesou dvě i více vlastních konidiogenních buněk – fialid v přeslenu. Jsou známy dva druhy konidií, makrokonidie a mikrokonidie. Makrokonidie jsou dvoubuněčné až vícebuněčné a mají typický srpovitý tvar. Po delší kultivaci se přestávají tvořit. Někdy je nutno jejich tvorbu pro potřebu identifikace vhodně stimulovat. Mikrokonidie jsou jednobuněčné a elipsoidní, oválné nebo široce vejčité. Mohou tvořit na konci konidiogenní buňky řetězce nebo shluky (Malíř, Ostrý a., 2003).
Obr. 5 Mikroskopické znaky – rod Fusarium Vysvětlivky: a – monofialida a konidie ve shluku, b – polyfialida, c – konidie v řetízku, d – makrokonidie, e – různé tvary mikrokonidií
23
Pro určení druhu jsou nejtypičtější makrokonidie. Sledujeme u nich počet buněk, velikost, tvar zahnutí. U mikrokonidií je charakteristický tvar, velikost a způsob vzniku. U některých druhů se vyskytují hojně chlamydospóry, které jsou různého tvaru a velikosti, o různém počtu buněk, často se zbarvenou stěnou, která mívá i bradavičnatou strukturu. Chlamydospóry vznikají buď na konci vláken, nebo mezi buňkami vlákna. Vedle chlamydospór některé druhy tvoří blastokonidie. U rodu Fusarium se setkáváme také se sklerocii – tuhými kulovitými útvary. Mnohé druhy tvoří „plodničky“ – perithecia (Ostrý, 2006). Jak již bylo uvedeno, patří rod Fusarium mezi polní plísně, které se v klimatických podmínkách naší republiky vyskytují nejčastěji. Zástupci tohoto rodu se vyskytují především v obilovinách (např.: ječmen, pšenice, tritikale). Mezi další potraviny, kde můžeme tyto zástupce nalézt, patří: čirok, brambory, banány, sójové boby, arašídy, rajčata, lilek, rýže, fazole, pepř, cukrová řepa, paprika, česnek, ovoce a hlavně kukuřice (Zedníková aj., 2006). Jedna z nejčastějších chorob vyvolaná rodem Fusarium je sněť hlavová (FHB) v pšenici a méně běžně v ječmeni. FHB je častá v mírných podnebných pásmech. Dvě odrůdy rodu Fusarium byly izolovány z FHB a to: Fusarium graminearum a Fusarium culmorum. Z napadených plodin jsou často izolovány i jiné druhy například: F. verticillioides, F.crookwellense a F. avenaceum, avšak většinou jsou přítomné i druhy Fusarium graminearum a Fusarium culmorum. Následující druhy se vyskytují méně často a při nižších teplotách, ale i přesto je lze z plodin izolovat: Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae a F. equiseti (Dabrowski, 2005). Vzhledem k zaměření diplomové práce je třeba se poukázat i druhy, které napadají především kukuřici. Nejvýznamnější zástupci vyskytující se na palicích kukuřice je kmen F. graminearum, který nejčastěji produkuje mykotoxiny deoxynivalenol a zearalenon, a kmen F. moniliforme (syn.= F. verticillioides (Saccardo)) nejčastěji produkující fumonisiny. F. graminearum je růžovo-červená plíseň, která se po palici obvykle rozšiřuje z vrchních částí listenů kukuřice nebo kolem požeru zavíječe kukuřičného, zatímco bíle zbarvená plíseň F. moniliforme má tendenci se šířit po vláscích – bliznách. Při společném výskytu na jedné palici, tak jak to může být i mezi jinými kmeny, může jeden kmen převažovat nad tím druhým. To však záleží na průběhu teplot v daném roce a lokalitě. F. moniliforme může mít výhodu v teplejším období a sušších rocích. Zvláště
24
pak, když během optimálního období pro růst F. graminearum (tj. během července až září) bude nižší vlhkost prostředí (Reid a kol., 1999). Celkově stupeň napadení zrn polními plísněmi závisí, díky jejich nárokům na vlhkost prostředí, především na klimatických podmínkách v době dozrávání a sklizně. Ve vlhkých a deštivých letech může být napadena i více než polovina porostů. Naopak suchá léta většinou růst polních plísní omezují. Kromě vlhkosti prostředí, rozvoj polních plísní a následná kontaminace kukuřice mykotoxiny závisí i na míře mechanického poškození zrn hmyzem, konkrétně zavíječem kukuřičným. Mechanické poškození zrna zvyšuje výskyt plísní díky tomu, že narušené zrno je polními plísněmi napadáno přednostně. Velmi často také dochází k tomu, že plíseň do zrna prorůstá z napadeného vřetene palice. Pokud se zrno po sklizni vysuší co nejrychleji, nejlépe pod 14 % vlhkosti, nejsou tyto plísně schopné dalšího růstu. Polní plísně většinou nepoškozují zárodek zrna, nezpůsobují biochemické změny ani samozahřívání (Chloupek aj., 2005).
Obr. 6 Fusarium moniliforme (syn.= F. verticillioides (Saccardo)) Vysvětlivky: a – Fusarium moniliforme na kukuřici, b – makrokonidie F. moniliforme
Mezi další významné druhy vyskytující se v potravinách náleží: Fusarium acuminatum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. longipes, F. moniliforme, F. oxysporum, F. poae, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichioides a Fusarium subglutinans. V rodu Fusarium jsou zastoupeny i některé významné patogenní druhy. Jsou známy jako původci hyalohyfomykózy člověka. U relativně zdravých jedinců se jedná nejčastěji o mykotickou keratitidu, onychomykózu nebo o formu subkutánní mykózy
25
projevující se jako cysta nebo absces. V případě celkového oslabení organismu se mohou onemocnění rozvíjet jako systémové oportunní infekce. Nejběžnějšími původci jsou F. solani, F. oxysporum apod., případy lokalizovaných a systémových mykóz byly rovněž popsány u F. aquaeductum, F. chlamydosporum, F. proliferatum, F. sacchari a F. subglutinans. Laboratorní diagnóza infekcí vyvolaných rodem Fusarium je založena na histologickém vyšetření bioptických vzorků, v případě systémové formy na relativně časté pozitivitě hemokultivace. Byl rovněž vyvinut exoantigenní test pro identifikaci nejdůležitějších patogenních druhů. Pro izolaci fuzárií z potravinových surovin a potravin jsou v mykologii potravin doporučeny následující živné půdy: •
Czapek Iprodione Dichloran agar (CZID)
•
Dichloran Chloramfenikol Pepton agar (DCPA)
•
Pentachloronitrobenzen Pepton agar (PCBPA)
•
Bramboro-glukózový agar s chloramfenikolem (PDA)
Ke stimulaci tvorby makrospor se používají: •
Carnation-leaf agar (CLA)
•
Syntetic nutrient agar (SNA)
Někteří odborníci se rovněž zabývali přípravou diagnostických živných půd, které by sloužili k rychlé identifikaci a rozlišení fuzárií (konkrétně se jednalo o taxonomickou selekci Liseola, do které spadají např.: F. moniliforme, F. subglutinans aj.) (Malíř, Ostrý aj., 2003) Mykotoxiny, které produkují plísně rodu Fusarium, se označují jako fuzáriové mykotoxiny. Pro všechna hospodářská zvířata jsou fuzáriové mykotoxiny toxické. Závažnost intoxikace však závisí na specifickém toxinu, stupni a délce trvání expozice a na druhu zvířete. Nejběžněji se vyskytují trichothecenové mykotoxiny (deoxynivalenol, T-2 toxin), dále zearalenon, fumonisiny a verukariny (Zedníková aj., 2006). 4.3.1
Nejvýznamnější mykotoxiny rodu Fusarium
4.3.1.1 T-2 toxin V roce 1968 byl poprvé T-2 toxin izolován Bamburgem z kultury Fusarium sporotrichioides Sherb., nesprávně identifikované jako Fusarium tricinctum. Tento toxin je snadno produkován během fermentace na Czapek-Doxově médiu obohaceném peptonem. T-2 toxin se řadí mezi významné zástupce mykotoxinů trichothecenové
26
skupiny. Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny (Malíř, Ostrý aj., 2003). Je produkován hlavně kmeny Fusarium poae, Fusarium solani a Fusarium sporotrichioides z jiných rodů pak Trichoderma lignorum. Existuje ale mnoho dalších producentů. Nejpravděpodobnější iniciála jeho škození je schopnost inhibice syntézy proteinů na polyribozomech či změny struktury membrán. Působí převážně kožní problémy, často se vyskytují krvácivá ložiska v oblasti hlavy a pohlavních orgánů zvířete. U prasat způsobuje nejčastěji poruchy reprodukce, u skotu sníženou imunitu telat, poruchy srážlivosti krve a hemoragie. Typickým projevem je hemoragický syndrom vedoucí ke značné ztrátě krve krvácením do střev a břišní dutiny , často končící uhynutím. T-2 toxin je známý svojí vysokou akutní toxicitou. U lidí je T-2 toxin vyvolávajícím či spoluvyvolávajícím faktorem nemoci tzv. „Nemoci tří D (dermatitis, diarrhoea, demence)“ Pelagry (Ostrý, 2006). Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC/WHO) řadí T-2 toxin do kategorie 3, tj. zatím není klasifikován jako karcinogen pro člověka, i když např. u myší byla karcinogenita po podání toxinu pozorována. T-2 toxin je také považován za jednoho z pravděpodobných původců mykotoxikózy – alimentární toxické aleukie (ATA) (Malíř, Ostrý aj., 2003). ATA probíhá ve třech fázích. V první dochází k prudkému nástupu příznaků bráně vstupu. Jde zpravidla o trávicí ústrojí – záněty sliznice, zvracení, průjmy, které mohou být i krvavé. Ve druhé fázi se pak dostavuje zdánlivá úleva, doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek (úbytek červených krvinek u těžších případů nastává později). V poslední, třetí, fázi jsou nemocní postiženi jednak bakteriálními infekcemi, a to banální a pro zdravého člověka neškodnou flórou, jednak krvácením (i vykrvácení žen během menstruace). Často bývají postiženy krční mandle, proto byla choroba známa i po synonymem „septická“ angína. Přeživší nemocní se dostávají do několikaměsíčního období rekonvalescence. Při chorobě je důležitý zejména přísun plnohodnotných bílkovin, který poněkud kompenzuje pokles proteosyntézy vyvolaný trichotheceny. Existence toxických látek v napadeném obilí byla při výzkumu ATA prokázána už ve 30. letech, ale pregnantní důkaz spojitosti této choroby s T-2 toxinem provedl až v 70. letech Ueno, 1985. Ačkoliv je T-2 toxin běžným kontaminantem krmiv rostlinného původu, v potravinách se vyskytuje méně často. Byl nalezen v ječmeni, kukuřici, ovsu, žitu, pšenici, fazolích, koření a pivu (Šimůnek, 2004). 27
Už méně je znám fakt, že s tímto mykotoxinem musíme počítat také v souvislosti s jeho možným zneužitím k vojenským nebo teroristickým účelům. A to proto, že získání tohoto mykotoxinu biotechnologickými metodami nepředstavuje žádný odborný problém pro výrobu, je dostatečně odolný, neničí se autoklávováním a nerozkládá se na světle. T-2 toxin může být požit, vdechnut nebo vstřebán kůží či sliznicí. Jeho účinky na kůži jsou podobné yperitu. Všechny tyto vlastnosti stejně jako mechanismus účinku, tzn. inhibice syntézy proteinů a nukleových kyselin, inaktivace různých enzymů a inhibice funkce mitochondrií, přímo vybízí k jeho zneužití (Vacková, 2006). 4.3.1.2 Deoxynivalenol (DON) DON nezávisle na sobě objevili Yoshizawa a Mooroka v roce 1973. Jeho producenty jsou Fusarium culmorum, F. graminearum, F.poae, F. sporotrichioides. Jiné názvy známé pro DON: Rd toxin a vomitoxin. Patří také mezi trichotheceny (Malíř, Ostrý aj., 2003). DON je patrně nejfrekventovanější a zřejmě nejvíce se vyskytujícím trichothecenem v potravinách a krmivech. Společně s T-2 toxinem jsou původci alimentární toxické aleukie (Richard, 2007). Je spojován se vznikem akutních mykotoxikóz Asii. V roce 1980 došlo v Indii a v Číně ke vzniku mykotoxikózy tzv. „otravě červenou plísní“. Na základě současných poznatků akutní DON mykotoxikóza pro populaci ČR nehrozí (Ostrý a kol., 2001). Deoxynivylenol také ovlivňuje negativně funkce trávicího traktu zvířat, a to má za následek snížené vstřebávání živin, snížení přírůstků a zhoršení růstu. Kromě toho vykazuje také zánětlivé a imunosupresivní účinky. K velmi citlivým zvířatům na DON patří zejména prasata. Postižená zvířata odmítají krmivo, zvrací a trpí průjmy. K dalším projevům intoxikace patří poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích, aborty u březích samic či náhlý úhyn. Přežvýkavci jsou opět méně vnímaví, působení DON se projevuje např. snížením mléčné produkce, sníženou konverzí krmiva a průjmy (Böhm, 2006). Deoxynivalenol byl nalezen v mnoha druzích potravin: obiloviny a výrobky z nich, dětská výživa z obilovin, různé druhy kukuřice, chleba apod. DON je pravděpodobně nejběžnější mykotoxin kontaminující potraviny a krmiva z obilovin. Kontaminace deoxynivalenolem může být při pěstování eliminována dodržováním zásad správné zemědělské praxe a použitím vhodných agrotechnických opatření a prostředků na ochranu rostlin. V krmivech se nachází poměrně vysoké koncentrace
28
DON. Krmivem je přenos na skot možný, ale v mléce jsou koncentrace DON extrémně nízké a přechod reziduí DON do masa, mléka nebo vajec je také zanedbatelný (Malíř, Ostrý aj., 2003). 4.3.1.3 Zearalenon (ZEA) Tento mykotoxin byl izolován z kultury Gibberella zeae. Je dalším metabolitem rodu Fusarium. Původní název pro zearalenon byl F-2 toxin. Z chemického hlediska je charakterizován jako lakton β-resorcylové. V současné době bylo izolováno 15 derivátů základní struktury zearalenonu. Mezi producenty zearalenonu lze zařadit: F. culmorum, F. equiseti, F. moniliforme, F. oxysporum, F. graminearum, F. sambucinum, F. semisectum a Fusarium sporotrichioides. Z nichž se jako nejvýznamnější uvádí Fusarium graminearum (obrázek 7) a F. semisectum.
Obr. 7 Fusarium graminearum Sice je zearalenon méně toxický než některé jiné mykotoxiny ( i akutní toxicita je nízká), avšak svými estrogenními účinky, při nichž poškozuje receptory estrogenů, způsobuje hyperestrogenismus a pokles plodnosti v chovech hospodářských zvířat. Bývá označován jako „nesteroidní hormon“ (Nedělník, Moravcová, 2006). S ohledem na jeho estrogenní účinky se někdy používá i označení mykoestrogen. Zearalenon a některé jeho metabolity mají schopnost se vázat na estrogenní receptor v proteinech cytosolu a tak působit jako antagonisté estrogenu. U mladých jedinců je tento efekt výraznější (Velíšek, 2002). Mnoho problémů s reprodukcí v chovech je způsobeno právě tímto toxinem, kdy blokuje funkci přirozených hormonů (díky strukturní podobnosti se steroidními hormony estrogeny) a způsobuje zvětšení vulvy, dělohy a vaječníků, výhřezy pochvy a rekta, tvorbu folikulárních cyst, poruchy říje, plodnosti, vývoje plodu a podobně. To může mít za následek následnou infertilitu, popř. úhyn
29
zvířat z důvodu bakteriální infekce vyhřeznutých orgánů. Nejcitlivější na zearalenon jsou prasata, méně pak skot a drůbež. S výskytem zearalenonu se můžeme setkat v pšenici, ječmenu, ovsu a hojně v kukuřici. Zearalenon není pravděpodobně karcinogenní, i když podporuje rozvinutý karcinom. Ve skladovaném obilí je velmi stabilní, ani mechanické zpracování jej neničí, zůstává nezměněn i po tepelném zpracování či fermentaci. Závažný je přechod tohoto mykotoxinu do mléka, kam se dostává od krav ze zearalennony kontaminovaného krmiva (Hrdina aj., 2004). 4.3.1.4 Fumonisiny Fumonisiny jsou relativně nově popsaná skupina mykotoxinů produkovaných druhy rodu Fusarium spp., konkrétně Fusarium moniliforme a částečně F. proliferatum, popř. dalšími kmeny rodu Fusarium, kteří neprodukují trichotheceny. Tyto patogeny jsou nejčastěji izolovány na kukuřici a na kukuřičných produktech (Richard, 2007). Podrobněji o fumonisinech v kapitole 6.
30
5
PREVENCE VÝSKYTU MYKOTOXINŮ V POTRAVINÁCH Prevence plísňové a mykotoxinové kontaminace je obtížná, neboť přítomnost
plísní v zrninách a pícninách je ovlivňována řadou obtížně kontrolovatelných faktorů. Výskyt mykotoxinů má několik základních příčin, mezi nejdůležitější patří: •
Sklizeň vlhkých nevyzrálých obilovin, mechanické poškození povrchu zrna při nešetrné manipulaci při sklizni, skladování obilovin ve vlhkých a nevětraných prostorách
•
Sušení, případná fermentace, resp. další manipulace s kořením, olejnatými ořechy, kávovými boby, ovocem volně na vzduchu při nevyhovujících hygienických podmínkách, při vysoké vlhkosti (časté srážky) a vysoké teplotě
•
Použití poškozeného a zaplísněného ovoce k výrobě ovocné šťávy
•
Delší uchovávání pečiva v nevyhovujících podmínkách (vyšší vlhkost) v domácnosti
•
Zkrmování zaplísněných krmiv (kontaminace mléka, vnitřnosti)
Z uvedených příkladů vyplývají preventivní opatření pro zábranu výskytu mykotoxinů v potravinách (Komprda, 2004). Tato preventivní opatření tedy zahrnují: •
Střídání plodin v osevních postupech, omezit vliv předplodin, riziková je z tohoto pohledu především kukuřice
•
Zpracování půdy
•
Výběr vhodné odrůdy, hybridu
•
Protiplísňové ošetření osiv (fungicidy – mořidla)
•
Vyrovnaná výživa porostů
•
Boj proti škůdcům a chorobám
•
Boj proti plevelům (rezervoarní organismy)
•
Šlechtění odrůd odolných proti houbovým chorobám a škůdcům (GM – odrůdy)
•
Dodržování všech agrotechnických zásad při pěstování kulturních plodin
•
Udržování porostů v dobrém zdravotním stavu
•
Využitím atoxigenních kmenů konkurenčně vyloučit z prostředí toxigenní plísně
31
•
Zabránit mechanickému poškození zrna (při sklizni a uskladnění nebo jakékoliv manipulaci)
•
Kvalitní ošetření a uskladnění krmiv po sklizni
•
Po sklizni cereálií do 48 hodin snížit vlhkost pod 14 % (Velíšek, 2002)
•
Nesklízet vlhké, nevyzrálé suroviny (v případě nutnosti obiloviny dosoušet)
•
Provádět patřičnou posklizňovou úpravu obilovin
•
K výrobě ovocných šťáv používat pouze vytříděné, nepoškozené a plísní nenapadené ovoce
•
Hospodářským zvířatům nepodávat zaplísněná krmiva (Komprda, 2004).
32
6
FUMONISINY Jak již bylo předestřeno fumonisiny jsou poměrně novou skupinou mykotoxinů.
Poprvé byly objeveny a izolovány v roce 1988 v Jihoafrické republice z kukuřice, která byla napadena plísní Fusarium moniliforme. V současné době jsou intenzivně studovány (Soriano et al., 2004). Za hlavní producenty fumonisinů se považují plísně Fusarium moniliforme a Fusarium proliferatum. Z méně významných pak lze jmenovat Fusarium anthophilum, F. oxysporum, F. dlaminii, F. nygamai a Fusarium napiforme. Údajným producentem fumonisinů (konkrétně fumonisinu B1) je i Alternaria alternata. Tento údaj však nebyl znovu potvrzen (Malíř, Ostrý aj., 2003). V současnosti je známo přes 20 různých fumonisinů a jejich metabolitů (např. A1, A2, B1, B2, B3, B4, C1, C2, C3, C4, P1, P2, P3, aj.). Nejrozšířenější jsou fumonisiny řady B – B1, B2 a B3, z nichž nejtoxičtější a nejvíce zastoupeným je fumonisin B1(obvykle představuje okolo 70 % celkového obsahu fumonisinů). Fumonisiny řady B se běžně vyskytují v přírodě, jako kontaminanty potravin a krmiv (Malíř, Ostrý aj., 2003). Z chemického hlediska jsou fumonisiny diestery různých 2-amino-12,16dimethylpolyhydroxyeikosanů, které mají hydroxylovou skupinu na C14 a C15 esterifikovanou propan-1,2,3-trikarboxylovou kyselinu. Z hlediska způsobu biosyntézy patří fumonisiny mezi nonaketidy.
Obr. 8 Fumonisin B1
Obr. 9 Fumonisin B2
33
6.1 Toxické účinky Fumonisiny jsou strukturně podobné sfinganinu a sfingosinu a mohou tak uplatnit svou biologickou aktivitu v blokaci biosyntézy sfingolipidů (Ruprich, Ostrý, 1998). Bylo prokázáno, že fumonisiny inhibují biosyntézu sfingolipidů (sfingomyelinu a glykosfingolipidů), které se vyskytují ve větším množství v mozku a nervové tkáni a jsou potřebné pro stavbu a fyziologickou činnost buněčné stěny.
Obr. 10 Sfinganin
Obr. 11 Sfingosin Při inhibici biosyntézy sfingolipidů dochází k útlumu ceramidsyntázy (sfinganin a sfingosin N-acetyltransferázy). Důsledkem tohoto útlumu je akumulace produktů sfinganinu a sfingosinu, jejich 1-fosforylovaných metabolitů a zároveň snížení koncentrace komplexních sfingolipidů (ceramidů). To také bylo prokázáno u poníků, prasat, potkanů, opic. Nejvíce postiženými orgány u těchto zvířat byla játra, plíce, ledviny. Účinek fumonisinů na ledviny se zjišťuje na základě vyšetření sfinganinu a sfingosinu a následného sledování změny poměru sfinganin/sfingosin v moči a také v ledvinách. (Voss et al., 2007)
Obr.12 Schéma metabol. sfingolipidů ukazující inhibici ceramidsyntázy fumonisiny
34
Právě hodnota poměru sfinganin/sfingosin v moči, krevním séru a ve tkáních byla navržena jako možný biomarker expozice fumonisinům i u člověka (Malíř, Ostrý aj., 2003). Tento poměr však lze účinně využít jen v průběhu expozice, respektive v krátké době po expozici, vzhledem k toxikokinetickým vlastnostem. O fumonisinech je totiž známo, že rychle mizí z krve, jejich akumulace v tkáních je nízká a ani vstřebávání v GIT (gastrointestinální trakt) není vysoké (Voss et al., 2007). Toxické účinky fumonisinů byly pozorovány a následně experimentálně ověřeny u hospodářských a laboratorních zvířat. Relativně nejnebezpečnější jsou pro koně, osly, prasnice a ovce, u kterých jsou jako důsledek příjmu kontaminovaného krmiva nejčastěji popsána závažná onemocnění typu encefalomalácie (ELEM). Jedná se o smrtelné onemocnění postihující mozek, játra, ledviny. Projevuje se svalovým třasem, poruchami koordinace pohybů, vrávoravou chůzí, natažením nohou a krku a může vést až celkovému ochrnutím (Böhm, 2006). Na leukoencefolomalacii uhynulo v roce 1995 v Kentucky a Virginii 38 koní. Bylo zjištěno, že přibližná dávka fumonisinu B1(FB1) a B2(FB2) vyvolávající ELEM u koní je asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Z dalších závažných onemocnění lze jmenovat plicní edém prasat (přibližně se jedná o dávku 100mg/kg tělesné hmotnosti), proximal jejunitis syndrom u koní a nádorové onemocnění jater u laboratorních potkanů (přívod zhruba 15 mg/kg tělesné hmotnosti) (Malíř, Ostrý aj., 2003). U drůbeže fumonisiny vyvolávají tzv. syndrom toxicity krmiva, při kterém dochází ke snížení hmotnosti, ke zvětšení jater a ke snížení produktivity. Bylo prokázáno, že působí synergicky s aflatoxiny při vzniku karcinomu u pstruhů (Morgavi, Riley, 2007). Mimo tato onemocnění byly zjištěny u imunotoxické a teratogenní účinky fumonisinů. Z těchto důvodů v USA Food and Drug Administration (FDA) doporučilo, aby koně, prasata, skot a drůbež nebyli krmeni krmivy s vyšším obsahem fumonisinů než 1, 10, 30 a 50 mg/kg krmiva. Kromě tohoto je známo, že fumonisiny jsou fytotoxické pro některé kulturní plodiny a plevele (Malíř, Ostrý aj., 2003). Dochází ke ztrátě elektrolytů a k vzájemnému ovlivňování s komplexem fytosfingolipidů (Voss et al., 2007). Bylo zjištěno, že fumonisin B1 a ostatní fumonisiny vykazují pozdní toxické účinky a podle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny Světové zdravotnické organizace (IARC-WHO), jsou fumonisiny klasifikovány jako možné karcinogeny pro člověka (třída 2B). Lze předpokládat, že jsou příčinou vzniku karcinomu jícnu (Ostrý, 2006). V Číně, v severovýchodní oblasti Itálie a v některých oblastech Jižní Afriky, kde je pozorován vysoký výskyt karcinomu jícnu, byl fumonisin B1 v kukuřici pozorován 35
častěji a ve vysokých koncentracích (Morgavi, Riley, 2007). V roce 1997 byl pozorován ve 27 vesnicích v Indii hromadný výskyt onemocnění u venkovského obyvatelstva ve spojitosti s požíváním zaplísněné kukuřice a čiroku. Příznaky onemocnění byly provázeny bolestmi břicha, průjmy, které se dostavily během několika málo hodin po požití chleba ze zaplísněné kukuřice, ve které byl prokázán ve vysoké koncentraci fumonisin B1. V těchto oblastech může navíc docházet k adici a potenciaci nežádoucích účinků fumonisinů na lidské zdraví z důvodu synergického působení dalších mykotoxinů – např. aflotoxinů, T-2 toxinu, které se v menších koncentracích vyskytují v potravinách a krmivech také (Malíř, Ostrý aj., 2003). Dalším onemocněním, které pravděpodobně souvisí s fumonisiny je anencefálie. Byly zaznamenány 2 případy, kdy u dětí nedošlo k vyvinutí mozku a lebka zcela chyběla (Morgavi, Rilay, 2007).
6.2 Výskyt v potravinách K nejvýznamnějším zdrojům fumonisinů patří kukuřice, krmiva a potraviny na bázi kukuřice. Nejčastěji se v kukuřici vyskytuje fumonisin B1 a B2, ale také B3. Přibližně 70 % celkové koncentrace fumonisinů v kukuřičných zrnech byl nejvíce zastoupený FB1, a to v poměru 3:1 (FB1:FB2) a v poměru 12:1 (FB1:FB3) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Jak bylo dokázáno plísně rodu Fusarium (např. i Fusarium moniliforme či v menší míře F. proliferatum produkující fumonisiny) jsou izolovány ze všech částí rostliny kukuřice. Způsobují poškozování vzcházejících rostlin, vyvolávají hnilobu stébel a palic a v neposlední řadě také poškození zrn. Podle nejnovějších poznatků jsou ale listy a stébla v případě silné infekce zatíženy stejně jako palice. Ke kontaminaci dochází již v průběhu vegetace a stejně tak jsou v tomto období již detekovatelné významné hladiny toxických látek. Obsah mykotoxinů narůstá v posledních pěti až šesti týdnech před silážní zralostí, přičemž napadení je častější na odumřelých pletivech. Na napadení rostlin má vliv celá řada faktorů (např. typ hybridu). Experimenty naznačují, že hybridy kukuřice s rychlejším dozráváním zbytku rostliny vykazují vyšší obsah mykotoxinů. Teoreticky méně napadené by měli být tzv. „stay green hybridy“, u nichž do posledních fází před sklizní fungují fyziologické procesy. Jedná se především o obranné procesy, které u „stay green hybridů“ pracují na relativně vysoké úrovni na rozdíl od rychle dozrávajících, kdy dozrávající pletiva jsou snadněji napadena mimojité proto, že obranné mechanismy jsou již utlumovány a i tito patogeni mají větší prostor pro napadení (Hrubý a kol., 2005)
36
V letech 1995 a 1996 bylo v ČR vyšetřeno 210 vzorků potravin na bázi kukuřice na obsah fumonisinů (FUM). Asi 89 % vzorků bylo pozitivních na obsah FUM v rozsahu 9 – 4594 ng/g potraviny. Z toho u 4 % vzorků byl obsah FUM větší než 1000 ng/g, u 10 % vzorků vyšší než 500 ng/g a u 38 % vzorků byl obsah FUM větší než 100 ng/g. Maximální koncentrace FUM byly stanoveny ve vzorku kukuřičného chleba (4594 ng/g), extrudovaných kukuřičných výrobků – crips (1178 ng/g) a ve vzorcích polenty (1243 ng/g). Poměrně nízké koncentrace fumonisinů byly stanoveny u potravin jako je cornflakes (max. 328 ng/g) nebo popcorn (max. 128 ng/g) Dále bylo vyšetřeno 127 vzorků kukuřičných potravin pro bezlepkovou dietu a 88 % bylo pozitivních na obsah fumonisinů (Ruprich, Ostrý, 1998 ?). Fumonisiny byly dále nalezeny v nudlích, koření (např. kari, kari pastách, chilli papričkách), pivu a chlebě. Je diskutována i možnost vzniku reziduí fumonisinů v potravinových surovinách živočišného původu (např. mléce) po konzumaco krmiv na bázi kukuřice s vysokými koncentracemi fumonisinů. Maragos a Richard v roce 1994 testovali na obsah fumonisinů 165 vzorků syrového mléka metodou HPLC a ELISA. Pouze jeden vzorek byl pozitivní (Malíř, Ostrý aj., 2003). 6.2.1
Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva (RASFF) Systém RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) slouží pro ohlašování
rizikových potravin a krmiv za účelem zamezení jejich uvádění do oběhu nebo za účelem jejich stažení ze společného evropského trhu. Základním kritériem pro oznámení zasílané prostřednictvím Systému Rychlého varování pro potraviny a krmiva je poznatek, že rizikový výrobek (potravina) představuje přímé nebo nepřímé riziko pro zdraví a bezpečnost spotřebitele. V případě mykotoxinů v potravinách se jedná především o překročení limitů stanovených předpisy Evropských společenství (ES). V rámci systému RASFF existují tři kategorie oznámení: •
Varování (Alert notification)
•
Informace (Information notification)
•
Novinka (News)
V případě Originální oznámení – varování se jedná (vztaženo na mykotoxiny) o záchyt mykotoxinů v potravinách, které se vyskytují na trhu (obchodní síti), a tudíž je zapotřebí okamžitě zajistit závaznými normami. V případě Originální oznámení – informace se
37
jedná o záchyt mykotoxinů v potravinách, které byly zadrženy na hranicích popř. v celním skladu před proclením nebo byly zachyceny náhodně a je nutno zabránit jejich vyvážení do jiného členského státu EU. Oznámení – novinka (News) poskytuje informace vztahující se k bezpečnosti potravin, které nebyly oznámeny „členským“ státem jako „varování“ nebo „informace“, ale které jsou považovány za důležité pro dozorové orgány členských států, může se jednat i o informace organizačního rázu (Ostrý, 2006). Přehled originálních oznámení – varování (Alert nortification), týkající se fumonisinů, členských států EU hlášený v systému RASFF v letech 2006-2008 je uveden v tabulkách č. 4 a 5.
Tab. 4 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v letech 2007 – 2008 Datum Oznámeno z: Důvod Země původu Rok 2008 6.10.2008
Holandsko
FUM v kuk. mouce
Itálie
24.9.2007
Německo
FUM v kuk. otrubách
Německo
25.6.2007
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
12.6.2007
Německo
FUM v bezglutenových špagetách
Itálie
20.4.2007
Holandsko
FUM v kuk. mouce
Itálie
13.4.2007
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
10.4.2007
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
6.3.2007
Německo
FUM v polentě
Itálie
4.1.2007
Německo
FUM v bezglutenových špagetách
Itálie
Rok 2007
38
Tab. 5 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v roce 2006 Datum Oznámeno z: Důvod Země původu Rok 2006 4.12.2006
Německo
FUM v bezglut. těstovinách
Itálie
21.9.2006
Německo
FUM v kuk.krekrách
Rakousko
20.9.2006
Německo
FUM v kuk. lupínky/chleba
Německo
14.9.2006
Německo
FUM v bezglut. špagety
Itálie
7.9.2006
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
5.9.2006
Německo
FUM v bezglut. těstovinách
Itálie
30.8.2006
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
28.7.2006
Slovinsko
FUM v kuk. vločkách
Itálie
12.7.2006
Německo
FUM v kuk. chlebu
Německo
14.4.2006
Francie
FUM v kuk. mouce
Francie
16.3.2006
Belgie
FUM ve směsi cereálií
Holandsko
20.2.2006
Německo
FUM v kuk. mouce
Itálie
13.2.2006
Holandsko
FUM v kuk. mouce
Itálie
6.3 Legislativa Stejně jako ve většině států světa, tak i v České republice jsou mykotoxiny v potravinách a potravinářských surovinách limitovány. Ve všech členských státech EU (tedy i v ČR) jsou limity mykotoxinů stanoveny nařízením (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. Toto nařízení bylo v určitých bodech pozměněno nařízením komise (ES) č. 1126/2007 ze dne 28. září 2007, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o fusariové toxiny v kukuřici a ve výrobcích z kukuřice. V doporučení komise (ES) č. 576/2006 ze dne 17. srpna 2006 o přítomnosti deoxynivalenolu, zearalenonu, ochratoxinu A, T-2 a HT-2 a fumonisinů jsou uvedeny směrné hodnoty pro jednotlivé produkty určené ke krmení zvířat. Pro fumonisiny (suma FB1 a FB2) je to směrná hodnota 60 mg/kg pro krmiva z kukuřice a produktů kukuřice. Pro doplnění lze dodat, pro kukuřici jako krmivo je stanoven obsah nežádoucích látek směrnicí (ES) č. 32/2002 ze dne 7. května 2002 o nežádoucích látkách v krmivech. Z hlediska mykotoxinů je zde stanoven pouze maximální obsah pro aflatoxin B1.
39
Tab. 6 Maximální limity fumonisinů v potravinách kukuřičného původu Bod Potravina
Suma FB1 a FB2
2.6.1 2.6.2
2.6.3 2.6.4 2.6.5
2.6.6
Nezpracovaná kukuřice kromě nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím. (*) Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě , kukuřičné potraviny k přímé lidské spotřebě kromě potravin uvedených v bodech 2.6.3 a 2.6.4 Kukuřičné snídaňové cereálie a svačinky z kukuřice
4000 µg/kg
Kukuřičné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti Mleté frakce kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů kódu KN 1103 13 nebo 1103 20 40 a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN 1904 10 10
200 µg/kg
Mleté frakce kukuřice s velikostí částic ≤ 500 mikronů kódu KN 1102 20 a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic ≤ 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu 1904 10 10
1000 µg/kg
800 µg/kg
1400 µg/kg
2000 µg/kg
(*)
Výjimka se týká pouze kukuřice, u které je zřejmé, např. na základě označování, místo určení, že je
určena pouze k použití v procesu mokrého mletí (výroba škrobu).
6.4 Stanovení fumonisinů Ke stanovování látek jsou důležité jejich analytické vlastnosti, stejně tak je tomu i u fumonisinů. Z chemické struktury těchto mykotoxinů vyplývá, že se jedná o polární látky. Jsou tedy rozpustné v polárních rozpouštědlech, např. voda, acetonitril, methanol či jejich směsi a nerozpustné v nepolárních rozpouštědlech. Práce s fumonisiny probíhá v neutrálním či slabě kyselém prostředí (zvyšuje jejich ionizaci a tím i rozpustnost). V alkalickém prostředí částečně či úplně hydrolyzují. Mezi podstatné vlastnosti pro stanovení fumonisinů patří i nedostatek UV chromoforů, což je ovšem pozorováno i u některých jiných mykotoxinů (Voss et al., 2007). 6.4.1
Příprava vzorku Stanovení fumonisinů se skládá z několika na sebe navazujících kroků, z nichž
každý rozhoduje o výsledku analýzy. Významným krokem je příprava vzorku tzn. jeho homogenizace, extrakce a úprava vzorku před vlastním stanovením. Při extrakci dochází k rozpuštění fumonisinů do roztoku (volné a vázané fumonisiny) a k odstranění
40
matrice. Pro odstranění matrice při extrakci se u homogenizovaného vzorku fumonisinů využívá buď kapalinová extrakce nebo kontinuální superkritická fluidní extrakce (SFE) oxidem
uhličitým.
Kapalinová
extrakce
vzorku
organickým
rozpouštědlem
(acetonitril/voda, methanol/voda, voda) se provádí nejlépe na laboratorní třepačce (třepání nejčastěji 30 min) nebo na homogenizátoru. Výtěžnost u tohoto typu extrakce je cca 89-96 %. Naproti tomu je extrakce SFE oxidem uhličitým, který je modifikovaný organickým rozpouštědlem, rychlejší a asi čtyřicetkrát účinnější než kapalinová extrakce. Úpravou vzorku před vlastním stanovením se rozumí čištění extraktu. Čištění extraktu je nejpracnější a časově nejnáročnější částí postupu analytického stanovení. Vzorky fumonisinů jsou čištěny jednak na imunoafinitních kolonkách jednak na SPE kolonkách (solid phase extraction) plněných iontoměničem, reverzní fází či imunosorbentem (Voss et.al, 2007).
Imunoafinitní kolonky
SPE kolonky
Obr. 13 Příklady čištění extraktu na kolonkách Extrakce na imunoafinitních kolonkách se v současné době používá častěji a to pro svoji vysokou specificitu, menší spotřebu organických rozpouštědel a menší časovou náročnost. Při čištění na imunoafinitních kolonkách se nechá přefiltrovaný a zředěný extrakt fumonisinů pomalu prokapat imunoafinitní kolonkou. V této fázi dochází k reverznímu specifickému spojení mezi protilátkami v kolonce a mykotoxinem z extraktu. Po promytí kolonky speciálním promývacím pufrem je mykotoxin v procesu desorpce (uvolnění adsorbovaných molekul z povrchu látky) z kolonky vyluhován eluční směsí (nejčastěji methanol, methanol/acetonitril apod.) (Malíř, Ostrý aj., 2003). Klasickou technikou na SPE kolonkách je nejprve extrakt mykotoxinu odpařen na rotační vakuové odparce a obnoven v malém množství rozpouštědla. Po zasáknutí 41
obnoveného extraktu do náplně kolonky je chromatografický sloupec promýván doporučenými elučními soustavami, nejčastěji dvěma. První eluční směsí nebo rozpouštědlem se vymývá část koextračních látek, většinou lipidů a většinou lipidů a mykotoxin zůstává na startu kolonky. Druhou eluční směsí se ze sloupce vymyje mykotoxin (Malíř, Ostrý aj., 2003). Po těchto krocích je vzorek připraven k vlastnímu stanovení. 6.4.2
Metody stanovení Fumonisiny mohou být stanovovány chromatografickými metodami či metodami
imunochemickými. 6.4.2.1 Plynová chromatografie (GC) GC je metoda separační a současně analytická. Umožňuje kvalitativní a kvantitativní analýzu plynných vzorků, popř. veškerých těkavých látek (kapaliny či tuhé látky), pokud je lze před separací převést v páry. Jak již ale bylo zmíněno fumonisiny mají vysokou polaritu a relativně vysokou molekulovou hmotnost (721,8). Jsou proto málo těkavé a pro stanovení plynovou chromatografií málo vhodné. Pro jejich stanovení pomocí GC by bylo nutné zvýšit jejich těkavost derivatizací (Voss et al., 2007). 6.4.2.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokotlaká kapalinová chromatografie (High pressure liquid chromatography) je separační a současně analytická fyzikálněchemická metoda pro separaci a analýzu směsí, jejímž základním principem je rozdělování složek směsi mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fází je v případě HPLC kapalina. Stacionární fází je příslušný film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče nebo na pevný adsorbent (Coufal, 2004). V chromatografii se uplatňují v různé míře vzájemné interakce mezi molekulami stacionární a mobilní fáze a mezi molekulami vzorku. Volbou mobilní a stacionární fáze lze ovlivnit proces separace a tím měnit eluční hodnoty separovaných složek. Mobilní fáze je silně polární a obvykle se jedná o směs vody a polárního organického rozpouštědla např. acetonitrilu, methanolu apod. Kapalinový chromatograf se skládá z částí, které zajišťují transport mobilní fáze, separaci složek, jejich detekci a automatický záznam. Schéma chromatografu je znázorněno na obrázku 14 (Malíř, Ostrý aj., 2003).
42
K separaci fumonisinů se používá především HPLC. A to především HPLC s fluorescenční detekcí nebo hmotnostní detekcí. Fotometrická detekce v UV či viditelné oblasti spektra je u těchto mykotoxinů velmi málo citlivá, což je způsobeno tím, že fumonisiny nemají silný chromofor (=uspořádání atomů v molekulách organických látek, jež způsobuje barevnost sloučeniny). Vzhledem k této jejich vlastnosti zavádí se do molekuly fumonisinů tzv. fluorofor (fluorescenční barvivo) a to reakcí vhodného činidla s aminoskupinou fumonisinů. Takto upravený vzorek je poté běžně detekován na fluorescenčím detektoru (Voss et al., 2007).
Obr. 14 Schéma chromatografu
6.4.2.3 ELISA ELISA (enzym – linked immuno sorbent assay) je analytická metoda využívaná ke stanovení různých antigenů. Metoda je založena na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný nebo fluoreskující. Tento produkt se poté stanovuje spektrometricky nebo fluorometricky. Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul (Prknová, 2006).
43
Při stanovování fumonisinů touto metodou je velkou nevýhodou tzv. křížová reaktivita (crossreactivity), kdy jsou neselektivně stanovovány fumonisiny B1, B2, B3, a není možné je kvantifikovat samostatně. V prodeji jsou sice i selektivnější ELISA kity ovšem za vyšší cenu. Další nevýhodou je i jejich relativně nižší přesnost a nedostatečná linearita. Tato metoda se tedy využívá spíše pro screening či pro prověřování celkového množství obsahu fumonisinů ve vzorku (Voss et al., 2007).
Obr. 15 Schéma průběhu reakce ELISA 6.4.2.4 Ostatní metody stanovení Fumonisiny lze dále stanovit chromatografiií na tenké vrstvě, ovšem tato metoda se používá spíše pro kvantifikaci a screening, nebo kapilární elektroforézou. Kapilární elektroforézou lze stanovit buď nativní fumonisin B1 nebo fumonisiny derivatizované (Voss et al., 2007). Také bylo publikováno použití detektoru rozptýleného světla (ELSD = Evaporative light scattering detector), jenž vykazuje vyšší citlivost než některé jiné detektory
pro
stanovení
metabolitů
a
toxických
produktů
mikroorganismů)
(http://www.hplc.cz/Faq/ELSD.htm)
7
VÝVOJ
METODIKY
PRO
STANOVENÍ
FUMONISINŮ
V KUKUŘICI Cílem bylo zavést novou metodiku pro stanovení fumonisinů z kukuřice. Byla provedena inovace standardních postupů pro stanovení fumonisinů B1 a B2. A to
44
kombinací vysoce účinné extrakce směsí methanol-acetonitril-voda za použití mixéru UltraTurrax a vysokotlaké kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí.
7.1 7.1.1
Materiál a metodika Chemikálie a činidla •
Octan amonný v analytické čistotě
•
Standardní roztok fumonisinů B1 a B2 (koncentrace FB1=50,1 ± 0,7 µg/ml, FB2=50,2 ± 0,7 µg/ml, v roztoku acetonitril/voda 50=50)
•
Rozpouštědla acetonitril a methanol o vysokém stupni čistoty (zakoupena z Sigma-Aldrich, s.r.o., Praha, Česká republika)
•
Deionizovaná voda (přístroj Demiwa ros, Vatek, s.r.o., Česká republika)
Všechny roztoky byly připravovány v deionizované vodě a uskladněny ve tmě při 4ºC, čistý standard fumonisinů v pevném skupenství uchováván při -20 ºC. 7.1.2
Chromatografické vybavení Byl použitý systém HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA) složený z: • vakuového odplyňovacího přístroje (model G1322A) •
kvarterní pumpy (G1311A)
•
autosampleru (G1313A)
•
kvadrupolového
hmotnostního
spektrometru
(G1946VL)
s elektrosprejovou ionizací Pro chromatografické vyhodnocení a řízení chromatografického systému byl použit software ChemStation (Rev. A 10.02). 7.1.3
Extrakce Proces extrakce je založen na modifikaci evropské normy EN 114352:2004
„Potraviny – stanovení fumonisinů B1 a B2 v potravinách s kukuřičným základem – metodou HPLC s imunoafinitní čistící kolonou“ (European Standard EN 114352:2004). Objem 25 ml extračního roztoku (methanol/acetonitril/voda, v poměru 1:1:2) byl přidán k 10 gramům pomletých kukuřičných zrn. Tato směs byla mixována na homogenizátoru Heidolph Diax 900 po dobu dvou minut. K mixování jsme použili třetí rychlostní stupeň mixéru. Vzorek byl centrifugován (Universal 32R, Hettich, Germany) při 4000 ot/min po dobu 5 min a supernatant poté převeden do odměrné baňky o objemu 50 ml.
45
Extrakce pevného zbytku byla provedena ještě dvakrát a to jednou s 20 ml a jednou s 15 ml extrakčního činidla a takto získané spojené extrakty doplněny na 50 ml. Před stanovením na HPLC/MS byl extrakt přefiltrován přes polytetrafluoroethylenový membránový filtr (SMI-LabHut Ltd., UK) s póry o velikosti 0,20 µm. 7.1.4
Analýza pomocí HPLC/MS Separace fumonisinů proběhla na koloně Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6
mm; velikost částic 5µm). Pro optimalizaci složení mobilní fáze byly připraveny následující roztoky: voda, octan amonný (1;2;5 nebo 20 mM, jejichž pH bylo upraveno koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 3). Byla použita lineární gradientová eluce (vymývání fumonisinů). Složení mobilní fáze se v průběhu analýzy měnilo. Na počátku analýzy tvořil podíl acetonitrilu v mobilní fázi 33 %, v osmé minutě pak 60 % a v deváté minutě znovu 33 %. Rychlost průtoku mobilní fáze byla 0,8 ml/min. Po každé analýze pak došlo k promývání kolony po dobu šesti minut mobilní fází o stejném složení jako na počátku separace. Celkový čas nutný pro analýzu, včetně kondicionace kolony činil 20 minut. Dávkovaný objem vzorku byl 5 µl. Všechna měření probíhala v laboratoři při teplotě 20 ºC.
Obr. 16 Chromatografické vybavení 7.1.5
Příprava standardních roztoků a vzorků kukuřice Kalibrační vzorky byly připraveny čerstvé ze zásobního roztoku fumonisinů B1 a
B2 zředěním a smícháním s příslušným množstvím mobilní fáze. Před analýzou
46
uskladněny při 4 ºC na temném místě. Přidáním čistých mykotoxinových standardů do vzorků kukuřice byly připraveny modelové vzorky. Tyto modelové vzorky byly analyzovány jeden den po přídavku mykotoxinů, z důvodu umožnění jejich interakce s matricí.
7.2 Výsledky a diskuze 7.2.1
Optimalizace HPLC/MS Abychom dosáhli co možná nejvyšší citlivosti kvadrupolového hmotnostního
detektoru bylo nutné optimalizovat hodnoty všech parametrů. Nejprve došlo k optimalizování složení mobilní fáze. Při předběžném experimentu jsme zaznamenali pozitivní vliv kyselého roztoku octanu amonného na ionizaci. Efekt koncentrace octanu amonného byl testován na ionizaci a srovnáván s ionizací neutrální mobilní fáze (acetonitril/voda). Přítomnost octanu amonného v mobilní fázi vede ke zvýšení ionizace. Sledovali jsme účinek různých koncentrací octanu amonného. Nejlepší (nejvyšší) hodnoty byly získány při koncentraci octanu amonného 5 mmol/l. S vyšší koncentrací této soli dochází díky vysoké vodivosti aerosolu k výbojům ve sprejovací komoře, které mají za následek sníženou funkci elektrospreje.
Obr. 17 Schématický diagram ESI – MS
47
Regulace rozpadu nabitých sloučenin je možná úpravou kolizního napětí na fragmentoru. Kvadrupólový hmotnostní detektor toto nastavení napětí na fragmentoru umožňuje. Při nízkém napětí se tvoří sloučeniny kvazimolekulárních iontů se sodíkem nebo se složkami mobilní fáze. Nedochází tak ke vzniku jednou nabitých (protonovaných) kvazimolekulárních iontů a to vede ke snížení intenzity molekulárního signálu. Jestliže se tedy zvýší napětí, zvyšuje se i množství protonovaných kvazimolekulárních iontů a klesá množství sloučenin kvazimolekulárních iontů se sodíkem či s mobilní fází. Nejvyšší intenzity molekulového píku bylo dosaženo při napětí 300 V. Se zvýšením napětí nad tuto hodnotu se signál snižuje. Důvodem ke snižování signálu již není tvorba zmíněných sloučenin se sodíkem (či s mobilní fází) nýbrž fragmentace protonovaných kvazimolekulárních iontů. Závislost intenzity signálu na napětí kapiláry elektrospreje má hyperbolický tvar. Maximální napětí jaké jsme sledovali mělo hodnotu 6000 V. Na ionizaci naopak neměl téměř žádný vliv tlak nebulizéru (rozprašovače). Důležitým se však stalo stanovení správného tlaku dusíku jako sušícího plynu. Při nízkém tlaku dusíku se začaly vyskytovat problémy s nedostatečným odpařováním mobilní fáze, díky jejímu relativně vysokému průtoku (0,8 ml/min) a vysokému obsahu vody. Proto se jako optimální zdál a byl vybrán nejvyšší možný tlak – 60 psig. K parametrům jejichž hodnoty byly optimalizovány, patří i průtok sušícího v nebulizéru (rozprašovač, zmlžovač). Při rychlosti průtoku sušícího plynu 12 l/min byla ionizace asi o 20 % vyšší než u průtoků, které takovéto rychlosti nedosahovali. Což bylo opět přisuzováno účinnějšímu odpařování nadbytku mobilní fáze. Protože jsou fumonisiny poměrně termostabilní látky (bod tání 103-105 ºC ), mohla se použít vysoká teplota sušícího plynu. Při hledání nejvýhodnější teploty se testovalo rozmezí teplot od 150 ºC do 350 ºC. Nižší teploty, respektive teploty pod 200 ºC, znesnadňují ionizaci, protože vysoká vlhkost aerosolu způsobuje výboje. Nejlépe docházelo k ionizaci při teplotě 350 ºC. Problémem tedy byla vysoká rychlost průtoku mobilní fáze a relativně nízký obsah organického rozpouštědla v ní. Na druhou stranu, bylo při optimalizaci dosaženo kompromisu mezi dobou trvání analýzy a ionizací.
48
Graf 1 Optimalizace napětí na fragmentoru
Graf 2 Optimalizace napětí na kapiláře
Graf 3 Optimalizace průtoku plynu ve zmlžovači (nebulizéru)
49
Graf 4 Optimalizace tlaku plynu ve zmlžovači
Lze říci, že vyvinutá metoda je v porovnání s využitím metody s fluorescenční detekcí rychlejší, protože není třeba před stanovením provádět derivatizaci. Metodu lze aplikovat na vzorky potravin bez potřebné prekoncentrace. Je to dáno detekčními limity pro fumonisin B1 a B2. Vyvinutá metoda byla poté použita ke stanovení fumonisinů v několika různých vzorcích mletých zrn kukuřice (kukuřičná mouka). Obsah mykotoxinů v těchto vzorcích byl v rozmezí < LOD – 10,878 mg FB1/kg a < LOD – 2,114 mg FB2/kg. U všech vzorků, které byly pozitivní, byl stanovený obsah FB1 vyšší než FB2. Toto zjištění se shoduje s výsledky rozborů vzorků přirozeně kontaminovaných plísní Fusarium moniliforme (syn = F. verticillioides (Saccardo)), kde obsah FB1 tvořil 70-80 % a FB2 15-25 % z celkového množství fumonisinů (Magan, Olsen, 2004). 7.2.2
Výsledky optimalizace MS Nejprve bylo potřeba nalézt nejlepší podmínky pro separaci a ionizaci
fumonisinů. Optimalizace separace bylo dosaženo především úpravami mobilní fáze. Sledované parametry hmotnostního detektoru a rozsah jejich hodnot: •
průtok plynu v nebulizéru (5 – 13 l/min, interval změny 1 l/min)
•
tlak nebulizéru (20 – 60 psig, interval 5 psig)
•
teplota sušícího plynu (150 – 350 ºC, interval 50 ºC)
•
napětí na kapiláře (1000 – 6000 V, interval 500 V)
50
•
napětí na fragmentoru (0 – 400 V, interval 25 V)
K optimalizaci hodnot jednotlivých parametrů došlo při detekci pozitivních iontů s použitím ESI/MS. Fumonisin B1 byl zjišťován jako [FB1 + H+] (722,4 m/z) a fumonisin B2 jako [FB2 + H+] (706,4 m/z). Fragmenty m/z 334 a 352 pro FB1 a m/z 336 a 318 pro FB2 pak byly využity pro ověření. Optimalizace byla prováděna FIA analýzou (flow injection analysis) s roztoky standardů o různé koncentraci. Nejvhodnější nastavení ESI/MS detektoru bylo tedy takovéto: tlak nebulizéru 60 psig, průtok plynu v nebulizéru 12 l/min, teplota sušícího plynu 350 ºC, napětí na kapiláře 6000 V a napětí na fragmentoru 300 V. Pro přehlednost jsou parametry nastavení shrnuty v tabulce č. 7. Výsledné parametry hmotnostního detektoru jsme porovnali s jinými autory a pro srovnání jsou uvedeny v tabulce č. 8. Tab. 7 Parametry hmotnostního detektoru Optimální Parametr hodnota
Rozmezí hodnot
Jednotky
12
5 – 13
l/min
60 (414)
20-60 (138 – 414)
psig (kPa)
Napětí na kapiláře elektrospreje
6000
1000 – 6000
V
Teplota sušícího plynu
350
150 – 350
ºC
Napětí na fragmentoru
300
0 – 400
V
Průtok sušícího plynu Tlak nebulizéru
Tab. 8 Srovnání parametrů hmotnostního detektoru s jinými autory Labuda Silva Parametr (2005) (2009)
Richard (2008)
Průtok sušícího plyn [l/min]
9
13
12
Tlak nebulizéru [kPa]
35
30
35
Napětí na kapiláře elektrospreje [V]
3000
4000
3000
Teplota sušícího plynu [ºC]
350
350
350
Napětí na fragmentoru [V]
160 – 240 FB1
140
-
280 FB2 7.2.3
Vliv octanu amonného Pro zlepšení ionizace fumonisinů byl použit přídavek octanu amonného do
mobilní fáze. Připravili jsme pět testovacích roztoků. Prvním roztokem byla čistá deionizovaná voda. Zbývající čtyři roztoky byly roztoky octanu amonného o různých
51
koncentracích (1; 2; 5 a 20 mmol/l). U těchto roztoků octanu amonného jsme pomocí koncentrované kyseliny octové upravili pH na hodnotu 3. Nejlepších výsledků bylo dosaženo po aplikaci 5 mmol/l octanu amonného. Chromatogram čistého standardu znázorňuje graf č. 1.
Graf 5 Chromatogram čistého standardu za optimálních podmínek
7.2.4
Kalibrační křivka pro čistý standard – linearita a limit detekce/kvantifikace V rozmezí koncentrací od 5µg/ml do 0,005 µg/ml (což koresponduje
s koncentrací 25 000 – 25 µg/kg) vykazuje vyvinutá metoda velmi dobrou linearitu. Mimo linearitu byl také sledován poměr mezi molekulárními ionty fragmenty molekul fumonisinů. Limit detekce (3x pomět signál/šum) je pro FB1 0,0124 µg/ml (62,0 µg/kg) a pro FB2 0,0117 µg/ml (58,5 µg/kg). Limit kvantifikace (rovná se desetinásobku poměru signál/šum) je pro FB1 0,041 µg/ml (202,7 µg/kg) a pro FB2 0,040 µg/ml (199,1 µg/kg) (uvedeno v tabulce č. 9).
Tab. 9 Kvantifikace FB1 a FB2 s limitem detekce, limitem kvantifikace, relativní směrodatnou odchylkou (RSD) a parametry kalibrační křivky Fumon. LOD LOQ RSD r2 Kalibrač. křivka µg/ml
µg/kg µg/ml
µg/kg
(%; n=6)
FB1
0,0124
62,0
0,041
202,7
1,95
0,9997
Y=43937x-390,08
FB2
0,0117
58,5
0,040
199,1
2,04
0,9997
Y=44927x-399,95
52
Graf 6 Kalibrační křivka
7.2.5
Extrakce Při vývoji této metodiky jsme se snažili dosáhnout při extrakci co nejvyšší
výtěžnosti mykotoxinů. V metodice jež doporučuje ČSN a Evropská norma je užito dvoukrokové extrakce na orbitální třepačce. Při každém kroku této extrakce dochází ke třepání po dobu 20 minut. Při tomto postupu je uváděna výtěžnost fumonisinů B1 a B2 75,6 resp. 72 %. Při našem způsobu extrakce jsme použili ponorný mixér (homogenizátor) ultraturrax a vzorky kukuřice byly postupně extrahovány ve třech krocích s 25, 20 a 15 ml extrakční směsi. Každý krok trval 5 minut. Při této podobě extrakce dosahovala výtěžnost v naspikovaném (tzn. vzorek kukuřice + standard FB1 a FB2) materiálu 94,7 – 100,6 % pro FB1 a 93,9 – 99,6 % pro FB2. Přidáním ještě jednoho kroku extrakce nedošlo k výraznému zvýšení výtěžnosti. Tříkrokové postup jsme tedy shledali jako dostačující. Námi vyvinutá metoda je tedy značně rychlejší a dosažená výtěžnost je vyšší než u metodiky uvedené v ČSN a v Evropské normě, což je dáno použitím invazivnějšího způsobu extrakce. Výtěžnost metody jsme prověřovali pomocí materiálu po přídavku čistého standardu. Tyto uměle kontaminované vzorky obsahovaly podlimitní, limitní a nadlimitní množství mykotoxinů. Výtěžnost byla velmi podobná na všech koncentračních hladinách.
53
Můžeme říci, že výtěžnost naší optimalizované metody je vysoká a to i v porovnání s jinými již validovanými metodami, u kterých se výtěžnost pohybuje velmi často v rozmezí 50 – 105 %. 7.2.6
Vývoj extrakce K monitorování výtěžnosti fumonisinů během jednotlivých kroků extrakce jsme
použili vzorky rozemleté kukuřice s přídavkem čistého standardu fumonisinů. Koncentrace fumonisinů v těchto vzorcích se pohybovala pod, nad a na úrovni maximálních limitů stanovených příslušnou legislativou (tzn. 100, 5000 a 2000 µg/kg). Postupně byl vyhodnocován každý vzorek zvlášť a každé stanovení bylo prováděno v pěti opakováních. V tabulce 10 jsou uvedeny hodnoty výtěžnosti naměřené během čtyř extrakčních kroků. Vzhledem k výsledkům shledali jsme, že třístupňový postup extrakce je optimální pro stanovení fumonisinů ve vzorcích kukuřice.
Tab. 10 Výtěžnost fumonisinů během extrakce Extr. 100 µg/kg 2000 µg/kg Krok
5000 µg/kg
FB1 [%]
FB2 [%]
FB1 [%]
FB2 [%]
FB1 [%]
FB2 [%]
1
61,1 ± 2,0
53,5 ± 1,9
62,7 ± 1,5
56,9 ± 0,7
63,2 ± 1,6
56,2 ± 1,7
2
88,1 ± 2,1
83,3 ± 1,8
91,2 ± 1,8
85,0 ± 1,7
91,7 ± 1,7
88,3 ± 1,8
3
94,7 ± 2,2
93,9 ± 2,1 100,0 ± 1,9
95,3 ± 1,8
100,6 ± 1,8
99,6 ± 2,3
4
98,2 ± 2,2
96,4 ± 2,4 102,2 ± 2,2
99,0 ± 2,3
102,9 ± 2,1 101,0 ± 2,3
Ultraturrax
Třepačka Obr. 18 Postupy extrakce
V porovnání s postupem doporučeným v ES (Evropský standard) je přesnost vyvinuté metody přibližně čtyřikrát vyšší. To může být způsobeno rozdílným použitím nástrojů pro extrakci. Zatímco ES doporučuje extrakci na orbitální třepačce po dobu 20
54
minut, my jsme použili ponorný mixér ultraturrax po dobu 5 minut. Tento námi použitý postup byl publikován již dříve. Avšak jak se ukázalo během evropského mezilaboratorního porovnávání metod pro stanovení fumonisinů, byla pro extrakci těchto mykotoxinů více užívána orbitální třepačka než mixování, které poskytovalo výsledky s vyšší směrodatnou odchylkou (Visconti et al., 1996). V našem případě však žádné výraznější rozdíly mezi metodami, co se směrodatné odchylky týče, nebyly pozorovány. 7.2.7
Správnost, přesnost a výtěžnost metody U této metody jsme hodnotili její správnost, přesnost a výtěžnost stanovením
s reálnými spikovanými vzorky, které byly upraveny vhodným množstvím standardu na koncentraci mezi 100 a 5000 µg/kg . Variační koeficienty inter-day (5 dní) a intra-day byly stanoveny analýzou 6 spikovaných vzorků. Každý den byla měřena kalibrační křivka a koncentrace analytů byla vypočtena z této křivky. Správnost byla posuzována porovnáním změřených koncentrací se známou koncentrací fumonisinů (viz Tab. č. 11).
Tab. 11 Přesnost a výtěžnost při stanovení FB1 a FB2 ve vzorcích kukuřice (n=5) Látka Koncentrace látky [µg/kg] Naměřeno Výtěžnost Kukuřice FB1
Intra-day (n=5)
FB1
FB2
FB2
Inter-day (n=25)
[%]
101,2 ± 2,3
594,0 ± 18,9
101,3
2558,4 ± 59,6
102,4
5092,3 ± 142,5 5728,1 ± 144,5
102,7
107,3 ± 3,9
600,5 ± 23,2
100,2
2518,0 ± 69,2
101,2
492,5 ± 21,4 1995,6 ± 71,3
Intra-day (n=5)
[µg/kg]
485,2 ± 17,5 2013,2 ± 62,3
Inter-day (n=25)
Spike vzorek
263,6 ± 8,4
5021,2 ± 159,3 5563,3 ± 159,2
100,9
102,1 ± 3,2
358,9 ± 15,9
98,3
2024,0 ± 58,9
2239,6 ± 67,5
97,9
5008,3 ± 104,2 5177,0 ± 162,3
98,2
99,7 ± 3,9
352,8 ± 29,2
98,1
2339,2 ± 79,5
99,3
259,9 ± 11,3 2079,3 ± 67,9
5052,4 ± 122,3 5264,5 ± 173,1
55
99,1
7.2.8
FAPAS – kruhový test Závěrem
byla
správnost
metody
ověřena
evropským
mezilaboratorním
porovnávacím testem (kruhovým testem) organizovaným Central Science Laboratory (Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, UK). Tato organizace organizuje největší a nejobsáhlejší schéma testování analytických laboratoří v potravinovém sektoru – FAPAS (food analysis performance assessment scheme). Více než 2500 laboratoří z 90 zemí celého světa má možnost ověřit si své laboratorní metody na širokém spektru matricí a analytů (nutriční komponenty, potravinové složky, přírodní, organické a anorganické kontaminanty, pesticidy, veterinární léčiva, aditiva, alergeny apod.). FAPAS zachovává naprostou důvěrnost informací. Pro porovnání jsou ve zprávách k dispozici anonymní výsledky účastnících se laboratoří. Pro usnadnění práce poskytuje FAPAS účastnícím se laboratořím poradenství v případě nevyhovujících výsledků kruhových testů.
Obr. 19 Kruhový test – testovaný vzorek kukuřice Zaslaný testovací vzorek kukuřice jsme zanalyzovali a naměřené výsledky jsme odeslali k hodnocení. Ty byly shledány jako správné a pohybovali se v přípustné toleranci. Můžeme tedy říci, že na naše metoda pro stanovení fumonisinů v kukuřičném materiálu je správná (Šuška, 2007). Proto byla vyvinutá metoda následně použita i pro rutinní stanovení fumonisinů v kukuřici.
56
7.3 Analýza reálných vzorků kukuřice Vyvinutou metodu jsme ověřili analýzou reálných vzorků tzn., že jsme pro stanovení použili výše uvedené chemikálie a dodrželi popsanou metodu s trojkrokovým postupem extrakce a chromatografické vybavení systém HP 1100 s optimalizovanými parametry. K analýze byly využity vzorky kukuřice, které poskytli následující firmy: Horákova farma, a.s. Čejč, Agrodružstvo Morkovice, stř. Litenčice, Agro Vyšehořovice a.s. a zemědělské družstvo Unčovice. Tab. 12 Specifikace vzorků Č. MT Firma
Oblast
Hybrid
762
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
PR38V12
763
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
Anasta
764
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
Sparta
765
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
PR38A24
766
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
PR38H20
767
Horákova farma a.s.
Čejč 3
Kukuřičná
PR37D25
768
Unčovice
Řepařská – morav.
PR38H20
769
Unčovice
Řepařská – morav.
PR38A24
770
Unčovice
Řepařská – morav.
PR38V12
771
Unčovice
Řepařská – morav.
PR37D25
772
Unčovice
Řepařská – morav.
Sparta
773
Unčovice
Řepařská – morav.
Anasta
858
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
PR38H20
859
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
Anasta
860
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
PR37D25
861
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
Sparta
862
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
PR38A24
863
Agrodružstvo Morkovice
Sokolovská
Suchá řepařská
PR38V12
964
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
PR39D82
965
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
PR39F56
966
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
PR38F71
967
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
PR39D81
968
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
PR39F58
969
Agro Vyšehořovice a.s.
Mochov
Řepařská – česká
Benicia
57
V tabulce č. 12 jsou blíže specifikovány použité vzorky, je zde uvedeno číslo materiálu, výrobní oblast, název hybridu a samozřejmě firma. 7.3.1
Charakteristika jednotlivých hybridů K analýze byli použity různé hybridy kukuřice.
Hybrid PR38V12 Jedná se o výkonný hybrid určený na siláž i na zrno s typem zrna mezityp až zub. Je velmi dobrý staygreen a hodí se i pro výrobu bioplynu. Doporučuje se pěstovat v ŘVO (Řepařská výrobní oblast) a KVO (Kukuřičná výrobní oblast). Hybrid Anasta Velmi výnosný intenzivní hybrid, náročný na kvalitu půdy a úroveň agrotechniky. Jde o univerzální středně raný hybrid odolný proti přísuškům. Oblast pěstování je lepší řepařská a kukuřičná. Hybrid Suarta Tento dvouliniový hybrid se řadí k středně pozdnímu sortimentu (určeno dle vlhkosti zrna při sklizni). Typ zrna u tohoto hybridu je mezityp až koňský zub. Hybrid PR38A24 Univerzální hybrid s vysokým výnosem siláže i zrna. Typ zrna opět mezityp až zub. Je určený pro pěstování v intenzivní kukuřičné oblasti na siláž i na zrno. Vyznačuje se rychlým uvolňováním vody ze zrna a dobrou odolností vůči suchu. Vyžaduje kvalitní půdy. Hybrid PR38H20 Určený jak na siláž tak na zrno s typem zrna zub. Vynikající v intenzivní řepařské oblasti. Jedná se o dobrý staygreen, lze ho využít i k výrobě bioplynu. Uvolňování vody ze zrna je pozvolné a odolnost proti suchu je rovněž dobrá. Hybrid PR37D25 Je vyhrazen pro pěstování v kukuřičné výrobní oblasti. Řadí se spíše mezi středně pozdní hybridy s typem zrna mezityp až zub. Poskytuje vynikající výnos silážní hmotya velmi dobrý výnos zrna. Přednostně je určen k pěstování na siláž. Právě vysoké výnosy silážní hmoty tohoto hybridu jsou důvodem k jeho využívání jako levného zdroje biomasy pro výrobu bioplynu (http://www.pioneercz.cz/). Hybrid PR39D82 Tento hybrid se pěstuje především na zrno (nejlepší na suché zrno) v bramborářské a řepařské oblasti s typem zrna zub. Vyznačuje se zvýšenou odolností
58
proti zavíječi kukuřičnému. Pozitivem je výjimečně rychlé uvolňování vody ze zrna a velmi dobrá odolnost proti suchu. Hybrid PR39F56 Často označován jako univerzální top hybrid. Typ zrna mezityp až zub. Vymezen pro řepařskou výrobní oblast. Pro tento hybrid je typický vynikající výnos zrna a vysoká kvalita silážní hmoty. Opět odolný vůči zavíječi kukuřičnému. Výrobce udává, že u příslušného hybridu je výrazně nižší výskyt hniloby palic a mykotoxinů. Lze taktéž využít pro výrobu bioplynu a ethanolu. Hybrid PR38F71 Prověřený intenzivní silážní hybrid pro řepařskou a kukuřičnou výrobní oblast s typem zrna tvrdý až mezityp. Velmi dobrý staygreen s vysokým výnosem siláže. A stejně jako předchozí odolný proti zavíječi kukuřičnému. Hybrid PR39F58 Druhý nejvýnosnější zrnový hybrid raného sortimentu s typem zrna mezityp až zub. Jde o špičkový hybrid na siláž. Vysoká kvalita silážní hmoty (vysoký obsah škrobu a dobrá stravitelnost) vybízí k využití tohoto hybridu na výrobu bioplynu a ethanolu. Hybrid Benicia Od tohoto hybridu je odvozen hybrid PR38F71. Oba mají vysoký výnosový potenciál a jsou charakteristické zvýšeným obsahem škrobu. Tím se řadí mezi hybridy, které lze bez problému použít pro výrobu bioplynu (http://www.pioneercz.cz/). 7.3.2
Výsledky měření reálných vzorků Výsledky měření vzorků kukuřice námi vyvinutou metodou jsou shrnuty v tabulce
č. 13. Spolu s těmito výsledky jsou zde uvedeny pro porovnání i výsledky jakých jsme dosáhli metodou ELISA. Důležité je podotknout, že metodou ELISA nelze stanovit jednotlivé fumonisiny, výsledkem je tedy celkový obsah fumonisinů. Limit detekce pro metodu ELISA, kterou jsme použili byl 0,2 mg/kg. Korelace ELISA s HPLC je 0,934. Srovnání mezi výsledky metody ELISA a HPLC je v následujícím grafu (č. 7). Tab. 13 Měření reálných vzorků Č. vz. Č. MT FB1 [mg/kg] FB2 [mg/kg] FB1 +FB2 [mg/kg]
ELISA
1
762
5,967
2,114
8,081
9,375
2
763
1,101
0,411
1,512
1,237
3
764
8,154
3,767
11,921
9,291
4
765
6,816
2,378
9,194
8,687
59
5
766
4,608
1,551
6,159
7,144
6
767
10,878
4,000
14,878
(21,935)
7
768
4,186
1,605
5,791
7,190
8
769
1,349
0,543
1,892
2,465
9
770
3,490
1,565
5,055
7,381
10
771
3,654
1,599
5,253
8,675
11
772
1,585
0,594
2,179
1,562
12
773
0,485
0,263
0,748
0,381
13
858
1,093
0,421
1,514
1,278
14
859
0,445
0,236
0,681
ND
15
860
2,848
1,240
4,088
2,831
16
861
0,356
0,219
0,575
ND
17
862
0,370
0,190
0,560
ND
18
863
0,549
0,261
0,810
0,726
19
964
ND
0,180
0,180
ND
20
965
ND
0,201
0,201
ND
21
966
ND
0,168
0,168
ND
22
967
0,360
0,287
0,647
0,709
23
968
ND
0,181
0,181
ND
Graf 7 Porovnání ELISA a HPLC 25 FB1+FB2 (HPLC)
20
ELISA (FUM total)
15 10 5 0 0 FUM (mg/kg)
5
10
15
60
20
25
8
ZÁVĚR Byla vyvinuta nová citlivá analytická metoda pro stanovení fumonisinů ve
vzorcích kukuřice. Došlo ke srovnání dvou procesů extrakce, extrakce na orbitální třepačce a extrakce s použitím ponorného homogenizátoru (mixéru) Ultraturrax. Při aplikaci
extrakční
metody
využívající
trojité
extrakce
s roztokem
acetonitril/methanol/voda za použití ponorného homogenizátoru Ultraturrax bylo dosaženo významně vyšší výtěžnosti než při užití extrakce na orbitální třepačce. V testovaném rozsahu koncentrací (vybrán okolo EU limitů) byla výtěžnost vyvinuté extrakční metody 96,4 – 102,9 %. Výběr kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí vedl ke zjednodušení postupu stanovení, protože nebylo nutné zařadit krok derivatizace, který je jinak nezbytný. Se zjištěnými limity detekce 62 µg FB1/kg a 58 µg FB2/kg v kukuřičných zrnech, které jsou výrazně pod maximálními limity jaké dovoluje EU, je metoda vhodná pro stanovení fumonisinů v mletých kukuřičných zrnech. Uvedená metoda byla optimalizována, validována a úspěšně použita pro analýzu jak referenčních materiálů (FAPAS), tak reálných vzorků. Výhodou vyvinuté metodiky oproti jiným, například ELISA, je tedy vysoká účinnost extrakce fumonisinů ze vzorku a především selektivní stanovení jednotlivých fumonisinů vedle sebe. Metoda také splňuje parametry, které jsou požadovány nařízeními Evropské komise.
61
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
BÖHM, J. Mykotoxiny v krmivech a jejich vliv na zdraví zvířat in Sborník vědeckých prací z mezinárodního symposia Konzervace objemových krmiv, Brno: VFU Brno, 2006, ISBN 80-7305-555-4.
Commision Decision 2002/657/EC: Commision Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (notified under document number C (2002) 3044). Official Journal L 221, 17/08/2002 P. 0008 – 0036.
COUFAL, P. High Performance Liguid Chromatography, HPLC. [online] Publikované 28.7.2004. [citované 6.3.2009] Dostupné z: http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html.
DABROWSKI, W. M., SIKORSKI, Z. E. Toxins in Food. London: CRC Press, 2005, 355 s.
Doporučení komise (ES) č. 576/2006 ze dne 17. srpna 2006 o přítomnosti deoxynivalenolu, zearalenonu, ochratoxinu A, T-2 a HT-2 a fumonisinů v produktech určených ke krmení zvířat
ELSD – detektor [online] poslední změna 15.4.2009 [citované 20.4.2009] Dostupné z: http://www.hplc.cz/Faq/ELSD.htm.
European Standard EN 114352:2004 „Foodstuffs – Determination of fumonisin B1 and B2 in maize based food – HPLC method with immunoaffinity column clean up“, Czech normalization institute, 2004.
HRDINA, V., JAHODÁŘ, L., MARTINEC, Z. a kol. Přírodní toxiny a jedy. Praha: Karolinum, 2004. s. 302. ISBN 80-246-0823-5.
HRUBÝ, J., BADALÍKOVÁ, B., NEDĚLNÍK, J. Kukuřice. Agromagazín. rok 2005, č. 1, ISSN 1214-0643.
62
CHLOUPEK, O.,PROCHÁZKOVÁ, B., HRUDOVÁ, E. Pěstování a kvalita rostlin. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, 2005. ISBN 80-7157-897-5.
KOMPRDA, T. Obecná hygiena potravin. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2004. 146 s. ediční středisko MZLU v Brně. ISBN 80-7157-757-X.
KUBÍČEK, J. Geneticky modifikovaná kukuřice v ČR, důvody pro pěstování a možnosti jejího využití. Zlín, 2008. Diplomová práce na Technologické fakultě Univerzity Tomáše Bati. Vedoucí diplomové práce Karel Říha.
LABUDA, R., PARICH, A., VEKIRU, E., TANČINOVÁ, D. Incidence of fumonisins, moniliformin and Fusarium species in poultry feed mixtures from Slovakia. Ann Agric Environ Med., 2005, vol. 12, p. 81-96
MAGAN, N., OLSEN, M. (ed.). Mycotoxins in food: Detection and control. Woodhead publishing limited, Cambridge, England, 2004. ISBN 1-85573-733-7.
MALÍŘ, F., OSTRÝ, V. a kol. Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1. vyd. Brno: Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, 2003. 349 s. Mikada. ISBN 80-7013-395-3.
MORGAVI, D. P., RILEY, R. T. An historical overview of field disease outbreaks known or suspected to be caused by consumption of feeds contaminated with Fusarium toxins. ScienceDirect. Animal Feed Science and Technology., 2007, 201-212.
Nařízení komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách
Nařízení komise (ES) č. 1126/2007 ze dne 28. září 2007, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o fusariové toxiny v kukuřici a ve výrobcích z kukuřice
NEDĚLNÍK, J., BÁCOVÁ, J. Kontaminace kukuřice mykotoxiny. Farmář. říjen 2000, roč. 6, č. 10, ISSN 1210-9789. 63
NEDĚLNÍK, J., MORAVCOVÁ, H. Mykotoxiny a pícniny in Sborník vědeckých prací z mezinárodního symposia Konzervace objemných krmiv, Brno: VFU Brno, 2006, ISBN 80-7305-555-4.
NEDĚLNÍK, J., MORAVCOVÁ, H. Problematika výskytu mykotoxinů v krmivech pro dojnice. Vetweb [online]. 2005, roč. 55, s. 214-219 [citované 20.4.2009] Dostupné z: http://www.vetweb.cz/projekt/clanek.asp?cid=3595&pid=2. ISSN 1214-7648
OSTRÝ, V. Plísně a potravin – 1. část. Potravinářská Revue. únor 2006, roč. 3, č. 1, ISSN 1801-9102.
OSTRÝ, V. Plísně a potraviny – 2. část. Potravinářská Revue. květen 2006, roč. 3, č. 2, ISSN 1801-9102.
OSTRÝ, V., ŠKARKOVÁ, J., RUPRICH, J. The Mycotoxin Research in Food-stuffs in the Czech Republic in the 90th Years. Mycotoxin Research. 2001.
PIONEER A Dupont Company. Dostupné z: http://pioneercz.cz/.
POHANKA, M. Aflatoxiny [online] Publikované 2008 Centrum pokročilých studií, fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany. [citované 6.3.2009] Dostupné z: http://www.toxicology.cz/modules.php?name=News&file=article&sid=177.
PRKNOVÁ, P. Metody molekulární biologie. [online] katedra biologie, fakulta pedagogická,
Západočeská
univerzita.
[citované
6.3.2009]
Dostupné
z:
http://www.kbi.zcu.cz/studium/ftp/mobi10.pdf.
REID, L. M., NICOL, R. W., OUELLET, T. a kol. Interaction of Fusarium graminearum, F. moniliforme in Maize Ears: Disease Progress, Fungal biomass, and Mycotoxin Accumulation. The American Phytopatology Society. Publication no. P1999-0913-02R.
64
RICHARD, J. L. Some major mycotoxins and thein mycotoxicoses – An overview. International Journal of Food Mikrobiology. 2007, 0168-1605.
RICHARD, E., HEUTTE, N., BOUCHART, V., GARON, D. Evaluation of fungal contamination and mycotoxin production in maize silage. Animal Feed Science and Technology., 2008, [in press].
RUPRICH, J., OSTRÝ, V. The Occurrence of Fumonisins in Corn-based Commodities in the Czech republic. Czech J. Food Sci. 1998, roč. 16, č. 4. Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2002/32/ES ze dne 7. května 2002 o nežádoucích látkách v krmivech
SILVA, L., FERNÁNDEZ-FRAZÓN, M.,FONT, G., PENA, A., SILVERIA, I., LINO, C., MANES, J. Analysis of fumonisins in corn-based food by liquid chromatography with fluorescence and mass spectromectry detectors. Food Chemistry., 2009, vol. 112, issue 4, p. 1031-1037
SORIANO, J. M., DRAGACCI, S. Occurrence of fumonisins in foods. Food Research International 37, 2004, p. 985-1000.
ŠIMŮNEK, J. Plísně a mykotoxiny. [online] Publikované 2004 [citované 6.3.2009] Dostupné z: http://www.med.muni.cz//dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf.
ŠIMŮNEK, J. Mykotoxiny. [online] Publikované 2003 [citované 1.2.2009] Dostupné z: http://www.med.muni.cz/prelek/MYKOTW/mtidx.htm.
ŠUŠKA, P. Kruhové testy FAPAS, FEPAS, GeMMA a LEAP [online] Publikované 2007 [citované 10. 3. 2009] Dostupné z: http://www.qualifood.cz/sluzby_2.php.
ZEDNÍKOVÁ,
M.,
CHMELÍKOVÁ,
E.
Když
plísně škodí
–
mykotoxiny
v zemědělských plodinách. Agromagazín. listopad 2006, roč. 7, č. 11, ISSN 1214-0643.
65
ZEMAN, L., DOLEŽAL, P., SKLÁDANKA, J. Vliv mykotoxinů na zdraví a plodnost hospodářských zvířat in Sborník přednášek z mezinárodního semináře Kukuřice v praxi 2006, Brno: MZLU v Brně a KWS Osiva s.r.o., 2006, ISBN 80-7157-922-X.
UENO, Y. Toxikology of mycotoxins. CRC Crit. Rev. Toxicko., 14 (2) 1985, 99- 132
VACKOVÁ, M. T-2 toxin a jeho možné zneužití. [online] katedra epidemiologie, fakulta
vojenského
zdravotnictví
UO.
[citované
6.3.2009]
Dostupné
z:
http://www.pmfhk.cz/Prednasky/prednasky.htm..
VELÍŠEK, J. Chemie potravin 3. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 368 s. Tiskárny Havlíčkův Brod, a.s. ISBN 80-86659-02-X.
VISCONTI, A., BOENKE, A., SOLFRIZZO, M., PASCALE, M., DOKO, M. B. European intercomparison study for the determination of the fumonisins kontent in two maize materiále. Food Additives and Contaminants., 1996, vol. 13, issue 8.
VOSS, K. A., SMITH G. W., HASCHEK W. M. Fumonisins: Toxicokinetics, mechanism of action and toxicity. Science Direct. Animal Feed Science and Technology., 2007, 137, 2007, 299-325.
66
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 1 Aspergillus flavus ................................................................................................ 18 Obr. 2 Aspergillus ochraceus.......................................................................................... 19 Obr. 3 Chemická struktura ochratoxinu A, B a C........................................................... 20 Obr. 4 Penicillium expansum.......................................................................................... 21 Obr. 5 Mikroskopické znaky – rod Fusarium ................................................................. 23 Obr. 6 Fusarium moniliforme (syn.= F. verticillioides (Saccardo)) .............................. 25 Obr. 7 Fusarium graminearum....................................................................................... 29 Obr. 8 Fumonisin B1 ....................................................................................................... 33 Obr. 9 Fumonisin B2 ....................................................................................................... 33 Obr. 10 Sfinganin............................................................................................................ 34 Obr. 11 Sfingosin ............................................................................................................ 34 Obr.12 Schéma metanol. sfingolipidů ukazující inhibici ceramidsyntázy fumonisiny.... 34 Obr. 13 Příklady čištění extraktu na kolonkách ............................................................. 41 Obr. 14 Schéma chromatografu...................................................................................... 43 Obr. 15 Schéma průběhu reakce ELISA ......................................................................... 44 Obr. 16 Chromatografické vybavení............................................................................... 46 Obr. 17 Schématický diagram ESI – MS......................................................................... 47 Obr. 18 Postupy extrakce................................................................................................ 54 Obr. 19 Kruhový test – testovaný vzorek kukuřice.......................................................... 56
67
SEZNAM TABULEK
Tab. 1 Členění mykotoxinů podle způsobu jejich biosyntézy (Malíř, Ostrý aj., 2003) ... 14 Tab. 2 Členění mykotoxinů podle chemické struktury .................................................... 15 Tab. 3 Dělení mykotoxinů podle toxicity – kvalitativní .................................................. 15 Tab. 4 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v letech 2007 – 2008 ....................................................................................................... 38 Tab. 5 Alert notification (týkající se fumonisinů) členských států EU hlášená v RASFF v roce 2006...................................................................................................................... 39 Tab. 6 Maximální limity fumonisinů v potravinách kukuřičného původu ...................... 40 Tab. 7 Parametry hmotnostního detektoru ..................................................................... 51 Tab. 8 Srovnání parametrů hmotnostního detektoru s jinými autory ............................. 51 Tab. 9 Kvantifikace FB1 a FB2 s limitem detekce, limitem kvantifikace, relativní směrodatnou odchylkou (RSD) a parametry kalibrační křivky ...................................... 52 Tab. 10 Výtěžnost fumonisinů během extrakce ............................................................... 54 Tab. 11 Přesnost a výtěžnost při stanovení FB1 a FB2 ve vzorcích kukuřice (n=5)....... 55 Tab. 12 Specifikace vzorků ............................................................................................. 57 Tab. 13 Měření reálných vzorků ..................................................................................... 59
68
SEZNAM GRAFŮ
Graf 1 Optimalizace napětí na fragmentoru................................................................... 49 Graf 2 Optimalizace napětí na kapiláře ......................................................................... 49 Graf 3 Optimalizace průtoku plynu ve zmlžovači (nebulizéru)....................................... 49 Graf 4 Optimalizace tlaku plynu ve zmlžovači................................................................ 50 Graf 5 Chromatogram čistého standardu za optimálních podmínek.............................. 52 Graf 6 Kalibrační křivka................................................................................................. 53 Graf 7 Porovnání ELISA a HPLC................................................................................... 60
69
