Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Monitoring fenolických sloučenin ve víně Diplomová práce
Vedoucí práce: prof. RNDr. Bořivoj Klejdus, Ph.D.
Brno 2013
Vypracovala: Eva Vosynková
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Monitoring fenolických sloučenin ve víně“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne…………………………… podpis…………………………
PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla poděkovat prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi, Ph.D. za vzorné vedení mé diplomové práce, odborné rady a metodické vedení a především za věnovaný čas a ochotu v průběhu řešení práce. Děkuji také panu Jaroslavu Tichému za poskytnuté vzorky vín.
ABSTRAKT Diplomová
práce
na
téma
„Monitoring
fenolických
sloučenin
ve
víně“
je rozdělena do dvou částí. První část je věnována obecnému přehledu fenolických sloučenin ve víně, chemickému složení vína a technologii výroby vína. Druhá
část
se
zabývá
stanovením
vybraných
fenolických
sloučenin
v konkrétních vzorcích metodou HPLC-MS. Vína pocházela z Vinařství Jaroslav Tichý a byla zastoupena odrůdami Svatovavřinecké, Frankovka, Zweigeltrebe, Zweigeltrebe rosé, Veltlínské zelené, Sauvignon, Rulandské bílé a Müller Thurgau. Chemickým rozborem byly zjištěny koncentrace vybraných fenolických sloučenin u zkoumaných vzorků vín. Klíčová slova: fenolické sloučeniny, víno, vinná réva, vysokoúčinná kapalinová chromatografie
ABSTRACT The diploma thesis is called „Monitoring of phenolic compounds in wine“ and it is divided into two parts. The first part is devoted to general overview of phenolic compounds, chemical composition of wine, technology of production and separation methods for identification and quantification of phenolic compounds. The second part is devoted to determination of selected phenolic compounds in specific samples using the HPLC–MS. Wines come from Winery Jaroslav Tichý and were represented by varieties of Saint Laurent, Lemberger, Zweigelt, Zweigelt rose, Veltliner, Sauvignon, Pinot Blanc and Müller Thurgau. Concentrations of selected phenolic compounds in wine samples were determined by chemical analyze.
Keywords: phenolic compounds, wine, grapevine, high performance liquid chromatography
OBSAH 1
ÚVOD ................................................................................................................ 8
2
CÍL ..................................................................................................................... 9
3
OBECNÝ PŘEHLED FENOLICKÝCH SLOUČENIN VE VÍNĚ ................. 10 3.1
Rozdělení fenolických látek ............................................................................. 11
3.2
Flavonoidy........................................................................................................ 12
3.2.1
Flavonoly .................................................................................................. 13
3.2.1.1 Kvercetin ............................................................................................... 14 3.2.1.2 Rutin ...................................................................................................... 14 3.2.1.3 Myricetin ............................................................................................... 15 3.2.1.4 Kempferol ............................................................................................. 15 3.2.2
Flavony, Izoflavony, Flavanony ............................................................... 15
3.2.3
Flavanoly .................................................................................................. 16
3.2.4
Antokyanidiny .......................................................................................... 18
3.3
Fenolové kyseliny ............................................................................................ 18
3.3.1
Kyselina gallová ....................................................................................... 20
3.3.2
Kyselina kávová ........................................................................................ 20
3.3.3
Kyselina kumarová ................................................................................... 21
3.4
Stilbeny ............................................................................................................ 21
3.4.1 3.5
Resveratrol ................................................................................................ 21
Lignany ............................................................................................................ 24 TECHNOLOGIE VÝROBY VÍNA ................................................................. 25
4 4.1
Složení hroznů .................................................................................................. 25
4.1.1
Zrání hroznů .............................................................................................. 27
4.1.2
Sklizeň hroznů .......................................................................................... 27
4.2
Zpracování hroznů na rmut .............................................................................. 29
4.3
Nakvašování rmutu .......................................................................................... 30
4.4
Lisování rmutu ................................................................................................. 30
4.5
Úprava moštu před kvašením ........................................................................... 31
4.6
Alkoholické kvašení moštu .............................................................................. 32
4.7
Ošetřování a školení vín ................................................................................... 33
4.8
Lahvování vín................................................................................................... 35 CHEMICKÉ SLOŽENÍ VÍNA ........................................................................ 37
5 5.1
Voda ................................................................................................................. 37
5.2
Organické kyseliny........................................................................................... 37
5.3
Sacharidy .......................................................................................................... 38
5.4
Alkoholy ........................................................................................................... 40
5.5
Aromatické látky .............................................................................................. 41
5.6
Minerální látky (popeloviny) ........................................................................... 41
5.7
Třísloviny ......................................................................................................... 42
5.8
Pektinové látky ................................................................................................. 43
5.9
Dusíkaté látky................................................................................................... 43
5.10
Vitamíny ....................................................................................................... 44
5.11
Enzymy ......................................................................................................... 44
5.12
Barviva ......................................................................................................... 45
5.13
Tuky, oleje a vosky....................................................................................... 45
5.14
Polyfenoly..................................................................................................... 46 MATERIÁL A METODIKA ........................................................................... 48
6 6.1
Vzorky vín ........................................................................................................ 48
6.1.1
Přesný popis použitých vín ....................................................................... 48
6.1.1.1 Červená odrůdová vína ......................................................................... 48 6.1.1.2 Bílá odrůdová vína ................................................................................ 51 6.1.1.3 Růžová vína ........................................................................................... 54 6.2
Chemikálie ....................................................................................................... 54
6.3
Přístrojové vybavení ......................................................................................... 55
6.4
Příprava vzorků ................................................................................................ 55
6.4.1
Extrakce fenolových kyselin ..................................................................... 55
6.5
Příprava standardů ............................................................................................ 55
6.6
Stanovení obsahu jednotlivých fenolických látek ............................................ 56 VÝSLEDKY .................................................................................................... 58
7 7.1
Kalibrace .......................................................................................................... 59
7.2
Statistické vyhodnocení ................................................................................... 61
7.3
Porovnání jednotlivých fenolických látek ve zkoumaných vzorcích vín ......... 62
7.4
Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stáří ........................... 63
7.4.1 Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stáří ve Svatovavřineckém víně ........................................................................................... 63 7.4.2 Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stárnutí ve víně Müller Thurgau ....................................................................................................... 64 7.4.3 Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stárnutí ve víně Veltlínské zelené ..................................................................................................... 66 7.4.4
Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech ................. 67
7.5 Porovnání obsahu derivátů fenolických kyselin (kyseliny benzoové a skořicové) ve vzorcích vín .......................................................................................... 68 7.6
Posouzení vlivu barvy vína na obsah fenolických sloučenin ........................... 70
7.7 Porovnání flavonoidů a fenolových kyselin v jednotlivých vzorcích zkoumaných vín .......................................................................................................... 74 7.8
Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vzorcích vín ......................... 75
8
DISKUZE ......................................................................................................... 77
9
ZÁVĚR ............................................................................................................ 79
10
POUŽITÁ LITERATURA............................................................................... 81
11
SEZNAM OBRÁZKŮ ..................................................................................... 89
12
SEZNAM TABULEK ...................................................................................... 90
13
SEZNAM ZKRATEK ...................................................................................... 91
14
SEZNAM PŘÍLOH ........................................................................................ 123
1
ÚVOD
Víno je po tisíciletí považováno za velmi cenný nápoj. Obsahuje řadu důležitých látek, které mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Lékaři je doporučována jeho konzumace v přiměřeném množství - tj. jednu, maximálně dvě skleničky denně. První doklady o výrobě vína pocházejí z období před 7 až 10 tisíci lety z oblastí kolem Kaspického moře, v Arménii a Gruzii. Kolem roku 3500 př. n. l. bylo vinařství na vysoké úrovni ve staré Mezopotámii a obzvláště v Egyptě. Egypťané zcela zvládli technologii výroby vína a pěstovali šest až osm odrůd révy vinné. Díky archeologickým nálezům se dochovalo mnoho pozůstatků, např. nádoby z pálené hlíny, některé z nich byly dokonce opatřeny nápisem kvality a původu vína. Víno se podávalo při slavnostních a náboženských obřadech i jako oběť bohům. V naší zemi má vinařství dlouholetou tradici. Na Moravě máme čtyři vinařské podoblasti a to Znojemskou, Mikulovskou, Velkopavlovickou a Slováckou. Vinařská oblast Čechy se skládá z Mělnické a Litoměřické podoblasti. Víno obsahuje kolem 200 různých fenolických látek a další jsou stále nacházeny. Fenolické sloučeniny se nacházejí v hroznech ve velké rozmanitosti a jejich kvalitativní složení je vysoce závislé na způsobu a rychlosti zpracování hroznů, na velikosti tlaku při lisování a také na druhu vína. Vyskytují se především v pecičkách, slupce a třapinách révy vinné. Zastoupení v červených a bílých vínech je odlišné. V bílém víně je obsah fenolických látek od 200 do 500 mg/l. V červeném víně je jejich obsah 3x až 10x vyšší. Fenolické sloučeniny jsou zodpovědné za senzorické vlastnosti vína, jako jsou barva, stabilita barvy, chuťový projev tříslovin a celkový charakter vína. Na změnu obsahu a složení fenolických látek v hroznech se vysokou mírou podílí odrůda, klimatické vlivy, půdní podmínky a také agrotechnika ve vinici. Metody, kterými můžeme fenolické látky identifikovat, a kvantifikovat jsou dnes již na velmi vysoké úrovni. Fenolické sloučeniny se stanovují separačními metodami. Mezi tyto metody můžeme zařadit chromatografické metody (vysokoúčinná kapalinová chromatografie-HPLC, plynová chromatografie-GC), elektromigrační metody např. (kapilární zónová elektroforéza–CZE) a jiné. Kombinací těchto technik lze zvýšit účinnost identifikace a lze najít i stopová množství fenolických sloučenin. 8
2
CÍL
Diplomová práce se zaměřuje na identifikaci a kvantifikaci fenolických sloučenin ve vzorcích vín pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Podobné výzkumy již byly na ústavu Chemie a biochemie uskutečněny, a proto nebylo nutné zavádět
nové
analytické
postupy.
Mým
úkolem
bylo
prostudovat
českou
i zahraniční literaturu týkající se výroby vína, fenolických sloučenin a také chemického složení vína.
Cíle práce: 1. určení celkového obsahu fenolických látek ve vzorcích vín posouzení vlivu stárnutí na změnu zastoupení vybraných obsahových složek v závislosti na ročníku 2. posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech 3. posouzení vlivu barvy vína na obsah fenolických sloučenin 4. porovnání obsahů derivátů kyseliny benzoové a skořicové ve vzorcích vín 5. porovnání flavonoidů a fenolových kyselin v jednotlivých vzorcích zkoumaných vín 6. porovnání zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vínech a letech
9
OBECNÝ PŘEHLED FENOLICKÝCH SLOUČENIN VE VÍNĚ
3
Pro vinařství a vinohradnictví mají obrovský význam fenolické látky. Fenoly obsahují ve své struktuře aromatické jádro, na které je navázána hydroxylová funkční skupina -OH (Pavloušek, 2010). Chemické sloučeniny, které obsahují více jak dvě fenolové skupiny na benzenovém jádře náležející dvěma různým látkovým třídám (např. flavony a katechiny), se souhrnně označují polyfenoly. Polyfenoly vznikají jako produkty sekundárního metabolismu rostlin a tvoří se biogeneticky ze dvou hlavních syntetických cest a to:
šikimátové
acetátové Za velmi mnoho důležitých charakteristik vína, obzvláště barvu, antioxidační
vlastnosti a tříslovitý chuťový projev odpovídají fenolické látky (Murray, 1998; Velíšek, 2002; Klejdus, 2004). Tyto látky můžeme rozdělit podle povahy do dvou skupin, na flavonoidní (flavonoly, antokyany, flavanoly, dihydroflavonoly) a neflavonoidní (hydroxybenzoové a hydroxyskořicové kyseliny a jejich deriváty, stilbeny) látky. Asi 85 % fenolických látek tvoří flavonoidní látky, ostatní jsou neflavonoidní. Fenolické látky mají antioxidační účinek (omezují aktivitu kyslíkových radikálů). Největší význam fenolických látek spočívá v tom, že snižují riziko rakovinových onemocnění, působí proti virům a jako prevence proti koronárním chorobám (Slanina a Táborská, 2004). Ve víně bylo doposud objasněno asi 200 fenolických látek, přičemž další jsou stále nacházeny (Kumšta, 2006). Kvalitativní složení fenolických látek ve víně je závislé na způsobu a rychlosti zpracování hroznů a velikosti tlaku při lisování. Dále pak na odrůdě, klimatických vlivech, půdních podmínkách stanoviště a agrotechnice ve vinicích.
10
V bílých vínech se obsah fenolických látek pohybuje od 200 do 500 mg/l a v červených podstatně více od 800 do 4000 mg/l. Fenolkarbonové kyseliny (gallová, vanilinová, kumarová, kávová, ferulová a protokatechová), dále pak flavonoidy katechin, epikatechin, quercetin a další, přecházejí z hroznů do vína. Při zpracování se jednoduché fenolické látky váží na cukr a uvolňují se až během kvašení a skladování. Tab. 1 Základní přehled fenolických látek (Velíšek, 2002). Počet
Základní skelet
Skupina
6
C6
jednoduché fenoly, benzochinony
7
C6 - C1
fenolové kyseliny
8
C6 - C2
acetofenoly, fenyloctové kyseliny
9
C6 - C3
10
C6 - C4
naftochinony
13
C6 - C1 - C6
xantony
14
C6 - C2 - C6
stilbeny, antrochinony
15
C6 - C3 - C6
flavonoidy, izoflavonoidy
18
(C6 - C3)2
lignany, neolignany
30
(C6 - C3 - C6)2
bioflavonoidy
n
(C6 - C3)n
lignin
n
(C6 - C3 - C6)n
flavolany
uhlovodíků
3.1
fenolové (skořicové) kyseliny, fenylpropeny, kumariny
Rozdělení fenolických látek
Fenolické látky jsou heterogenní skupinou látek. Některé se vyznačují organoleptickými vlastnostmi, jiné biologickými účinky (působí jako účinné antioxidanty) a mohou také patřit mezi obranné látky rostlin (fytoalexiny), (Alonso a kol., 2002; Fujita a kol., 2005).
11
Podle organoleptických vlastností se mohou členit na přírodní barviva (některé chinony, flavonoidy, stilbeny, lignany, xanthony), chuťové látky (jednoduché fenoly a polyfenoly) a vonné látky (např. některé kumariny), (Doležal, 2000; Velíšek, 2002; Handique, 2002). Fenolické látky můžeme rozdělit podle chemické struktury a to na:
1. Flavonoidy
(flavonoly,
flavony,
isoflavony,
flavanoly,
flavanony,
antokyanidiny) 2. Fenolové kyseliny (kyselina benzoová, skořicová a jejich deriváty) 3. Stilbeny (resveratrol) 4. Lignany (sekoisolariciresinol, matairesinol), (Suková, 2006; Trna a Táborská, 2011).
3.2
Flavonoidy
Flavonoidy jsou velmi pestrá a početná skupina látek, patří mezi sekundární metabolity rostlin
(Jones,
1998).
Dodnes
bylo
popsáno
okolo
5000
látek
(Velíšek a Hajšlová, 2009). Vyskytují se v zelenině a ovoci (malinách, ostružinách, borůvkách, atd.). Valná většina flavonoidů se účastní v potravinách reakcí enzymového hnědnutí. Tyto reakce spočívají v enzymové oxidaci fenolových sloučenin některými oxidoreduktázami za přítomnosti vzdušného kyslíku. K produktům oxidace patří příslušné chinony, které svými následnými enzymovými a neenzymovými reakcemi poskytují barevné pigmenty (Velíšek, 2002). Flavonoidy jsou látky odvozené od kyslíkaté heterocyklické sloučeniny 2H-chromenu, který je substituován v poloze C-2 fenylovou skupinou, nazývaného flavan. Flavanová kostra je složena ze dvou benzenových kruhů (A a B) a také kruhu, který je odvozený od 2H-pyranu (C). Všechny tří kruhy bývají běžně substituovány hydroxy- nebo methoxyskupinami. Jednotlivé deriváty se liší jen stupněm substituce a oxidace (Velíšek a Hajšlová, 2009). Flavonoidy se nejčastěji vyskytují ve formě O-glykosidů, ve kterých je přítomna D-glukóza, D-galaktóza, L-arabinóza, D-xylóza nebo jiná cukerná složka. Méně se potom flavonoidy vyskytují jako vonné látky.(Švejcar, 1986; Velíšek, 2002).
12
Flavonoidní látky mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Jednak mají schopnost snižovat riziko vzniku srdečně-cévních onemocnění a aterosklerózy. Působí ale také antibakteriálně, protizánětlivě a vazodilatačně (Zloch, 2003). Flavanoidy dělíme do několika skupin a to na: 1. Flavonoly (viz. kapitola 3.2.1)
2. Flavony (viz. kapitola 3.2.2)
3. Izoflavony (viz. kapitola 3.2.2)
4. Flavanony (viz. kapitola 3.2.2)
5. Flavanoly (katechiny a proantokyanidiny) (viz. kapitola 3.2.3)
6. Antokyanidiny (viz. kapitola 3.2.4) (Manach a kol., 2004).
3.2.1 Flavonoly Flavonoly
jsou
významné
fenolické
sloučeniny,
nacházející
se
převážně
ve slupkách bobulí révy vinné. Jejich koncentrace bývá vyšší v červených odrůdách než v bílých. Koncentrace flavonolů v hroznech je ovlivňována řadou faktorů, mezi ty nejvýznamnější patří například tloušťka slupky, množství slunečního záření během růstu, stupeň zralosti při sklizni a v neposlední řadě způsobu zpracování a výroby (Farkaš, 1973; Fujita a kol., 2005). Největší výskyt flavonolů je především v česneku, dále potom v čaji (v listech keře Camellia sinensis), brokolici, borůvkách, hroznovém víně a jablkách (Lachman a kol., 2000; Manach a kol., 2004). Mezi nejvýznamnější flavonoly řadíme kvercetin, rutin, myricetin a kempferol.
13
3.2.1.1 Kvercetin
Kvercetin se vyskytuje ve vysokých koncentracích v běžně přijímaných potravinách. Bohatým zdrojem je cibule, pórek, česnek, kapusta, jablka, červené víno, zelený a černý čaj. Například v červeném víně se jeho obsah pohybuje okolo 4 až 16 mg/l. Kvercetin se vyskytuje ve formě volné, ale může se vyskytovat také jako glykosid. Například kvercetin-3-O-rhamnosid, kvercetin-3-O-glukosid a rutin (kvercetin-3-β-rutinosid) má prospěšné účinky na lidské zdraví, především protizánětlivé, protisrážlivé a antiaterosklerotické (Jones, 1998; Velíšek, 2002; Trna a Táborská, 2011). Kvercetin je v přirozené formě neaktivní a k jejímu zreagování dojde po přidání kvasinek do moštu, kde se přemění na kvercin. Podobně jako zde k tomuto ději dochází i činností střevní mikroflóry v gastrointestinálním traktu (Manach a kol., 2004).
Obr. 1 Kvercetin (Trna a Táborská, 2011).
3.2.1.2 Rutin Rutin je chemická sloučenina patřící mezi glykosid kvercetinu. Jeho cukerná část rutinóza se skládá z glukózy a rhamnózy. Nejvýznamnějším zdrojem rutinu je pohanka. Jeho množství závisí na odrůdě pohanky a na množství přijatého slunečního záření. Obsah rutinu se v různých částech rostliny liší. Tepelným zpracováním pohanky však obsah rutinu klesá. Rutin má řadu pozitivních zdravotních účinků, především zesiluje účinek vitamínu C v lidském organismu a zabraňuje jeho chemické degradaci. Podílí se na snižování hladiny LDL cholesterolu a má schopnost pohlcovat volné
14
radikály, dále ovlivňuje pružnost a propustnost krevních kapilár (Farkaš, 1973; Velíšek a Hajšlová, 2009).
3.2.1.3 Myricetin Bohatým zdrojem myricetinu (3,3 ´,4´,5´,5,7-hexahydroxyflavon) jsou čaj, vlašské ořechy, a také černý rybíz. Myricetin má při vyšší koncentraci příznivý vliv na metabolismus LDL cholesterolu (Farkaš, 1973).
3.2.1.4 Kempferol
Kempferol
(3,4´,5,7
–tetrahydroxyflavon)
se
vyskytuje
v
ovoci
(jablkách
a grapefruitu), brokolici nebo černém čaji. Vyznačuje se protirakovinnými a antioxidačními účinky (Kumšta, 2006).
3.2.2 Flavony, Izoflavony, Flavanony
Flavony patří spolu s flavonoly k nejrozšířenějším žlutým pigmentům rostlin. Nejvýznamnější představitelé této skupiny jsou glykosidy apigenin a luteolin, které jsou obsažené v bylinách (petržel), červených paprikách a celeru. Méně často se vyskytují flavony tricetin a další. Nejběžnější C-glykosidy vitexin a orientin můžeme nalézt v rýžových otrubách, pšenici, jáhlech a v řadě druhů ovoce (Velíšek, 2002; Manach a kol., 2004). C-glykosid schaftosid, který se nachází ve fících, slouží k identifikaci fíkové šťávy v jiných ovocných šťávách, například ve šťávách vinných hroznů (Velíšek, 2002). Flavanony se vyskytují ve vyšších koncentracích v citrusovém ovoci a podílejí se na typické chuti citrusového ovoce. Vyskytují se buď světle žluté, nebo bezbarvé, ale jako barviva nemají téměř žádný význam. Hlavní zástupci jsou aglykony hesperetin (nacházející se v pomerančích), naringenin (nacházející se v grapefruitech) a eriodictyol (nacházející se v citrónech). Koncentrace flavanonů v rostoucích plodech narůstá a v době zralosti je již konstantní (1 až 6 g/plod). Důležité je ovšem zmínit, že se tyto 15
látky nalézají nejvíce pod slupkou, proto je obsah flavanonů vyšší v celém ovoci (až 5 krát) než ve sklenici džusu (Velíšek, 2002; Manach a kol., 2004; Velíšek a Hajšlová, 2009). Izoflavonoidy jsou významnou flavonoidních skupinou látek, vyznačující se rozličnými biologickými účinky, jako jsou antikarcinogenní, antibakteriální, antioxidativní, potlačují negativní symptomy menopauzy u žen a další. Nejnovější studie poukazují na fakt, že by izoflavonoidy mohli chránit například proti osteoporóze a proti hormonálně podmíněným onemocněním (Mazur, 1998). Některé deriváty izoflavonů však vykazují toxické účinky a řadí se mezi přirozené toxické složky potravin (Velíšek, 2002). Významní zástupci izoflavonoidů jsou dadzein a genistein, formononetin, glycitein a biochanin A. Výskyt izoflavonů je prakticky pouze v luštěninách (čeledích Fabaceae), (Dixon a Ferreira, 2002). Celkový obsah izoflavonů se například v sójových bobech pohybuje v mezích od 0,13 % až 0,42 %. Úpravou se ale obsah jednotlivých izoflavonoidů mění (Velíšek, 2002).
3.2.3 Flavanoly Mezi hlavní zástupce flavanolů řadíme katechin, epikatechin, epigallokatechin a další. Chemické složení katechinu je odvozené od flavanu (3-flavanol). V plodech révy vinné se katechiny vyskytují převážně ve slupce a semenech a ve stopových množstvích i v dužině. Hnědnutí vína během stárnutí je závislé na koncentraci katechinů. Dále se nachází ve švestkách, bobulovém ovoci i v zeleném čaji. Jelikož jsou katechiny součástí kondenzovaných tříslovin, podílí se na chuti hlavně u červených vín. Snižují riziko nádorových onemocnění, potlačují vzniklé nádory a ničí bakterie (Švejcar, 1986; Víno a zdraví, 2003-2004; Manach a kol., 2004; Trna a Táborská, 2011). Díky několika asymetrických center v molekule katechinů, se vyskytují v několika izomerech např. epikatechin, který zlepšuje funkci CNS a zlepšuje paměť.
16
OH OH O
HO
OH OH
Obr. 2 Katechin (Trna a Táborská, 2011). Proantokyanidiny patří mezi kondenzované taniny. Taniny mohou tvořit se sacharidy a proteiny nerozpustné komplexy. Vyskytují se v jablkách, hroznech, čokoládě, kakau, luštěninách a červeném víně (zde tvoří asi 50 % všech flavonoidů a jsou odpovědné za tříslovitost hroznů a vín), (Andersen a Markham, 2006). Během procesu zrání se svíravost mění a dosažením zralosti mizí (Manach a kol., 2004). Proantokyanidiny se nacházejí v rostlinných materiálech jako komplexní směsi polymerů se stupněm polymerace 4 až 11 (Trna a Táborská, 2011).
Obr. 3 Proantokyanidin A (Trna a Táborská, 2011).
17
3.2.4 Antokyanidiny
Antokyany jsou glykosidy různých aglykonů nazývajících se antokyanidiny (Manach a kol., 2004). Antokyany tvoří nejpočetnější skupinu rostlinných barviv a patří mezi nejdůležitější barviva modrých odrůd révy vinné (Švejcar, 1986). Do dnešní doby bylo identifikováno asi 300 různých antokyanů. V závislosti na pH existují jak barevné, tak nebarevné formy. Hlavní zdroje antokyanů, které se využívají jako potraviny, jsou plody rostlin čeledi révovitých Vitaceae (hrozny révy vinné), růžovitých Rosaceae (třešně, švestky, maliny, jahody, ostružiny, atd.), lilkovitých Solanaceae (lilek, odrůdy brambor s červenou slupkou, brukvovitých Brassicaceae (červené zelí, ředkvičky, atd.), vřesovcovitých Ericaceae (borůvka, brusinka) a jiné. Počet antokyanů, které jsou přítomny v rostlinách, se odlišuje v závislosti na druhu rostliny. Menší množství se nachází v jahodách a ostružinách, mnohem více antokyanů se nachází například v hroznech červených odrůd révy vinné. V přírodě se nachází celkem patnáct různých antokyanidinů a všechny tyto látky jsou v poloze C4´ substituované hydroxylovou skupinou. Vzájemně se odlišují substitucí v polohách 3, 5, 6, 7, 3´ a 5´. (Velíšek, 2002). V hroznech révy vinné (Vitis vinifera) je obsah antokyanů velmi proměnlivý souvisí se řadou podmínek. Během zrání a v průběhu stárnutí vín dochází k významnějším změnám barvy. Dochází ke snížení původního množství antokyanů, ale zároveň vznikají červené pigmenty, které jsou méně citlivé na změny pH prostředí. Z daného vyplývá, že mladá vína mají světlejší barvu než zralá (Pátek, 2001; Velíšek a Hajšlová, 2009).
3.3
Fenolové kyseliny
Fenolové kyseliny patří mezi nejjednodušší fenolické látky ve víně. Mezi fenolové kyseliny řadíme především: 1. kyselina benzoová a její deriváty - jsou tvořeny uhlíkatou kostrou C6 – C1 2. kyselina skořicová a její deriváty - jsou tvořeny uhlíkatou kostrou C6 – C3 18
Obr. 4 Deriváty kyseliny benzoové (Anonym 1).
Obr. 5 Deriváty kyseliny skořicové (Anonym 2). S těmito kyselinami se můžeme setkat v řadě rostlinných materiálů (Mikeš, 2004). Nejznámější deriváty kyseliny benzoové se řadí kyselina vanilová, gallová, salicylová, p-hydroxybenzoová, syringová, protokatechová, gentisová a veratrová (Velíšek, 2002). Deriváty kyseliny skořicové jsou kyseliny o-kumarová, m-kumarová, p-kumarová, kávová, ferulová a sinapová (Trna a Táborská, 2011). Sloučeniny, které jsou odvozené od kyseliny benzoové, mají relativně nízké antioxidační účinky. Naproti tomu deriváty kyseliny skořicové chrání organismus proti působení volných radikálů mnohem ochotněji, díky konjugované dvojné vazbě. Na počtu hydroxylových a methoxylových skupin závisí antioxidační účinek. Čím více je těchto skupin, tím je antioxidační účinek větší (Minárik a Navara, 1986). Průměrný obsah fenolových kyselin se pohybuje od 30 do 100 mg/l v červených a od 1 do 15 mg/l v bílých vínech (Minárik a Navara, 1986). Ve víně je z derivátů kyseliny skořicové nejvíce zastoupena kyselina kávová a kumarová a z derivátů kyseliny benzoové je to především kyselina gallová. Ostatní se ve víně vyskytují v nižších koncentracích (Minárik a Navara, 1986). 19
Deriváty kyseliny benzoové a to především kyselina gallová a ellagová se nacházejí v bobulích (jahody, ostružiny, maliny) a také ořeších (King a Young, 1999). Deriváty kyseliny skořicové se nachází především ve vnějších vrstvách zralého ovoce. Kyselina kávová, která je nejrozšířenější, představuje asi 75% z celkového obsahu derivátů skořicové kyseliny obsažených v ovoci (Manach a kol., 2004). V přírodě se fenolové kyseliny vyskytují ve dvou formách a to ve volné nebo vázané (esterifikované). Ve volné formě jsou jen v nízkých koncentracích. Je to proto, že je většina těchto kyselin v přirozeném stavu esterifikována (Davídek a kol., 1983). Fenolové kyseliny se tedy ve vázané formě se objevují převážně jako estery, mohou se však objevovat i jako glykosidy. Ve víně jsou deriváty kyseliny skořicové esterifikovány buď kyselinou vinnou, nebo jablečnou (Manach a kol., 2004).
3.3.1 Kyselina gallová
Kyselina
gallová
(3,4,5-hydroxybenzoová
kyselina)
je
organická
kyselina.
Na benzenové jádro jsou navázány tři hydroxylové a jedna karboxylová skupina. Díky těmto skupinám může vytvářet deriváty, estery a soli. Kyselina gallová se vyskytuje například v dubové kůře, čajových lístcích, ořeších, duběnkách a v pevných částech bobule hroznu. Má silné antioxidační a antibakteriální účinky (Vetrano a kol., 2005).
3.3.2 Kyselina kávová Kyselina
kávová
(3,4-dihydroxyskořicová
kyselina)
se
vyskytuje
v
přírodě
ve formě volné i ve formě derivátů. Jeden z nejvýznamnějších derivátů kyseliny kávové je například kyselina chlorogenová (5-caffeoylchinová kyselina), která je přítomna v řadě potravin, ovoci, zelenině (brambory, hrušky, meruňky, broskve a artyčok) a kávě. (Farkaš, 1973; Manach a kol., 2004; Trna a Táborská, 2011).
20
3.3.3 Kyselina kumarová Kyselina kumarová patří mezi deriváty kyselina skořicové. Vyskytuje se ve třech izomerech: o-kumarová, m-kumarová, p-kumarová kyselina, podle polohy hydroxylové skupiny na benzenovém jádře. Nejvíce se ovšem v přírodě vyskytuje p-kumarová kyselina. Kyselina kumarová se vyskytuje v rajčatech, česneku, mrkvi a ořeších. Vyznačuje se antioxidační aktivitou a redukcí rizika rakoviny žaludku (Farkaš, 1973).
3.4
Stilbeny
V hroznech a následně ve víně se stilbeny vyskytují pouze v malém množství. Stilbeny jsou
strukturálně
podobné
flavonoidům,
základní
chemická
struktura
je 1,2-difenylethylen (dvě benzoová jádra jsou spojena dvouuhlíkatým řetězcem). Stilbeny se vyskytují buď volně, nebo vázané jako glykosidy (Šmidrkal a kol., 2011). V lidském těle působí řada těchto látek jako antioxidanty, fytoestrogeny a také jako antikarcinogenní látky (Fremont, 2000; Velíšek, 2002).
Obr. 6 Stilben (Velíšek, 2002). 3.4.1 Resveratrol
Resveratrol
(3,4´,5-trihydroxystilben)
řadíme
do
skupiny stilbenů.
Vyskytuje
se ve formě cis- i trans-izomerů. V rostlinných materiálech se jsou přítomny směsi obou izomerů, ale většinou převažuje trans-resveratrol. Resveratrol se řadí mezi fytoalexiny (sekundární metabolity rostlin). Ty se v rostlině začínají tvořit nebo se jejich 21
koncentrace zvyšuje jako odpověď na stresový faktor (Jones, 1998). Příkladem stresové situace může být mechanické poškození, UV záření, napadení hroznu plísněmi (Šmidrkal a kol., 2011). Zdrojem trans-resveratrolu ve víně jsou polyfenolické látky (konstitutivní stilbeny) extrahované ze slupek bobulí a třapin. Obsah resveratrolu ve víně je také závislý na odrůdě a druhu révy vinné, způsobu zpracování a v neposlední řadě na způsobu skladování vína a zemi, kde bylo víno pěstováno. (Farkaš, 1973). Naše červená vína mají mnohem vyšší koncentraci resveratrolu než vína z oblastí jižní Evropy a ze zámoří. Důvodem je, že v našich klimatických podmínkách musí réva vinná (Vitis vinifera) odolávat stresovým faktorům, a proto produkuje velké množství obranných látek (Rajdl a kol., 2007; Šamánek a Urbanová, 2010). Koncentrace resveratrolu ve víně se pohybuje od 0,1 do 8 mg/l. Průměrná koncentrace v červených vínech je od 2 do 6 mg/l, bílá vína obsahují pouze kolem od 0,2 do 0,8 mg/l. Mezi bílým a červeným vínem je deset krát vyšší koncentrace resveratrolu (Jang, 1997; Kopec, 1999). Významnou roli při přechodu obsahu resveratrolu do moštu a následně pak do vína hraje odlišná technologie zpracování hroznů při výrobě červeného a bílého vína. Zatímco hrozny bílých odrůd jsou rozemlety a ihned se z nich lisuje mošt, u hroznů červených odrůd po rozemletí trvá několik dní, než mošt získá barvu a je dále zpracován. Resveratrol nevytváří pouze réva vinná (Vitis vinifera), ale je produkován i v jiných rostlinách například v černém rybízu, podzemnici olejné, moruších, grapefruitu a dalších. Jeho koncentrace může být snížena špatným skladováním a následnou úpravou pokrmů. Kromě obrany proti stresu rostlin má resveratrol silný antioxidační účinek. Konzumace červeného vína zvyšuje podíl HDL cholesterolu (lipoproteiny vysoké
hustoty),
což
vede
ke
snížení
agregace
krevních
destiček
a potlačuje možnost výskytu koronárních chorob. (Jang a kol., 1997; Šmidrkal a kol., 2011). Další příznivý účinek je protinádorový.
22
Obr. 7 Resveratrol (Šmidrkal a kol., 2011). S účinkem resveratrolu se spojuje termín tzv. „Francouzský paradox“. Ve Francii je nízký výskyt kardiovaskulárních onemocnění a to i přes to, že se zde konzumuje jídlo s poměrně vysokým příjmem nasycených tuků. Tento paradox je spojován se zvýšenou konzumací červeného vína spolu se stravou bohatou na vitamíny. Nadměrná konzumace vína tyto účinky ovšem ztrácí. Podobně jako ve Francii jsou na tom Itálie a ostatní země s vysokou spotřebou vína (Arnous a kol., 2001; Doležal, 2008). Tab. 2 Obsah fenolických látek ve víně (Mikeš, 2004). Fenolické látky
Červená vína [mg/l]
Bílá vína [mg/l]
15
stopové množství
deriváty kyseliny benzoové
50 - 100
1,5
deriváty kyseliny skořicové
50 - 100
1,5
malvidin, delfinidin, kyanidin
20 - 500
0
1500 - 5000
0 - 100
50 - 100
0
kempferol, kvercetin, myricetin
taniny katechiny
23
3.5
Lignany
Lignany jsou obsaženy ve spoustě rostlinných materiálů a potravinách. Nacházejí se ve dřevě, obilninách (především v různých druzích semen), ovoci (hrušky, švestky, jahody,
brusinky),
zelenině
(česnek,
mrkev,
rajčata,
chřest)
a
ořeších
(Andersen a Markham, 2006). Nejbohatším potravinovým zdrojem lignanů je lněné semínko, ve kterém je jeho obsah v průměru 90 až 370 mg lignanů na 100 g sušiny. Lněné semínko obsahuje sekoisolariciresinol a matairesinol, což jsou aglykony lignanu (Velíšek,
2002).
Lignany
jsou
metabolizovány
střevní
mikroflórou
na tzv. enterolignany, enterodiol a enterolakton, které vykazují střevní aktivitu. Tyto látky se vyznačují protirakovinnými, protivirovými a antioxidačními vlastnostmi (Manach a kol., 2004).
24
4
TECHNOLOGIE VÝROBY VÍNA
Víno je po tisíciletí považováno za velmi cenný nápoj. Obsahuje celou řadu důležitých látek, které mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Mezi ně patří posilující a uklidňující účinek, podporuje ale také trávení člověka. Lékaři je doporučována jeho konzumace v přiměřeném množství (Salfellner, 1992). První doklady o výrobě vína pocházejí z období před 7 až 10 tisíci lety z oblastí kolem Kaspického moře, v Arménii a Gruzii, které jsou považovány za pravou pravlast vína. Sumerové jsou zatím nejstaršími zjištěnými vinaři. Kolem roku 3500 př. n. l. bylo vinařství na vysoké úrovni ve staré Mezopotámii a obzvláště v Egyptě. Již v této době Egypťané zcela zvládli technologii výroby vína a pěstovali šest až osm odrůd révy vinné (Staněk, 1998). Kolem dnešního města Alexandrie se nacházely nejstarší egyptské vinice. Díky archeologickým nálezům se dochovaly nádoby z pálené hlíny, některé z nich byly dokonce opatřeny nápisem kvality a původu vína. Z Egypta se vinařství postupem času rozšířilo do Řecka, Itálie, na Sicílii, do Španělska a dnešní Francie (Kraus a kol., 1997). Na našem území začali ve velkém pěstovat révu vinnou a konzumovat víno zřejmě Keltové. Ke značnému rozšíření vinic došlo na našem území během 9. a 10. století, tedy v době Velkomoravské říše. Podstatnou úlohu v šíření vinařství u nás hrála klášterní společenství. Ti, kteří se rozhodli pro mnišský život v klášterech, zakládali vinice a vyráběli víno (Kraus a kol., 2005).
4.1
Složení hroznů
Základní surovinou pro výrobu vína je hrozen, který je tvořen bobulemi a třapinou. Třapina se podílí na celkovém objemu hroznů 2 až 5 % a bobule 95 až 98 %. Na výrobu vína z technologického hlediska působí nepříznivě zejména třapiny nevyzrálých hroznů. Třapina obsahuje podle stupně zralosti asi 75 až 80 % vody, 1 až 3 % taninu a 7 až 10 % dřevitých látek. Mezi další obsahové látky patří třísloviny, minerální látky, organické kyseliny, apod. Třapiny dávají hroznům tvar a nesou bobule. Bobule je tvořena slupkou, dužinou a semeny. Rozpoznávacím znakem jednotlivých odrůd je právě velikost, hmotnost, tvar a barva bobulí. Slupka bobulí bývá 25
různě zbarvená. Na povrchu bobule se nachází tenká vosková vrstva (kutikula), která chrání před odpařováním vody a také před účinky dešťové vody, postřikových látek a mikroorganismů. Nejvýznamnější součástí bobulí je dužina, která je u většiny odrůd bezbarvá nebo načervenalá. Jen výjimečně se může u některých odrůd vyskytnout červené barvivo i v dužině. Z celkové hmotnosti dužiny připadá přibližně 8 % na cévní svazky, zbytek tvoří sladká šťáva (mošt). Nejdůležitějšími chemickými látkami dužiny jsou cukry a organické kyseliny, jejichž obsah je závislý na odrůdě, ročníku, poloze, půdě a stupni zralosti hroznů (Farkaš, 1973; Malík, 1996; Hubáček, 1997). Z cukrů jsou v dužině zastoupeny jednoduché zkvasitelné cukry (hroznový a ovocný). Z organických kyselin jsou zastoupeny nejvíce kyselina vinná a jablečná. Kyselina
jablečná
převládá
v
nepříznivých
ročnících.
Semena
(pecičky)
se u jednotlivých odrůd liší barvou, tvarem a velikostí. Mají 10 až 20 % olejů (převážně se skládají z glyceridů, kyseliny palmitové, stearové a linolové) a dále obsahují značné množství tříslovin a hořkých látek (Laho a kol., 1970; Kraus a kol., 2005). Tab. 3 Chemická složení jednotlivých částí hroznu (% hmotnosti), (Malík, 1996). Složka
Třapina
Slupka
Semena
Bobule
Voda
35 - 90
50 - 100
30 - 45
55 - 90
Pentózy
1,0 - 2,8
1,0 - 1,2
3,9 - 4,5
0,2 - 0,5
Hexózy
*
**
0
10 - 30
Sacharoza
0
0
0
0 - 1,5
Škrob
*
0
0
0
Celulóza
0
3,5
0
*
0,7
0,9
0
0,1 - 0,3
Kyseliny
0,5 - 1,6
0,1 - 0,7
0
0,2 - 0,3
Třísloviny
1,3 - 5,0
0,1 - 4,0
0,5 - 8,0
*
Barviva
0
1 - 15
0
*
Enzymy
*
*
*
Monosacharidy
Polysacharidy
Pektinové a slizové látky
26
Vitamíny
**
**
**
*
0,7 - 2,2
0,8 - 2,0
0,8 - 6,0
0,2 - 1,4
Aromatické látky
0
*
*
0
Olej
0
0,1 - 1,5
8 - 20
0
Popel
6 - 10
0,5 - 3,7
1-5
0,1 - 1,0
Dusíkaté látky
Legenda: * stopy
** nízké koncentrace
4.1.1 Zrání hroznů V průběhu zrání dochází ke zvyšování obsahu cukrů ve šťávě bobulí a zvyšuje se i její hustota. Zralost hroznů posuzujeme podle účelu použití. Rozlišujeme dva typy zralosti, a to konzumní a technologickou. Konzumní zralost bývá spojována se stolními odrůdami a vyjadřuje schopnost hroznů k jídlu. Pro výrobu vína musí být hrozny ve stádiu technologické zralosti (Hubáček, 1997; Kraus a kol., 2005).
4.1.2 Sklizeň hroznů Doba sklizně závisí na stupni zralosti, zdravotního stavu hroznů a na odrůdě. Ke sklizni hroznů dochází v našich podmínkách převážně v období září a října. Prvním krokem k produkci vysoce kvalitního vína je sklizeň kvalitních hroznů v optimální úrovni zralosti a dobrém zdravotním stavu (Hubáček, 1997; Malík, 1996).
27
Technologické etapy výroby vína: 1. Zpracování hroznů na rmut 2. Lisování rmutu 3. Úprava moštu před kvašením 4. Alkoholické kvašení moštu 5. Ošetřování a školení vín 6. Lahvování vín odzrňování příjem hroznů
odzrňování
samotok
mletí hroznů
nakvašení krmivo
lisování
výlisky extrakce
mošt
hroznový výluh
kvašení další zpracování stáčení, odstřeďování, filtrace
kvasničné kaly
zrání vína
filtrace
filtrace
další zpracování
plnění do lahví
révová vína Obr. 8 Schéma výroby vína (Červenka a Samek, 2004).
28
4.2
Zpracování hroznů na rmut
Sklizené hrozny bychom měli ještě stejný den zpracovat, nejpozději však 24 hodin od převzetí. Při přejímce hroznů se stanovuje hmotnost a průměrná cukernatost. K jejich měření slouží tzv. moštoměry. Můžeme se setkat např. s normalizovaným moštoměrem, udávajícím množství cukru v kg na 100 l moštu (°NM) nebo Klosterneuburským moštoměrem, který udává množství cukru v % hmotnostních při 20 °C (°Kl), (Hubáček, 1997; Červenka a Samek, 2004). V prvním kroku se provede tzv. rmutování (Rop a Hrabě, 2009). Pro snadnější uvolnění šťávy z bobulí, musíme hrozny rozemlít, a to tak, aby byly odděleny třapiny od bobulí. Přitom se nesmějí porušit semena a nesmí být rozmačkány třapiny, z nichž by přešla do rmutu nežádoucí šťáva obsahující chlorofyl a třísloviny. Obě složky zhoršují kvalitu vína (Kraus a kol., 2000). Pro mlýnkování a odzrňování hroznů se používá celá řada strojů, např. mlýnkoodzrňovače, také agrapumpy nebo fulograpy (Švejcar, 1986; Steidl a kol., 2002).
Obr. 9 Stanovení cukernatosti moštu (Steidl a kol., 2002).
29
4.3
Nakvašování rmutu
Po drcení hroznů následuje nakvašování rmutu, ale to jen v případě výroby červených vín a některých bílých aromatických vín, muškátové a kořeněné odrůdy révy vinné (Kraus a kol., 2000; Pátek, 2001). Pro nakvašení rmutu by měly být hrozny odzrněné a také zdravé. Při teplém počasí probíhá proces nakvašování asi 6 hodin, při chladném 15 až 20 hodin (maximálně 8 až 10 dní), a to proto, aby se uvolnilo co možná nejvíce aromatických látek (Kraus a kol., 2000). Pokud dojde k překročení doby nakvašování rmutu, dochází u vína k hnědnutí, octovému kvašení a tudíž získává nepříjemnou chuť (Rop a Hrabě, 2009). V procesu nakvašování dochází díky činností kvasinek k tvorbě etanolu a oxidu uhličitého. Oxid uhličitý s sebou napovrch strhává nečistoty a vytváří vrstvu, která se nazývá matolinový klobouk (Kraus a kol., 2000). U červených rmutů dochází k lisování tedy až po nakvašování při pravidelném ponořování do matolinového koláče. Tento proces je velmi důležitý z hlediska vyluhování co nejvíce červeného barviva ze slupek modrých hroznů (Edwards, 2001; Pátek, 2001).
4.4
Lisování rmutu
Lisování je proces, kterým oddělujeme mošt od tuhých částí rmutu. Intenzita lisování je ovlivněna konstrukcí lisu, použitým tlakem a mechanickými vlastnostmi rmutu. Podstata lisování spočívá v pomalé práci lisu a za použití nízkého tlaku, aby měl mošt dostatek času odtéci ze rmutu. Nízkého podílu tříslovin a kalů je možné dosáhnout prostřednictvím nízkého lisovacího tlaku (pod 0,8 MPa/8 atm), minimálním předcházejícím drcením a krátkou dobou lisování (hrozí nebezpečí oxidace), (Švejcar 1986; Steidl a kol., 2002).
30
4.5
Úprava moštu před kvašením
Mezi sklizní a kvašením se používají postupy, které rozhodují o budoucím charakteru a
kvalitě
vína. Proto hraje
důležitou roli
úprava
moštu před kvašením.
Tu tvoří tři kroky, které jsou odkalování, úprava cukernatosti a úprava kyselosti (Kraus a kol., 2000). Odkalování moštu se provádí z několika důvodů. Mezi nejhlavnější patří odstranění mechanických nečistot, které jsou nositeli takových mikroorganismů, jejichž přítomnost v kvasném procesu není žádoucí. Dále odstranění kalových látek, které se do moštu dostávají z nahnilých bobulí, a na kterých se mohou zachytávat rezidua chemických
přípravků,
jimiž
byly
ošetřeny
plody
během
vegetace
(Pátek, 2001; Malík, 2003; Kraus a kol., 2005). Pokud by se odkalení neprovedlo, mohlo by to vést k rychlému prokvašení moštu a ve víně zavinit nečistou chuť, rychlé stárnutí, vyšší obsah tříslovin a přítomnost reziduí pesticidů (Steidl a kol., 2002). V současně době se doporučuje snížení obsahu kalů na maximálně 0,6 % objemu, od 1 % jsou již ve víně patrné nečisté tóny. V praxi se uplatňují následující způsoby odkalování: 1. Statické odkalování (usazování, sedimentace) je jedna z nejčastěji používaných metod, která není příliš náročná. Princip této metody spočívá v sedimentaci kalů v nádobě (káď, sud, tank) a následné stočení čistého moštu. Účinnost této metody závisí na době ponechání moštu v klidu. Nejčastěji probíhá celý proces 12 až 24 hodin. Statické odkalování je vhodné kombinovat s chlazením na teplotu 4 až 8 °C a přidáním do moštu moštový bentonitu (100 g/hl), moštové želatiny (50 až 100 ml/hl) nebo jiných čiřidel (Kraus a kol., 2005; Steidl a kol. 2002; Anonym 3). 2. Dynamické odkalování se používá spíše ve velkých výrobních podnicích. Tento
způsob odkalování zahrnuje flotaci, filtraci a odstřeďování. Do moštu odkaleného flotací se dává přídavek menšího množství bentonitu, který odstraní přebytečné
bílkoviny a
vytvoří
vnitřní
povrch
(Kraus a kol., 1997; Steidl a kol., 2002; Anonym 3).
31
moštu
pro
kvasinky
Úprava cukernatosti neboli doslazování, spočívá ve zvýšení obsahu cukru v moštu. K úpravě cukernatosti se používá nejčastěji přídavek sacharózy nebo zahuštěného hroznového moštu. Na zvýšení cukernatosti o 1°NM je potřeba přidat do moštu přibližně 1,1 kg cukru na 100 l moštu (Malík, 1996). Úpravou kyselosti moštu můžeme zvýšit kvalitu vína, ve kterém bude harmonický poměr mezi obsahem kyselin a dalšími složkami. Na chemické odkyselování se používá například uhličitan vápenatý (CaCO 3), který se použije při překročení obsahu kyselin nad 10 g/l (Feldkamp, 2003; Malík, 2003). Odkyselování moštů by mělo být maximálně na 9 až 10 g/l (Steidl a kol., 2002).
4.6
Alkoholické kvašení moštu
Kvašení moštu je složitý biochemický proces, při kterém kvasinky přeměňují nejen cukr na alkohol a vedlejší produkty (kyselina mléčná, kyselina octová, glycerol, vyšší alkoholy, metanol), ale uvolňuje se i aroma a vytvářejí se nové sloučeniny – vzniká kvasný buket (Steidl a kol., 2002). Průběh kvašení moštu ovlivňuje celá řada faktorů například teplota, cukernatost moštu, obsah alkoholu, složení kvasné mikroflóry, obsah kalů a ostatní nežádoucí látky (Rop a Hrabě, 2009). Teplota je prakticky nejdůležitějším faktorem. Optimální teplota pro kvašení a tedy i pro množení buněk je asi 25°C. Pokud nastanou větší odchylky od této hodnoty, dochází k brždění látkové výměny kvasinek. Teplota by se měla měnit rychlostí maximálně 4 °C/hod., aby se tím předešlo stresu kvasinek způsobenou rychlou změnou teploty. Optimální teplota kvašení je asi 20 °C. Vysoké teploty kvašení (35 až 37 °C) mohou způsobit úplné přerušení kvašení. Při teplotách 12 až 15 °C (tzv. studená fermentace) je důležité aplikovat speciální kvasinky (Kraus a kol., 2000; Steidl a kol., 2002). Mošty o nízké cukernatosti kvasí bez problémů, ovšem vysoké obsahy cukrů prokvášejí špatně a to v důsledku vysokého osmotického tlaku. Mošt poté odnímá vodu z buněk kvasinek a tím se snižuje intenzita jejich množení. Nejznámějším druhem kvasinek, které se podílí na kvasném procesu, jsou Saccharomysces cerevisce var. vini. Kvasinky mohou být kulaté, oválné, válcovité a svůj tvar i velikost mohou měnit v závislosti na kultivačních podmínkách. Jejich délka se pohybuje od 5 do 10 μm a šířka 32
od 4 do 6 μm (Dudaš a kol., 1981; Malík 1996, Steidl a kol., 2002). Rozkvašený mošt, který obsahuje více cukru, než alkoholu se nazývá „burčák“. Vyniká příjemnou chutí a výraznou vůní (Kraus a kol., 2000; Sedláček a Kočí, 2003).
Ošetřování a školení vín
4.7
Školení vína, které vede ke zlepšování a uchovávání jeho vlastností a také úpravy jeho kvality, zahrnuje několik základních operací, mezi které řadíme scelování, síření, čiření vína, jeho stabilizace, filtrace apod. (Malík, 2003). Scelování vína je významný technologický krok. Snahou je vylepšit vzhled, chuť nebo také aroma. Proto dochází ke scelování vín například kyselých s méně kyselými. Jde tedy o míchání vín vhodného složení, kde hlavním záměrem je dosažení vína s požadovanými vlastnostmi. Touto operací se vinaři snaží docílit harmonie všech složek ve víně, tedy alkoholu, kyselin, cukru, barvy, chuti a vůně (Pátek, 2001; Kraus a kol., 2005). Zakázáno je scelovat vína napadená chorobami. Scelování je prováděno při prvním přetáčení z kvasnic, anebo při přípravě čiření před lahvováním (Pátek, 2001; Kraus a kol., 2005). K ošetřování vína se používá technologická operace „síření“. Jedná se tedy o ošetřování vína oxidem siřičitým a využívání jeho stabilizačního účinku (Malík, 1996). Působení kyseliny siřičité má několik účinků a to:
1.
Biologický účinek - zabránění aktivit bakterií a divokých kvasinek
2.
Antioxidační účinek - víno je chráněno před oxidací a tudíž zůstává svěží, ovocné a vynikne odrůdové aroma
3.
Účinek deaktivující enzymy - přenášející kyslík potlačuje enzymy
4.
Účinek zlepšující aroma - vyvázáním kvasných produktů (acetaldehydu) se zlepšuje aroma (Steidl a kol., 2002).
33
Víno nesmí při uvedení do oběhu za účelem přímé lidské spotřeby překročit celkový obsah oxidu siřičitého a to: Pro červené víno s obsahem zbytkového cukru do 5 g/l - 160 mg/l SO2 Pro bílé a růžové víno s obsahem zbytkového cukru do 5 g/l - 210 mg/l SO2 Pro červené víno s obsahem zbytkového cukru od 5 g/l - 210 mg/l SO2 Pro bílé a růžové víno s obsahem zbytkového cukru od 5 g/l - 260 mg/l SO2 (Steidl a kol., 2002) Aby si víno zachovalo svoji svěžest a lahodnost, je důležité zbavit se kalů vína co možná nejdříve. Během skladování dochází sice k samovolnému čiření vína, avšak tento proces je dosti zdlouhavý a může vést až k nežádoucím změnám kvality vína. Sedimentace kalicích látek se urychluje přidáním různých čiřidel, které musí být zdraví neškodné a chemicky neutrální (Hubáček, 1997). Intenzita čiření je ovlivněna kyselostí vína a teplotou. Optimální teplota je do 25 °C a hodnoty pH od 2,8 do 3,2 (Malík, 1996). Jednotlivé druhy čiřidel se volí podle příčin zákalu. Čiřicí prostředky se dělí do dvou skupin: 1. Čiřidla se záporným elektrickým nábojem: agar - čiřidlo se silným záporným nábojem, vhodný k odstranění slizových zákalů apod., v současné době se vzhledem k pracnosti prakticky nepoužívá aktivní uhlí - používá se k odstranění pachuti po plísních, lze jím odbarvit víno apod. kaolin - využívá se při čiření sladkých, viskózních vín tanin - používá se v kombinaci s čiřidly s kladným nábojem (např. želatina), důležité je stanovení poměru taninu a želatiny, aby nebyla ovlivněna chuť vína při předávkování taninu bentonit - srážení s bílkovinami (odstraňuje termolabilní bílkoviny) a jinými kalícími látkami probíhá v závislosti na složení vína různě rychle kyselina křemičitá - vhodná k čiření červených vín s malým obsahem tříslovin modré čiření, kasein apod. 34
2. Čiřidla s kladným elektrickým nábojem: želatina - bílkovinné čiřidlo, vhodná ke srážení koloidních částic se záporným nábojem (např. třísloviny ve víně), po čiření želatinou má víno nižší barvu vaječný bílek - používá se k čiření jemných špičkových červených vín, zjemňuje trpkost vína vyzina - používá se pro jemná aromatická vína, určená k archivování, vínu neodebírá žádné cenné složky a jiné (Malík, 1996; Uhrová, 2002; Steidl a kol., 2002; Anonym 3) Následujícím technologickým krokem je stabilizace vína. Tyto zásahy vedou k tomu, aby se víno, které je naplněné do láhví uchovalo čiré a chuťově i barevně docházelo jen k pomalým změnám vyvolávaným stárnutím. Stabilita vína může být ohrožena bílkovinnými a mikrobiálními zákaly, nebo zákaly z nadbytku železa, vysrážení vinného kamene (Hubáček, 1997; Malík, 2003; Anonym 3). Závěrečným technologickým krokem je filtrace vína, což je vlastně proces odstranění všech pevných částic z tekutiny pomocí filtru a dosažení jiskrné čirosti (Kraus a kol., 2000). Úspěšná filtrace je taková, kde víno dosáhlo čistoty, potřebné pro danou filtraci (Steidl a kol., 2002). Mezi nejpoužívanější druhy filtrů řadíme vakuový rotační filtr, kalový filtr, cross-flow filtr a jiné. Nejznámější filtrační materiály jsou celulóza (má nižší čistící účinek), perlit (je používán u produktů, u nichž není nutné ihned dosáhnout vysoké čistoty) a křemelina (podle složení se rozlišuje hrubá, střední a jemná křemelina), (Trioli a Holmann, 2009).
4.8
Lahvování vín
Významným krokem výroby vína je lahvování. Víno musí být stabilní a to proto, aby nevznikaly v láhvi usazeniny. Z tohoto důvodu je nutné dodržet nezbytná opatření před lahvováním. Jedním z nich je senzorické zhodnocení vína, které by mělo být provedeno pár týdnů před lahvováním (Malík, 1996; Kuttervašer, 2003). Dále by mělo víno vykazovat ustálenou hodnotu SO2, musí být výhradně čisté, podrobeno tepelnému testu, zkoušce na obsah kovů a stabilitu vína vůči vinnému kamenu (Švejcar, 1989; Steidl a kol., 2002). Pro lahvování se vyžadují dokonale vyškolená, stabilizovaná 35
a jiskrná vína. Proces zrání vína ovšem pokračuje i po lahvování, víno tím získává na kvalitě. Kvalita vyzrávání vín závisí na použitých uzávěrech lahví i na samotném materiálu sklenic (Malík, 2003). Každá láhev, která naplněná vínem musí být řádně uzavřena (Pátek, 2001). Jako uzávěry lahví se používá více možností, jsou to například přírodní nebo lisovaný korek, plastová zátka a korunkový nebo šroubovací uzávěr. 1. Přírodní korek - má vysokou elasticitu a propouští plyny, čímž umožňuje vínu zrát v láhvi. Korkové zátky bývají potištěny a jejich povrch je ošetřen. 2. Lisovaný korek - patří mezi levnější alternativu přírodního korku. Výchozí materiál bývá nejčastěji odpad, který vzniká při produkci přírodních korků. Lisovaný korek se používá jen pro krátkodobější skladování vína a to z toho důvodu, že zvyšuje nebezpečí mikrobiologické kontaminace a dále lepidlo, které se používá při výrobě, zvyšuje nebezpečí pachuti po plísni ve víně. 3. Plastové zátky - jsou vhodné pro krátko až střednědobé skladování. Víno, které je uzavřeno plastovou zátkou, zraje podstatně pomaleji, v důsledku menší propustnosti plynů. 4. Korunkový uzávěr - tento uzávěr je velmi oblíben u litrových lahví, jelikož se velmi snadno odstraňuje a je levný. 5. Šroubovací uzávěr - běžně se používá hlavně ve Švýcarsku. Předností je nejen nízká cena, ale i možnost opětovného uzavření (Pátek, 2001; Steidl a kol., 2002). Velikost zátek běžných vín se pohybuje od 26 až do 46 mm, ale například archivní vína mají korkovou zátku dlouhou asi 7 cm (Sedláček a Kočí, 2003).
36
5
CHEMICKÉ SLOŽENÍ VÍNA
Víno je považováno za velmi cenný nápoj, ve kterém bylo do současné doby identifikováno více jak 600 komponent (Richter, 2002). Tyto komponenty ovlivňují jak organoleptické vlastnosti, tak kvalitu vín. Další faktory ovlivňující kvalitu vín a obsah jednotlivých složek jsou průběh počasí (povětrnostní podmínky), vyzrálost hroznů a v neposlední řadě i samotná odrůda (Švejcar, 1986).
5.1
Voda
Voda je převládající složkou vína a hraje důležitou roli v ustanovení základních charakteristik vína. Tvoří asi 70 až 80 % veškerého objemu (Farkaš, 1973; Stevenson, 2001). Množství vody ve víně je závislé na celé řadě podmínek, jako je například stupeň vyzrálosti, klimatické podmínky během vegetační doby a především na kultivaru (Švejcar, 1986). Ideální půdou pro pěstování odrůd révy vinné jsou takové, které mají relativně tenkou orniční vrstvu, lehce prostupný a dobře odvodněné podloží s dobrou schopností zadržovat vodu (Stevenson, 2001). Voda se podílí na řadě chemických reakcí například při kvašení a zrání vína (Soleas a kol., 1997).
5.2
Organické kyseliny
Tvoří jednu z hlavních složek vína. Velmi rozšířené jsou v rostlinách a to nejen v plodech, ale i ostatních částech rostlin (Farkaš, 1973). Faktory ovlivňující celkové množství organických kyselin jsou odrůda, biochemické procesy při zrání vína, viniční trať, ročník a vyzrálost hroznů (Steidl a kol., 2002). Organické kyseliny nacházíme ve víně nejčastěji ve formě rozpustných solí (Švejcar, 1986). Během dozrávání se tvoří jako první kyselina jablečná a později kyselina vinná, které tvoří hlavní složky. Kyselina jablečná se nachází v řadě plodů, zejména v bobulích, listech a stopkách hroznů révy vinné, jejíž obsah se zvyšuje během zrání 37
na 15 až 20 g/l. Zralé hrozny mají průměrný obsah pouze 3 až 5 g/l (Steidl a kol., 2002). Obsah kyseliny vinné je prakticky neměnný a tvoří asi 35 až 70 % obsahu všech kyselin ve víně, přičemž dobré ročníky jsou charakteristické vyšším obsahem kyseliny vinné (Richter, 2002). Minimální množství ve víně ale nesmí klesnout pod 1 g/l (Švejcar, 1986). Kyselina vinná hraje důležitou roli při výrobě vína, protože se podílí na udržování chemické stability, barvy a ovlivňuje chuť konečného vína (Kohout, 1986; Richter, 2002). V menším množství se pak vyskytuje ve víně například kyselina citronová, octová, glykolová, jantarová, malonová, fumarová apod. Jejich nízké obsahy ve víně jsou způsobeny činností mikroorganismů, které je rozkládají během kvašení. Vzájemný obsah kyselin závisí na vegetačním období (Malík, 1996; Kraus a kol., 1997). Pro barvu červených vín (která je stálá při nízkých pH), je velmi důležitý obsah kyselin. Při zvýšeném pH přechází barva vína z červené do namodralé barvy (Kraus a kol., 1997; Matějíček a kol., 2005).
5.3
Sacharidy
Sacharidy jsou jedny z nejdůležitějších složek vína. Podílejí na senzorických vlastnostech, především na chuti (Švejcar, 1986). Podle počtu cukerných jednotek, které jsou vázané v molekule, dělíme sacharidy na: 1. Monosacharidy - složené z jedné cukerné jednotky 2. Oligosacharidy - dva až deset stejných nebo různých monosacharidů spojených vzájemně glykosidovými vazbami 3. Polysacharidy - složeny z více než deseti stejných nebo různých monosacharidů 4. Složené (komplexní sacharidy) - obsahují i jiné sloučeniny jako například peptidy, proteiny, lipidy (Velíšek, 2002)
V moštu se nachází přibližně stejné množství D-glukózy (hroznový cukr) a D-fruktózy (ovocný cukr), které tvoří asi 99 % všech cukrů (Pavloušek, 2005). Na počátku zrání převládá obsah glukózy, na konci zrání se množství obou monosacharidů vyrovná (Malík, 1996). Průměrně se pohybuje obsah cukrů v moštech 38
od 100 až 250 g/l (Salfellner, 1992). Obsah cukru samozřejmě kolísá podobně jako v případě kyselin podle ročníku, odrůdy révy vinné, polohy, apod. Proto mohou u moštů klesnout obsahy cukrů v nepříznivých letech i pod 150 g/l (Kraus a kol., 1997). V přezrálých hroznech se vyskytuje více glukózy, což je způsobeno snadnou oxidací fruktózy. V moštech se tyto dva cukry tzv. invertní cukry nachází v poměru 1:1 a jsou nejvýznamnější pro alkoholové kvašení. Kvasinkami jsou přeměňovány na etanol a oxid uhličitý (Steidl a kol., 2002). Pokud vína zrají v dubových sudech, je možno pozorovat změnu obsahu cukrů (fruktózy, galaktózy, glukózy, xylózy a arabinózy). Tento efekt je připisován hydrolýzou dřevní hemicelulózy s postupným uvolňováním cukrů (Del Alamo, 2000). Další velký význam mají ve víně D-arabinóza, L-arabinóza, L-xylóza a L-ramnóza. Víno dělíme do čtyř skupin a to podle obsahu zbytkového cukru na: 1. Suché (do 4 g/l) 2. Polosuché (4 až 12 g/l) 3. Polosladké (12 až 45 g/l) 4. Sladké (nad 45 g/l), (Steidl a kol., 2002).
Tab. 4 Obsah jednotlivých sacharidů ve vínech (Velíšek, 2002).
Sacharid
Obsah [mg/l]
Monosacharidy Ribóza
6,3 - 62
Arabinóza
1 - 242
Xylóza
0,6 - 146
Glukóza
56 - 25000
Mannóza
2 - 37
Galaktóza
6,3 - 249
Fruktóza
93 - 26500
Rhamnóza
2,2 - 121
Fukóza
2-9
Oligosacharidy Trehalóza
0 - 61 39
Cellobióza
2-7
Maltóza
1-5
Sacharóza
0
Laktóza
1-5
Melibióza
stopy - 1
Rafinóza
0-1
5.4
Alkoholy
Alkoholy se získávají kvasnými pochody a jsou významným zdrojem energie. Mezi nejvýznamnější alkoholy řadíme metanol, etanol, vyšší alkoholy a glycerol. Metanol vzniká při enzymatickém odbourávání slupek, třapin a peciček. Ve víně se vyskytuje v nepatrném množství. Metanol je vysoce jedovatý. Otrava má za následek slepotu, krvácení do žaludku, mozku, plic až následnou smrt (Salfellner, 1992). Koncentrace metanolu ve víně se pohybuje okolo 50 mg/l. Jeho obsah lze regulovat způsobem lisování (Richter, 2002). Etanol je velmi důležitá součást vína, která podstatně ovlivňuje, jak víno působí na lidský organismus, ale je také důležitý pro zrání vína, jeho stabilitu a senzorické vlastnosti. Etanol vzniká při enzymatickém kvašení cukrů. Ve víně se množství alkoholu pohybuje mezi 10 až 15 obj. % (Jackson, 2008; Šamánek a Urbanová, 2010). 10 obj. % alkoholu je minimální hranicí, která zajišťuje optimální mikrobiologickou stabilitu vína (Kraus a kol., 1997). Podle obsahu alkoholu se vína dělí na lehká, středně těžká a těžká (Salfellner, 1992). Vyšší alkoholy se ve víně vyskytují jen v relativně malém množství od 150 do 700 mg/l. Mají ale důležitou roli pro aroma (chuť a vůni vína). Často bývají nazývány také tzv. „přiboudlinou“ (Steidl a kol., 2002). Glycerol vzniká již na počátku alkoholového kvašení a je vytvářen především divokými kvasinkami. Dodává vínu plnost a zjemňuje i jejich chuť. Velmi důležitý pojem, který se v souvislosti s glycerolem uvádí je „glycerolový faktor“. Ten uvádí podíl glycerolu k etanolu a běžně se pohybuje v poměru 1:10, což odpovídá množství glycerolu 6 až 10 g/l (Steidl a kol., 2002). 40
5.5
Aromatické látky
Aromatické látky představují významnou roli při senzorickém hodnocení vína a mají velký význam pro jeho kvalitu. Do pojmu aromatických látek řadíme jak vonné, tak i chuťové látky, které sumarizuje výraz buket (Steidl a kol., 2002). Ve víně byly doposud prokázány stovky chuťových a vonných látek. K vonným látkám řadíme lehce těkavé látky (alkoholy, estery), k chuťovým látkám špatně těkavé a netěkavé sloučeniny (organické kyseliny, cukry, fenolické sloučeniny), (Kraus a kol., 1997). Aromatické látky se nacházejí a tvoří ve slupkách hroznů. Tvorba těchto látek je závislá a kolísá s určitými podmínkami, jako je zrání hroznů, teplota, jejich zdravotní stav apod. (Švejcar, 1986). Nejvyšší obsah aromatických látek obsahuje hrozen v plné zralosti. V současné době se rozlišují aromatické i buketní látky podle jejich tvorby na: 1. Primární buket - aromatické látky jsou obsažené v bobulích a z nich přechází do moštu a vína 2. Sekundární buket - aromatické látky, které vznikly v průběhu alkoholového kvašení činností mikroorganizmů 3. Terciální buket - aromatické látky, které vznikají během dlouhodobého zrání (je způsobován chemickými reakcemi v průběhu zrání), (Farkaš, 1973; Steidl a kol., 2002).
5.6
Minerální látky (popeloviny)
Minerální látky přijímá réva vinná (Vitis vinifera) kořenovým systémem společně s vodou (Almeida, 2003). Množství přijatých látek závisí především na agrotechnice, dále pak na počasí, druhu půdy, odrůdě, vyzrálosti (Laho a kol., 1970; Salfellner, 1992). Množství a složení stopových prvků v hroznech ovlivňuje celá řada faktorů, například půda, zařízení používané během výrobního procesu a úpravami vína - zejména filtrací (Kohout, 1986). Minerální látky se stanovují jako obsah popelovin (zbytek po spálení organických součástí vína při 500 °C). Obsah popelovin se pohybuje od hodnot 1,5 až 4 g/l vína (Steidl a kol., 2002). V průběhu kvašení a školení vína se část minerálních látek
41
ztrácí, jelikož kvasinky spotřebovávají minerální látky a vápník se ztrácí při tvorbě vinného kamene (Pavloušek, 2006; Richter, 2002).
Tab. 5 Obsah minerálních látek v jednom gramu popela (Laho a kol., 1970). Minerální látka
Obsah [mg/g]
draslík
500 až 700
vápník
40 až 70
hořčík
30 až 50
sodík
10 až 25
železo
4 až 20
kyselina fosforečná
80 až 160
kyselina sírová
40 až 100
kyselina křemičitá
20 až 40
chlór
20 až 60
bór
jen stopy
5.7
Třísloviny
Třísloviny
nacházející
se
ve
víně
patří
do
skupiny
fenolových
látek
(polyhydroxyfenoly), které mají stahující vliv na sliznici a také mají vliv na barvu, stárnutí a texturu vína (Kohout, 1986). Vyskytují se především v pecičkách, slupce a třapinách révy vinné. V průběhu zpracování se dostávají do vína a dávají mu trpkou až svíravou chuť, kterou nejvíce pociťujeme na dásních a patře (Švejcar, 1986; Salfellner, 1992). Na stabilizaci barvy mají pozitivní vliv třísloviny ze semen. Obvyklý obsah tříslovin v červených vínech je 1 až 2 g/l. U bílých vín je obsah tříslovin nižší (asi 0,2 g/l) což je způsobeno rychlým a opatrným lisováním (Richter, 2002).
42
5.8
Pektinové látky
Pektinové
látky jsou
z
chemického
hlediska
deriváty
vysokomolekulárních
polysacharidů. V nezralém hroznu se nachází ve formě nerozpustného protopektinu. Zráním hroznu, účinkem kyselin a enzymu pektázy dochází k přeměně protopektinu na pektin (Malík, 1996). Pektiny jsou deriváty polygalakturonové kyseliny, jejíž karboxylové skupiny jsou částečně esterifikované metanolem. Ve šťávě hroznů je poměrně málo pektinů 1 až 2 g/l, ovšem obsah pektinů v hroznu a v moštu je závislý na odrůdě (Laho a kol., 1970; Malík, 1996). Kyselina pektinová a pektiny mají ve víně funkci ochranného koloidu, ztěžují tak např. čiření a filtraci vína (Farkaš, 1973). V technologii zpracování vína je důležité, aby obsah pektinů byl co nejnižší. K tomuto účelu se využívá pektinolytických preparátů, jež rozrušují pektiny a tím se zvýší výtěžnost moštu a rychlost lisování (Laho a kol., 1970).
5.9
Dusíkaté látky
K dusíkatým látkám, nacházejících se ve víně, řadíme aminokyseliny a peptidy. Dále jsou potom v menší míře zastoupeny bílkoviny, amonné soli, aminy a dusičnany. V moštu se nachází 240 až 1600 mg/l celkového dusíku (Malík, 1996). Dusíkaté látky se dostávají z hroznu do moštu a z něho potom do vína (Farkaš, 1973). Dusíkaté látky spolupůsobí při vytváření buketu, barvy i chuti vína. Peptidy se podílí na plnosti vína a bílkoviny ovlivňují stabilitu vína. Množství dusíkatých látek ve víně je závislé na řadě faktorů, např. způsob hnojení, odrůda, počasí a technologie výroby vína (Farkaš, 1973). Biogenní
aminy,
které
vznikají
při
kvašení
kyseliny
mléčné,
patří
ke sloučeninám dusíku a představují vážné nebezpečí pro zdraví. Především ty, které se vyskytují v červeném víně, mohou vyvolat například bolesti hlavy, závratě, žaludeční potíže a jiné. Nejznámější biogenní amin je histamin, který se v červeném víně vyskytuje v koncentracích až do 2,2 mg/100 ml a bílém víně pod 0,5 mg někdy dokonce pod 0,1 mg/100 ml. Výskyt histaminu ve víně můžeme zabránit vysokou hygienou ve vinném sklepě (Salfellner, 1992).
43
5.10 Vitamíny Obsah vitamínů je u vín silně závislý na odrůdě révy. Všeobecně lze říci, že víno příliš vitamínů neobsahuje. Nejvíce vitamínů obsahuje čerstvý hrozen (Richter, 2002). Při zpracování přechází jenom část vitamínů do moštu, zbytek zůstává nevyužit ve slupkách a matolinách. Vitamíny se účastní biochemických a fyzikálně - chemických procesů (Švejcar, 1986). V průběhu těchto procesů se může obsah vitamínů změnit a v průběhu dokvašení vína se může zase obsah vitamínů zvýšit. Nejdůležitější vitamíny ve víně jsou: 1. Kyselina askorbová - vitamín C - vyskytuje se ve víně v množství okolo 30 mg/l, důležitý činitel oxidačně - redukčních procesů 2. Thiamin - vitamín B1 - v červených vínech se množství pohybuje od 120 do 150 μg/l a v bílých vínech od 15 do 130 μg/l, thiamin využívají kvasinky v průběhu kvasného procesu 3. Riboflavín - vitamín B2 - v červených vínech se jeho množství pohybuje od 100 - 200 μg/l, v bílých jen od 10 - 100 μg/l, spolupůsobí při kvašení vína 4. Kyselina nikotinová a nikotinamid - nachází se v množství 3,2 mg/l (z toho 2 mg/l je ve vázané formě a 1,2 mg/l ve formě volné) 5. Kyselina pantotenová - vitamín B5 - hromadí se v bobulích, v červených vínech je obsah okolo 1 mg/l, v bílých vínech je obsah nižší 6. Pyridoxin - vitamín B6 - průměrné množství se pohybuje okolo 0,45 mg/l, účastní se metabolických procesů přeměny aminokyselin 7. Biotin - vitamín H - ve víně se nachází jen v malých množstvích okolo 2 μg/l 8. Kyselina listová - vitamín M - ve víně se vyskytuje volná, z hroznu přechází do moštu, (Laho a kol, 1970).
5.11 Enzymy Enzymy řadíme mezi proteiny (bílkoviny), které katalyzují a také řídí veškeré látkové výměny u rostlin i živočichů (Steidl a kol., 2002). Procesy probíhající v moštu a ve víně účinkem enzymů mohou být pozitivní i negativní. Negativní je například 44
působení polyfenoloxidázy, která způsobuje hnědnutí moštu i vína. V dnešní době jsou již známé způsoby zpomalení nebo urychlení enzymatických reakcí ve víně (Farkaš, 1973). Rychlé zpracování, zabránění přístupu vzduchu a také použití oxidu siřičitého potlačují účinek enzymatických reakcí. Do pozitivních účinků enzymů řadíme například štěpení pektinových látek a účinek proteolytických enzymů. Nejvýznamnější enzymy vyskytující se ve víně jsou například kataláza, hydroláza, oxidoreduktáza (Laho a kol., 1970; Farkaš, 1973).
5.12 Barviva Zabarvení hroznových bobulí závisí na obsahu jednotlivých druhů přírodních barviv. Zelené rostlinné barvivo chlorofyl se spolu se žlutým barvivem karotenem a xantofylem nachází v chloroplastech rostlinných buněk. Při dozrávání hroznů se obsah chlorofylu snižuje a při přezrávání úplně mizí ( Laho a kol., 1970). Červené, modré a fialové barviva se nacházejí u plodů červeně zbarveného ovoce. Barvivo se tvoří ve slupkách bobulí účinkem světla. Z biochemického hlediska do této skupiny patří antokyany (Richter, 2002). Antokyany přechází do vína ze slupek bobulí v době nakvašení. Tato barviva nejsou obsažena v dužině, a proto lisováním hroznů bez nakvašení vyrobíme růžové nebo bílé víno (Stávek, 2006). Od počátku zrání se ve slupkách bobulí vyskytuje klasické barvivo červeného vína oenin. Barva oeninu se postupně mění působením kyselin na zářivě červenou. Bakterie mohou způsobit rozložení barviva červeného vína, což pak zaviní hořkou chuť červeného vína (Salfellner, 1992).
5.13 Tuky, oleje a vosky V bobulích hroznů révy vinné se můžeme setkat jak s oleji tak i tuky. Postupným zráním bobulí se v jejich semenech hromadí olej, jehož množství závisí na odrůdě a také na vyzrálosti (Farkaš, 1973). Víno obsahuje malé množství tukových látek (asi 0,05 až 0,1 g/l vína). Hlavní část je tvoří tuky pocházející z kvasinek (Salfellner, 1992; Richter, 2002). Množství oleje v semenech se pohybuje od 4 do 20 %, převážná 45
část oleje ovšem zůstává v hroznových výliscích a tudíž se v moštu nachází jen velmi malé množství oleje. Vína z modrých odrůd obsahují více olejů než odrůd bílých. V hroznových výliscích zůstává značná část oleje. Špatným lisováním se však může do moštu a následně vína dostat větší část olejů a tím negativně ovlivnit chuť vína (Laho a kol., 1970; Farkaš, 1973). Vosky můžeme najít na slupkách bobulí révy vinné ve formě políček nebo zrníček. Hrají důležitou roli v ochraně bobule před vysycháním, smočením vodou a před napadením nejrůznějšími mikroorganismy (Švejcar, 1986).
5.14 Polyfenoly Polyfenoly bývají tradičně označované jako třísloviny a barviva. Tato skupina obsahuje asi 8000 sloučenin. Polyfenoly plní řadu důležitých funkcí ve víně, především se podílí na senzorických vlastnostech (chuť - hořkost, svíravost), barvě červeného vína a hrají důležitou roli při ochraně vína. Je důležité poukázat také na fakt, že jsou polyfenoly náchylné ke vzdušné oxidaci, což vede u bílých vín k jejich hnědnutí (Steidl a kol., 2002; Pavloušek, 2005; Jeong a kol., 2008). Kvalita i kvantita fenolických látek ve víně závisí na řadě faktorů, například na rychlosti zpracování hroznů (odzrnění, doba macerace, teplota, intenzita lisování, apod.), způsob školení a zrání vína, odrůdě, stupni zralosti, podnebím, půdou, místem pěstování révy apod. (Soleas a kol., 1997; Steidl a kol., 2002). Tab. 6 Hodnoty fenolických látek pro bílá a červená vína (Waterhouse, 2002). Bílá vína Třídy fenolů
Červená vína
mladá
zralá
mladá
zralá
164
145
225
120
0
100
0
60
0,5
0,5
7
250
164,5
245,5
232
430
Fenolové kyseliny Benzoové kyseliny Hydrolyzovatelné taniny Stilbeny (resveratrol) Celkem [mg/l] Flavonoidy
46
Flavanoly
25
15
200
100
Proantokyanidy, kond.taniny
20
25
750
1000
Flavonoly
-
-
100
100
Antokyanidiny
-
-
400
90
Ostatní
-
-
50
75
45
40
1500
1365
209,5
285,5
1732
1795
Celkem [mg/l] Celkem všechny fenoly [mg/l]
47
6
MATERIÁL A METODIKA
6.1
Vzorky vín
Pro monitoring fenolických sloučenin byly použity vzorky červených, růžových a bílých vín, které byly zakoupeny ve Vinařství Jaroslav Tichý. Vinařství Jaroslav Tichý se zaměřuje na výrobu kvalitních přívlastkových vín, jehož rozmanitou skladbu odrůd tvoří 15 druhů bílých a červených vín. Vinařství je známé výraznými minerálními víny. Vína, která jsou zde vyráběna, reprezentují severozápadní znojemské vinařské podoblasti. Vznikají tu vína plná, aromatická s ovocnými a květinovými tóny. Červená vína ve sledovaném souboru vín reprezentuje Svatovavřinecké, Frankovka a Zweigeltrebe, bílá vína zastupují Veltlínské zelené, Sauvignon, Rulandské bílé a Müller Thurgau, jako vzorek růžového vína byl vybrán Zweigeltrebe rosé. Bližší přehled zkoumaných vzorků je v následující kapitole 6.1.1. Výše zmíněné odrůdy jsou zástupci velmi kvalitních vín jižní Moravy a byly vybrány z důvodu možnosti sledování v jednotlivých letech výroby (2008, 2010, 2011 a 2012).
6.1.1 Přesný popis použitých vín 6.1.1.1 Červená odrůdová vína
Svatovavřinecké 2008 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2008 obsah: 375 ml cena: 100,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,0 obj. % celkové kyseliny: 5,6 g/l zbytkový cukr: 2,1 g/l označení pro analýzu: SV08 48
Svatovavřinecké 2010 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2010 obsah: 750 ml cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,0 obj. % celkové kyseliny: 6,3 g/l zbytkový cukr: 0,2 g/l označení pro analýzu: SV10
Svatovavřinecké 2011 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2011 obsah: 750 ml cena: 150,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,5 obj. % celkové kyseliny: 6,5 g/l zbytkový cukr: 0,4 g/l označení pro analýzu: SV11
Svatovavřinecké 2012 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2012 obsah: 750 ml cena: 120,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,5 obj. % 49
celkové kyseliny: 6,0 g/l zbytkový cukr: 1,0 g/l označení pro analýzu: SV12
Frankovka 2011 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – pozdní sběr – suché ročník: 2011 obsah: 750 ml cena: 170,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Dolní Kounice – vinařská trať Nová Města obsah alkoholu: 12,2 obj. % celkové kyseliny: 6,7 g/l zbytkový cukr: 0,4 g/l označení pro analýzu: FR11
Zweigeltrebe 2011 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2011 obsah: 750 ml cena: 150,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,5 obj. % celkové kyseliny: 6,7 g/l zbytkový cukr: 0,4 g/l označení pro analýzu: ZWT11
50
6.1.1.2 Bílá odrůdová vína
Veltlínské zelené 2008 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – pozdní sběr – polosuché ročník: 2008 obsah: 750 ml cena: 140,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Petrovice – vinařská trať Kokusové hory obsah alkoholu: 12,5 obj. % celkové kyseliny: 7,5 g/l zbytkový cukr: 2,1 g/l, označení pro analýzu: VZ08
Veltlínské zelené 2010 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2010 obsah: 750 ml cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Petrovice – vinařská trať Kokusové hory obsah alkoholu: 11,5 obj. % celkové kyseliny: 7,5 g/l zbytkový cukr: 5,8 g/l, označení pro analýzu: VZ10
Veltlínské zelené 2011 kategorie: jakostní víno odrůdové – suché ročník: 2011 obsah: 750 ml cena: 95,- Kč
51
oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Petrovice – vinařská trať Kokusové hory obsah alkoholu: 11,8 obj. % celkové kyseliny: 7,3 g/l zbytkový cukr: 1,7 g/l označení pro analýzu: VZ11
Veltlínské zelené 2012 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – pozdní sběr ročník: 2012 obsah: 750 ml cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Petrovice – vinařská trať Kokusové hory obsah alkoholu: 11,0 obj. % celkové kyseliny: 5,8 g/l zbytkový cukr: 22,5 g/l označení pro analýzu: VZ12
Sauvignon 2010 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – kabinetní víno - suché ročník: 2010 obsah: 750 ml cena: 140,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Dobelice – vinařská trať Domovní - Písky obsah alkoholu: 10,5 obj. % celkové kyseliny: 7,1 g/l zbytkový cukr: 0,7 g/l označení pro analýzu: SG10
52
Rulandské bílé 2011 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – výběr z hroznů - polosladké ročník: 2011 obsah: 750 ml cena: 210,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 12,5 obj. % celkové kyseliny: 5,8 g/l zbytkový cukr: 12,9 g/l označení pro analýzu: RB11
Müller Thurgau 2010 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – kabinetní víno – suché ročník: 2010 obsah: 750 ml cena: 120,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Dobelice – vinařská trať Domovní – Písky obsah alkoholu: 11,5 obj. % celkové kyseliny: 6,6 g/l zbytkový cukr: 0,4 g/l označení pro analýzu: MT10
Müller Thurgau 2012 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – Moravské zemské víno - polosladké ročník: 2012 obsah: 750 ml cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – vinařská obec Dobelice – vinařská trať Domovní – Písky obsah alkoholu: 10,3 obj. % 53
celkové kyseliny: 7,1 g/l zbytkový cukr: 19,0 g/l označení pro analýzu: MT12 6.1.1.3 Růžová vína
Zweigeltrebe rosé 2011 kategorie: jakostní víno s přívlastkem – kabinetní víno – suché ročník: 2011 obsah: 750 ml oblast pěstování: Vinařská oblast Morava – podoblast Znojemská – obec Trboušany – vinařská trať Hájky obsah alkoholu: 11,5 obj. % zbytkový cukr: 3,5 g/l celkové kyseliny: 7,1 g/l označení pro analýzu: ZWT rosé
6.2
Chemikálie
Veškeré chemikálie, které byly použity, dosahovaly čistoty p. a. Chemikálie používající se jako rozpouštědla pro přípravu mobilní fáze měly čistotu „HPLC gradient grade“ Veškeré chemikálie použité pro měření (kyselina mravenčí, octová, metanol a dietylether byly zakoupeny od dodavatele Sigma Aldrich s. r. o. (Praha, Česká republika). Standardy, které byly použity pro stanovení fenolových kyselin, flavonoidů a stilbenu resveratrolu byly také zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich, s. r. o. (Praha, Česká republika). Na přístroji Milli Q RG (Millipore, Massachusetts, USA) byla získána opakovanou destilací demineralizovaná voda. SPE RP-105 Resin byl zakoupen od firmy Applied Separations (Allentown, Illinois, USA).
54
Přístrojové vybavení
6.3
K extrakci fenolických sloučenin bylo využito následujících přístrojů: -
odparka R-215 A advanced (Maneko, Praha, Česká republika)
-
třepačka Vortex Genius 3 (Biotech, Praha, Česká republika)
-
chromatografu HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA), který se skládá z: - automatického dávkovače vzorku (model G1313A) - kvarterního čerpadla mobilní fáze (model G1311A) - vakuové odplyňovací jednotky (model G1322A) - chromatograf HP 1100 byl propojen s UV-VIS detektorem (G1314A) a kvadrupólovým hmotnostním detektorem s ESI. - vyhodnocovací software Chemstation (Rev.A 10,02)
6.4
Příprava vzorků
6.4.1 Extrakce fenolových kyselin
K extrakci fenolických kyselin na pevné fázi (SPE) byly použity RP-105 SPE kolonky, které
byly
kondicionovány
3
ml
metanolu
a
3
ml
vody.
Následně
se na kolonku naneslo 5 ml vzorku vína. Poté byla kolonka se vzorkem vysoušena po dobu 10 minut. V následujícím kroku se do kolonky aplikovalo 5 ml diethyletheru. Tímto způsobem připravený vzorek byl přelit ze zkumavky do 50 ml odměrné baňky. Pomocí rotační vakuové odparky byl solvent odpařen při teplotě 50 °C a po vysušení smíchán s 500 μl 80% metanolem. Posledním krokem bylo injektování 1 μl vzorku do systému HPLC-MS. Celý proces byl opakován třikrát pro statistické zpracování.
6.5
Příprava standardů
K přípravě jednotlivých standardů bylo použito vždy 1 mg dané látky, která byla rozpuštěna ve 100 ml 80% metanolu. V případě fenolových kyselin byl od každé látky
55
použit 1 mg a naráz všechny rozpuštěny ve 100 ml 80% metanolu. Ředění následovalo dle potřeby a to buď 1:10, 1:100 a 1:1000. Z toho plyne že: 1mg/ 100ml = 10 μg/ml 1:10: 1 μg/ml 1:100: 0,1 μg/ml 1:1000: 0,01 μg/ml
6.6
Stanovení obsahu jednotlivých fenolických látek
Všechna měření byla provedena v laboratoři na ústavu Chemie a Biochemie. Pro kvantifikaci a identifikaci fenolických sloučenin bylo využito vysokoúčinného kapalinového chromatografu HP 1100 na reverzní fázi. K samotné separaci byla použita kolona Zorbax SB-C18 o velikosti částic 1,8 μm a rozměrech 50 x 2,1 mm (Agilent Technologies, USA). Složení gradientové eluce pro separaci fenolových kyselin a flavonoidů je uvedena v tabulce 8. Při separaci stilbenu resveratrolu se jednalo o isokratickou eluci, jejíž složení je uvedeno v tabulce 9. Mobilní fáze se skládala ze směsi a 0,2 % kyseliny octové (A) a metanolu (B) o objemovém průtoku 0,6 ml/min. Separace probíhala při teplotě 45 °C. Do systému bylo dávkováno 1 μl vzorku, nebo vzorku upraveného SPE. Doba detekce činila 4,5 minuty a postkolonový čas 1 minutu.
Tab. 7 Složení gradientové eluce při stanovení fenolových kyselin a flavonoidů Solvent A (%) čas [min]
0,2% kyselina octová
Solvent B (%) metanol
0,00
85
15
0,17
85
15
0,51
75
25
1,70
70
30
4,00
70
30
6,00
85
15
56
Tab. 8 Složení isokratické eluce při stanovení stilbenu resveratrolu Solvent A (%) 0,2% kyselina octová
Solvent B (%) metanol
60
40
57
7 VÝSLEDKY Pro monitoring fenolických sloučenin ve vzorcích vín bylo použito vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Ve víně byly analyzovány následující fenolické sloučeniny: kyselina ferulová, kyselina gallová, kyselina chlorogenová, kyselina kávová, kyselina p-kumarová, kyselina
p-hydroxybenzoová, kyselina
protokatechová, kyselina salicylová, kyselina sinapová, kyselina syringová, kyselina vanilová,
3,4-dihydroxybenzaldehyd,
p-hydroxybenzaldehyd,
vanilin,
stilben:
resveratrol, flavonoidy: katechin, epikatechin, prokyanidin B1 a prokyanidin B2. V příloze 1 jsou uvedeny chromatogramy sledovaných fenolických standardů. V příloze 3 lze nalézt chromatogramy separovaných fenolických sloučenin, které jsou demonstrovány na víně Frankovka 2011. V následující tabulce jsou uvedeny retenční časy, přechody, fragmentační napětí a kolizní energie sledovaných látek.
58
Tab. 9 Parametry MRM přechodů Retenční
Kolizní
čas Název látky
[min]
Fragmentační
energie
Přechod
napětí [V]
[V]
3,54
kyselina ferulová
193→134
100
10
0,43
kyselina gallová
169→125
100
10
1,76
kyselina chlorogenová
353→191
100
10
2,01
kyselina kávová
179→135
100
10
2,95
kyselina p-kumarová
163→119
100
10
1,29
kyselina p-hydroxybenzoová
137→93
100
10
0,75
kyselina protokatechová
153→109
100
10
3,44
kyselina salicylová
137→93
100
10
3,89
kyselina sinapová
223→208
100
10
2,50
kyselina syringová
197→182
100
10
1,99
kyselina vanilová
167→152
100
10
1,12
3,4-dihydroxybenzaldehyd
137→108
120
20
2,61
epikatechin
289→245
146
4
1,38
katechin
289→245
146
4
0,87
p-hydroxybenzaldehyd
121→92
120
20
0,96
prokyanidin B1
577,5→407
170
0
2,08
prokyanidin B2
577,5→407
170
0
2,59
vanilin
151→136
100
10
2,03
resveratrol
227→185
130
10
7.1
Kalibrace
Před kvantitativní analýzou vybraných fenolických sloučenin byly provedeny kalibrace, konkrétně metoda přímého stanovení. Byly provedeny nástřiky standardních látek, kde koncentrační rozsah činil od 0,2 do 5 ng/ml a celé stanovení probíhalo za přesně definovaných podmínek. Přesné parametry provedených kalibrací jsou uvedeny v tabulce 9. 59
Tab. 10 Jednotlivé parametry pro kvantitativní analýzu RRLC-MS/MS (n=6) v MRM modu.
LOD
LOQ
Kalibrační rovnice
R2
kyselina ferulová
y = 14471,73x + 1451,52
0,9998
0,29
0,95
kyselina gallová
y = 15005,50x + 444,25
0,9999
0,33
0,98
kyselina chlorogenová
y = 39025,72x + 2215,62
0,9999
0,21
0,77
kyselina kávová
y = 40407,53x + 1372,58
0,9999
0,22
0,76
kyselina p-kumarová
y = 54154,79x + 4774,12
0,9998
0,52
1,68
hydroxybenzoová
y = 20868,05x + 2340,40
0,9997
0,44
1,33
kyselina protokatechová
y = 13480,38x + 641,70
0,9999
0,22
0,74
kyselina salicylová
y = 37961,00x + 10022,94
0,9983
0,44
1,42
kyselina sinapová
y = 6008,94x + 816,85
0,9996
0,15
0,46
kyselina syringová
y = 7582,32x + 1248,83
0,9996
0,2
0,66
kyselina vanilová
y = 6980,24x + 1816,88
0,9986
0,27
0,92
3,4-dihydroxybenzaldehyd
y = 3801,32x + 860,12
0,9973
0,07
0,23
epikatechin
y = 14285,10x + 35,03
0,9999
0,77
2,31
katechin
y = 14245,52x - 68,81
0,9998
1,12
3,36
p-hydroxybenzaldehyd
y = 7753,30x + 3779,64
0,9963
0,24
0,71
prokyanidin B1
y = 6651,00x + 342,98
0,9999
1,22
3,66
prokyanidin B2
y = 7403,92x + 221,36
0,9999
0,69
2,07
y = 20755,03x + 7008,79
0,9982
0,42
1,33
Název látky
[ng/ml] [ng/ml]
kyselina p-
vanilin
[μg/ml] [μg/ml] resveratrol
y = 3005,32x - 85,28
60
0,9996
0,21
0,63
7.2
Statistické vyhodnocení
Statistická vyhodnocení naměřených hodnot u všech vzorků vín jsou uvedeny v příloze 2. Bylo provedeno vyhodnocení pomocí následujících statistických veličin: aritmetický průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Průměrné obsahy fenolických sloučenin u všech zkoumaných vín jsou vyneseny v následujících tabulkách.
61
Tab. 11 Průměrné hodnoty stanovovaných fenolických sloučenin ve vzorcích červených a růžových vín v mg/l SV08
SV10
SV11
SV12
FR11
ZWT11
kyselina ferulová kyselina gallová kyselina chlorogenová kyselina kávová kyselina p-kumarová kyselina p-hydroxybenzoová kyselina protokatechová kyselina salicylová kyselina sinapová kyselina syringová kyselina vanilová 3,4-dihydroxybenzaldehyd vanilin p-hydroxybenzaldehyd
0,212 3,430 0,003 2,612 2,202 0,143 0,800 0,143 0,002 1,902 1,104 0,041 0,006 0,035
0,595 16,592 0,043 9,138 5,899 0,685 4,196 0,616 0,024 2,846 2,613 0,012 n.d. 0,001
0,112 4,269 n.d. 0,927 1,755 0,206 0,913 0,100 0,005 1,933 1,347 0,031 0,006 0,023
0,119 2,415 0,002 0,561 0,732 0,141 0,613 0,051 0,006 1,346 1,372 0,016 0,002 0,024
0,504 9,582 0,005 3,556 3,012 0,440 1,295 0,175 0,049 4,405 3,052 0,049 0,003 0,011
0,277 2,417 0,002 1,004 1,425 0,177 0,312 0,053 0,017 1,862 0,835 0,013 0,003 0,016
ZWT rosé 0,171 0,643 0,008 0,723 0,520 0,224 0,679 0,117 0,009 1,351 0,535 0,060 0,011 0,042
epikatechin
3,770
9,728
8,330
9,257
20,334
7,460
0,974
katechin
6,711
14,666
14,275
15,631
14,855
4,639
1,105
prokyanidin B1
0,604
2,094
1,625
1,793
2,233
1,313
0,065
0,942 0,480 25,142
2,830 0,280 72,858
3,948 0,180 39,985
3,875 0,995 38,951
6,088 1,213 70,861
4,532 0,668 27,025
0,118 0,095 7,450
Flavonoidy
Fenolové kyseliny
Sloučenina
prokyanidin B2 Stilben resveratrol Celkový obsah fenolických sloučenin
62
Flavonoidy
Fenolové kyseliny
Tab. 12 Průměrné hodnoty stanovovaných fenolických sloučenin ve vzorcích bílých vín v mg/l Sloučenina kyselina ferulová kyselina gallová kyselina chlorogenová kyselina kávová kyselina p-kumarová kyselina p-hydroxybenzoová kyselina protokatechová kyselina salicylová kyselina sinapová kyselina syringová kyselina vanilová 3,4-dihydroxybenzaldehyd vanilin p-hydroxybenzaldehyd
VZ08 0,518 0,338 n.d. 1,015 1,382 0,149 0,467 0,765 0,015 0,116 0,133 0,060 1,425 4,675
VZ10 0,771 2,143 0,010 1,944 3,208 0,403 1,139 0,831 0,036 78,154 0,277 0,037 1,654 4,919
VZ11 0,215 0,373 0,006 0,347 0,205 0,184 0,571 0,083 0,002 0,115 0,155 0,010 1,021 3,785
VZ12 0,609 0,354 n.d. 0,825 0,535 0,125 0,178 0,029 0,017 0,08 0,12 0,009 1,035 3,913
MT10 0,723 2,514 0,006 3,516 4,245 0,852 2,863 0,497 0,022 0,247 0,385 0,041 5,483 8,516
MT12 0,981 0,862 0,013 1,797 1,185 0,395 1,391 0,168 0,038 0,343 0,595 0,064 1,121 2,244
SG10 0,460 3,855 0,008 2,527 3,042 0,559 1,497 0,361 0,011 0,445 0,483 0,059 1,056 1,674
RB11 0,170 1,598 0,005 0,922 0,395 0,369 0,943 0,090 0,005 0,096 0,164 0,017 1,715 3,226
epikatechin
0,062
0,047
0,074
0,020
0,044
0,033
0,055
0,043
katechin
0,161
0,211
0,132
0,233
0,447
0,184
0,005
0,170
prokyanidin B1
0,089
0,233
0,084
0,142
0,532
0,161
0,036
0,058
0,009 0,726 12,105
0,006 0,210 96,233
n.d. 0,185 7,547
0,001 0,173 8,398
0,007 0,588 31,528
0,004 0,055 11,634
0,022 0,142 16,297
0,001 0,022 10,009
prokyanidin B2 Stilben resveratrol Celkový obsah fenolických sloučenin
63
7.3 Porovnání jednotlivých fenolických látek ve zkoumaných vzorcích vín V tabulkách 10 a 11 jsou vypsány průměrné obsahy stanovovaných fenolických sloučenin u jednotlivých vzorků červených, růžových a bílých vín. V červených vínech byla, co se týče fenolových kyselin, nejvýrazněji zastoupena u všech vzorků kyselina gallová. Nejvyšších hodnot dosahovala u Svatovavřineckého vína, ročník 2010 a to 16,592 mg/l. Další významná množství byla nalezena u vína Frankovky 2011. Z bílých vín byla zastoupena ve větším množství v Sauvignonu, ovšem její množství nepřekročilo 4 mg/l. Ze zjištěných poznatků můžeme usuzovat, že se kyselina gallová vyskytuje ve větší míře právě u červených vín. Její množství ve vínech je ovšem závislé na zpracování hroznů, výroby vína až po lahvování, tedy na celém procesu vinifikace. Kyselina kávová byla identifikována téměř u všech vzorků ve vyšších koncentracích. Nejvyšší hodnoty dosáhla opět u vína Svatovavřinecké 2010 a to 9,138 mg/l. Nejnižších hodnot dosáhla u odrůdy Svatovavřinecké 2012, pouhých 0,561 mg/l. Kyselina chlorogenová se ve vzorcích nevyskytuje ve vysokých hodnotách. Její nejvyšší obsah byl ve víně Svatovavřinecké 2010 0,043mg/l. V ostatních vzorcích nepřesáhla koncentrace 0,013mg/l. Výskyt kyseliny p-kumarové činil 5,899 mg/l u odrůdy Svatovavřinecké 2010. U bílých vín byl celkový obsah o něco nižší a činil ve víně Müller Thurgau 2010, 4,245 mg/l. Při identifikaci fenolických sloučenin, byly stanoveny také flavanoly katechin a epikatechin. Obsah epikatechinu nabýval nejvyšších hodnot u Frankovky 2011 20,334 mg/l. Vyzráváním se u Frankovky zvýrazňuje chuť spolu s osobitou vůní a dávají tak vínu osobitý charakter. U ostatních červených vín se pohyboval v rozmezí 3,770 až 9,728 mg/l. V bílých vínech od 1,021 mg/l u odrůdy Veltlínské zelené 2011 až po 5,483 mg/l u Müller Thurgau 2010. Následně byl stanoven obsah katechinu, který byl značně vyrovnaný u červených odrůd vín Svatovavřinecké 2010, 2011, 2012 a Frankovka 2011 (14,275 až 15,631 mg/l) a u bílých vín Veltlínské zelené 2008, 2010, 2011, 2012 Müller Thurgau 2012 (2,244 až 4,675 mg/l), Sauvignon 2010 a Rulandské bílé 2011, kde se jeho koncentrace pohybovala v rozmezí 1,674 mg/l až 4,919 mg/l. U Müllera Thurgau 2010 dosahoval obsah katechinu dokonce k 8,516 mg/l. 62
Opomenout nelze ani hodnoty prokyanidinu B1 i B2. Prokyanidin B2 nabyl nejvyšších hodnot u Frankovky 2011 6,088 mg/l. Koncentrace ostatních látek nebyly příliš významné.
7.4
7.4.1
Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stáří
Posouzení
změny
zastoupení
fenolických
látek
vlivem
stáří
ve Svatovavřineckém víně
V této kapitole jsem posuzovala, jaký má vliv stáří vína na změnu zastoupení obsahu fenolických sloučenin. Použito bylo odrůdové Svatovavřinecké víno a to ve čtyřech ročnících (2008, 2010, 2011, 2012). Tato odrůda má velmi intenzivní granátovou barvu, příjemnou
vůni
a
typickou
plnou
chuť.
V
některých
ročnících
se objevuje značné množství kyselin, které se ale postupně odbourávají (Pátek, 2001).
cm [mg/l] 20 16 12 8 4 0
SV12
SV11
resveratrol
vanilin
prokyanidin B2
prokyanidin B1
p-h-benzaldehyd
katechin
SV08 epikatechin
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k. kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. syringová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd
SV10
Obr. 10 Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve čtyřech ročnících Svatovavřineckého vína v mg/l
63
(Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd) Posuzování změn zastoupení fenolických látek je patrné z obrázku 10. Nejméně byla zastoupena kyselina chlorogenová, jejíž obsah se během roku snížil natolik, že ji v roce 2011 nebylo možné detekovat. Naopak obsah kyseliny sinapové se zvýšil téměř pětkrát a vzrostl tedy z původních 0,005 mg/l na 0,024 mg/l. Nejvýraznější vliv stáří bylo vidět u většiny kyselin (gallové, kávové, p-kumarové, p-hydroxybenzoové, protokatechové, salicylové a syringové), kdy došlo k nárůstu koncentrací těchto látek. Například koncentrace kyseliny gallové byla v roce 2012 2,415 mg/l, v roce 2011 4,269 mg/l, ale v roce 2010 stoupla až na 16,592 mg/l. U kyseliny kávové tomu bylo obdobně. Ve Svatovavřineckém víně byla zastoupena v roce 2012 0,562 mg/l, v roce 2011 obsah mírně vzrostl na 0,927 mg/l a markantní navýšení koncentrace vidíme v roce 2010, kdy se obsah zvýšil na 9,138 mg/l. Ročník 2008 dosahoval oproti roku 2010 nízkých hodnot. Důvodem může být přezrálost vína a to z toho důvodu, že jakostní vína zrají od jednoho do tří let. Tento fakt se nám potvrdil, neboť největší podíl fenolických látek byl právě v roce 2010. Poměrně vyrovnaná koncentrace ve Svatovavřineckém víně v letech 2010, 2011 a 2012 je patrná u katechinu a epikatechinu. Což je pozitivní zjištění, protože katechin má velký pozitivní vliv na lidské zdraví (antioxidační vlastnosti - vychytávání volných radikálů) a podle nejnovějších studií má také schopnost omezovat agregaci trombocytů a tím snižovat riziko vzniku krevních sraženin. 7.4.2 Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stárnutí ve víně Müller Thurgau
K porovnání zastoupení fenolických látek v závislosti na stáří bylo použito dvou ročníků vín a to Müller Thurgau 2010 a 2012. Müller Thurgau je kříženec Ryzlinku rýnského a Madlenky královské. Víno je méně kyselé a vyznačuje se jemnou muškátovou vůní a chutí po vyzrálé broskvi. Správně zvládnutou technologií by se mělo vyrobit víno, které by se mělo pít mladé a svěží (Kraus a kol., 2005).
64
cm [mg/l] 10 8 6 4 2 0
reveratrol
vanilin
prokyanidin B2
MT10
prokyanidin B1
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k. kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. syringová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd epikatechin katechin p-h-benzaldehyd
MT12
Obr. 11 Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve dvou ročnících vína Müller Thurgau v mg/l (Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd) Z obrázku 11 je opět patrné, jak velký má vliv stáří na obsah fenolických látek ve víně. Markantně stoupl obsah nejen fenolových kyselin, ale také flavonoidů. Flavanol katechin, stoupl z původních 2,244 mg/l na 8,516 mg/l během pouhých dvou let. Epikatechin
se
zvýšil
téměř pětkrát, z
1,121 mg/l
na
5,483
mg/l.
A ani nárůst koncentrace u katechinu není zanedbatelný. Zatím co v roce 2012 byla koncentrace jen 2,244 mg/l, v roce 2010 již činila 8,516 mg/l. Také u kyseliny p-kumarové se zvýšil obsah z 1,185 mg/l na 4,245 mg/l. Nepatrné poklesy koncentrací byly naměřeny u 3,4-dihydroxybenzaldehydu, kyseliny vanilové, sinapové, syringové a chlorogenové. Jednalo se však o velmi malé poklesy.
65
7.4.3 Posouzení změny zastoupení fenolických látek vlivem stárnutí ve víně Veltlínské zelené
Víno Veltlínské zelené je vyšlechtěno z odrůdy Tramín. Zapsáno bylo do Státní odrůdové knihy v roce 1941. V současné době patří Veltlínské zelené k druhé nejpěstovanější odrůdě v České republice. Nejvíce se pěstuje ve Znojemské podoblasti. Víno je plné s hořkomandlovou příchutí (Kraus a kol., 2005).
cm [mg/l] 5 4 3 2 1 0
VZ12
VZ11
resveratrol
vanilin
prokyanidin B2
prokyanidin B1
p-h-benzaldehyd
VZ08 katechin
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k. kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd epikatechin
VZ10
Obr. 12 Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve čtyřech ročnících vína Veltlínské zelené v mg/l (Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd)
V obrázku 12 vidíme zastoupení jednotlivých fenolických sloučenin ve čtyřech ročnících Veltlínského zeleného. Co se týče flavanolů katechinu a epikatechinu vidíme, že v jednotlivých letech se jejich koncentrace zvyšuje. V roce 2008 se hodnota nepatrně snížila, ale pořád byla na srovnatelné hodnotě s ročníkem 2010. Z dalších látek stojí 66
za zmínku obsah kyseliny gallové, která byla nejvyšší v roce 2010 2,143 mg/l a i u ostatních látek byla koncentrace v roce 2010 nejvyšší. Kyselina kávová dosáhla 1,944 mg/l a kyselina p-kumarová 3,208 mg/l. Kyselina syringová, která v roce 2010 nabyla hodnot 78,154 mg/l, byla z grafu vyřazena z důvodu lepšího rozpoznání minoritních složek v grafu. 7.4.4
Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech
Jak můžeme vidět v následujících obrázcích 13 a 14, má obsah fenolických látek vzrůstající tendenci a to od roku 2012 až do roku 2010 kdy bylo dosaženo maximální zralosti vín. Od roku 2010, tedy v našem případě v roce 2008 můžeme zjistit, že se obsah fenolických látek snížil a to proto, že již bylo víno přezrálé. U běžných jakostních vín se doba zrání pohybuje od 1 do 3 let po sklizni. Ideální zralost vína nezávisí jen na samotném víně, ale závisí i na chuti, kterou konzument upřednostňuje (Anonym 4).
SV08
MT12 VZ12 SV12 RB11 ZWT rosé11 ZWT11 FR11 VZ11 SV11 SG10 MT10 VZ10 SV10 VZ08 SV08
VZ08 SV10 VZ10
MT10 SG10 SV11 VZ11 FR11 ZWT11 ZWT rosé11 RB11 0
10
20
30
40 50 60 cm [mg/l]
70
80
90
Obr. 13 Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech v mg/l 67
SV12
2008 2012
2010 2011
2011
2012
2010 2008 0
5
10
15
20
25 30 35 cm [mg/l]
40
45
50
55
60
Obr. 14 Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech v mg/l
7.5
Porovnání
obsahu
derivátů
fenolových
kyselin
(kyseliny
benzoové a skořicové) ve vzorcích vín V této kapitole byly porovnány obsahy derivátů kyseliny benzoové a skořicové. Deriváty
kyseliny
benzoové
jsou:
kyselina
gallová,
protokatechová,
p-hydroxybenzoová, vanilová, salicylová, syringová, a 3,4-dihydroxybenzaldehyd a p-hydroxybenzaldehyd. Deriváty skořicové kyseliny jsou: kyselina ferulová, chlorogenová, kávová, p-kumarová, sinapová a vanilin. Celkový obsah derivátů kyseliny benzoové byl 187,833 mg/l a derivátů kyseliny skořicové 68,043 mg/l.
68
cm [mg/l] 40 deriváty kyseliny benzoové
20
RB11
SG10
MT12
deriváty kyseliny skořicové MT10
SV08 SV10 SV11 SV12 FR11 ZWT11 ZWT rosé VZ08 VZ10 VZ11 VZ12
0
Obr. 15 Porovnání obsahu derivátů benzoové a skořicové ve vzorcích vín v mg/l Celkový obsah derivátů kyseliny benzoové je vyšší než celkový obsah derivátů kyseliny skořicové. Na obrázku 15 si ale můžeme povšimnout, že u ročníků Svatovařinecké 2008, Sauvignon 2010, Müller Thurgau 2010 a Müller Thurgau 2012 je obsah derivátů kyseliny benzoové a skořicové prakticky vyrovnaný. U ostatních odrůd se hodnoty liší a to tak, že ve většině případů je koncentrace derivátů kyseliny benzoové vyšší než derivátů kyseliny skořicové. Nejvyšší
obsah
derivátů
kyseliny benzoové
byl
naměřen
u
odrůdy
Svatovavřinecké 2010, kde dosahoval hodnot 27,561 mg/l, taktéž deriváty kyseliny skořicové dosahovaly nejvyšších hodnot právě u této odrůdy a to 15,699 mg/l. Naopak nejnižší obsah derivátů kyseliny benzoové byl naměřen u odrůdy Veltlínské zelené 2012 0,915 mg/l a nejnižší obsah derivátů kyseliny skořicové u odrůdy Veltlínské zelené 2011 0,775 mg/l. Obsah derivátů kyseliny benzoové je u červených vín (74,653 mg/l) nižší než u vín bílých (109,529mg/l). Co se týče derivátů kyseliny skořicové, je obsah u bílých (31,781 mg/l) i červených vín (34,821 mg/l) prakticky vyrovnaný.
69
7.6
Posouzení vlivu barvy vína na obsah fenolických sloučenin
Červená vína se vyznačují barvou od světle červené, přes cihlově červenou, rubínovou až po ohnivě tmavě červenou. Intenzita barvy záleží na odrůdě, zralosti hroznů a samozřejmě i na technologii výroby vína. Při stárnutí vín se mění barva ze světle červené na tmavě červenou. Širokou škálou odstínů barev od světle zelenkavých, přes žlutozelené a jantarově žluté barvy se vyznačují vína bílá. Podle barvy se dá snadno určit stav i charakter vín. Mladá vína mají intenzivní zelenkavou barvu, zatímco vyšší intenzitu barvu mají vína nedostatečně sířená. U mladých vín může vyšší barva ukazovat i na nedokonalé vyškolení vína, působení oxidačních enzymů nebo i vyšším obsahem tříslovin u vín, které jsou vyrobeny z nedozrálých hroznů s nezdřevnatělými třapinami (Kraus a kol., 1997). V obrázku 16 můžeme vidět, že obsah fenolických látek je obecně vyšší u červených vín než u bílých. Jejich obsah u červených vín byl vyrovnaný u odrůd Svatovavřinecké 2008 a Zweigeltrebe 2011, dále u odrůd Svatovavřinecké 2011 a 2012 a Frankovka 2011 a Svatovavřinecké 2010. Koncentrace fenolických sloučenin u bílých vín byl vcelku vyrovnaný, pouze u Veltlínského zeleného 2010 byla koncentrace vyšší, a to z důvodu vysokého obsahu kyseliny syringové. V kategorii růžových vín nejsou hodnoty průkazné, protože byl použit pouze jeden zástupce Zweigeltrebe rosé, svými hodnotami se ale blíží spíše hodnotám bílých vín.
70
SV08 SV10 RB11 SG10 MT12 MT10 VZ12 VZ11 VZ10 VZ08 ZWT rosé ZWT11 FR11 SV12 SV11 SV10 SV08
SV11 SV12 FR11 ZWT11 ZWT rosé
VZ08 VZ10 VZ11 VZ12 MT10 MT12 SG10 0
10
20
30
40
50
60
70
80
RB11 100 cm[mg/l]
90
Obr. 16 Posouzení vlivu barvy na obsah fenolických látek u zkoumaných vzorků vín v mg/l Červená (6,451
vína mg/l),
se
vyznačovala
kyseliny
kávové
vysokou (2,966
koncentrací mg/l),
kyseliny
katechinu
(11,796
gallové mg/l)
a epikatechinu (9,813 mg/l) a v neposlední řadě také prokyanidinů B1 (1,610 mg/l) a B2 (3,703 mg/l). Majoritní látkou u bílých vín dosahovala kyselina syringová. Její obsah v bílých vínech činil 9,950 mg/l. Kyselina gallová, kávová a p- kumarová dosahovaly přibližně stejných koncentrací u bílých vín od 1,505 mg/l až do 1,775 mg/l. Větší obsah fenolických sloučenin byl u červených vín.
71
Červená vína
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k.kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. syringová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd epikatechin katechin p-h-benzaldehyd procyanidin B1 procyanidin B2 vanilin resveratrol
Obr. 17 Koncentrace fenolických sloučenin u červených vín v mg/l (Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd)
72
Růžová vína
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k.kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. syringová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd epikatechin katechin p-h-benzaldehyd procyanidin B1 procyanidin B2 vanilin resveratrol
Obr. 18 Koncentrace fenolických sloučenin u růžových vín v mg/l (Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd)
73
Bílá vína
k. ferulová k. gallová k. chlorogenová k.kávová k. p-kumarová k. p-hydroxybenzoová k. protokatechová k. salicylová k. sinapová k. syringová k. vanilová 3,4-d-h-benzaldehyd epikatechin katechin p-h-benzaldehyd procyanidin B1 procyanidin B2 vanilin resveratrol
Obr. 19 Koncentrace fenolických sloučenin u bílých vín v mg/l (Legenda: k.: kyselina; p-h-benzaldehyd: p-hydroxybenzaldehyd; 3,4-d-h-benzaldehyd: 3,4-dihydroxybenzaldehyd)
7.7
Porovnání flavonoidů a fenolových kyselin v jednotlivých
vzorcích zkoumaných vín V následujícím obrázku 20 byly srovnávány u jednotlivých vzorků vín zastoupení fenolových kyselin a flavonoidů. Celková koncentrace fenolových kyselin činila 255,876 mg/l a koncentrace flavonoidů 214,135 mg/l. Je tedy vidět, že obsah fenolových kyselin je o trochu vyšší, než obsah flavonoidů. V odrůdách Svatovavřinecké 2008, Veltlínské zelené 2008, Müller Thurgau 2010 a Rulandské bílé 2011. U většiny červených vín převažoval obsah flavonoidů, což je dobré zjištění, neboť flavonoidy mají antioxidační účinek a potvrzuje to fakt, že pití červeného vína pozitivní vliv na lidské zdraví. U bílých byl u většiny vín obsah srovnatelný.
74
RB11 SG10 MT12 MT10 VZ12 VZ11 VZ10 VZ08 ZWT rosé ZWT11 FR11 SV12 SV11 SV10 SV08
Flavonoidy Fenolové kyseliny
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
cm [mg/l]
Obr. 20 Porovnání fenolových kyselin a flavonoidů ve sledovaných vzorcích vín v mg/l
7.8
Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vzorcích vín
V obrázku 21 vidíme zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vzorcích vín. Nejvyšších hodnot, co se týče červených vín, dosáhl v roce 2011 ve Frankovce 1,213 mg/l. Druhá nejvyšší koncentrace následovala v roce 2012 v odrůdě Svatovavřinecké 0,995 mg/l. V bílých vínech činila koncentrace resveratrolu u Veltlínského zeleného v roce 2008 0,726 mg/l a u odrůdy Müller Thurgau 2008 0,588 mg/l. Jak můžeme vidět v obrázku 21, byl celkový obsah resveratrolu u bílých vín o polovinu nižší než u vín červených. Obsah resveratrolu u růžových vín není průkazný, neboť zástupce růžových vín byl pouze jeden vzorek Zweigeltrebe rosé. Obrázek 22 ukazuje u vín změnu obsahu resveratrolu v jednotlivých letech. Nejbohatší na resveratrol byla vína ročníku 2011, kdy jeho obsah dosáhl téměř k 2,5 mg/l, což je o polovinu více než u ročníků ostatních.
75
1,4 cm [mg/l] 1,2 1 0,8
0,6 0,4 0,2 0
Obr. 21 Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vzorcích vín v mg/l
2012 2008 2011
2010 2011
2010
2012
2008 cm [mg/l]
0
0,5
1
1,5
2
Obr. 22 Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých letech v mg/l
76
2,5
8
DISKUZE
V současné době je hodně pozornosti věnována látkám, které mají pozitivní vliv na lidské zdraví. Mezi tyto látky řadíme i fenolické sloučeniny. Kladný účinek byl prokázán hlavně jako prevence rakoviny a kardiovaskulárních onemocnění. Moderní metody, kterými můžeme identifikovat a kvantifikovat fenolické sloučeniny jsou plynová chromatografie, vysokoúčinná kapalinová chromatografie a elektromigrační metody. V této diplomové práci byla použita právě vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí pro její vysokou citlivost, efektivitu i rozlišovací schopnost (Manach a kol., 2004; Boudet, 2007) Obsah fenolických sloučenin se ve zkoumaných vzorcích vín odlišuje. Tato odlišnost byla zkoumána u jednotlivých vzorků vín v závislosti na stáří a barvě. Samozřejmě, že tyto rozdíly v obsahu nejsou způsobeny pouze stářím a barvou vína, ale také řadou dalších faktorů. Jako ty nejvýznamnější jmenujme odrůdu hroznů, zralost hroznů, klimatické podmínky, technologie výroby vína (například rychlost a tlak při lisování, teplota macerace, teplota kvašení hroznů), a v neposlední řadě také vliv skladování a stárnutí vín. Tyto jmenované faktory ovlivňují tedy nejen obsah fenolických sloučenin ve víně, ale také antioxidační aktivitu (Granato a kol., 2011). Při posuzování koncentrací fenolových kyselin bylo zjištěno narůstající množství kyseliny gallové, kávové, p-kumarové. Koncentrace kyseliny gallové byla výraznější u červených vín a to z toho důvodu, že se hydrolýzou flavonoidů tvoří fenolové kyseliny gallát estery. Uvádí se, že by obsah kyseliny gallové měl činit v průměru pro červené víno 70 mg/l. Takové množství jsme v našich zkoumaných vínech nenalezli, přesto se koncentrace kyseliny gallové zvýšila ve starších ročnících. Při vyhodnocování výsledků byl zaznamenán také vyšší obsah kyseliny kávové a kumarové u červených vín. U vín bílých byl taktéž nejvýznamnější obsah kyseliny gallové a kávové, ovšem nedosahovaly takových hodnot jako u červených vín. Jmenované kyseliny mají podle literatury nejvýznamnější antioxidační aktivitu (Waterhouse, 2002; Minussi a kol., 2003). Obsah stilbenu resveratrolu se v měřených vzorcích lišil. V našem případě byl stanovován trans-resveratrol. V literatuře je stilben resveratrol spojován spíše s výskytem v červených vínech. Samozřejmě, že jeho množství je ovlivněno opět řadou podmínek (odrůda, klimatické podmínky, technologie výroby). Dle literatury 77
Atanacković a kol., (2012) se celkové množství resveratrolu pohybuje u červených vín v rozmezí 0,35 až 4,85 mg/l. V námi naměřených vzorcích se obsah resveratrolu pohyboval v rozmezí 0,480 až 1,213 mg/l. Nejvyšší hodnota byla naměřena u odrůdy Frankovky 2011 a nejnižší u odrůdy Svatovavřinecké 2011. Z bílých vín obsahovalo největší koncentraci resveratrolu Veltlínské zelené 2008. Vzorky, které byly analyzovány, pochází z České republiky. V literatuře je uvedeno, že u vín pocházející z České republiky lze očekávat vyšší obsah trans-resveratrolu, právě díky našim klimatickým podmínkám (Kolouchová-Hanzlíková a kol., 2004). Jedním z cílů této diplomové práce bylo zjistit, jak se vlivem stáří vín změní obsah fenolických sloučenin. To jsme pozorovali u tří odrůd vín a to Svatovavřinecké (2008, 2010, 2011, 2012), Veltlínské zelené (2008, 2010, 2011, 2012) a Müller Thurgau 2010 a 2012. Zjistili jsme, že ve starších ročnících vín 2011 a 2010 došlo k nárůstu fenolických sloučenin, přičemž nejvyšších hodnot bylo dosaženo v roce 2010. V roce 2008 se hodnota většiny fenolických sloučenin opět snížila, což bylo zapříčiněno tím, že jakostní víno zraje po dobu jednoho až tří let, kdy se koncentrace fenolických látek zvyšují zráním v lahvích, poté obsahy látek opět klesají. Koncentrace flavonoidů katechinu, epikatechinu, prokyanidinu B1 a B2 byly sledovány v jednotlivých a odrůdách a letech. U většiny červených vín byl celkový obsah katechinu a epikatechinu vyšší než obsah fenolových kyselin. Což potvrzuje i Katalinic a kol., (2003). Flavanoly mají vysokou antioxidační aktivitu a chrání proti kardiovaskulárním onemocněním, omezují agregaci trombocytů a snižují riziko vzniku krevní sraženiny. S obsahem fenolických sloučenin souvisí také barva. Velký význam hrají barviva antokyaniny. V měřených vzorcích vín bylo naměřeno významné množství derivátů kyseliny skořicové, které mohou být důvodem hnědnutí vín (Manach a kol., 2004;Torchio a kol., 2011). Střídmé pití vína má pozitivní vliv na snižování obsahu LDL cholesterolu v krvi a působení proti ischemické chorobě srdeční. V neposlední řadě je víno známé také jako antioxidant. Z našich naměřených výsledků vyplývá, že fenolické sloučeniny se stárnutím vín zvyšují, ale při překonání optimální doby zrání, což je u našich zkoumaných jakostních vín po třech letech, dochází ke snižování koncentrací těchto látek. Z daného vyplývá, že po překročení optimální doby zrání se snižuje antioxidační aktivita.
78
9
ZÁVĚR
Fenolické
látky
mají
obrovský
význam
pro
lidské
zdraví.
Projevují
se antioxidačním účinkem (omezují aktivitu kyslíkových radikálů). Největší význam fenolických látek spočívá v tom, že snižují riziko rakovinových onemocnění, působí proti virům a jako prevence proti koronárním chorobám. V rámci mé diplomové práce na téma „Monitoring fenolických sloučenin ve víně“ se staly fenolické sloučeniny předmětem
zkoumání.
Červená
vína
ve
sledovaném
souboru
reprezentuje
Svatovavřinecké, Frankovka a Zweigeltrebe, bílá vína zastupují Veltlínské zelené, Sauvignon, Rulandské bílé a Müller Thurgau, jako vzorek růžového vína byl vybrán Zweigeltrebe rosé. Výše zmíněné odrůdy jsou zástupci velmi kvalitních vín jižní Moravy, byly zakoupeny ve Vinařství Jaroslav Tichý a vybrány z důvodu možnosti sledování změn obsahu fenolických sloučenin v jednotlivých letech výroby (2008, 2010, 2011 a 2012), rok 2009 nebyl k dispozici, proto nebyl zahrnut do měřené skupiny vín. V literárním přehledu je stručně nastíněno chemické složení vína, technologie výroby vína a rozdělení fenolických sloučenin. V praktické části byl sledován obsah jednotlivých fenolických látek v rámci zkoumaných vín. Porovnáván poměr množství derivátů kyseliny benzoové a skořicové, vliv stáří a barvy na obsah fenolických sloučenin u bílých, červených a růžových vín. Fenolické
složení
vín
je
ovlivněno
řadou
faktorů.
Především
odrůdou,
ale i agrotechnikou, technologií výroby vína, podmínkami skladování a stárnutím. Všechny
vzorky
byly
separovány
pomocí
vysokoúčinné
kapalinové
chromatografie s hmotnostní detekcí (HPLC-MS). Pro detekci derivátů kyseliny benzoové a skořicové, jejichž zástupci jsou kyselina ferulová, chlorogenová, gallová, kávová, protokatechová, p-kumarová, p-hydroxybenzoová, syringová, salicylová, sinapová, 3,4-dihydroxybenzaldehyd, vanilová a vanilin. Nejprve musela být provedena extrakce na pevné fázi podle Matějíčka a kol., 2004. Při srovnávání množství derivátů kyseliny benzoové a skořicové u zkoumaných vzorků vín, jsme došli k poznatkům, že celkový obsah derivátů kyseliny benzoové je vyšší, než celkový obsah derivátů kyseliny skořicové a to tak, že množství derivátů kyseliny benzoové byl 187,833 mg/l a derivátů kyseliny skořicové 68,043 mg/l. U ročníků Svatovařinecké 2008, Sauvignon 2010, Müller Thurgau 2010 a Müller
79
Thurgau 2012 byl obsah derivátů kyseliny benzoové a skořicové prakticky vyrovnaný. U ostatních odrůd se hodnoty liší a to tak, že ve většině případů je koncentrace derivátů kyseliny benzoové vyšší než derivátů kyseliny skořicové. Posuzování změn zastoupení fenolických látek v závislosti na stáří vín bylo demonstrováno na odrůdě Svatovavřinecké ročník 2008, 2010, 2011 a 2012. Nejvýraznější vliv stárnutí bylo vidět u většiny kyselin (gallové, kávové, p-kumarové, p-hydroxybenzoové, protokatechové, salicylové a syringové), kdy došlo k nárůstu koncentrací těchto látek. Například koncentrace kyseliny gallové byla v roce 2012 2,415 mg/l, v roce 2011 4,269 mg/l, ale v roce 2010 stoupla až na 16,592 mg/l. Poměrně vyrovnaná koncentrace ve svatovavřineckém víně v letech 2010, 2011 a 2012 je patrná u katechinu a epikatechinu, což je pozitivní zjištění. U odrůdy Müller Thurgau se potvrdilo, jak velký má vliv stárnutí na obsah fenolických látek ve víně. Markantně stoupl obsah nejen fenolových kyselin, ale také flavanoidů. Například flavanol katechin, stoupl z původních 2,244 mg/l na 8,516 mg/l během pouhých dvou let. Dalším zkoumaným prvkem byla závislost obsahu fenolických sloučenin na barvě vína. Zastoupení vybraných fenolických sloučenin má nejvyšší úroveň u červených vín. U bílých vín dosahovaly fenolické látky asi poloviny obsahu fenolických látek v červeném víně. Obsah fenolických látek je spojován s metodou zpracování hroznů a také technologii výroby vín. Koncentrace fenolických sloučenin byl u červených vín vyrovnaný u odrůd Svatovavřinecké 2008 a Zweigeltrebe 2011, dále u odrůd Svatovavřinecké 2011 a 2012 a Frankovka 2011 a Svatovavřinecké 2010. Koncentrace fenolických sloučeninu bílých vín byl vcelku vyrovnaný, pouze u Veltlínského zeleného 2010 byla koncentrace vyšší, a to z důvodu vysokého obsahu kyseliny syringové. V současnosti se věnuje stále větší pozornost zdravotnímu hledisku pití vína, a to především ve vztahu k prevenci a léčbě některých civilizačních chorob. Jedná se zejména o velmi rozšířené srdeční a cévní onemocnění. Fenolové sloučeniny, které jsou obsažené ve víně, mají ochranný účinek na cévy, napomáhají funkci srdce a udržování lepšího krevního oběhu. Díky vysokoúčinné kapalinové chromatografii s hmotnostní detekcí můžeme najít i stopové množství těchto látek. V práci se dosáhlo zajímavých výsledků, které nám pomohly zmonitorovat obsah fenolických sloučenin v jednotlivých odrůdách v severozápadní znojemské vinařské podoblasti. 80
10
POUŽITÁ LITERATURA
ALMEIDA, C. M. R. -- VASCONCELOS, M. T. S. D.: Multielement Composition of Wines and Their Precursors Including Provenance Soil and Their Potentialities As Fingerprints of Wine Origin. J. Agric. Food Chemistry 2003, 51, 4788-4798 s., ISSN 00218561
ALONSO M. a kol.,: Determination of Antioxidant Activity of Wine Byproducts and Its Correlation with Polyphenolic Content , J. Agric. Food Cheistry 2002, 50 (21), 5832–5836 s. ANDERSEN, Ø. M. -- MARKHAM, K. R.: Flavonoids : chemistry, biochemistry, and applications. 1. Vydání, USA: Taylor & Francis Group, 2006. 1197 s. ISBN 0-8493 -2021-6
ARNOUS, A. -- MARKIS, D. P. -- KEFALAS, P.: Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant characteristics of aged red wines. J. Agric. Food Chemistry 2001, 49, 5736-5742 ATANACKOVIĆ, A. a kol.,: Influence of winemaking techniques on the resveratrol content, total phenolic content and antioxidant potential of red wines. Food Chemistry. 2012, 131, s. 513-518. Dostupné z: WWW:
.
BOUDET: Phytochemistry 2007 Nov-Dec., 68 (22-24):2722-2735 s. ČERVENKA, J. – SAMEK, M.: Potravinářské zbožíznalství, 2. vydání, Praha: Credit 2004, 213 s., ISBN 80-213-1151-7 DAVÍDEK, J. -- JANÍČEK, G. -- POKORNÝ, J.: Chemie potravin. Praha: SNTL, 1983. 629 s.
81
DEL ALAMO, M., a kol.,: Red wine aging in oak barrels: evolution of the monosaccharides content, Food Chemistry 2000, vol. 71, 189-193 s., ISSN 0308 -8146/00
DIXON R. A. -- FERREIRA D.: Phytochemistry, 2002/60, 205 s. DOLEŽAL, V.: Polyfenoly ve víně, Vinařský obzor. 1.1.2000, roč. 93/2000, č. 10, 352-353 s., ISSN 1212-7884. DOLEŽAL, V.: Víno a zdraví, 2008 [online], [cit. 2013-3-2]. Dostupné na www: <www.gastro-server.com/jpz/pagepiti/vino_a_zdravi.php> DUDAŠ, F., a kol.: Skladování a zpracování rostlinných výrobků, Praha 1981, 89 s. EDWARDS, M.: Červené víno: Průvodce pro znalce, 1. vydání, Praha: Slovart 2001, 256s., ISBN 80-7209-211-1 FARKAŠ, J.: Technológia a biotechnológia vína, Nakladatelství
technickej
a ekonomickej literatury Bratislava 1973, 776 s. FELDKAMP, H.: Domácí výroba vína: vlastní víno z hroznů, ovoce, bylinek a květů, Praha: Víkend 2003, 125 s, ISBN 80-7222-267-8. FREMONT, L.: Biological effects of resveratrol, Life Science 2000, 66, 663 – 673 s.
FUJITA, A. a kol.: Anthocyanidin Reductase Gene Expression and Accumulation of Flavan-3-ols in Grape Berry, American Journal of Enology and Viticulture, 2005/56, 336 – 337 s.
JEONG, S. T. a kol.: Expression of multi-copy flavonoid pathway genes coincides with anthocyanin, flavonol and flavan-3-ol accumulation of grapevine, Vitis 2008/47, 135 – 140s.
82
GRANATO, D. -- KATAYAMA, F. Ch. U. -- ALVES DE CASTRO, I. Phenolic composition of South American red wines classified according to their antioxidant activity, retail price and sensory quality. Food Chemistry. 2011, 129. Dostupné na www:
HANDIQUE, J. G. -- BARUAH, J. B.: Polyphenols compounds. Reactive and Functional Polymers, 2002/52, 163 – 188 s. HUBÁČEK, V. – MÍŠA, D.: Vinařův rok, Praha: Květ ČZS 1996, 110 s., ISSN 1214 -6099 JACKSON, R. S.: Wine Science: Principles and Applications, 3. vydání, Academic Press, Mar 2008, 751 s, ISBN-13:978-0123736468
JANG, M.: Cancer chemopreventive aktivity of resveratrol, a natural product derived from grapes, Science 275/1997, 218-220 s. JONES, F.: Víno: Každý den sklenku pro zdraví, 1. vydání, Praha: Knižní klub 1998, 235 s., ISBN 80-7176-756-5
KATALINIC, M. a kol.,: Antioxidant effectiveness of selected wines in comparison with (+)-catechin, University of Split, Department of Biochemistry and Food Chemistry, Faculty of Chemical Technology, 2003
KING A. -- YOUNG G. Characteristics and occurrence of phenolic phytochemicals. J. Am. Diet Assoc., 1999, roč. 99, č. 2, s. 213-218. KLEJDUS, B.: Separace a identifikace isoflavonů v rostlinném materiálu, Habilitační práce. Univerzita Palackého v Olomouci 2004, 51 s. KOHOUT, F.: O víně, 2. Doplněné vydání, Praha: Merkur, 1986. 265 s. ISBN 51-573 -86.
83
KOLOUCHOVÁ-HANZLÍKOVÁ,
I.
a
kol.
:Rapid
method
for
resveratrol
determination by HPLC with electrochemical and UV detections in wine. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. 2004, 87, s. 151-158. Dostupné na www: . KOPEC K.: Resveratrol – chemoprotektivni složka vinnych hroznů a vin. Zahradnictvi. Hort. Sci., 1999/26, č. 4, 135-138 s. KRAUS, V. a kol.: Encyklopedie českého a moravského vinařství, 1. vydání, Praha: Nakladatelství Melantrich a.s. 1997, 224s., ISBN 32-010-97 KRAUS, V. a kol.: Rukověť vinaře, 1. vydání, Praha: Květ, 2000. 262 s., ISBN 80-209 -0286-4 KRAUS, V. a kol.: Nová encyklopedie českého a moravského vína: 1. díl. 1. vydání, Praha: Praga Mystica, 2005. 306 s., ISBN 80-86767-00-0 KUMŠTA, M.: Zdraví prospěšné látky ve víně. Vinařský obzor. 1 – 2, ročník 99 / 2006, 48 – 49 s. KUTTELVAŠER, Z.: Abeceda vína, 1. vydání, Praha: Nakladatelství Radix spol. s.r.o. 2003, 296 s., ISBN 80-86031-43-8 LAHO, L. -- MINÁRIK E. -- NAVARA A.: Vinárstvo- chémia, mikrobioólia a analytika vína, Bratislava: Príroda 1970, 426 s. LACHMAN J. -- ORSAK M. -- PIVEC V.: Antioxidačni komplex bioflavonoidů a askorbove kyseliny v jablkach (Mulus pumila mill.), Chemické Listy, 2000, roč. 94, č. 9, 818-821s. MALÍK,
F.:
Dobré
víno,
2.
vydání,
ISBN 80-88780-04-7
84
Bratislava:
Polygrafia
1996,
341s,
MALÍK, F.: Ze života vína, Pardubice: Filip Trend 2003, 221s., ISBN 80-86282-27-9
MANACH, C. a kol.: Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr., 2004/79, č. 5, 727-747 s. MATĚJÍČEK, D. a kol.: Changes in contents of phenolic compounds during maturit of barrique red wines. LWT : Food Chemistry 2005/90, 791-800 s. MIKEŠ, O.: Sledování změn obsahu fenolikcýh kyselin v průběhu barikování vín. Vinařský obzor, 2004, 3, 127 s. MINÁRIK, E. – NAVARA, A.: Chémia a mikrobiológia vína, 1 vydání, Bratislava: Príroda 1986, 547s.
MINUSSI, R. C a kol.,: Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines. Food Chemistry. 2003, 82, s. 409-416. Dostupné na www: .
MURRAY, R. K., a kol.,: Harperova biochemie, Praha: H & H Praha, 1998 PÁTEK, J.: Zrození vína – všechno o zpracování hroznů, výrobě vína a jeho zrání, 3. vydání, Brno: Nakladatelství Jota s.r.o. 2001, 304 s., ISBN 80-7217-137-2 PAVLOUŠEK, P.: Možnosti nalezení optimálního termínu sklizně hroznů pro výrobu kvalitních vín. Vinařský obzor., 1.1.2005, roč. 98/2005, č. 7 - 8, 381-383 s., ISSN 1212 -7884. PAVLOUŠEK, P.: Výroba vína u malovinařů, 2. vydání, Praha: Grada 2010, 120 s. ISBN 978-80-247-3487-3 PAVLOUŠEK, P.: Fenolická kvalita – základ produkce kvalitních červených vín., Vinařský obzor, 2006/7-8, 360 s.
85
RAJDL D. a kol.,: Effect of White Wine Consumption on Oxidative Stress Markers and Homocysteine Levels Physiol. Res. 56: 203-212, 2007 RICHTER, J. Léčení vínem – Dobré víno náš nejlepší lék. Bratislava: Eko-konzult, 2002. 168 s. ISBN 80-89044-35-2. ROP, O. -- HRABĚ, J.: Nealkoholické a alkoholické nápoje, 1. vydání, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně 2009, 129 s, ISBN 978-80-7318-748-4 SALFELLNER, H.: Víno a medicína, Praha: Vitalis 1992, 192 s., ISBN 80-901370-0 -84. SEDLÁČEK, I. -- KOČÍ, L.: Nápoje: příprava a podávání, 1. vydání, Brno: Computer Press 2003, 162 s., ISBN 80-251-0002-2
SOLEAS, G. J., -- DIAMANDIS, E. P., -- GOLDBURG, D. M.: Wine as a Biological Fluid: History, Production, and Role in Disease Prevention. Journal of Clinical Laboratory Analysis 1997, 11, 287 – 313 s. SLANINA, J. -- TÁBORSKÁ, E.: Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka, Chemické listy, 2004, 9, s. 239 – 245 STANĚK, J.: Víno není vinno: kapitoly z dějin vína, 1. Vydání, Praha: Pasek 1998, 285 s, ISBN 80-7185-189-2 STÁVEK, J.: Macerace slupek versus barevnost klaretů, růžových a červených vín, Vinařský obzor, 2006/4: 178 s. STEIDL, R. -- SCHÖDL, H.: Sklepní hospodářství, 1. vydání, Valtice: Národní salon vín 2002, 307 s., ISBN 80-903201-0-4 STEVENSON, T.: Světová encyklopedie vína, Czech edition by Gemini Limited, 86
Bratislava; 3. přepracované vydání, Praha: Knižní klub v edici Balios, 2001, 502 s. ISBN 80-242-0619-6. SUKOVÁ, I.: Polyfenoly v ovoci a zelenině, Kvalita potravin, 6/2006,č. 2: 8-9 s. ŠAMÁNEK, M. -- URBANOVÁ Z.: Víno na zdraví, 1. vydání, Praha: Agentura Lucie 2010, 169 s., ISBN 978-80-87138-17-5 ŠMIDRKAL, J. a kol.: Resveratrol, Chemické Listy, 2011, 95, 602-609 s. ŠVEJCAR, V.: Vinařství: Základy technologie: Určeno pro posluchače zahradnické fakulty, 1. vydání, Brno: Vysoká škola zemědělská 1986, 56 s. TRNA, J. -- TÁBORSKÁ, E.: Přírodní polyfenolické antioxidanty [online]. [cit. 2013 - 04 -11]. Dostupné na www: <www.med.muni.cz/biochem/seminare/prirantiox.rtf>
TORCHIO, F. a kol.,: Changes in chromatic characteristics and phenolic composition during winemaking and shelf-life of two types of red sweet sparkling wines. Food Research
International.
2011,
44,
729–738.
Dostupné
na
www:
TRIOLI, G. -- HOFMANN, U.: Kodex dobrého ekologického vinohradnictví, Orwine. Brno: Svaz ekologické a integrované produkce vína Ekovín, 2009. 240 s. UHROVÁ, H.: Děláme si sami víno: rybízové, jahodové, šípkové, trnkové, révové a jiná ovocná vína, šťávy a mošty, 1. vydání, Vimperk: Víkend 2002, 93 s. ISBN 80-7222 -234-1 VELÍŠEK, J. – HAJŠLOVÁ, J.: Chemie potravin 1, 3. vydání, Tábor: OSSIS 2009, 602 s., ISBN 978-80-86659-15-2 VELÍŠEK, J. – HAJŠLOVÁ, J.: Chemie potravin 2, 3. vydání, Tábor: OSSIS 2009, 644s., ISBN 978-80-86659-16-9 87
VELÍŠEK, J.: Chemie potravin 2, Tábor: OSSIS 2002, 320s., ISBN 80-86659-01-1 VELÍŠEK, J.: Chemie potravin 3, Tábor: OSSIS 2002, 368s., ISBN 80-86659-02-X VÍNO & ZDRAVÍ [online]. 2003-2004 [cit. 2013-03-02]. Dostupné na www: <www.vinoazdravi.cz/index.php?soubor=latkove_slozeni_vina˃
VETRANO, A. M. a kol.,:Characterization of the oxidase activity in mammalian catalase, Journal of Biological Food Chemistry 29. 2005. 266 s.
WATERHOUSE, A.: Wine Phenolics, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 957, Alcohol And Wine In Health And Disease, Page 21-36, May 2002 ZLOCH, Z.: Zdravotní efekt polyfenolů z hlediska jejich příjmu a využitelnosti, Vojenské zdravotnické listy 2003, 226 – 229 s. ANONYM 1 [online], [cit. 2013-03-02]. Dostupné na www:
88
11
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 1
Kvercetin (Trna a Táborská, 2011)
14
Obr. 2
Katechin (Trna a Táborská, 2011)
17
Obr. 3
Proantokyanidin A (Trna a Táborská, 2011)
17
Obr. 4
Deriváty kyseliny benzoové (Anonym 1)
19
Obr. 5
Deriváty kyseliny skořicové (Anonym 2)
19
Obr. 6
Stilben (Velíšek, 2002)
21
Obr. 7
Resveratrol (Šmidrkal a kol., 2011)
23
Obr. 8
Schéma výroby vína (Červenka a Samek, 2004)
28
Obr. 9
Stanovení cukernatosti moštu (Steidl a kol., 2002)
29
Obr. 10
Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve třech ročnících Svatovavřineckého vína v mg/l
Obr. 11
Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve dvou ročnících vína Müller Thurgau v mg/l
Obr. 12
63
65
Porovnání změny zastoupení obsahových látek ve čtyřech ročnících vína Veltlínské zelené v mg/l
66
Obr. 13
Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech
67
Obr. 14
Posouzení zastoupení fenolických látek v jednotlivých letech
68
Obr. 15
Porovnání obsahu derivátů benzoové a skořicové ve vzorcích vín
69
Obr. 16
Posouzení vlivu barvy na obsah fenolických látek u zkoumaných vzorků vín
71
Obr. 17
Koncentrace fenolických sloučenin u červených vín
72
Obr. 18
Koncentrace fenolických sloučenin u růžových vín
72
Obr. 19
Koncentrace fenolických sloučenin u bílých vín
73
Obr. 20
Porovnání fenolových kyselin a flavonoidů ve sledovaných vzorcích vín
74
Obr. 21
Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých vzorcích vín
75
Obr. 22
Zastoupení stilbenu resveratrolu v jednotlivých letech
75
89
12
SEZNAM TABULEK
Tab. 1
Základní přehled fenolických látek (Velíšek, 2002)
11
Tab. 2
Obsah fenolických látek ve víně (Mikeš, 2004)
24
Tab. 3
Chemická složení jednotlivých částí hroznu (% hmotnosti), (Malík, 1996)
26
Tab. 4
Obsah jednotlivých sacharidů ve vínech (Velíšek, 2002)
39
Tab. 5
Obsah minerálních látek v jednom gramu popela (Laho a kol., 1970)
42
Tab. 6
Hodnoty fenolických látek pro bílá a červená vína (Waterhouse, 2002)
Tab. 7
46
Složení gradientové eluce při stanovení fenolových kyselin a flavonoidů
55
Tab. 8
Složení isokratické eluce při stanovení stilbenu resveratrolu
56
Tab. 9
Parametry separace u stanovovaných fenolických sloučenin
58
Tab. 10
Jednotlivé parametry pro kvantitativní analýzu RRLC-MS/MS (n=6) v MRM modu
Tab. 11
Průměrné hodnoty stanovovaných fenolických sloučenin ve vzorcích červených a růžových vín v mg/l
Tab. 12
59
60
Průměrné hodnoty stanovovaných fenolických sloučenin ve vzorcích bílých vín v mg/l
90
61
13
SEZNAM ZKRATEK
FR11
Frankovka 2011
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography)
CZE
kapilární zónová elektroforéza (Capillary Zone Electrophoresis)
GC
plynová chromatografie (Gas Chromatography)
LOD
limit detekce (Limit of Detection)
LOQ
limit kvantifikace (Limit of Quantification)
MRM
přechod prekurzorového na produktový iont (Multiple Reaction Monitoring)
MS
hmotnostní detektor (Mass Spectrometry Detector)
MT10
Müller Thurgau 2010
MT12
Müller Thurgau 2012
n. d.
nebylo detekováno (Not Detected)
p. a.
pro analýzu
R2
koeficient determinace
RB11
Rulandské bílé 2011
RP-HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie na obrácené fázi (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography)
SPE
extrakce na pevné fázi (Solid Phase Extraction)
SG10
Sauvignon
SV08
Svatovavřinecké 2008
SV10
Svatovavřinecké 2010
SV11
Svatovavřinecké 2011
SV12
Svatovavřinecké 2012
VZ08
Veltlínské zelené 2008
VZ10
Veltlínské zelené 2010
VZ11
Veltlínské zelené 2011
VZ12
Veltlínské zelené 2012
ZWT11
Zweigeltrebe 2011
ZWT rosé
Zweigeltrebe Rosé
k.
kyselina 91
p-h-benzaldehyd
p-hydroxybenzaldehyd
3,4-d-h-benzaldehyd
3,4-dihydroxybenzaldehyd
92
Příloha 1-3
93
Příloha 1 Chromatogramy standardů separovaných látek
Counts vs. Acquisition Time (min)
94
Counts vs. Acquisition Time (min)
95
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 1 MRM chromatogramy standardů fenolových kyselin. Identifikace píku: 1.
kyselina
gallová,
2.
kyselina
protokatechová,
3.
3,4-dihydroxybenzaldehyd,
4. p-hydroxybenoová, 5. kyselina chlorogenová, 6. p-hydroxybenzaldehyd, 7. kyselina vanilová, 8. kyselina kávová, 9. kyselina syringová, 10. vanilin, 11. kyselina p-kumarová, 12. kyselina salicylová, 13. kyselina fellurová, 14. kyselina sinapová
Counts vs. Acquisition Time (min)
96
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr.
2
MRM
chromatogramy
standardů
prokyanidinů.
Identifikace
píku:
1. prokyanidin B1, 2. prokyanidin B2
Counts vs. Acquisition Time (min)
Counts vs. Acquisition Time (min)
97
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr.
3
MRM
chromatogramy
standardů
flavanolů.
Identifikace
píku:
1. katechin, 2. epikatechin
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 4 MRM chromatogramy standardů stilbenu 1. trans-resveratrol
98
Příloha 2 Statistické vyhodnocení naměřených dat
Tab. 1 Obsah kyseliny kávové ve vzorcích vín ČERVENÉ
SV08
cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] 2,612 2,612 2,613 2,612 0,0005
vx[%] 0,018
SV10
9,138
9,137
9,140
9,138
0,0012
0,014
SV11
0,926
0,928
0,926
0,927
0,0009
0,102
SV12
0,561
0,562
0,561
0,561
0,0005
0,084
FR
3,555
3,555
3,557
3,556
0,0009
0,027
ZWT
1,004
1,003
1,004
1,004
0,0005
0,047
RŮŽOVÉ cm1mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,725
0,720
0,723
0,723
0,0021
vx [%] 0,284
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] VZ08 VZ10 VZ11 VZ12 MT10 MT12 SG RB
vx [%]
1,012
1,019
1,013
1,015
0,0030
0,305
1,944
1,945
1,944
1,944
0,0005
0,024
0,347
0,348
0,345
0,347
0,0010
0,360
0,822
0,828
0,825
0,825
0,0024
0,297
3,515
3,515
3,518
3,516
0,0010
0,040
2,130
2,131
1,131
1,797
0,4711
26,215
2,525
2,526
2,53
2,527
0,0022
0,085
0,922
0,923
0,922
0,922
0,0005
0,051
99
Tab. 2 Obsah kyseliny chlorogenové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,001
0,002
0,005
0,003
0,0017
63,738
SV10
0,008
0,011
0,11
0,043
0,0474
110,214
SV11
n.d.
n.d.
n.d.
-
-
-
SV12
0,001
0,003
0,002
0,002
0,0008
40,825
FR
0,006
0,005
0,005
0,005
0,0005
8,839
ZWT
0,001
0,002
0,002
0,002
0,0005
28,284
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,008
0,007
0,008
0,008
0,0005
vx [%] 6,149
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
n.d.
n.d.
n.d.
-
-
-
VZ10
0,008
0,01
0,012
0,010
0,0016
16,330
VZ11
0,007
0,006
0,006
0,006
0,0005
7,443
VZ12
n.d.
n.d.
n.d.
-
-
-
MT10
0,007
0,004
0,006
0,006
0,0012
22,010
MT12
0,012
0,015
0,011
0,013
0,0017
13,418
SG
0,007
0,007
0,01
0,008
0,0014
17,678
RB
0,006
0,004
0,006
0,005
0,0009
17,678
100
Tab. 3 Obsah kyseliny ferulové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,211
0,211
0,213
0,212
0,0009
0,445
SV10
0,596
0,593
0,595
0,595
0,0012
0,210
SV11
0,111
0,113
0,111
0,112
0,0009
0,844
SV12
0,117
0,119
0,12
0,119
0,0012
1,051
FR
0,501
0,504
0,507
0,504
0,0024
0,486
ZWT
0,065
0,700
0,066
0,277
0,2991
107,981
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,169
0,172
0,171
0,171
0,0012
vx [%] 0,731
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,516
0,519
0,518
0,518
0,0012
0,241
VZ10
0,770
0,773
0,771
0,771
0,0012
0,162
VZ11
0,214
0,215
0,215
0,215
0,0005
0,220
VZ12
0,607
0,61
0,609
0,609
0,0012
0,205
MT10
0,722
0,724
0,724
0,723
0,0009
0,130
MT12
0,98
0,98
0,982
0,981
0,0009
0,096
SG
0,459
0,46
0,462
0,460
0,0012
0,271
RB
0,170
0,170
0,171
0,170
0,0005
0,277
101
Tab. 4 Obsah kyseliny gallové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
3,429
3,429
3,431
3,430
0,0009
0,027
SV10
16,592
16,595
16,59
16,592
0,0021
0,012
SV11
4,269
4,270
4,268
4,269
0,0008
0,019
SV12
2,415
2,417
2,412
2,415
0,0021
0,085
FR
9,579
9,583
9,584
9,582
0,0022
0,023
ZWT
2,417
2,418
2,417
2,417
0,0005
0,020
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,640
0,642
0,647
0,643
0,0029
vx [%] 0,458
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,337
0,338
0,338
0,338
0,0005
0,140
VZ10
2,141
2,145
2,144
2,143
0,0017
0,079
VZ11
0,375
0,374
0,371
0,373
0,0017
0,455
VZ12
0,355
0,353
0,353
0,354
0,0009
0,267
MT10
2,513
2,514
2,516
2,514
0,0012
0,050
MT12
0,861
0,862
0,862
0,862
0,0005
0,055
SG
3,856
3,854
3,856
3,855
0,0009
0,024
RB
0,262
2,265
2,266
1,598
0,9445
59,115
102
Tab. 5 Obsah kyseliny p-kumarové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
2,203
2,201
2,203
2,202
0,0009
0,043
SV10
5,897
5,901
5,899
5,899
0,0016
0,028
SV11
1,755
1,755
1,754
1,755
0,0005
0,027
SV12
0,732
0,733
0,732
0,732
0,0005
0,064
FR
3,013
3,012
3,011
3,012
0,0008
0,027
ZWT
1,425
1,424
1,425
1,425
0,0005
0,033
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,52
0,521
0,52
0,520
0,0005
vx [%] 0,091
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
1,380
1,382
1,384
1,382
0,0016
0,118
VZ10
3,207
3,208
3,209
3,208
0,0008
0,025
VZ11
0,207
0,205
0,204
0,205
0,0012
0,607
VZ12
0,534
0,533
0,537
0,535
0,0017
0,318
MT10
4,248
4,245
4,241
4,245
0,0029
0,068
MT12
1,183
1,185
1,186
1,185
0,0012
0,105
SG
3,042
3,041
3,043
3,042
0,0008
0,027
RB
0,393
0,397
0,394
0,395
0,0017
0,431
103
Tab. 6 Obsah kyseliny p-hydroxybenzoové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,146
0,14
0,142
0,143
0,0025
1,748
SV10
0,685
0,685
0,684
0,685
0,0005
0,069
SV11
0,206
0,205
0,206
0,206
0,0005
0,229
SV12
0,141
0,141
0,142
0,141
0,0005
0,334
FR
0,440
0,441
0,440
0,440
0,0005
0,107
ZWT
0,177
0,178
0,176
0,177
0,0008
0,461
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,223
0,224
0,224
0,224
0,0005
vx [%] 0,211
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,149
0,15
0,149
0,149
0,0005
0,316
VZ10
0,400
0,403
0,407
0,403
0,0029
0,711
VZ11
0,184
0,184
0,183
0,184
0,0005
0,257
VZ12
0,124
0,125
0,127
0,125
0,0012
0,995
MT10
0,850
0,853
0,852
0,852
0,0012
0,146
MT12
0,393
0,398
0,394
0,395
0,0022
0,547
SG
0,557
0,560
0,561
0,559
0,0017
0,304
RB
0,367
0,371
0,370
0,369
0,0017
0,460
104
Tab. 7 Obsah kyseliny protokatechové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,798
0,800
0,801
0,800
0,0012
0,156
SV10
4,193
4,196
4,198
4,196
0,0021
0,049
SV11
0,910
0,912
0,916
0,913
0,0025
0,273
SV12
0,612
0,615
0,613
0,613
0,0012
0,203
FR
1,629
1,625
0,630
1,295
0,4700
36,302
ZWT
0,312
0,312
0,312
0,312
0,0000
0,000
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,675
0,680
0,682
0,679
0,0029
vx [%] 0,434
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,468
0,469
0,465
0,467
0,0017
0,364
VZ10
1,138
1,14
1,138
1,139
0,0009
0,083
VZ11
0,669
0,673
0,371
0,571
0,1414
24,769
VZ12
0,177
0,179
0,178
0,178
0,0008
0,459
MT10
2,866
2,862
2,862
2,863
0,0019
0,066
MT12
1,723
1,724
0,727
1,391
0,4698
33,763
SG
1,737
1,379
1,374
1,497
0,1700
11,355
RB
0,94
0,943
0,946
0,943
0,0024
0,260
105
Tab. 8 Obsah kyseliny salicylové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,140
0,143
0,145
0,143
0,0021
1,440
SV10
0,618
0,612
0,617
0,616
0,0026
0,426
SV11
0,100
0,098
0,102
0,100
0,0016
1,633
SV12
0,051
0,051
0,052
0,051
0,0005
0,918
FR
0,174
0,176
0,176
0,175
0,0009
0,538
ZWT
0,054
0,053
0,052
0,053
0,0008
1,541
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,112
0,119
0,119
0,117
0,0033
vx [%] 2,828
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,760
0,766
0,768
0,765
0,0034
0,445
VZ10
0,826
0,836
0,830
0,831
0,0041
0,495
VZ11
0,082
0,083
0,084
0,083
0,0008
0,984
VZ12
0,027
0,030
0,030
0,029
0,0014
4,877
MT10
0,495
0,495
0,500
0,497
0,0024
0,475
MT12
0,165
0,168
0,172
0,168
0,0029
1,703
SG
0,359
0,363
0,362
0,361
0,0017
0,470
RB
0,087
0,090
0,092
0,090
0,0021
2,292
106
Tab. 9 Obsah kyseliny sinapové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,002
0,002
0,002
0,002
0,0000
0,000
SV10
0,021
0,025
0,025
0,024
0,0019
7,967
SV11
0,004
0,005
0,005
0,005
0,0005
10,102
SV12
0,006
0,006
0,007
0,006
0,0005
7,443
FR
0,046
0,050
0,052
0,049
0,0025
5,056
ZWT
0,013
0,019
0,019
0,017
0,0028
16,638
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,009
0,009
0,008
0,009
0,0005
vx [%] 5,439
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,014
0,014
0,016
0,015
0,0009
6,428
VZ10
0,035
0,036
0,036
0,036
0,0005
1,322
VZ11
0,002
0,003
0,002
0,002
0,0005
20,203
VZ12
0,017
0,018
0,017
0,017
0,0005
2,720
MT10
0,023
0,021
0,021
0,022
0,0009
4,351
MT12
0,037
0,038
0,038
0,038
0,0005
1,252
SG
0,011
0,013
0,010
0,011
0,0012
11,005
RB
0,006
0,005
0,005
0,005
0,0005
8,839
107
Tab. 10 Obsah kyseliny syringové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
1,903
1,900
1,904
1,902
0,0017
0,089
SV10
2,848
2,847
2,842
2,846
0,0026
0,092
SV11
1,932
1,935
1,932
1,933
0,0014
0,073
SV12
1,345
1,346
1,347
1,346
0,0008
0,061
FR
4,400
4,409
4,405
4,405
0,0037
0,084
ZWT
1,862
1,862
1,862
1,862
0,0000
0,000
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
ZWT rosé
1,349
1,352
1,352
1,351
0,0014
vx [%]
0,105
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,115
0,116
0,118
0,116
0,0012
1,072
VZ10
0,228
0,235
234
78,154
110,1995
141,002
VZ11
0,113
0,115
0,116
0,115
0,0012
1,088
VZ12
0,076
0,08
0,085
0,080
0,0037
4,583
MT10
0,247
0,247
0,246
0,247
0,0005
0,191
MT12
0,341
0,342
0,345
0,343
0,0017
0,496
SG
0,446
0,448
0,442
0,445
0,0025
0,560
RB
0,099
0,095
0,095
0,096
0,0019
1,957
108
Tab. 11 Obsah kyseliny vanilové ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
1,102
1,106
1,105
1,104
0,0017
0,154
SV10
2,611
2,614
2,614
2,613
0,0014
0,054
SV11
1,345
1,347
1,348
1,347
0,0012
0,093
SV12
1,369
1,372
1,375
1,372
0,0024
0,179
FR
3,052
3,052
3,053
3,052
0,0005
0,015
ZWT
0,833
0,835
0,836
0,835
0,0012
0,149
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,533
0,534
0,539
0,535
0,0026
vx [%] 0,490
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,130
0,134
0,136
0,133
0,0025
1,871
VZ10
0,275
0,278
0,279
0,277
0,0017
0,613
VZ11
0,150
0,156
0,160
0,155
0,0041
2,646
VZ12
0,117
0,120
0,122
0,120
0,0021
1,717
MT10
0,383
0,386
0,387
0,385
0,0017
0,441
MT12
0,594
0,595
0,597
0,595
0,0012
0,209
SG
0,483
0,484
0,482
0,483
0,0008
0,169
RB
0,161
0,163
0,168
0,164
0,0029
1,795
109
Tab. 12 Obsah 3,4-dihydroxybenzaldehydu ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,041
0,041
0,042
0,041
0,0005
1,140
SV10
0,010
0,011
0,016
0,012
0,0026
21,281
SV11
0,028
0,030
0,035
0,031
0,0029
9,497
SV12
0,016
0,015
0,016
0,016
0,0005
3,009
FR
0,049
0,049
0,00
0,049
0,0005
0,956
ZWT
0,015
0,011
0,012
0,013
0,0017
13,418
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,059
0,06
0,06
0,060
0,0005
vx [%] 0,790
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,058
0,059
0,063
0,060
0,0022
3,600
VZ10
0,039
0,035
0,038
0,037
0,0017
4,553
VZ11
0,011
0,009
0,011
0,010
0,0009
9,124
VZ12
0,010
0,009
0,009
0,009
0,0005
5,051
MT10
0,042
0,041
0,041
0,041
0,0005
1,140
MT12
0,063
0,062
0,067
0,064
0,0022
3,375
SG
0,060
0,060
0,058
0,059
0,0009
1,589
RB
0,015
0,018
0,017
0,017
0,0012
7,483
110
Tab. 13 Obsah p-hydroxybenzaldehydu ve vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,034
0,038
0,032
0,035
0,0025
7,195
SV10
0,001
0,002
0,001
0,001
0,0005
35,355
SV11
0,024
0,021
0,023
0,023
0,0012
5,502
SV12
0,023
0,027
0,022
0,024
0,0022
9,001
FR
0,010
0,010
0,013
0,011
0,0014
12,856
ZWT
0,014
0,018
0,016
0,016
0,0016
10,206
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,043
0,042
0,042
0,042
0,0005
vx [%] 1,114
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,064
0,062
0,061
0,062
0,0012
2,001
VZ10
0,047
0,048
0,047
0,047
0,0005
0,996
VZ11
0,072
0,076
0,073
0,074
0,0017
2,307
VZ12
0,018
0,022
0,019
0,020
0,0017
8,642
MT10
0,044
0,046
0,043
0,044
0,0012
2,813
MT12
0,034
0,031
0,035
0,033
0,0017
5,099
SG
0,056
0,058
0,052
0,055
0,0025
4,508
RB
0,042
0,047
0,039
0,043
0,0033
7,734
111
Tab. 14 Obsah vanilinu vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,008
0,005
0,004
0,006
0,0017
29,994
SV10
n.d.
n.d.
n.d.
-
-
-
SV11
0,006
0,006
0,006
0,006
0,0000
0,000
SV12
0,002
0,002
0,003
0,002
0,0005
20,203
FR
0,002
0,003
0,003
0,003
0,0005
17,678
ZWT
0,003
0,003
0,003
0,003
0,0000
0,000
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,011
0,013
0,01
0,011
0,0012
vx [%] 11,005
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,009
0,009
0,009
0,009
0,0000
0,000
VZ10
0,006
0,007
0,006
0,006
0,0005
7,443
VZ11
n.d.
n.d.
n.d.
-
-
-
VZ12
0,006
0,005
0,006
0,006
0,0005
8,319
MT10
0,002
0,002
0,003
0,002
0,0005
20,203
MT12
0,002
0,003
0,003
0,003
0,0005
17,678
SG
0,003
0,003
0,003
0,003
0,0000
0,000
RB
0,006
0,005
0,006
0,006
0,0005
8,319
112
Tab. 15 Obsah katechinu vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
6,709
6,712
6,711
6,711
0,0012
0,019
SV10
18,665
18,667
6,665
14,666
5,6573
38,575
SV11
14,273
14,278
14,275
14,275
0,0021
0,014
SV12
15,633
15,635
15,624
15,631
0,0048
0,031
FR
14,856
14,856
14,854
14,855
0,0009
0,006
ZWT
4,638
4,639
4,64
4,639
0,0008
0,018
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
1,102
1,105
1,108
1,105
0,0026
vx [%] 0,234
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
4,678
4,674
4,672
4,675
0,0025
0,053
VZ10
4,916
4,915
4,925
4,919
0,0045
0,091
VZ11
3,453
3,451
4,450
3,785
0,4705
12,431
VZ12
3,910
3,912
3,916
3,913
0,0025
0,064
MT10
8,514
8,518
8,517
8,516
0,0017
0,020
MT12
2,246
2,242
2,243
2,244
0,0017
0,076
SG
1,675
1,673
1,674
1,674
0,0008
0,049
RB
3,225
3,229
3,224
3,226
0,0022
0,067
113
Tab. 16 Obsah epikatechinu vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
3,769
3,77
3,772
3,770
0,0012
0,033
SV10
9,729
9,725
9,731
9,728
0,0025
0,026
SV11
8,332
8,329
8,330
8,330
0,0012
0,015
SV12
9,258
9,256
9,256
9,257
0,0009
0,010
FR
20,332
20,335
20,334
20,334
0,0012
0,006
ZWT
7,459
7,460
7,461
7,460
0,0008
0,011
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,975
0,972
0,976
0,974
0,0018
vx [%] 0,180
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
1,423
1,428
1,424
1,425
0,0022
0,152
VZ10
1,655
1,655
1,653
1,654
0,0009
0,057
VZ11
1,022
1,020
1,022
1,021
0,0009
0,092
VZ12
1,035
1,037
1,033
1,035
0,0016
0,158
MT10
5,483
5,481
5,486
5,483
0,0021
0,037
MT12
1,120
1,121
1,123
1,121
0,0012
0,111
SG
1,056
1,057
1,056
1,056
0,0005
0,045
RB
1,712
1,716
1,716
1,715
0,0019
0,110
114
Tab. 17 Obsah prokyanidinu B1 vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,601
0,607
0,605
0,604
0,0025
0,413
SV10
2,096
2,092
2,095
2,094
0,0017
0,081
SV11
1,626
1,625
1,625
1,625
0,0005
0,029
SV12
1,791
1,792
1,795
1,793
0,0017
0,095
FR
2,230
2,232
2,236
2,233
0,0025
0,112
ZWT
1,311
1,315
1,312
1,313
0,0017
0,129
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,062
0,065
0,068
0,065
0,0026
vx [%] 4,038
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,16
0,160
0,163
0,161
0,0014
0,878
VZ10
0,209
0,210
0,215
0,211
0,0026
1,242
VZ11
0,132
0,135
0,129
0,132
0,0024
1,856
VZ12
0,232
0,235
0,231
0,233
0,0017
0,731
MT10
0,447
0,449
0,445
0,447
0,0016
0,365
MT12
0,184
0,186
0,183
0,184
0,0012
0,677
SG
0,004
0,005
0,005
0,005
0,0005
10,102
RB
0,172
0,170
0,169
0,170
0,0012
0,732
115
Tab. 18 Obsah prokyanidinu B2 vzorcích vín ČERVENÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
SV08
0,945
0,941
0,940
0,942
0,0022
0,229
SV10
2,831
2,829
2,830
2,830
0,0008
0,029
SV11
3,949
3,949
3,947
3,948
0,0009
0,024
SV12
3,877
3,876
3,873
3,875
0,0017
0,044
FR
6,088
6,089
6,088
6,088
0,0005
0,008
ZWT
4,529
4,531
4,536
4,532
0,0029
0,065
RŮŽOVÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l] ZWT rosé
0,114
0,118
0,122
0,118
0,0034
vx [%] 2,897
BÍLÉ cm1 [mg/l] cm2 [mg/l] cm3 [mg/l] cm x [mg/l] sx [mg/l]
vx [%]
VZ08
0,086
0,090
0,092
0,089
0,0025
2,792
VZ10
0,229
0,234
0,237
0,233
0,0033
1,414
VZ11
0,085
0,085
0,083
0,084
0,0009
1,118
VZ12
0,146
0,142
0,139
0,142
0,0029
2,015
MT10
0,531
0,532
0,532
0,532
0,0005
0,089
MT12
0,160
0,162
0,160
0,161
0,0009
0,587
SG
0,037
0,037
0,035
0,036
0,0009
2,595
RB
0,057
0,057
0,060
0,058
0,0014
2,438
116
Příloha 3
Chromatogramy separovaných látek v jakostním víně Frankovka Jedná se pravděpodobně o rakouskou odrůdu, na jejímž vzniku se podílela odrůda Heunisch. V roce 1941 byla Frankovka zapsána do Státní odrůdové knihy. Odrůda se doporučuje pěstovat ve vinařské oblasti Morava. V České republice tvoří asi 7 % celkové plochy vinic. Víno Frankovka se vyznačuje tmavě rubínovou barvou s fialovými odlesky, tvrdší ovocnou chutí a vůní po ostružinách (Kraus a kol., 2005).
Counts vs. Acquisition Time (min)
117
Counts vs. Acquisition Time (min)
118
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 1 MRM chromatogramy fenolových kyselin v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. kyselina gallová, 2. kyselina protokatechová, 3. 3,4-dihydroxybenzaldehyd, 4. kyselina p-hydroxybenoová, 5. kyselina chlorogenová, 6. p-hydroxybenzaldehyd, 7. kyselina vanilová, 8. kyselina kávová, 9. kyselina syringová, 10. vanilin, 11. kyselina p-kumarová, 12. kyselina salicylová, 13. kyselina fellurová, 14. kyselina sinapová 119
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 2 MRM chromatogramy prokyanidinů v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. prokyanidin B1, 2. prokyanidin B2
Counts vs. Acquisition Time (min)
120
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 3 MRM chromatogramy flavanolů v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. katechin, 2. epikatechin
Counts vs. Acquisition Time (min)
121
Counts vs. Acquisition Time (min)
Obr. 4 MRM chromatogramy stilbenu v reálném vzorku jakostního vína Frankovka 1. trans-resveratrol
122
14
SEZNAM PŘÍLOH
Příloha 1: Chromatogramy standardů separovaných látek
Obr. 1 MRM chromatogramy standardů fenolových kyselin. Identifikace píku: 1. kyselina gallová, 2. kyselina protokatechová, 3. 3,4-dihydroxybenzaldehyd, 4. kyselina p-hydroxybenoová, 5. kyselina chlorogenová, 6. p-hydroxybenzaldehyd, 7. kyselina vanilová, 8. kyselina kávová, 9. kyselina syringová, 10. vanilin, 11. kyselina p-kumarová, 12. kyselina salicylová, 13. kyselina fellurová, 14. kyselina sinapová Obr. 2 MRM chromatogramy standardů prokyanidinů. Identifikace píku: 1. prokyanidin B1, 2. prokyanidin B2 Obr.
3
MRM
chromatogramy
standardů
flavanolů.
Identifikace
1. katechin, 2. epikatechin
Obr. 4 MRM chromatogramy standardů stilbenu 1. trans-resveratrol
PŘÍLOHA 2: Statistické vyhodnocení naměřených dat
Tab. 1 Obsah kyseliny kávové ve vzorcích vín Tab. 2 Obsah kyseliny chlorogenové ve vzorcích vín Tab. 3 Obsah kyseliny ferulové ve vzorcích vín Tab. 4 Obsah kyseliny gallové ve vzorcích vín Tab. 5 Obsah kyseliny p-kumarové ve vzorcích vín Tab. 6 Obsah kyseliny p-hydroxybenzoové ve vzorcích vín Tab. 7 Obsah kyseliny protokatechové ve vzorcích vín Tab. 8 Obsah kyseliny salicylové ve vzorcích vín Tab. 9 Obsah kyseliny sinapové ve vzorcích vín 123
píku:
Tab. 10 Obsah kyseliny syringové ve vzorcích vín Tab. 11 Obsah kyseliny vanilové ve vzorcích vín Tab. 12 Obsah 3,4-dihydroxybenzaldehydu ve vzorcích vín Tab. 13 Obsah p-hydroxybenzaldehydu ve vzorcích vín Tab. 14 Obsah vanilinu vzorcích vín Tab. 15 Obsah katechinu vzorcích vín Tab. 16 Obsah epikatechinu vzorcích vín Tab. 17 Obsah prokyanidinu B1 vzorcích vín Tab. 18 Obsah prokyanidinu B2 vzorcích vín
PŘÍLOHA 3: Chromatogramy separovaných látek v jakostním víně Frankovka Obr. 1 MRM chromatogramy fenolových kyselin v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. kyselina gallová, 2. kyselina protokatechová, 3. 3,4-dihydroxybenzaldehyd, 4. kyselina p-hydroxybenoová, 5. kyselina chlorogenová, 6. p-hydroxybenzaldehyd, 7. kyselina vanilová, 8. kyselina kávová, 9. kyselina syringová, 10. vanilin, 11. kyselina p-kumarová, 12. kyselina salicylová, 13. kyselina fellurová, 14. kyselina sinapová Obr. 2 MRM chromatogramy prokyanidinů v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. prokyanidin B1, 2. prokyanidin B2 Obr. 3 MRM chromatogramy flavanolů. v reálném vzorku jakostního vína Frankovka. Identifikace píku: 1. katechin. 2. epikatechin
Obr. 4 MRM chromatogramy stilbenu v reálném vzorku jakostního vína Frankovka 1. trans- resveratrol
124
