Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Stanovení probiotických mikroorganismů ve vybraných mléčných výrobcích Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

Ing. Hana Šulcerová, PhD. Pálenská

Bc. Anna

Brno 2010

Zadání diplomové práce

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení probiotických mikroorganismů ve vybraných mléčných výrobcích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………. podpis diplomanta ……………………….

Poděkování

Touto cestou bych ráda poděkovala Ing. Haně Šulcerové, Ph.D. a Ing. Radce Burdychové, PhD., za cenné rady a připomínky k vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat svému manželovi MUDr. Vítězslavovi Pálenskému, Ph.D., za psychickou podporu a v neposlední řadě také rodičům za finanční a psychickou podporu v průběhu studia. Můj dík patří také všem, kteří mi pomáhali ať už s hlídáním mého syna či jakkoliv jinak. Děkuji.

Abstrakt Probiotika se řadí mezi živé mikroorganismy přítomné v potravě příznivě ovlivňující složení a rovnováhu střevní mikroflóry, a následně zdraví člověka. Na trhu se nejčastěji můžeme setkat s kysanými mléčnými výrobky s přídavkem probiotik, avšak čím dál více se začínají probiotika používat také v masném a nápojovém průmyslu.

Mezi nejčastěji používané kmeny patří Lactobacillus a

Bifidobacterium. Aby mohl být výrobek označen za probiotický, musí podle platné legislativy obsahovat stanovený minimální počet živých probiotických bakterií, tzv. terapeutické minimum. Za něj je považován obsah alespoň 10⁶ živých probiotických bakterií na 1 ml nebo 1 g výrobku. Tento obsah bakterií se musí udržet po celou dobu trvanlivosti výrobku. V této práci bylo analyzováno šest druhů zakysaných mléčných výrobků Bifidrink a tři druhy Acidophilo s různými příchutěmi. Kvantitativní analýza měla ukázat zastoupení probiotických mikroorganismů v době koupě spotřebitelem a na konci minimální doby trvanlivosti. Dle výrobce by výrobky měly obsahovat probiotické druhy L.acidophilus a Bifidobacterium sp.

Klíčová slova: probiotika, kysané mléčné výrobky, L. acidophilus, Bifidobacterium sp.

Abstract

Probiotics are living organisms present in the food, which affect content and balance of enteric microflora and consequently one´s health in a positive manner. We can find femrented diary products with added probiotics in the market however, they are also often being used in meat and beverage industry. Lactobacillus and Bifidobacterium are the most frequently used strains. A product can be labeled as probiotic only if containing defined number of the probiotic bacteria given by the valid legislation, so called therapeutic minimum. This is defined as content of at least 10⁶ living probiotic bacteria in 1 ml or 1 g of the product. This content is to be maintained until expiration date. Six kinds of fermented diary products Bifidrink and three kinds of Acidophilo products with various flavours were analyzed in this thesis. The quantitative analysis is supposed to show representation of the probiotic organisms on the date of purchase and on the expiration date. The products should contain probiotic strains L.acidophilus and Bifidobacterium sp. according to the producer.

Key words: probiotics, fermented diary products, L. acidophilus, Bifidobacterium sp

Obsah

1 ÚVOD..................................................................................................................... 10

2 CÍL PRÁCE ............................................................................................................ 11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................ 12 3.1 Základní pojmy .............................................................................................. 12 3.1.1 Probiotika................................................................................................ 12 3.1.2 Prebiotika ................................................................................................ 12 3.1.3 Synbiotika ............................................................................................... 12 3.2 Nejdůležitější charakteristiky probiotik.......................................................... 13 3.2.1 Prospěšnost pro zdraví ............................................................................ 13 3.2.2 Mikrobiologické bezpečnostní požadavky ............................................. 13 3.2.3 Průmyslové požadavky ........................................................................... 13 3.3 Mechanismy možného působení probiotik ..................................................... 13 3.4 Vlastnosti prebiotik......................................................................................... 14 3.5 Charakteristika vybraných probiotických rodů............................................... 14 3.5.1 Rod Lactobacillus ................................................................................... 15 3.5.1.1 Rozdělení rodu Lacobacillus dle fermentace sacharidů ..................... 15 3.5.2 Rod Bifidobacterium............................................................................... 15 3.5.2.1 Metabolismus rodu Bifidobacterium .................................................. 16 3.5.3 Rod Enterococcus ................................................................................... 17 3.5.3.1 Metabolismus rodu Enterococcus ....................................................... 18 3.5.4 Rod Streptococcus .................................................................................. 19 3.5.4.1 Metabolismus rodu Streptococcus ...................................................... 19 3.6 Střevní mikroflóra........................................................................................... 20 3.6.1 Složení střevní mikroflóry ...................................................................... 21 3.7 Účinek probiotik na zdraví ............................................................................. 21 3.7.1 Imunitní systém....................................................................................... 22 3.7.1.1 Podíl probiotik na stimulaci imunitního systému ............................... 22 3.7.2 Vliv probiotik na imunopatologická onemocnění .................................. 23 3.7.2.1 Průjmová onemocnění ........................................................................ 23 3.7.2.2 Laktózová intolerance......................................................................... 24 3.7.2.3 Crohnova choroba............................................................................... 24 3.7.2.4 Kancerogenní onemocnění ................................................................. 24 3.7.2.5 Atopický ekzém .................................................................................. 26 3.7.2.6 Infekce vyvolaná Helicobacter pylori................................................. 27 3.8 Výroba kysaných mléčných výrobků ............................................................. 28 3.8.1 Fermentované mléčné výrobky............................................................... 28 3.8.2 Mléko ...................................................................................................... 29 3.8.2.1 Jakost mléka........................................................................................ 29 3.8.3 Základní úpravy mléka ........................................................................... 30 3.8.3.2 Svoz mléka.......................................................................................... 30 3.8.3.2 Příjem mléka ....................................................................................... 30

3.8.3.3 Odstřeďování ...................................................................................... 30 3.8.3.4 Tepelné ošetření mléka ....................................................................... 30 3.8.3.5 Úprava tučnosti ................................................................................... 31 3.8.3.6 Homogenizace .................................................................................... 31 3.8.3.7 Fermentace.......................................................................................... 32 3.8.3.8 Přídavek probiotik............................................................................... 32 3.8.4 Požadavky na mléko pro výrobu fermentovaných výrobků ................... 32 3.8.5 Legislativní úprava probiotik.................................................................. 33 3.9 Faktory ovlivňující stabilitu a životaschopnost probiotik............................... 33 4 MATERIÁL A METODY...................................................................................... 34 4.1 Použitý materiál .............................................................................................. 34 4.1.1 Kultivační média..................................................................................... 34 4.1.1.1 MRS médium...................................................................................... 34 4.1.1.2 MRS- clindamycin médium................................................................ 35 4.1.1.3 BSM médium...................................................................................... 35 4.1.2 Použité vzorky ........................................................................................ 36 4.1.3 Použité chemikálie.................................................................................. 41 4.1.4 Použité přístroje ...................................................................................... 41 4.1.5 Použité pomůcky..................................................................................... 42 4.2 Metody ............................................................................................................ 42 4.2.1 Stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení ....................... 42 4.2.1.1 Příprava kultivační půdy..................................................................... 43 4.2.1.2 Příprava ředění .................................................................................... 43 4.2.1.3 Inokulace misek, zalévání, kultivace .................................................. 43 4.2.1.4 Hodnocení ........................................................................................... 44 4.2.2 Stanovení počtu Lactobacillus acidophillus ........................................... 44 4.2.2.1 Příprava kultivační půdy..................................................................... 44 4.2.2.2 Příprava ředění .................................................................................... 44 4.2.2.3 Inokulace misek, zalévání, kultivace .................................................. 44 4.2.2.4 Hodnocení ........................................................................................... 45 4.2.3 Stanovení počtu Bifidobacterium sp. ...................................................... 45 4.2.3.1 Příprava kultivační půdy..................................................................... 45 4.2.3.2 Příprava ředění .................................................................................... 45 4.2.3.3 Inokulace misek, zalévání, kultivace .................................................. 45 4.2.3.4 Hodnocení ........................................................................................... 46 4.2.3.5 Vyjádření výsledů ............................................................................... 46 4.2.4 Měření pH ............................................................................................... 47 5 VÝSLEDKY A DISKUZE..................................................................................... 48 5.1 Testování probiotických kultur....................................................................... 48 5.2 Testování výrobků BIFIDRINK a ACIDOFILO............................................ 50 5.2.1 Analýza počtu KTJ * g ¯¹ u jednotlivých stanovení ............................... 50 5.2.2 Stanovení pH................................................................................................... 57 5.3 Diskuze ........................................................................................................... 59 6 ZÁVĚR ................................................................................................................... 62

7 POUŽITÁ LITERATURA ..................................................................................... 63

1 ÚVOD Potravinářský průmysl vyrábí stále nové potraviny, které napomáhají snižovat riziko vzniku mnoha onemocnění. Obohacené potraviny zejména o probiotika hrají důležitou roli ve výživě lidí. Je to dáno především jejich příznivým účinkem na gastrointestinální trakt člověka. Probiotické mikroorganismy osidlují toto prostředí a brání adherenci patogenů. Celosvětově je prodáváno více než 100 různých probiotických výrobků a spotřeba potravin obsahujících Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium spp. je pozorně sledována. Mezi fermentovanými mléčnými produkty zůstává nejvýznamnějším výrobkem jogurt. Příznivý účinek probiotik je podmíněn dostatečným počtem živých bakterií. Na životnost probiotických kultur ve fermentovaném mléce působí řada faktorů, zejména pak výsledná kyselost produktu, dostupnost živin, rozpustnost a možnost permeace kyslíku přes obal výrobku. Stabilita probiotických kultur ve výrobcích je důležitým problémem, na který je zaměřena hlavní pozornost. Různé mikroorganismy mají odlišné kultivační nároky. Je proto nesnadné najít podmínky vyhovující všem. Probiotika řadíme mezi tzv. funkční potraviny. Potravina může být označena jako funkční, jestliže obsahuje takovou složku (může to být živina, ale i jiná složka), která cíleně pozitivním způsobem ovlivňuje jednu nebo více funkcí lidského organismu anebo má fyziologický nebo psychologický účinek nad rámec tradičního nutričního účinku (KOMPRDA, 2003).

2 CÍL PRÁCE

Cílem této diplomové práce bylo: • vypracovat literární rešerši na téma probiotické mikroorganismy a jejich aplikace do mléčných výrobků • zpracovat informace o technologii mléčných výrobků a použití probiotických kultur • naučit se laboratorní diagnostiku • zpracovat reálné vzorky mléčných výrobků a sledovat kvantitativní zastoupení deklarovaných probiotik • výsledky statisticky vyhodnotit.

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Základní pojmy 3.1.1 Probiotika Probiotika můžeme definovat jako živé mikroorganismy přidávané do potravin, které příznivě ovlivňují zdraví konzumenta zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry (FULLER, 1989).

3.1.2 Prebiotika

Prebiotikum je látka, která slouží jako substrát pro bakteriální flóru, jež působí prospěšně na hostitele (ať už se jedná o bakterie vlastní nebo probiotika dodaná v nadbytku zvenčí) (KOHOUT, 2008). Funkci prebiotik plní nestravitelné oligosacharidy, které se musí dostat do tlustého střeva a nerozštěpené. Zde se stávají substrátem pro probiotika (ŠUSTOVÁ, 2006).

3.1.3 Synbiotika Synbiotikum je kombinace probiotika a prebiotika v jednom preparátu (KOHOUT, 2008). V zásadě jde o to, že vhodná bakterie má k dispozici substrát, který bude moci selektivně fermentovat v tlustém střevu. Tím se zesiluje její šance prosadit se v konkurenci s přirozenou mikroflórou. Název vznikl z pozorovaného jevu synergismu, což znamená, že zdravotní přínos kombinace obou účinných složek je vyšší než aplikace samostatně (ŠUSTOVÁ, 2006).

3.2 Nejdůležitější charakteristiky probiotik

3.2.1 Prospěšnost pro zdraví

• schopnost kolonizace a adherence • antagonistický vliv na patogenní flóru • schopnost tvorby antimikrobiálních substancí • schopnost imunomodulace • měřitelná a klinicky dokumentovatelná užitečnost pro zdraví příjemce • snížení potravinových alergií u dětí (PARVEZ a kol., 2006)

3.2.2 Mikrobiologické bezpečnostní požadavky

• možnost přesného taxonomického zařazení • humánní původ • netoxické a nepatogenní • geneticky stabilní • schopnost přežívat, růst a být metabolicky aktivní v trávicím ústrojí příjemce • potencionálně rezistentní proti antimikrobiálním substancím původní mikroflóry příjemce • rezistentní proti žaludeční kyselině a žlučovým kyselinám

3.2.3 Průmyslové požadavky

• stabilita žádaných vlastností během výroby, transportu a skladování • příznivé organoleptické vlastnosti

3.3 Mechanismy možného působení probiotik • stabilizace střevní flóry kompeticí s patogenními mikroorganismy o vazebná místa na receptorech a o živiny (HENKER a kol., 2007)

• produkce mastných kyselin s krátkými řetězci (zvláště kyselina máselná) • pokles pH střevního obsahu • zvýšení rozpustnosti minerálních látek • omezení zpětné resorpce žlučových kyselin • stabilizace střevní slizniční bariéry, úprava střevní permeability • produkce antimikrobiálních substancí • modifikace toxinů a toxinových receptorů • stimulace imunitní odpovědi na patogeny

3.4 Vlastnosti prebiotik • procházejí horní částí trávicího ústrojí v nezměněné formě, zde se nehydrolyzují ani nevstřebávají • slouží selektivně určitým baktériím tlustého střeva jako substrát, který zvyšuje metabolickou aktivitu těchto bakterií nebo podporuje jejich růst • pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry tlustého střeva • mají celkově pozitivní vliv na zdraví a pohodu jedince

3.5 Charakteristika vybraných probiotických rodů Tab. 1 Nejčastěji komerčně využívané probiotické mikroorganismy L. acidophilus

B. bifidum

L. rhamnosus Bifidobacterium

B. lonfum

L. casei Lactobacillus L. bulrgaricus

B. animalis Enterococcus

L. fermentum L. brevis L. reuteri

E. faecium S. thermophilus

Streptococcus

S. intermedius S. diacetylactis

3.5.1 Rod Lactobacillus

Rod Lactobacillus patří mezi grampozitivní nesporulující tyčinky, které jsou fakultativně anaerobní a mikroaerofilní. Vyskytují se v mléce a mléčných výrobcích, na povrchu rostlin, zelenině, pivu, vínu a dalších poživatinách (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). Některé druhy se využívají ve formě čistých zákysových kultur při výrobě jogurtů, acidofilního mléka (L. acidophilus), tvarohů a sýrů.

3.5.1.1 Rozdělení rodu Lactobacillus dle fermentace sacharidů

Dle fermentace sacharidů je možné rozdělit rod Lactobacillus do tří skupin: • Homofermentativní – hexózy fermentují na kyselinu mléčnou, pentózy a glukonáty nefermentují Patří sem např. L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii spp. bulgaricus, L. acidophilus, L. salivarus • Fakultativně heterofermentativní – hexózy fermentují na kys. mléčnou, při nedostatku glukózy produkují některé druhy kys. octovou, etanol, kys. mravenčí, pentózy fermentují na fosfoketolátky Tato skupina obsahuje např. L.casei spp. casei, L. casei spp. rhamnosus, L. plantarum • Heterofermentativní – hexózy fermentují na kys. mléčnou, octovou, etanol a CO , pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou Skupina obsahuje plynotvorné laktobacily např. L. buchneri, L. brevis, L. fermentum, L. kefir. Optimální kultivační teplota je 30 °C.

Obr. 1 Rod Lactobacillus

3.5.2 Rod Bifidobacterium

Řadíme jej mezi grampozitivní nepravidelné anaerobní tyčinky. Netvoří spory, jsou nepohyblivé. V hojném počtu se vyskytují především ve stolici kojenců (ŠUSTOVÁ, 2009). Velmi dobře rostou s jejich přirozeným střevním partnerem L. acidophilem. Produkuje kyselinu octovou, která má více mikrobicidní účinky než kyselina mléčná, čímž se potlačují nevítané choroboplodné střevní bakterie (ŠUSTOVÁ, 2008). Spolu s jinými bakteriemi mléčného kysání slouží k výrobě probiotických kyselých mlék, např. Bifidobacterium longum. Řada bifidobakterií má probiotické vlastnosti (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007).

3.5.2.1 Metabolismus rodu Bifidobacterium

Fermentují cukry za produkce kyseliny mléčné a octové. Vedlejším metabolitem je malé množství etanolu, kyseliny mravenčí a jantarové (GÖRNER, VALÍK, 2004). Optimum pro růst se pohybuje mezi 37 a 41 °C.

Obr. 2 Rod Bifidobacterium

3.5.3 Rod Enterococcus

Grampozitivní, fakultativně anaerobní, nesporulující nepohyblivé buňky nebo řetízky. Rod Enterococcus, stejně jako většina ostatních probiotických bakterií, patří mezi bakterie mléčného kvašení. Jedná se o všudypřítomné mikroorganismy, dominantně však osídlují lidský a zvířecí gastrointestinální trakt. Po staletí byly bakterie rodu Enterococcus používány jako indikátory fekální kontaminace. Z technologického hlediska jsou důležité při produkci různých fermentovaných masných i mléčných

potravin, kde se uplatňují buď jako startovací kultury nebo je jejich přítomnost důsledkem mikrobiální kontaminace. Užívá se jako doplňková kultura při zrání čedarového typu sýrů. Některé druhy vykazují dekarboxylační aktivitu, což způsobuje nežádoucí tvorbu biogenních aminů (SHALABY a kol., 1996).

3.5.3. 1 Metabolismus rodu Enteroccus Rod Enterococcus má fermentativní metabolismus. Štěpí sacharidy na L(+) kyselinu mléčnou, zkvašuje sorbitol, nezkvašuje L-arabinózu, zřídka redukuje nitráty a z argininu tvoří amoniak. Roste při 6,5% hm. NaCl. Optimální pH je 9,6 a teplota 10-45 °C.

Obr. 3 Rod Enterococcus

3.5.4 Rod Streptococcus

Rod Streptococcus zahrnuje grampozitivní kokovité oválné buňky vyskytující se v párech

nebo

různě

dlouhých

řetízcích.

Jsou

fakultativně

anaerobní

a

chemoorganotrofní. Vyskytuje se v intestinálním traktu člověka i zvířat, v lidských slinách (např. Streptococcus salivarius K12 je probiotický druh, který byl izolován ze slin zdravých dětí a v in vitro podmínkách působí antimikrobiálně proti Streptococcus pyogenes (BURTON a kol. 2006)), tepelně ošetřeném mléku. Používá se především do fermentovaných mléčných výrobků, méně pak jako testovací mikroorganismus na detekci přítomnosti inhibičních látek.

3.5.4.1 Metabolismus rodu Streptococcus Tento rod, stejně jako většina ostatních kultur, které se využívají jako probiotika, se vyznačuje fermentativním metabolismem. Stejně tak štěpí sacharidy na L(+) kyselinu mléčnou. Optimální kultivační teplota je 37-42 °C. Roste při 6,5 % hm. NaCl. Přežívá záhřev na 60 °C po dobu 30 min.

Obr. 4 Rod Streptococcus

3.6 Střevní mikroflóra Střevní mikroflóra má velkou metabolickou aktivitu, mění se během života a je významným faktorem, který ovlivňuje zdraví jedince. Fyziologická funkce normální střevní mikroflóry je součástí obranného mechanismu, který spočívá v kompetitivní inhibici bakteriální adheze patogenních bakterií na sliznici trávícího ústrojí, v syntéze sloučenin, které inhibují a ničí patogenní bakterie, a v kompetitivní konzumpci živin potřebných pro růst patogenních mikroorganismů. Fyziologická mikroflóra moduluje rovněž imunitní systém efektivní stimulací mikrobiálními antigeny. Ovlivňuje humorální, buněčnou i nespecifickou imunitu, může mít vliv na produkci cytokinů a genovou transkripci. Mikroflóra má též nutriční význam jako pomoc při trávení a při odstraňování nebo inaktivaci škodlivých látek (KOHOUT, 2008).

3.6.1 Složení střevní mikroflóry

Mikrobiální osídlení trávícího traktu představuje specificky vyváženou a komplexní soustavu, kterou lze vhodně označit jako mikrobiální ekosystém, neboť rovnováha je jednou ze základních vlastností (ZBOŘIL, 2005). Složení střevní mikroflóry je významně ovlivňováno způsobem výživy. Při narození je mikroflóra novorozence sterilní (QUIGLEY, 2010). U novorozenců, kteří jsou výlučně kojeni, je pak intestinální flóra složena z laktobacilů a bifidobakterií. Bifidobakterie jsou do prvního týdne dominantním mikroorganismem (TLÁSKAL, 2001). Chybí fakultativně anaerobní E.coli a striktně anaerobní Bacteroides fragilis a Clostridium sp. Převaha bifidobakterií je způsobena látkami, které jsou obsaženy v mateřském mléku a selektivně příznivě působí na růst bifidobakterií a laktobacilů (bifidogenní faktor). Hovoříme o prebiotické aktivitě mateřského mléka (KOHOUT, 2008). Tento bifidogenní faktor je v mateřském mléce tvořen oligosacharidy (třetí, kvantitativně největší složka mateřského mléka po laktóze a tucích) a glykoproteiny. Vlivem této prebiotické aktivity je mikroflóra s převahou laktobacilů a bifidobakterií vytvořena během jednoho měsíce. Tvorba kyseliny mléčné jako konečného produktu metabolismu těchto bakterií spolu s působením specifických živin v mateřském mléce, jako jsou laktoferin, kasein a nukleotidy, přispívají k vytvoření prostředí, ve kterém laktobacily a bifidobakterie dobře rostou. Osídlení pokračuje během prvních dnů a

týdnů, stabilizuje se během výlučného kojení do odstavení a zavedení příkrmů nebo použití přípravků kojenecké mléčné výživy (KOHOUT, 2008). U dětí uměle živených se vyvíjí mnohem pestřejší střevní mikroflóra, která obsahuje vedle bifidobakterií bakteroidy, enterobakterie, enterokoky a klostridia. Dospělý typ střevní mikroflóry (převaha anaerobních bakterií rodu Bacteroides a Firmicutes) je dosažen ve věku 1 až 2 let (NEVORAL, 2009).

3.7 Účinek probiotik na zdraví • Napomáhají udržovat vyváženou mikroflóru tlustého střeva • Zvyšují odolnost tlustého střeva proti osídlení mikroorganismy, které vyvolávají některé střevní infekce. • Napomáhají snížit tvorbu bakteriálních enzymů v tlustém střevě, které mohou působit rakovinotvorně. • Přispívají k lepšímu trávení laktózy. • Posilují imunitu organismu (ROLFE, 2000) • Napomáhají syntéze některých vitamínů.

Probiotika v sobě skrývají nepochybně pozitivní preventivní i léčebný potenciál. Různá gastrointestinální i systémová onemocnění lze léčit právě s jejich přispěním. Probiotika se ukázala jako účinná v prevenci a léčbě mnohých onemocnění, například atopických chorob, podporují vstřebávání laktózy, tedy mléčného cukru. Studie prokázaly jejich příznivé účinky také u pacientů trpících Crohnovou nemocí či jinými autoimunními onemocněními. Velmi významná je jejich schopnost tlumit enzymatické aktivity, které působí rakovinotvorně v tlustém střevě (NEVORAL, 2009). Tyto vlastnosti jsou doloženy experimenty in vitro a v modelových studiích chorob trávicího ústrojí (např. enterokolitid, kolorektálního karcinomu, jaterních chorob, akutní pankreatitidy, infekce H. pylori) i jiných afekcí (syndrom multiorgánové dysfunkce, alergická dermatitida, experimentální artritida) (FRIČ, 2007). Probiotika a prebiotika mohou být též prevencí nemocí u předčasně narozených dětí (SZAJEWSKA, 2010). Hlavním předpokladem působení probiotik je jejich dostatečné množství. Není tedy důležité, zda jsou probiotické bakterie dodávány ve formě tablety, kapsle, koktejlu či

jogurtu nebo jogurtového nápoje, důležitý je výběr správného kmene bakterií a jejich aplikované množství (HOŘEJŠÍ, 2008).

3.7.1 Imunitní systém

Imunitní systém je soubor mechanismů, které se podílejí na rozeznávání a likvidaci cizích či vlastních látek, které by mohly být pro organismus škodlivé. Plní tedy obrannou funkci našeho organismu (ANONYM, 2009). Náš imunitní systém je rozptýlen po celém těle. Je uspořádán celým komplexem svých centrálních orgánů, periferních orgánů a buněk, které mají schopnost zasáhnout kdekoli v organismu. K těmto orgánům patří kostní dřeň a brzlík jako základní orgány, ve kterých vznikají a učí se imunitní buňky, a dále slezina a lymfatické uzliny, kde se odehrávají důležité imunitní reakce. V tkáních samotných působí buňky imunitního systému a ve sliznicích se pak odehrává maximum reakcí při interakci se zevním prostředím. Důležité však je, že buňky imunitního systému jsou prakticky ve všech tkáních, především ale ve sliznici střeva, kde se nalézá až 70% buněk imunitního systému. Náš obranný systém má mimořádný význam, ovšem velmi často se setkává s vlivy, které ho mohou oslabit. Proto je důležitá jeho cílená podpora v rámci každodenního života. Imunitní systém je tvořen souborem buněk, molekul a humorálních makromolekul, které jsou schopné vzájemně komunikovat při rozlišování pozměněných nebo cizích buněk či tkání a odstraňovat je. Rozlišujeme dva typy imunitních mechanismů, a to specifické imunitní mechanismy (uplatňují se okamžitě po působení cizorodých látek nezávisle na předchozím setkání s nimi) a nespecifické imunitní mechanismy (vyvíjejí se teprve po setkání s danou látkou, působí až po určité době a jsou zaměřeny jen proti látce, která je vyvolala) (KAŇKOVÁ, 2003).

3.7.1.1 Podíl probiotik na stimulaci imunitního systému

Podstatou působení probiotických kultur kysaných mléčných výrobků je imunomodulační účinek na ty imunitní mechanismy, které se uplatňují v obraně proti patogenním mikroorganismům v gastrointestinálním traktu, a naopak imunosupresivní

účinek na reakce imunitní přecitlivělosti na potravinové antigeny. Důležitou úlohu má při tom dodržování správné rovnováhy mezi prozánětlivými a protizánětlivými cytokiny sekretovanými TH1 a TH2 lymfocyty a stimulace tvorby sekrečního IgA (FERENČÍK, EBRINGER, 2002).

Probiotika tedy mohou ovlivňovat imunitní odpověď dvěma způsoby, a to: 1. nespecificky – stimulací fagocytózy, cytotoxické aktivity a ovlivněním produkce imunoregulačních cytokinů 2. specificky – stimulací tvorby protilátek IgA a IgG a supresí tvorby IgE. Zdravá střevní mikroflóra sehrává významnou úlohu při maturaci imunitního systému do nealergického typu (STIBŮREK a kol., 2009).

3.7.2 Vliv probiotik na imunopatologická onemocnění

Podle výzkumů způsobují probiotika aktivaci makrofágů a zvyšují tak hladinu imunoglobinu IgG2. Tím zvyšují i odolnost proti veškerým infekcím, zejména pak proti těm, které způsobují zažívací potíže, jako jsou průjmy, dyspepsie a dismikrobie (HRONEK, 2004). Pozitivní vliv se uvádí také v souvislosti s léčbou idiopatických střevních zánětů (Crohnova choroba, ulcerózní kolitida), infekcí žaludku způsobenou Helicobacter

pylori,

akutní

pankreatitidou,

laktózovou

intolerancí,

atopickou

dermatitidou a potravinovými alergiemi (ŠPELINA, 2006).

3.7.2.1 Průjmová onemocnění

Jako průjem označujeme 3 a více stolic za den, které jsou řidší konzistence. Zvýšený odchod stolice může být nebezpečný. Je příznakem onemocnění nebo poruchy v trávicím traktu. Mezi nejčastější původce průjmových onemocnění patří salmonela, kampylobakter a rotavirus (MARTEAU, 2001). Průjmy také patří k nejčastějším nežádoucím účinkům při léčbě antibiotiky. Vyskytují se u 20-40% populace (NEVORAL, 2005).

Probiotika mírně zkracují dobu trvání průjmového onemocnění (o 17–30 hodin). Jejich účinek je závislý na použitém probiotiku. Zřejmá je také závislost na dávce, vyšší účinek byl pozorován při dávce vyšší než 1010 CFU. Probiotika jsou účinná na vodnaté průjmy a virové gastroenteritidy, ne však na invazivní bakteriální průjmy a jsou více účinná, pokud jsou podána brzy (NEVORAL, 2009).

3.7.2.2. Laktózová intolerance

Asi 10–15 % dospělé populace má výrazně sníženou aktivitu střevní laktázy (betagalaktoxidázy) a po požití již malého množství laktózy má zažívací potíže. Laktóza je metabolizována bakteriemi a výsledkem je flatulence, průjem, nauzea, bolesti břicha. Tito lidé lépe snáší fermentovaná mléka. Fermentované výrobky vykazují vysokou aktivitu betagalaktoxidázy (KOMPRDA, 2008). Jejich efekt se vykládá delší pasáží trávicím ústrojím a účinkem živých bakterií, které obsahují laktázu. Probiotikum pomocí laktázy, kterou obsahuje, pomáhá štěpit laktózu v tlustém střevě a tak zlepšuje toleranci laktózy. Laktázu produkují laktobacily, jako jsou Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus (v jogurtech) (NEVORAL, 2009).

3.7.2.3 Crohnova choroba

Zánětlivé onemocnění Crohnova choroba je spuštěna abnormální aktivací slizničních T-lymfocytů, které působí proti střevním bakteriím. Autoři, zabývající se studií bakterie Lactococcus lactis K. Robinson a L. M. Chamberlain zjistili, že tato bakterie spolu s Lactobacillus casei má pozitivní vliv na postiženou tkáň a zároveň redukuje množství T-lymfocytů na slizniční vrstvě střeva (LIONG, 2007).

3.7.2.4 Kancerogenní onemocnění

Rakovina je onemocnění způsobené zhoubným nádorem, pro který je charakteristický nekontrolovaný růst s ničením okolních tkání, zakládání metastáz a

celkové působení na organismus. Je výsledkem mutací. Sérií mutací získá buňka schopnost proliferovat bez normálních zábran. Potomstvo této buňky mutace zdědí, množením vzniká nádor, který může neomezeně růst (KOMPRDA, 2003).

Obr. 5 Srovnání normální buněčné proliferace s neomezenou buněčnou proliferací způsobenou onkogenem. Popis obrázku z leva doprava: 1. Zdravá buňka v klidu. 2. Zdravá buňka dostává signál k dělení, navázání ligandu na receptor, spuštění signalizační dráhy. Následuje aktivace regulačního proteinu a spuštění transkripce. 3. Buňka rakovinná – receptor není aktivován. Dochází k mutacím, dochází k množení buňky bez přítomnosti signalizačních proteinů (Upraveno dle KOMPRDA, 2003)

Proces karcinogeneze se dělí na tři fáze, a to iniciaci, promoci a progresi. Iniciace znamená prvotní změnu způsobující transformaci buňky. Promoce je dělení transformované nádorové buňky. Progrese je pak nekontrolované šíření nádoru doprovázené vznikem metastáz (KOMPRDA, 2003). Preventivní účinek probiotik u vzniku nádorových onemocnění byl prokázán

mnoha studiemi, které přímo potvrdily, že probiotika brání vzniku a růstu prekancerózních lézí a nádorů. Probiotika nebo jimi produkované rozpustné látky mohou podle vědců přímo reagovat s nádorovými buňkami v kultuře a inhibovat jejich růst.

Přímé antiproliferativní působení na nádorové buňky prokázala mléka

fermentovaná

kmeny

Bifidobacterium

infantis,

Bifidobacterium

bifidum,

Bifidobacterium animalis, Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus paracasei. Důvodem antikarcinogenního působení probiotik spočívá v jejich schopnosti tvorby SCFA (mastné kyseliny s krátkým řetězcem). Při rozkladu nestrávených sacharidů pomocí probiotik vznikají mastné kyseliny s krátkým řetězcem, které pak slouží jako výživa pro kolonocyty, ale také jako substrát pro růst střevní mikroflóry. Dalším efektem SCFA ve střevě je snížení pH, které dosahuje až hodnoty 4. Nízké pH je nepříznivé pro růst a množení patogenních bakterií osidlujících střevo a vede tak k inhibici jejich růstu (GILL, ROWLAND, 2002). Mezi další mechanismy působení probiotik v prevenci karcinogeneze je zvyšování imunity hostitele, úprava metabolických aktivit střevní mikroflóry, vazba a degradace potenciálních karcinogenů a především úprava střevní mikroflóry, která je schopná vytvářet některé karcinogeny a promotory (HRONEK, KUDLÁČKOVÁ 2005; MUTUOGLU a kol., 2006).

3.7.2.5 Atopický ekzém

Atopický ekzém je kožní zánět, většinou alergického původu, čili reakce organizmu na dráždivý podnět. Jeho projevem je kožní vyrážka, obvykle červená, kůže bývá velmi suchá, nepříjemně svědí, často je rozpraskaná, někdy i mokvající. Zánětlivá ložiska se nejčastěji objevují na loktech, zápěstí, krku, pod koleny, nártech a na obličeji. (ANONYM, 2006). Nejčastějšími alergeny u ekzému jsou některé potraviny, zejména kravské mléko, vejce, čokoláda, vlašské ořechy, citrusové plody nebo lepek. U starších dětí pak inhalační alergeny, např. prach, roztoči, peří, pyly a srst zvířat. Jako prevence léčby jsou doporučovány různé doplňky stravy, které pomáhají posilovat imunitu a schopnost organismu vyrovnávat se s alergeny. Právě ovlivnění průběhu a léčby atopických ekzémů je dalším z důvodů, které se v souvislosti s probiotiky dlouhodobě zkoumají. Předmětem těchto výzkumů je jejich vliv na redukci symptomů a léčba atopického ekzému a citlivost na potravinové

alergeny, zejména na kravské mléko. Předpokládaným mechanismem účinku je ovlivnění prostupnosti střevní stěny pro alergeny, zmírnění lokálních imunitních odpovědí organismu na alergeny, redukce fekálně-orálních infekcí a ovlivnění složení střevní mikroflóry (VILJANEN, 2005; BROUWER, 2006). Pacienti s atopickým ekzémem mají v trávicím traktu méně gram-pozitivních aerobních kmenů a celkově je jejich mikroflóra hodnocena jako chudší. I mikroflóra u zdravých novorozenců a batolat se liší od té u dětí s atopickým ekzémem. Je prokázáno, že probiotika mají na vyvážení a regulaci mikroflóry GIT (gastrointestinální trakt). pozitivní vliv. U lidí trpících tímto onemocněním je typický zvýšený počet bakterií kmenu Bakteroides a naopak snížený počet bifidobakterií. Právě podávání bifidobakterií vede ke snížení patogenní Escherichia coli a Bacteroides sp., což by mohlo vést ke snížení alergické reakce (FRIČ, 2007). Probiotika, která jsou zodpovědná právě za poměr mikroorganismů ve střevě, můžou mít také antialergenní efekt stimulací produkce Th-1-cytokinů, TGF β a střevního IgA (VILJANEN, 2005).

3.7.2.6 Infekce vyvolaná Helicobacter pylori

Infekce Helikobakterem pylori je pravděpodobnou přičinou velké většiny chronických zánětů žaludeční sliznice a zároveň je považována za hlavní příčinu žaludečního karcinomu (ANONYM, 2010). Mezi příznaky vředů způsobených touto bakterií patří řezavá a pálivá bolest v epigastriu objevující se, když je žaludek prázdný. Zmírňuje se po naplnění žaludku potravou a po použití antacid. Méně často může příznaky doprovázet i nausea, zvracení a ztráta chuti k jídlu. Podle výsledků odborných studií probiotika ovlivňují růst a výskyt bakterie Helicobacter pylori v lidském GIT. Přisuzuje se jim hned několik mechanizmů účinku. Tím nejjednodušším a nejjasnějším účinkem proti Helicobarter pylori je obecná vlastnost probiotik, že obsazují vazebná místa na sliznici. V žaludku (stejně jako ve střevě) tak dochází ke kompetitivní inhibici, tzn. Helicobacter pylori už nemá takovou možnost se na sliznici vázat, protože jsou receptory obsazené probiotickými bakteriemi (LESBROS-PANTOFLÍČKOVÁ a kol., 2007, SZAJEWSKA, 2007).

3.8. Výroba kysaných mléčných výrobků 3.8.1 Fermentované mléčné výrobky

Podle Vyhlášky Ministerstva zemědělství ČR č.77/2003 Sb. se jako fermentovaný mléčný výrobek označuje výrobek, který je získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů mléčného kysání, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Tato vyhláška též stanovuje pro jednotlivé skupiny kysaných mléčných výrobků množství bakterií použité mikrobiální kultury.

Tab. 2 Druhy a minimální počty živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Podle přílohy č. 2 k Vyhlášce Ministerstva zemědělství ČR č. 77/2003 Sb.) Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g

Druh výrobku

Použité mikroorganismy

Acidofilní mléko

Lactobacillus acidophilus a další mezofilní příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení

Jogurty *)

protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermopilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

107

Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany

monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení

106

Kefír

zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašujících laktózu bakterie Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále mléčného Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter kvašení 106 a kvasinky rostoucí ve vzájemném společenství 104

Kefírové mléko

zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a

106 Lactobacilus acidophilus

bakterie mléčného kvašení 106 a kvasinky

termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou

Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kvašení

102

106 bifidobakterie

*) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo texturovou charakteristiku výrobku. Musí být však zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury.

3.8.2. Mléko

Mléko je pravý sekret mléčné žlázy, určený primárně pro výživu novorozenců. Je získáváno v období, které nazýváme laktace (ŠUSTOVÁ, 2008). Obsahovými složkami je voda, která tvoří 87.5%, sušina a plyny. Složení mléka je možné do určité míry ovlivňovat díky složení krmiva. Tyto přijímané živiny jsou transportovány krví do mléčné žlázy, která látkovou přeměnou následně syntetizuje mléko (ŠUSTOVÁ, 2006).

3.8.2.1 Jakost mléka

Požadavky na kvalitu mléka a mléčných výrobků se řídí čtyřmi základními kritérii dle Evropské unie: Celkový počet mikroorganismů v 1 ml mléka

≤ 100.000

Počet somatických buněk v 1 ml mléka

≤ 400.000

Rezidua inhibičních látek v mléce

negativní

Bod mrznutí mléka

≤ -0,520 °C

3.8.3 Základní úpravy mléka

3.8.3.1 Svoz mléka Svoz mléka z mléčných farem do mlékáren je prvním technologickým procesem. Na jeho rychlosti a provedení závisí výsledná kvalita mléka a tím i všech vyráběných produktů. Tato činnost je vykonávána speciálními cisternovými vozidly pro svoz mléka. Vozidla jsou vybavena čerpadly na mléko, průtokoměry mléka a zařízením pro odběr vzorků mléka.

3.8.3.2 Příjem mléka Množství přivezeného mléka se kontroluje jak kvantitativně, tak kvalitativně. Při přejímce se odebírá vzorek, u kterého se měří především obsah tuku, dále titrační kyselost, měrná hmotnost, obsah bílkovin, vzhled, vůně a další parametry.

3.8.3.3 Odstřeďování V tomto technologickém kroku dochází k odstředění smetany. Optimální teplota se pohybuje mezi 40-45°C. Po odstředění smetany je tučnost mléka kolem 0,03- 0,05%. Tučnost smetany se pohybuje kolem 35-40% (ŠUSTOVÁ, 2006).

3.8.3.4 Tepelné ošetření mléka Tepelné ošetření mléka má zajistit především zdravotní nezávadnost mléka, prodloužit jeho trvanlivost a v neposlední řadě má vytvořit optimální podmínky pro výrobu určitých výrobků (ŠUSTOVÁ, 2006).

• Pasterace – Cílem pasterace je zničení vegetativních forem patogenních, podmíněně patogenních a toxinogenních mikroorganismů, devitalizace většiny ostatních a dezaktivizace části enzymů a bezpečné usmrcení všech

choroboplodných zárodků při zachování fyzikálních, chemických i biologických vlastností mléka (ŠUSTOVÁ, 2008)

Způsoby pasterace: Vysoká - 85°C po dobu 15-20s (pro konzumní mléko, mléko pro fermentované produkty) Šetrná - 72°C po dobu 20-30s (pro výrobu tvrdých sýrů) Dlouhodobá - 65°C po dobu 30 min • Sterilace - jejím cílem je prodloužení trvanlivosti mléka z několika dnů na několik měsíců, zničení všech mikroorganismů i spor, devitalizace anaerobních sporotvorných neurotoxických MO. Probíhá při teplotách 110-130°C • UHT záhřev – kontinuální průtokový ohřev mléka na velmi krátkou dobu. Cílem je zničení MO včetně spor. Dochází zde k velmi malému narušení nutričních vlastností. Teploty užívané v praxi se pohybují u mléka 137-142°C, u smetany pak 140150°C (ŠUSTOVÁ, 2008).

3.8.3.5 Úprava tučnosti

Úprava tučnosti nebo též standardizace spočívá ve smíchání odstředěného mléka se smetanou (dle daného poměru), čímž dojde k úpravě obsahu tuku dle požadavků výrobce na výrobek.

3.8.3.6 Homogenizace

Zabraňuje vyvstávání a oddělování tuku z plazmatu. Dochází zde k rozbití tukových globulí. Probíhá při teplotě 60-70°C (ŠUSTOVÁ, 2008). Mezi výhody homogenizace patří zabránění ulpívání tuku na obalech, mléko má při nižším obsahu tuku plnější chuť a u kysaných výrobků zajišťuje homogenizace jemnější konzistenci (ŠUSTOVÁ, 2006).

3.8.3.7. Fermentace

Mléko, po úpravě teploty na předepsané teploty, je zakysáváno ve fermentačních tancích a následně plněno do spotřebitelského balení, ve kterém pak probíhá fermentační proces, nebo může fermentace probíhat přímo v tanku a po prokysání a případném doplnění komponenty je výrobek chlazen a plněn do spotřebitelských obalů (SIMEONOVOVÁ a kol., 2003).

3.8.3.8 Přídavek probiotik Výrobky

získávané

fermentací

mléka

mikroorganismy

L.acidophilus

a

Bifidobacterium spp. působí pozitivně na zdravotní stav konzumenta. Pro výrobu se však vzhledem k jejich organoleptickým vlastnostem používá kombinace s jinými kulturami. Při výrobě se používá oddělená kultivace tradičních zákysů a probiotických kultur, oddělená fermentace mléka a následné smíchání koagulátů, přídavek rychle prokysávající kultury předcházený začátkem fermentace probiotickou kulturou nebo fermentace mléka tradiční kulturou s následným přídavkem koncentrované kultury před balením (HRABĚ a kol, 2007).

3.8.4. Požadavky na mléko pro výrobu fermentovaných výrobků Mléko určené na výrobu fermentovaných výrobků musí být především prosté inhibičních látek, musí mít výbornou kysací schopnost (minimálně 25 SH) a vysokou tukuprostou sušinu (nejméně 8,5%). Dále je požadován vyšší obsah bílkovin, nižší obsah somatických buněk a nízký počet především psychrotrofních mikroorganismů, které mají za následek vady v konzistenci, chuti a vůni (ŠUSTOVÁ, 2006). Obsah vzduchu v mléce používaném pro fermentované mléčné výrobky musí být co nejnižší, zvlášť pokud je pro fermentaci použito anaerobních mikroorganizmů (rod Bifidobacterium). Deareace má pozitivní vliv na růst mikroorganismů a zlepšuje průběh homogenizace, snižuje riziko napalování při tepelném ošetření mléka, zvyšuje viskozitu a odstraňuje nežádoucí těkavé látky (KADLEC, 2002).

3.8.5 Legislativní úprava probiotik

V rámci EU neexistuje žádný legislativní předpis, který by upravoval uvádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh. V České republice je používání probiotik vymezeno Vyhláškou č. 446/2004 Sb., kterou se stanoví požadavky na doplňky stravy a na obohacování potravin potravními doplňky. V příloze č. 2 k Vyhlášce MZe ČR č. 77/2003 Sb. - Fyzikální, chemické a mikrobiologické požadavky na jednotlivé mléčné výrobky a na druhy mikroorganismů mléčného kysání - jsou uvedeny druhy a minimální množství živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích.

3.9 Faktory ovlivňující stabilitu a životaschopnost probiotik Řadu let se hledají způsoby, jak zvýšit stabilitu probiotických bakterií. Probiotika jako živé bakterie jsou velmi nestabilní. Dříve, než se dostanou na místo určení, tj. do střev, umírají během uchovávání nebo vlivem kyselého prostředí v žaludku (HAVEL, 2005). Stabilita probiotických bakterií je v přípravcích časově omezena na pár měsíců a musí se udržovat v chladničce. I životnost probiotických bakterií, např. v různých jogurtech, je omezena jen na několik dní, i přesto výrobci uvádějí delší záruční lhůty (LISÁK, 2009). Přežití probiotické kultury ve výrobku závisí na interakci mezi přítomnými druhy, velikosti inokula, teplotě, trvání fermentace, skladovací teplotě, konečné kyselosti, použitém kmeni a složení fermentačního média (MALCATA, 1999; LOURENS-HATTINGH, 2001). Mnoho kmenů mléčných bakterií používaných k výrobě jogurtů nedokáže kolonizovat lidské střevo. Tyto přípravky často také neobsahují bakteriové druhy a počty zárodků. Při výrobě probiotického přípravku využívá technologie obalení probiotických bakterií, která je chrání při průchodu trávícím traktem. Tak zůstanou probiotické bakterie plně životaschopné, dokud nedosáhnou místa svého primárního působení (LISÁK, 2009).

4 MATERIÁL A METODY

4.1 Použitý materiál 4.1.1 Kultivační média •

MRS médium – Noack, Francie

•

BSM médium – Fluka, USA

MRS médium bylo použito pro kultivaci bakterií mléčného kvašení rodu Lactobacilus.. Pro stanovení L. acidophilus bylo použito médium MRS - clindamycin s přídavkem clindamycinu (0,5 mg/l, Sigma-Aldrich, Německo). Pro stanovení bakterií rodu Bifidobacterium bylo použito médium BSM s přídavkem směsi antibiotik pro selektivní stanovení bifidobakterií v mléčných výrobcích (BSM suplement).

4.1.1.1 MRS médium

Složení MRS média Polypepton

10,0 g

Masový extrakt

10,0 g

Kvasničný extrakt

5,00 g

Glukóza

20,0 g

Tween 80

1,00 g

Fosforečnan draselný

2,00 g

Octan sodný

5,00 g

Citrát amonný

2,00 g

Síran hořečnatý

0,20 g

Síran manganatý

0,05 g

Bakteriologický agar

15,0 g

Destilovaná voda

1000 ml

pH připraveného média je při 25 °C 5,7 ± 0,1.

Na 1 litr destilované vody bylo použito 70,3 g půdy v dehydratovaném stavu. Půda byla sterilována a před použitím ochlazena na teplotu cca 42 °C.

4.1.1.2 MRS- clindamycin médium

Na 1 litr destilované vody bylo použito 70,3 g půdy v dehydratovaném stavu. Po sterilaci a zchlazení bylo přidáno antibiotikum clindamycin, a to ve výsledné koncentraci 0,5 mg/l.

4.1.1.3 BSM médium

Na 1 litr destilované vody bylo použito 55,0 g půdy v dehydratovaném stavu. Po sterilaci a zchlazení byla přidána směs antibiotik BSM suplement a to v konečné koncentraci 0,116 g/l.

4. 1. 2 Použité vzorky

V experimentu bylo použito šest druhů zakysaných mléčných výrobků BIFIDRINK (výrobce Hollandia Karlovy Vary, a.s.) s různou příchutí a čtyři nápoje ACIDOFILO (výrobce Meggle, s.r.o.). Označení vzorků je uvedeno v Tab. 3. Výrobce na obalu těchto produktů deklaruje přítomnost dvou probiotických druhů, a to Bifidobacterium spp. a L. acidophilus.

Tab. 3 Označení vzorků Označení Název výrobku

vzorku č.

Bifidrink, jahoda

1

Bifidrink, jablko a banán

2

Bifidrink, granátové jablko

3

Bifidrink, zelený čaj

4

Bifidrink, pomeranč

5

Bifidrink, espresso

6

Acidofilo, 1%

Vzorek A

Acidofilo, 3,6%

Vzorek B

Acidofilo, jahoda

Vzorek C

Obr. 6 Vzorek č.1 - Bifidrink, jahoda s cereáliemi (energie:39,8 kJ, obsah tuků:3,2 g, obsah sacharidů:12,7 g, obsah bílkovin:3,27 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 7 Vzorek č.2 - Bifidrink, jablko a banán s cereáliemi (energie:394 kJ, obsah tuků:3,25g, obsah sacharidů:12,83 g, obsah bílkovin:3,27 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 8 Vzorek č.3 - Bifidrink, jablko a banán s cereáliemi (energie:376,3 kJ, obsah tuků:3,25g, obsah sacharidů:11,95 g, obsah bílkovin:3,1 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 9 Vzorek č.4 - Bifidrink, zelený čaj (energie:390,6 kJ, obsah tuků:3,25 g, obsah sacharidů: 12,79 g, obsah bílkovin:3,11 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 10 Vzorek č.5 - Bifidrink, zelený čaj (energie:372,2 kJ, obsah tuků:3,25 g, obsah sacharidů: 11,7 g, obsah bílkovin:3,1 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 11 Vzorek č. 6 - Bifidrink, espresso (energie:413,3 kJ, obsah tuků: 3,25g, obsah sacharidů:14,3g, obsah bílkovin: 3,11 g, skladování: 4-8°C)

Obr. 12 Vzorek A - Acidofilo, 1% (energie:170 kJ, obsah tuků: 1 g, obsah sacharidů: 4,8 g, obsah bílkovin: 3,2 g, skladování)

Obr. 13 Vzorek B - Acidofilo, 3,6% (energie:270 kJ, obsah tuků:3,6 g, obsah sacharidů: 4,7 g, obsah bílkovin:3,2g, skladování)

Obr. 14 Vzorek C - Acidofilo, jahoda (energie:380 kJ, obsah tuků:3g, obsah sacharidů:13,3, obsah bílkovin: 2,7 g, skladování)

4.1.3 Použité chemikálie

Clindamycin (0,5 mg/l) - Sigma-Aldrich, Německo BSM suplement (0,116 g/l) - Fluka, USA Fyziologický roztok – NOACK, Francie

4.1.4 Použité přístroje

Laboratorní váhy – Biotech, Česká republika Termostat - Biotech, Česká republika Chladnička K4260 - Liebherr, SRN/Rakousko Chladnička PREMIUM – Liebherr, SRN/Rakousko Autokláv – Scholler instruments, Česká republika Vodní lázeň - Scholler instruments, Česká republika

Stomacher – Biotech, Česká republika Mikropipety - Biotech, Česká republika Vortex – Biotech, Česká republika pH metr GRYF 259 – Gryf, Česká republika Elektroda PCL 321/tD - Gryf, Česká republika

4.1.5 Použité pomůcky

Petriho misky – MERCI, Česká republika Zkumavky - MERCI, Česká republika Anaerostaty – Oxoid, Anglie Vyvíječe anaerobního prostředí – Merck, Německo Jednorázový spotřební materiál

4.2 Metody

4.2.1 Stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení

Mezofilní bakterie mléčného kvašení jsou bakterie, které za podmínek specifikovaných normou ČSN ISO 6610 vytvářejí kolonie na tuhé selektivní půdě (MRS o pH = 5,7) po inkubaci při 30 °C 72 hodin. Jedná se zejména o bakterie rodu Lactobacilus, Streptococcus a Pediococcus a Lactococcus..

4.2.1.1 Příprava kultivační půdy

1. Bylo naváženo do skleněné reagenční láhve potřebné množství dehydratované půdy a zalito destilovanou vodou. 2. Reagenční láhev byla ponechána 10 minut v klidu, aby došlo k nabobtnání agaru. 3. Láhev byla vložena do autoklávu a sterilována při 121 °C 15 minut. 4. Po sterilaci byla láhev vložena do vodní lázně vytemperované na 45°C.

4.2.1.2 Příprava ředění

1. Odběrové místo vzorku potraviny bylo vydezinfikováno tamponem namočeným v 70 % ethanolu. 2. Do sterilního sáčku bylo naváženo 10,0 ± 0,1 g 3. Navážka byla asepticky zalita za pomoci sterilního odměrného válce 90 ml fyziologického roztoku laboratorní teploty. 4. Sáček byl vložen do stomacheru a homogenizován 60 s. 5. Další desetinné ředění bylo připraveno přenesením 1 ml výchozí (předchozí) suspenze novou sterilní pipetou do sterilní zkumavky s předem odměřenými 9 ml fyziologického roztoku. Obsah byl promíchán pomocí vortexu po dobu 5-10 s.

4.2.1.3 Inokulace misek, zalévání, kultivace

1. Petriho misky byly položeny dnem vzhůru a řádně popsány. 2. Z každého ředění souběžně do dvou sterilních Petriho misek bylo přeneseno sterilní pipetou 1 ml suspenze doprostřed misky. 3. Inokulum v každé Petriho misce bylo přelito 15 ml rozehřáté půdy MRS ochlazené na 45 °C. Obsah v misce byl řádně promíchán a ponechán ztuhnout. 4. Po ztuhnutí byly misky přelity asi 10 ml rozehřáté půdy MRS ochlazené na 45 °C.

5. Naočkované Petriho misky byly vloženy dnem vzhůru do termostatu a kultivovány při 30 °C 72 hodin.

4.2.1.4 Hodnocení

Po skončení inkubace se pro výpočet použily misky obsahující ne více než 300

KTJ

ve

dvou

po

sobě

jdoucích

ředěních

(BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007).

4.2.2 Stanovení počtu Lactobacillus acidophillus


1. Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo potřebné množství dehydratované půdy a zalito destilovanou vodou. 2. Reagenční láhev byla ponechána 10 minut v klidu, aby došlo k nabobtnání agaru. 3. Láhev byla vložena do autoklávu a sterilována při 121 °C 15 minut. 4. Po sterilaci byla láhev vložena do vodní lázně vytemperované na 45 °C. 5. Před použitím byl přidán clindamycin v konečné koncentraci 0,5 mg/l.

4.2.2.2 Příprava ředění Viz. 4.2.1.2


1. Petriho misky byly položeny dnem vzhůru a řádně popsány. 2. Z každého ředění souběžně do dvou sterilních Petriho misek bylo přeneseno sterilní pipetou po 1 ml suspenze doprostřed misky.

3. Inokulum v každé Petriho misce bylo přelito 15 ml rozehřáté půdy MRS s clindamycinem ochlazené na 45 °C. Obsah v misce byl řádně promíchán a ponechán ztuhnout. 4. Po ztuhnutí byly misky přelity 10 ml rozehřáté půdy MRS s clindamycinem ochlazené na 45 °C. 5. Naočkované Petriho misky byly vloženy dnem vzhůru do termostatu a kultivovány při 37 °C 72 hodin.

4.2.2.4 Hodnocení Viz. 4.2.1.4

4.2.3 Stanovení počtu Bifidobacterium sp.


1. Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo potřebné množství dehydratované půdy a zalito destilovanou vodou. 2. Reagenční láhev byla ponechána 10 minut klidu, aby došlo k nabobtnání. 3. Láhev byla vložena do autoklávu a sterilována při 121 °C 15 minut. 4. Po sterilaci byla láhev vložena do vodní lázně předem vytemperované na 45 °C. 5. Před použitím byl přidán BSM suplement připravený dle návodu výrobce.

4.2.3.2 Příprava ředění Viz. 4.2.1.2


1. Petriho misky byly položeny dnem vzhůru a řádně popsány.

2. Z každého ředění souběžně do dvou sterilních Petriho misek bylo přeneseno sterilní pipetou po 1 ml suspenze doprostřed misky. 3. Inokulum v každé Petriho misce bylo přelito 25 ml rozehřáté půdy BSM s BSM suplementem ochlazené na 45 °C. Obsah v misce byl řádně promíchán a ponechán ztuhnout. 4. Naočkované Petriho misky byly vloženy dnem vzhůru do anaerostatu, kde byl vložen vyvíječ anaerobní atmosféry a indikátor anaerobního prostředí. Kultivace probíhala při 37 °C 72 hodin.

4.2.3.4 Hodnocení

Viz. 4.2.1.4

4.2.3.5 Vyjádření výsledků

Kvantitativní stanovení bakterií mléčného kvašení bylo provedeno dle ČSN ISO 15214. Selektivní stanovení L. acidophilus, Bifidobacterium sp. bylo provedeno dle Burdychové (2007). Pro správnost (platnost) výsledků se obecně předpokládá za nezbytné, aby alespoň jedna plotna vybraná pro výpočet obsahovala minimálně 15 kolonií. Výsledek byl zaokrouhlen tak, aby obsahoval pouze dvě platné číslice (různé od nuly) a byl vyjádřen jako počet mikroorganismů (KTJ) v gramu výrobku. Počet mikroorganismů N přítomných ve zkušebním vzorku byl vypočítán jako vážený průměr ze dvou po sobě následujících ředění podle následujícího vzorce (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007).

N= ∑C

∑C V ( n1 + 0,1n 2) d

součet

kolonií

mikroorganismů

ve

vybraných

miskách

(nebo

všech

konfirmovaných buněk ve vybraných miskách) n1

počet vybraných misek z prvního ředění

n2

počet vybraných misek z druhého ředění

d

ředící faktor odpovídající prvnímu pro výpočet použitému ředění

V

objem inokula v ml očkovaného na každou plotnu

4.2.4 Měření pH Při laboratorní teplotě byly odečteny hodnoty pH přímým ponořením pH metru do zkoušeného vzorku.

5 VÝSLEDKY A DISKUZE

5.1 Testování probiotických kultur Probiotické kultury byly kultivovány na pevných půdách MRS a BSM dle podmínek metody uvedených v kapitole 4.2.2 a 4.2.3. Mimo stanovení probiotických kultur bylo provedeno také stanovení bakterií mléčného kvašení, dle podmínek uvedených v kapitole 4.2.1. Podmínky kultivace, velikost kolonií a vzhled kolonií jsou uvedeny v Tab. 4.

Tab. 4 Podmínky kultivace, velikost kolonií a vzhled kolonií probiotických kultur

Stanovení

Podmínky kultivace

Velikost kolonií

Vzhled kolonií

1,5 - 2,5 mm

lesklé, fialové, vypouklé

0,5 - 1,0 mm

krémové, drobné, nepravidelné

anaerobně Bifidobacterium sp.

37 °C 72 hodin anaerobně

L. acidophilus

37 °C 72 hodin

Kolonie vykazovaly při uvedených podmínkách kultivace charakteristický vzhled. Vzhled jednotlivých kolonií uvádí Obr. 15 - Obr. 17.

Obr. 15 Bakterie mléčného kvašení na půdě MRS

Obr. 16 Lactobacillus acidophilus na půdě MRS s clindamycinem

Obr. 17 Bifodobacterium sp. na půdě BSM s BSM suplementem

5.2 Testování výrobků BIFIDRINK a ACIDOFILO

5.2.1 Analýza počtu KTJ/ml u jednotlivých stanovení

Fermentované mléčné výrobky byly analyzovány dle metod uvedených v kapitole (4.2.1 – 4.2.3). Jednotlivé vzorky byly naočkovány na kultivační půdu v požadovaném ředění. Podmínky kultivace jsou uvedeny v Tab. 5. Tab. 5 Podmínky kultivace a vzhled kolonií u jednotlivých stanovení

Stanovení Bakterie mléčného kvašení

Podmínky kultivace anaerobně 30°C 72 hodin anaerobně

Bifidobacterium sp.

37°C 72 hodin

anaerobně L. acidophilus

37°C 72 hodin

Analyzováno bylo vždy šest výrobky jedné šarže u každé příchuti Bifidrinku a tři výrobky Acidofila. Analýza probíhala vždy na začátku (v době koupě) a na konci doby trvanlivosti, a to na přítomnost a počet kolonie tvořících jednotek na gram výrobku (KTJ * g¯¹). V Tab. 6 - 10 jsou uvedeny výsledky získané dle ČSN 6610 a ČSN ISO 8261. Interval spolehlivosti byl zvolen na hladině statistické významnosti 95 %. Zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorcích uvádí Obr. 18 – Obr. 22.

Tab. 6 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 1, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Kvantitativní zastoupení probiotik ve vzorku č. 1 (KTJ * g¯¹) Den zakoupení

Konec doby minimální trvanlivosti

Bifidobacterium sp.

(1,69±0,04) * 10⁷

(2,89±0,06) * 10⁸

BMK

(2,27±0,06) * 10⁷

(3,13±0,06) * 10⁷

L.acidophilus

(8,07±0,03) * 10³

(4,27±0,06) * 10⁴



Bifidobacterium sp.

(4,18±0,06) * 10⁷

(3,23±0,06) * 10⁸

BMK

(7,57±0,06) * 10⁶

(2,88±0,08) * 10⁷

L.acidophilus

(2,73±0,06) * 10³

(7,22±0,03) * 10³



Bifidobacterium sp.

(3,32±0,01) * 10⁷

(2,01±0,01) * 10⁸

BMK

(6,39±0,07) * 10⁶

(2,48±0,06) * 10⁷

L.acidophilus

(2,72±0,06) * 10³

(2,20±0,05) * 10³



Bifidobacterium sp.

(1,13±0,01) * 10⁸

(6,45±0,07) * 10⁸

BMK

(1,76±0,05) * 10⁷

(2,53±0,06) * 10⁷

L.acidophilus

(6,79±0,01) * 10³

(2,15±0,05) * 10⁴



Bifidobacterium sp.

(5,74±0,02) * 10⁷

(3,23±0,06) * 10⁸

BMK

(3,61±0,01) * 10⁷

(1,07±0,1) * 10⁷

L.acidophilus

(1,22±0,03) * 10⁴

(7,23±0,03) * 10³



Bifidobacterium sp.

(5,44±0,02) * 10⁶

(3,13±0,06) * 10⁸

BMK

(1,18±0,03) * 10⁷

(1,07±0,03) * 10⁷

L.acidophilus

(7,27±0,06) * 10³

(4,41±0,04) * 10⁴

K markantnímu nárůstu počtu mikroorganismů Bifidobacterium sp. došlo u vzorku č. 6 (viz. Obr. 18), jejichž počet stoupl během analýzy o dva řády, a to z počáteční hodnoty (5,44±0,02) * 10⁶ na konečnou (3,13±0,06) * 10⁸. Naopak k nejmenšímu nárůstu došlo u vzorku č. 4, kde byla naměřena počáteční hodnota 1,13±0,01 * 10⁸ a konečná hodnota 6,45±0,07 * 10⁸. U všech ostatních vzorků došlo během analýzy ke zvýšení počtu mikroorganismu Bifidobacterium sp. o jeden řád.

Obr. 18 Zastoupení Bifidobacterium sp. ve vzorcích Bifidrinku

K největšímu nárůstu počtu mikroorganismů BMK došlo u vzorku č. 2 a 3, a to o jeden řád (viz Obr. 19). Vzorek č. 2, u kterého byla počáteční hodnota BMK 7,57±0,06 * 10⁶ vzrostla na hodnotu 2,88±0,08 * 10⁷ a u vzorku č. 3 to bylo z hodnoty 6,39±0,07 * 10⁶ na hodnotu 2,48±0,03 * 10⁷. U vzorků č. 1 a č. 4 došlo k mírnému zvýšení v rámci řádu. U vzorků č. 5 a č. 6 naopak došlo ke konci doby trvanlivosti ke snížení počtu BMK. U vzorku č. 6 jen nepatrně, avšak u vzorku č. 5 to bylo z hodnoty 3,61±0,01 * 10⁷ na hodnotu 1,07±0,1 * 10⁷.

Obr. 19 Zastoupení BMK ve vzorcích Bifidrinku

Obr. 20 Zastoupení L. acidophilus ve vzorcích Bifidrinku

Tab. 12 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku A, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Kvantitativní zastoupení probiotik ve vzorku A (KTJ * g¯¹) Den zakoupení


BMK

(1,49±0,01) * 10⁷

(1,49±0,02) * 10⁷

L. acidophilus

(6,78±0,03) * 10⁶

(1,12±0,03) * 10⁷

Tab. 13 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku B, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Kvantitativní zastoupení probiotik ve vzorku B (KTJ * g¯¹) Den zakoupení


BMK

(7,22±0,03) * 10⁷

(1,58±0,03) * 10⁷

L. acidophilus

(4,12±0,03) * 10⁶

(1,18±0,03) * 10⁷

Tab. 14 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku C, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Kvantitativní zastoupení probiotik ve vzorku C (KTJ * g¯¹) Den zakoupení


BMK

(1,28±0,03) * 10⁶

(1,03±0,03) * 10⁷

L. acidophilus

(9,03±0,03) * 10⁵

(5,29±0,02) * 10⁶

U vzorku A prakticky nedošlo k žádné změně zastoupení BMK v průběhu celé analýzy (viz. Obr. 21). Vzorek B vykazoval snížení v rámci řádu, naopak vzorek C vykazoval zvýšení o řád, a to z hodnoty 1,28±0,03 * 10⁶ na hodnotu 1,03±0,03 * 10⁷.

Obr. 21 Zastoupení BMK ve vzorcích Acidofilo Při analýze počtu L. acidophilus došlo u vzorku A k nárůstu o jeden řád z hodnoty 6,78±0,03 * 10⁶ na hodnotu 1,12±0,03 * 10⁷ (viz. Obr. 22). Stejně tak i u vzorku B došlo k nárůstu z hodnoty 4,12±0,03 * 10⁶ na hodnotu 1,18±0,03 * 10⁷. U vzorku C byla počáteční hodnota 9,03±0,03 * 10⁵. Tato hodnota však nevyhovuje legislativním požadavkům. Ke konci doby trvanlivosti se počet L. acidophilus zvýšil na hodnotu 5,29±0,02 * 10⁶.

Obr. 22 Zastoupení L. acidophilus ve vzorcích Acidofilo

5.2.2

Stanovení pH

Hodnoty pH byly měřeny vždy v době koupě na začátku analýzy a na konci doby trvanlivosti. Analyzovány byly všechny výrobky Bifidrinku a Acidofila. Výsledky jsou uvedeny v Tab. 15 - Tab. 16 a Obr. 23 - Obr. 24.

Tab. 15 Hodnoty pH u jednotlivých vzorků Bifidrinku, interval spolehlivosti IS 0,05

Vzorek č.

Hodnoty pH Doba koupě

1 2 3 4 5 6

(5,03±0,01) (5,15±0,01) (5,12±0,01) (5,06±0,06) (5,04±0,01) (5,08±0,01)

Konec doby minimální trvanlivosti (5,0±0,01) (5,08±0,01) (5,04±0,01) (5,01±0,01) (5,0±0,01) (5,01±0,01)

Nejvyšší počáteční hodnota byla zjištěna u vzorku č. 2 (viz. Obr. 23) a nejnižší pak u vzorku č. 1. U vzorků č. 1 - č. 4 došlo v průběhu analýzy ke snížení hodnoty pH, u vzorků č. 5 a č. 6 ke zvýšení hodnoty pH. Je to nejspíš následek snížení CPM v průběhu analýzy u těchto vzorků.

Obr. 23 Hodnoty pH u Bifidrinku

Tab. 16 Hodnoty pH u jednotlivých vzorků Acidofila, interval spolehlivosti IS 0,05

Hodnoty pH u Acidofila Vzorky

Doba koupě


A

(4,67±0,02)

(4,54±0,03)

B

(4,78±0,01)

(4,80±0,05)

C

(4,75±0,01)

(4,66±0,02)

V průběhu analýzy došlo u vzorku A k poklesu pH z hodnoty 4,67 na hodnotu 4,54 (viz. Obr. 24). U vzorku C došlo také ke snížení pH z hodnoty 4,75 na 4,66. U vzorku B naopak došlo ke zvýšení, avšak nepatrnému, a to z hodnoty 4,78 na 4,80.

Obr. 24 Hodnoty pH u Acidofila

5.2 Diskuze Cílem této práce bylo pomocí kultivačních metod stanovit počty probiotických mikroorganismů ve vybraných mléčných výrobcích běžně se nacházejících v tržní síti a sledovat jejich počet na začátku koupě a na konci doby trvanlivosti. Byl stanoven celkový počet probiotických mikroorganismů mléčné fermentace a zvlášť počet bakterií rodu Bifidobacterium a L. acidophilus. Počty L. acidophilus byly stanoveny na médiu MRS - clindamycin při anaerobní kultivaci při 37 °C 72 hodin. Celkový počet bakterií mléčného kvašení byl stanoven na médiu MRS. Obsah Bifidobacterium sp. byl stanoven na médiu BSM při anaerobní kultivaci při 37 °C 72 hodin. Obsah těchto kultur byl deklarován na obale výrobcem. Kysané mléčné výrobky byly srovnány mezi sebou podle stanoveného počtu mikroorganismů. U

analyzovaných

výrobků

došlo

k velmi

výrazným

změnám

počtu

mikroorganismů. U vzorků Bifidrinku došlo k největšímu nárůstu Bifidobacterium sp. u vzorku č. 6 a to o dva řády. U ostatních vzorků počet mikroorganismů v průběhu analýzy vzrostl o jeden řád. Výjimkou je vzorek č. 4, u kterého došlo ke zvýšení, ale pouze v rámci řádu. Obsah BMK vzrostl na konci analýzy nejvíce u vzorku č. 2 a č. 3, a to o jeden řád. U vzorků č. 5 a č. 6 naopak došlo ke konci doby trvanlivosti ke snížení

počtu BMK, avšak v rámci řádu 10⁷, což vyhovuje legislativním požadavkům. Obsah L. acidophilus se pohyboval v řádu 10³ a na konci doby trvanlivosti v řádu 10⁴. Tyto hodnoty nevyhovují legislativním požadavkům, avšak obsah této kultury nebyl u tohoto výrobku na obale deklarován. Vzorky Acidofila vykazovaly na konci doby analýzy zvýšený počet mikroorganismů L. acidophilus. Avšak na začátku analýzy byl zjištěn počet pohybující se v řádu pouze 10⁶ a u vzorku C dokonce 10⁵, což legislativně nevyhovuje, neboť obsah L.acidophilus musí být obsažen v množství 10⁷ v jogurtu a 10⁶ v acidofilním mléce. Obsah Bifidobacterium sp. u vzorku A nevykazoval žádnou změnu počtu na konci doby trvanlivosti. Vzorek B vykazoval snížení v rámci řádu, naopak vzorek C vykazoval zvýšení o řád, a to z hodnoty 1,28±0,03 * 10⁶ na hodnotu 1,03±0,03 * 10⁷. Mikroorganismy jsou ve výrobcích vystaveny působení stresu, což vede k tomu, že i když jsou ve výrobku přítomny, nejsou schopny růstu. Proto jsou tyto výrobky většinou obohaceny ještě o další látky, které pomohou mikroorganismům překonat nepříznivé podmínky chladu a nedostatku živin. Bifidobakterie vykazují v mléce pouze slabý nárůst. Potřebují přídavek růstových faktorů, aby dosáhly požadovaného počtu. Růst bifidobakterií podporuje například κ-kasein, α-laktalbumin,β-laktoglobulin, kvasničný extrakt, threonin, cystein, pepton, dextrin, maltosa a hydrolyzáty kaseinu, D-glukózamin, α-ethyl-N-acetyl-Dglukózamin, N-karboetoxy-D-glukózamin, N-acetylglukózamin, N-acetyl-laktoamin, NN-diacetylchitobióza a N-acetylneuraminová kyselina (MAXA, RADA, 2002). Významný vliv na růst bifidobakterií má i Streptococcus thermophilus, který při svém metabolismu spotřebovává kyslík a tím podporuje i jejich růst (LOURENSHATTINGH, VILJOEN, 2001). Přežití kultury bifidobakterií ve výrobku závisí též na velikost inokula, složení fermentačního média, skladovací teplotě, cukerném zdroji, dostupnosti živin, růstových promotorů a v neposlední řadě na konečné kyselosti produktu. Aby nedošlo k poklesu populace bifidobakterií, nemělo by konečné pH produktu klesnout pod hodnotu 4,6. U výrobků, kde bylo zjištěn nejmenší počet bakterií rodu Bifidobacterium zřejmě hrál roli některý z výše uvedených faktorů (LOURENS-HATTINGH, VILJOEN, 2001). Růst bakterie Lactobacillus acidophilus stimuluje kaseinový hydrolyzát, koncentrát syrovátkových bílkovin, fruktosa, rajčatová šťáva, kyselina octová a minerální látky (MAXA, RADA, 2002; NEVORAL, 2005). Vzhledem k nákladnosti

obohacování výrobků

aminosacharidy se některé výrobky fortifikují prebiotickými

oligosacharidy, které jsou v tlustém střevě specificky těmito bakteriemi fermentovány. Patří mezi ně galaktooligosacharidy, inulin, rafinosa, fruktooligosacharidy a jiné (NEVORAL, 2005). Probiotické bakteriální kultury modulují růst mikrobiální flóry, potlačují potenciální škodlivé bakterie a posilují přirozenou lidskou obranyschopnost (GIRAFFA a kol., 2010). Probiotika patří ke zdravému životnímu stylu velké části obyvatel a jsou proto velmi důležitou a dynamicky se vyvíjející součástí potravinářského průmyslu.

6 ZÁVĚR

V této práci byl zpracován literární přehled týkající se problematiky probiotik. Charakteristicky byly popsány probiotické rody, jejich účinky a také technologie výroby mléčných výrobků.

Pro vlastní analýzu bylo zvoleno šest fermentovaných mléčných výrobků BIFIDRINK s různou příchutí a tři výrobky ACIDOFILO. Na obalu Bifidrinku výrobce deklaruje přítomnost Bifidobacterium sp. a na Acidofilu přítomnost L. acidophilus. Byl analyzován počet živých probiotických druhů.

V analýze

bylo

zjištěno,

že

kvantitativní

zastoupení

probiotických

mikroorganismů ne vždy odpovídalo požadavkům české legislativy a bylo potvrzeno, že údaje deklarované výrobcem tedy nejsou pravdivé. Největší nedostatky byly zjištěny u vzorku Acidofila s příchutí jahody, kdy počáteční hodnota byla zjištěna 9,03±0,03 * 10⁵, což nevyhovuje legislativním požadavkům na obsah probiotické kultury L. acidophilus. Ostatní výrobky mohou být spotřebitelům doporučeny a to v množství minimálně 100g denně.

7 POUŽITÁ LITERATURA ANONYM, 2008: Probiotika zmírní spoušť po antibiotikách, Právo, Dostupné z: http://www.forsapi.cz/menu-2/clanky/probiotika-zmirni-spoust-po-antibiotikach.htm

ANONYM, 2009: Pod ochranou probiotik, periodika Překvapení, str. 34

ANONYM, 2010: Masticha-zabiják helicobacter pylori, Dostupné z: http://www.masticha.cz/masticha---zabijak-helicobacter-pylori BROUWER, M. L., 2006: No effects of probiotics on atopic dermatitis in infancy: a randomized placebo-controlled trial. Clinical and Experimental Allergy, vol. 36, pg. 899 BURDYCHOVÁ, R., 2008: Sledování počtu probatických mikroorganismů ve fermentovaných mléčných výrobcích, Sborník přednášek semináře Mléko a sýry, VŠCHT Praha BURDYCHOVÁ, R., 2007: Identifikace a charakteristika bakterií rodu Enterococcus určených pro výrobu funkčních potravin, Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis., sv. LV, č. 2, s. 9-14. ISSN 1211-8516. BURDYCHOVÁ, R., 2007: Mikrobiologická detekce probiotických mikroorganismů ve fermentovaných

mléčných

výrobcích.

Acta

Universitatis

Agriculturae et

Silviculturae Mendelianae Brunensis., sv. LV, č. 2, s. 15-20. ISSN 1211-8516. BURDYCHOVÁ, R., SLÁDKOVÁ, P., 2007: Mikrobiologická analýza potravin. 1. vyd. Brno : Ediční středisko MZLU v Brně, 218 s. ISBN 9788073751166. BURDYCHOVÁ, R., 2007 : Mikrobiologická analýza potravin. Přednášky, MZLU Brno BURTON, J. P., WESCOMBE, P.A., MOORE, C.J., CHILCOTT, C.N., TAGG, J.R., 2006: Safety assessment of the oral cavity probiotic Streptococcus salivarius K12. Appl. Environ. Microbiol., 72(4): 3050–3053.

FRIČ, P., 2007: Probiotika, prebiotika a atopie. Dermatologie pro praxi, roč. 1, č. 2, s. 87-8914. FERENČÍK, M., EBRINGER, L., 2002: Možnosti využitia probiotík v prevencii a terapii alergických chorôb. Alergie, s. 1-9. FULLER, R., 1989: Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol., 66(5): 365–378. GILL, C.I.R., ROWLAND, I.R., 2002: Diet and cancer: assessing the risk. British Journal of Nutrition, Vol. 88, Iss. S1; pg. 73 GIRAFFA, G.,CHANISHVILI, N., WIDYASTUTI,Y., 2010: Importance of lacobacilli in food and feed biotechnology, Research in Microbiology, GÖRNER, F., VALÍK, L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, 528 s. HRONEK, M., 2004: Výživa ženy v obdobích těhotenství a kojení, Praha, Maxdorf, s.256, ISBN 80-7345-013-5 HAVEL,

P.,

2005:

Nová

generace

probiotik,

Dostupné

z:

http://www.foodnet.cz/polozka/?jmeno=Nov%E1+generace+Probiotik&id=7238&food net=cd591633f808aa0ecd57041094e84ac5 HENKER, J., LAASS, M., BLOKHIN, B.M., BOLBOT, Y.K, MAYDANNIK, V.K. ELZE, M., WOLFF, C., SCHULZE, J., 2007: The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) stops acute diarrhoea in infants and toddlers., Eur. J. Pediatr., 166(4): 311–318. HOŘEJŠÍ, J., 2008: Probiotika a prebiotika-fascinace místo podceňování, Medical tribune, Dostupné z: http://www.tribune.cz/clanek/12378 HRABĚ, J., BUŇKA, F., HOZA, I., BŘEZINA, P., 2007: Technologie výroby potravin živočišného původu, 1. Vyd., Zlín:Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 186 s., ISBN:97880-7318-521-3. HRONEK, M., KUDLÁČKOVÁ, Z., 2005: Probiotika a prebiotika v profylaxi a terapii poruch GIT a v prevenci karcinogeneze. Praktické lékárenství, roč. 1, č. 1, s. 41-42

KAŇKOVÁ, K. aj., 2003: Patologická fyziologie pro bakalářský studijní program, Brno: Masarykova univerzita, s. 42-47 KADLEC, P., 2002: Technologie potravin II, 1. Vyd. Praha: VŠCHT, 236 s., ISBN: 807080-510-2 KOHOUT, P., 2008: Probiotika a jejich užití v klinické praxi, Lékařské listy, březen, str. 29. Dostupné z: http://www.forsapi.cz/menu-2/clanky/probiotika-a-jejich-uziti-vklinicke-praxi.htm KOMPRDA, T., 2008: Funkční potraviny. Cyklus přednášek, SBN 978-80-7375-219-4. KOMPRDA, T., 2003: Základy výživy člověka, Brno, cyklus přednášek LESBROS-PANTOFLICKOVA, D. - CORTHÉSY-THEULAZ,I – BLUM, A.L., 2007: Helicobacter pylori and probiotics. The Journal of Nutrition, 2007, vol. 137, iss. 3S, pg. 812S- 816S. LIONG, M. T., 2007: Probiotics: A critical Reviw od their Potential Role as Antihypertensives, immune Modulators, Hypocholesterolemics, and Preimenopausal Treatments. Nutrition Reviews, vol. 65, No 7, pg. 320 LISÁK, [online]. [cit. 2010-15-03], Dostupné z: http://www.aloeinfo.cz/probiotika LOURENS-HATTINGH A., VILJOEN, B., 2001: Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal, s. 1–17. MAXA, V., RADA, V., 2002: Význam bifidobakterií a bakterií mléčného kvašení pro výživu a zdraví, 2. vydání, Praha: ÚZPI, 40 s. ISBN 80-85120-57-7

MALCATA F. X, GOMES A., 1999: Bifidibacterium spp. and Lactobacillus Acidophilus biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science and Technology, s.139-157.

MARTEAU, P. R., et al., 2001: Protection from gastrointestinal diseases with the use of probiotics. American Journal of Clinical Nutrition [online], [cit. 2008-12-20], s. 430436. Dostupný z : .

MUTUOGLU, M., ISIKGOR, S., TOSUN, S., 2006: Effects od probiotics on the severity of experimental acute panceratitis. Europian Journal of Cilinical Nutrition, vol. 60, pg. 265-268. NEVORAL, J. aj., 2005: Probiotika, prebiotika a synbiotika. Pediatrie pro praxi, roč. 6, č. 2, s. 59-65, Dostupné z http://www.pediatriepropraxi.cz NEVORAL, J., 2009: Probiotika a jejich praktické využití, Postrgraduální medicína, str. 14, [cit. 06-02-2010], Dostupné z: http://www.forsapi.cz/menu-2/clanky/probiotika-ajejich-prakticke-uziti.htm PARVEZ S., MALIK, K.A., AH KANG, S., KIM, H.Y., 2006: Probiotics and their fermented food products are beneficial for health. J. Appl. Microbiol., 100(6): 1171– 1185. QUIGLEY, E. M. M., 2010: Prebiotics and probiotics; modifying and mining the microbiota, Pharmacological Research, s.213-218 ROLFE R.D., 2002 : The Role of Probiotic Cultures in the Control of Gastrointestinal Health, J. Nutr., 130: 396–402. SIMEONOVOVÁ, J., INGR, I., GAJDŮŠEK, S., 2003: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů. Brno: MZLU, 122 s. ISBN 80-7157-708-1. SHALABY, A. R., 1996: Significance of biogenic amines in food safety and human health. Food Research International. 29, 675-690. STIBŮREK, O., PŘÍBRAMSKÁ, V., LATA, J., 2009: Místo probiotik v léčbě (nejen) gastrointestinálních chorob. Interní medicína pro praxi, č. 1, s. 25-28. SZAJEWSKA, H., 2007: Probiotics and prebiotics in pediatrics: where are we now? The Turkish Journal of Pediatrics, s. 232 SZAJEWSKA, H., 2010: Probiotics and prebiotics in preterm infants: Where are we? Where are we going? Early Human development

ŠPELINA, V., 2006: Probiotika a startovací kultury. Vědecký výbor pro potraviny [online] [cit.2009-01-03]. Dostupný z : . ŠUSTOVÁ, K., 2008: Laktologie, Cyklus přednášek, MZLU Brno ŠUSTOVÁ, K., 2009: Laktologie, Cyklus přednášek, MZLU Brno ŠUSTOVÁ, K., 2006: Mlékárenská technologie, Cyklus přednášek, MZLU Brno TLÁSKAL,

P.,

2001:

Probiotika

ve

výživě

dítěte,

Dostupné

z:

http://www.rodina.cz/clanek1629.htm VILJANEN, M. et al., 2005: Probiotics in th treatment of atopic eczema/dermatitis syndrome in infants: a double-blind placebo controlled trial. Allergy, s. 494

Použité normy a vyhlášky ČSN ISO 6610 Stanovení počtu jednotek mikroorganismů tvořících kolonie. Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C ČSN ISO 8261 Příprava analytických vzorků a ředění pro mikrobiologické zkoušení ČSN ISO 15214 (560117) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C Nařízení EP a Rady č.258/97/ES, o nových potravinách a nových složkách potravin Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje Vyhláška č. 446/2004 Sb. ze dne 1.8.2004, kterou se stanoví požadavky na doplňky stravy a na obohacování potravin potravními doplňky

Zdroje obrázků http://www.acidofilo.cz/Informace-o-vyrobku/Sortiment-Acidofilo/Acidofilo-1-450g.aspx http://www.acidofilo.cz/Informace-o-vyrobku/Sortiment-Acidofilo/Acidofilo-3,6--450g.aspx http://www.acidofilo.cz/Informace-o-vyrobku/Sortiment-Acidofilo/Acidofilo-jahoda450-g.aspx http://www.acidofilo.cz/Informace-o-vyrobku/Sortiment-Acidofilo/Acidofilo-vanilka450-g.aspx http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/cerveny-pomeranc.html http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/espresso.html http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/granatove-jablko.html http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/jablko-a-banan-s-cerealiemi.html http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/jahoda-s-cerealiemi.html http://www.hollandia.cz/nase-produkty/bifi-drinky/zeleny-caj-s-limetkou.html www.besthealth101.com/ Lactobacillus_acidophilus.jpg www.microbiologybytes.com http://nccam.nih.gov/health/probiotics/ http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Dental_Caries_Prevention_by_Camellia_sine nsis BUREŠOVÁ, K.: Stanovení probiotických mikrooganismů ve vybraných mléčných výrobcích, Diplomová práce, MZLU v Brně, 2007

SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Rod Lactobacillus Obr. 2 Rod Bifidobacterium Obr. 3 Rod Enterococcus Obr. 4 Rod Streptococcus Obr. 5 Srovnání normální buněčné proliferace s neomezenou buněčnou proliferací způsobenou onkogenem. Obr. 6 Vzorek č. 1 - Bifidrink, jahoda s cereáliemi Obr. 7 Vzorek č. 2 - Bifidrink, jablko a banán s cereáliemi Obr. 8 Vzorek č. 3 - Bifidrink, granátové jablko Obr. 9 Vzorek č. 4 - Bifidrink, zelený čaj Obr. 10 Vzorek č. 5 - Bifidrink, červený pomeranč Obr. 11 Vzorek č. 6 - Bifidrink, espresso Obr. 12 Vzorek A - Acidofilo, 1% Obr. 13 Vzorek B - Acidofilo, 3,6% Obr. 14 Vzorek D - Acidofilo, jahoda Obr. 15 Bakterie mléčného kvašení na půdě MRS Obr. 16 Lactobacillus acidophilus na půdě MRS s clindamycinem Obr. 17 Bifodobacterium sp. na půdě BSM s BSM suplementem Obr. 18 Zastoupení Bifidobacterium sp.ve vzorcích Bifidrinku Obr. 19 Zastoupení BMK ve vzorcích Bifidrinku Obr. 20 Zastoupení L. acidophilus ve vzorcích Bifidrinku Obr. 21 Zastoupení BMK ve vzorcích Acidofilo Obr. 22 Zastoupení L. acidophilus ve vzorcích Acidofilo

Obr. 23 Hodnoty pH u Bifidrinku Obr. 24 Hodnoty pH u Acidofila

SEZNAM TABULEK Tab. 1 Nejčastěji komerčně využívané probiotické mikroorganismy Tab. 2 Druhy a minimální počty živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích Tab. 3 Označení vzorků Tab. 4 Podmínky kultivace, velikost kolonií a vzhled kolonií probiotických kultur Tab. 5 Podmínky kultivace a vzhled kolonií u jednotlivých stanovení Tab. 6 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 1, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 7 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 2, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 8 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 3, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 9 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 4, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 10 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 5, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 11 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku č. 6, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 12 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku A, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 13 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku B, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05)

Tab. 14 Kvantitativní zastoupení probiotických mikroorganismů ve vzorku C, určení intervalů spolehlivosti (IS 0,05) Tab. 15 Hodnoty pH u jednotlivých vzorků Bifidrinku, interval spolehlivosti IS 0,05 Tab. 16 Hodnoty pH u jednotlivých vzorků Acidofila, interval spolehlivosti IS 0,05

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Recommend Documents