Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Biologicky aktivní aminy ve vybraných fermentovaných potravinách živočišného původu Dizertační práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Prof. MVDr. Ing. T. Komprda, CSc.
Mgr. Kateřina Novická
Brno 2010
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem dizertační práci na téma Biologicky aktivní aminy ve vybraných fermentovaných potravinách živočišného původu vypracovala samostatně a použila jen pramenů citovaných v přiloženém seznamu použité literatuty.
Dizertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana AF Mendelovy univerzity v Brně.
Dne……………………………………………… Podpis doktoranda……………………………….
Děkuji panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc za odborné vedení, všestrannou pomoc a cenné rady, které mi při zpracování dizertační práce poskytoval. Dále bych ráda poděkovala za spolupráci Ing. P. Pechové, PhD.
Obsah 1 Úvod............................................................................................................................... 8 2 Literární přehled ............................................................................................................ 9 2.1 Biogenní aminy - definice, struktura ...................................................................... 9 2.2 Vznik BA v potravinách ....................................................................................... 11 2.3 Fyziologický význam BA ..................................................................................... 14 2.4 Toxicita BA........................................................................................................... 15 2.4.1 Toxicita histaminu ......................................................................................... 16 2.4.2 Toxicita tyraminu ........................................................................................... 18 2.4.3 Toxicita diaminů a polyaminů ....................................................................... 19 2.5 Výskyt BA v potravinách ..................................................................................... 19 2.5.1 Ryby a rybí výrobky ...................................................................................... 20 2.5.2 Sýry ................................................................................................................ 21 2.5.3 Maso a masné výrobky .................................................................................. 23 2.5.4 Potraviny rostlinného původu ........................................................................ 24 2.5.5 Pivo a víno ..................................................................................................... 25 2.6 Hygienické limity pro BA v potravinách .............................................................. 26 2.7 Metody stanovení BA v potravinách .................................................................... 27 2.8 Faktory ovlivňující vznik BA v sýrech ................................................................. 31 2.8.1 Kvalita suroviny a způsob jejího ošetření ...................................................... 31 2.8.2 Kontaminující mikroorganizmy..................................................................... 33 2.8.3 Startovací kultury ........................................................................................... 37 2.8.4 Fyzikálně-chemické faktory .......................................................................... 39 2.8.5 Část sýra ......................................................................................................... 42 3 Cíl práce ....................................................................................................................... 43 4 Materiál a metodika ..................................................................................................... 44 4.1 Materiál ................................................................................................................. 44 4.1.1 Přírodní zrající sýry ....................................................................................... 44 4.1.2 Tavené sýry .................................................................................................... 45 4.2 Analýza biogenních aminů ................................................................................... 46 4.3 Mikrobiologický rozbor ........................................................................................ 49 4.4. Statistické vyhodnocení ....................................................................................... 50
5 Výsledky a diskuze ...................................................................................................... 52 5.1 Analytická metoda ................................................................................................ 52 5.2 Biogenní aminy v přírodních polotvrdých zrajících sýrech holandského typu (Eidam) ....................................................................................................................... 53 5.2.1 Vliv doby zrání na obsah biogenních aminů ................................................. 55 5.2.2 Distribuce biogenních aminů v sýrech........................................................... 62 5.2.3 Vliv výrobce a startovací kultury na obsah biogenních aminů ...................... 70 5.3 Biogenní aminy v tavených sýrech ....................................................................... 78 6 Závěry .......................................................................................................................... 85 7 Seznam použité literatury ............................................................................................ 88 8 Přílohy........................................................................................................................ 106 9 Anotace ...................................................................................................................... 112
Summary Biogenic amines (BA; histamine, tyramine, tryptamine, 2-phenylethylamine, cadaverine) and polyamines (PA; putrescine,
spermidine, spermine) content was
determined within 6 months of ripening in the edge and core part of Dutch-type semihard cheese using the reverse phase high performance liquid chromatography method with spectrofotometric detection. Cheeses were produced by two different producers (R30 and R45 cheese) using pasteurized milk and different starter culture (FD and CH, in the case of the R30 cheeses) and differed in their fat content (30 % and 45 % of fat in dry matter). Tyramine, putrescine and phenylethylamine were quantitatively the most important amines in cheese samples, their contents after 22nd week of ripening varied in the range 15.7 – 299.8 and 6.0 – 60.8, and 1.0 – 54.3 mg kg –1, respectively. Tyramine content increased linearly (P<0.01) with increasing time of ripening both in R30-FD and R30-CH and R45 cheese, concentration of tyramine in the R45 cheese after 18 weeks of ripening exceeded a toxicological limit. Therefore, the R45 cheese cannot be recommended for the groups of consumers at risk (allergic individuals, patients taking monoamine oxidase inhibotors). Also sum of all BA increased significantly (P<0.01) in all cheeses within the whole ripening period. Substantially higher (P<0.01) contents of tyramine and the sum of biogenic amines were found after 8th week of ripening in the outer-part samples in comparison with the core ones in the R30 cheeses. Also higher (P<0.01) counts of lactic acid bacteria, total anaerobs and total aerobic and facultative anaerobic microorganisms were found in outer parts of the R30 cheeses within the ripening interval. Tyramine, putrescine, phenylethylamine, and sum of all BA contents in R45 cheese were significantly higher (P<0.05) after 18th and 22nd week of ripening in comparison with R30-FD and R30-CH cheeses. However, the counts of all evaluated groups of microorganisms were substantially higher (P< 0.05) in both R30 cheeses after 22nd week of ripening. Contents of biogenic amines and polyamines were also determinated in the samples
of processed cheese, a possible effect of heat treatment (pasteurisation and sterilisation), storage time (22 and 57 weeks) and storage temperature (8 °C and 25 °C) of the samples on amines content was tested.
In all cases, tyramine was quantitatively the most important biogenic amine (1.3 – 29.3 mg kg-1), the highest level (P<0.05) was found in pasteurized processed cheese stored 22 weeks after processing at 8 °C. The contents of all evaluated amines were generally very low, regardless of tyramin, the content of no biogenic amine exceeded 2.5 mg kg-1 and it can be concluded that processed cheese represents no health hazard regarding biogenic amines content even when stored long-term at room temperature.
1 Úvod V potravinách existuje řada problematických složek, které mohou představovat zdravotní rizika pro spotřebitele, a z tohoto důvodu je otázce bezpečnosti potravin věnována stále větší pozornost. Problematika potravinových reakcí vstupuje stále více i do povědomí laické veřejnosti, která velmi často hledá příčinu svých zdravotních obtíží právě v potravinách. Mezi často sledované nežádoucí složky potravin patří v poslední době i biogenní aminy, které mohou být za určitých okolností příčinou alimentárních otrav. Biogenní aminy vznikají v procesu výroby a skladování potravin jako výsledek metabolického působení mikroorganizmů, ve vyšším množství se nachází v rybách a fermentovaných výrobcích jako jsou sýry, trvanlivé salámy, pivo, víno, či kysané zelí. Sledování obsahů biogenních aminů je však významné nejen z hlediska ovlivnění zdravotní nezávadnosti potravin, ale i z hlediska možnosti posouzení kvality potravin, neboť vysoké koncentrace biogenních aminů se vyskytují u potravin v pokročilém stupni kažení. Sýry jsou významnou složkou jídelníčku většiny evropských zemí, v České republice se jejich roční spotřeba pohybuje kolem 10 kg na osobu. Jelikož rozhodující cestou vzniku biogenních aminů je dekarboxylace přirozených aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz, představují sýry díky své vysokoproteinové povaze a fermentačním procesům během výroby ideální prostředí pro jejich tvorbu. S konzumací sýrů jsou tak spojovány jedny z nejčastějších intoxikací biogenními aminy. Preventivním opatřením vzniku biogenních aminů v sýrech může být jednak testování bakterií startovacích kultur na dekarboxylázovou aktivitu, ale především zamezení nežádoucí kontaminace dekarboxylačními bakteriemi. K omezení tvorby biogenních aminů v sýrech může výrazně přispět i znalost faktorů ovlivňujících růst a aktivitu těchto mikroorganizmů, stejně jako činnost jejich proteolytických a dekarboxylačních enzymů.
8
2 Literární přehled
2.1 Biogenní aminy - definice, struktura Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární bazické sloučeniny vznikající dekarboxylací přirozených aminokyselin působením živých organismů, příp. aminací a transaminací aldehydů a ketonů (Silla Santos, 1996). Jsou to dusíkaté organické báze syntetizované v rámci mikrobiálního, rostlinného i živočišného metabolizmu (Ladero et al., 2010a). V potravinách bylo identifikováno přibližně 30 vazoaktivních a psychoaktivních aminů (Standara et al., 2000). Přehled nejvýznamnějších BA uvádí obr.1. Podle struktury se uvedené BA člení na aromatické (tyramin – TYR a fenylethylamin – FEA), heterocyklické (histamin – HIS a tryptamin – TRY) a alifatické diaminy a polyaminy (putrescin – PUT, kadaverin – KAD, spermin – SPM a spermidin – SPD; Ladero et al., 2010a). Spermin, spermidin a putrescin se však vzhledem ke svým specifickým biologickým vlastnostem řadí do zvláštní skupiny označované jako přirozené (fyziologické) polyaminy (PA). Polyaminy jsou velmi stabilní sloučeniny odolné vůči teplu, kyselinám i zásadám. Jsou to flexibilní polykationty, při fyziologickém pH mohou na svých aminoskupinách vytvářet 2 - 4 kladné náboje. Díky nim interagují s negativně nabitými strukturami buněčného povrchu a jsou schopny řady specifických funkcí (Gugliucci, 2004; Kalač a Krausová, 2005).
9
N
CH2
CH2
NH2
CH2
N
CH2
NH2
N
H
H
Histamin
CH2
CH2
NH2
Tryptamin
HO
CH2
Fenylethylamin
H2N
(CH2)4
NH2
Tyramin
N H2
H2N
Putrescin
H2N C NH
CH2
(C H2)5
N H2
Kadaverin
(C H2)4
H2N
N H2
(C H2)3
NH
(C H2)4
NH Agmatin
Spermidin
H2N
(CH2)3
NH
(CH2)4
NH
(C H2)3
N H2
Spermin
Obrázek 1. Přehled nejvýznamnějších biogenních aminů vyskytujících se v potravinách
10
N H2
2.2 Vznik BA v potravinách Biogenní aminy v potravinách mohou být buď přirozenou součástí buněčných struktur rostlin nebo mohou vznikat v procesu výroby a skladování potravin jako výsledek metabolického působení mikroorganizmů (Greif et al, 1999). Rozhodující cestou vzniku BA je dekarboxylace přirozených aminokyselin působením bakteriálních dekarboxyláz (Křížek a Kalač, 1998; Pereira et al., 2009; obr.2).
dekarboxylace R CH COOH → R CH2 NH2 |
-CO2
NH2 aminokyselina
biogenní amin
Obrázek 2. Nejběžnější způsob vzniku biogenních aminů.
Takto vzniká histamin z histidinu, tyramin z tyrosinu, 2-fenylethylamin z fenylalaninu, tryptamin z tryptofanu a kadaverin z lysinu. Polyaminy putrescin, spermin a spermidin jsou tvořeny z methioninu a argininu, klíčovými enzymy této biosyntézy jsou ornithin dekarboxyláza a S-adenosylmethionin dekarboxyláza (Kusano et al., 2008; obr.3).
11
Methionin
Arginin
5)
ATP
MAT1)
CO 2
Argináza ADC
S-adenosyl-methionin AdoMetDC2)
3)
Ornithin ODC4)
CO 2
Agmatin CO 2 Agmatináza
Dekarboxylovaný
PUTRESCIN
S-adenosylmethionin
SPERMIDIN Spermin syntáza 5´-methyladenosin SPERMIN
Obrázek 3. Schéma vzniku polyaminů (Hillary, Pegg, 2003) 1)
methioninadenosyltransferáza
2)
S-adenosylmethionindekarboxyláza
3)
arginindekarboxyláza
4)
ornithindekarboxyláza
5)
adenosin-trifosfát
Významným předpokladem tvorby BA je proteolýza (autolytická či bakteriální), jež je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýra. Pro tvorbu významnějšího množství biogenních aminů jsou potom nezbytné následující podmínky (Fernández et al., 2007; Landete et al., 2007; Bover-Cid et al., 2008):
•
dostupnost volných aminokyselin jako prekurzorů,
•
přítomnost mikroorganizmů vybavených dekarboxylázami aminokyselin,
•
podmínky umožňující růst mikroorganizmů, biosyntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu.
Mikroorganizmy produkující dekarboxylázy mohou být přirozenou součástí produktů, popřípadě se do potravin dostávají před vlastním technologickým zpracováním, během nebo po ukončení výroby (úmyslné použití startovacích kultur, náhodná kontaminace;
Shalaby,
1996;
Komprda et
al.,
2008a).
Schopnost
dekarboxylovat jednu, či více aminokyselin má řada bakteriálních druhů, včetně bakterií 12
mléčného kvašení (BMK). Jedná se zejména o rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium,
Escherichia, Klebsiella, Micrococcus, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella,
Shigella a BMK rodu Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus a Streptococcus (Silla Santos, 1996; Leuschner et al, 1999; Arena et al., 2001; Wolken et al., 2006; Pereira et al., 2009). Přestože mléčné bakterie vykazují v porovnání s aerobními mikroorganizmy nižší dekarboxylační aktivitu, jejich podíl na tvorbě biogenních aminů v sýrech je vzhledem k vysokým populacím dosahovaných během zrání významný (Fernández-García et al., 2000; Settani a Moschetti, 2010). Charakteristickými mikroorganizmy produkující biogenní aminy v sýrech jsou tak především Lactobacillus buchneri, Lb. bulgaricus,
Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb. arabinosa, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus facieum, S. mitis, Bacillus macerans a Propionibacterium spp. (Shalaby, 1996; Bonetta et al., 2008; Komprda et al., 2008a; Buňková et al., 2010). Schopnost bakteriálních enzymů dekarboxylovat aminokyseliny se může lišit nejen v rámci jednoho rodu, ale i mezi jednotlivými kmeny daného druhu. Proto je téměř nemožné nalézt přímou korelaci mezi množstvím biogenních aminů a celkovým počtem mikroorganizmů (Halasz et al., 1994; Wolken et al., 2006). Vzhledem k různorodosti bakteriálních druhů a kmenů se potom liší i podmínky pro vlastní tvorbu biogenních aminů, jako jsou teplota, přítomnost kyslíku, pH, či obsah chloridu sodného (Křížek a Kalač, 1998). Většina aminů včetně histaminu je tepelně stálá. Rovněž některé dekarboxylázy zůstávají aktivní i po pasteraci, takže obsah BA může následně vzrůstat i během skladování potravin (Brink et al., 1990). Dle Davídka a Davídka (1995) lze obsah biogenních aminů již přítomných v potravinách snížit následujícími způsoby:
•
přídavkem enzymu diaminooxidázy oxidovat BA za přítomnosti kyslíku na aldehydy,
•
přídavkem sacharidů umožnit rekci s aminy vedoucí k neenzymovému hnědnutí,
•
vyluhovat část aminů do varné lázně, pokud se nekonzumuje.
Autoři Mohamed et al. (2009) sledovali vliv přidaných organických i anorganických sloučenin (kyselina askorbová, kyselina citronová, glukóza), přidaného mléka, jogurtu, různých druhů džusů a koření na snížení obsahu HIS a TYR v rajčatech, banánech, jahodách, mangu a čokoládě. Nejvýraznějších výsledků dosáhli autoři působením 13
kyseliny askorbové a citronové. Přidání mléka, jogurtu nebo limetkového džusu do jahod vedlo také k výraznému snížení obsahu HIS i TYR. Uvedené možnosti lze však využít jen v omezené míře, rozhodující je předcházet vzniku biogenních aminů. Obecně lze obsah BA v potravinách omezit používáním hygienicky nezávadných surovin a dodržováním přísné hygieny během jejich zpracování, což následně vede k potlačení kontaminujících bakterií. Při použití startérových bakteriálních kultur omezujících spontánní fermentaci je nutno vybírat takové kmeny, jež nejsou vybaveny dekarboxylázami (Carminati et al., 2010).
2.3 Fyziologický význam BA Biogenní aminy syntetizované lidským organizmem zde plní řadu důležitých metabolických funkcí. Kromě jejich biologického významu, coby zdroje dusíku a prekurzorů syntézy hormonů, nukleových kyselin a proteinů, mají i vlastní farmakologické účinky (Ladero at al., 2010a). Jedním z nejvýznamnějších biologicky aktivních biogenních aminů je histamin. Vykazuje účinky jak psychoaktivní, tak vazoaktivní. Za normálních podmínek je skladován ve speciálních granulích žírných buněk a bazofilů, v případě potřeby se uvolňuje do krevního oběhu a působí prostřednictvím vazby na histaminové receptory (H1, H2, H3, H4) buněčných membrán. Histamin hraje prvotní úlohu coby mediátor alergických reakcí a zánětu, stimuluje hladkou svalovinu dělohy, střeva a respiračního traktu, působí snížení krevního tlaku, zvyšuje permeabilitu malých cév, zvyšuje sekreci kyseliny chlorovodíkové v žaludku. HIS také přispívá k regulaci tělesné teploty, ovlivňuje denní a noční biorytmy, proces učení i paměť(Maintz a Nowak, 2007, Ladero et al., 2010a). Tyramin, tryptamin a fenylethylamin patří rovněž mezi vazoaktivní aminy, oproti histaminu však působí vazokonstrikčně. Tyramin působí na uvolňování noradrenalinu ze sympatického nervového systému, což prostřednictvím periferní vazokonstrikce a zvýšením srdečního výkonu vede ke zvýšení krevního tlaku. Tyramin dále ovlivňuje dilataci zornice, sekreci slz a slin, zvyšuje respiraci a zvyšuje hladinu krevního cukru (Shalaby, 1996; Vlieg-Boerstra et al., 2005). Polyaminy putrescin, spermin a spermidin se v těle účastní řady anabolických pochodů zahrnujících syntézu DNA, RNA a proteinů, a jsou tak nepostradatelné pro
14
stabilizaci buněčných membrán, pro buněčný růst a proliferaci (Seiler, 1992; Kalač et al., 2005; Larque et al., 2007). Právě z důvodu úzkého vztahu polyaminů k rychle rostoucím a proliferujícím buňkám je v posledních letech zaměřena velká pozornost na jejich úlohu při nádorovém bujení. Organizmus využívá jak polyaminy endogenní, tak i ty přijímané potravou. Užívání léků s inhibičním účinkem na biosyntézu polyaminů (především inhibice enzymu ornithindekarboxylázy) v kombinaci s omezenou konzumací potravin obsahující vysoké hladiny polyaminů se proto jeví jako vhodná součást terapie onkologických pacientů (Seiler, 2003a, b; Gerner, E.W., 2010; Önal, A., 2010). Podle autorů Forshell et al. (2010) se jako slibný cíl terapie B-buněčného lymfomu jeví kromě výše uvedené inhibice ornithindekarboxylázy také inhibice enzymu spermidinsyntházy. Zvýšené nároky na příjem polyaminů mohou být především v období intenzivního růstu, jako jsou pooperační stavy, hojení ran či regenerace jater. Polyaminy rovněž ovlivňují správný vývoj střevní sliznice i ostatních orgánů trávicího traktu novorozenců a napomáhají udržení vysoké metabolické aktivity normálně fungujícího střeva a jeho imunologického systému u dospělých jedinců (Kalač a Krausová, 2005; Pérez-Cano, F.J. et al., 2010). Podle řady studií (Peulen et al., 2004, Weiss et al., 2004) se ovlivnění metabolismu polyaminů jeví jako slibný cíl prevence či terapie zánětlivých onemocnění trávicího traktu (např. hepatitida, pankreatitida, ulcerózní kolitida, Crohnova choroba). SPM, SPD a PUT se také výrazně podílejí na antioxidačním mechanizmu buňky, neboť jsou schopny zhášet volné radikály (Fujisawa, Kadoma, 2005).
2.4 Toxicita BA Přestože
biogenní
aminy jsou
v lidském
organizmu
potřebné
pro
řadu
fyziologických funkcí, konzumace potravin s jejich vysokým obsahem může vést až k toxickým účinkům (Ladero et al., 2010a). Klinický průběh těchto intoxikací bývá obvykle mírný a symptomy mizí během několika hodin, přesto u některých jedinců mohou vést k vážným zdravotním komplikacím. Důležitá je především velikost konzumované porce, neboť již např. minimální množství dlouho zrajícího sýra může tyto potíže zapříčinit (McCabe-Sellers et al., 2006). Za normálních okolností jsou BA přijímané potravou odbourávány účinným enzymatickým systémem monoaminooxidáz (MAO – MAO A a MAO B) a
15
diaminooxidáz (DAO), v případě histaminu se účastní i N-methyltransferáza. Aminooxidázy jsou hojně přítomny ve střevním epitelu gastrointestinálního traktu, nacházejí se ale i v játrech, plících, krevních destičkách, slinivce a ledvinách (VliegBoerstra, 2005). Histamin-N-methyltrasferázy se v nejvyšší míře nachází v játrech a ledvinách, tyto enzymy jsou však rovněž přítomny např. ve střevě, průduškách, či průdušnici (Maintz a Nowak, 2007). Činností výše uvedených enzymů se do systémového oběhu dostávají pouze neškodné oxidační produkty a nízké dávky BA tak nepředstavují zdravotní riziko. Aktivita aminooxidáz však může být negativně ovlivněna řadou faktorů jako je genetická porucha enzymu, zdravotní stav jedince (detoxikační schopnost organismu se zhoršuje při některých onemocněních), konzumace alkoholu (alkohol snižuje účinek DAO), či užívání některých léčiv (Wöhrl et al., 2004; Ladero et al., 2010a). Z hlediska tyraminu představují riziko např. léčiva ze skupiny psychofarmak, tzv. inhibitory MAO (označované též jako thymoeretika nebo energizéry) užívané jako antidepresiva. Neselektivně a ireverzibilně působící inhibitory MAO (např. tranylcypromin) již v České republice nejsou registrovány. V současné době se z inhibitorů MAO používají pouze antidepresiva, jež selektivně blokují pouze MAO-A (moclobemid, obchodním názvem Aurorix). Inhibitory MAO-B jsou i léčiva s účinnou látkou selegilin (Jumex, resp. Cognitiv) a rasagilin (Azilect) používaná v terapii Parkinsonovy choroby. Inhibiční efekt na MAO má také hypericin (hlavní účinná složka standardizovaného extraktu z třezalky tečkované užívaného rovněž při depresích), některé flavonoidy nebo chemoterapeutikum isoniazid (obchodním názvem Nidrazid) používané k léčbě tuberkulózy (Anders, 2009). Aktivitu enzymu DAO, jež se podílí na odbourávání KAD, PUT a HIS snižují např. léky s obsahem ambroxolu (obchodním názvem Mucosolvan, Ambrobene, Ambrosan) nebo acetylcysteinu (ACC, Mucobene, Solmucol), používané jako expektorancia, tj. pro usnadnění vykašlávání (Kalač a Křížek, 2002). Metabolizmus HIS ovlivňují i některá léčiva ze skupiny antihypertenziv (Verapamil), analgetik (Acylpyrin), diuretic (Amilorid) nebo antibiotik (Cefuroxim; Maintz a Nowak, 2006).
2.4.1 Toxicita histaminu Histamin je z BA přítomných v potravinách nejtoxičtější, histaminové otravy tak patří jednoznačně k nejzávažnějším. V lidském organizmu zasahuje HIS do řady metabolických funkcí, proto se i intoxikace projevují širokou škálou symptomů. 16
Zahrnují
projevy
kožní
(vyrážky,
kopřivka,
otoky,
lokalizované
záněty),
gastrointestinální (nevolnost, nadýmání, zvracení, průjmy, křeče v břiše) a řadu dalších jako jsou hypotenze, bušení srdce, závratě, bolesti hlavy (u osob trpících migrénami, ale i u osob zdravých), či pálení a brnění v ústech (Ekici et al., 2002). Inkubační doba histaminových otrav je velmi krátká (obvykle 5 – 30 minut po požití), příznaky potom odeznívají během několika hodin. Osoby s intolerancí histaminu mohou mít potíže již v průběhu konzumace potraviny, či alkoholického nápoje obsahující vysoké koncentrace tohoto aminu. Projevy mohou být mírné (sekrece z nosu, otok nosní sliznice), v extrémním případě může dojít až k astmatickému záchvatu (Maintz a Nowak, 2007). V řadě případů bývají intoxikace HIS zaměňovány s alergickými reakcemi na potraviny. Kritériem rozlišení jsou potom údaje anamnézy. Zjišťuje se dřívější výskyt alergie na stejnou potravinu, zda došlo k projevům u větší skupiny jedinců a zda u dané potraviny lze předpokládat vyšší obsah HIS (Ettlerová a Kohout, 2000). V případě intoxikace histaminem lze podat antihistaminika na bázi cetirizinu (Zodac, Zyrtec, Analergin), loratidinu (Claritin) či des-loratidinu (Xyzal), symptomy by měly odeznít do 10 až 15 minut po podání. Intoxikace mohou být následkem vysokého příjmu HIS potravou, či snížením aktivity detoxikačních enzymů (alkohol, inhibitory DAO, některá onemocnění). Rovněž současný příjem KAD a PUT může vést ke zvýšení hladiny HIS v krvi, neboť afinita DAO k oběma diaminům je ve srovnání s HIS podstatně vyšší a dochází tak k vyčerpávání kapacity DAO pro histamin (Taylor, 1986). Podle některých autorů (King et al, 2000; Vlieg-Boerstra, 2005; Meintz a Nowak, 2007) existuje navíc předpoklad, že určité potraviny a potravní doplňky mají schopnost uvolňovat HIS přímo z žírných buněk organismu. Do této skupiny se řadí např. ananas, citrusové plody, jahody, papája, rajčata, špenát, ořechy, arašídy, čokoláda, vaječný bílek, ryby, vepřové maso, ale i některé druhy koření, alkohol, či některá aditiva. V zemích s velkou spotřebou mořských ryb a mořských plodů patří otravy histaminem k nejběžnějším typům otrav z potravin (Hungerford, 2010). Např. v USA je mezi třemi nejčastějšími chorobami vyvolanými konzumací mořských plodů právě intoxikace histaminem (Den Brinker et al., 2000). Často se používá pojmu skombrotoxikóza, protože původcem otrav bývají nejčastěji ryby z čeledi Scombridae (makrelovité), představované zejména tuňáky a makrelami (Rauschner-Gabering et al., 2009).
17
Histamin přijímaný potravou může u citlivých jedinců zhoršovat již probíhající onemocnění. King (2000) ve své klinické studii uvádí vliv přísné diety neobsahující histamin u pacientů s chronickou kopřivkou a angioedémem. Po 14 dnech diety došlo k výraznému zlepšení stavu pacientů a dávkování užívaných antihistaminik mohlo být značně sníženo. Obdobný pokus provedli Wantke et al. (1993) u pacientů trpících chronickými bolestmi hlavy. Během diety trvající několik měsíců až let uváděli pacienti výrazné snížení intenzity, frekvence i délky trvání příznaků.
2.4.2 Toxicita tyraminu Tyramin je nejúčinnější ze skupiny vazoaktivních aminů (podstatně slabší účinky vykazují TRY a FEA). Hlavní význam TYR v potravinách spočívá ve farmakologické interakci s inhibitory MAO (viz. část 2.4), jež může navodit tzv. hypertenzní krizi (zvýšení krevního tlaku nad 180/120 mmHg). U pacientů užívajících právě inhibitory MAO může dojít k nahromadění TYR v systémovém oběhu s následným uvolňováním noradrenalinu z nervových zakončení a k prudkému zvýšení krevního tlaku s možným vznikem mrtvice nebo srdečního infarktu (Westfall a Westfall, 2006). Zatímco u zdravého jedince nízká dávka TYR z potravy nepředstavuje riziko (k výraznému zvýšení systolického krevního tlaku by došlo až jednorázovým požitím více než 400 mg tyraminu), pro zmíněnou skupinu osob příjem již 6 mg může způsobit mírnou krizi a příjem 10 – 25 mg tyraminu může vést k prudkým bolestem hlavy s nitrolebečním krvácením (McCabe, 1986; Ladero et al., 2010a). Poprvé bylo zvýšení krevního tlaku vyvolané TYR zaznamenáno v 60. letech 20. století po konzumaci sýrů u pacientů léčených inhibitory MAO, odtud se intoxikace tyraminem označuje jako „reakce na sýry“ (z angl. „cheese reaction“; Křížek a Kalač, 1998). Zatímco řada dřívějších autorů (Sandler, 1974; Peatfield, 1995; Leira a Rodriguez, 1996) na základě klinických pokusů uvádí TYR obsažený v potravě jako možný spouštěč migrén u citlivých jedinců včetně dětí, novější studie (Jansen, 2003; Holzhammer, 2005; Crawford, 2006) tyto hypotézy pro nedostatek vědeckých podkladů nepotvrzují. Podle nich může mít potrava pouze limitující roli v urychlení vzniku migrény či tenzních bolestí hlavy, popř. je neovlivňuje vůbec. Kromě výše uvedených systémových účinků může TYR také zvyšovat přilnavost
E. coli 1057H k buňkám střevního epitelu (Lyte, 2004). Zvýšené koncentrace TYR 18
v mozku mohou dle autorů Coruzzi et al. (2001) a Premont et al. (2001) souviset s výskytem neurologických onemocnění, jako je schizofrenie, Parkinsonova choroba, Reyův syndrom, či deprese.
2.4.3 Toxicita diaminů a polyaminů Přímé toxické účinky putrescinu, sperminu a spermidinu popsány nebyly, diaminy PUT a KAD však mohou díky vyšší afinitě k DAO zvyšovat toxicitu HIS. Vzhledem k tomu, že PUT, SPM a SPD se v organizmu podílí na řadě důležitých buněčných pochodů (regulace buněčného růstu a buněčné proliferace) a jejich zvýšené koncentrace bývají přítomny v maligně transformovaných buňkách, příjem těchto aminů potravou by měl být do jisté míry regulován (Ladero et al., 2010a). Putrescin je také některými autory (Shah a Swiatlo, 2008) dáván do souvislosti s virulentními
faktory
řady
grampozitivních
a
gramnegativních
patogenních
mikroorganizmů. Dle autorů Jones et al. (2007) usnadňuje přítomnost PUT v extracelulárním slizu plazivých a plovoucích buněk, typických pro rod Proteus, vzájemnou buněčnou komunikaci a významně se tak podílí na pohyblivosti těchto bakterií, jenž způsobují např. záněty močových cest. Zahříváním PUT vzniká piperidin, z KAD pyrolidin, což jsou sloučeniny, které mohou stejně jako sekundární aminoskupiny SPM a SPD raegovat s přítomnými nitráty za vzniku kancerogenních nitrosaminů (Shalaby, 1996). Kancerogenita nitrososloučenin byla prokázána u více než 40 živočišných druhů, u většiny z nich se projevoval i účinek mutagenní, popř. teratogenní. Rovněž u člověka existuje předpoklad, že právě nitrosaminy (jak endogenní, tak přijímané potravou) jsou jedním z faktorů podílejících se na vzniku rakoviny gastrointestinálního traktu (rakovina tlustého střeva, žaludku, jícnu či jater; de Kok a van Maahen, 2000; Farombi, 2004).
2.5 Výskyt BA v potravinách BA v potravinách v řadě případů poukazují na stupeň mikrobiální kontaminace, jejich koncentrace tak může být považována ze jeden z ukazatelů kvality potravin. Vyskytují se jak v potravinách fermentovaných (tj., připravovaných kvasnými pochody), tak nefermentovaných. Nejvyšší hladiny BA se nachází především v rybách a
19
rybích výrobcích, dlouhozrajících sýrech, fermentovaných masných a zeleninových výrobcích, pivě a víně (McCabe-Sellers, 2006). Hladiny TYR a HIS v mg vztažené na běžně konzumovanou porci vybraných druhů potravin dle autorů Vlieg-Boerstra et al. (2005) uvádí tabulka 1. Vzhledem k rozdílné dekarboxylační schopnosti bakteriálních kmenů podílejících se na tvorbě BA se i obsahy jednotlivých BA v potravinách značně liší. Jejich hladiny v určitém druhu potraviny tak mohou v širokém rozpětí kolísat nejen mezi různými výrobci, ale i mezi jednotlivými šaržemi téhož výrobce (Kalač a Křížek, 2002; Standarová et at., 2008).
Tabulka 1. Obsah tyraminu a histaminu ve vybraných skupinách potravin (Vlieg-Boerstra et al., 2005) Potravina Ryby
Tyramin (mg / porce) 1,8 - 9,0 / 70 g
Histamin (mg / porce) 0,6 - 11,5 / 70 g
Sýry
1,0 - 31,0 / 20 g
0,7 - 35,0 / 20 g
Maso a masné výrobky
1,7 - 11,0 / 20 g
0,6 - 5,5 / 20 g
Zelenina
12,2 - 33,0 / 200 g
5,0 - 23,0 / 200 g
Pivo a víno
0,5 - 3,6 / 100 ml
0,6 - 1,6 / 100 ml
1,5 - 18,0 / 10g
0,8 - 21,0 / 10g
Fermentované sojové výrobky
2.5.1 Ryby a rybí výrobky Ryby a výrobky z ryb patří mezi potraviny s nejvyšším obsahem BA, především však histaminu. Jedná se hlavně o mořské ryby představované tuňáky, makrelami, sledi, sardinkami nebo ančovičkami. Vyšší koncentrace HIS jsou rovněž běžné u krevet a jiných mořských plodů. Svalovina mořských ryb obsahuje velké množství volného histidinu (od 1 g kg-1 u sleďů po 15 g kg-1 u tuňáků), který je za příznivých podmínek dekarboxylován na histamin. Na této reakci se podílí endogenní histidindekarboxyláza, podle autorů Halasz et al. (1994); Bjornsdottir et al. (2009) a Tsai et al. (2009) je však pro tvorbu HIS v rybách rozhodující činnost dekarboxyláz bakteriálních. U čerstvě vylovených ryb jsou hladiny HIS obvykle nízké (do 10 mg kg-1), pokud však nedojde k rychlému zchlazení a udržování teploty ryb kolem 0 °C, koncentrace mohou vzrůstat až na tisíce mg kg-1. Vzhledem k mezofilní povaze většiny bakterií podílejících se na vzniku BA, dochází ke značné tvorbě HIS již při teplotě nad 10 °C (Křížek a Kalač, 1998). Skladováním ryb při 30 °C, což je teplotní optimum právě pro
20
mezofilní bakterie, může dojít k překročení akceptovatelné dávky HIS již během 48 hodin. Během tepelných úprav (např. pečení ryb) může dojít k vytěkání časti BA, sterilací při konzervaci se však obsahy BA již nemění (Shalaby, 1996). Přídavek glukono-deltalaktonu (známého jako přídatná látka – E575) výrazně potlačuje tvorbu putrescinu (Maijala et al., 1993). Kromě HIS vzrůstá při kažení ryb i koncentrace KAD a PUT, obsahy SMP a SPD naopak klesají (Baixas-Nogueras et al., 2002; Křížek et al., 2002). Pro kvalitativní posouzení ryb z hlediska poživatelnosti proto Karmas (1981) navrhl tzv. index BA (BAI). Pro obsahy BA (v mg/kg) dle něj platí: BAI =
HI + PUT + KAD . 1 + SPD + SPM
Při hodnotě BAI<1 je kvalita výborná, při BAI>10 velmi špatná. Dle autorů Sims et al. (1992) je však pro hodnocení poživatelnosti spolehlivějším kritériem součet obsahu PUT a KAD. Dalším z kvalitativních ukazatelů ryb a rybích výrobků je i obsah bakteriálního metabolitu trimetanolaminu, látky zodpovědné za typický zápach zkažených ryb.
2.5.2 Sýry Sýry se v četnosti otrav histaminem řadí hned za ryby a rybí výrobky. Také hypertenzní krize vyvolaná zvýšeným příjmem tyraminu je nejčastěji spojována s konzumací sýrů . Zatímco v čerstvém mléce jsou koncentrace BA nepatrné (obvykle do 1 mg kg-1; Petridis, Steinhart, 1996; Novella-Rodríguez, 2000), v sýrech mohou být nalezeny hodnoty až tisíců mg kg-1. Hladiny BA ve zrajících sýrech jsou obecně vyšší, než v sýrech nezrajících. U dlouhozrajících sýrů mohou být koncentrace až 2000krát vyšší v porovnání se sýry čerstvými (Novella-Rodríguez, 2003; McCabe et al., 2006). Nejvíce jsou zastoupeny HIS, TYR, KAD, PUT (desítky až stovky mg kg-1), FEA (jednotky až desítky mg/kg), na počátku zrání SPM a SPD, v menší míře může být přítomen i TRP. Obsahy BA u jednotlivých typů sýrů značně kolísají, jsou závislé na řadě faktorů. Výrazně vyšší koncentrace měly sýry vyrobené z nepasterovaného mléka (Schneller et al., 1997; Elsanhoty et al., 2009), podle autorů Novella-Rodríguez et al. (2002) lze vyšší hodnoty předpokládat i v případě vysokotlakého ošetření mléka, neboť zde může oproti pasteraci docházet
k výraznější proteolýze a následnému vzrůstu nabídky volných
21
aminokyselin. Riziko vzniku většího množství BA představuje bakteriální kontaminace (např. laktobacily, enterokoky, Enterobacteriaceae), a to jak v původní surovině, tak během výrobního procesu (Komprda et al., 2008a). Z technologického hlediska obsah BA ovlivňuje teplota sýřeniny, doba zrání či použití startérových a plísňových kultur (Křížek a Kalač, 1998). Během zrání a skladování sýrů se koncentrace BA zvyšují, hladiny SPM a SPD naopak klesají (Novella-Rodríguez et al., 2003; Standarová et al., 2010). Nižší hladiny BA mají tvrdé sýry holandského typu, vyšší potom zrající sýry měkké a poloměkké, sýry švýcarského typu a plísňové. Jednotlivé druhy sýrů mají svá charakteristická spektra, např. histamin dosahuje nejvyšších koncentrací v sýrech švýcarského typu, naopak nízké hladiny HIS se nacházejí v eidamech nebo čedarech (Stratton et al., 1991; Degheidi et al., 1992; Standarová et al., 2008). Přehled obsahů TYR, HIS a PUT v různých typech sýrů produkovaných v Evropě je uveden v tabulce 2.
Tabulka 2. Přehled kvantitativně významných biogenních aminů v různých typech sýra (Komprda a Dohnal, 2010). Biogenní amin (mg kg-1)
Typ sýra
Histamin
Tyramin
Putrescin
750-1290
64-910
17-360
Tvrdé sýry holandského typu
2 - 17
3-310
6 - 61
Plísňové sýry
ND-90
10-185
ND-117
Poloměkké sýry z pasterovaného mléka
ND-124
39-770
6-109
Poloměkké sýry z nepasterovaného mléka
226-573
400-1478
76-308
Kozí sýry
10
68
34
Tradiční portugalské ovčí sýry
16
176
218
Sýry švýcarského typu
ND – nedetekováno
Tavené sýry, přestože jsou během výroby vystaveny vysokým teplotám, obsahují rovněž určitá množství BA, v porovnání se sýry přírodními se však jedná o hladiny nižší (Stratton et al., 1991; Degheidi et al., 1992; El-Sayed, 1996; Kung et al., 2005, Standarová et al., 2008).
22
2.5.3 Maso a masné výrobky Maso a nefermentované masné výrobky zpravidla nepředstavují z hlediska obsahu BA zdravotní rizika. V čerstvém mase teplokrevných živočichů se nachází především SPM (20 - 60 mg kg-1) a SPD (obvykle do 10 mg kg-1), v malém množství mohou být přítomny i PUT, KAD, HIS a TYR (Halasz et al., 1994; Kalač a Krausová, 2005). Přítomnost BA byla zjištěna ve vařeném i nevařeném hovězím a vepřovém mase (Németh-Szerdahelyi, 1993), HIS byl detekován v hovězím a jehněčím mase (Teodorović et al., 1994). Vysoké obsahy SPM a SPD byly zjištěny v hovězích, vepřových a drůbežích játrech (Krausová et al., 2006). Vzrůstající hodnoty BA během skladování masa indikují bakteriální kontaminaci a jejich obsahy tak mohou sloužit jako indikátory čerstvosti masa (Ntzimani et al., 2008). Dle autorů Chen et al. (1994) jsou tyto změny přímo závislé na teplotě. Vepřové maso skladované při 30°C obsahovalo výrazně vyšší hladiny BA než maso skladované při teplotě 4°C, zvyšovaly se hlavně koncentrace KAD, PUT, ale i HIS a TYR. Smith et al. (1993) prokázali u vakuově baleného hovězího masa tvorbu BA i při velmi nízkých teplotách. Významné hladiny BA (především tyraminu) byly detekovány již 20. den skladování při 1°C. Poněkud odlišná situace je v případě fermentovaných trvanlivých masných výrobků, u kterých je naopak tvorba BA velmi významná. Obdobně jako u sýrů, i zde dochází během zrání k proteolýze s následným zvýšením nabídky volných aminokyselin pro dekarboxylující mikroorganizmy. Spektrum BA se mění s dobou zrání. Zatímco na počátku fermentace se vyskytuje hlavně HIS a KAD, ke konci převažuje spíše TYR a PUT, vyskytovat se mohou i TRP, FEA, SPM a SPD (Komprda et al., 2009). Hladiny BA v těchto výrobcích se obvykle pohybují v rozmezí jednotek až desítek mg kg-1, popř. desítek až stovek mg kg-1. Výsledný obsah BA v konečném výrobku závisí na ošetření původní suroviny, dodržování přísné hygieny výrobního procesu, použití startérových kultur, ale i na použité technologii Důležitými fyzikálně – chemickými faktory ovlivňující obsah BA ve fermentovaných masných výrobcích jsou především pH, vodní aktivita, teplota a doba zrání, průměr salámu. (Suzzi a Gardini, 2003; Komprda et al., 2009; Latorre-Moratalla et al., 2010).
23
2.5.4 Potraviny rostlinného původu BA jsou běžnou součástí rostlinných orgánů, plní řadu fyziologických funkcí. U některých rostlinných druhů (např. Acacia berlandieri z čeledi Fabaceae) mají BA pravděpodobně i funkce obranné, předpokládá se, že rostlinu chrání před hmyzem a býložravci (Forbes et al., 1995). Pro potraviny rostlinného původu je typický vyšší obsah SPD oproti SPM, u potravin živočišného původu je tomu přesně naopak (Kalač a Krausová, 2005). V čerstvém ovoci a zelenině je obsah BA obvykle nízký (McCabe et al. 2006), vyšší hladiny TYR byly zjištěny např. u banánů (výrazně vyšší hladiny přitom obsahuje slupka), švestek, jahod a manga (Halasz et al., 1994; Mohamed et al., 2009). Zvýšené koncentrace PUT zaznamenali Kalač et al. (2005) v jablkách, mrkvi a cibuli. Během mechanického
zpracovávání
však
může
dojít
ke
kontaminaci
především
dekarboxylujícími bakteriemi čeledi Enterobacteriaceae (Valero et al., 1998; SimonSarkadi et al., 1994) a k následnému zvýšení hladin BA (zejména PUT). Právě PUT byl ve vyšších koncentracích (přesahujících 130 mg kg-1) stanoven v řadě ovocných džusů (pomerančovém, mandarinkovém, grepovém nebo jahodovém). V malinové šťávě byl dominantní TYR, HIS se oproti tomu vyskytoval minimálně (Maxa a Brandes, 1993; Kalač a Krausová, 2005). Vyšší hladiny BA byly zaznamenány u rajčat (TYR, TRP, HIS), špenátu (HIS),
čínského zelí a ledového salátu (PUT; Moret et al., 2005). Během vaření zeleniny dochází k částečnému vyluhování BA do vroucí vody naopak během skladování hladiny BA (především PUT) stoupají (Kolesárová, 1995). Fenylethylamin je běžnou součástí kakaových bobů, nachází se proto i v čokoládě,
čokoládových výrobcích a cukrovinkách obsahujících čokoládu. Vysoké hladiny FEA byly rovněž zjištěny u některých druhů hub (Silla-Santos, 1996). Stejně jako v případě fermentovaných živočišných produktů, i u potravin rostlinného původu připravovaných fermentací je předpoklad tvorby BA vysoký. Obsahy značně kolísají v závislosti na podmínkách fermentace, množství prekurzorů a přítomné mikroflóře (Peñaz et al., 2010). U kvašeného zelí v počátku fermentace převažuje tvorba PUT, ke konci rostou hladiny TYR a HIS (udávají se hodnoty desítek až stovek mg kg-1; Moret et al., 2005). Dle autorů Kalače a Křížka (2001) by bylo možné výrazně snížit obsahy BA v nakládaném zelí naočkováním vybranými kulturami mléčných bakterií.
24
Fermentované výrobky ze sóji (sojové omáčky, miso, tempeh) rovněž obsahují různě vysoké hladiny BA, především TYR a HIS (Yongmei et al., 2009; Shukla et al., 2010).
2.5.5 Pivo a víno Zatímco jednorázová konzumace sýrů a fermentovaných masných výrobků není obvykle příliš vysoká, u piva a vína je situace odlišná. Pivo i víno jsou získávány alkoholovým kvašením, pokud se ale uplatní kontaminující mléčné bakterie, může obsah aminů představovat zdravotní riziko. To je dáno jak konzumací větších množství v krátkém časovém úseku, tak schopností alkoholu snižovat účinek střevních aminooxidáz, podílejících se na odbourávání BA Obsahy BA v pivech mohou být ovlivněny kvalitou sladu a čistotou kvasného procesu. Typický je vzrůst jejich obsahu během hlavního kvašení, zatímco v dalších fázích výroby se již významněji nemění (Kalač et al., 1997). Riziko vzniku BA v pivech představuje hlavně kontaminace mléčnými bakteriemi (Křížek a Kalač, 2005). Indikátorem kontaminace bývají zvýšené hladiny TYR a KAD (Izquierdo-Pulido et al., 1996; Kalač et al., 1997). Z BA se v pivech nejčastěji vyskytuje právě TYR (Halasz et al., 1994) a HIS (Dumont et al., 1992), přičemž hladiny nad 10 mg l-1 mohou být dosaženy jak v pivech běžných, tak nealkoholických (Kalač a Křížek, 2002). Nejvyšší obsahy byly zjištěny u spontánně kvašených belgických piv. Vzorky převážné většiny (90 %) sledovaných značek tuzemských piv však obsahovaly méně než 2 mg l-1 histaminu (Kalač et al., 1997). Ve víně se nejčastěji vyskytuje HIS, TYR a PUT, v menší míře i KAD, etanolamin a agmatin. HIS a TYR bývají obvykle detekovány v jednotkách mg l-1, v řadě případů však byly zjištěny i hodnoty vyšší (10-30 mg l-1 pro HIS, desítky – stovky mg l-1 pro TYR; Ancín-Azpilicueta et al., 2008; Costantini et al., 2009). Obsahy BA ve víně značně kolísají a mohou být ovlivňovány např. podmínkami fermentace. Koncentrace BA ve víně se mohou lišit mezi různými odrůdami vinné révy nebo dokonce různými oblastmi, ve kterých se vinná réva stejných odrůd pěstuje (Marques et al., 2008). Červená vína obsahují obecně vyšší hladiny BA než vína růžová, či bílá. Autoři Ancín-Azpilicueta et al. (2008) tuto skutečnost vysvětlují působením rozdílných faktorů během výroby červeného a bílého vína.
25
2.6 Hygienické limity pro BA v potravinách Stanovení maximálních přípustných koncentrací BA v potravinách je značně obtížné, neboť vnímavost vůči BA je velice individuální. Jak již bylo řečeno, detoxikační schopnost organismu závisí na zdravotním stavu jedince, genetických predispozicích, současném podávání některých léků a dalších faktorech. Pro osoby z rizikových skupin (např. pacienti léčení inhibitory MAO) mohou již relativně nízké dávky BA způsobit vážné zdravotní komplikace. Existují proto přísná doporučení, podle kterých by se tito jedinci měli potravinám s vyššími obsahy BA vyhýbat úplně, nebo alespoň jejich konzumaci omezit. Zatímco jednorázový příjem HIS do 40 mg způsobuje pouze lehké a nad 40 mg střední potíže, orální příjem 70 a více mg HIS může vést k projevům intoxikace. Závažné intoxikace jsou spojovány s jednorázovým příjmem HIS nad 1000 mg kg-1 . (Rauscher-Gabering et al., 2009). Ve většině sledovaných případů histaminových otrav po konzumaci sýrů (hlavně sýry švýcarského typu a čedary) na Novém Zélandu (Australia-New Zealand Standards code, 2006) a ve Spojených státech amerických (Stratton et al., 1991) byly zjištěny koncentrace HIS právě nad 1000 mg kg-1. Autoři Rauscher-Gabering et al. (2009) považují obsahy 100 – 400 mg kg-1 HIS v sýrech za bezpečné (při konzumaci 60 g sýra za den), v salámech udávají odpovídající hodnoty 120 – 500 mg kg-1 HIS (při konzumaci 50 g salámu za den). Pokud by došlo také ke konzumaci ryb (150 g ryby za den), doporučují uvedení autoři snížit limity pro HIS u sýrů i salámů až o dvě třetiny. Podle citovaných autorů je velikost konzumované porce, a četnost konzumace těchto porcí během dne, důležitým kritériem pro posouzení toxikologického významu dané potraviny z hlediska obsahu BA. U jedinců užívajících inhibitory MAO se doporučuje udržovat jednorázový příjem TYR pod 5 mg, neboť již dávka 6 mg může u těchto osob vyvolat střední krizi, 10 –25 mg TYR
může mít za následek těžké bolesti hlavy s nitrolebečním krvácením
(McCabe-Sellers et al., 2006; Ladero et al., 2010a). Za přijatelný obsah TYR v potravinách považuje řada autorů hladiny do 100 mg kg-1, pro FEA 30 mg kg-1. Suma uvedených aminů do 100 – 200 mg kg-1 by rovněž neměla představovat riziko (Halasz et al., 1994, Nout et al, 1994). Podle autorů Spanjer et al. (1991) by suma HIS, PUT a KAD v rybách a rybích výrobcích neměla přesáhnout hladinu 300 mg kg-1, u sýrů a kvašeného zelí by celkový součet obsahů TYR, HIS, KAD a PUT neměl být vyšší než 900 mg kg-1 výrobku. Pro ostatní BA zatím limity nebo doporučení nebyly stanoveny.
26
Řada zemí zákonem stanovila maximální přípustné koncentrace v rybách, rybích výrobcích, ale i v dalších potravinách. Americká FDA (2001), australský Food Standard Code (2006) a legislativa řady dalších zemí (Německo, Španělsko, Izrael, Turecko) stanovili přípustné hladiny histaminu v rybách a rybích výrobcích v rozmezí 50 – 200 mg kg-1. V evropské unii je legislativní limit stanoven Nařízením EP a Rady (ES) č. 2073/2005 O mikrobiologických kritériích pro potraviny jen pro obsah histaminu. Mezní hodnoty se vztahují na ryby z čeledí Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae, Pomatomidae a Scombraesosidae. V devíti odebraných vzorcích nesmí být průměrný obsah HIS nad 100 mg kg-1. Ve dvou vzorcích může obsah překročit tuto hodnotu, ale nesmí být vyšší než 200 mg kg-1. V žádném vzorku nesmí obsah překročit 200 mg kg-1. U ryb uvedených druhů, jenž byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku, mohou být hladiny HIS vyšší, ne však víc než dvojnásobně. Výrobci nejsou povinni deklarovat obsah biogenních aminů na obalech.
2.7 Metody stanovení BA v potravinách Pro stanovení BA existuje řada analytických postupů, vypracovaných podle typu materiálu, v němž mají být aminy sledovány. V praxi se BA nejčastěji stanovují v potravinách, potravinových doplňcích, nápojích a krmivech, ale i v biologickém materiálu (např. v oblasti medicíny ve vzorcích tělních tekutin). Pro potravinářské účely jsou důležité jak metody zaměřené na stanovení aromatických a heterocyklických aminů (právě vysoké hladiny TYR a HIS představují možné riziko), tak na biogenní aminy (včetně polyaminů) jako celek (Křížek a Kalač, 1998).
Využívají
se
především
metody
chromatografické,
enzymatické
a
elektroforetické. Největší uplatnění pro analýzu BA v poživatinách mají vysokotlaková kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC), plynová chromatografie (GC) a iontově výměnná chromatografie (IEC), své postavení si zachovává i tenkovrstvá chromatografie (TLC). Všechny výše uvedené metody zahrnují dva následující kroky (Innocente et al., 2007) : •
extrakce aminů z původního materiálu,
•
vlastní analytické stanovení BA.
27
Vzhledem k bazické povaze aminů jsou nejpoužívanějšími extrakčními činidly anorganické i organické kyseliny (kyselina chlorovodíková, chloristá, trichloroctová). Při extrakci v kyselém prostředí dojde k vyizolování jak volných aminů, tak aminů vázaných na komponenty původní matrice. Výběr kyseliny závisí na materiálu, v němž mají být BA analyzovány. K extrakci BA ze sýrů se nejčastěji používá 0,1M kyselina chlorovodíková nebo 0,2M a 0,6M kyselina chloristá (Komprda a Dohnal, 2010), pro salámy a ryby je nejvhodnějším extrakčním činidlem kyselina trichloroctová (Moret a Conte, 1996). Po izolaci aminů ze vzorku následuje zpravidla alkalizace alikvotního podílu extraktu (Křížek a Kalač, 1998). V závislosti na charakteru původního materiálu a přirozeném obsahu volných aminokyselin (vysoký je jejich obsah např. ve zrajících sýrech), jež by mohly být rušivou složkou stanovení, jsou někdy kromě základní extrakce nezbytné i další předseparační kroky (Innocente et al., 2007). Nejčastěji se volí extrakce do organického rozpouštědla (butanol, butanol/chloroform, diethyleter), během níž přecházejí volné aminy do organické fáze, zatímco aminokyseliny zůstávají ve fázi vodné (Moret a Conte, 1996). Lipidy, jež by také mohly být rušivou složkou stanovení BA, lze ze vzorků eliminovat zamražením nebo centrifugací za snížené teploty (obvykle 4 °C; Gianotti et al., 2008; Gosetti et al., 2007). Aby bylo možné stanovit pomocí kapalinové chromatografie i nearomatické biogenní aminy, jež neabsorbují záření v UV/VIS oblasti, je nezbytné vzorek před vlastní detekcí vhodně derivatizovat. Nejrozšířenějším derivatizačním činidlem je tzv. dansylchlorid (5-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid; DCl). Dansylderiváty lze po HPLC separaci detekovat jak UV/VIS detektorem, tak fluorimetricky, výhodou jsou poměrně krátké eluční časy a možnost využití i u TLC. Dansylaci lze použít při stanovení BA v sýrech (Moret a Conte, 1996; Schneller et al., 1996; Vale a Gloria, 1997a; Pinho et al., 2001; Innocente et al, 2007; Martuscelli et al., 2005; Lanciotii et al., 2007; Komprda et al. 2008a), v mase a masných výrobcích (Komprda et al., 2009) v rybách (Park et al., 2010), ve víně (Dugo et al., 2006), v zelenině (Moret et al., 2005) a dalších materiálech. Derivatizační činidlo se nejčastěji připravuje rozpouštěním v acetonu v slabě zásaditém prostředí. Následná derivatizace probíhá při teplotě 40 – 60 °C po dobu 20 – 60 minut, nižší teploty a kratší doba derivatizace vedou k nízké výtěžnosti i opakovatelnosti. Nevýhodou dansylderivátů může být nižší stabilita při uchovávání a rovněž jejich fotolabilita. Nižší detekční limity umožňuje derivatizace oftaldialdehydem (OPA), oproti dansylchloridu je ale nutná delší doba analýzy a možnost 28
pouze spektrofluorimetrické detekce (Moret et al., 2005). Velkou nevýhodou je i to, že OPA nereaguje se sekundárními aminoskupinami sperminu a spermidinu, stanovit tak lze pouze primární aminy. Další možností předkolonové derivatizace je např. reakce s benzoylchloridem, 9fluorenylmethyloxycarbonylchloridem (dichlorotriazinylaminofluorescein)
(FMOC),
nebo
deriváty
fenylthioisokyanátem
fluoresceinu (Gosetti,
2007).
Derivatizace pomocí FMOC umožňuje stanovení primárních i sekundárních aminů. Velkou výhodou tohoto činidla je stabilita vzniklých derivátů při pokojové teplotě a především možnost detekovat i velmi nízké koncentrace sledovaných aminů (Lozanov et al., 2007). Biogenní aminy lze na reverzní fázi HPLC separovat i nederivatizované, a to ve formě iontových párů (Izquierdo-Pulido, 1993). Derivatizace následuje až po separaci, nejčastěji
ninhydrinem, za
tvorby barevných produktů nebo již zmíněným o-
ftaldialdehydem v přítomnosti 2-merkaptoethanolu za tvorby fluorescenčních produktů (Alberto et al., 2002; Novella-Rodríguez et al., 2003). Kromě nejčastěji používané RP-HPLC, lze pro stanovení BA v sýrech využít i micelárni kapalinovou chromatografii (MLC), jako mobilní fáze u této metody se používají vodné roztoky povrchově aktivních látek (Gil-Agustí et al., 2007). Pro rychlá kontrolní stanovení BA lze využít klasickou TLC, její výhodou je jednoduchost, použitelnost pro velká množství vzorků v minimálním čase a cenová dostupnost (Shalaby, 1996). I zde je však nutná předseparace a vhodná derivatizace. TLC pro analýzu BA v tavených sýrech využil El-Sayed (1996). Srovnání TLC a HPLC pro stanovení BA v rybách a rybích výrobcích provedli Shakila et al. (2001), podle autorů je TLC velmi vhodnou metodou pro sledování HIS, PUT a KAD právě v rybím průmyslu. Pro stanovení aminů v sýrech, ale i ostatních potravinách lze využít i ionexovou chromatografii (IEC). Výhodou IEC je jednoduchá příprava vzorku bez nutnosti derivatizace a možnost stanovení primárních i sekundárních aminů (Standara et al., 2000). Nevýhodou jsou delší retenční časy, vznikající zadržováním aminů v koloně díky silným hydrofóbním interakcím. Dle autorů De Borba a Rohrer (2007) lze hydrofóbní interakce mezi aminy a stacionární fází minimalizovat použitím slabě kyselých iontoměničů. Výhodu je podle posledně citovaných autorů i možnost použití konduktometrické detekce.
29
Metodu kapilární zónové elektroforézy (CZE; separace založená na rozdílech v náboji analytu) s ampérometrickou detekcí použili pro stanovení BA v mléce Sun et al. (2003). Také Kvasnička a Voldřich (2006) analyzovali biogenní aminy v různých druzích potravin s použitím CZE, detekce však v jejich případě byla konduktometrická. Pro stanovení BA v potravinách je možné využít i kapilární elektrochromatografii (Oguri et al., 2007) nebo micelární elektrokinetickou kapilární chromatografii (Křížek a Kalač, 1998). Plynová chromatografie není pro stanovení BA v potravinách příliš využívaná. Při separaci na náplňových kolonách vznikají nepravidelné píky, rovněž separace nederivatizovaných aminů není častá, protože dochází ke chvostování píků (Fernandes a Ferreira, 2000). Výhodnější je použití GC (popřípadě i HPLC) ve spojení s hmotnostním detektorem (MS). Tato metoda se vyznačuje vysokým stupněm citlivosti a selektivity, předností je i to, že pro stanovení není nutná derivatizace. Iontově výměnnou chromatografii s následnou MS detekcí využili Saccani et al. (2005) pro stanovení HIS, PUT, KAD, FEA a SPD v mase a fermentovaných masných výrobcích. Vysoké výtěžnosti, přesnosti, nízkých limitů detekce a rychlosti ve stanovení histaminu v sýrech dosáhli Schievano et al. (2009) použitím nukleární magnetické rezonance. Tuto metodu úspěšně aplikovali při analýze měkkých i tvrdých sýrů a doporučují ji i pro stanovení histaminu v ostatních potravinách. Z biologických metod se pro stanovení histaminu v potravinách osvědčily metody enzymové imunoanalýzy RIA (z angl. radioimmunoassay) a ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Metody jsou založeny na imunitní reakci sledované látky s protilátkami, jejich výhodou je rychlost a ve srovnání s HPLC i menší finanční náročnost (Stratton et al., 1991). Srovnáním metod ELISA a HPLC pro stanovení HIS v sýrech se ve své práci zabývali např. Azgün et al. (1997). Na enzymatické reakci s následným kolorimetrickým stanovením je založena i metoda, kterou vyvinuli Sato et al. (2005). S využitím histamindehydrogenázy získané z bakteriálního rodu Rhizobium takto stanovili HIS v různých druzích potravin.
30
2.8 Faktory ovlivňující vznik BA v sýrech Sýry představují díky své vysokoproteinové povaze a fermentačním procesům během výroby ideální prostředí pro vznik biogenních aminů. Tvorba BA v sýrech je závislá na koncentraci aminokyselin nebo peptidů, které hrají roli prekurzorů jejich tvorby, přítomnosti bakterií schopných dekarboxylovat aminokyseliny, pH prostředí, koncentraci soli, vodní aktivitě, přítomnosti kyslíku, části sýra (okraj nebo střed), době a teplotě zrání a skladování, množství mikroorganizmů a na přítomnosti kofaktorů jako je pyridoxalfosfát (Pinho et al., 2004; Fernández et al., 2007; Landete et al., 2007; Bover-Cid et al., 2008; Emborg a Dalgaard, 2008). Podmínkou vzniku toxického množství BA v sýrech je proteolýza kaseinu, jež ve velké míře ovlivňuje kvalitu sýra (textura, aroma). Kromě výše uvedených skutečností má podstatný vliv na produkci BA i kvalita původní suroviny a způsob jejího ošetření, včetně hygienických podmínek v průběhu výroby. Tvorba BA je tak mimořádně složitý proces závislý na mnoha faktorech, jehož výsledkem jsou charakteristická spektra BA pro jednotlivé typy sýrů (Pinho et al., 2001; Martuscelli et al; 2005). Koncentrace BA se mohou výrazně lišit jak mezi jednotlivými druhy sýrů, tak u jednoho typu sýra mezi různými šaržemi nebo výrobci (Standarová et al., 2008).
2.8.1 Kvalita suroviny a způsob jejího ošetření O přítomnosti BA v sýrech rozhoduje již kvalita použitého mléka (Stratton et al., 1991). Mléka s vysokým obsahem dekarboxyláza-pozitvních bakterií obsahují i vyšší hladiny BA. Nařízením evropského parlamentu a rady (ES) č. 853/2004 (v platném znění č. 1662/2006) jsou pro
kravské mléko na další zpracování stanoveny následující
mikrobiologické požadavky: •
celkový počet aerobních a
fakultativně
anaerobních
mezofilních
mikroorganismů ≤ 100 000 ml-1, •
počet somatických buněk ≤ 400 000 ml-1.
Vysokým obsahům dekarboxylujících bakterií lze předejít vhodným tepelným ošetřením mléka, nejčastěji se volí pasterace při 72 °C po dobu 15 s. Pasterací se snižuje
31
i dostupnost kofaktorů, neboť pyrridoxalfosfát je termolabilní (Joosten, 1987). Oproti tomu většina aminů včetně histaminu je tepelně stálá, rovněž některé dekarboxylázy zůstávají aktivní i po pasteraci, takže obsah BA může následně vzrůstat i během skladování potravin (Brink et al., 1990). Rozhodující je proto preventivní důsledné dodržování hygieny před vlastním tepelným ošetřením mléka, které zamezí možnou bakteriální kontaminaci s následnou tvorbou BA. Výsledky publikované moha autory (Joosten et al., 1988; Ordónez et al., 1997; Schneller et al., 1997; Gennaro et a., 2003; Novella-Rodríguez et al., 2004; Martuscelli et al, 2005; Innocente et al., 2007; Elsanhoty et al., 2009) potvrzují významnou roli pasterace při tvorbě BA v sýrech. Ve všech uvedených studiích byly obsahy BA v sýrech vyráběných z pasterovaného mléka 2-3 krát nižší, než v případě sýrů z mléka syrového, popř. nedostatečně pasterovaného. Schneller et al. (1997) např. uvádí hodnoty celkového množství BA pro poloměkké sýry vyráběné z pasterovaného mléka 51 – 1096 mg kg-1, oproti hladinám 1011 - 3133 mg kg-1 BA zjištěných u sýrů z mléka tepelně neošetřeného. Nejvyšší hladiny TYR a HIS byly rovněž zjištěny u sýrů z nepasterovaného mléka. Výzkumy se týkaly jak mléka kravského, tak ovčího a kozího. Slibnou alternativou pasterace je podle řady autorů (Saldo et al., 2000; Trujillo et al., 2000; Buffa et al., 2001; Novella-Rodríguez, 2002a, b) vysokotlaké ošetření mléka s využitím rozmezí 100 – 1000 MPa. Použití již 300 – 600 MPa může vést k inaktivaci mikroorganizmů včetně hlavních patogenů. Výhodou takto ošetřeného mléka je kratší doba zrání sýrů a vyšší výnosy, aniž by došlo k negativnímu ovlivnění senzorických vlastností sýra. Na druhé straně, mechanickým působením tlaku může dojít k výraznější proteolýze než v případě pasterace a následnému zvýšení koncentrace volných
aminokyselin
představujících
prekurzory
tvorby
BA.
Porovnáním
vysokotlakého ošetření kozího mléka a pasterace z hlediska obsahů BA v sýrech se zabývali Novella-Rodríguez et al. (2002a). V obou případech se nejvíce vyskytoval TYR, KAD, PUT a HIS, jejich hladiny však byly u obou použitých metod srovnatelné. Původní předpoklad vyšší produkce BA po vysokotlakém ošetření se tak nepotvrdil, pro stanovení konečných závěrů jsou však nezbytné další experimenty.
32
2.8.2 Kontaminující mikroorganizmy Za tvorbu BA jsou z největší části zodpovědné dekarboxylační enzymy produkované řadou mikroorganizmů. Schopnost produkce BA se může značně lišit, dle autorů Novella-Rodriguéz et al. (2002a) a Wolken et al. (2006) je spíše kmenově než druhově specifická. Pro mikrobiální růst a aktivitu je rozhodující přítomnost vhodných podmínek (pH, vodní aktivita, přítomnost soli, kyslíku, atd.), dle řady autorů (Fernández et al., 2007; Landete et al., 2007; Bover-Cid et al., 2008) jsou během fermentace a zrání tyto faktory důležitější než dostupnost prekurzorů. Dekarboxylační aktivita byla prokázána u některých kmenů bakterií startovacích kultur, z největší části jsou však za tvorbu BA v sýrech zodpovědné kontaminující mikroorganizmy (Petridis, Steinhert, 1996; Komprda et al, 2008a,b; Buňková et al., 2010). Nezbytným krokem pro syntézu větších množství BA je proteolýza s následným uvolněním aminokyselin, k níž dochází během zrání sýrů (Novella-Rodríguez et al., 2003). Na proteolýze mléčných bílkovin se podílí jak nativní proteázy mléka, proteázy zákysových kultur, kontaminující mikroflóry a syřidlové enzymy, tak především bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbruecki subs. Bulgaricus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium) (Joosten, Nuñez, 1996; Galgano et al., 2001; Greifová et at., 2003). Co se týče vlivu doby zrání na vznik BA, většina autorů zastává podobný názor. Vznik aminů je podle nich přímo úměrný stupni proteolýzy, přičemž s rostoucí dobu zrání stoupají i hladiny BA (Petridis, Steinhart, 1996; Schneller et al., 1997; Novela-Rodríguez, 2003; Martuscelli et al., 2005; Komprda et al., 2008b; Standarová et al., 2009a). Těmto tvrzením odpovídá také skutečnost, že nezrající sýry (tedy sýry s nízkým stupněm proteolýzy) obsahují podstatně méně biogenních aminů než sýry zrající (Roig-Sagués et al., 2002). Podle údajů Ministerstva zdravotnictví Nového Zélandu (ESR, 2001) byla hlavní příčinou histaminových otrav po konzumaci sýrů (hlavně sýry švýcarského typu a čedary) právě extrémně dlouhá doba jejich skladování. Vyšší hladiny BA byly zjištěny také u sýrů vyráběných s použitím bakteriálních proteáz přidávaných za účelem urychlení zrání (Leuschner et al., 1998; Fernández-García et al., 2000). Kromě tvorby BA mají některé bakterie schopnost aminy i degradovat. Jedná se o mikroorganizmy obsahující aminooxidázy (MAO-A či MAO-B). Jejich působením dochází k oxidativní deaminaci aminů za tvorby aldehydů, peroxidu vodíku a amoniaku (Anli a Bayran, 2009). Právě činností aminooxidáz enterokoků vysvětlují Schneller et 33
al. (1997) postupné snížování hladin PUT ve zrajících poloměkkých sýrech, zatímco koncentrace ostatních BA stoupaly. Činnost tyraminoxidázy některých bakterií je velmi závislá na vnějších faktorech, charakteristická pro tento enzym je vysoká aktivita za aerobních podmínek. Při rozkladu HIS hraje významnou roli především teplota. Aminoxidázy zodpovědné za odbourávání HIS mají teplotní optimum při 37 °C, při teplotě 20 °C si však stále udržují asi 50 % své maximální aktivity (Suzzi a Gardini, 2003). Leuschner a Hammes (1998) a Leuschner et al. (1998a) studovali vliv přídavku vybraných fermentačních mikroorganizmů za účelem zabránění nebo snížení tvorby BA v sýrech. Nejvyšší potenciál degradovat HIS a TYR vykazovaly kmeny Brevibacterium linens a koryneformní bakterie. Tyto mikroorganizmy hrají významnou roli při povrchovém zrání sýrů typu Munster nebo Limburger (sýry s mazem na povrchu). Odbourávání aminů v povrchových vrstvách sýru s následnou difúzí aminů ze středních
částí vedlo k výraznému snížení celkové hladiny BA, nejúčinněji byl katabolizován TYR a HIS. Vysoká tyramin-oxidační aktivita byla zjištěna u rodu Micrococcus varians, bakterie mléčného kvašení se na degradaci BA podílely minimálně. Přítomnost BA v potravinách je tak výsledkem celkové rovnováhy mezi složením potraviny a enzymatickou aktivitou populace mikroorganizmů. Při výběru startovací kultury pro výrobu fermentovaných potravin by měla hrát důležitou roli kromě dekarboxylační schopnosti mikroorganizmů i přítomnost aminooxidáz a jejich možná aktivita.
Bakterie mléčného kvašení (BMK) Bakterie mléčného kvašení patří mezi nejvýznamnější producenty biogenních aminů v mléce a sýrech. V porovnání s aerobními bakteriemi vykazují nižší dekarboxylační aktivitu, během zrání sýrů však populace BMK dosahují vysokých hodnot a významně tak přispívají k celkovým hladinám BA v konečném výrobku (Fernández-García et al., 2000; Settani a Moschetti, 2010). BMK jsou nezbytné pro fermentační procesy během zrání sýrů, tvorba BA je však více spojena s kontaminujícími BMK než s bakteriemi startovacích kultur. Schopnost dekarboxylovat jednu nebo více aminokyselin byla prokázána u řady kmenů druhů Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc a Streptococcus (Fernández-García et al., 2000; Martuscelli et al., 2005; Komprda et al., 2008a; Pereira et al., 2009; Buňková et al., 2010; Ladero et al., 2010b). V počátečních fázích zrání sýrů se ve vyšších koncentracích nachází především laktokoky. Laktobacily, které rostou pomaleji, převažují v průběhu a ke konci zrání 34
(Fontecha et al., 1990). Významná tyrosin- a/nebo histidindekarboxylázová aktivita byla řadou autorů (Joosten a Northolt, 1989; Stratton et al., 1992; Giraffa et al., 1995; Straub et al., 1995; Leuschner et al., 1998; Roig-Sagues, 2002; Buňková et al, 2010) popsána u bakterií druhů Lactobacillus acidophillus, Lb. brevis, Lb. bulgaricus, Lb. casei, Lb. delbrueckii, Lb. fermentum, Lb. helveticus, Lb. plantarum nebo Lactococcus lactis. Některé kmeny laktobacilů a laktokoků jsou schopny produkovat FEA, v menší míře i PUT. KAD mléčné bakterie přítomné v mléce a sýrech neprodukují vůbec nebo jen v minimálním množství (Leuschner et al., 1998; Bover-Cid, Holzapfel, 1999). Vysoké koncentrace tyraminu poukazují na pomnožení grampozitivních koků, především Enterococcus faecalis a E. faecium. Některé druhy vykazují i fenylalanin-, histidin-, lysin- a ornithindekarboxylázovou aktivitu (Valenzuela et al., 2009). Enterokoky se vyskytují a rostou v řadě sýrů, zvláště v tradičně vyráběných produktech v jižní Evropě (Portugalsko, Španělsko, Itálie, Řecko), kde je výchozí surovinou syrové nebo pasterované kozí, ovčí, buvolí nebo kravské mléko. Vysoké hodnoty počtu enterokoků obvykle vyplývají z nedostatečných hygienických podmínek během výroby těchto sýrů. Enterokoky jsou navíc odolné i vůči teplotám pasterace a vysokým koncentracím solí (Franz et al., 2003; Ogier a Serror, 2008). Enterokoky se vyznačují proteolytickou a lipolytickou aktivitou, rozkládají citrát a významně se tak mohou podílet na zrání sýrů a vytváření aroma (Foulquié-Moreno et al., 2006). Některé enterokoky jsou navíc považovány za producenty bakteriocinů, jež mohou inhibovat
řadu patogenních mikroorganizmů, jako Bacillus cereus, Clostridium spp., Listeria monocytogenes nebo Staphylococcus aureus (Franz et al., 2007). Vedle bifidobakterií a laktobacilů se enterokoky (hlavně E. faecium) uplatňují také jako probiotika (Narayan et al., 2010; Wilson Graz et al., 2010). Použití enterokoků jako startovacích kultur je však nutno zvážit nejen z hlediska produkce toxických biogenních aminů, ale především z hlediska jejich podmíněné patogenity. Virulence enterokoků byla zjištěna u některých kmenů izolovaných z potravin, obecně jsou ale eneterokoky považovány za významné nemocniční patogeny způsobující infekce močových cest, žlučových cest, infekce ran nebo endokarditidy. Nebezpečí enterokokových infekcí spočívá i v rezistenci enterokoků na řadu antibiotik (cefalosporiny I., II. i III. generace, tetracyklin, erytromycin, ciprofloxacin), stoupá i rezistence na vankomycin (Valenzuela et al., 2009).
35
Čeleď Enterobacteriaceae Bakterie čeledi Enterobacteriaceae se vyznačují vysokou dekarboxylázovou aktivitou, zejména pokud jde o produkci kadaverinu a putrescinu. Vysoké koncentrace diaminů jsou tak ukazatelem kontaminace enterobakteriemi. V mléce a sýrech byla identifikována řada kmenů těchto bakterií, jako je Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloaceae, Serratia spp., Citrobacter freundii nebo Proteus, schopných produkovat KAD a PUT ve vysoké míře. U některých kmenů enterobakterií byla prokázána i histidin-dekarboxylázová aktivita. Schopnost produkce HIS mají např. kmeny Enterobacter cloaceae, Enterobakter aerogenes, Hafnia alvei, Escherichia coli, Klebsiaella oxytoca a Morganella morganii (Roig-Sagués et al., 2002; Greifová et al., 2003; Suzzi a Gardini, 2003). Vysoké hladiny PUT jako důsledek kontaminace enterobakteriemi jsou časté u tradičních jihoevropských sýrů, které se obvykle vyrábějí z nepasterovaného mléka za nedostatečných hygienických podmínek (Galgano et al., 2001; Martuscelli et al., 2005). Enterobakterie jsou značně termolabilní a také podmínky během zrání sýrů nepředstavují vhodné prostředí pro jejich růst a aktivitu. Při nedostatečném tepelném ošetření mléka nebo masivní kontaminaci během výroby však může dojít k uvolnění dekarboxyláz již v počátečních fázích a následné tvorbě BA i v nepřítomnosti mikroorganizmů (Fontecha et al., 1990; Roig-Sagués et al., 2002).
Ostatní mikroorganizmy V mléce a sýrech se může nacházet řada dalších mikroorganizmů schopných ve větší či menší míře produkovat BA. Jedná se především o kontaminující mikroflóru, jejíž výskyt je úzce spjat se stupněm hygieny celého výrobního procesu. Schopnost produkovat KAD a PUT byla zjištěna u gramnegativních bakterií rodu Pseudomonas fluorescens a P. aeruginosa, s tvorbou diaminů jsou spojovány také vysoké počty mikrokoků (Petridis, Steinhart, 1996; Innocente a D´Agostin, 2002). Rodríguez-Jerez et al. (1994) popsali produkci histaminu bakteriemi rodu Bacillus macerans v italských dlouhozrajících sýrech. Dekaboxylázovou aktivitu mají i některé sporulující mikroorganismy, bakterie rodu Clostridium perfringens byly např. schopny tvořit histamin (Stratton et al., 1991). Poměrně málo studií se dosud zabývalo kvasinkami či plísněmi coby producenty BA v sýrech. Roig-Sagués et al. (2002) zjistili přítomnost histidin-dekarboxylázy u kvasinek rodu Geotrichum candidum. Tyto kvasinky jsou běžnou součástí startovacích 36
kultur při výrobě měkkých sýrů typu Camembert nebo polotvrdých sýrů z ovčího a kozího mléka (Boutrou a Guéguen, 2005). Podle tvrzení jiných autorů (Tornadijo et al., 1998) však přídavek těchto kvasinek vliv na tvorbu BA nemá. Gardini et al. (2006) sledovali schopnost produkce biogenních aminů kvasinkami vyskytujícími se ve vysokých počtech během zrání typických jihoitalských ovčích sýrů Pecorino Crotonese. Významnými producenty FEA, TYR a KAD byly kmeny Sacharomyces cerevisiaea a Yarrowia lipolytica, žádný z nich ale neprodukoval HIS. Kvasinky rodu Debaryomyces hansenii byly oproti tomu schopny tvořit pouze HIS, a to ve vysokých koncentracích.
2.8.3 Startovací kultury Jako startovací kultury se označují mikroorganizmy, jejichž metabolické činnosti se využívá k výrobě řady potravinářských výrobků. Tyto mikroorganizmy se svojí činností výrazně podílí na konzistenci, chuti i vůni fermentovaných mléčných výrobků. Základními požadavky na startovací kultury jsou (Klaenhammaer et al., 2002; Lukášová, 2004): •
produkce kyseliny mléčné,
•
vznik senzoricky významných složek (diacetyl, acetaldehyd, volné těkavé mastné kyseliny),
•
hydrolýza bílkovin a tuků,
•
produkce biologicky významných složek (bakteriociny),
•
potlačování patogenních a technologicky nežádoucích mikroorganismů.
Kromě výše uvedených metabolických produktů mohou činností bakterií startovacích kultur vznikat i nežádoucí toxické látky jako jsou biogenní aminy. Startovací kultury mohou ke zvýšeným koncentracím BA přispívat
buď přímou
dekarboxylací aminokyselin, nebo častěji nepřímo, ovlivněním pH a proteolýzou s následným zvýšením nabídky volných aminokyselin pro ostatní dekarboxylující mikroorganizmy (Fernández-García et al., 2000). Při použití kultur s vysokou dekarboxylázovou a proteolytickou aktivitou tak může docházet k výrazné produkci BA a jejich následné kumulaci, především v dlouhozrajících sýrech. Výběr vhodné startovací kultury je proto jedním z důležitých preventivních opatření tvorby BA.
37
Nejčastěji používanými startovacími kulturami v technologii sýrů jsou BMK, především bakterie rodu Lactobacillus a Lactococcus, v menší míře Leuconostoc, Streptococcus a Enterococcus (Smith et al., 2005; Grattepanche et al., 2008). Při výrobě plísňových sýrů a sýrů s mazem na povrchu se využívají také plísně a kvasinky rodů Penicillium, Geotrichum a Candida. Vlivem startovacích kultur na vznik BA nebo potlačení jejich tvorby se ve svých pracích zabývala řada autorů. Novella-Rodríguez et al. (2002) testovali potenciální dekarboxylázovou aktivitu dvou různých běžně používaných kultur - Lactococcus lactis subsp. lactis plus L. lactis subsp. cremoris. resp. L. lactis subsp. lactis - při výrobě zrajícího kozího sýra. U žádné z kultur nebyla prokázána schopnost produkovat biogenní aminy. K obdobným výsledkům dospěli i Fernández-García et al. (2000). Tito autoři sledovali vliv rozdílných hladin (0,1 % a 1 %) naočkovaných startovacích kultur Lactococcus lactis subsp. lactis a L. lactis subsp. cremoris na tvorbu BA v polotvrdých španělských sýrech. Ve vzorcích byl detekován TYR, HIS, TRP a FEA, jejich vznik však nebyl ovlivněn použitou startovací kulturou. Hladiny BA u sýrů s 0,1% i 1% startovací kulturou byly srovnatelné i po 90 dnech zrání. Rovněž podle dalších autorů (Martuscelli et al., 2005; Elsanhoty et al., 2009, Buňková et al, 2010) netvoří tyto startovací kultury v sýrech takové množství dekarboxyláz, aby byly schopné produkce BA. Přestože různá dekarboxylázová aktivita byla jinými autory popsána i u některých rodů startovacích kultur, obecně platí, že přítomnost BA v sýrech je dána více činností nestartovacích BMK a ostatních dekarboxylujících mikroorganizmů, než přidanými startovacími kulturami. Použití startovacích kultur může vést i k potlačení tvorby BA. Řada druhů je schopna produkovat antimikrobní látky jako jsou organické kyseliny, peroxid vodíku nebo tzv. bakteriociny a inhibovat tak nežádoucí mikroorganizmy podílející se na vzniku BA. Bakteriociny produkují převážně enterokoky (tzv. enterociny) a laktobacily (tzv. nisin), při použití těchto kultur je však nezbytné volit takové složení, aby nedošlo k negativnímu vlivu na růst a aktivitu ostatních kmenů startovací kultury (Ivanova a Iliev, 2009; Grattepanche et al., 2008).
38
2.8.4 Fyzikálně-chemické faktory Řada faktorů, jako je pH, teplota, koncentrace NaCl, vodní aktivita, přítomnost kyslíku, mají vliv na růst a aktivitu mikroorganizmů a mohou tak ovlivňovat i produkci biogenních aminů v sýrech.
pH Hodnoty pH jsou klíčovým faktorem ovlivňujícím aktivitu amino-dekarboxyláz. pH
čerstvých sýrů krátce po vysolení se v závislosti na typu sýra pohybuje mezi 4,8 (Romadur, Limburg) – 5,3 (Gouda, Eidam; Spreer, 1998). Na počátku fermentace produkují startovací kultury značné množství kyseliny mléčné, což vede ke snížení hladin pH . Během zrání sýrů se v důsledku bazických produktů proteolýzy hodnoty pH opět mírně zvyšují (Fernández-García et al., 2000 Novella-Rodríguez et al., 2004a, b). U tavených egyptských sýrů zjistil El Sayed (1996) průměrnou hodnotu pH 5,4; podobné hodnoty pH (5,0 – 6,0) naměřili Kung et al. (2004) v taiwanských tavených sýrech.
Řada současných i dřívějších autorů (Joosten, Northolt, 1989; Cotter a Hill, 2003; Baker-Austin a Dopson, 2007; Fernández et al., 2007; Lucas et al., 2007; Shukla et al., 2010) se shoduje na tom, že optimální pH pro činnost bakteriálních dekarboxyláz se nachází v kyselé oblasti, v rozmezí 4,0 – 5,5. Podle dalších autorů (Arena, de Nadra, 2001; Pereira et al., 2009), kteří tuto teorii potvrzují, je produkce biogenních aminů, jež jsou bazičtější než samotné aminokyseliny, fyziologickým obranným mechanizmem bakterií proti kyselému prostředí. Na základě těchto závěrů lze předpokládat, že celá doba zrání sýrů představuje z hlediska pH ideální podmínky pro činnost dekarboxylujících enzymů s následnou produkcí BA. Na druhé straně může nízké pH inhibovat růst řady bakterií citlivých na kyselé prostředí, jako jsou např. enterobakterie. Enterobacter aerogenes, jenž patří mezi významné producenty KAD a PUT, je např. schopný přežívat pouze v prostředí o pH vyšším než 4,2 (Greif et al., 1999). Bylo zjištěno, že produkci aminů ovlivňuje daleko více růstová schopnost bakterií než vlastní podmínky růstu. Vyšší hodnoty pH jsou pravděpodobně příznivé pro vývoj bakterií vybavených enzymy zodpovědnými za dekarboxylaci aminokyselin (González-Fernández et al., 2003, Greifová et al. 2003). Maijala (1994) zjistil, že snížením pH růstového média došlo k výraznému snížení počtu dekarboxyláza-pozitivních laktobacilů a následnému poklesu produkce BA. Obdobné výsledky publikovali Gardini et al. (2001). Ve své práci se zabývali vlivem 39
pH na tvorbu BA enterokoky v odstředěném mléce. Produkce biogenních aminů se prokazatelně snižovala se snižujícím se pH. Také Sagun et al. (2005) se domnívají, že relativně nízké koncentrace histaminu v bylinkových tureckých sýrech byly způsobeny nízkým pH během celého zrání.
Chlorid sodný Přídavek NaCl se běžně používá při výrobě mléčných výrobků včetně sýrů. Solení má vliv na výslednou chuť sýra, ovlivňuje aktivitu kultur a enzymů při zrání sýrů, reguluje obsah vody v těstě sýra a zpevňuje povrch sýra. Obsah NaCl v sýrech se obvykle pohybuje mezi 0,5 – 2%. U plísňových sýrů (např. Roquefort, Gorgonzola, Camembert, Cabrales) nebo bílých sýrů v solném nálevu (např. Feta, balkánský sýr) jsou obsahy soli vyšší, pohybují se mezi 3 – 7%. V závislosti na koncentraci NaCl však může dojít ke zhoršení růstu řady bakterií s následným snížením tvorby BA. Greifová et al. (2003) zjistili, že koncentrace NaCl v rozmezí 1,0 % - 1,3 % měla příznivý vliv na růst E. faecalis i E. faecium, tyto hodnoty dokonce odpovídaly nejvyšší specifické rychlosti růstu enterokoků. Se zvyšující se koncentrací NaCl růstová rychlost postupně klesala. Obdobné výsledky obdrželi Joosten (1988), Sumner et al. (1990), Beutling (1996) a Gardini et al. (2001). Obsahy NaCl nad 5% značně redukovaly možnost vzniku BA. Produkcí BA kmeny Lactobacillus bulgaricus v prostředí NaCl se zabývali Chander et al. (1989). Zjistili, že hladiny BA se prokazatelně snižovaly se zvyšující se koncentrací solí (0 % - 6 %). Sumner et al. (1990) vysvětlují tento negativní vliv vysokých koncentrací NaCl jednak inhibicí bakteriálního růstu s následným snížením počtu buněk, ale i porušením membrán, v nichž jsou mikrobiální dekarboxylační enzymy uloženy. U některých druhů halotolerantních mikroorganizmů však může docházet k produkci BA (především TYR a HIS) i v prostředí s vysokým obsahem NaCl. Produkce HIS a TYR má na tyto druhy bakterií osmoprotektivní účinek a se zvyšující se koncentrací
NaCl
v substrátu
rostou
v
důsledku
aktivace
tyrosin-
a/nebo
histidindekarboxylázy i obsahy příslušných biogenních aminů (Silla-Santos, 1996). Autoři Tsai et al. (2006a) zjistili významnou produkci HIS halotolerantními kmeny Staphylocuccus capitis v typických čínských fermentovaných sojových produktech i při koncetraci NaCl 10 %.
40
Teplota Teplota během zrání a skladování sýrů je důležitý faktor ovlivňující růst a aktivitu mikroorganizmů, stejně jako činnost jejich proteolytických a dekarboxylačních enzymů. Většina mikroorganizmů produkujících BA v sýrech patří do skupiny mezofilů. Ideální růstové podmínky tak pro ně představují teploty nad 20 °C, s optimem kolem 35 °C. Se stoupající teplotou se značně urychluje růstová kinetika dekarboxylázapozitivních bakterií a jejich vysoké počty mohou být následně příčinou vzniku významných hladin BA (Gardini et al., 2001; Greifová et al., 2003). Vyšší teploty jsou rovněž nezbytné pro aktivitu
samotných
dekarboxyláz.
Bylo
zjištěno,
že
histidin-,
tyrosin-
i
lysindekarboxyláza vyžadují pro svoji činnost teplotu nad 15 °C (s optimem kolem 30 °C). Při teplotách nižších než 15 °C si tyrosindekarboxyláza může část své aktivity zachovat, produkce TYR je však velmi nízká. Při teplotách pod 10°C byla tyrosindekarboxyláza zcela inaktivována (Beutling, 1996, Greifová, 2003). Teploty používané během zrání sýrů se v závislosti na druhu sýra pohybují mezi 6 °C – 23 °C, obvykle však nepřesahují 15 °C. Riziko vzniku BA je především u sýrů švýcarského typu, neboť v kvasném sklepě zrají při teplotě 23 °C. Podle řady autorů zabývajících se vlivem teploty zrání/skladování na tvorbu BA v sýrech (Beutling, 1996; Gardini et al., 2001; Greifová et al., 2003, Andie et al., 2010, Buňková et al, 2010) teplota významně ovlivňuje produkci BA, a to tak, že s rostoucí teplotou a dobou zrání/skladování rostou i koncentrace aminů. Pinho et al. (2001) sledovali tvorbu BA během skladování zrajícího sýru Azeitaõ při dvou různých teplotách (4 °C a 25 °C). Sýry uchovávané při 4 °C obsahovaly podstatně nižší hladiny volných aminokyselin (valin, leucin) i BA (TYR, PUT a HIS), než sýry skladované při pokojové teplotě. Jakmile došlo ke zvýšení teploty ze 4 °C na 25 °C, obsah BA vzrostl až o 35 %. K obdobným výsledkům dospěli i Standarová et al. (2010), a to v případě Olomouckých tvarůžků skladovaných při 5 °C a 20 °C. Rovněž tito autoři zjistili sedmý týden skladování trojnásobně vyšší hladiny sumy BA u vzorků uchovávaných při vyšší teplotě. Podle posledně jmenovaných autorů tak mohou hladiny zmíněných aminokyselin a biogenních aminů sloužit jako indikátory teplotních změn u zrajících sýrů. Na základě výše uvedených tvrzení lze konstatovat, že dodržováním nízkých teplot během skladování sýrů (období od procesu výroby přes distribuci až po konečného zákazníka) lze významně předejít tvorbě biogenních aminů.
41
2.8.5 Část sýra Distribuce biogenních aminů v jednotlivých částech sýra může být ovlivněna řadou faktorů jako je druh sýra, průměr sýra, přítomnost vhodné mikroflóry nebo podmínky během zrání. Údaje týkající se obsahu BA v různých částech sýra jsou v literatuře značně rozporuplné. Novella-Rodríguez et al. (2003) zjistili vyšší hladiny tyraminu (ale naopak nižší hladiny tryptaminu) ve středové části tvrdého zrajícího kozího sýra, než v částech okrajových. Rozdíly v distribuci TYR a TRP autoři nedokázali vysvětlit, nicméně se domnívají, že velkou roli hrají rozdílné mikroklimatické podmínky (vodní aktivita, koncentrace NaCl) vně a uvnitř sýra (především u sýrů s velkým průměrem) a rozdílné požadavky producentů TYR a TRP na kyslík. Také Standarová et al. (2009b) uvedli, že obsahy BA byly vyšší ve středových částech sýra Niva v porovnání s okrajem. Zcela odlišné výsledky však publikují Petridis a Steinhart (1996). Ve své práci uvádí, že koncentrace histaminu i tyraminu v sýrech švýcarského typu se zvyšovala od středu k okraji, hladiny obou aminů v okrajové vrstvě byly prokazatelně vyšší, než v ostatních částech sýra. Vzhledem k tomu, že se jednalo o sýry zrající pod kůrou, kde je předpoklad nízké vodní aktivity v povrchových vrstvách, jsou tyto výsledky překvapivé. Vyšší hladiny BA v okrajových vrstvách sýra autoři vysvětlují vhodnými růstovými podmínkami pro aerobní a aerotolerantní mikroorganizmy (enterokoky, koliformní bakterie). Rovněž Komprda et al. (2008b) naměřili vyšší obsahy BA v okrajových částech zrajících sýrů eidamského typu. Zjištěné koncentrační rozdíly vysvětlují posledně jmenovaní autoři masivnější kontaminací povrchových vrstev enterokoky během výroby sýrů, ale i specifickými podmínkami vně a uvnitř sýra umožňující růst a činnost bakteriálních kmenů s dekarboxylázovou aktivitou. Výrazně vyšší hladiny kadaverinu v povrchových vrstvách sýru Camembert oproti obsahům ve střední části zjistili také Engel et al. (2005). Standarová et al. (2009a) uvádí prokazatelně vyšší koncentrace kadaverinu v povrchových vrstvách různých vzorků sýrů s bílou plísní na povrchu. Jelikož hladiny ostatních biogenních aminů zde byly kromě putrescinu poměrně nízké a rozdíly v obsahu kadaverinu se značně lišily i mezi jednotlivými šaržemi, přisuzují autoři tyto výsledky také mikrobiální kontaminaci.
42
3 Cíl práce
Cílem předkládané práce bylo: -
sledovat obsah biogenních aminů (tyraminu, histaminu, fenylethylaminu, kadaverinu, tryptaminu) a polyaminů (putrescinu, sperminu a spermidinu) ve vzorcích polotvrdého zrajícího sýra eidamského typu a taveného sýra
-
posoudit vliv doby zrání, části sýra, výrobce a použité startovací kultury na obsah uvedených aminů ve vzorcích sýra eidamského typu
-
posoudit vliv tepelné úpravy (pasterace, resp. sterilace), teploty skladování (8 °C, resp. 25 °C) a doby skladování (22, resp. 57 týdnů) na obsah uvedených aminů ve vzorcích taveného sýra
-
provést toxikologické zhodnocení analyzovaných vzorků zrajícího i taveného sýra z hlediska obsahu biogenních aminů a polyaminů.
43
4 Materiál a metodika
4.1 Materiál Biogenní aminy a počty mikroorganizmů byly stanovovány v přírodních zrajících polotvrdých sýrech holandského typu (Eidam) a v tavených sýrech. V obou případech se jednalo o sýry vyrobené z pasterovaného mléka.
4.1.1 Přírodní zrající sýry Přírodní zrající sýry byly odebírány od dvou různých výrobců. Vzájemně se lišily obsahem tuku v sušině (30 a 45 %) a byly označeny jako R30 (obsah tuku 30 %; výrobce 1) a R45 (obsah tuku 45 %; výrobce 2). Kromě obsahu tuku (ČSN ISO 1735) byl ve vzorcích rovněž zjišťován celkový obsah sušiny (dle ČSN ISO 5534). R30 sýry byly vyrobeny ve dvou šaržích obsahujících rozdílné startovací kultury (označeny jako R30-CH a R30-FD), R45 sýry pouze v jedné šarži s jedním typem startovací kultury (tabulka 3). Všechny tři použité startovací kultury obsahovaly stejné bakteriální kmeny Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, lišily se ale množstevním poměrem příslušných kmenů. Přesný poměr bakteriálních kmenů ve startovacích kulturách byl součástí obchodního tajemství jednotlivých producentů. Mikrobiální kultury byly u všech tří typů sýra dávkovány ve stejném množství. Pro zaočkování 500 l provozního zákysu bylo použito 10 g lyofilizované kultury a na 48 000 l mléka pro výrobu sýrů bylo následně přidáno 25 l provozního zákysu. Sýry byly lisovány do bloků klasické cihly o délce 25 cm a baleny do polyetylénových obalů. Byly umístěny do zracího sklepa, kde zrály pod fólií při teplotě 10 – 12 °C, při blíže neurčené relativní vlhkosti vzduchu. Jednotlivé odběry vzorků sýra byly podřízeny požadavkům a výrobnímu plánu obou výrobců. Z každé várky sýra (tabulka 2) bylo odebráno 15 bloků. Z tohoto počtu byly odebírány vždy tři bloky po 4, 8, 18, 22 a 26 týdnech zrání (obě šarže sýru R30), respektive po 4, 8, 14, 18 a 22 týdnech (sýr R45). Příslušný blok sýra byl vždy příčně rozříznut a z tohoto dílu bylo odebráno 200 g střední části a 200 g okrajové části (odebrány byly vždy 2 cm okraje; v případě obou várek sýra R30), u sýra R45 bylo na
44
žádost výrobce odebíráno pouze 200 g střední části. Vzorky pro mikrobiologické, chemické (stanovení BA) a ostatní (stanovení celkového obsahu sušiny, stanovení obsahu tuku) analýzy byly vždy odebírány ze stejné části 200 gramového řezu sýra. Mikrobiologický rozbor byl proveden ihned po převozu vzorků (při chladírenské teplotě) od výrobce do laboratoře. Pro analýzu biogenních aminů bylo 100 g sýra homogenizováno v mixéru Moulinex (Moulinex, SEB Česká republika, Praha) a poté skladováno ve skleněných tmavých prachovnicích při teplotě –18 °C až do doby vlastní analýzy.
Tabulka 3. Charakteristika analyzovaných vzorků přírodních zrajících sýrů Výrobce
Označení vzorku
Obsah tuku v sušině (%)
Obsah sušiny1) (%)
Obsah tuku2) (%)
Startovací kultura
R30-FD
32,5
50,8
16,5
Flora Danica Normal3)
R30-CH
30,7
51,5
15,8
CH-N-113)
R45
45,4
57,3
26,0
Probat 5054)
Výrobce 1
Výrobce 2 1)
stanoveno v naší laboratoři podle české normy ČSN ISO 1735
2)
stanoveno v naší laboratoři podle české normy ČSN ISO 5534
3)
Chr. Hansen (Nienburg/Weser, Německo)
4)
Danisco (Copenhagen, Dánsko)
Část sýra okraj střed okraj střed střed
4.1.2 Tavené sýry Analyzované tavené sýry byly vyrobeny pro vojenské účely s hlavním požadavkem dlouhodobé údržnosti (minimální trvanlivost je stanovena na 26 měsíců při pokojové teplotě). Vzorky sýra dodané do naší laboratoře pocházely dle údajů dodavatele z jedné šarže vyrobené ze stejných vstupních surovin – Eidamská cihla (45% tuku v sušině), Moravský bochník, máslo, tvaroh, pitná voda a tavící soli. Směs surovin byla za stálého míchání zpracovávána při teplotě 85 °C za mírného podtlaku po dobu 10 minut. Homogenní tavenina byla plněna do laminovaných hliníkových obalů o obsahu 200 gramů s přivařitelným víčkem. Po naplnění byly tavené sýry rozděleny na dvě části. První část byla během 2 hodin zchlazena na teplotu 10 °C, tyto sýry byly označeny jako pasterované tavené sýry - P. Druhá část vzorků byla umístěna do laboratorního
45
autoklávu (Labo Autocale Sanyo, model MLS 3780) a sterilována při teplotě 117 °C pod tlakem 0,25 MPa po dobu 20 minut a následně zchlazena. Tyto vzorky byly označeny jako sterilované tavené sýry - S. Sterilace ihned po výrobě byla zvolena jako jediný možný způsob ošetření tavených sýrů, kterým lze dosáhnout výše uvedené minimální trvanlivosti. Jak pasterované, tak sterilované sýry byly následně skladovány po dobu 22 nebo 57 týdnů. Pasterované sýry byly uchovávány při teplotě 8 °C, sterilované sýry při teplotě 8 °C nebo 25 °C (tabulka 4). Mikrobiologický rozbor i analýza biogenních aminů probíhaly ihned po převozu vzorků tavených sýrů od dodavatele do naší laboratoře.
Tabulka 4. Charakteristika analyzovaných vzorků taveného sýra Označení vzorku S1 S2 S3 P1 P2
n 2 4 4 2 4
Tepelné ošetření sterilace pasterace
Teplota skladování (ºC) 8 8 25 8 8
Doba skladování (týdny) 22 57 57 22 57
n – počet testovaných vzorků; každý vzorek byl testován ve dvojím opakování
4.2 Analýza biogenních aminů Zmrazené vzorky byly přes noc rozmraženy (tavené sýry byly analyzovány ihned po odběru bez předchozího zamražení), 10 g (± 1 mg) bylo naváženo do 85 ml tub, bylo přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1,7-diaminoheptan o koncentraci 1 mg ml-1) a vzorek byl extrahován po dobu 2 minut 20 ml 0,1M kyseliny chlorovodíkové (HCl). K extrakci byl použit přístroj Heidolph Diax 900 (Německo). Suspenze byla odstředěna při 760g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C (Hettich Universal 32R, Německo). Supernatant byl přefiltrován přes papírový filtr (velikost pórů 0,40 µm) a pevný podíl byl znovu extrahován výše uvedeným postupem. Získané extrakty byly smíchány v 50 ml odměrné baňce, doplněny po rysku deionizovanou vodou a objem potřebný pro analýzu byl přefiltrován přes nylonový filtr (13 mm, 0,45 µm, Chromatography Research Supplies, Addison, USA).
46
Pro porovnání účinnosti extrakce byla jako paralelní extrakční činidlo použita kyselina chlorovodíková v koncentraci 5 % v množství 15 ml. Postup extrakce byl stejný jako v případě HCl. Alikvotní objem každého extraktu byl derivatizován dansylchloridem (5dimethylaminonaftalen-1-sulfonyl chlorid, DCL). Derivarizační
činidlo
bylo
připraveno rozpuštěním 5 mg dansyl chloridu v 1 ml 2-propanonu (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA). Derivatizace byla provedena postupem, který popsali Eerola et al. (1993). 1 ml extraktu (nebo standardu) byl smíchán s 0,5 ml nasyceného roztoku Na2CO3 (pH bylo upraveno na 11,2), ke směsi byl přidán 1 ml derivatizačního činidla (Sigma-Aldrich, Německo) a výsledná směs byla 1 minutu míchána (MS2 Minishaker IKA Werke, Německo). Derivatizační proces probíhal 1 hodinu ve tmě při 40 °C. Po derivatizaci byl odstraněn přebytek derivatizačního činidla přidáním 250 µl amoniaku. Po 30ti minutách byly hydrofóbní deriváty aminů vyextrahovány diethyletherem (3 x 1 ml). Organická fáze byla vysušena dusíkem do sucha a pevný zbytek rozpuštěn v 0,5 ml (standard v 1 ml) acetonitrilu. Roztok byl přefiltrován přes nylonový filtr 0,45 µm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Stabilita DCL derivátů standardu při snížené (5 ºC) i pokojové teplotě byla ověřena po 24 hodinách skladování. Za tuto dobu nedošlo k žádným kvalitativním ani kvantitativním změnám, vzorky tak byly z důvodu velkého množství dávkovány pomocí automatického dávkovače. Pro separaci biogenních aminů byl použit kapalinový chromatograf HP 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) skládající se z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového odplyňovače (G1322A), automatického dávkovače (G1313A), UV/VIS detektoru s proměnlivou vlnovou délkou (G1314A) a fluorescenčního detektoru (G1321A). DCL deriváty aminů byly separovány na koloně Zorbax Eclipse XDB C18 s reverzní fází (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 µm) s předkolonkou Meta Guard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 µm) gradientovou elucí. Mobilní fáze obsahovala H2O a acetonitril, eluční program je uveden v tabulce 5. Průtok byl 0,8 ml min-1 a analýzy probíhaly při pokojové teplotě. K detekci byl použit fotometrický UV/VIS detektor, signál byl snímán při vlnové délce 254 nm.
47
Tabulka 5. Eluční program separace DCl derivátů biogenních aminů
Čas (min) 0 1 10 12 16 23
H2O (%) 35 35 20 10 0 0
ACN (%) 65 65 80 90 100 100
ACN - acetonitril
S ohledem na několik kroků přípravy vzorku byla pro kvantitativní vyhodnocení obsahu aminů zvolena metoda vnitřního standardu. Vnitřní standard vyrovnává odchylky vzniklé nejen během úpravy vzorků a derivatizace, ale také odchylky v nástřikovém objemu a retenčním čase během LC analýzy (Eerola et al., 1993). Koncentrace jednotlivých aminů byla vypočítána podle následujícího vzorce: cx = cIS x Ax/AIS x RFx kde: cIS - koncetrace vnitřního standardu (mg kg-1) Ax - plocha píku biogenního aminu (v jednotkách plochy) AIS - plocha píku vnitřního standardu (v jednotkách plochy) RFx - faktor odezvy aminu: RFx = AISr/Axr x cxr/cISr kde: AISr - plocha píku vnitřního standardu v referenčním vzorku (v jednotkách plochy Axr - plocha píku biogenního aminu v referenčním vzorku (v jednotkách plochy) cxr - koncentrace biogenního aminu v referenčním vzorku (mg kg-1) cIsr - koncentrace vnitřního standardu přidaného k referenčnímu vzorku (mg kg-1). Identifikace separovaných aminů (HIS, TYR, TRY, PUT, FEA, KAD, SPM, SPD) byla provedena srovnáním retenčních časů jednotlivých aminů se standardy (standardy aminů byly ve formě hydrochloridů; Sigma-Aldrich, Německo) a jejich koncentrace po derivatizaci byla vyjádřena v mg kg-1 čerstvé hmoty sýra. Opakovatelnost celého analytického procesu (vyjádřena jako relativní standardní odchylka v %) byla ověřena 10ti-násobným nástřikem derivatizované směsi standardů biogenních aminů (pro instrument) a 5ti-násobným nástřikem extraktu vybraného
48
vzorku sýra s nízkým obsahem BA (sýr R30, 4. týden zrání), rovněž po derivatizaci (pro metodu). Výtěžnost metody byla stanovena přidáním směsi biogenních aminů ve dvou koncentračních hladinách (1 a 2 mg kg-1) ke skutečnému vzorku sýra. Nástřik byl proveden 5krát pro každou koncentraci, výtěžnost byla vypočítána porovnáním s reálným vzorkem bez přidaného standardu podle následujícího vzorce: %RU = [(CF – CU)/CA] x 100 kde: CU
- koncentrace v neobohaceném vzorku (mg kg-1)
CF - koncentrace přidaného analytu (mg kg-1) CA
- koncentrace v obohaceném vzorku (mg kg-1).
Získané hodnoty výtěžnosti však nebyly při konečném výpočtu koncentrace jednotlivých biogenních aminů ve vzorcích zohledněny.
4.3 Mikrobiologický rozbor Mikrobiologická analýza byla provedena ve spolupráci s Ústavem půdoznalství a mikrobiologie Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Mikrobiální profil hraje významnou roli při tvorbě BA. Z tohoto důvodu je zde v krátkosti uvedena i metodika mikrobiologického rozboru, přestože vlastní analýza nebyla předmětem předkládané dizertační práce. Z každého vzorku sýra bylo asepticky odebráno 20 g, homogenizováno se 180 ml destilované vody a podle potřeby byla připravena řada decimálních ředění. Byl stanoven celkový počet mikroorganizmů (CPM) na masopeptonovém agaru (MPA; Imuna, Slovenská republika) po 72 hodinách inkubace při 29 °C; počet bakterií mléčného kvašení (BMK) na De Man-Rogosa-Sharpe mediu (MRS; Biokar Diagnostics, Francie) po 72 hodinách při 37 °C; celkový počet anaerobů na MPA po 120 hodinách při 29 °C; kvasinky + plísně na agaru s glukózou, kvasničným extraktem a chloramfenikolem po 120 hodinách při 25 °C. Dekarboxylázová aktivita startovacích kultur jako celku, respektive jednotlivých izolovaných kmenů, které byly složkami uvedených startovacích kultur, byla posouzena dvěma metodami. Při aplikaci obou metod byl nejprve 1 g kultury (nebo suspenze příslušného kmene jako složky dané kultury) naočkován do 99 ml fyziologického
49
roztoku. Po 24 hodinách bylo 0,3 ml směsi přeočkováno do zkumavky obsahující příslušné dekarboxylační médium: •
metoda 1 - 0,5 g peptonu, 0,3 g kvasničného extraktu, 1 ml bromkresolpurpuru (BKP; 2 % v 50 % ethanolu), 1 g jednotlivých L-aminokyselin a 100 ml destilované vody;
•
metoda 2 - 0,5 g peptonu, 0,3 g kvasničného extraktu, 0,3 g glukózy, 1 g acetátu sodného, 0,1 ml Tween 80, 0,5 ml roztoku soli A (10 g K2HPO4 + 10 g KH2PO4 + 100 ml destilované vody), 0,5 ml roztoku soli B (11,5 g MgSO4.7H2O + 2,4 g MnSO4.4H2O + 0,68 g FeSO4.7H2O + 100 ml destilované vody), 1 ml BCP, 1 g L-aminokyseliny a 100 ml destilované vody).
Směs byla přelita sterilním parafinovým olejem. Pokud se médium zbarvilo fialově po 1, 4, resp. 24 hodinách při 37 °C (metoda 1) nebo po 1, 6, resp. 10 dnech při stejné teplotě (metoda 2), bylo posouzeno jako pozitivní, pokud se zbarvilo žlutě, bylo posouzeno jako negativní. I když je tato metoda používána pouze pro kvalitativní hodnocení, bylo možné rozlišit tři stupně intenzity zabarvení. V první metodě byl použit jako kontrolní druh pro pozitivní reakci Plesiomonas shigeloides CCM 1991 a pro negativní reakci Alcaligenes faecalis CCM 1052, v druhé metodě byl použit jako pozitivní kontrolní druh Lactobacillus brevis CCM 1815 a jako negativní kontrolní druh Lactobacillus rhamnosus CCM 1828.
4.4. Statistické vyhodnocení Stanovení biogenních aminů i počtu mikroorganizmů bylo prováděno duplicitně v okrajových i středových částech všech bloků sýra i ve všech vzorcích tavených sýrů. Pro veškerá statistická vyhodnocení byl použit program Unistat, verze 4.53 (Unistat Ltd., Londýn, Anglie) a program Statistica Cz, verze 9 (StatSoft CR s.r.o.). Byly vypočteny základní statistické charakteristiky a provedena regresní analýza (včetně testování průkaznosti lineárního, resp. kvadratického členu). Pro sledování statisticky významných rozdílů obsahu BA a počtu mikroorganizmů mezi okrajem a středem R30 sýrů a mezi jednotlivými výrobci (R30 a R45 sýry) byla použita jednofaktorová analýza rozptylu včetně následného testování pomocí Duncanova testu. Těsnost vztahů mezi obsahy biogenních aminů a počty mikroorganizmů byla vyjádřena korelačními koeficienty. Z důvodu nutnosti respektovat provozní podmínky a
50
požadavky výrobců zrajících přírodních sýrů, nebylo možné pro oba výrobce dohromady zobecnit, jakým podílem se na celkové, resp. vysvětlené variabilitě obsahu BA nebo počtu mikroorganizmů podílely jednotlivé testované faktory (doba zrání, část sýra, výrobce, startovací kultura). Vícefaktorová analýza rozptylu tak byla použita pouze pro porovnávání vlivu startovací kultury, části sýra a doby zrání u sýra R30.
51
5 Výsledky a diskuze
5.1 Analytická metoda Zjištěné hodnoty charakterizující opakovatelnost chromatografického systému (instrumentu), opakovatelnost vlastní metody a výtěžnost biogenních aminů jsou uvedeny v tabulce 6.
Tabulka 6. Opakovatelnost (vyjádřena jako relativní standardní odchylka, RSD) analytického procesu a výtěžnost metody pro stanovení biogenních aminů v sýrech Výtěžnost3 (%) Biogenní amin Tryptamin 2-Fenylethylamin Histamin Tyramin Putrescin Kadaverin Spermidin Spermin
Instrument¹ (RSD, %) 0,3 0,4 0,3 1,6 0,3 0,3 0,3 0,2
2
Metoda (RSD, %) ND 6,8 5,8 5,0 3,0 2,9 1,8 5,4
1 mg kg-1
2 mg kg-1
75,1 78,4 115,4 59,8 65,1 74,6 63,3 66,6
94,9 90,3 93,6 56,1 57,2 71,3 52,6 50,2
1)
10ti-násobný nástřik derivatizované směsi standardů biogenních aminů
2)
5 podílů stejného vzorku skutečného sýra bylo opakovaně analyzováno popsanou metodou
3)
skutečný vzorek sýra obohacený o známé množství standardů BA na dvou koncentračních hladinách (1 a 2 mg) byl měřen 5krát
ND – nedetekováno
Při extrakci biogenních aminů kyselinou chlorovodíkovou jsme z hlediska opakovatelnosti i výtěžnosti BA obdrželi mnohem lepší výsledky, než v případě extrakce kyselinou trichloroctovou. Ke stejným závěrům dospěli i Moret a Conte (1996), Vale a Gloria (1997a) i Innocente et al. (2007). Veškeré výsledky prezentované v předkládané dizertační práci jsou tak založeny na extrakci BA kyselinou chlorovodíkovou. Novella-Rodríguez et al. (2000) dosáhli naopak lepších výsledků s použitím kyseliny trichloroctové. Hodnoty výtěžnosti při extrakci BA ze vzorků parmazámu kyselinou trichloroctovou se u posledně jmenovaných autorů pohybovaly v rozmezí 58 % (fenylethylamin) – 98 % (putrescin). 52
Námi získané hodnoty výtěžnosti BA (tabulka 6) jsou plně srovnatelné s výsledky, které publikovali Vale a Gloria (1997a) pro vzorky parmezánu. V jejich případě se hodnoty výtěžnosti pohybovaly v rozmezí 71,4 % (Spermidin) – 95,4 (histamin). Moret a Conte (1996) stanovili výtěžnost BA v tvrdých sýrech Grana Padano v rozpětí 3 % (putrescin) – 79 % (fenylethylamin). Výrazně vyšších hodnot výtěžnosti BA dosáhli Innocente et al. (2007) ve vzorcích nezrajících sýrů (91 %, fenylethylamin – 98 %, kadaverin). Moret a Conte (1996) vyzdvihují nezbytnost kontroly pH pro vlastní extrakci BA. Z hlediska dobré výtěžnosti všech analyzovaných BA považují autoři za optimální hodnotu pH 11,5. Při vyšších hodnotách došlo k výraznému poklesu výtěžnosti tyraminu (s miminem při pH 12,5 – 13), hodnoty pH kolem 10 (což je optimum pro TYR) byly naopak nepříznivé pro extrakci ostatních biogenních aminů. Naše výsledky se v tomto ohledu poněkud liší. Námi použité nižší pH (11,2) nevedlo ke zvýšení výtěžnosti TYR, hodnoty pro TYR byly naopak nejnižší ze všech testovaných aminů. Naproti tomu pro ostatní BA jsme při pH 11,2 zjistili vyšší hodnoty výtěžnosti, než které stanovili Moret a Conte (1996).
5.2 Biogenní aminy v přírodních polotvrdých zrajících sýrech holandského typu (Eidam) Naměřené hodnoty stanovovaných biogenních aminů ve středových i okrajových
částech R30 (R30-CH i R30-FD) a R45 sýrů v průběhu zrání jsou uvedeny v tabulce 7. V předkládané práci byl sledován vliv faktorů doby zrání (4, 8, 18, 22 a 26 týdnů),
části sýra (okraj a střed u R30 sýra) a použité startovací kultury (Flora Danica Normal a CH-N-11) na obsah jednotlivých biogenních aminů a počty mikroorganizmů.
53
Tabulka 7. Obsah biogenních aminů v sýrech eidamského typu v průběhu zrání (4. – 22. týden)
Doba zrání (týdny)
Sýr
1)
R30-FD 4
R30-CH R45 R30-FD
8
R30-CH R45 R30-FD
18
R30-CH R45 R30-FD
22
R30-CH R45
Biogenní aminy (mg kg-1, průměr ± střední chyba) Část sýra střed okraj střed okraj střed střed okraj střed okraj střed střed okraj střed okraj střed střed okraj střed okraj střed
TRP2) 0,0A 0,1A 0,0A 0,0A 0,0A 0,0A 0,0A 0,0A 0,0A 0,4B 1,3A 0,4A 0,0A 0,0A 1,2A 1,8A 0,5A 0,6A 0,1A 0,0A
± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,35 ± 0,15 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,40 ± 0,85 ± 0,05 ± 0,55 ± 0,00 ± 0,00
FEA3)
HIS4)
TYR5)
PUT6)
2,2B ± 0,15 0,5A ± 0,50 0,0A ± 0,00 0,0A ± 0,00 2,2B ± 0,15 1,3A ± 0,75 0,8A ± 0,25 0,0A ± 0,00 0,8A ± 0,05 0,6A ± 0,05 2,0A ± 0,40 1,4A ± 0,35 1,5A ± 0,25 2,9A ± 0,60 43,5B ± 3,95 1,0A ± 0,05 1,3A ± 0,15 2,0A ± 0,05 2,7A ± 0,70 54,3B ± 1,30
4,7A ± 2,15 5,7A ± 2,95 9,0A ± 2,00 19,5B ± 0,70 4,7A ± 2,15 14,3B ± 1,75 32,0C ± 1,90 16,3B ± 3,45 32,5C ± 1,55 0,5A ± 0,00 9,6A ± 2,30 23,3A ± 6,85 10,4A ± 0,55 45,2B ± 8,50 2,8A ± 0,35 10,7A ± 5,90 9,2A ± 4,50 17,1A ± 0,05 40,6B ± 9,10 1,8A ± 0,15
0,4A ± 0,15 0,7A ± 0,20 1,3A ± 0,60 3,7B ± 0,20 0,4A ± 0,15 2,9A ± 0,20 13,1B,C ± 0,95 11,4B ± 0,15 50,0D ± 1,05 14,4C ± 0,45 34,5A ± 2,95 95,2B ± 2,30 34,7A ± 0,25 114,6B ± 11,30 309,5C ± 9,25 15,7A ± 0,40 135,3B ± 2,30 41,2A ± 1,20 121,8B ± 6,50 299,8C ± 4,80
KAD7)
0,5A ± 0,05 0,7A ± 0,05 0,1A ± 0,10 0,6A ± 0,05 2,1B ± 0,90 0,8A ± 0,25 B 2,8 ± 0,10 0,6A ± 0,05 0,5A ± 0,05 0,7A ± 0,05 C 6,1 ± 0,90 1,4A ± 0,55 3,8B ± 0,50 0,8A ± 0,10 A 1,2 ± 0,20 0,6A ± 0,10 3,8B ± 0,25 0,6A ± 0,00 0,3A ± 0,05 0,9A ± 0,05 B 13,1 ± 0,95 0,9A,B ± 0,05 17,5B ± 2,35 1,1B ± 0,20 2,1A ± 0,50 0,6A ± 0,00 5,4A ± 0,80 0,7A ± 0,10 26,6C ± 2,05 0,9A,B ± 0,05 6,0A ± 1,00 0,8A ± 0,00 4,6A ± 0,40 0,8A ± 0,05 6,7A ± 0,05 0,7A ± 0,10 12,3A ± 3,50 0,6A ± 0,40 60,8B ± 2,20 2,0B ± 0,00
SPD8) 0,4A 0,3A 0,2A 0,2A 0,5A 0,3A 0,2A 0,4A 0,2A 0,4A 0,2A 0,1A 0,3A 0,2A 0,2A 0,3A 0,1A 0,0A 0,0A 0,3A
± 0,10 ± 0,10 ± 0,20 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,25 ± 0,10 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,00 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,00 ± 0,05 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,00 ± 0,10
SPM9) 2,2A ± 0,20 1,3A ± 0,60 0,9A ± 0,60 1,2A ± 0,10 2,2A ± 0,20 1,1B ± 0,40 0,5A,B ± 0,00 0,6A,B ± 0,25 0,0A ± 0,00 0,2A ± 0,05 0,3A,B ± 0,00 0,2A,B ± 0,15 0,0A ± 0,00 0,4A,B ± 0,05 0,2B ± 0,02 0,1A ± 0,05 0,1A ± 0,00 0,2A ± 0,00 0,1A ± 0,00 0,2A ± 0,10
1)
R30-FD – obsah tuku 30 %, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH - 30 %, CH-N-11; R45 – obsah tuku 45 %, startovací kultura Probat 505
2)
tryptamin, 3) fenylethylamin, 4) histamin, 5)tyramin,
A,B,C,D
6)
putrescin, 7) kadaverin, 8)spermidin,
9)
spermin
průměry s odlišnými exponenty v rámci daného sloupce v příslušném časovém intervalu se průkazně (P<0,05) liší, n = 3.
54
5.2.1 Vliv doby zrání na obsah biogenních aminů V sýrech R30 ovlivnila doba zrání koncentraci tyraminu (78,8% z vysvětlené variability, P<0,001), putrescinu (66,7; P<0,01), sumy BA (73,0; P<0,001) i sumy polyaminů (58,7; P<0,01) nejvýrazněji ze všech sledovaných faktorů. Vliv doby zrání na počty mikroorganizmů byl však buď nevýznamný (P>0,05; laktobacily a CPM) nebo jen minimální (P<0,05; celkový počet anaerobů, 22,5% z vysvětlené variability). Také Komprda et al. (2008a) zjistili v sýrech eidamského typu významný (P<0,01) vliv doby zrání na obsah TYR (67,0% z vysvětlené variability), PUT (76,1), sumy BA (73,0) i sumy polyaminů (73,5). V citovaném experimentu ovlivnila doba zrání průkazně i počet laktobacilů (79,3) a anaerobů (56,4 % z vysvětlené variability). V předkládané práci byl kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem ve všech vzorcích v průběhu zrání tyramin, následovaný již nižšími koncentracemi putrescinu, fenylethylaminu a histaminu. Tryptamin, kadaverin, spermidin a spermin byly ve většině případů detekovány pouze v nízkých koncentracích. To potvrzuje již známou skutečnost, že TYR, PUT a HIS jsou hlavními aminy vyskytujícími se ve zrajících sýrech, přičemž dominantní postavení má právě TYR (Moret et al., 1992; Novella-Rodríguez, et al., 2004; Martuscelli et al., 2005; Giuffrida et al., 2006). Během prvních 4 týdnů zrání byly hladiny všech BA nízké, s výjimkou HIS nepřesáhl obsah žádného z nich 3,7 mg kg-1. To je plně v souladu s obecným tvrzením, že obsah BA významněji narůstá mezi 14. – 30. dnem zrání a jejich hladiny stoupají teprve s rostoucím časem (Martuscelli et al., 2005). Důvodem nízkých hladin BA po prvním odběru (4. týden) mohl být v předkládané práci jednak nedostatek prekurzorů BA v nízkém stupni zrání, neboť proteiny se nejprve rozkládají na peptidy, důležitou roli hrají ale i bakterie mléčného kvašení startovacích kultur, jež mohly v počátcích potlačovat nežádoucí mikroflóru. Vysoké hladiny BA v počátcích zrání by naopak svědčily o špatné kvalitě suroviny, nedodržení správné výrobní technologie, popř. sekundární mikrobiální kontaminaci. Schneller et al. (1997) zjistili u poloměkkých sýrů zrajících 30 dní dokonce nulové hladiny TYR, HIS i PUT, Novella-Rodríguez et al. (2004) detekovali uvedené BA v kozích sýrech zrajících rovněž 30 dní v koncentracích srovnatelných s našimi hodnotami (TYR 2,54 mg kg-1, PUT 7,83 mg kg-1, HIS 2,16 mg kg-1). V dalším průběhu zrání
již v předkládané práci podle očekávání statisticky
významně rostly koncentrace TYR i celkové sumy BA u všech vzorků sýra, u většiny
55
vzorků i hladiny FEA a PUT. U všech R30 i R45 vzorků byla v průběhu zrání zjištěna významná korelace (P<0,05) mezi obsahem TYR a FEA (0,80-0,92). Toto zjištění odpovídá skutečnosti, že
bakterie s tyrozindekarboxylázovou aktivitou (především
enterokoky) mohou použít jako svůj substrát kromě tyrozinu i fenylalanin a následně tak produkovat TYR i FEA ve vysokých koncentracích (Novella-Rodriguez et al., 2004a; Elsanhoty et al., 2009). Obsah tyraminu se v předkládané práci lineárně zvyšoval (P<0,01) s rostoucím
časem ve středových (obr.4) i okrajových částech všech vzorků. Nejvyšší regresní gradient byl zaznamenán u sýra R45, v jehož případě hladina tyraminu mezi 8. a 18. týdnem zrání vzrostla (P < 0,001) více než 20ti násobně (z 14,4 mg kg-1 na 309,5 mg kg-1, viz obr. 6). Obdobně výrazný nárůst koncentrací u sýra R45 (P<0,01) platil i pro sumu BA, tento ukazatel se zvyšoval podle rovnice y = – 239,1 + 4,00x; R2 = 0,83, lineárně stoupaly i hladiny BA ve středových částech vzorků sýra R30-FD (y = – 35,6 + 0,90x; ; R2 = 0,90) a R30-CH (y = – 12 + 0,25x; ; R2 = 0,63).
500
Tyramin (mg kg-1)
400 R45 y = - 166,6 + 2,95x R2 = 0,71, P<0,01
300
200 R30-FD y = - 43,8 + 0,75x R2 = 0,54, P<0,01
100
R30-CH y = - 3,1 + 0,24x R = 0,79, P<0,01 0 4
9
14
19
24
29
Doba zrání (týdny)
Obrázek 4. Nárůst obsahu tyraminu během zrání středových částí sýra R30 a R45. R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.
56
Mezi 8. a 18. týdnem se u sýra R45 významně zvýšily i koncentrace FEA, PUT (P<0,01) a HIS (P<0,05). K takto výraznému nárůstu koncentrací biogenních aminů pravděpodobně došlo díky zvýšené nabídce substrátu způsobené postupnou proteolýzou a také díky možným změnám podmínek během zrání, jež následně umožňovaly růst a množení mikroorganizmů s dekarboxylační, popř. i proteolytickou aktivitou. K tomuto vysvětlení přispívá i mikrobiologický rozbor vzorků sýra R45. Na konci 18. týdne zrání byl celkový počet mikroorganizmů, počet laktobacilů i anaerobů několikanásobně vyšší (P<0,05), než na konci 8.týdne, od 18. týdne potom jejich počty opět klesaly (P<0,05; obrázek 5). Podle řady autorů (Novella-Rodriguéz et al., 2002; Wolken et al., 2006) nelze nalézt přímou korelaci mezi obsahy jednotlivých biogenních aminů a počty jednotlivých druhů mikroorganizmů, neboť dekarboxylační aktivita je spíše kmenově, než druhově specifická. Také v předkládané práci nebyla v případě sýra R45 zjištěna korelace mezi obsahy TYR, FEA, PUT a počty sledovaných skupin mikroorganizmů.
5,00E+07 C -1
počty mikroorganizmů (ktj g )
4,50E+07 4,00E+07 C
C
3,50E+07 3,00E+07
8 18 22
2,50E+07 2,00E+07
B
1,50E+07 A
1,00E+07
B
B A
A
5,00E+06 0,00E+00 CPM
BMK
anaerobi
Obrázek 5. Počty mikroorganizmů 8., 18. a 22. den zrání sýra R45. A,B,C
průměry s odlišnými exponenty se v rámci každé skupiny mikroorganizmů průkazně
(P<0,01) liší, n = 3; CPM – celkový počet mikroorganizmů; BMK – bakterie mléčného kvašení; 8 – 8. týden zání; 18 – 18. týden zrání, 22 – 22. týden zrání.
57
Hladiny TYR (obr.6) i sumy BA se mezi 8. a 18. týdnem významně (P<0,01) zvýšily u všech sledovaných vzorků (R30-FD, R30-CH, R45), oproti sýru R45 však u sýrů R30 nedošlo k výraznému zvýšení počtu mikroorganizmů. B
320
280
-1
tyramin (mg.kg )
240
200
8 160
18
120
80
B
B
40 A
A
A
0 R30-FD
R30-CH
R45
Obrázek 6. Rozdíly v obsahu tyraminu mezi 8. a 18. týdnem zrání ve středových částech sýrů R30 a R45. A,B
průměry s odlišnými exponenty se v rámci daného typu sýra (R30-FD, R30-CH, R45)
významně liší (P<0,01), n = 3; R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp.
cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; 8 – 8.týden zrání, 18 – 18.týden zrání.
Vzrůst koncentrace TYR v průběhu zrání různých typů sýra uvádí řada autorů. Zatímco v předkládané práci byl významný nárůst TYR i celkové sumy BA ve většině vzorků mezi 8. a 18. týdnem zrání, Martuscelli et al. (2005) zaznamenal nejvyšší produkci BA již v průběhu 8. týdne. Také Schneller et al. (1997) popisují u polotvrdých sýrů nejprudší vzrůst hladin TYR do 12. týdne zrání. Petridis a Steinhart (1996) zjistili 58
hladiny TYR (320 mg kg-1) u sýrů švýcarského typu zrajícího 20 týdnů srovnatelné s našimi hodnotami (sýr R45; 309,5 mg kg-1; 22 týdnů zrání), Schneller et al. (1997) detekovali množství TYR v poloměkkých sýrech po 22 týdnech zrání v rozmezí 225 – 770 mg kg-1. Novella-Rodriguez et al. (2003) nalezli obsah tyraminu 300 mg kg-1 ve zrajících ovčích sýrech již 12. týden zrání. Komprda et al. (2008b) naměřili po šesti měsících zrání polotvrdých sýrů holandského typu koncentrace TYR v rozmezí 5 – 392 mg kg-1. Za přijatelný obsah TYR v sýrech je považováno množství do 100 mg kg-1 (Silla-Santos, 1996), u zdravého jedince by ke zvýšení systolického tlaku došlo až jednorázovým příjmem množství TYR nad 400 mg kg-1 (Westfal a Westfal, 2006). Z tohoto hlediska můžeme považovat konzumaci obvyklé porce (20g) obou R30 sýrů pro běžného konzumenta za zcela bezpečnou. U sýra R45 došlo již 18. týden zrání k překročení uvedené hranice, ale i doporučeného limitu 200 mg kg-1 (Halasz et al, 1994) pro sumu TYR + FEA. Navíc zde významně vzrostla i koncentrace putrescinu, jež je znám, jako umocňovatel toxicity tyraminu (Bover-Cid et al., 2009). Konzumace sýra R45 by tak mohla být vysoce nebezpečná pro určité skupiny osoby, především pro pacienty užívající inhibitory MAO (např. antidepresivum Aurorix, antiparkinsonika Jumex nebo Cognitiv, antituberkulotikum Nidrazid). U těchto jedinců je doporučen jednorázový příjem tyraminu pod 6 mg kg-1, již běžná porce sýra R45 zrajícího pouze 18. týdnů by u těchto osob mohla vyvolat hypertenzní krizi. Těmto osobám nelze ke konzumaci doporučit ani R30 sýry. Dalšími kvantitativně významnými aminy v průběhu zrání byly v předkládané práci PUT, FEA a HIS, hodnota žádného z nich však nepřekročila hladinu 61 mg kg-1. Koncentrace PUT lineárně stoupala (P<0,01) s rostoucí dobou zrání pouze ve středové
části sýra R30-FD (y = – 3,6 + 0,12x, R2 = 0,62) a sýra R45 (y = – 36,2 + 0,45x, R2 = 0,71), maximální hladina (60,8 mg kg-1) byla dosažena 22. týden zrání právě u vzorku R45. Výrazný nárůst hladiny PUT (a rovněž výše zmíněného TYR) od 18. týdne zrání mohl být způsoben mírným zvýšením teploty během zrání tohoto sýra (údaje o případných změnách teplot během zrání sýrů nebyly od výrobce k dispozici), neboť právě vysoké hladiny obou aminů mohou sloužit jako indikátory teplotních změn v průběhu zrání, popř. následného skladování sýrů (Pinho et al., 2001; Standarová et al., 2010). U vzorků R30-CH došlo v předkládané práci naopak mezi 22. a 26. týdnem k významnému (P<0,05) poklesu koncentrace PUT. Obdobné výsledky zjistili i 59
Schneller et al. (1997), Ordóñez et al. (1997), Valsamaki et al. (2000) a Standarová et al. (2010) u různých druhů sýrů zrajících déle než 60 dní; pokles PUT vysvětlují
činností bakteriálních aminooxidáz. Koncentrace FEA u sýra R30 nepřesáhla 10 mg kg-1, u žádného vzorku nebyl v průběhu zrání zaznamenán statisticky významný vzrůst hladin (P>0,05). Lineární nárůst FEA byl naopak zjištěn u sýra R45 (y = – 33,2 + 0,46x, R2 = 0,83), 22. týden byla dosažena koncentrace 54,3 mg kg-1. Jak již bylo uvedeno, významně vyšší hodnoty (P<0,05) FEA u sýra R45 v porovnání se sýry R30 mohly být způsobeny pomnožením bakterií s tyrozindekarboxylázovou aktivitou. Během prvních 8 týdnů zrání hladiny HIS u R30 sýra stoupaly (P<0,05) nebo měly tendenci růst, poté došlo k pozvolnému poklesu. U sýra R45 koncentrace klesaly již od 4. týdne. Obdobný pokles hladin HIS v průběhu zrání italského ovčího sýra Pecorino uvádí i Martuscelli et al. (2005). Zatímco v sýrech švýcarského typu bývá histamin zastoupen ve vysokých koncentracích, pro Eidamy a čedary jsou typické spíše hladiny nižší (Stratton et al., 1991; Degheidi et al., 1992). To potvrzují i výsledky v předkládané dizertační práci, hodnota HIS v žádném vzorku sýra nepřesáhla 46 mg kg-1, u většiny vzorků však koncentrace dosáhly výrazně nižších hodnot (4,7-23,3 mg kg-1, viz tab. 7). Nízké hladiny HIS v průběhu zrání různých druhů sýrů zaznamenali i Ordóñez et al. (1997; 25 mg kg-1) a Novella-Rodríguez et al. (2004b; 3,5 mg kg-1). Naopak vyšší obsahy HIS (22 – 59 mg kg-1) rovněž u zrajících sýrů holandského typu uvádí Komprda et al. (2008b). Výrazně vyšší koncentrace HIS (250 mg kg-1) naměřili po 20ti týdnech zrání v sýrech švýcarského typu Petridis a Steinhart (1996), i Schneller at al. (1996) v poloměkkých sýrech zrajících 22 týdnů (124 mg kg-1). V obou případech se jednalo o sýry se startovací kulturou obsahující Streptococcus cremoris nebo Lactobacillus casei, patřící mezi silné producenty HIS. Absence těchto bakterií mléčného kvašení ve startovacích kulturách sýrů analyzovaných v předkládané dizertační práci mohla být pravděpodobně příčinou obecně nízkých hladin HIS v průběhu celé doby zrání. Autoři Rauscher-Gabering et al. (2009) považují za přijatelný obsah HIS v sýrech (při konzumaci 60 g sýra za den) 100 – 400 mg kg-1. Podle posledně citovaných autorů se však tato hranice podstatně sníží, pokud jsou konzumovány i další potraviny, u kterých je předpoklad vyššího obsahu HIS (např. konzumace 150 g ryby). V předkládané práci byly obsahy HIS ve všech vzorcích po celou dobu zrání velmi nízké. Konzumace obou sýrů R30 i R45 tak z hlediska HIS nepředstavuje zdravotní
60
rizika. U žádného z analyzovaných vzorků nebyla v průběhu zrání překročena ani toxikologicky bezpečná hranice 900 mg kg-1 (dle Valsamaki et al., 2000), stanovená pro sumu TYR, HIS, CAD a PUT. Maximální hodnoty sumy uvedených aminů (419 mg kg-1) bylo dosaženo 22. týden zrání u sýra R45. Co se týče tryptaminu, jeho hladiny byly po celou dobu zrání nulové nebo nepřesáhly 2 mg kg-1. Rovněž koncentrace kadaverinu byly zanedbatelné a dosahovaly hladin do 2 mg kg-1. Řada autorů uvádí koncentrace KAD ve vzorcích zrajících sýrů stonásobně (Novella-Rodriguez et al., 2003; Elsanhoty et al., 2009) nebo dokonce tisícinásobně (Standarová et al., 2010) vyšší, důvodem takto vysokých hladin byly vždy kontaminující bakterie, především pak enterobakterie. Obecně lze vysoké hladiny KAD považovat za ukazatel zvýšené proteinové degradace a kažení potraviny (Valsamaki et al., 2000). Polyaminy spermin a spermidin nevznikají činností bakteriálních dekarboxyláz během zrání, ale přecházejí do konečného výrobku (v našem případě sýra) z původní suroviny (mléka). Předpoklad jejich konstantního obsahu, popř. pokles v průběhu zrání potvrdily i naše výsledky. Koncentrace SPD byly obecně velmi nízké, hladiny u jednotlivých vzorků se neměnily nebo vykazovaly pouze tendenci klesat. V případě SPM byl zjištěn lineární pokles (P<0,01) ve středových i okrajových částech sýra R30-FD a u sýra R45 (viz obr. 7), nicméně maximální hodnoty nepřesáhly 2,5 mg kg-1. Zcela odlišné hladiny SPD (71,6 mg kg-1) naměřili Novella-Rodríguez et al. (2003) v tvrdých zrajících sýrech, přičemž tento typ sýra považují za významný zdroj polyaminů při jejich zvýšené potřebě (pooperační stavy, hojení ran, regenerace jater) .
61
2,5
Spermin (mg kg-1)
2 R30-FD-střed y = 2,3 - 0,01x R2 = 0,85, P<0,01
1,5
R30-FD-okraj y = 1,3 - 0,01x R2 = 0,62, P<0,01
1
0,5
R45 y = 2,1 - 0,01x R2 = 0,43, P<0,05
0 4
9
14
19
24
29
Doba zrání (týdny)
Obrázek 7. Pokles koncentrace sperminu v průběhu zrání R30-FD a R45 sýra. R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal, okrajová (odebrána byla vždy část okraje o síle 2 cm) a středová část; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.
Výsledky předkládané dizertační práce potvrzují skutečnost, že s rostoucí dobou zrání stoupají i koncentrace toxikologicky významných biogenních aminů (především tyraminu). Výše zmíněné rizikové skupiny jedinců by se tak konzumaci dlouhozrajících sýrů měly vyhýbat úplně. Standarová et al. (2008) těmto osobám doporučují např. termizované měkké sýry nebo sýry smetanové.
5.2.2 Distribuce biogenních aminů v sýrech Rozdíl v obsahu biogenních aminů mezi okrajovou a středovou částí byl sledován u obou várek sýra R30 (R30-FD a R30-CH, podrobný popis vzorků viz část 4.1, tabulka 3). Faktor části sýra významně ovlivnil (P<0,01) pouze hladinu HIS, TYR a sumu BA (48,9, 21,2 a 27,1 % z vysvětlené variability obsahu jednotlivých aminů), ještě
62
výraznější (P<0,001) byl jeho podíl na počtu BMK, CPM a počtu anaerobů (70,4; 77,6 a 77,5 % z vysvětlené variability obsahu jednotlivých aminů). Vyšší hladiny tyraminu i sumy biogenních aminů v okrajových částech oproti
částem středovým byly nalezeny ve všech R30-FD i R30-CH vzorcích na počátku (4. týden; obr. 8) i na konci (26.týden; obr. 9) zrání. V případě sýra R30-FD byla v okrajových vrstvách na počátku zrání zjištěna pouze tendence (P>0,05) ke zvyšování obsahu TYR, u ostatních vzorků byly již rozdíly významné (P<0,05). Na konci zrání byly rozdíly v obsahu TYR i sumy BA u všech vzorků sýrů vysoce průkazné (P<0,01).
35
B
-1
Biogenní aminy (mg.kg )
30
25
20
střed okraj
A
15
A
B
10 B
5 A
A
A
0 TYR
BA
TYR
R30-FD
BA
R30-CH
Obrázek 8. Rozdíly v obsahu tyraminu a sumy BA mezi středovou a okrajovou částí na počátku zrání sýra R30-FD a R30-CH (4.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris;
A,B
průměry s odlišnými exponenty v rámci každého vzorku sýra pro TYR i BA se
významně liší (P<0,05), n = 3; TYR - tyramin, BA - suma biogenních aminů; okraj – odebrána byly vždy část okraje o síle 2 cm.
63
Také v průběhu zrání byly hladiny TYR průkazně (P<0,05) vyšší v okrajových
částech při všech odběrech vzorků sýra R30-FD i R30-CH. 8. týden zrání byl obsah TYR ve středových a okrajových částech sýra R30-FD 3 a 13 mg kg-1, odpovídající hodnoty pro sýr R30-CH byly 11 a 50 mg kg-1. 18. týden zrání byly rozdíly v obsahu TYR mezi středem a okrajem sýra R30-FD 32 a 95 mg kg-1, u sýra R30-CH byly zjištěny koncentrace 35 a 115 mg kg-1. Při odběru vzorků sýra R30-FD 22. týden zrání byl obsah TYR ve středových a okrajových částech 16 a 35 mg kg-1, hodnoty pro sýr R30-CH byly 41 a 147 mg kg-1. Obdobné výsledky byly zjištěny i pro sumu biogenních aminů, rovněž zde byly rozdíly v koncentracích mezi okrajovou a středovou částí při všech odběrech sýrů R30-FD i R30-CH průkazné (P<0,05). 8. týden zrání byl obsah BA ve středové a okrajové části sýra R30-FD 27 a 51 mg kg-1, v případě sýra R30-CH byly odpovídající hodnoty 31 a 88 mg kg-1. 18. týden zrání byla ve středové části sýra R30FD zjištěna koncentrace sumy BA 62 mg kg-1, v okrajové části byla koncentrace sumy BA 139 mg kg-1. U sýra R30-CH byly potom 18. týden zrání rozdíly v sumě BA mezi středem a okrajem 50 a 169 mg kg- 1. 22. týden zrání byly ve středových a okrajových
částech sýra R30-FD zjištěny koncentrace sumy BA 36 a 152 mg kg-1, ve vzorcích sýra R30-CH byly odpovídající hodnoty 68 a 203 mg kg-1. Hladiny histaminu byly rovněž vyšší v okrajové části, statisticky významné (P<0,05) však tyto rozdíly byly pouze u R30-CH vzorků. Také hladiny putrescinu a fenylethylaminu měly tendenci být vyšší (P>0,05) v okrajových částech sýra 30-FD i R30-CH.
64
350
B
250
B
-1
Biogenní amin (mg.kg )
300
A 200
střed A
okraj
150
B B
100
A
50
A
0 TYR
BA
TYR
R30-FD
BA
R30-CH
Obrázek 9. Rozdíly v obsahu tyraminu a sumy BA mezi středovými a okrajovými částmi na konci zrání sýra R30-FD a R30-CH (26.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris;
A,B
průměry s odlišnými exponenty v rámci každého vzorku pro TYR i BA se
významně liší (P<0,01), n = 3; TYR - tyramin, BA - suma biogenních aminů; okraj – odebrána byla vždy část okraje o síle 2 cm.
K obdobným výsledkům dospěli i Petridis a Steinhart (1996) ve vzorcích zrajících sýrů švýcarského typu. V průběhu 22 týdnů zrání zjistili v okrajových částech průkazně vyšší hladiny histaminu i tyraminu v porovnání s jádrem. Jednalo se o sýry zrající pod kůrou, kde předpoklad vyšší vodní aktivity je spíše uvnitř sýra. Vyšší koncentrace HIS, TYR, KAD i PUT v kůře tak autoři vysvětlují příhodnými podmínkami pro růst a množení aerobních a aerotolerantních mikroorganizmů s dekarboxylázovou aktivitou, což potvrdil i profil uvedených aminů. Právě enterokoky a koliformy patří mezi obecně známé producenty zmíněných biogenních aminů. Standarová et al. (2009a) zjistili
65
rovněž průkazně vyšší hladiny kadaverinu (P<0,05) a sumy biogenních aminů (P<0,01) v okrajových vrstvách všech testovaných vzorků zrajících sýrů s bílou plísní na povrchu. Tento rozdíl jednoznačně vysvětlují kontaminací okrajových částí aerobními bakteriemi. Také Vale a Gloria (1997b) přisuzují vysoké koncentrace biogenních aminů nalezené ve strouhaných směsných sýrech použití závadných sýrů nebo právě okrajů, jež podle těchto autorů obsahují výrazně vyšší hladiny BA než středové části. Rovněž v předkládané práci korespondoval mikrobiologický rozbor s obsahem biogenních aminů v jednotlivých částech sýra. Vzhledem ke skutečnosti, že se jednalo o sýry zrající pod fólií, byl vysoký předpoklad vyšší vodní aktivity (v našem experimentu měřena nebyla) i podmínek umožňující růst a množení anaerobních mikroorganizmů právě v povrchových vrstvách. Vodní aktivitu ve středových a okrajových částech zrajících sýrů eidamského typu měřili Komprda et al. (2008a). Uvedení autoři zjistili statisticky významné rozdíly (P<0,01) ve vodní aktivitě vně a uvnitř sýrů, překvapivě vyšší však byly hodnoty ve středových částech. Vyšší koncentrace biogenních aminů v okrajových vrstvách tak autoři vysvětlují kontaminací těchto částí sýra enterokoky během výrobního procesu a také rozdílnými specifickými podmínkami vně a uvnitř sýra umožňující růst a činnost bakteriálních kmenů s dekarboxylázovou aktivitou. Počty anaerobů, laktobacilů, ale i celkový počet mikroorganizmů byly na počátku (obr. 10) i na konci zrání (obr. 11) prokazatelně (P<0,05, resp. P<0,01) vyšší v okrajových částech obou R30 sýrů. Rozdíly v počtu mikroorganizmů mezi okrajem a středem během celé doby zrání jsou dobře patrné i z obrázku 12.
66
7,00E+07
B
-1
Počty mikroorganizmů (ktj g )
6,00E+07 B
5,00E+07 B 4,00E+07
A
střed okraj
B 3,00E+07 B
2,00E+07 A
A A
1,00E+07
A
B A
0,00E+00 CPM
LAB
anaerobi
R30-FD
CPM
LAB
anaerobi
R30-CH
Obrázek 10. Počty mikroorganizmů ve středových a okrajových částech sýra R30-FD a R30CH na počátku zrání (4.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; okraj – odkrojena byla vždy část o síle 2 cm; A,Bprůměry s odlišnými exponenty se pro jednotlivé skupiny mikroorganizmů průkazně liší (P<0,05), n = 3; CPM - celkový počet mikroorganizmů, BMK - bakterie mléčného kvašení; okraj – odebrána byla vždy část okraje o síle 2 cm.
67
1,40E+08 B
B
B
-1
Počty mikroorganizmů (ktj g )
1,20E+08 B
B
1,00E+08
8,00E+07
B
střed okraj
6,00E+07
4,00E+07
2,00E+07
A
A
CPM
LAB
A
A
A
A
0,00E+00 anaerobi
R30-FD
CPM
LAB
anaerobi
R30-CH
Obrázek 11. Počty mikroorganizmů ve středových a okrajových částech R30-FD a R30-CH sýra na konci zrání (26.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris;
A,B
průměry s odlišnými exponenty se pro jednotlivé skupiny mikroorganizmů
průkazně liší (P<0,01), n = 3; CPM – celkový počet mikroorganizmů, BMK – bakterie mléčného kvašení, okraj - odebrána byla vždy část okraje o síle 2 cm.
Rozdíly mezi jádrem a kůrou byly patrné i v počtu kvasinek a plísní. Zatímco ve středových částech obou R30 sýrů nebyly po celou dobu zrání detekovány vůbec, v okrajových částech byly přítomny ve všech testovaných vzorcích v rozmezí 0,4 – 3,8 x 104 ktj.g-1.
68
2,00E+08 1,80E+08 1,60E+08
-1
Anaerobi (ktj.g )
1,40E+08
R30-FD střed R30-FD okraj R30-CH střed R30-CH okraj
1,20E+08 1,00E+08 8,00E+07 6,00E+07 4,00E+07 2,00E+07 0,00E+00 4
9
14
19
24
29
Doba zrání (týdny)
Obrázek 12. Počty anaerobů ve středových a okrajových částech R30-FD a R30-CH sýra v průběhu celé doby zrání (4. – 26. týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; obě startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; CPM – celkový počet mikroorganizmů, BMK – bakterie mléčného kvašení, okraj odkrojena byla vždy okrajová část o síle 2 cm.
Zcela opačný koncentrační gradient tyraminu v okrajových a středových částech tvrdého kozího sýra zjistili Novella-Rodríguez et al. (2003). Koncentrace tohoto aminu se prokazatelně (P<0,05) zvyšovaly od kůry k jádru. Hladiny tryptaminu naopak významně (P<0,05) stoupaly směrem k povrchovým vrstvám. Distribuční rozdíl mezi těmito dvěma biogenními aminy nebyly autoři schopni vysvětlit, domnívají se, že mohl být způsoben rozdílnými požadavky jejich producentů na kyslík a dalšími specifickými podmínkami vně a uvnitř sýra. Öher et al. (2004) zjistili naopak významnou korelaci (P<0,01, r = 0,66) mezi obsahem tyraminu a tryptaminu v kozích sýrech a domnívají se, že tvorba obu aminů je ovlivněna obdobnými faktory. V předkládané práci nebyla korelace mezi koncentracemi TYR a TRP v sýru zjištěna v žádném vzorku.
69
Také Standarová et al. (2009b) pozorovali signifikantně vyšší (P<0,01) hladiny tyraminu, kadaverinu a sumy biogenních aminů ve středových částech sýru Niva ve srovnání s jejich obsahem na povrchu. S lišícími se koncentracemi uvedených aminů vně a uvnitř sýra korespondovaly i počty enterokoků a enterobakterií. Jejich počty ve středových částech sýra byly prokazatelně vyšší (P<0,01). Počty laktobacilů ve středových a okrajových částech se na rozdíl od výsledků v předkládané práci nelišily. Komprda et al. (2008c) zjistili rovněž vyšší (P<0,01) hladiny TYR uvnitř sýru Niva, koncentrace PUT, HIS a KAD byly naopak výrazně vyšší v okrajových vrstvách. Z prezentovaných výsledků je partné, že obsahy biogenních aminů v různých
částech sýra obecně korespondují s počty mikroorganizmů. Koncentrační rozdíly BA mezi jádrem a okrajem jsou však do velké míry ovlivněny typem, průměrem sýra (čím je průměr větší, tím rozdílnější jsou podmínky vně a uvnitř sýra), podmínkami během výroby, či zrání (větší bakteriální kontaminace okrajových částí). Všechny tyto faktory vytváří následně podmínky pro růst a činnost mikroorganizmů s dekarboxylační aktivitou. U polyaminů sperminu a spermidinu nebyl očekáván žádný obsahový rozdíl v různých částech sýra, neboť jak již bylo řečeno, nevznikají činností mikroorganizmů během zrání, ale přecházejí do sýra přímo z mléka. Tento předpoklad byl potvrzen jak našimi výsledky (tab. 7), tak i daty publikovanými v literatuře (Novella-Rodríguez et al. 2003; Standarová et al, 2009a).
5.2.3 Vliv výrobce a startovací kultury na obsah biogenních aminů Analyzované vzorky sýra se vzájemně lišily obsahem tuku v sušině (30,7-32,5 % u sýra R30-FD, resp. R30-CH - výrobce 1; 45,4 % u sýra R45 - výrobce 2) a použitou startovací kulturou. Ta ve všech třech případech obsahovala stejné bakteriálních kmeny (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris), ovšem v rozdílných poměrech (přesné zastoupení kmenů bylo součástí výrobního tajemství obou výrobců). Z důvodu objektivity byly pro srovnávání obsahů biogenních aminů mezi dvěma různými výrobci uvažovány v případě R30 sýrů pouze středové části, vzorky sýrů R45 byly pouze ze středových částí. Zatímco během prvních osmi týdnů zrání byly rozdíly v koncentracích všech sledovaných aminů statisticky nevýznamné (P>0,05) a obsahy
70
aminů byly obecně nízké (viz tab. 7), již 18. týden byly u sýra produkovaného výrobcem 2 zjištěny významně (P<0,05) vyšší hladiny tyraminu (viz obr. 13), putrescinu, fenylethylaminu i celkové sumy biogenních aminů a polyaminů. Obsah TYR (309 mg kg-1) u sýra R45 zrajícího 18 týdnů byl vůbec nejvyšší ze všech naměřených hodnot všech vzorků po celou dobu zrání. Signifikantně vyšší koncentrace (P<0,05) TYR, PUT, FEA a KAD u vzorků R45 oproti sýrům R30 byly zjištěny i 22. týden zrání (tabulka 7). Z obrázku 14, je patrné, že to samé platilo i pro sumu biogenních aminů a sumu polyaminů. Standarová et al. (2009a) rovněž zjistili průkazné (P<0,01) rozdíly v obsahu a profilu biogenních aminů u sýrů s bílou plísní na povrchu produkovaných třemi různými výrobci.
B
320
280
Tyramin (mg kg-1)
240
200
R30-FD R30-CH
160
R45 120 80 A
40 B
A
A
B
0
8. týden
18. týden
Obrázek 13. Rozdíly v obsahu tyraminu mezi vzorky středových částí sýra dvou různých výrobců 8. a 18. den zrání. R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; A,B
průměry s odlišnými exponenty se v rámci jednotlivých skupin biogenních aminů významně
liší (P<0,01), n = 3.
71
Zcela opačná situace byla v předkládané práci v případě histaminu. Hladiny HIS měly u sýra R45 tendenci být naopak nižší, než u obou sýrů R30 (viz. tab. 7). Obecně však byly koncentrace HIS ve všech testovaných vzorcích sýrů nízké (nepřesáhly 17 mg kg-1) a rozdíly mezi jednotlivými výrobci nebyly statisticky významné (P>0,05).
450
C
400
-1
Biogenní aminy (mg kg )
350 300
R30-FD
250
R30-CH 200
R45
150 100 50
B
B
A A
A
0
BA
POLY
Obrázek 14. Rozdíly v obsahu sumy biogenních aminů a sumy polyaminů mezi vzorky sýra dvou různých výrobců (R30 a R45) 22. den zrání. R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; BA – suma všech stanovovaných biogenních aminů; POLY - putrescin + spermin + spermidin; A,B,C
průměry s odlišnými exponenty se v rámci jednotlivých skupin biogenních aminů významně
liší (P<0,01), n = 3.
Oba výrobci produkovali sýry z pasterovaného mléka, rozdílné obsahy biogenních aminů tak nelze přisuzovat odlišnému bakteriálnímu spektru výrobní suroviny, ale
činnosti bakterií startovacích kultur a/nebo mikroflóry kontaminující sýry během výrobního procesu. Výrazně vyšší (P<0,01) hladiny biogenních aminů u sýra produkovaného výrobcem 2 (R45; obr. 14) však příliš nekorespondovaly s počty stanovovaných mikroorganizmů 72
(obr. 15, 16, 17). 22. týden zrání byly u sýra R45 naopak zjištěny průkazně nižší (P<0,05) počty laktobacilů, anaerobů i celkové počty mikroorganizmů, než u sýrů R30. V době, kdy došlo k nejprudšímu nárůstu obsahu tyraminu (18. týden), byl sice celkový počet anaerobů u sýra R45 v porovnání s oběma R30 vzorky dvojnásobný, počty laktobacilů však byly nižší
(P<0,05) a celkový počet aerobních mikroorganizmů
srovnatelný u obou výrobců.
4,00E+07
3,50E+07
BMK (KTJ g-1)
3,00E+07
2,50E+07 R30-FD 2,00E+07
R30-CH R45
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00 4
9
14
19
24
týdny
Obrázek 15. Počty BMK v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; BMK – bakterie mléčného kvašení.
Rozdíly mezi sýry různých výrobců nebyly nalezeny ani v počtech koliformních mikroorganizmů. Počty koliformů však byly obecně velice nízké (7 – 11 x 103 ktj g-1) a od 8. týdne zrání již tato skupina mikroorganizmů nebyla v sýrech detekována vůbec. U sýra R45 byly sice 18. a 22. týden nalezeny průkazně vyšší počty kvasinek a plísní
73
(P<0,05) oproti sýrům R30, ani maximální zjištěná hodnota 15 x 104 ktj.g-1 však nemohla významně ovlivnit koncentrační rozdíl biogenních aminů mezi jednotlivými výrobci.
4,5E+07 4,0E+07 3,5E+07
anaerobi (KTJ g-1)
3,0E+07 2,5E+07
R30-FD R30-CH
2,0E+07
R45
1,5E+07 1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 4
9
14
19
24
týdny
Obrázek 16. Počty anaerobních mikroorganizmů v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.
Sýry obou výrobců se lišily obsahem tuku v sušině, tato skutečnost však pravděpodobně neměla výrazný vliv na rozdílné obsahy biogenních aminů. To potvrzují i výsledky prezentované autory Komprda et al. (2008b) pro zrající sýry stejného typu. Rozdílný obsah tuku (30 a 45%) v jejich experimentu významně neovlivnil (P>0,05) koncentraci žádného z biogenních aminů.
74
4,0E+07
3,5E+07
CPM (KTJ g-1)
3,0E+07
2,5E+07 R30-FD 2,0E+07
R30-CH R45
1,5E+07
1,0E+07
5,0E+06
0,0E+00 4
9
14
19
24
týdny
Obrázek 17. Celkový počet mikroorganizmů v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden). R30-FD – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura Flora Danica Normal; R30-CH – výrobce 1, 30 % tuku v sušině, startovací kultura CH-N-11; R45 – výrobce 2, 45 % tuku v sušině, startovací kultura Probat 505; všechny tři startovací kultury obsahovaly v rozdílných poměrech bakteriální kmeny: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
lactis, Lactococcus lactis subsp. diacetilactis a Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris; CPM – celkový počet mikroorganizmů.
Co se týče srovnání hladin biogenních aminů mezi dvěma různými produkty jednoho výrobce (R30-FD, resp. R30-CH; zohledněny byly v tomto případě pouze středové části vzorků) lišícími se pouze startovací kulturou, nelze rovněž vyvodit jednoznačný závěr. Koncentrace tyraminu byla u sýra R30-CH po celou dobu zrání vyšší, statisticky významný (P<0,05) byl však tento rozdíl pouze 8. týden zrání (2,9 mg kg-1 u sýra R30-FD, resp. 11,4 mg kg-1 u sýra R45; viz také tab. 7). Počty laktobacilů byly u
vzorku R30-CH
průkazně vyšší (P<0,05) 8. týden zrání
(1,5 x107 ktj g-1 u sýra R30-CH oproti 0,8 x107 ktj g-1 u sýra R30-FD), 18. týden zrání (3,6 x107 ktj g-1 oproti 1,8 x107 ktj g-1 ) i 22. týden zrání (2,4 x107 ktj g-1 oproti 1,8 x107 ktj g-1). Anaerobní mikroorganismy jevily pouze tendenci být vyšší a celkový počet mikroorganizmů se v průběhu zrání u obou typů sýra R30 značně měnil. U obou 75
sýrů R30 byly nalezeny významné korelace mezi obsahem TYR a počty BMK (r = 0,70 pro R30-CH a r = 0,64 pro R30-FD; P<0,05), resp. obsahem TYR a počty anaerobních mikroorganizmů (r = 0,77 a r = 0,76; P<0,05). V případě putrescinu však byly ve vzorcích odebraných po 8, resp. 18 týdnech zrání naměřeny vyšší (P<0,05) obsahy v sýrech R30-FD, během zrání zde byly zjištěny i průkazné (P<0,05) korelace mezi obsahem PUT a CPM (r = 0,71), PUT a BMK (r = 0,71) a PUT a počtem anaerobů (r = 0,80). Podobně nesourodé výsledky týkající se obsahu biogenních aminů a počtu mikroorganizmů byly získány i porovnáním obsahu tyraminu mezi okrajovými částmi obou sýrů R30. Zatímco u R30-CH sýra byly v porovnání s R30-FD nalezeny průkazně vyšší (P<0,05) koncentrace TYR po celou dobu zrání, počty mikroorganizmů jevily zcela opačnou tendenci. Výsledky prezentované v předkládané práci jen dále potvrzují teorii, podle níž je téměř nemožné nalézt přímou korelaci mezi obsahy biogenních aminů a počty mikroorganizmů. Dekarboxylační schopnost bakterií se totiž liší nejen v rámci jednotlivých druhů, ale i kmenů, přičemž rozdíly v produkci BA mezi různými kmeny jednoho druhu mohou být až řádové (Innocente a D´Agostin, 2002; Wolken et al., 2006). Také neprůkazné korelace mezi obsahem TYR, resp. sumy BA na jedné straně a počty sledovaných mikroorganizmů na straně druhé, v R45 sýrech, u nichž byly zjištěny nejvyšší hladiny tyraminu i celkové sumy BA, tuto teorii podporují. Nevýznamné korelace mezi obsahem TYR a počty BMK, resp. mezi obsahem TYR a počty anaerobních mikroorganizmů zjistili u polotvrdých zrajících sýrů holandského typu i Komprda et al. (2008a). Fernández-García et al. (2000) uvádí, že bakterie s tyrozindekarboxylázovou aktivitou představovaly v jejich experimentu pouze 1 % z celkového počtu přítomných bakterií. U řady mikroorganizmů používaných jako součást startovacích kultur byla prokázána dekarboxylační aktivita, jejich vliv na tvorbu biogenních aminů je však pouze limitující. Vysoké koncentrace tyraminu, histaminu, fenylethylaminu, či putrescinu bývají spojeny s pomnožením laktobacilů a enterokoků, produkce biogenních aminů je však přisuzována spíše činnosti sekundárních kontaminujících bakterií než vlastním startovacím kulturám (Schneller et al., 1996; Fernández-García et al., 2000; Marino et al., 2000; Roig-Sagues, 2002; Öner et al., 2004; Komprda et al., 2008a,b). Novella-Rodriguez et al. (2004a), Elsanhoty et al. (2009) a Buňková et al.
76
(2010) uvádí, že v rámci jejich experimentů neprodukovaly bakterie startértových kultur biogenní aminy vůbec. Faktor startovací kultury v předkládané práci nijak významně neovlivnil (P>0,05) hladiny tyraminu ani sumu biogenních aminů u žádného ze sýrů R30. Vliv startovací kultury na tvorbu histaminu a putrescinu je možno odhadnout z podílu variability obsahu uvedených aminů vlivem startovací kultury z celkové vysvětlené variability obsahu těchto aminů: 15,8, resp. 31,5% (P<0,01). Nepodstatný vliv startovací kultury (maximálně 6% z vysvětlené variability) na tvorbu biogenních aminů u polotvrdých zrajících sýrů holandského typu popisují i Komprda et al. (2008b). Martuscelli et al. (2005) zjistili, že přidané bakterie startovacích kultur v počátcích zrání ovčích sýrů dokonce potlačovaly divokou mikroflóru a došlo tak k pozvolnější produkci biogenních aminů, než v případě sýrů vyrobených z nepasterovaného mléka bez přídavku startérů. V předkládané práci nebyly počty enterokoků stanovovány, je však
vysoce
pravděpodobné, že za významnými koncentracemi TYR (především u sýra R45) stojí právě kontaminace různými kmeny těchto bakterií. Rozdílné počty eneterokoků byly zřejmě i důvodem odlišných hladin TYR mezi oběma produkty jednoho výrobce (R30-FD, R30-CH) i mezi oběma výrobci. Tyto závěry lze vyvodit jednak z obecného tvrzení, že enterokoky patří mezi nejvýznamnější producenty TYR (Novella-Rodríguez et al., 2004a; Bonetta et al., 2008, Pereira et al., 2009; Valenzuela et a., 2009), ale i na základě výsledků, jež publikovali Komprda et al. (2008a) pro stejný typ sýra (zrající sýr eidamského typu) produkovaný dvěma různými výrobci. Ve vzorcích s prokazatelně vyššími (P<0,01) koncentracemi TYR (392 mg kg-1 TYR u sýra produkovaného jedním výrobcem, oproti 210 mg kg-1 TYR u sýra produkovaného druhým výrobcem), zjistili posledně jmenovaní autoři i významně vyšší (P<0,01) počty enterokoků (3,18 oproti 1,95 log ktj g-1). Také obecně vyšší hladiny TYR v okrajových částech všech vzorků (P<0,05) oproti částem středovým korelovaly s vyššími počty enterokoků. Zmínění autoři tento rozdíl vysvětlují rovněž masivnější kontaminací okrajových částí sýra enterokoky během výrobního procesu.
77
5.3 Biogenní aminy v tavených sýrech Zjištěné hodnoty biogenních aminů ve všech analyzovaných vzorcích taveného sýra jsou uvedeny v tabulce 8.
Tabulka 8. Obsah biogenních aminů ve vzorcích taveného sýra Vzorek (mg kg -1 sýra; průměr ± střední chyba průměru )
Biogenní amin
P1
P2
S1
S2
S3
Tryptamin
0,7A ± 0,10
0,2A ± 0,10
0,0A ± 0,00
0,2A ± 0,06
0,8A ± 0,75
Fenylethylamin
1,8B ± 1,40
0,3A ± 0,03
0,2A ± 0,00
0,7A,B ± 0,14
0,3A ± 0,94
Histamin
0,7A ± 0,35
0,3A ± 0,21
0,0A ± 0,00
0,7A ± 0,14
0,4A ± 0,23
Tyramin
29,3C ± 6,90
6,3A,B ± 0,56
1,3A ± 0,05
9,3B ± 0,45
7,7B ± 0,19
Putrescin
1,0A ± 0,35
1,9A ± 0,33
0,3A ± 0,05
2,2A ± 0,61
1,6A ± 0,60
Kadaverin
0,7A,B ± 0,05
1,3A,B ± 0,29
0,5A ± 0,05
1,2B ± 0,12
1,0A,B ± 0,13
Spermin
0,2B ± 0,00
0,1A ± 0,00
0,2B ± 0,00
0,2B ± 0,03
0,1A,B ± 0,03
Spermidin
1,0B ± 0,30
0,1A ± 0,13
0,0A ± 0,00
0,2A ± 0,18
0,3A ± 0,13
Suma BA
35,3C ± 7,15
10,4B ± 0,61
2,4A ± 0,15
14,5B ± 1,06
12,2B ± 1,27
P1 - pasterovaný, skladovaný 22 týdnů při teplotě 8 °C; P2 - pasterovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 8 °C; S1 - sterilovaný, skladovaný 22 týdnů při teplotě 8 ° C; S2 - sterilovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 8 °C; S3 - sterilovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 25 °C A,B,C
průměry s odlišnými exponenty v rámci daného řádku se průkazně liší (P<0,05), n = 2 (P1,
S1), n = 4 (P2, S2, S3)
Kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem byl ve všech testovaných vzorcích tyramin. Koncentrace TYR v pasterovaném sýru skladovaném 22 týdnů po výrobě (P1) byla prokazatelně vyšší (P<0,05) než u stejně dlouho skladovaného sterilovaného sýra (S1) a stejně tak i ve srovnání s ostatními vzorky. P1 vzorek rovněž obsahoval výrazně vyšší hladinu (P<0,05) sumy biogenních aminů než sýr S1 (tab. 8). Hladina TYR ani celková suma BA v pasterovaném sýru skladovaném 57 týdnů (P2) se naopak od sterilovaného sýru skladovaného rovněž 57 týdnů (S2) významně nelišila (P>0,05; tab. 8). Jedním ze sledovaných faktorů potenciálně ovlivňujících obsah BA v tavených sýrech byl vliv tepelného ošetření vzorků (pasterace nebo sterilace) ihned po výrobě. Z tohoto hlediska se naše výsledky značně lišily od původního předpokladu. Hlavní příčinou výskytu biogenních aminů v tavených sýrech je již jejich přítomnost ve 78
vstupních surovinách, tedy zrajících sýrech. Důvodem je skutečnost, že hladiny BA nejsou téměř nebo vůbec ovlivnitelné tepelným záhřevem (Shalaby, 1996; El-Sayed, 1996) a během výroby přecházejí z původních surovin (zrající sýr) do konečného produktu (tavený sýr). Tavící teplota ani následné tepelné ošetření by tak na obsah již přítomných BA neměly mít žádný vliv. Výrazně vyšší obsah tyraminu v sýru P1 nejen ve srovnání s S1 sýrem, ale i s ostatními vzorky může mít několik reálných vysvětlení. Jedna z možností vychází z výše uvedeného tvrzení, tedy přechodu BA z výrobních surovin do produktu a tepelné stálosti BA. Statisticky významné rozdíly v obsahu TYR mezi jednotlivými vzorky označenými jako pasterované a sterilované mohly být způsobeny použitím různých vstupních surovin pro výrobu těchto tavených sýrů. Jinými slovy: lze se domnívat, že vzorky dodané do naší laboratoře nepocházely pouze z jedné várky, jak bylo udáno dodavatelem, ale minimálně ze dvou různých várek. Této domněnce nasvědčuje např. i fakt, že všechny P1 vzorky se od ostatních lišily svojí polotekutou konzistencí. Druhá z možností, která však předpokládá původ všech vzorků tavených sýrů z jediné várky, je použití různých druhů zrajících sýrů (Eidam, Moravský bochník) s odlišným obsahem tyraminu a jeho následné nerovnoměrné rozptýlení do objemu taveniny během výroby. Dalším možným
vysvětlením prokazatelně vyšší
(P<0,05) hladiny TYR
v pasterovaném sýru skladoveném 22 týdnů (P1) v porovnání s ostatními vzorky, včetně sterilovaného sýru skladovaného 57 týdnů při teplotě 25 °C (S3), je přítomnost bakterií s tyrozin-dekarboxylázovou aktivitou. Během výroby tavených sýrů je materiál podroben vysokým teplotám (80 °C po dobu 10 minut), při nichž dochází k inaktivaci většiny mikroorganizmů. Výskyt vyššího počtu dekarboxylujících bakterií následně schopných produkce BA je proto v tomto druhu sýra nepravděpodobný. Vyšší hladiny TYR u P1 sýra by však mohly být důsledkem sekundární mikrobiální kontaminace, a to jak během plnění taveniny do obalů, tak např. díky nedokonale těsnícím víčkům. Tento předpoklad je podporován i mikrobiálním rozborem analyzovaných vzorků. V žádném vzorku nebyly detekovány bakterie mléčného kvašení, kvasinky ani plísně. Rovněž koliformní bakterie a anaerobi byli zjištěni pouze v nízkých počtech (tabulka 9) a rozdíly mezi jednotlivými vzorky nebyly statisticky významné (P>0,05). Naproti tomu byly výrazně vyšší (P<0,05) hodnoty celkového počtu mikroorganizmů zjištěny právě u P1 vzorku ve srovnání s ostatními analyzovanými tavenými sýry (tabulka 9). Jak je patrné z tabulky 9, hodnota CPM v P1 sýru byla řádově 5 - 6krát vyšší než v ostatních 79
vzorcích a také koncentrace TYR byla u P1 sýru zhruba 5krát vyšší než průměrná hladina TYR u dalších čtyř vzorků tavených sýrů. I přes výše uvedené skutečnosti je proto vysoce pravděpodobné, že u P1 sýrů došlo k sekundární kontaminaci, a to aerobní mikroflórou obsahující také dekarboxylující bakteriální kmeny. Rovněž tepelné podmínky, jimž byly vzorky tavených sýrů, označené jako pasterované, po výrobě vystaveny (zchlazení na teplotu 10 ºC a následné uchovávání při teplotě 8 ºC), by mikrobiální růst s následnou tvorbu TYR umožňovaly, neboť většina bakterií produkujících BA patří do skupiny mezofilů. Tabulka 9. Počty mikroorganizmů (ktj g–1) ve vzorcích taveného sýra P1
P2
S1
S2
S3
CPM
1,3 x 106 B
6,5 x 101 A
2,5 x 100 A
1,5 x 101 A
4,6 x 101 A
anaerobi
3,5 x 101 A
2,1 x 101 A
2,0 x 101 A
1,1 x 101 A
ND
koliformní bakterie
ND
6,3 x 10
0A
ND
2,8 x 10
1A
7,5 x 100 A
P1 - pasterovaný, skladovaný 22 týdnů při teplotě 8 ° C; P2 - pasterovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 8 ° C; S1 - sterilovaný, skladovaný 22 týdnů při teplotě 8 ° C; S2 - sterilovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 8 ° C; S3 - sterilovaný, skladovaný 57 týdnů při teplotě 25 ° C; A,B,C
průměry s odlišnými exponenty v rámci každého řádku se průkazně liší (P<0,05); n = 2 (P1,
S1), n = 4 (P2, S2, S3); CPM – celkový počet mikroorganizmů; ND – nedetekováno
Počty všech sledovaných skupin mikroorganizmů byly ve vzorcích tavených sýrů podle očekávání výrazně nižší, než v analyzovaných sýrech zrajících. Z tabulky 9 vyplývá, že mikrobiální počty v tavených sýrech byly obecně velmi nízké. I v případě P1 sýra, u nějž došlo k pravděpodobné kontaminaci během výroby, byly hodnoty CPM stále řádově nižší, než u všech vzorků polotvrdých sýrů (viz část 5.2) po celou dobu zrání. Přestože hladiny TYR ani sumy BA se mezi pasterovaným a sterilovaným taveným sýrem skladovaným 57 týdnů při stejné teplotě (P2, S2) statisticky nelišily (tabulka 8), u S2 vzorků měly obsahy TYR i sumy BA tendenci být vyšší, než u vzorků P2. Jestliže způsob tepelného ošetření považujeme za jediný možný faktor ovlivňující obsah BA v P2 a S2 sýrech, je toto zjištění poněkud překvapivé. Výsledky mikrobiálního rozboru vylučují možnost sekundární kontaminace, mezi počty mikroorganizmů P2 a S2 vzorků nebyly
zaznamenány
žádné
významné
rozdíly
(P>0,05;
tabulka
9).
Jako
nejpravděpodobnější vysvětlení se proto jeví rozdílný původ surovin pro výrobu P2 a 80
S2 sýrů. Tyto vzorky zřejmě pocházely ze dvou různých výrobních várek obsahující rozdílné množství BA, nikoliv pouze z jediné, jak bylo deklarováno dodavatelem. Na druhou stranu, rozdíly v obsahu ostatních BA (tabulka 8) ani polyaminů (obrázek 18) mezi pasterovanými a sterilovanými sýry nebyly příliš významné, obecně byly koncentrace jednotlivých aminů relativně nízké a z toxikologického hlediska nepříliš významné.
45
C
40
Biogenní aminy (mg kg-1)
35 30 P1 P2 S1
25 20
S2 S3
B B
15 A,B 10 5
A
A,B
B
A,B
A,B
A 0 suma biogenních aminů
suma polyaminů
Obrázek 18. Suma biogenních aminů (tryptamin, fenylethylamin, histamin, tyramin, putrscin, kadaverin, spermidin, spermin) a polyaminů (putrescin, spermidin, spermin) ve vzorcích tavených sýrů. A,B,C
průměry s odlišnými exponenty v rámci každé skupiny se průkazně liší (P<0,05), n = 2 (P1,
S1), n = 4 (P2, S2, S3); P – pasterovaný, S – sterilovaný, 1 – skladování 22 týdnů při 8 °C, 2 skladování 57 týdnů při 8 °C, 3 - skladování 57 týdnů při 25 °C.
Co se týče doby skladování (22 a 57 týdnů) pasterovaných sýrů, sýr skladovaný delší dobu (P2) měl oproti předpokladům výrazně nižší (P<0,05) hladinu TYR (tab.8) i celkovou sumu BA (obr. 18). Pro zrající sýry obecně platí, že s rostoucí dobou zrání nebo skladování rostou i koncentrace biogenních aminů (Ordóñez et al., 1997; Schneller et al., 1997; Valsamaki et al., 2000; Novela-Rodríguez, 2003; Komprda et al., 2008b; 81
Buňková et al., 2010), vyjimku tvoří polyaminy SPD a SPM, jejichž hladiny zůstávají konstantní nebo postupně klesají. Během skladování tavených sýrů je oproti tomu vzhledem k minimální mikrobiální aktivitě předpoklad růstu koncentrací BA velmi malý. Nižší hladiny TYR i sumy BA u déle skladovaných vzorků by teoreticky mohly být následkem působení některých bakteriálních kmenů (viz část 2.8.2), jež jsou díky aminooxidázové aktivitě schopny degradovat BA. Tato varianta se však i vzhledem k nízkému počtu mikroorganizmů u P2 vzorků (tab. 8) jeví jako nepravděpodobná. Za nelogicky vyšší hladiny TYR i sumy BA u P1 sýrů oproti déle skladovaným P2 vzorkům je zřejmě zodpovědná již dříve uvažovaná sekundární mikrobiální kontaminace. Z tohoto důvodu nelze u pasterovaných sýrů vyvodit žádný závěr týkající se vlivu doby skladování na tvorbu biogenních aminů. Hladiny BA u sterilovaných sýrů se naopak s rostoucí dobou skladování zvyšovaly. Koncentrace TYR i suma BA byla výrazně vyšší (P<0,05) u vzorků skladovaných 57 týdnů (S2 i S3) v porovnání se vzorky skladovanými 27 týdnů (S1). Také obsahy ostatních BA, i v případě, že rozdíly nebyly statisticky významné, měly tendenci být vyšší u déle skladovaných vzorků (tabulka 8). U čerstvě vyrobených a následně skladovaných sterilovaných tavených sýrů je minimální předpoklad bakteriálního růstu, což potvrzují i výsledky mikrobiologické analýzy (tabulka 9). Proto i stoupající hladiny BA u déle skladovaných sýrů (S2, S3) byly překvapivé. U těchto vzorků byly oproti S1 sýrům detekovány i koliformní bakterie, jejich nízké počty (7,5 – 28 ktj g-1) však pravděpodobně nemohly být zodpovědné za zjištěné rozdíly v koncentracích BA. Vyšší hladiny BA u sýrů skladovaných delší dobu byly pravděpodobně ovlivněny jinými faktory, než vlastní dobou skladování. Tomu napovídají i výsledky týkající se rozdílné teploty skladování stejně dlouho (57 týdnů) skladovaných sterilovaných sýrů S2 (8 °C) a S3 (25 °C). Pokud by platila závislost zvyšující se koncentrace BA s časem, s rostoucí teplotou by logicky množství BA stoupalo také. Mezi S2 a S3 sýry však nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (P>0,05), a to ani v počtu mikroorganizmů (tabulka 9), ani v obsahu BA (tabulka 8). Obsahy BA i počty mikroorgamizmů u sýrů S3 jevily naopak tendenci být nižší než u sýrů S2. Podle údajů dodavatele, na jehož žádost byla analýza tavených sýrů provedena, se jednotlivé vzorky lišily pouze způsobem tepelného ošetření, dobou a teplotou skladování. Z našich výsledků je však patrné, že hladiny biogenních aminů musely být ovlivněny i jinými faktory, popř. nebyly správně dodržovány výrobní nebo skladovací podmínky. Z tohoto důvodu nelze na základě našeho experimentu stanovit obecný závěr 82
týkající se vlivu námi sledovaných faktorů na tvorbu biogenních aminů v tavených sýrech. Objektivně lze analyzované tavené sýry zhodnotit z toxikologického hlediska. Co se týče TYR i HIS, tedy dvou nejtoxičtějších BA, žádný z testovaných vzorků by nepředstavoval zdravotní riziko. Pro tyramin je přípustná koncentrace v sýrech do 100 mg kg –1, v předkládané práci byla zjištěna maximální hladina TYR pouze 29,3 mg kg–1 (vzorek P1). Tato koncentrace by nebyla riziková ani pro pacienty léčené inhibitory MAO (např. antidepresivum Aurorix, antiparkisonikum Jumex nebo Cognitiv, antituberkulotikum Nidrazid), jejichž jednorázový příjem TYR by neměl přesáhnout 6 mg. Nejvyšší naměřená hladina HIS byla 0,7 mg kg-1 (P1 a S2 vzorek), autoři Valenzuela et al. (2009) považují za přijatelný obsah HIS v sýrech 100 – 400 mg kg –1. Podle autorů Valsamaki et al. (2000) by součet koncentrací TYR, HIS, PUT a KAD v sýrech neměl překročit 900 mg kg-1, v předkládané práci byla maximální zjištěná hladina 32,3 mg kg-1 (P1 vzorek). Protože i suma polyaminů byla u všech vzorků nízká (obrázek 18), je možné tyto tavené sýry doporučit ke konzumaci i osobám s dietními opatřeními. Analyzované tavené sýry lze zhodnotit i po stránce požadavků zadavatele,
čili jejich dlouhodobé údržnosti (minimální trvanlivost 26 týdnů) při zvýšené teplotě (25 °C). Žádný ze vzorků nepředstavuje z hlediska biogenních aminů riziko ani v případě dlouhodobého skladování při pokojové teplotě, lze je proto doporučit i pro využití v extrémních podmínkách, jako jsou např. vojenské účely. Analyzované tavené sýry obsahovaly podle předpokladu výrazně nižší koncentrace BA, než přírodní zrající sýry (viz část 5.2.). Rozdíl v obsahu TYR, HIS i sumy BA mezi tavenými sýry skladovanými 22 týdnů a sýry eidamského typu zrajícími rovněž 22 týdnů jsou patrné z obrázku 19. Také Standarová et al. (2008) zjistili u tavených sýrů výrazně nižší hladiny biogenních aminů v porovnání s tvrdými zrajícími sýry. Zvýšené koncentrace aminů detekovali pouze u ochucených tavených sýrů, což vysvětlují použitím suroviny nižší kvality.
83
B 140
Biogenní aminy (mg kg-1)
120 B
100 80
tavené* zrající**
60 40
B
A
A
20
A 0
TYR
HIS
BA
Obrázek 19. Porovnání tavených a zrajících sýrů ohledně obsahu tyraminu, histaminu, resp. sumy biogenních aminů (tryptamin, fenylethylamin, histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, spermidin, spermin) 22. týden skladování/zrání. A,B
průměry s odlišnými exponenty v rámci každé skupiny se průkazně liší (P<0,01); TYR –
tyramin, HIS – histamin, BA – suma biogenních aminů. * všechny vzorky tavených sýrů skladovaných 22 týdnů (P1, S1) byly posouzeny jako jeden soubor, n = 4. **všechny vzorky sýrů eidamského typu zrající 22 týdnů od výrobce 1 (R30-FD, R30-CH) bez ohledu na část sýra (okraj, střed), se startovací kulturou obsahující kmeny Lactococcus lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, byly posouzeny jako jeden soubor, n = 12.
Nízké obsahy BA v tavených sýrech z Taiwanu zjistili i Kung et al. (2005): putrescin 1,3 mg kg-1, kadaverin 8,3 mg kg-1, tyramin 4,0 mg kg-1, spermin 4,1 mg kg-1, histamin 2,7 mg kg-1. Průměrné hodnoty zjištěné autorem El-Sayed (1996) pro tavené sýry dostupné v Egyptě byly oproti našim výsledkům naopak vyšší: putrescin 21,1 mg kg-1, kadaverin 41,0 mg kg-1, tyramin 58,7 mg kg-1, spermin 56,0 mg kg-1 a fenylethylamin dokonce 149,7 mg kg-1.
84
6 Závěry Kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem byl během zrání polotvrdých sýrů eidamského typu tyramin, následovaný již nižšími koncentracemi putrescinu, fenylethylaminu a histaminu. Tryptamin, kadaverin, spermidin a spermin byly detekovány pouze v nízkých koncentracích. Doba zrání ovlivnila v sýrech R30 koncentraci TYR, resp. sumu BA (P<0,001) i koncentraci PUT, resp. sumu polyaminů (P<0,01) nejvíce ze všech sledovaných faktorů. Vliv doby zrání na počty BMK i CPM byl nevýznamný (P>0,05), ovlivněny byly pouze počty anaerobů (P<0,05). Obsah TYR i sumy BA se v průběhu zrání lineárně zvyšoval (P<0,01) ve středových i okrajových částech sýra R30-FD, resp. R30-CH i v sýru R45. Koncentrace PUT lineárně stoupala (P<0,01) ve středových částech sýra R30-FD i R45, u sýra R30CH došlo naopak od 18. týdne zrání k poklesu (P<0,01). Koncentrace FEA se s rostoucím časem lineárně zvyšovala (P<0,05) pouze u sýra R45. Obsah HIS se ve vzorcích R30 i R45 s rostoucí dobou zrání snižoval (P<0,05) nebo měl tendenci klesat. Koncentrace SPD se u žádného z analyzovaných vzorků významně neměnila (P>0,05), obsah SPM lineárně klesal (P<0,01) u sýra R30-FD i R45. Faktor části sýra u vzorků R30 významně (P<0,01) ovlivnil obsah HIS, TYR i sumu BA, ještě výraznější (P<0,01) byl jeho podíl na počtech BMK, CPM i počtu anaerobů. Od 8. týdne zrání byly ve všech vzorcích R30-FD i R30-CH zjištěny v okrajových částech průkazně (P<0,05) vyšší koncentrace TYR i sumy BA, než v částech středových. Rozdíly v obsahu HIS byly průkazné (P<0,05) u sýra R30-CH, u vzorku R30-FD byla pouze tendence k vyšším obsahům HIS v okrajové části. Také hladiny PUT a FEA měly tendenci být vyšší v okrajích obou sýrů R30. S distribucí
BA
v jednotlivých
částech
sýra
korespondovaly
i
počty
mikroorganizmů. Během celé doby zrání byly počty BMK, anaerobů i celkové počty mikroorganizmů prokazatelně (P<0,05; resp. <0,01) vyšší v okrajových částech obou R30 sýrů. Rozdíly v obsahu BA mezi sýry produkovanými dvěma různými výrobci nebyly na počátku zrání významné (P>0,05). Od 18. týdne zrání již byly zjištěny průkazně (P<0,05) vyšší koncentrace TYR, PUT, FEA, i sumy BA u výrobce 2 (sýr R45).
85
S vyššími obsahy BA u sýra R45 korespondovaly 18. týden zrání pouze počty anaerobů, počty BMK byly naopak vyšší (P<0,05) u obou sýrů produkovaných výrobcem 1 (R30). Rozdíl v celkovém počtu aerobních mikroorganizmů mezi sýry různých výrobců nebyl významný (P>0,05). 22. týden zrání byly počty všech sledovaných skupin mikroorganizmů průkazně (P<0,05) vyšší u R30 sýrů. Tyto výsledky mohou být vysvětleny skutečností, že dekarboxylační aktivita bakterií se liší nejen mezi jednotlivými druhy, ale i mezi kmeny stejného druhu. Produkce BA mezi různými kmeny jednoho druhu se přitom může lišit až o několik řádů. Faktor startovací kultury významně neovlivnil (P>0,05) hladiny TYR, ani sumu BA u žádného ze sýrů R30. Koncentrace TYR měla po celou dobu zrání tendenci být vyšší (P>0,05) u vzorků R30-CH v porovnání se sýry R30-FD, statisticky významný (P<0,05) byl tento rozdíl pouze 8. týden zrání. Počty BMK byly od 8. týdne zrání průkazně (P<0,05) vyšší ve vzorcích R30-CH, rozdíly v počtu anaerobů a celkovém počtu mikroorganizmů mezi sýry R30 nebyly významné (P>0,05). U sýra R45 došlo již 18. týden zrání k výraznému překročení doporučeného limitu pro obsah TYR v sýrech (100 mg kg-1), ale i doporučeného limitu pro sumu TYR a FEA (200 mg kg-1). Suma TYR, HIS, KAD a PUT však během celého zrání nepřekročila toxikologicky bezpečnou hranici 900 mg kg-1. Sýr R45 nemůže být rozhodně doporučen ke konzumaci osobám užívajícím inhibitory MAO – u těchto jedinců by již běžná porce (20 g) sýra R45 mohla vyvolat hypertenzní krizi. Vzhledem k obsahu TYR přesahujícím v okrajových částech obou sýrů R30 od 18. týdne zrání 100 mg kg-1, nelze těmto osobám ke konzumaci doporučit ani sýry R30. Uvedené skupiny jedinců by se měly dlouhozrajícím sýrům vyhýbat úplně, popř. během konzumace odstranit minimálně 2 cm okraje. Obecně lze obsah BA v sýrech omezit používáním hygienicky nezávadných surovin a dodržováním přísné hygieny během jejich zpracování, což následně vede k potlačení kontaminujících bakterií. Při použití startérových bakteriálních kultur je nutno vybírat takové kmeny, jež nejsou vybaveny dekarboxylázami. Vzhledem k rostoucím obsahům BA během zrání sýrů lze jako preventivní opatření vzniku vysokých koncentracích BA doporučit i používání kratších dob fermetace. Během následného skladování sýrů je potom nezbytné dodržovat takové podmínky, které nebudou podporovat růst dekarboxylujících mikroorganizmů, ani činnost jejich enzymů.
86
Obsah biogenních aminů i polyaminů byl ve vzorcích taveného sýra velmi nízký. Lze usuzovat, že eidamské sýry použité pro výrobu těchto tavených sýrů byly v nízkém stupni zrání. Kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem byl ve všech vzorcích TYR, koncentrace ostatních aminů byly toxikologicky nevýznamné. Pasterovaný sýr P1 překvapivě obsahoval průkazně (P<0,05) vyšší koncentrace TYR i sumy BA než déle skladovaný sýr P2. U vzorku P1 byly zjištěny i průkazně vyšší (P<0,05) celkové počty mikroorganizmů, než u sýra P2. Nelogicky vyšší obsah TYR i sumy BA u sýra P1 tak lze přisuzovat pravděpodobné kontaminaci aerobní mikroflórou během výroby tohoto sýra. U pasterovaných sýrů tak nelze vyvodit žádný závěr týkající se doby skladování. U sterilovaných tavených sýrů se s rostoucí dobou skladování zvyšoval (P<0,05) obsah TYR i sumy BA, počty stanovovaných mikroorganizmů však byly velmi nízké a rozdíly mezi jednotlivými vzorky byly statisticky nevýznamné (P>0,05). U sterilovaných sýrů skladovaných při 25 °C (S3) nebyl zjištěn rozdíl (P>0,05) v obsahu TYR ani sumy BA oproti sýrům skladovaným při 8 °C (S2). Obsahy TYR i sumy BA měly u sýrů S3 naopak tendenci být nižší. Mezi obsahy TYR, resp. sumy BA mezi pasterovanými a sterilovanými tavenými sýry skladovanými stejnou dobu nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly (P>0,05), tendenci k vyšším obsahům měly překvapivě sterilované sýry. Na základě prezentovaných výsledků se lze domnívat, že na obsah BA ve vzorcích analyzovaných tavených sýrů měly vliv i jiné faktory, než pouze způsob tepelné úpravy a rozdílná doba, resp. teplota skladování. Je vysoce pravděpodobné, že vzorky tavených sýrů pocházely z různých šarží, nikoliv pouze z jedné výrobní dávky, jak bylo deklarováno dodavatelem. Z toxikologického hlediska jsou obsahy biogenních aminů v analyzovaných tavených sýrech nevýznamné a tyto sýry lze ke konzumaci doporučit i osobám, jež by měly dbát na nízký příjem biogenních aminů (především tyraminu a histaminu) potravou (např. pacienti léčení inhibitory MAO, alergici). Z výsledků předkládané práce plyne, že analyzované tavené sýry nepředstavují z hlediska obsahu biogenních aminů riziko ani v případě dlouhodobého skladování při pokojové teplotě.
87
7 Seznam použité literatury Abeijón, M.C., Medina, R.B., Katz, M.B., Gonzýles, S.N. (2006). Technological properties of Enterococcus faecium isolated from ewe's milk and cheese with importance for flavour development. Canadian Journal of Microbiology, 52, 237-245.
Alberto, M.R., Arena, M.E., Manca de Narda, M.C. (2002). A comparative survey of two analytical methods for identification and quantification of biogenic amines. Food Control, 13, 125-129.
Anders, M. (2009). Léčiva používaná k terapii centrální nervové soustavy. In: Remedia Compendium, IV. vydání, 232-287.
Ancín-Azpilicueta, C., González-Marco, A., Jiménez-Moreno, N. (2008). Current Knowledge about the Presence of Amines in Wine. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 48, 257-275.
Andie, S., Genecelep, H., Tunetürk, Y., Köse, S. (2010). The effecto of storage temperatures and packaking methods on properties on Motal cheese. Journal of Dairy Science, 93, 849-859.
Anli, R.E., Bayram, M. (2009). Biogenic amines in wine. Food Reviews interantional, 25, 86-102.
Arena, M.E., Manca de Narda M.C. (2001). Biogenic amine production by Lactobacillus. Journal of Applied Microbiology. 90, 158-162.
Askar, A., Treptow, H. (1986). Biogene amine in Lebensmitteln. Stuttgart, Verlag Eugen Ulmer, 197.
Australia New Zealand Food Standards Code (2006). A Risk profile of Dairy Products in Australia.
Azgün, O., Schneider, E., Scheurer, R., Usleber, E., Gareis, M., Märtlbauer, E. (1999). Comparison of ELISA and HPLC for the determination of histamine in cheese. Journal of Food Chemistry, 47, 1964-1964.
Baixas-Nogueras, S., Bover-Cid, S., Veciana-Nogúes, T., Vidal-Carou, M.C. (2002). Chemical and sensory changes in Mediterranean hake (Merluccius merluccius) under refrigeration (6-8 °C) and stored in ice. Jouranl of Agriculural and Food Chemistry, 50, 6504-6510.
Baker-Austin, C., Dopson, M. (2007). Life at acid: pH homeostasis on acidophiles. Trends Microbiology, 15, 165-171.
88
Beutling, D. (1996). Biogenic amine in nutrition. Archiv für Lebensmittelhygiene, 47, 97-102.
Bjornsdottir, K., Bolton, G., McClellan-Green, E., Jaykus, L.A., Green, D.P. (2009). Detection of Gram-Negative Histamine-Producing Bacteria in Fish: A Comparative Study. Journal of Food Protection, 72, 1987-1991.
Bonetta, S., Carraro, E., Coïsson, J.D., Travaglia, F., Arlorio, M. (2008). Detection of biogenic amine producer bacteria in a typical Italian goat cheese. Journal of Food Protection, 71, 205-209.
Boutrou, R., Guéguen, M. (2005). Interests in Geotrichum candidum for cheese technology. International Journal of Food Microbiology, 102, 1-20.
Bover-Cid, S., Holzapfel, W.H. (1999). Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 53, 33-41.
Bover-Cid, S., Schoppen, S., Izquiedo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C. (1999). Relationship between biogenic amine contents and the size of dry fermented sausages. Meat Science, 51, 305-311.
Bover-Cid, S., Miguclez-Arriyado, M. J.,Becker, B., Holzapfel, W. H., VidalCarou, M.C., (2008). Amino acid decarboxylation by Lactobacilluscurvatus CTC273 affected by the pH and glucose availability. Food Microbiology, 25, 269-277.
Bover-Cid, S., Torriani, S., Gatto, T., Tofalo, R., Suzzi, G., Belletti, N., Gardini, F. (2009). Relationships between microbial population dynamics and putrescine and cadaverine accumulation during dry fermented sausage ripening. Journal of Applied Microbiology, 106, 1397-1407.
Brink, B. ten, Damink, C., Joosten H.M.L.J., Huis in´t Veld, J.H.J. (1990). Occurence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology, 11, 73-84.
Buffa M., Guanis, B. Royo, C., Trujillo, A.J. (2001). Microbiological changes throughout ripening of goat cheese made from raw, pasteurized and high-pressuretreated milk. Food Mocrobiology, 18, 45-51.
Buňková, L., Buňka, F., Mantlová, G., Čablová, A., Sedláček, I., Švec, P., Pachlová, V., Kráčmar, S. (2010). The effect of ripening and storage conditions on the distribution of tyramine, putrescine and cadaverine in Edam cheese. Food Microbiology, v tisku.
89
Carminati, D., Giraffa, G., Quiberoni, A., Binetti, A., Suárez, V., Reinheimer, V. (2010). Advanceed and trends in starter cultures for dairy fermentations. Biotechnology of lacti acid bacteria: Novel applications, cap.10, 177-192.
Coruzzi, G., Morin,i G., Adami, M., Grandi, D. (2001). Role of histamine H3 receptors in theregulation of gastric functions. Journal of Physiology and Pharmacology, 52, 539-53.
Costantini, A., Vaudano, E., Del Prete, V., Danei, M., Garcia-Moruno, E. (2009). Biogenic amine production by contaminating bacteria found in starter preparations used in winemaking. Journal of Agriculuture and Food Chemistry, 57, 10664-10669.
Cotter, P. D., Hill, C. (2003). Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH. Microbiology of Molecular Biology. 67, 429-453.
Crawford, P., Simmons M. (2006). What dietary modifications are indicated for migraines? The journal of family practice, 55, 1.
ČSN ISO 5534 (1985). Sýry a tavené sýry. Stanovené obsahu celkové sušiny (Referenční metoda)
ČSN ISO 1735 (1987). Sýry a tavené sýrové výrobky. Stanovení obsahu tuku – Vážková metoda (Referenční metoda).
Davídek, T., Davídek, J., (1995). In: Davídek, J., (Ed.). Natural Toxic Compounds of Foods. Boca Raton, Florida, CRC Press, 108-123.
De Borba, B.M., Rohrer, J.S. (2007). Determination of biogenic amines in alcoholic beverages by ion chromatography with suppressed conductivity detection and integrated pulsed amperometric detection, Journal of Chromatography A, 1155, 22-30.
De Kok, T.M.C.M., van Maanen, J.M.S. (2000). Evaluation of fecal mutagenicity and colorectal cancer risk. Mutation Rresearch-Reviews in Mutation Research, 463, 53-101.
Degheidi, M.A., Effat, B.A., Shalaby, A.R. (1992). Development of some biogenic amines during Ras cheese ripening with special reference to different starters. Proceedings of the 5th Egyptian Conference on Dairy Science Technology, Ismailia, 205-217.
Den Brinker den, Rayner, C., Kerr, M., Bryder, W.L. (2000). Biogenic amines in fish and fish products. Proceedings of the Nutrition Society Australia, 24, 227.
Dugo, G., Vilasi, F., La Torre, G.L., Pellicano, T.M. (2006). Reverse phase HPLC/DAD determination of biogenic amines as dansyl derivates in experimenatl red wines. Food Chemistry, 95, 672-676.
90
Dumont, E., De Geeter, H., Huyghebaert, A. (1992). Presence and formation of biogenic
amines
in
local
Belgian
beers.
Mededelingen
van
de
Faculteit
Landbouwwetens, University of Ghent, 57, 423-427.
Edwards, S., Sandine, W. (1981). Public health significance of amines in cheese. Journal of Dairy Science, 64, 2431-2438.
Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., Hirvi, T. (1993). Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausage. Journal of AOAC Internatonal, 76, 575-577.
Ekici, K., Coskun, H., Sienkiewicz, T. (2002). Histamine formation and its control in cheese. 1st International Congress on the Chemistry of Natural Products, Trabzon, Proceeding Book, 165-169.
El-Sayed, M.M. (1996). Biogenic amines in processed cheese available in Egypt. International Diary journal, 6, 1079-1086. Elsanhoty, R.M., Mahrous, H., Ghanaimy G.A. (2009). Chemical, microbial counts and evaluation of biogenic amines during the ripening of Egyptian soft domiati cheese made from raw and pasteurized buffaloes milk. International Journal of Diary Science, 4, 80-90.
Emborg, J., Dalgaard, P. (2008). Modelling the effect of temperature, carbon dioxide, water
activity
and
pH
on
growth
and
histamine
formation
on
Morganellapsychrotolerans. International Journal of Food Microbiology, 128, 226233.
Engel, E., Tournier, C., Salles, C., Le Quéré, J.L. (2005). Evolution of the composition of a selected bitter Camembert cheese during ripening, release and migration of taste-active compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2940-2947.
ESR (2001). Scombroid (histamine) poisoning. Ministry of Health, New Zealand, 1-3. Ettlerová, K., Kohout, P. (2000). Diagnostické možnosti potravinové alergie a intolerance. Alergie, 3, 190-196.
Farombi, O.E. (2004). Diet-related cancer and prevention using anticancerogens. African Journal of Biotechnology, 3, 12-16.
Fernandes, J.O., Ferreira, M.A. (2000). Combined ion-pair extraction and gas chromatography–mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines, polyamines and aromatic amines in Port wine and grape juice. Journal of Chromatography A, 886, 183-189. 91
Fernández-García, E., Tomillo, J., Nunez, M., (2000). Formation of biogenic amines in raw milk Hispánico cheese manufactured with proteinases and different levels of starter culture. Journal of Food Protection, 63, 1551-1555.
Fernández, M., Linares, D. M., Rodriguez, A.,Alvarez, M. A., (2007). Factors affecting tyramine production in Enterococcus durans IPLA 655. Applied Microbiology and Biotechnology, 73, 1400-1406.
Fontecha J., Peláez, C., Juárez, M., Requena, T., Gómez, C. (1990). Biochemical and microbiological characteristics of Artisanal hard goat´s cheese. Journal of Dairy Science, 73, 1150-1157.
Forbes, T.D.A., Pemberton, I.J., Smith, G.R., Hensarling, C.M., Toleson, D.R. (1995). Seasonal production of phenolic amines by Acacia berlandieri. Texas Agricultural Experiment, PR-4785.
Forshell, T.P., Rimpi, S., Nillson, J.A. (2010). Chemoprevention of B-Cell lymphomas by Inhibition of the Myc target spermidine synthase. Cancer Prevention Research, 3, 140-147.
Foulquié-Moreno, M.R., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vyust, L. (2006). The role and application of enterococci in food and health. International Journal of Food Microbiology, 106, 1-24.
Franz, C.M.A.P., van Belkum, M.J., Holzapfel, W.H., Abriouel, H., Gálvez, A. (2007). Diversity of enterococcal bacteriocins and their grouping into a new classification scheme. FEMS Microbiologicy Reviews, 31, 293-310.
Franz, C., M.A.P., Stiles, M.E., Schleifer, K.H., Holzapfel, W.H. (2003). Enterococci in foods – a conundrum for food safety. International Journal of Food Microbiology, 88, 105-122.
Fujisava, S., Kadoma, Y. (2005). Kinetic evaluation of polyamines as radical scavengers. Anticancer Research, 25, 965-969.
Galgano, F., Suzzi, G., Favati, F., Caruso, M, Martuscelli, M., Gardini, F., Salzano, G. (2001). Biogenic amines during ripening in 'Semicotto Caprino' cheese: role of enterococci. Inernational Journal of Food Science and Technology, 36, 123-160.
Gardini, F., Martuscelli, M., Caruso, M.C., Galgano, F., Crudele, M.A., Favati, F., Guerzoni, M.E., Suzzi, G. (2001). Effects of pH, temperature and NaCl concentration on growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of Enterococcus faecalis. International Journal of Food Microbiology, 64, 105-117.
92
Gardini, F. Tofalo, R., Belleti, N., Iucci, L., Suzzi, G., Torriani, S., Guerzoni, M.E., Lanciotti, R. (2006). Characterization of yeasts involved in the ripening of the Pecorino Crotonese cheese. Food Microbiology, 23, 641-648.
Gennaro, M.C., Gianotti, V., Marengo, E., Pattono, D., Turi, R.M. (2003). A chemometric investigation of the effect of the cheese-making process on contents of biogenic amines in a semi-hard Italian cheese (Toma). Food Chemistry, 82, 545-551.
Gerner, E.W. (2010). Cancer chemoprevention locks onto a new polyamine. Cancer Prevention Research, 3, 125-127.
Gianotti, V.U., Chiuminatto, U.,
Mazzucco, E., Gosetti, F., Bottaro, M.,
Frascarolo., P., Gennaro, M.C. (2008). A new hydrophilic interaction liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of seven biogenic amines in cheese, Journal of Chromatography A, 1185, 296-300.
Gil-Agusti, M., Carda-Broch, S., Monferrer-Pons, L., Esteve-Romero, J. (2007). Simultaneous determination of tyramine and tryptamine and their precursor amino acids by micellar liquid chromatography and pulsed amperometric detection in wines, Journal of Chromatography A, 1156, 288-295.
Giraffa, G., Pepe, G., Locci, F., Neviani, E., Carminati, D. (1995). Haemolytic activity, production of thermonuclease and biogenic amines by dairy enterococci. Italian Journal of Food Science, 4, 341-349.
Giuffrida, D., Ziino, M., Verzera, A., Condurso, C., Romeo, V. (2006). Biogenic amines in typical “pasta filata“ Italian cheese. Acta alimentaria, 35, 435-443.
Gosetti, F., Mazzucco, E., Gianotti, V., Polati, S., Gennaro., M.C. (2007). High performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of biogenic amines in typical Piedmont cheeses. Journal of Chromatography A, 1149, 151157.
Grattepanche, F., Miescher-Schwenninger, S., Meile, L., Lacroix, C. (2008). Recent developments in cheese cultures with protective and probiotic functionalities. Dairy Science Technology, 88, 421-444.
Greif, G., Greifová, M, Dvoran, J., Karovičová, J., Buchtová, V. (1999). Štúdium rastu a produkcie biogénnych aminóv nektorými mikroorganizmami za modelových podmínek. Czech Jounal of Food Science, 17, 15-21.
Greifová, M., Greif, G, Novorolníková, B., Kubová, A. (2003). Biogénne amíny v mliečnych výrobkoch a ich tvorba enterokokami. Mliekarstvo, 4, 31-33.
93
Gugliucci A. (2004). Polyamines as clinical laboratory tools. Clinica Chimica Acta, 344, 23-35.
Halász, A., Baráth, Á., Simon-Sarkadi, L., Holzapfel, W. (1994). Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends in Food Science and technology. 5, 42-49.
Hillary, R.A., Pegg, A.E. (2003). Decarboxylases involved in polamine biosynthesis and their inactivation by nitric oxide. Biochimica et Biophysica Acta, 1647, 161-166.
Holzhammer, J., Wöber, C. (2005). Alimentäre Triggerfaktoren bei Migräne und Kopfschmerz vom Spannungstyp. Der Schmerz, 20, 151-159.
Hungerford, J.M. (2010). Scombroid poisoning: A review. Toxicon, 56, 2, 231-243. Chander H., Batish V.H., Babu, S. (1989). Factors affecting amine production by a selected strain of Lactobacillus bulgaricus. Journal of Food Science, 54, 940-942.
Chen, C.M., Lin, L.C., yen, G.G. (1994). Relationship between changes in biogenic amine contents and freshness of pork during storage at different temperatures. Juornal o fthe Chinese Agricultural Chemical, Society, 32, 47-60.
Innocente, N., D´Agostin, P. (2002). Formation of biogenic amines in a typical semihard Italian cheese. Journal of Food Protection, 65, 1498–1501.
Innocente, N., Biasutti, M., Padovese, M., Moret, S. (2007). Determination of biogenic amines in cheese using HPLC technique and direct derivatization of acid extract. Food Chemistry, 110, 1285-1289.
Ivanova, I., Iliev I. (2009). The impact of lactic acid bacteria isolated from traditional Bulgarian milk products and food safety. Ecologica, 16, 37-46.
Izquierdo-Pulido, M., Hernández-Jover, T., Mariné-Font, A., Vidal-Carou, M.C. (1996). Biogenic amines in European beers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 3159-3163.
Izqueirdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C., Mariné-Font, A. (1993). Determination of biogenic amines in beers and their raw materials by ion-pair liquid chromatography with postcolum derivatization. Journal of AOAC International, 76, 1027-1032.
Jansen, S.C., van Dusseldorp, M., Bottema, K.C., Dubois, A.E. (2003). Intolerance to dietary biogenic amines: a review. An Allergy Asthma Immunolgy, 91, 233-240.
Jones, S. M., Yerly, J., Hu, Y., Ceri, H., Martinuzzi, R. (2007). Structure of Proteus mirabilis biofilms grown in artificial urine and standard laboratory media. FEMS Microbiological Letters, 268,16 – 21.
94
Joosten, H.M.L.J. (1987). Conditions allowing the formation of biogenic amines in cheese. 3. Factors influencing the amounts formed. Netherland Milk Dairy, 41, 239357.
Joosten, H.M.L.J. (1988). The biogenic amine contents of Dutch cheese and their toxicological significance. Netherland Milk Dairy, 42, 25-42.
Joosten, H. M. L. J., and M. Nuñez. (1996). Prevention of histamine formation in cheese by bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Aplpied Environmental Microbiology,. 62, 1178–1181.
Kalač, P., Hlavatá, V., Křížek, M. (1997). Concentration of five biogenic amines in Czech beers and factors affecting their formation. Food Chemistry, 58, 209-214.
Kalač, P., Krausová, P. (2005). A review of dietary polyamines: Formation, implications for growth and health and occurence in foods. Food Chem., 90, 219-230.
Kalač, P., Křížek, M. (2002). Biogenní aminy a polyaminy v potravinách. Výživa a potraviny, 57, 12–13.
Kalač, P., Křížek, M. (2005). Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Potravinářská revue, 2, 40-45.
Kalač, P., Křížek, M., Pelikánová, T., Langová, M., Veškrna, O. (2005). Contents of polyamines in selected foods. Food Chemistry, 90, 561-564.
Karmas, E. (1981). Biogenic amines as indicators of seafood freshness. Food Science Technology, 17, 20-23.
King, W., McCargar, L., Joneja, J.M., Ibarr, S. (2000). Benefits of histaminereducing diet for some patients with chronic urticaria and angioedema. Canadian Journal of Dietetic Practice and Research, 1, 24-26.
Klaenhammer, T, van Leuvenhook A. (2002). Ed. Kluwer Academy Publishers, Discovering Lactic acid bacteria by genomics. 82, 29-58.
Kolesárová, E. (1995). Výskyt a vznik biogénnych amínov v potravinách. Bulletin PV (Bratislava), 3-4, 109-122.
Komprda, T., Burdychová, R., Dohnal, V., Cwiková, O., Sládková, P., Dvořáčková, H. (2008a). Tyramine production in Dutch-type semihard cheese from two different producers. Food Microbiology, 25, 219-227.
Komprda, T., Burdychová, R., Dohnal, V., Cwiková, O., Sládková, P. (2008b). Some factors influencing biogenic amines and polyamines content in Dutch-type semihard cheese. Europian Food Research Technology, 227, 29-36.
95
Komprda, T., Dohnal, V. (2009). Amines. In: Taylor&Francis, Handbook of Dairy Food Analysis, 865-882.
Komprda, T., Sládková, P., Dohnal, V. (2009).
Biogenic amine content in dry
fermented sausages as influenced by a producer, spice mix, starter culture, sausage diameter and time of ripening. Meat Science, 83, 534-542.
Komprda, T., Dohnal, V., Závodníková, R. (2008c). Contents of some biologically active amines in a Czech blue-vein cheese, Czech J. Food, 26, 428-440.
Komprda, T., Smělá, D, Pechová, P, Kalhotka, L., Štencl, J., Klejdus, B. (2004). Effect of starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausage. Meat Science, 67, 607-616.
Krausová, P., Kalač, P., Křížek, M., Pelikánová, T. (2006). Content of biologically active polyamines in livers of cattle, pigs and chickens after animal slaughetr. Meat Science, 73, 640-644.
Křížek, M., Kalač, P. (1998). Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě. Czech Journal of Food Science, 4, 151-159.
Křížek, M., Pavlíček, T., Vácha, F. (2002). Formation of selected biogenic amines in carp meat. Journal of the Science of Food and Agriculture, 82, 1088-1093.
Kung, H.F., Tsai, Y.H., Hwang, Ch.Ch., Lee, Y.H., Hwang, J.H., wei, Ch.I., Hwang, D.F. (2005). Hygienic quality and incidence of histamine-forming Lactobacillus species in natural and processed cheese in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis, 1, 51-56.
Kusano, T., Berberich, T., Tateda, C., Takahashi, Y. (2008). Polyamines: essential factors for growth and survival. Planta, 228, 367-381.
Kvasnička, F. and Voldřich, M. (2006). Determination of biogenic amines by capillary
zone
electrophoresis
with
conductometric
detection.
Journal
of
Chromatography A 1103, 145-149.
Ladero, V., Calles, M., Fernandez M., Alvarez A.M. (2010a). Toxicological effects of dietary biogenic aminesCurrent Nutrition and Food Science, 6, 2, 145-156.
Ladeero, V., Fernández, M., Cuesta, I., Alvarez, M.A. (2010b). Quantitative detection and identification of tyramine-priducing enterococci and lactobacilli in cheese by multiplex qPCR. Food Microbiology, v tisku.
Lanciotti, R., Patrignani, F., Lucci, L., Guerzoni, M.E., Suzzi, G., Belletti, N., Gardini, F. (2007). Effects of milk high pressure homogenization on biogenic amine
96
accumulation during ripening of ovine and bovine Italian cheeses, Food Chemistry, 104, 693-701.
Landete, J. M., Ferrer, S., Pardo, I. (2007). Biogenic amine production by lactic acid bacteria, acetic bacteria and yeast isolated from wine. Food Control, 18, 1569-1574.
Larque, E, Sabater-Molina, M., Zamora, S. (2007). Biological significance of dietary polyamines. Nutrition, 23:87–95.
Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., Vidal-Carou, M.C. (2010). Technological conditions influence aminogenesis during spontaneous sausage fermentation. Meat Science, 85, 537-541.
Lehane, L., Olley, J. (2000). Histamine fish poisoning revisted. International Journal of Food Microbiology, 58, 1-37.
Leira, R., Rodriguez, R. (1996). Diet and migraine. Revista de Neurologia, 129, 534-538.
Leuschner, R.G.K, Hammes, W.P. (1998). Degradation of histamine and tyramine by Brevibacterium linens durin surface ripening of Munster cheese. Journal of Food Protection, 7, 874-878.
Leuschner, R.G.K, Hammes, W.P., Heidel, M.
(1998). Histamine and tyramine
degradation by food fermeting microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 39, 1-10.
Lozanov, V., Benkova, B., Mateva, L., Petrov, S., Popov, E., Slavov, Ch., Mitev, V. (2007). Liquid chromatography method for simultaneous analysis of amino acids and biogenic amines in biological fluids with simultaneous gradient of pH and acetonitrile, Journal of Chromatography B, 860, 92-97.
Lucas, P. M., Blancato, V. S., Claisse, O., Magni, C., Lolkema, J. S., LonvaudFunel, A. (2007). Agmatine deiminase pathway genes in Lactobacillus brevis are linked to the tyrosine decarboxylation operon in a putative acid resistance locus. Microbiology 153, 2221-2230.
Lukášová, J. (2004). Význam mikrobiologie pro zajištění zdravotní nezávadnosti a jakostipotravin.
Veterinářství,
www.vetweb.cz/projekt/clanek.asp?pid=2&cid=3482,
staženo 18.4.2010.
Lyte, M. (2004). The biogenic amine tyramine modulates the adherence of Escherichia coli O157:H7 to intestinal mucosa. Journal of Food Protection, 67, 878-83.
97
Maijala, R.L., Eerola, S.H., Aho, M.A. & Hirn, J.A. (1993). The effect of GDLinduced pH decrease on the formation of biogenic amines in meat. Jornal of Food Protection, 56, 125-129.
Maijala, R. (1994). Histamine and tyramine production by a Lactobacillus strain subjected to external pH decrease. Journal of Food Protection, 57, 259-262.
Maintz, L., Nowak N. (2007). Histamine and histamine intolerance. American Journal of Clinical Nutrition, 85, 1185-1196.
Marques, A.P., Leitão, M.C., San Romão, M.V. (2008). Biogenic amines in wines: Influence of oenological factors. Food Chemistry, 107, 2, 853-860.
Martelli, A., Arlorio, M., Tourn, M.L. (1993). Determination of amines and precursors amino acids in Gorgonzola cheese by ion-pair HPLC without derivatization. La Rivista di scienza dell'alimentazione, 21, 261-270.
Martuscelli, M., Gardini, F., Torriani, S. Mastrocola, D., Serio, A., Chaves-López, C., Schirone, M., Suzzi, G. (2005). Production of biogenic amines during the ripening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal, 15, 571-578.
Maxa, E., Brandes, W. (1993). Biogenie Amine in Fruchtsäften. Mitteil. Klosterneuburg, 43, 101-106.
McCabe, B.J. (1986). Dietary tyramine and other pressor amines in MAOI regimes: a review. Journal of American Diet Associacione, 86(8), 1059-1064.
McCabe-Sellers, B., Staggs, C.G., Bogle, M.L. (2006). Tyramine in foods and monoamine oxidase inhibitor drugs: A crossroad where medicine, nutrtition, pharmacy, and food industry converge. Journal of Food Composition and Analysis, 19, 58-65.
Mohamed, G.G., El-Hameed, A.K.A., El-Din, E.M.N., El-Din, L.A.M.M.N. (2009). High
performance
liquid
chromatography,
thin
layer
chromatography
and
spectrophotometric studies on the removal of biogenic amines from some Egyptian foods using organic, inorganic and natural compounds. The Journal of Toxicological Sciences, 35, 176-187.
Moret, S., Conte, L.S. (1996). High-performance liquid chromatographic evaluation of biogenic amines in foods. An analysis of different methods of samples preparation in relation to food characteristics. Journal of Chromatography A, 729, 363-369.
Moret, S., Smělá, D., Populin, T., Conte, L.S. (2005). A survey of free biogenic amine content of fresh and preserved vegetables. Food Chemistry, 89, 355-361.
Naryan, S.S., Jalgaonkar, S., Shanani, S., Kulkarni, V.R. (2010). Probiotics: current trends in the treatment of diarrhoea. Hong Kong Medicinal Journal, 16, 213-218. 98
Németh-Szerdahelyi, L., Freundreich, P., Fischer, K. (1993). Studies on biogenic amine contents in pork. Fleischwirtschaft, 73, 789-790.
Nout, M.J.R. (1994). Fermented foods and food safety. Food Research International, 27, 291-298.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M.T., Izquerdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C. (2003). Distribution of biogenic amines and polyamines in cheese. Journal of Food Science, 68, 750-755.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, Saldo, J., Vidal-Carou, M.C. (2002b). Effects of high hydrostatic pressure treatments on biogenic amine contents in goat cheese during ripening. Journal if Food Chemistry, 50, 7288-7292.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M.T., Trujillo-Mesa, A.J., Vidal-Carou, M.C. (2002a). Profile of biogenic amines in goat cheese made from pasteurized and pressuirized milks. Journal of Food Science, 67, 2940-2944.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M.T., Roig-Sagués, A.X., Trujillo-Mesa, A.J., Vidal-Carou, M.C. (2004a). Evaluation of biogenic amines and microbial counts throughout the ripening of goat cheese from pasteurized and raw milk. Journal of Dairy Research, 71, 245-252.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, M.T., Roig-Sagués, A.X., Trujillo-Mesa, A.J., Vidal-Carou, M.C. (2004b). Comparison of biogenic amine profile in cheese manufactured from fresh and stored (4°C, 48 hours) raw goat´s milk. Journal of Food Protection, 67, 110-116.
Novella-Rodríguez, S., Veciana-Nogués, Vidal-Carou, M.C. (2000). Biogenic amines and polyamines in milks and cheeses by ion-pair liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 5117-5123.
Ntzimani, A.G., Paleologos, E.K., Savvaidis, I.N., Kontominas, M.G. (2008). Formation of biogenic amines and relation to microbial flora and sensory changes in smoked turkey breast fillets stored under various packaging conditions at 4 °C. Food Microbiology, 25, 509-517.
Ogier, J.C., Serror, P. (2008). Safety assessments on of dairy microorganisms: The Enterococcus genus. International Journal of Food Microbiology, 126, 291-301.
Oguri, S., Oga, C., and Takeda, H. (2007). Micro-magnetic particles frit for capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A 1157, 304-308.
Önal, A. (2010). Current Status of Polyamine and Polyamine Analogs Analysis in Cancer Research. Criticapacl Rewievs in Analytical Chemistry, 40, 20, 60-67. 99
Ordóñez, A.I., Ibénez, F.C., Torre, P., Barcina, Y. (1997). Formation of biogenic amines in Idiazábal ewe´s-milk cheese: effect of ripening, pasteurization, and starter. Journal of Food Protection, 11, 1371-1375.
Park, J.S., Lee, CH.H., Kwon, E.Y., Lee, H.J., Kim, J.Y., Kim, S.H. (2010). Monitoring the contents of biogenic amines in fish and fish products consumed in Korea. Food control, 21, 1219-1226.
Pereira, C. I., Matos, D.,. San Romão, M. V., Barreto Crespo, M.T. (2009). Dual role for the tyrosine decarboxylation pathway in Enterococcus faecium E17: Response to an acid challenge and generation of a proton motive force. Applied Environmental Microbiology, 75,345–352.
Pe´rez-Cano, F.J., lez-Castro, A.G., Castellote, C., Franch, A., Castell, M. (2010). Influence of breast milk polyamines on suckling rat immune system maturation. Developmental and Comparative Immunology, 34, 210-218.
Pessione, E., Pessione, A., Lamberti, C., Coïsson, D.J., Riedel, K., Mazzoli, R., Bonetta, S., Eberl, L., Giunta, C. (2009). First evidence of a membrane-bound, tyramine and phenylethylamine producing, tyrosine decarboxylase in Enterococcus faecalis: A two-dimensional electrophoresis proteomic study. Protomics, 9, 10, 2695-2710.
Peñaz, E., Frias, J., Sidro, B., Vidal-Valverde, C. (2010). Impact of fermentation conditions and refrigerated storage on microbial quality and biogenic amine content of sauerkraut. Food Chemistry, 123, 143-150.
Petridis K.D., Steinhert, H. (1996). Biogene Amine in der Hart-käse-Produktion: II. Stufenkontroll-Studie einer standardisierten Emmentalerkäse-Produktion. Deutshe lebensmi-Rundsch, 5, 142-146.
Peulen, O., Deloyer, P., Deville C., Dandrifosse, G. (2004). Polyamines in gut iflammation and allergy. Current Medicinal Chemistry, 3, 1-8.
Pinho, O., Ferreira, I.M., Mendes, E., Oliviera, B.M., Ferreira, M. (2001). Effect of temperature on evaluation of free amini acid and biogenic amine contents during storage of Azeitao cheese. Food Chemistry, 75, 287-291.
Pinho, O., Pintado A.I.E., Gomes, A.M.P., Pintado M.M.E., Malcata F.X., Ferreira, I.M. (2004). Interrelationships among microbiological, physicochemical, and biochemical properties of Terrincho cheese, with emphasis on biogenic amines. Journal of Food Protection, 12, 2779-2785.
100
Premont, R.T, Gainetdinov, R.R, Caron, M.G. (2001). Following the trace of elusive amines. Proceedings of the National Academy of Sciencis of the United States of America. 98, 9474-5.
Rauscher-Gabernig, E., Grossgut, R., Bauer, F., Paulsen, P. (2009). Assessment of alimentary histamine of consumers in Austria and development of tolerable levels in typical foods. Food Control, 20, 423-429.
Rea, M.C., Franz, C.M.A.P., Holzapfel, W.H., Cogan, T.M. (2004). Development of enterococci and production of tyramine during the manufacture and ripening of Cheddar cheese. Irish Journal of Agricultural and Food Research, 43, 247-258.
Rodríguez-Jerez, J. J. Giaccone, V. Colavita, G. Parisi, E. (1994). Bacillus macerans - a new potent histamine producing micro-organism isolated from Italian cheese. Food Microbiology, 11, 409-412.
Roig-Sagués, A.X., Molina, A.P., Hernández-Herrero, M.M. (2002). Histamine and tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheesees. Europian Food and Research Technology, 215, 96-100.
Saccani, G., Tanzi, E., Pastore, P., Cavalli, S., Rey, M. (2005). Determination of biogenic amines in fresh and processed meat by suppressed ion chromatography-mass spectrmetry using a cation-exchange column. Journal of Chromatography A, 1082, 43-50.
Sagun, E., Ekici, K., Durmaz, H. (2005). The forming of histamine in herby cheese during ripening. Journal of Food Quality, 28, 171-176.
Saldo, J., Seandra E., Guamis, B. (2000). High hydrostatic pressure for accelerating ripening of goat´s milk cheese. Proteolysis and texture. Journal of Food Science, 65, 636-640.
Sandler, M., Youdim, M.B., Hanington, E. (1974). E phenylethylamin oxydising defect in migraine. Nature, 250, 335-337.
Sato, T., Horiuchi, T., Nishimura, I. (2005). Simple and rapid determination of histamine in food using a new histamine dehydrogenase from Rhizobium sp. Analytical Biochemistry, 346, 320-326.
Schievano, E., Guardini, K., Mammi, S. (2009). Fast determination of histamine in cheese by nuclear magnetic resonance. J.Agri. Food Chemistry, 57, 2647-2652.
Schneller, R., Good, P., Jenny, M. (1997). Influence of pasteurized milk, raw milk and different ripening cultures on biogenic amine concentrations in semi-soft cheeses during ripening. Zeitchrift für Lebensmitteln Untersuchung und Forschung A, 204, 265-272. 101
Seiler, N. (1992). The role of polyamines in cell biology. Chemistry of the Living Cel; Bittar, E.E., JAI Press: Greenwich, CT.
Seiler, N. (2003a). Thirty years of polyamines-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. 1. Selective enzyme inhibitors. Current Drug Targets. 4, 537564.
Seiler, N. (2003b). Thirty years of polyamines-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. 2. Structural analogues and derivatives. Current Drug Targets. 4, 565-585.
Settani, L., Moschetti, G. (2010). Non starter lactic acid bacteria used to improve cheese quality and provide health benefits. Food Microbiology, v tisku.
Shah, P, Swiatlo, E. (2008). A multifaceted role for polyamines in bacterial pathogens. Molecular Microbiology, 68, 4-16.
Shakila, R.J., Vasundhara, t.S., Kumudavally, K.V. (2001). A comparison of the TLC-densitometry and HPLC method for the determination of biogenic amines in ish and fishery products. Food Chemistry, 75, 255-259.
Shalaby Ali, R. (1996). Significance of biogenic amines to food safety and human health, Food Research International. 7, 675-690.
Shukla, S., Park, H.K., Kim, J.K., Kim, M. (2010). Determination of biogenic amines in Korean traditional fermented soybean paste (Doejang). Food and Chemical Toxicology, 48, 1191-1195.
Silla-Santos, M.H. (1996). Biogenic amines: their importance in foods. International Journal of Food Microbiology, 29, 213-231.
Simon-Sarkadi, L., Holzapfel, W.L., Halász, A. (1994). Biogenic amine content and microbial contamination of leafy vegetables during storage at 5 °C. Journal of Food Biochemistry, 17, 407-418.
Sims, G.G., Fran, G., York, R.K. (1992). Quality indices for canned skipjack tuna: correlation of sensory attributes with chemical indices. Journal of Food Science, 57, 1112-1115.
Smith, C.K., Durrack, D.T. (1978). Isoniazid and reaction to cheese. Annual Internal medicine, 88, 520-523.
Smith, J.S., Kenney, P.B., Kastner, C.L., Moore, M.M. (1993). Biogenic amine formation in fresh vacuum-packaged beef during storage at 1 °C for 120 days. Journal of Food Protection, 56, 497-500.
102
Smith, G., Smit, B.A., Engels, W.J.M. (2005). Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiology Reviews, 29, 591-610.
Spanjer, M.C., Van Roode, B.A.S.W. (1991). Towards a regulatory limit for biogenic amines in fish, cheese, and sauerkraut. De Ware(n)-Chemicus, 21, 139-167.
Spreer, E. (1998). Cheese manufacture. In: Milk and dairy product technology, 248294.
Standara, S., Veselá, M., Drdák, M. (2000). Determination of biogenic amines in cheese by ion exchange chromatography. Nahrung, 44(1), 28-31.
Standarová, E., Borkovcová, I., Vorlová, L. (2008). Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě. Veterinářství, 58, 735-739.
Standarová, E., Vorlová, L., Borkovcová, I. (2009a). Zastoupení vybraných biogenních aminů v sýrech s bílou plísní na povrchu. Acta fytotechnica et zootechnica, Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitrae, 610-617.
Standarová, E., Vorlová, L., Borkovcová, I. (2009b). Effect of some factors on the biogenic amines and polyamines content in blue-veined cheese Niva. Czech Journal of Food Science, 27, 56-60.
Standarová, E.,Vorlová, L., Kordiovská, P., Janštová, P., Dračková, M., Borkovcová, I. (2010). Biogenic amine production in Olomouc curd cheese (Olomoucké tvarůžky) at various storage conditions. Acta Veterinariae Brno, 79, 147–156.
Stratton, J.E., Hutkins, W.R., Sumner, S.S., Taylor, S.L. (1992). Histamine and histamine-producing bacteria in retail Swiss and low-salt cheeses. Journal of Food Protection, 55, 165-173.
Stratton, J.E., Hutkins, W.R., Taylor, S.L. (1991). Biogenic amines in cheese and other fermented foods. A review. Journal of Food Protection, 54, 460-470.
Straub, B.W., Kicherer, M., Schilcher, S.M., Hammes W.P. (1995). The formation of biogenic amines by fermentation organisms.
Zeitschrift für Lebensmittel-
Unterschung und-Forschung, 201, 79-82.
Sumner, S.S., Roche, F., Taylor. (1990). Factors controlling histamine production in Swiss cheese inoculated with Lactobacillus buchneri. Journal of Dairy Science, 73, 3050-3058.
103
Sun, X., Yang, X., and Wang, E. (2003). Determination of biogenic amines by capillary
electrophoresis
with
pulsed
amperometric
detection.
Journal
of
Chromatography A, 1005, 189-195.
Suzzi, G., Caruso, M., Gardini, M., Lombardi, A., Vannini, L., Guerzoni, M.E., Andrighetto, C., Lanorte, M.T. (2000). A survey of the enterococci isolated from the artisanal Italian goat´s cheese. Journal of Applied Microbiology, 89, 267-274.
Suzzi, G., Gardini, F. (2003). Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. International Journal of Food Microbiology, 88, 41-54.
Špinar, B., Kellner, V., Čulík, J. (1991). Histamín vo víne a v pive. In: Zborník z XV. Celoštátnej konferencie zo zahraničnou účasťou. Cuzorodé látky v poživatinách, Starý Smokovec.
Taylor, S.L. (1986). Histamine food poisoning: Toxicology and clinical aspects. Crit. Rev. Toxicology. 17, 91-128.
Teodorović, v., Buncić, S., Smiljanić, D. (1994). A study of factor influencing histamine producing in meat. Fleischwirtschaft, 74, 181-183.
Tornadijo M.E., Fresno, M.J., Sarmiento, J.M., Carballo, J. (1998). Study of the yeasts during ripening process of Armada cheeses from raw goat´s milk. Le Lait, 78, 647-659.
Trujillo, A.J., Capellas, M., Buffa M., Royo, C., Gervilla , R., Felipe, X., Sendra, E., Saldo, J., ferragut, V., Guarnis, B. (2000). Application of high preassure treatment for cheese production. International Food Research, 34, 311-316.
Tsai, Y.H., Kung, H.F., Chang, S.C., Lee, T.M:, Wei, C.I. (2006a). Histamine formation by histamine-forming bacteriain douchi, a Chinese traditional fermented soybean product. Food Chemistry, 103, 1305-1311.
Tsai, Y.H., Lin, C.Y., Chien, L.T., Lee, T.M., Wei, C.I. and Hwang, D.F. (2006b). Histamine contents of fermented fish products in Taiwan and isolation of histamineforming bacteria. Food Chemistry, 98, 64-70.
Vale, S.R., Glória, M.B. (1997a). Determination of Biogenic Amines in Cheese. Journal of AOAC International, 5, 1006-1012.
Vale, S.R., Glória, M.B. (1997b). Biogenic amines in Brazilian cheeses. Food Chemistry, 63, 343-348.
Valenzuela, A.S., Omar, N.B., Abriouel, H., López, R.L., Veljovic, K., Canamero, M.M:, Topisirovic, M.K.K:, Gálvez, A. (2009). Virulence factors, antibiotic
104
resistance, and bacteriocinic in enterococci from artisan foods of animal origin. Food Control, 20, 381-385.
Valero, D., Martinez, D., Riquelme, F., Serrano, M. (1998). Polyamine response to external mechanical bruising in two mandarin cultivars. Hortscience, 33, 1220-1223.
Valsamaki, K., Michaelidou, A., Polychroniadou, A. (2000). Biogenic amines production in Feta cheese. Food Chemistry, 71, 259-266.
Vlieg-Boerstra, B.J., van der Heide, S., Oude Elberink, J.N.G., Kluin-Nelemans, J.C., Dubois, A.E.J. (2005). Mastocystis and adverse reactions to biogenic amines andhistamine-releasing foods: what is the evidence? Netherlands Journal of Medicine. 63, 7-13.
Wantke, F., Gotz, M., Jarisch, R. (1993). Histamine free-diet. Treatment of choice for histamine-induced food intolerance and supporting traetment for chronic headaches. Clinical Experimenatl Allergy, 23, 971-972.
Weiss, T.S., Herfarth, H., Obermeier, F., Ouart,J., Vogl. D., Scholmerich, J., Jauch, K.W., Rogler, G. (2004). Intracellular polyamine levels of intestinal epithelial cells in inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases, 10, 529-535.
Westfall, T.C., Westfall, D.P. (2006). Adrenergic agonists and antagonists. In: Brunton, L.L., Lazo, J.S., Parker, K.L., Buxton, I.L.O., Blumenthal, D., eds. Goodman
& Gilamn´sThe Pharmacological Basis of Therapeutics. 11th ed.New York, Mc Grave Hill, 237-295.
Wilson Gratz, S., Mykkanen, H., El-Nezami, H.S. (2010). Probiotics and gut health: A special focus on liver diseases. World Journal of gastroeneterology, 16, 403-410.
Wolken, W. A. M., Lucas, P., Lonvaud-Funel, A., Lolkema, J. S. (2006). The mechanism of the tyrosine transporter TyrP supports a proton motive tyrosine decarboxylation pathway in Lactobacillus brevis. Journal of Bacteriology, 188, 2198-2206.
Wöhrl, S., Hemme,r W., Focke, M., Rappersberger, K., Jarisch, R. (2004). Histamine intolerance-like symptoms in healthy volunteers after oral provocation with liquid histamine. Allergy Asthma Proc,; 25, 305–11.
Yongmei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Xin, L., Rahman, N., Mingsheng, D. (2009). Biogenic amines in Chinese soy sauce. Food Control, 20, 593-597.
105
8 Přílohy
106
Seznam obrázků Obrázek 1. Přehled nejvýznamnějších biogenních aminů vyskytujících se v potravinách
Obrázek 2. Nejběžnější způsob vzniku biogenních aminů
Obrázek 3. Schéma vzniku polyaminů (Hillary, Pegg, 2003)
Obrázek 4. Nárůst obsahu tyraminu během zrání středových částí sýra R30 a R45
Obrázek 5. Počty mikroorganizmů 8., 18. a 22. den zrání sýra R45
Obrázek 6. Rozdíly v obsahu tyraminu mezi 8. a 18. týdnem zrání ve středových částech sýrů R30 a R45
Obrázek 7. Pokles koncentrace sperminu v průběhu zrání R30-FD a R45 sýra
Obrázek 8. Rozdíly v obsahu tyraminu a sumy BA mezi středovou a okrajovou částí na počátku zrání sýra R30-FD a R30-CH (4.týden)
Obrázek 9. Rozdíly v obsahu tyraminu a sumy BA mezi středovými a okrajovými částmi na konci zrání sýra R30-FD a R30-CH (26.týden)
Obrázek 10. Počty mikroorganizmů ve středových a okrajových částech sýra R30-FD a R30-CH na počátku zrání (4.týden)
Obrázek 11. Počty mikroorganizmů ve středových a okrajových částech R30-FD a R30-CH sýra na konci zrání (26.týden)
Obrázek 12. Počet anaerobů ve středových a okrajových částech R30-FD a R30-CH sýra v průběhu celé doby zrání (4. – 26. týden)
107
Obrázek 13. Rozdíly v obsahu tyraminu mezi vzorky středových částí sýra dvou různých výrobců 8. a 18. den zrání
Obrázek 14. Rozdíly v obsahu sumy biogenních aminů a sumy polyaminů mezi vzorky sýra dvou různých výrobců (R30 a R45) 22. den zrání
Obrázek 15. Počty BMK v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden)
Obrázek 16. Počty anaerobních mikroorganizmů v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden)
Obrázek 17. Celkový počet mikroorganizmů v průběhu zrání středových částí sýrů R30 a R45 (4. – 22.týden)
Obrázek 18. Suma biogenních aminů (tryptamin, fenylethylamin, histamin, tyramin, putrscin, kadaverin, spermidin, spermin) a polyaminů (putrescin, spermidin, spermin) ve vzorcích tavených sýrů
Obrázek 19. Porovnání tavených a zrajících sýrů ohledně obsahu tyraminu, histaminu, resp. sumy biogenních aminů (tryptamin, fenylethylamin, histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, spermidin, spermin) 22. týden skladování/zrání
108
Seznam tabulek Tabulka 1. Obsah tyraminu a histaminu ve vybraných skupinách potravin (VliegBoerstra et al., 2005)
Tabulka 2. Přehled kvantitativně významných biogenních aminů v různých typech sýra (Komprda a Dohnal, 2010).
Tabulka 3. Charakteristika analyzovaných vzorků přírodních zrajících sýrů
Tabulka 4. Charakteristika analyzovaných vzorků taveného sýra
Tabulka 5. Eluční program separace DCl derivátů biogenních aminů
Tabulka 6. Opakovatelnost (vyjádřena jako relativní standardní odchylka, RSD) analytického procesu a výtěžnost metody pro stanovení biogenních aminů v sýrech
Tabulka 7. Obsah biogenních aminů v sýrech eidamského typu v průběhu zrání (4. – 22. týden)
Tabulka 8. Obsah biogenních aminů ve vzorcích taveného sýra Tabulka 9. Počty mikroorganizmů (ktj g–1) ve vzorcích taveného sýra
109
Seznam zkratek ACN - acetonitril ADC - arginindekarboxyláza AdoMetDC – S-adenosylmethionindekarboxyláza ATP - adenosintrifosfát BA – biogenní aminy BMK – bakterie mléčného kvašení CO2 – oxid uhličitý CPM – celkový počet mikroorganizmů CZE - kapilární zónová elektroforéza DAO – diaminooxidáza DCL - dansylchlorid DNA – deoxyribonukleová kyselina E. - Enterococcus ES – evropské společenství FEA – fenylethylamin FMOC - fluorenylmethyloxycarbonylchlorid GC – plynová chromatografie HIS – histamin HPLC – vysokotlaká kapalinová chromatografie IEC – iontově výměnná chromatografie KAD – kadaverin L. – Lactococcus Lb. - Lactobacillus MAO - monoaminooxidáza MAT – methioninadenosyltransferáza MPA – masopeptonový agar MRS – De Man-Rogosa-Sharpe agar ODC – ornithindekarboxyláza OPA – o-ftalaldidehyd P. - Pseudomonas PUT – putrescin
110
resp. - respektive RNA – ribonukleová kyselina RP-HPLC – vysokotlaká kapalinová chromatografie na reverzní fázi RSD – relativní standardní odchylka S. - Streptococcus SPD – spermidin SPM – spermin spp. – species subsp. - subspecies TLC – chromatografie na tenké vrstvě TYR – tyramin TRY – tryptamin UV/VIS – ultrafialové/viditelné záření
111
9 Anotace Cílem předkládané práce bylo posoudit vliv doby zrání, části sýra, výrobce a použité startovací kultury na obsah biogenních aminů (tyraminu, histaminu, fenylethylaminu, kadaverinu, tryptaminu) a polyaminů (putrescinu, sperminu a spermidinu) ve vzorcích polotvrdého zrajícího sýra eidamského typu a sledovat možný vliv tepelné úpravy, teploty skladování a doby skladování na obsah uvedených aminů ve vzorcích taveného sýra. Kvantitativně nejvýznamnějšími biogenními aminy byly v průběhu zrání sýrů eidamského typu tyramin, putrescin a fenylethylamin, jejich koncentrace se při odběru 22. týden zrání pohybovaly v rozmezí 15,7 – 299,8; 6,0 – 60,8 a 1,0 – 54,3 mg kg –1. Obsah TYR i sumy BA se v průběhu zrání lineárně zvyšoval (P<0,01) ve středových i okrajových částech sýra R30-FD, resp. R30-CH, i v sýru R45. Koncentrace tyraminu v sýru R45 přesáhla již 18. týden zrání nejen doporučený limit pro obsah TYR v sýrech, ale i limit pro sumu TYR a PHE. Sýr R45 tak nemůže být doporučen ke konzumaci osobám užívajícím inhibitory MAO nebo alergikům. Od 8. týdne zrání byly ve všech vzorcích R30-FD i R30-CH zjištěny v okrajových
částech průkazně (P<0,05) vyšší koncentrace TYR i sumy BA, než v částech středových. S distribucí BA v jednotlivých částech sýra korespondovaly i počty mikroorganizmů. Koncentrace tyraminu, putrescinu, fenylethylamini i suma BA byly od 18. týdne zrání průkazně (P<0,05) vyšší v sýru produkovaném výrobcem 2 (sýr R45), počty mikroorganizmů byly naopak výrazně vyšší (P<0,05) ve vzorcích sýra produkovaného výrobcem 1 (sýry R30). Faktor startovací kultury významně neovlivnil (P>0,05) hladiny TYR, ani sumu BA u žádného ze sýrů R30. Kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem byl ve všech vzorcích tavených sýrů tyramin (1,3 – 29,3 mg kg-1), nejvyšší koncentrace byla zjištěna ve vzorku pasterovaného sýra skladovaného 22 týdnů při teplotě 8 °C. Koncentrace biogenních aminů a polyaminů byly ve vzorcích tavených sýrů obecně velmi nízké, kromě tyraminu nepřesáhl obsah žádného z nich 2,5 mg kg-1. Lze konstatovat, že analyzované tavené sýry nepředstavují z hlediska obsahu biogenních aminů riziko ani v případě dlouhodobého skladování při pokojové teplotě. 112
113
114
115
