MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav technologie potravin

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav technologie potravin

Vliv přídavku probiotik na výskyt biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích Disertační práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Prof. MVDr. Ing. T. Komprda, CSc.

Mgr. Petra Hoferková

Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Vliv přídavku probiotik na výskyt biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ……………………………………….

podpis doktoranda ……………………….

PODĚKOVÁNÍ Mé poděkování patří především vedoucímu mé disertační práce panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za odborné rady a vedení při zpracování této disertační práce a Mgr. Radce Hulánkové, Ph.D. za poskytnutí cenných rad a připomínek. Poděkování za spolupráci při řešení experimentální části práce patří také Doc. RNDr. Vlastimilu Dohanlovi, Ph.D. a Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně za poskytnuté technické zázemí.

OBSAH 1 Úvod...............................................................................................................................8 2 Cíl práce........................................................................................................................10 3 Literární přehled...........................................................................................................11 3.1 Trvanlivé fermentované salámy.................................................................................. 11 3.1.1 Produkce ve světě...........................................................................................11 3.1.2 Suroviny a výroba...........................................................................................12 3.2 Mikroorganismy v trvanlivých fermentovaných salámech.........................................14 3.2.1 Bakterie mléčného kvašení.............................................................................15 3.2.2 Micrococcaceae..............................................................................................17 3.2.3 Kvasinky ........................................................................................................17 3.2.4 Plísně .............................................................................................................17 3.3 Startovací kultury........................................................................................................ 17 3.4 Probiotika.................................................................................................................... 19 3.4.1 Historie probiotik............................................................................................19 3.4.2 Definice a vlastnosti.......................................................................................20 3.4.3 Tradiční probiotika – laktobacily a bifidobakterie.........................................22 3.4.4 Enterokoky......................................................................................................23 3.4.5 Probiotika ve fermentovaných salámech........................................................25 3.5 Molekulární metody.................................................................................................... 26 3.5.1 Polymerázová řetězová reakce.......................................................................27 3.6 Biogenní aminy........................................................................................................... 29 3.6.1 Charakteristika a zdravotní aspekty................................................................29 3.6.2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy................................................31 3.6.3 Výskyt BA ve fermentovaných salámech.......................................................33 3.6.4 Faktory ovlivňující výskyt BA ve fermentovaných salámech........................34 3.6.5 Legislativa......................................................................................................35 3.6.6 Detekční metody.............................................................................................36 4 Materiál a metodika......................................................................................................38 4.1 Materiál....................................................................................................................... 38 4.1.1 Výroba salámů................................................................................................38 4.1.2 Přístroje a pomůcky........................................................................................38 4.1.3 Roztoky a kultivační půdy..............................................................................40 4.1.3.1 Roztoky....................................................................................................40 4.1.3.2 Kultivační půdy.......................................................................................41 4.1.3.3 Komponenty a chemikálie pro PCR........................................................43 4.2 Metodika..................................................................................................................... 43 4.2.1 Skladování a odběr vzorků.............................................................................43 4.2.2 Mikrobiologická analýza................................................................................44 4.2.3 Metoda stanovení biogenních aminů a polyaminů.........................................44 4.2.4 Stanovení pH a vodní aktivity........................................................................45 4.2.5 Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity u startovacích kultur a kmenů L. casei v dekarboxylačním médiu (DCM).............45 4.2.6 Konfirmace schopnosti izolátů startovacích kultur a probiotických kmenů L. casei produkovat tyramin a histamin v DCM metodou HPLC ...............................46 4.2.7 Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu.......47 4.2.8 Konfirmace L. casei metodou PCR................................................................47 4.2.9 Statistické zpracování výsledků......................................................................48

5 Výsledky.......................................................................................................................49 5.1 Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání a skladování fermentovaných salámů...............................................................................49 5.2 Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu.................................61 5.3 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei ve fermentovaných salámech na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování........................................................62 5.3.1 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH a aktivity vody67 5.3.2 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů.......................................................................................................68 6 Diskuse.........................................................................................................................72 6.1 Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání fermentovaných salámů.................................................................................................... 75 6.2 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH a aktivity vody v průběhu zrání................................................................................................................. 78 6.3 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů .......................................................................................................................................... 79 6.4 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování............................................................................................................. 81 7 Závěr.............................................................................................................................84 8 Seznam použité literatury.............................................................................................86

SUMMARY Biogenic amines (BA) content in fermented meat products can be influenced by many factors. The aim of this study was to evaluate the influence of different producers, spice mixtures, starter cultures and especially probiotic cultures on BA content and additional physical-chemical and microbiological parameters during rippening (up to 28 th day after stuffing) and storage at 15°C (up to 49th day after stuffing). Sausages were made in two processing facilities with use of two different spice mixtures (H: Herkules, P: Paprikáš). Each type of product was made in four batches, each with different combination of starter (C: Pediococcus pentosaceus, F: Lactobacillus curvatus + Staphylococcus carnosus) and probiotic culture (Lactobacillus casei BGP 93 and Lactobacillus casei 431). Sausages were sampled 0, 14, 28 and 49 days after stuffing. With exception of spermine and spermidine the content of BA determined with HPLC-UV method increased during rippening and storage. At the end of storage tyramine, putrescine and cadaverine reached the highest values. Concentrations of the three biogenic amines were significantly (P < 0.05) lower in sausages with L.casei BGP 93 (139, 119 and 26 mg·kg-1) and L. casei 431 (173, 123 and 27 mg·kg-1) in comparison with control (240, 155 and 42 mg·kg-1). There were no statistically significant differences in the sum of BA between the sausages of different producers. However the sausages with spice mixture P exhibited at the end of storage lower concentrations of BA than the sausages with spice mixture H (P < 0.05) and the sausages with starter culture C exhibited lower concentrations of BA than the sausages with starter culture F (P < 0.05). In all sausages there was a typical drop of pH during first weeks of fermentation from approx. 6.0 to average value 4.5. Values of a w decreased faster in probiotic sausages than in control (P < 0.05). Addition of probiotics projected partially in counts of lactic acid bacteria, but the total viable count and counts of enterococci were not significantly affected. L. casei strain BGP 93 lowered the concentrations of BA in sausages more than L. casei 431, reflecting probably the higher initial content of BGP 93 (5.62 log CFU·g-1) than that of the strain 431 (4.62 log CFU·g-1). Both strains of L. casei were capable to survive well in the analysed sausages and their counts incresed during rippening and storage to 6.83 (strain BGP 93) and 5.83 (strain 431) log CFU·g-1.

In light of positive effects on human organism it would be advisable to increase the content of probiotics at least by 1 log. We proved that the incorporation of probiotic cultures into dry fermented sausages led to lower concentrations of biogenic amines. This effect was notable especially at the end of rippening and during storage. Higher addition of probiotics in combination with more appropriate starter culture (not producing BA) or application of probiotic culture as a starter culture could further decrease the BA content in sausages.

1 ÚVOD V dnešní době nabývají v Evropě stále více na popularitě potraviny působící příznivě na lidské zdraví, tzv. funkční potraviny. S těmito potravinami přicházejí na trh výrobci ve snaze se odlišit a prosadit své výrobky na trhu. Funkční potraviny jsou potraviny obohacené o větší množství biologicky aktivních látek, než se nachází v jejich standardní podobě. Prospěšné složky, jako jsou vitamíny, antioxidanty, vláknina a probiotické bakterie mléčného kvašení se začaly do potravin přidávat v 90. letech 20. století. Mezi snad nejznámější funkční potraviny patří výrobky obohacené o probiotické mikroorganismy. Jako nosiče probiotických kultur se většinou používají fermentované mléčné výrobky. Nedávno se však pozornost obrátila také k trvanlivým fermentovaným masným výrobkům, do kterých jsou cíleně přidávána probiotika. Představiteli probiotik jsou hlavně střevní kmeny rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Produkce kvalitních a zdravotně nezávadných trvanlivých fermentovaných masných výrobků patří dnes bezesporu mezi základní předpoklad úspěchu výrobců jak na tuzemském, tak také na zahraničním trhu. Z tohoto důvodu je ze strany výrobních společností vyvíjena snaha o inovaci procesů výroby k eliminaci výskytu zdraví škodlivých mikroorganismů nebo toxických látek. Vzhledem k technologii výroby fermentovaných masných výrobků dochází ke zvýšené tvorbě biologicky aktivních látek, které mohou mít nepříznivý vliv na zdravotní nezávadnost finálního produktu. Mezi tyto látky se řadí nízkomolekulární látky bazické povahy odvozené od aminokyselin – biogenní aminy. Vyskytují se v buňkách rostlinných a živočišných materiálů, kde zajišťují řadu důležitých funkcí. V nadměrném množství mohou způsobovat nežádoucí až toxické účinky a jejich přítomnost je tedy nežádoucí. Za tvorbu biogenních aminů jsou zodpovědné enzymy dekarboxyláz, zejména tyrosindekarboxyláza a histidindekarboxyláza. Některé startovací kultury jsou schopny redukovat

koncentrace

biogenních

aminů

v závislosti

na fyzikálně-chemických

parametrech, zejména pH a vodní aktivita, kdy pH je klíčový faktor ovlivňující činnost dekarboxyláz aminokyselin. Byl zaznamenán vzájemný vztah mezi produkcí biogenních

8

aminů a poklesem pH v salámech způsobeným mléčnou fermentací. Teplota má také jednoznačně vliv na tvorbu biogenních aminů hlavně v rybím mase a v sýrech, kde obsah biogenních aminů vzrůstá se zvyšující se teplotou a dobou skladování. Teplota ovlivňující činnost mikroorganismů přítomných v salámech může mít na hromadění aminů opačný efekt. Zvolením vhodného typu probiotických bakterií a zvolením vhodných podmínek zrání a skladování fermentovaných výrobků je možné ovlivnit tvorbu biogenních aminů. Mezi metody umožňující detekci mikroorganismů produkujících biogenní aminy se jako nejvíce vhodné jeví molekulárně genetické metody, konkrétně metoda polymerázové řetězové reakce (PCR).

9

2 CÍL PRÁCE Cílem této disertační práce bylo: •

Stanovení

koncentrací

biogenních

aminů

v trvanlivých fermentovaných

salámech s přídavkem probiotické kultury L. casei a jejich srovnání s výrobky téhož typu bez přídavku probiotické kultury. •

Posouzení vlivu vybraných faktorů (výrobce, kořenící směs s startovací kultury) na koncentraci biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích.

•

Určení fyzikálně-chemických parametrů (pH a aktivity vody) a posouzení tvorby biogenních aminů v souvislosti s těmito parametry.

•

Ověření

dekarboxylázové

aktivity

použité

směsné

startovací

kultury

(Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus a Pediococcus pentosaceus) a probiotické kultury kmenů Lactobacillus casei.

10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Trvanlivé fermentované salámy Podle vyhlášky č. 326/2001 Sb., ve znění pozdějších předpisů, je trvanlivý fermentovaný masný výrobek definován jako „výrobek tepelně neopracovaný určený k přímé spotřebě, u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení a uzení za definovaných podmínek došlo ke snížení aktivity vody na hodnotu aw (max.) = 0,93 s minimální dobou trvanlivosti 21 dní při teplotě plus 20 °C“. Údržnost tohoto typu výrobku je výsledkem působení celé řady překážek pro rozvoj nežádoucí a patogenní mikroflóry: •

přídavek dusitanu, soli a/nebo cukru,

•

snížení redoxního potenciálu,

•

přídavek startovací kultury obsahující bakterie mléčného kvašení (produkce kyseliny mléčné, bakteriocinů, kompetice o živiny),

•

snížení pH,

•

snížení vodní aktivity,

•

uzení (Toldrá et al., 2007).

3.1.1 Produkce ve světě Fermentované masné výrobky se vyrábí po celém světě a jejich škála je značně široká. Fermentované salámy vynalezli údajně již Sumerové a ve starověku je znali i Číňané, Řekové a Římané (Cocolin et al., 2008). Za kolébku výroby v Evropě je považována Itálie, odkud se tato technologie rozšířila i do dalších zemí. V průběhu staletí se vyvinuly určité tradiční postupy a zásady v produkci trvanlivých fermentovaných masných výrobků napříč Evropou. V některých zemích se velice často používají tradiční postupy bez aplikace startovacích kultur. Zkušenosti řeznických mistrů i podmínky, které převládaly v produkčních oblastech, vtiskly salámům charakteristické rysy a umožnily rozlišit např. italské či francouzské výrobky od německých nebo švédských

11

produktů. Mezi nejvýznamnější producenty trvanlivých fermentovaných salámů dnes patří Německo, Itálie, Španělsko, Francie či Maďarsko (Kameník, 2011). Obecně se fermentované masné výrobky dělí dle konzistence (trvanlivé-sušené, polosušené, roztíratelné) a dle finálního pH na výrobky s vysokým finálním pH a s nízkým finálním pH, s čímž obvykle souvisí i délka zrání (Marianski and Marianski, 2009). Výrobky s vysokou finální hodnotou pH zrají dlouho a jsou typické právě pro Itálii nebo Maďarsko. V Itálii je tradiční doba zrání až 6 měsíců, v Maďarsku 90 – 100 dní. Výrobky s nízkou finální hodnotou pH jsou typické např. pro Skandinávii a Střední Evropu (Kameník a Budig, 2010). 3.1.2 Suroviny a výroba Trvanlivé fermentované salámy se připravují z mraženého vepřového a hovězího masa a vepřového tuku (Vignolo et al., 2010). Nejrozšířenějším druhem masa pro výrobu trvanlivých salámů (zejména v Evropě) je vepřové maso. V našich podmínkách se zpracovává v různých poměrech s hovězím masem. V zahraničí se používá např. i maso koňské, skopové nebo krůtí. Vepřové sádlo má být jadrné, využívá se pouze hřbetní sádlo. Měkký tuk je nežádoucí z hlediska konzistence výrobku a kvůli větší náchylnosti k oxidaci (Kameník, 2011). Obsah tuku v trvanlivých fermentovaných salámech je vysoký a dosahuje až 50 % (Marianski and Marianski, 2009). Dalšími zásadními přísadami jsou dusitanová solící směs v množství 2 – 4 %, sacharidy, koření a startovací kultura (Vignolo et al., 2010). Sůl představuje jednu z prvních překážek pro růst nežádoucích mikroorganismů. Navíc se podílí na rozpuštění svalových bílkovin a tvorbě gelu mezi masem a tukovými částicemi v díle. Samozřejmě má také význam pro chuť finálního výrobku (Leroy and De Vuyst, 2008). Dusitany představují další překážku pro růst patogenů, která funguje už v díle. Také se podílí na tvorbě barvy. Vznik a stabilitu barvy typické pro uzené maso zaručuje i případný přídavek askorbátů (Marianski and Marianski, 2009). Z koření se používá např. pepř, kardamon, česnek či paprika. V Maďarsku se produkuje řada trvanlivých salámů se značným obsahem papriky (1 – 2 %) (Kameník, 2011). Kromě vlivu na chuť a vůni může mít koření i antioxidační a antimikrobiální účinky. Na inhibici různých bakterií na povrchu salámů se navíc 12

podílejí i složky kouře během uzení, např. fenoly, karbonylové sloučeniny a různé organické kyseliny (Feiner, 2006). Sacharidy se přidávají jako zdroj živin pro startovací kulturu (Toldrá, 2004). Přídavek sacharidů do díla ovlivňuje rychlost a intenzitu fermentace. Používají se monosacharidy (glukóza, fruktóza), disacharidy (sacharóza, laktóza), případně i oligosacharidy

(např.

škrobový sirup).

Glukóza

i sacharóza

jsou

vzájemně

zastupitelné. Pro fermentované salámy s dobou zrání 4 týdny a více je optimální přídavek 0,3 % dextrózy nebo sacharózy. Pro salámy s rychlejším a kratším zráním (méně než 3 týdny) lze přidávat 0,5 – 0,7 %. Laktóza způsobuje pomalejší pokles hodnot pH a je třeba počítat s její vyšší zbytkovou koncentrací v díle. Proto se doporučuje přídavek 0,5 % laktózy do salámů pomalu zrajících a 1 % pro salámy s rychlejší fermentací (Ruiz, 2007). Ne všechny bakterie mléčného kvašení však laktózu snadno fermentují a zvláště některá probiotika (např. Lactobacillus rhamnosus GG) ji nejsou schopna využívat vůbec (Työppönen et al., 2003). V některých recepturách se přidává do díla místo sacharidů glukono-deltalakton (GdL). Jeho hydrolýzou vzniká D-glukonová kyselina, která snižuje pH díla již za několik hodin (Leroy and De Vuyst, 2008). GdL se obvykle aplikuje v množství 0,3 – 0,5 %. Negativní stránkou GdL je nežádoucí vliv na tuk ve fermentovaných salámech. Proto lze GdL použít pouze do salámů s kratší dobou zrání a kratší trvanlivostí (Lücke, 2003). Pro trvanlivé fermentované salámy s nízkou konečnou hodnotou pH je charakteristický přídavek sacharidů do díla v množství 0,3 – 0,7 % a vyšší počáteční teploty zrání (22 – 25 °C), které umožní rozvoj bakterií mléčného kvašení (startovacích kultur). Tyto mikroorganismy fermentují sacharidy na kyselinu mléčnou, a tím dojde k poklesu pH na 5,3 i méně (4,5 – 5,0) (Leroy and De Vuyst, 2008). Typickými českými výrobky ve skupině s vyšším finálním pH byly Poličan a Lovecký salám, s nízkým pH salám Herkules. V současnosti však výrobci přidávají z důvodů větší standardizace procesu zrání sacharidy a startovací kultury i do tradičních produktů, jejichž hodnoty pH mohou tímto klesat < 5,0 (Kameník, 2011). Po mělnění a promíchání se solí, kořením a dalšími přísadami se vzniklé dílo plní do obalového střeva (Marianski and Marianski, 2009). Mělnění, míchání a narážení díla do obalových střev musí zajistit, aby zůstala zachovaná struktura tukové tkáně, která 13

potom tvoří v nákroji výrobků charakteristickou mozaiku. Je proto třeba použít mraženou surovinu, ostré řezací nástroje a vhodnou narážečku. Pro výrobu trvanlivých masných produktů se používají střeva propustná pro vodní páru, plyny a složky kouře. V dnešní době se u nás používají především tenká vepřová střeva, a to pro produkci trvanlivých klobás. Z umělých střev jsou to především tzv. „fibrousová“ střeva (zpevněná celulóza) a klihovkové obaly (Kameník, 2011). Za definovaných podmínek (teplota, relativní vlhkost a proudění vzduchu) probíhá v klimatizovaných komorách zrání (Toldrá, 2004). Teplota je rozhodující pro fermentační děje v díle. Musí být nastavena na požadavky bakterií, které jsou jako startovací kultury přidány do díla. Začíná se na 24 – 25 °C, poté se teplota postupně snižuje na cca 16 °C. Relativní vlhkost vzduchu musí zajistit v kombinaci s prouděním vzduchu sušení – tj. odvod vody z díla a povrchu výrobku. Pokud je vlhkost v komoře příliš nízká a proudění vzduchu příliš vysoké, sesychá povrchová vrstva těsně pod obalovým střevem a vzniká tzv. „kroužek“, kdy v nevysušeném středu salámu může docházet ke kažení. Délka zrání závisí na typu výrobku. Salámy se zpravidla udí po dobu prvních sedmi dnů, kdy visí v tzv. zakuřovacích komorách. V této fázi probíhá také fermentační proces, teploty jsou nastavené na 22 – 25 °C s postupným snižováním až na 17 – 18 °C ke konci tohoto období. Poté se výrobky přesunují do zracích komor, kde při již nižších teplotách kolem 15 °C a relativní vlhkosti vzduchu kolem 78 – 80 % pokračuje zrání a sušení produktů. Délka pobytu v klimatizovaných komorách záleží na druhu výrobku. Tenké výrobky ve skopových střívkách (příp. kolagenních jedlých obalech) jsou hotové za několik dní, salámy o průměru 50 – 70 mm za 3 týdny. Sladění externích parametrů (teplota, vlhkost, proudění) harmonizuje proces fermentace se sušením díla, navozuje rovnoměrné zrání a výsledkem je produkce kvalitních výrobků (Kameník, 2011).

3.2 Mikroorganismy v trvanlivých fermentovaných salámech V trvanlivých fermentovaných masných výrobcích můžeme nalézt širokou škálu mikroorganismů. Mezi nejvýznamnější skupiny patří bakterie mléčného kvašení, gram pozitivní,

kataláza

pozitivní

koky

a dále 14

kvasinky

a plísně.

Tyto

skupiny

mikroorganismů se ve fermentovaných masných výrobcích vyskytují jednak v množství daném kontaminací použitého masa, případně jsou záměrně přidávány do díla jako startovací kultury (Toldrá, 2008). Další skupiny mikroorganismů vyskytující se ve fermentovaných trvanlivých salámech jsou pseudomonády nebo čeleď Enterobacteriaceae, jejichž rozvoj je však omezen nepříznivými podmínkami prostředí (Lücke, 2003). Také patogenní bakterie (Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium spp., Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157 aj.) jsou inhibovány obsahem soli a dusitanů, později produkty fermentace bakterií mléčného kvašení včetně bakteriocinů (Marianski and Marianski, 2009). 3.2.1 Bakterie mléčného kvašení Obecně se jedná o acidotolerantní, gram pozitivní tyčky nebo koky, s výjimkou rodu Sporolactobacillus nesporulující a náležející převážně do řádu Lactobacillales, což je geneticky velmi různorodá skupina. V současné době jsou do skupiny bakterií mléčného kvašení (BMK) řazeny rody Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc,

Pediococcus,

Sporolactobacillus,

Streptococcus,

Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Rod Bifidobacterium je někdy řazen mezi bakterie mléčného kvašení díky fenotypické podobnosti (Fontana et al., 2011). Fermentací sacharidů vytváří BMK kyselinu mléčnou a ovlivňují tak zásadně údržnost a chuť výrobku. Kromě kyseliny mléčné produkují heterofermentativní druhy (např. L. reuteri) i méně žádoucí produkty jako je kyselina octová, etanol, acetoin, peroxid vodíku apod. (Toldrá, 2008). Řada významným druhů jako je Lactobacillus sakei, L. curvatus nebo L. plantarum jsou fakultativně heterofermentativní a v případě změněných podmínek prostředí (např. při přítomnosti kyslíku) mohou přejít na heterofermentativní metabolismus (Kameník, 2011). Některé rody bakterií mléčného kvašení jsou producenty bakteriocinů. Jedná se o sloučeniny bílkovinné povahy, které vykazují baktericidní aktivitu proti omezenému spektru mikroorganismů, většinou úzce příbuzných s daným producentem. Bakteriocinogenní startovací kultury jsou používány ke zlepšení konkurenceschopnosti 15

startovacích kultur a k prevenci růstu alimentárních patogenů (Cocconcelli and Fontana, 2010). BMK se kromě údržnosti a chuti podílí v menší míře i na tvorbě aroma fermentovaných salámů, a to nejen nežádoucími produkty heterofermentativního metabolismu. Např. Lactobacillus sakei disponuje peptidázami, čímž zvyšuje obsah volných aminokyselin. Ovlivněny mohou být i senzorické vlastnosti tuku, a to díky produkci lipáz a následnému zvyšování koncentrace volných mastných kyselin (např. Lactobacillus plantarum). Na druhou stranu u Lactobacillus sakei byla detekována kataláza, která omezuje žluknutí tuků (Flores and Toldrá, 2011). Jednotlivé druhy BMK se liší různou optimální teplotou růstu i citlivostí vůči obsahu soli. Minimální růstové podmínky pro BMK jsou pH 3,0 a aW 0,95, teplota a obsah soli se liší (viz tabulka 1). Z původního množství 3 – 4 log KTJ·g-1 se během fermentace jejich počty zvýší až na 6 – 8 log KTJ·g-1 (Talon and Leroy, 2011). Některé BMK mohou být však i nežádoucí. L. viridescens způsobuje zelenání masa v důsledku tvorby peroxidu vodíku, L. brevis a L. mesenteroides jsou nežádoucí tvorbou plynu a nepřijatelným okyselením. Rod Brochotrix může způsobovat odchylky chuti a vůně (Marianski and Marianski, 2009). Tabulka 1: Růstové vlastnosti různých mikroorganismů podílejících se na fermentaci masa (Marianski and Marianski, 2009). Mikroorganismus Optimální teplota (°C) Maximální obsah NaCl (%) Lactobacillus sakei

30

9

Lactobacillus farciminis

37

10

Lactobacillus plantarum

30

13

Lactobacillus curvatus

24

10

Lactobacillus pentosus

25

9

Pediococcus acidilactici

40

10

Pediococcus pentosaceus

35

7

Staphylococcus carnosus

30

16

Staphylococcus xylosus

30

15

Micrococcaceae

30

16

16

Mezi dominantní druhy u tradičních fermentovaných salámů vyráběných bez přídavku startovacích kultur patří laktobacily, a to zejména Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus a Lactobacillus plantarum (Talon and Leroy, 2011). 3.2.2 Micrococcaceae Do této čeledi náleží stafylokoky a rod Kocuria. Podílí se na vzniku barvy, neboť redukují dusičnany na dusitany (Cocolin et al., 2008). Množí se poměrně pomalu a při pH vyšším než 5,4. Mají proteolytickou a částečně i lipolytickou aktivitu. Stafylokoky jsou anaerobní a více tolerantní vůči NaCl, zatímco mikrokoky jsou aerobní a jsou aktivní spíše na povrchu výrobku (Toldrá, 2008). Nejčetnějšími druhy této skupiny bakterií izolovaných z trvanlivých fermentovaných salámů na konci zrání jsou S. xylosus, S. equorum a S. saprophyticus (Talon and Leroy, 2011). 3.2.3 Kvasinky Kvasinky jsou součástí tradičních fermentovaných salámů. Vyznačují se také proteolytickou a lipolytickou aktivitou a podílejí se tak na chuti a aroma výrobku. Částečně odbourávají kyselinu mléčnou, čímž zvyšují pH výrobku (Toldrá, 2004). Predominantním druhem ve fermentovaných masných výrobcích je Debaryomyces hansenii (Toldrá, 2008). 3.2.4 Plísně Plísně na povrchu jsou typické pro některé druhy fermentovaných salámů. Používají se kulturní plísně, např. Penicillium nagliovense, Penicillium chrysogenum, které se očkují na salámy před umístěním do zracích komor (Toldrá, 2008). Porost kulturní plísně chrání obsah před světlem a tedy oxidací tuků. Kulturní plísně se podílejí na chuti výrobku, zajišťují rovnoměrné sušení a omezují růst divokých plísní, které mohou produkovat mykotoxiny (Marianski and Marianski, 2009).

3.3 Startovací kultury Zatímco po staletí se používala tradičně fermentace masa pomocí mikroorganismů přítomných v mase a v prostředí, v dnešní době jsou tyto techniky nahrazovány aplikací 17

komerčně vyprodukovaných startovacích kultur (Marianski and Marianski, 2009). Startovací kultury jsou definované jako přípravky, které obsahují živé mikroorganismy nebo mikroorganismy v klidovém stavu, které vyvíjejí v mase žádoucí metabolickou aktivitu (Cocconcelli, 2008). Zatímco zpočátku se používaly zejména kmeny izolované z rostlinného materiálu, dnes se klade důraz na získávání kmenů z fermentovaných masných výrobků, adaptovaných již na toto prostředí (Cocconcelli and Fontana, 2010). Bakterie mléčného kvašení se v mase přirozeně vyskytují, ale v těžko odhadnutelné kvalitě a množství. Většinou se jedná o heterofermentativní typ, který se kromě tvorby kyseliny mléčné podílí i na dalších reakcích, vedoucích ke vzniku nepříjemných pachů. Startovací kultury jsou homofermentativní a produkují pouze kyselinu mléčnou. Jejich přídavek ve velkém množství zaručuje jejich dominanci, vedoucí k potlačení rozvoje nežádoucích mikroorganismů (Marianski and Marianski, 2009). Startovací kultury se používají ve výrobě salámů ke snížení doby fermentace a k zajištění nízkých koncentrací zbytkových dusitanů a dusičnanů ve finálním výrobku, čímž se zlepšuje bezpečnost a stabilita výrobku a prodlužuje jeho údržnost. Jedná se o směsi bakterií mléčného kvašení a kataláza pozitivních, koaguláza negativních koků, namíchaných dle požadovaných finálních vlastností výrobku (Burdychová a Šulcerová, 2009). Aplikují se do díla současně s přídavkem sacharidů (Kameník, 2011). Nejčastěji se jako masné startovací kultury používají směsi Lactobacillus sakei, L. casei, L. curvatus, L. pentosus, L. plantarum, Pediococcus acidilactici a P. pentosaceus, Staphylococcus carnosus

a S. xylosus,

Kocuria

varians,

Debaryomyces

hansenii,

Penicillium

nalgiovense a Penicillium chrysogenum (Coconcelli and Fontana, 2010; Fontana et al., 2011). Mezi základní požadavky na startovací kultury patří kromě dobrého růstu v daném prostředí i aspekty bezpečnosti pro lidské zdraví. Týkají se zejména patogenity, toxických či alergenních účinků (včetně produkce biogenních aminů) a rezistence vůči antimikrobiálním látkám (Burdichon et al., 2012). Zástupci rodů Lactobacillus, Leuconostoc a Pediococcus jsou navrženy Evropským úřadem pro bezpečnost potravin na status QPS (Qualified Presumption of Safety), tedy jako bezpečné pro použití v potravinách (EFSA, 2011). Bezpečnostní rizika jsou spojována zejména s koaguláza negativními stafylokoky. U některých kmenů včetně např. druhu S. xylosus byla zjištěna

18

rezistence vůči antibiotikům nebo geny rezistence (Resch et al., 2008), produkce stafylokokových enterotoxinů (Zell et al., 2008) a v menší míře i tvorba biogenních aminů (Even et al., 2010; Talon and Leroy, 2011). Na druhou stranou přidání startovacích kultur snižuje hromadění biogenních aminů v salámech (Ruiz-Capillas et al., 2011). Aby dokázaly startovací kultury potlačit růst mikroorganismů schopných tvořit aminy, musí být schopné konkurence (Suzzi and Gardini, 2003). Vhodné druhy startovacích kultur jsou využívány rovněž jako protektivní kultury nebo dokonce jako probiotika.

3.4 Probiotika 3.4.1 Historie probiotik První poznatky o výrobcích s obsahem bakterií mléčného kvašení s příznivými účinky na lidské zdraví jsou přisuzovány ruskému bakteriologovi a imunologovi Mečnikovovi. Mechanismus účinku si vysvětloval tak, že bakterie mléčného kvašení v trávicím traktu brzdí nadměrné množení proteolytické mikroflóry, které tvoří pro organismus škodlivé štěpné produkty proteinů (Görner a Valík, 2004). Bakterie mléčného kvašení byly prvně objeveny Pasteurem v roce 1857. V roce 1878 je Lister izoloval ze zkysaného mléka a později byly objeveny i v trávicím traktu. V roce 1889 Tissier objevil Bifidobacterium spp., a v roce 1900 Moro izoloval Lactobacillus acidophilus (Lee and Salminen, 2009). Probiotika byla prvně použita pro terapeutické účely při střevních potížích Tissierem v roce 1906 (Muller et al., 2009). Pojem „probiotika“ poprvé použil Lilley a Stillwell v roce 1965 jako pojem opačný k antibiotikům. V roce 1974 podal Parker první oficiální definici probiotik, která je potom v roce 1991 revidována R. Fullerem do podoby, ve které se uvádí dodnes (Borchers et al., 2004). Prvními probiotickými výrobky v Evropě byly kysané mléčné výrobky, nyní jsou však v této skupině zahrnuty i další druhy potravin, např. další mléčné produkty, masné výrobky, nápoje a kvašené výrobky obecně (Gueimonde and Salminen, 2005).

19

3.4.2 Definice a vlastnosti Probiotikum je definováno jako živý organismus přidávaný do potravin, který příznivě ovlivňuje

zdraví

konzumenta

zlepšením

rovnováhy

jeho

střevní

mikroflóry

(FAO/WHO, 2001). Příznivý účinek probiotik (viz tabulka 2) je podmíněn požitím dostatečného množství živých bakterií. Za tzv. terapeutické minimum je považována podle různých autorů dávka 6 – 12 logaritmických řádů buněk (Huckle and Zhang, 2011). Tabulka 2: Pozitivní účinky probiotik na zdraví (De Vuyst et al., 2008). lepší trávení potravin (např. proteinů, dietárních polysacharidů) snížená intolerance laktózy dodání živin a růstových faktorů (vitamínů, minerálů) v biologicky využitelné formě udržování mikroflóry tlustého střeva v rovnováze snížení rizika střevních potíží (gastrointestinální infekce, zácpa) snížení rizika vzniku a délky průjmu (způsobeného rotaviry, antibiotiky, Clostridium difficile, cestovatelský průjem) inhibice nežádoucích a patogenních bakterií (gastrointestinální infekce vyvolané Streptococcus mutans, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium difficile; infekce močového systému, infekce dýchacího systému) modulace/stimulace imunitního systému (buněčná imunita, tvorba protilátek) snížení rizika vzniku atopického ekzému a alergií (astma, senná rýma, potravinová alergie, ekzémy, dermatitidy) příznivé účinky na žaludeční potíže (syndrom podrážděného žaludku) příznivé účinky na zánětlivá onemocnění žaludku a střev (ulcerativní kolitida, Crohnova choroba) protirakovinné účinky snižování hladiny cholesterolu v krvi

Mezi kritéria, která by měly splňovat kmeny s probiotickými vlastnostmi, patří: •

musí být zdravotně nezávadné,

•

nesmí být patogenní,

•

musí

být

natolik

rezistentní,

aby

přežily

bez

poškození

v průběhu

technologického zpracování a zůstaly životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny, •

neměly by ovlivňovat organoleptické vlastnosti potraviny, 20

•

přežívají v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny),

•

přichycují se na epiteliální buňky ve střevech a jsou schopny dalšího růstu,

•

je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav (Makras et al., 2004)

Tabulka 3: Příklady kmenů, které jsou komerčně využívány jako probiotika (De Vuyst et al., 2008). Kmen Název výrobku Zaměření Laktobacily Lactobacillus casei Imunitass

Actimel

obranyschopnost

Yakult

zažívací systém, obranyschopnost

LC1

zažívací systém, obranyschopnost

Lactobacillus plantarum 299v

ProViva

zažívací systém

Lactobacillus rhamnosus GG

Gefilus, Vifit, ...

zažívací systém, obranyschopnost

(DN-114 001) Lactobacillus casei Shirota (YIT 9029) Lactobacillus johnsonii La1 (NCC 533)

(ATCC 53103) Bifidobakterie Bifidobacterium animalis subsp. lactis různé názvy

střevní mikroflóra, imunitní systém

Bb12 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Activia

průběh zažívání

Bifidus Actiregularis (DN 173-010) Bifidobacterium breve Yakult

Bifiene

zažívací systém, střevní mikroflóra

Bifidobacterium longum BB 536

různé názvy (jogurt, střevní mikroflóra, imunitní systém prášek)

Směsi bakterií mléčného kvašení VSL#3 (směs osmi kmenů)

VSL#3 (prášek)

léčba (střevní onemocnění, syndrom podrážděného žaludku)

Další bakterie Escherichia coli Nissle 1917

Mutaflor (suspenze)

léčba

(střevní

mikroflóra,

střevní

onemocnění) Kvasinky Saccharomyces boulardii

Enterol (tablety)

léčba (průjem, Clostridium difficile)

Jako probiotické kultury jsou nejčastěji používány kmeny z rodu Lactobacillus a Bifidobacterium a v menší míře rody Pediococcus, Propionibacterium, Enterococcus, 21

Bacillus, Streptococcus a Saccharomyces (Champagne and Møllgaard, 2008; Khan et al., 2011). Příklady kmenů a výrobků jsou uvedeny v tabulce 3. 3.4.3 Tradiční probiotika – laktobacily a bifidobakterie Rody Lactobacillus a Bifidobacterium jsou nejčastěji využívány jako probiotika (Lee and Salminen 2009). Jejich pozitivní účinky na zdraví jsou dobře známé a doložené.

Tabulka 4: Druhy rodu Lactobacillus využívané jako probiotika (Hammes and Hertel, 2009). Lactobacillus Metabolismus Habitat acidophilus

homofermentativní

A, B *

casei

fakultativní heterofermentativní

A

crispatus

homofermentativní

A, B

delbrueckii

homofermentativní

A

johnsonii

homofermentativní

A, B

paracasei

fakultativní heterofermentativní

A, B, C

plantarum

fakultativní heterofermentativní

B, C

reuteri

heterofermentativní

A, B

rhamnosus

fakultativní heterofermentativní

A

salivarius

homofermentativní

B

* A: fermentované potraviny a krmiva; B: zvířata/člověk; C: potraviny (kažení)

Do rodu Lactobacillus se v současnosti řadí přes 100 druhů. L. alimentarius, amylovorus, aviarius, brevis, buchneri, curvatus, farciminis, fermentum, gallinarum, gasseri, helveticus, hilgardii, kefiranofaciens kefiri, mucosae, panis, paraplantarum, pentosus, pontis, sakei, a sanfranciscensis mají statut QPS (bezpečné pro použití v potravinách) a zástupci L. acidophilus, casei, crispatus, delbrueckii, johnsonii, paracasei, plantarum, reuteri, rhamnosus a salivarius jsou navíc využívány jako probiotika (Felis et al., 2009), pro které je typická produkce bakteriocinů ze skupiny lantibiotik (Reis et al., 2012). Jedná se o gram pozitivní, mikroaerofilní, kataláza negativní, nesporulující tyčky nebo kokobacily nacházené v potravinách, respiračním systému, ústní dutině, ve střevním traktu a ve vaginálním prostředí zvířat i lidí, v rostlinném materiálu a menší míře v odpadních vodách. Tato velmi různorodá skupina 22

je geneticky nejvíce spjata s rody Paralactobacillus a Pediococcus (Felis et al., 2009). Z hlediska zkvašování cukrů zahrnuje druhy homofermentativní, heterofermentativní i fakultativně heterofermentativní (viz tabulka 4). Rod Bifidobacterium v současnosti čítá 30 druhů. Jako probiotika se využívají rody B. adolescentis, bifidum, animalis, breve a longum (Nayak, 2011). I když se řadí mezi bakterie mléčného kvašení, fylogeneticky je tento rod od ostatních bakterií mléčného kvašení velmi vzdálen, neboť patří do zcela odlišného kmene. Druhy tohoto rodu specificky metabolizují hexózy s použitím enzymu fruktóza-6-fosfát-fosfoketoláza (konečný produkt kyselina octová a v o něco menší míře kyselina mléčná), čímž se velmi liší od laktobacilů a jim příbuzných rodů. Jedná se o gram pozitivní, nepohyblivé, nesporulující, někdy rozvětvené tyčky (odtud název Bifidobacterium), které jsou obligátně anaerobní (Felis et al., 2009). Vyskytují se převážně v trávicím traktu člověka (kde jsou považovány za predominantní mikroflóru) a zvířat, ale byly izolovány i z ústní dutiny a vaginálního prostředí člověka, obsahu bachoru, odpadních vod a zažívacího traktu včely medonosné (Nayak, 2011). Probiotické účinky jsou pravděpodobně dány i tvorbou bakteriocinů skupiny lantibiotik (bifidin I, bifidocin B) (Reis et al., 2012). 3.4.4 Enterokoky Enterokoky jsou gram pozitivní, fakultativně anaerobní, kataláza negativní, oválné až lehce protáhle koky uspořádané ve dvojicích nebo řetízcích. V současnosti je jich popsáno přes 30 druhů (Franz et al., 2011). Vyskytují se v různém prostředí zejména proto, že jsou schopné přežívat a množit se i ve velmi nepříznivých podmínkách. Běžně se nachází v půdě, vodě, potravinách, rostlinách a ve střevním traktu široké škály zvířat, jakožto i člověka (Kayser, 2003). Enterokoky produkují bakteriociny (enterociny), které jsou schopné potlačovat růst jiných, často patogenních druhů bakterií (Cebrián et al., 2012). Nejvýznamnější druhy enterokoků jsou E. faecalis a E. faecium, které dominují mezi humánními izoláty (Kayser, 2003). Enterokoky tvoří normální součást střevní mikroflóry a patří mezi závažné podmíněné patogeny. Jsou původci infekcí močových cest, infekcí ran, nitrobřišních zánětů, enterokokových endokarditid, bakterémií a katét23

rových sepsí, meningitid, peritonitid, osteomyelitid, infekcí žlučových cest a gynekologických zánětů (Votava, 2003). Významné jsou zvláště nosokomiální infekce. Nosokomiální kmeny jsou často rezistentní na všechna konvenčně používaná antibiotika. Infekce způsobené enterokoky jsou velmi časté u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů s katétry a u pacientů léčených širokospektrálními antibiotiky, aminoglykosidy a cefalosporiny (Kayser, 2003). Nejvýznamnější je rezistence na vankomycin. Rezistence je spojena s geny van (Votava, 2003). Gen vanC je gen přirozené rezistence některých enterokokových druhů na vankomycin a není přenosný. Geny vanA, vanB, vanD, vanE či vanG lze přenést plasmidy, takže enterokoky původně citlivé mohou přenosem těchto genů rezistenci získat. Kromě rezistence na antibiotika tyto kmeny také často vykazují faktory virulence jako je tvorba adhezinů, invazinů nebo hemolyzinu (Ogier and Serror, 2008). Studie zabývající se výskytem faktorů virulence u enterokoků ukázaly, že tyto faktory a antibiotická rezistence se mohou vyskytovat i u kmenů izolovaných z potravin a přírodních zdrojů (např. z rostlin). Obecně se zdá, že výskyt faktorů virulence je u kmenů izolovaných z potravin častější u E. faecalis než u E. faecium (Franz et al., 2011). Enterokoky patří mezi bakterie mléčného kvašení a mají význam jak ve fermentaci, tak při kažení potravin. Mohou způsobovat kažení tepelně opracovaných masných výrobků, ale mohou se podílet také na tvorbě aroma fermentovaných salámů, zvláště tradičních, spontánně fermentujících výrobků z oblasti Středomoří (Latorre-Moratalla et al., 2011). Role těchto mikroorganismů v onemocnění člověka vyvolává pochybnosti o jejich bezpečnosti při použití jako startovací kultury nebo probiotika (Ogier and Serror, 2008). Problémem samozřejmě může být i produkce biogenních aminů. Z těchto důvodů nejsou enterokoky na seznamu QPS mikroorganismů, jejich použití v potravinách se považuje za bezpečné (EFSA, 2011). Přesto však bylo provedeno několik studií se záměrným přídavkem enterokoků do fermentovaných salámů. Autoři Latorre-Moratalla et al. (2011) použili ve svém experimentu osm různých kmenů enterokoků, které záměrně očkovali do díla na výrobu fermentovaných masných výrobků. Na konci experimentu bylo zjištěno, že v průběhu skladování salámů docházelo podstatně méně k jejich oxidaci, než u salámů vyráběných 24

dle výrobní receptury. Autoři Sparo et al. (2008) použili úspěšně pro výrobu fermentovaných trvanlivých klobás kmen Enterococcus faecalis CECT7121 s inhibiční aktivitou proti nežádoucím mikroorganismům. Enterokoky byly studovány také z hlediska probiotických účinků. Jako probiotické kultury se v současnosti používají kmeny E. faecium NCIMB 10415 (SF68) a E. faecalis Symbioflor, a to jako doplňky stravy a doplňky výživy zvířat (Franz et al., 2011). Dalšími studovanými kmeny z hlediska bezpečnosti a probiotického potenciálu byl např. kmen E. faecium KH 24, E. faecalis CP58 nebo E. faecalis UGRA 10 (Bhardwaj et al., 2010; Nueno-Palop and Narbad, 2011; Cebrián et al., 2012). 3.4.5 Probiotika ve fermentovaných salámech Fermentované salámy jako výrobky, které neprochází tepelným ošetřením, jsou vhodnými nosiči probiotických kultur. Při použití probiotik ve fermentovaných salámech je nutno zajistit, že kultura přežije v dostatečném množství, aby měla příznivé účinky na zdraví konzumenta. Proto by měla být probiotická kultura dobře přizpůsobena podmínkám ve fermentovaných salámech, aby se stala dominantní kulturou (Toldrá and Reig, 2011). Vhodné kultury lze získat screeningem kmenů izolovaných z tradičních typů fermentovaných salámů či komerčně používaných startovacích kultur (De Vuyst et al., 2008). Přežívání probiotik v dostatečném množství lze zaručit i jejich ochranou metodou mikroenkapsulace ve vhodném nosiči, jak dokázali např. Muthukumarasamy and Holley (2007). Neméně důležité je, aby probiotická kultura nezpůsobovala odchylky chuti a vůně výrobku například svojí lipolytickou aktivitou (Toldrá and Reig, 2011). Většina studií se zaměřuje na přežívání potenciálně probiotických kmenů v prostředí fermentovaných trvanlivých salámů, v menší míře na přežívání v trávicím traktu a adhezní schopnosti. Neméně důležité je však prokázání prospěšných účinků na lidské zdraví, v kterémžto směru existuje jen málo klinických studií. Tyto studie by přitom mohly zvýšit důvěru konzumentů v probiotické potraviny (Khan et al., 2011). Němečtí a japonští výrobci vyvinuli masné výrobky obsahující bakterie mléčného kvašení izolované z lidského střeva. Německý salám z roku 1998 obsahoval tři kmeny –

25

L. acidophilus, L. casei a Bifidobacterium sp. a považuje se za první probiotický salám v tržní síti (Klingberg et al., 2005). Arihara et al. (1998) prokázali možnost použití kmene L. gasseri JCM 1131, Sameshina et al. (1998) použili k fermentaci kmeny L. rhamnosus FERM P-15120 a L. paracasei subsp. paracasei FERM P-15121. Tyto dva probiotické kmeny inhibovaly růst a tvorbu enterotoxinu u Staphylococcus aureus ve stejné míře jako komerční startovací kultura L. sakei. Andersen (1998) fermentoval trvanlivé salámy směsí tradiční startovací kultury Bactoferm T-SPX a potenciálně probiotickým kmenem L. casei LC-01 nebo směsí Bactofermu s Bifidobacterium lactis Bb-12. Také byly úspěšně vyzkoušeny kmeny L. rhamnosus GG a L. rhamnosus E-97800 (Erkkilä et al., 2001) a L. paracasei L26 a Bifidobacterium lactis B94 (Pidcock et al., 2002). Dále byla prokázána zvýšená inaktivace Eshcerichea coli O157:H7 během výroby salámu s probiotickými kmeny Lactobacillus reuteri ATCC 55730 a Bifidobacterium longum ATCC 15708 (Muthukumarasamy and Holley, 2007). Ruiz-Moyano et al. (2011) úspěšně vyrobili fermentovaný trvanlivý salám španělského typu (salchichón) s pomocí potenciálně probiotické kultury Pediococcus acidilactici SP979.

3.5 Molekulární metody Molekulární metody nacházejí v mikrobiologii potravin stále větší uplatnění, a to nejen jako nástroj identifikace a studia patogenních mikroorganismů, ale také např. identifikace nových kmenů BMK izolovaných z fermentovaných masných výrobků. Pro možnost ověření, zda se přidaný probiotický kmen nachází ve výrobku v dostatečném množství, je nezbytné jeho odlišení od podobných bakterií. Kromě identifikace jsou molekulární metody užitečným nástrojem zejména pro studium vlastností potenciálních probiotických nebo startovacích kultur, jako je tvorba toxinů, biogenních aminů či bakteriocinů, rezistence vůči antibiotikům a další vlastnosti. Polymerázová řetězová reakce (PCR – polymerase chain reaction) představuje dnes jednu z nejpoužívanějších, ne-li vůbec nejpoužívanější techniku molekulární biologie, z níž vychází i většina sofistikovanějších metod (Broll, 2010).

26

Historie této metody je ještě krátká, poprvé byla publikována v roce 1985 autory Saikim a Mullisem. V roce 1993 dostal Karl Mullis za objev PCR Nobelovu cenu v oblasti chemie (Patrinos and Ansorge, 2010). 3.5.1 Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce je metoda založená na zmnožení (amplifikaci) definovaného úseku DNA v podmínkách in vitro. Pomocí PCR je možné vytvořit miliony kopií úseku DNA v průběhu několika hodin (Patrinos and Ansorge, 2010). Toto in vitro namnožení nukleové kyseliny má své podmínky a reagencie, bez nichž nelze amplifikaci uskutečnit (Broll, 2010). PCR vyžaduje přítomnost templátové DNA, DNA polymerázy, oligonukleotidových primerů, MgCl2 a nukleotidů (dNTP) v roztoku s vhodným pH a iontovou silou. Aby byl průběh PCR efektivní, je potřeba optimalizovat koncentrace jednotlivých složek a teplotní režim (Dale et al., 2012). DNA polymeráza katalyzuje syntézu nového DNA řetězce ve směru 5′→3′ podle sekvence nukleotidů v komplementárním řetězci DNA od místa primeru navázaného na templát až do konce (Sambrook and Russell, 2001). Nejčastěji používaná termostabilní DNA polymeráza je izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus a označuje se Taq DNA polymeráza. Optimální teplota pro její aktivitu je 65-72 °C po dobu přibližně 5 minut. Taq polymeráza vyžaduje pro svoji funkci přítomnost volných Mg2+ iontů dodávaných ve formě MgCl2 (Patrinos and Ansorge, 2010). Na to, aby se mohla PCR uskutečnit, je nevyhnutelně potřebná templátová DNA. Jako vzorek se může použít DNA vyizolovaná z buněk, případně jen hrubý buněčný extrakt. V některých případech se jako vzorek používají celé buňky, respektive kolonie (Čikoš aj., 2001). Templátová DNA musí být neporušená v amplifikované oblasti, musí být přítomná v dostatečném množství a nesmí být kontaminovaná látkami, které by inhibovaly PCR (Patrinos and Ansorge, 2010). Z hlediska průběhu reakce je také nezbytná přítomnost primerů. Jsou to dva oligonukleotidy dlouhé zpravidla 20-25 nukleotidů, jejichž sekvence odpovídá sekvencím úseku DNA určeného k amplifikaci (Čikoš aj., 2001). V případě použití PCR na průkaz patogenních bakterií se primery vybírají tak, aby se amplifikovaly úseky DNA, které jsou specifické pro daný

27

mikroorganizmus, nebo kódují charakteristický protein, související s jeho patogenitou (Patrinos and Ansorge, 2010). Amplifikace DNA v PCR (obrázek 1) probíhá ve třech opakujících se krocích:

Obrázek 1: Schéma polymerázové řetězové reakce (Alberts et al., 1998)

•

Denaturace, při které dochází při teplotě kolem 95 ºC k oddělení jednotlivých vláken DNA templátu na dvě samostatná vlákna (Čikoš aj., 2001)

•

Annealing (hybridizace), čili nasednutí primerů ke komplementární sekvenci denaturovaného templátu DNA. Probíhá za teploty 40-72 ºC, v závislosti na délce a sekvenci primerů.

•

Extenze (elongace), při níž DNA polymeráza přikládá k 3'OH konci primeru nukleotidy podle komplementární sekvence templátu. Probíhá při teplotě 72 ºC, což je optimum pro Taq DNA polymerázu (Dale et al., 2012).

Denaturace, annealing a extenze tvoří jeden cyklus PCR. Jeden primer nasedá na jedno vlákno denaturovaného DNA templátu, druhý primer nasedá na druhé vlákno templátu, přičemž úsek DNA ohraničený těmito dvěma primery se amplifikuje opakováním cyklů PCR – vznikne produkt PCR. PCR produkty je možné vizualizovat pomocí různých barviv reagujících s DNA, přičemž nejčastěji se používá ethidium bromid, který se včleňuje do molekuly DNA a po vystavení UV záření červeně fluoreskuje. K detekci PCR produktu je možné také použít radioaktivní nebo neradioaktivní značku zabudovanou přímo do PCR produktu 28

nebo hybridizační sondy specifické určitému PCR produktu. Další možností je použití imunologické detekce DNA (Čikoš aj., 2001).

3.6 Biogenní aminy 3.6.1 Charakteristika a zdravotní aspekty Biogenní aminy (BA) jsou zásadité, dusíkaté sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a alifatickou, heterocyklickou nebo aromatickou strukturou (obrázek 2). Mezi biogenní aminy nacházené v potravinách patří histamin, tyramin, tryptamin, putrescin kadaverin, fenylethylamin, spermin a spermidin (Ruiz-Capillas et al., 2011). Putrescin, spermidin, spermin a případně i agmatin se označují jako polyaminy, neboť obsahují více aminoskupin (Larqué et al., 2007).

Obrázek 2: Chemická struktura biogenních aminů (A: histamin, B: tyramin, C: fenylethylamin, D: tryptamin, E: putrescin, F: kadaverin, G: spermidin, H: spermin, I: agmatin) (Koutsoumanis et al., 2010).

29

BA jsou syntetizovány u mikroorganismů, rostlin i zvířat (Vidal-Carou et al., 2011). Hlavní cestou vzniku BA je dekarboxylace (odstranění α-karboxylové skupiny) volných aminokyselin specifickými enzymy. Z aminokyseliny histidinu vzniká histamin, z tyrosinu tyramin, z tryptofanu tryptamin, z lysinu kadaverin. Putrescin vzniká z aminokyseliny argininu, a to buď přes agmatin, nebo přes ornitin. Z putrescinu poté může vznikat spermin a spermidin (Danquah et al., 2012). Biogenní aminy mají významné fyziologické vlastnosti. Mohou fungovat jako hormony a neurotransmitery (histamin), podílet se na syntéze hormonů, alkaloidů, nukleových kyselin a proteinů. Významná je regulace krevního tlaku. Polyaminy jsou velmi důležité pro regeneraci buněk a hojení tkání (Karovičová and Kohajdová, 2005; Spano et al., 2010). V nadměrném množství však mohou být BA zdraví škodlivé. Normální příjem BA ze stravy je metabolizován ve střevním traktu savců detoxifikačním systémem založeným na aktivitě enzymů monoaminooxidázy (MAO), diaminoooxidázy (DAO) a histidinmethyltransferázy (HMT). Účinnost tohoto detoxikačního systému je však velice individuální a při nadměrném příjmu BA potravou detoxikační kapacita nemusí stačit (Koutsoumanis et al., 2010). Toxicita histaminu a tyraminu je zvyšována současnou konzumací alkoholu a potravin obsahujících jiné BA, zejména diaminy a polyaminy. Jejich negativní působení spočívá v odčerpání detoxikační kapacity enzymů a v následném zesílení účinku toxičtějších BA (Standarová et al., 2008). Nejznámějším a nejvíce prostudovaným biogenním aminem je histamin, který je původcem tzv. „scombroid poisoning“ (Hungerford, 2010). Tyto otravy se týkají určitých druhů ryb spojených s vysokým obsahem histidinu a mohou se projevovat svěděním a překrvením kůže, bolestí hlavy, zvracením, žaludečními křečemi, průjmem nebo poklesem krevního tlaku v důsledku vasodilatačních účinků histaminu (VidalCarou et al., 2011). Kromě otrav z ryb byly v mnohem menší míře hlášeny i otravy histaminem z různých druhů sýrů a dokonce i z piva (Shalaby, 1996). Otravy tyraminem jsou spojovány hlavně s konzumací sýrů, proto se také nazývají jako „reakce na sýr“ (Standarová et al., 2008). Projevují se zejména hypertenzí a bolestmi hlavy až migrénami (Ruiz-Capillas et al., 2011). Podobně jako tyramin má vasokonstrikční účinky i fenylethylamin. Putrescin a kadaverin nejsou považovány samy o sobě 30

za toxické, ale mohou zvyšovat toxicitu histaminu a tyraminu (Vidal-Carou et al., 2007). Jako další zdravotní riziko u BA se uvádí jejich možná přeměna na karcinogenní nitrosaminy, což se týká hlavně polyaminů. Za tepla se spermidin, spermin, kadeverin, putrescin a tyramin mohou přeměňovat na sekundární aminy, které za přítomnosti dusitanů tvoří nitrosaminy (Ruiz-Capillas et al., 2011). Předpokládá se, že tato přeměna může probíhat nejen v potravinách (např. masné výrobky s přídavkem dusitanové solící směsi), ale i v našem trávicím traktu činností střevní mikroflóry (Koutsoumanis et al., 2010). 3.6.2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy Pro tvorbu BA je nutná přítomnost volných aminokyselin, bakterií tvořících dekarboxylázy

a podmínek,

při

nichž

bakterie

mohou

růst

(Kalač,

2006).

Dekarboxylázy aminokyselin se u bakterií příliš nevyskytují, ale schopnost tvořit BA byla popsána pro některé mikroorganismy, a to zejména z čeledi Enterobacteriaceae, dále Pseudomonas spp. a pro bakterie mléčného kvašení, přičemž tvorba biogenních aminů není záležitosti rodů či druhů, ale spíše kmenů v rámci druhu (Landete et al., 2007). Např. gen pro produkci tyraminu se u L. brevis pravděpodobně šíří horizontálním přenosem prostřednictvím mobilního elementu (genomic island) (Coton and Coton, 2009), zatímco u Enteroccus faecalis, E. faecium a E. durans se pravděpodobně jedná o druhovou charakteristiku (Ladero et al., 2012). Významné mikroorganismy tvořící BA jsou uvedeny v Tabulce 5. Bakteriální buňky vytváří svou činností BA pro snižování intracelulárního pH, jedná se tedy o obranný mechanismus proti kyselému prostředí (Bover-Cid et al., 2008), i když některé studie naznačují, že by mohly být dekarboxylázy využívány i v alternativních cestách získávání energie. Dekarboxylázy jsou substrátově specifické, nicméně bylo prokázáno, že např. tyrosin dekarboxyláza může za určitých podmínek dekarboxylovat alanin na fenylethylamin (Pessione et al., 2009). Existují dvě různé enzymatické skupiny dekarboxyláz. První jsou dekarboxylázy, jejichž aktivní centrum je tvořeno pyridoxal-5-fosfátem a které se vyskytují u gram negativních mikroorganismů (Landete et al., 2008). Tyto mikroorganismy jsou převážně 31

zodpovědné za tvorbu BA v rybách, neboť se ve fermentovaných salámech běžně nepomnožují. Nicméně vyšší počáteční kontaminace a nesprávné skladování surovin mohou stejně jako nekontrolovaná fermentace vést k pomnožení bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Dekarboxylázy uvolněné z jejich buněk v počátečních fázích výroby mohou způsobovat akumulaci BA i v dalších fázích výroby, kdy už je růst těchto bakterií zastaven (Suzi and Gardini, 2003). Zástupci čeledi Enterobacteriaceae byli jako významní producenti BA identifikováni např. u tradičních španělských fermentovaných salámů (Lorenzo et al., 2010). Tabulka 5: Mikroorganismy produkující biogenní aminy (Vidal-Carou et al., 2007). Mikroorganismus

tyramin fenylethylamin tryptamin histamin putrescin kadaverin

Carnobasterium divergens

+

+

carnobacterium piscicola

+

+

Enterococus faecalis

+

+

Enterococus faecium

+

+

Lactobacillus bavaricus

+

Lactobacillus brevis

+

Lactobacillus buchneri

+

Lactobacillus curvatus

+

+ +

+

Lactobacillushilgardi

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Lactobacillus plantarum

+

+

Pediococcus carnosus

+

Staphylococcus carnosus

+

+

Staphylococcus epidermidis

+

+

+

Staphylococcus xylosus

+

Staphylococcus warneri

+

Kocuria varians

+

+

+

Citrobacter freundii

+

+

Enterobacter aerogenes

+

+

+

Enterobacter cloacae

+

+

+

Escherichia coli

+

Hafnia alvei

+

+

+

Klebsiella oxytoca

+

Morganella morganii

+

Serratia liquefaciens

+

Pseudomonas spp.

+ + +

32

+

Druhou enzymatickou skupinou jsou dekarboxylázy s kovalentně vázaným pyruviolem, které se vyskytují u gram pozitivních mikroorganismů, a zvláště u bakterií mléčného kvašení (Koutsoumanis et al., 2010). Právě produkce BA bakteriemi mléčného kvašení, které se ve fermentovaných salámech vyskytují ve velkém množství, představuje největší riziko. Tvorba biogenních aminů byla prokázána u celé řady izolátů ze skupiny bakterií mléčného kvašení, izolovaných ze spontánně fermentovaných masných výrobků, včetně druhů, jejichž zástupci se používají jako startovací kultury (Ruiz-Capillas et al., 2011). Predominantními druhy BMK ve fermentovaných masných výrobcích jsou Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus. Zatímco kmeny L. sakei nebývají schopny dekarboxylovat aminokyseliny, u kmenů L. curvatus je tato schopnost poměrně častá (BoverCid et al., 2008). Za velmi významné producenty tyraminu jsou mezi BMK považovány enterokoky (Bhardwaj et al., 2009). Naopak koky z čeledi Micrococcaceae se obvykle vyznačují slabou nebo vůbec žádnou dekarboxylázovou aktivitou (Vidal-Carou et al., 2007). Podíl koaguláza negativních stafylokoků schopných produkovat detekovatelné množství BA představoval v několika studiích fermentovaných salámů jen 6 – 14 % (Even et al., 2010; Latorre-Moratalla et al., 2010a; Martín et al., 2006). Seitter et al. (2011) zaznamenali vyšší výskyt aminogenních kmenů u S. carnosus než u S. xylosus. 3.6.3 Výskyt BA ve fermentovaných salámech BA se v potravinách vyskytují především jako produkty činnosti mikroorganismů. Proto jsou obsaženy hlavně ve fermentovaných potravinách, např. fermentovaných salámech, mléčných výrobcích, pivu, vínu či kysaném zelí (Danquah et al., 2012; Garcia-Marino et al., 2010; Ozdestan and Uren, 2010). Zvýšené koncentrace BA byly nalezeny vedle ryb např také v čokoládě, oříšcích, ovoci a zelenině (Shalaby, 1996; Suzzi and Gardini, 2003). U nefermentovaných potravin jsou BA (hlavně kadaverin a putrescin) především indikátorem nežádoucí mikrobiální činnosti (Karovičová and Kohajdová, 2005). V případě skladování potravin může být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (Latorre-Moratalla et al., 2008). Fermentované salámy jsou často kontaminovány biogenními aminy, neboť během fermentace představuje mikrobiální růst, nízké pH a proteolýza vhodné podmínky 33

pro jejich tvorbu (Bover-Cid et al., 2001). Klíčový je již výběr hygienicky kvalitní suroviny (Latorre-Moratalla et al., 2008). Jediné aminy vyskytující se ve významném množství v čerstvém mase jsou spermin a spermidin a v menší míře putrescin. Vysoké koncentrace putrescinu a dalších biogenních aminů jsou spojovány s mikrobiálním růstem až kažením masa (Suzzi and Gardini, 2003). Ve fermentovaných salámech je jako hlavní amin vytvářen tyramin, a to již v prvních týdnech fermentace zároveň s poklesem pH. Naopak tvorba putrescinu nastupuje později a pozvolna a finální koncentrace bývají nižší než u tyraminu. Tvorba fenylethylaminu je mnohem méně výrazná a obvykle začíná až ve druhé polovině zracího procesu, kdy už jsou bakterie ve stacionární fázi růstu nebo odumírají (Bover-Cid et al., 2008). Kvantitativně se BA ve fermentovaných salámech vyskytují v množství od nuly až po několik set mg·kg-1 (Vidal-Carou et al., 2007), a to v závislosti na mnoha faktorech. 3.6.4 Faktory ovlivňující výskyt BA ve fermentovaných salámech Tvorba biogenních aminů ve fermentovaných salámech je komplexní záležitost, která může být ovlivněna celou řadou faktorů, jako je úroveň mikrobiální kontaminace, použití startovacích kultur a faktory prostředí ovlivňující růst mikroorganismů (RuizCapillas et al., 2011). Prvním předpokladem je přítomnost prekurzorů, tedy volných aminokyselin. Ty jsou uvolňovány činností endogenních a mikrobiálních proteáz (Koutsoumanis et al., 2010). Aro Aro et al. (2010) zkoumali množství aminokyselin v průběhu zrání a zjistili, že ve srovnání s kontrolou obsahovaly salámy se startovací kulturou méně volných aminokyselin včetně argininu, histaminu a lysinu. Nejmenší obsah volných aminokyselin vykazovaly salámy se směsí Pediococcus pentosaceus a Staphylococcus xylosus, i když S. xylosus při samostatném přídavku množství aminokyselin neovlivňoval. Účinná byla i kombinace Lactobacillus sakei a S. carnosus. Použití vhodných startovacích kultur potlačujících rozvoj mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou vedlo v mnoha studiích ke snížení tvorby BA. V závislosti na použité kultuře, druhu salámu a sledovaném BA bylo dosaženo poklesu až o 95 % (Bover-Cid et al., 2000; Talon et al., 2008; Latorre-Moratalla et al., 2010a; Lu et al.,

34

2010). Kromě potlačení růstu dekarboxyláza pozitivních mikroorganismů byla u některých kmenů BMK také prokázána schopnost degradace BA in vitro (Chong et al., 2011). Během oxidativní deaminace BA vznikají aldehydy, peroxid vodíku a amoniak. Tyto enzymy mají optimum při 37°C a neutrálním až mírně zásaditém pH (Koutsoumanis et al., 2010). Z fyzikálně-chemických parametrů se diskutuje zejména vliv pH, aktivity vody, obsahu soli či dalších aditiv, teplota a relativní vlhkost při zrání. Tyto faktory ovlivňují tvorbu BA převážně prostřednictvím potlačení rozvoje dekarboxyláza pozitivních mikroorganismů (hlavně čeledi Enterobacteriaceae). Na druhou stranu pH a teplota ovlivňují přímo enzymatickou aktivitu dekarboxyláz. Dekarboxylázová aktivita je obvykle silnější při nižším pH, jako optimum se uvádí pH 4,0 – 5,5. Nižší pH také bude indukovat tvorbu dekarboxyláz jako obranný mechanismus. Zároveň však rychlé okyselení inhibuje růst Enterobacteriaceae a tím i přítomnost dekarboxyláz (Koutsoumanis et al., 2010). Podobně rozporuplný může být i vliv teploty. Pro spontánně fermentované salámy obvykle platí, že čím delší je doba zrání a čím vyšší teplota a relativní vlhkost, tím vyšší bude obsah BA (LatorreMoratalla et al., 2010b). Na druhou stranu vyšší teploty při zrání (kolem 24 °C) umožní startovací kultuře rychleji přerůst ostatní, aminogenní mikroorganismy (Suzi and Gardini, 2003). Také byl potvrzen vliv kalibru salámu na tvorbu BA, kdy u výrobků s větším průměrem bývá detekován vyšší obsah biogenních aminů, zřejmě díky rozdílům v redox potenciálu, obsahu soli a aktivitě vody. Obdobně ve středu výrobku bývá vyšší koncentrace BA než v okrajových částech, které jsou více a rychleji vysušené a vykazují tak i vyšší koncentraci soli (Bover-Cid et al., 1999; Komprda et al., 2009; LatorreMoratalla et al., 2010b). 3.6.5 Legislativa Toxické dávky BA je obtížné stanovit. Velmi záleží na individuálních rozdílech mezi lidmi, zastoupení jednotlivých BA v potravině, množství konzumované potraviny a přítomnosti jiných potencujících složek, jakými jsou například alkohol nebo léky

35

(Chong et al., 2011). Příjem histaminu v množství 5 – 10 mg už může vyvolat problém u některých citlivých jedinců, 10 mg je považováno za přijatelný limit, 100 mg vyvolává

mírnou

toxicitu

a 1000 mg

je

již

vysoce

toxických

(Karovičová

and Kohajdová, 2005). V současnosti je v ČR platný pouze limit pro obsah histaminu v rybách a výrobcích z ryb spojovaných s vysokým množstvím histidinu, uváděný v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005, v platném znění. Základní limit je 100 mg·kg-1 (resp. 200 mg·kg-1 u výrobků, které enzymaticky zrály v láku), přičemž 2 vzorky z 9 mohou obsahovat až dvojnásobné množství. Například v USA používají konzervativnější limit 50 mg·kg-1 v reprezentativním vzorku (Hungerford, 2010). Rauscher-Gabernig et al. (2009) navrhli používat v EU limity pro histamin 500 mg·kg-1 v salámech a 400 mg·kg-1 v sýrech. 3.6.6 Detekční metody K identifikaci a kvantifikaci BA v potravinách se používají zejména chromatografické metody, a to zvláště HPLC (v reverzní fázi). Lze však použít i chromatografii na tenké vrstvě, plynovou chromatografii nebo ultra HPLC (Latorre-Moratalla et al., 2009). Existují i enzymatické, spektrofotometrické a imunologické metody stanovení, zvláště pro histamin (Vidal-Carou et al., 2011). Při výběru vhodné metody je třeba zohlednit především analyzovanou matrici. Chromatografické stanovení BA v potravinách zahrnuje jako hlavní kroky extrakci z matrice, derivatizaci, separaci a detekci (Komprda a Dohnal, 2010). Zvláště extrakce a derivatizace jsou při stanovení BA klíčové. Pro extrakci BA z potravin bylo navrženo použití kyseliny chloristé (0,4 – 0,6 M), kyseliny trichloroctové (5 – 10 %) a kyseliny chlorovodíkové (Karovičová and Kohajdová, 2005). Kyselina chlorovodíková však není vhodná k analýze ryb a masa (De Mey et al., 2012). Smělá a kol. (2004) porovnávali obě zbývající extrakční činidla a největší výtěžnost byla pro fermentované salámy dosažena po trojnásobné extrakci 5% kyselinou trichloroctovou. Dalším specifickým krokem je derivatizace. Většina BA není schopna dostatečné absorpce, ani nevykazuje významnou fluorescenci, a právě pomocí derivatizace se dosáhne citlivosti potřebné pro UV/VIS i fluorescenční detekci (De Mey et al., 2012). Nejčastěji se používají dansylchlorid, dabsylchlorid, benzoylchlorid a o-ftaldialdehyd, ale lze použít i řadu

36

dalších látek (Vidal-Carou et al., 2009). Ftalaldehyd nereaguje se sekundárními aminy a nelze ho tedy použít pro stanovení sperminu a spermidinu (Smělá a kol., 2004). Pro prevenci vzniku BA ve fermentovaných salámech je také klíčová včasná detekce mikroorganismů produkujících BA. Může zahrnovat průkaz tvorby BA ve speciálních kultivačních médiích, nebo ještě lépe průkaz přítomnost genů kódujících dekarboxylázy v genomu bakterie (Spano et al., 2010). Geny kódující histidin dekarboxylázu, lyzin dekarboxylázu, tyramin dekarboxylázu a ornithin dekarboxylázu se nazývají hdc, ldc, tdc a odc (v literatuře je možné najít i označení hisdc, tyrdc, hisDC, tyrDC apod.). Histidin dekarboxyláza, lysin dekarboxyláza a ornithin dekarboxyláza jsou různé u gram pozitivních a u gram negativních mikroorganismů, proto se u těchto skupin používají jiné sety primerů (Landete et al., 2007). Bylo také vyvinuto několik protokolů multiplex PCR pro současnou detekci hdc a tdc (Coton and Coton, 2005), hdc, tdc a odc (De las Rivas et al., 2005; Marcobal et al., 2005) nebo všech čtyř genů (De las Rivas et al., 2006).

37

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 4.1.1 Výroba salámů V rámci této práce byly použity trvanlivé tepelně neopracované (fermentované) salámy ze dvou výrobních závodů v České republice. V rámci běžné výrobní praxe za dodržení hygienických a skladovacích podmínek vyrobil každý výrobce od každého typu výrobku čtyři várky díla o hmotnosti 25 kg. Receptura obou výrobců byla následující: Na 100 kg hotového výrobku bylo použito 162 kg masa. Základní surovinou bylo vepřové maso a sádlo (80 %) a libové hovězí maso (20 %). Dále byla při výrobě použita dusitanová solící směs obsahující 0,9 % dusitanu sodného (2,5 %), směs koření (1,7 %), dextróza (1 %), antioxidant isoaskorban sodný (E 316) a mikrobiální kultury. Salámy byly vyrobeny s použitím dvou různých kořenících směsí (směs typická pro salám Herkules a směs typická pro salám Paprikáš). Od každého typu výrobku byly vyrobeny čtyři várky, každá s jinou kombinací startovací a probiotické kultury. Jako startovací kultura (0,5 g·kg-1) byl přidáván Pediococcus pentosaceus (AS-3/100, Chr. Hansen, Dánsko) nebo směs Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus (FU-2, Alfred Willich, Německo). Probiotickou kulturu představoval kmen Lactobacillus casei BGP 93 (Sacco, Itálie) v množství 106 KTJ·g-1 díla nebo kmen Lactobacillus casei 431® (Chr. Hansen, Dánsko) ve stejném množství. Směs mraženého sádla, masa a ostatních přísad byla po rozmělnění a smíchání na kutru naražena do kutisinových střev o průměru 45 mm. Fermentace a zrání probíhalo první den při 27 °C a relativní vlhkosti vzduchu 92 %, dále po dobu jedenácti dnů při 20 °C a relativní vlhkosti 85 % s přívodem studeného kouře a následovalo dosoušení po dobu šestnácti dnů (12 °C, relativní vlhkost 70 %). Celková doba zrání tedy byla 28 dní. 4.1.2 Přístroje a pomůcky Anaeroboxy (Merck, Německo) 38

AnaeroGen (Merck, Německo) Autokláv Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instruments, Česká republika) AW SPRINT TH-500 (Novasina, Švýcarsko) Běžné sterilní laboratorní sklo a pomůcky Centrifuga Hettich Universal 32R (Hettich, Německo) Chromatograf HP 1100 (Agilent Technologies, USA) Fotoaparát HP Photosmart R 707 (Hewlett-Packard, USA) Homogenizátor (Fabrilabo, Francie) Horizontální elektroforéza Midigel II (Apelex, Francie) Kapalinový chromatograf HP 1100 (Agilent technologies, Wilmington, USA) Kombinovaná chladnička s mrazákem (Scholler, Německo) Laboratorní váhy (Schoeller instruments, Česká republika) MS2 Minishaker (IKA Werke, Německo) Mikropipety (Biotech, Česká republika) Mikroskop Olympus BX50 (Olympus, Japonsko) Mixer (Moulinex, Francie) Nylonový membránový filtr (Chromatography Research Supplies, Addison, USA) pH-metr WTW pH 95 (Weilheim, Německo) Ponorný mixer (Heidolph Diax 900, Německo) Stomacher (Schoeller instruments, Česká republika) Termocyklátor PTC-150HB ( MJ Research, Waltham, USA) Termostat Sanyo (Schoeller instruments, Česká republika) Transluminátor (Vilber Laurmat, Francie) Vodní lázeň Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Česká republika) Vortex (neoLab Migge, Německo) 39

Zdroj stejnosměrného proudu (Omni-Bio, Česká republika) 4.1.3 Roztoky a kultivační půdy 4.1.3.1 Roztoky Roztok pro agarózovou gelovou elektroforézu TBE pufr připravíme naředěním ze zásobního roztoku 5 x TBE, pH 8,3 Tris(hydroxymethyl)aminomethane

54,0 g/l

Kyselina boritá

27,5 g/l

EDTA

3,72 g/l

Destilovaná voda

1000 ml

Ředící roztok Pepton

1,0 g/l

Chlorid sodný

8,5 g/l

Destilovaná voda

1000 ml

Vše se dobře rozpustí za stálého míchání. Sterilizujeme v autoklávu 20 minut při teplotě 121 °C. Dekarboxylační médium Trypton

5,0 g/l

Kvasničný extrakt

5,0 g/l

Masový extrakt

5,0 g/l

NaCl

2,5 g/l

Glukóza

2,0 g/l

Twenn 80

1,0 g/l

MgSO4

0,2 g/l

MnSO4

0,05 g/l 40

FeSO4

0,04 g/l

Citrát amonný

2,0 g/l

Thiamin

0,01 g/l

K2PO4

2,0 g/l

CaCO3

0,1 g/l

Pyridoxal-5-fosfát

0,05 g/l

Bromcresol pyrole

0,06 g/l

Agar

20,0 g/l

Použité aminokyseliny v dekarboxylačním médiu L-tyrosin 1 % disodné soli (Sigma, Francie)

10 g/l

Volná báze L-histidinu (Calbiochem, Kanada)

10 g/l

4.1.3.2 Kultivační půdy Plate count agar (Noack, Francie) Trypton

5,0 g/l

Kvasničný extrakt

2,5 g/l

Glukóza

1,0 g/l

Bakteriologický agar

12,0 g/l

20,5 g přípravku bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace proběhla v autoklávu při 121 °C po dobu 20 minut. MRS agar (Noack, Francie) Pepton

10,0 g/l

Masový extrakt

10,0 g/l

Kvasničný extrakt

5,0 g/l

Glukóza

20,0 g/l

41

Tween 80

1,08 g/l

Difosfát sodný

2,0 g/l

Octan sodný

5,0 g/l

Citrát sodný

2,0 g/l

Sulfid hořčíku

0,2 g/l

Sulfid manganu

0,05 g/l

Bakteriologický agar

15,0 g/l

70,3 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace v autoklávu proběhla při 121 °C po dobu 20 minut. MRS agar s přídavkem moxalactamu (Noack, Francie) K 1000 ml sterilního MRS agaru připraveného dle výše uvedeného postupu a zchlazeného na teplotu 45 °C bylo přidáno antibiotikum moxalactam (Sigma – Aldrich, Německo) v množství 112 mg. Agar s kanamycinem a azidem sodným (Merck, Německo) Pepton z kaseinu

20,0 g/l

Kvasničný extrakt

5,0 g/l

Chlorid sodný

5,0 g/l

Citrát sodný

1,0 g/l

Azid sodný

0,15 g/l

Kanamycin sulfát

0,002 g/l

Eskulin

1,0 g/l

Citrát železito-amonný

0,5 g/l

Agar

15,0 g/l

47,5 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Sterilizace proběhla v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 20 minut.

42

4.1.3.3 Komponenty a chemikálie pro PCR Bromfenolová modř

MBI Fermentas, Kanada

EDTA

SERVA, Německo

Ethidium bromid

SERVA, Německo

GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder

MBI Fermentas, Kanada

PCR agaróza

SERVA, Německo

Pufr – 10 x loading pufr

MBI Fermentas, Kanada

Qiagen HotStar Master Mix

Qiagen, Německo

Taq DNA polymeráza

Qiagen, Německo

Voda pro injekce

B. Braun Melsungen AG, Německo

4.2 Metodika 4.2.1 Skladování a odběr vzorků Salámy byly po výrobě převezeny na Ústav technologie potravin Mendelovy univerzity, kde byly skladovány při teplotě 15 °C po dobu 21 dní (až do 49. dne po naražení výrobku). Odběry vzorků probíhaly 0., 14., 28. a 49. den po naražení salámů. Vzorky byly od výrobců dopravovány do laboratoře v transportních chladicích boxech. Každá z provedených analýz byla provedena ve dvou opakováních. Odběr vzorků na mikrobiologické vyšetření proběhl v souladu s ČSN EN ISO 68872. Pro mikrobiologické vyšetření bylo za sterilních podmínek odebráno 10 g vzorku ze středu salámu a po dobu 90 sekund homogenizováno s 90 ml sterilního fyziologického roztoku ve Stomacheru. Po odběru vzorku na mikrobiologické vyšetření bylo odebráno 150 g vzorku na stanovení obsahu biogenních aminů. Do doby analýzy BA byly vzorky uchovávány v tmavých prachovnicích při -18 °C. Zbývající část salámu byla použita pro stanovení pH a vodní aktivity.

43

V průběhu pokusu byl sledován vliv vybraných faktorů (výrobce, použitá kořenící směs, startovací kultury, probiotické kultury, doba zrání/skladování) na relevantní ukazatele (mikrobiologické, chemické, fyzikální). 4.2.2 Mikrobiologická analýza U vzorků bylo prováděno stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), počtu bakterií mléčného kvašení (BMK), Lactobacillus casei a enterokoků. Vyšetření se provádělo zalitím 1 ml inokula v Petriho misce příslušným živným médiem. Pro inokulaci byla použita dvě po sobě jdoucí desetinásobná ředění a z každého ředění byly připraveny dvě misky. Stanovení CPM se provádělo podle normy ČSN ISO 2293 Stanovení celkového počtu mikroorganismů, a to na půdě Plate Count Agar, inkubace aerobně 30 °C/72 h. Stanovení BMK se provádělo podle ČSN ISO 13721 Stanovení počtu bakterií mléčného kvašení, a to na půdě MRS agar, inkubace anaerobně 30 °C/72 h. Počty L. casei byly stanovovány podle Kröckela (2006) na půdě MRS s moxalactamem a konfirmovány pomocí PCR. Inkubace probíhala v anaerostatu při 37 °C/72 h. Enterokoky byly stanovovány na půdě s kanamycinem, eskulinem a azidem sodným (KEAA), inkubace aerobně při 37 °C/48 h. 4.2.3 Metoda stanovení biogenních aminů a polyaminů Do 85 ml zkumavek bylo naváženo vždy 10 g vzorku, ke kterému bylo přidáno 0,5 ml vnitřního standardu (1,7-diaminoheptan v koncentraci 1 mg·ml-1). Vzorky byly homogenizovány s přídavkem 15 ml 5 % kyseliny trichloroctové (TCA) po dobu 2 minut. Vzniklá suspenze byla centrifugována po dobu 15 minut a následně filtrována přes papírový filtr. Supernatant byl filtrován přes papírový a vzniklý pevný podíl byl opět extrahován. Supernatant byl doplněn na objem 50 ml deionizovanou vodou a zfiltrován přes jednorázový nylonový membránový filtr (13 mm, 0,45 μl). Extrakt byl derivatizován dansylchloridem (5-dimethylaminonaphtalen-1-sulfonylchlorid, DCl). Derivatizační činidlo bylo připraveno rozpuštěním 5 mg dansylchloridu v 1 ml acetonu. Postup derivatizace: K 1 ml extraktu bylo přidáno 0,5 ml nasyceného Na2CO3 (pH 11,2). Derivatizační činidlo v množství 1 ml a směs byla promíchána 1 minutu. 44

Derivatizace probíhala 1 hodinu při 40 °C bez přístupu světla. Deriváty aminů byly extrahovány diethyletherem (3 x 1 ml). Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a odparek byl rozpuštěn v 0,5 ml acetonitrilu (ACN). Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 μm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Biogenní aminy byly separovány pomocí kapalinové chromatografie HP 1100. Chromatograf byl složen z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degazeru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCl byla provedena pomocí gradientové eluce s H2O/ACN (čas 0 – 23 minut: H2O 35 – 0 %, ACN 65 – 100 %) na koloně Zorbax Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) s předkolonou Meta Gard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) při průtoku 0,8 ml·min.-1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 254 nm. Separované biogenní aminy byly porovnáním retenčních časů se standardem BA po derivatizaci DCl (všechny standardy BA byly dodány jako hydrochloridy) a jejich koncentrace po DCl derivatizaci vyjádřeny v mg·kg-1 původního (čistého) vzorku (nikoli na kg sušiny) pro lepší vyjádření podmínek konzumace (Latorre-Moratalla et. al., 2008). Koncentrace BA ve vzorku byla upravená metodou vnitřního standardu (Komprda a kol., 2004). 4.2.4 Stanovení pH a vodní aktivity Měření pH bylo prováděno pH metrem WTW pH 95 vybaveným vpichovou elektrodou. Stanovení vodní aktivity bylo provedeno podle ČSN ISO 21807 Stanovení vodní aktivity, a to na přístroji AW SPRINT TH-500. 4.2.5 Testování tyrosindekarboxylázové a histidindekarboxylázové aktivity u startovacích kultur a kmenů L. casei v dekarboxylačním médiu (DCM) Přečištěné

probiotické

a startovací

kultury

(kultura

Lactobacillus

curvatus

a Staphylococcus carnosus byla testována jako celek) byly inokulovány do tekutého dekarboxylačního média (DCM; podle autorů Bover-Cid and Holzapfel, 1999), které obsahovalo 1 % disodné soli tyrosinu a volnou bázi histidinu. Všechny izoláty byly inokulovány duplicitně v DCM s a bez (negativní kontrola) tyrosinu a histidinu

45

a inkubovány 4 dny při 37 °C. Izoláty byly vyhodnoceny jako DCM pozitivní v případě barevné změny média ze žluté na fialovou. Do skleněné reagenční láhve o objemu 1 litr byly naváženy komponenty uvedené v rozpisu pro dekarboxylační médium (vyjma aminokyselin). Získaná směs byla rozpuštěna v litru destilované vody. Poté byla směs vložena do autoklávu, kde následně proběhla sterilace při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Po ochlazení bylo pH směsi upraveno sterilními roztoky (0,1 M HCl a 0,1 M NaOH) na 7,4. Poté byly aminokyseliny předem rozpuštěné v 0,1 mol/l sterilní HCl přefiltrovány a opět bylo upraveno pH na 7,4 sterilními roztoky 0,1M NaOH nebo 0,1 M HCl. 4.2.6 Konfirmace schopnosti izolátů startovacích kultur a probiotických kmenů L. casei produkovat tyramin a histamin v DCM metodou HPLC Po inkubaci v DCM byly vzorky centrifugovány při 10.000 ot./min po dobu 3 minuty při 4 °C; 1 ml supernatantu byl smíchán s 1 ml 0,1 M HCl a 20 μl vnitřního standardu 1,7-diaminoheptan, roztok byl odstředěn na mini míchadle a znovu centrifugován. Supernatant byl filtrován přes nylonovou membránu (13 mm, 0,45 μl). Derivatizace probíhala 1 hodinu bez přístupu světla při 40 °C a deriváty aminů byly extrahovány diethyletherem (3 x 1 ml). Organická fáze byla odpařena do sucha dusíkem a odparek byl rozpuštěn v 0,5 ml acetonitrilu. Roztok byl zfiltrován přes nylonový membránový filtr 0,45 μm a nastříknut na chromatografickou kolonu. Biogenní aminy byly separovány pomocí kapalinové chromatografie HP 1100 složeného z kvartérní pumpy (G1311A), vakuového degazeru (G1322A), autosampleru (G1313A) a UV/VIS detektoru s proměnnou vlnovou délkou (G1314A). Separace po derivatizaci DCl byla provedena pomocí gradientové eluce s H2O/ACN (čas 0 – 23 minut: H 2O 35 – 0 %, ACN 65 – 100 %) na koloně Zorbax Elipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) s předkolonou Meta Gard ODS-2 (30 mm x 4,6 mm, velikost částic 5 μm) při průtoku 0,8 ml·min.-1 s použitím fotometrického UV/VIS detektoru při 254 nm. Separované biogenní aminy byly porovnáním retenčních časů se standardem BA po derivatizaci DCl a jejich koncentrace po DCl derivatizaci byly vyjádřeny v mg·kg-1 původního (čistého) vzorku (nikoli na kg sušiny) pro lepší vyjádření podmínek

46

konzumace, Latorre-Moratalla et al., 2008). Koncentrace BA ve vzorku byla upravená metodou vnitřního standardu (Komprda et al., 2004). 4.2.7 Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu DNA byla izolována z kolonií startovacích a probiotických kultur podle autorů Sambrook and Russell (2001). PCR byla provedena s konečným objemem 25 μl obsahujícím přibližně 10 ng genomové DNA, 10 pmol primerů, 1U Taq DNA polymerázy a odpovídající množství Qiagen Hotstar Master Mix. Pro detekci tyrDC a hDC byly použity následující primery (Coton and Coton, 2005): TD2 (5`ACATAGTCAACCATRTTGAA-3`)/TD5

(5`-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-

3`) a HDC3 (5`- GATGGTATTGTTTCKTATGA-3`)/HDC4 (5`-CAAACACCAGCAT CTTC -3`). DNA byla kompletně denaturovaná inkubací při 94 °C po dobu 15 min. a následně amplifikována ve 30 cyklech (denaturace při 95 °C po dobu 45 s., hybridizace primerů při 52 °C po dobu 45 s., a syntéza komplementárního DNA řetězce při 72 °C po dobu 75 s. pomocí termocyklátoru). V posledním amplifikačním kroku byly vzorky inkubovány při 72 °C po dobu 10 min. pro kompletní prodloužení finálních produktů PCR. Po PCR byly amplifikované fragmenty DNA separovány pomocí agarosové gelové elektroforézy. 4.2.8 Konfirmace L. casei metodou PCR Suspektní kolonie L. casei izolované na MRS agaru s přídavkem moxalactamu byly konfirmovány metodou PCR podle metodiky Španová a kol. (2009). Primer

Sekvence

FcaselS

5´ CTA TAA GTA AGC TTT GAT CCG GAG ATT T 3´

RcaselS

5´ CTT CCT GCG GGT ACT GAG ATG T 3´

Všechny složky PCR směsi byly důkladně promíchány, krátce centrifugovány a umístěny do termocykleru. Podmínky amplifikace byly následující: denaturace DNA 95 °C/30 s., hybridizace primerů 54 °C/30 s. a syntéza komplementárního řetězce 72 °C/60 s. 47

Před prvním cyklem byla směs zahřívána při 95 °C/5 min.; v posledním cyklu byla syntéza řetězce při 72 °C prodloužena na 7 min. Amplifikace proběhla v 30 cyklech. Poté byla reakční směs analyzována pomocí 1,5 % agarosové gelové elektroforézy. Při detekci PCR produktu (132 bp) byl použit velikostní standard DNA (100-1500 bp Ladder). 4.2.9 Statistické zpracování výsledků Jednotlivé ukazatele byly měřeny ve dvou opakováních u každého vzorku salámu. Zprůměrované hodnoty byly použity následně ve statistickém vyhodnocení. Pro statistickou analýzu počtů mikroorgasnimů

byly

použity hodnoty vyjádřené

v logaritmech KTJ·g-1. Hodnoty u vzorků bez přídavku probiotických kultur, které byly v této práci použity pro srovnání, byly získány z paralelního pokusu, který probíhal za stejných podmínek (Sládková, 2010). Výsledky byly zpracovány počítačovým programem Statistica 8 (StatSoft Inc., USA). Pro statistické vyhodnocení vlivu sledovaných faktorů byla použita jednofaktorová ANOVA a následně provedena post-hoc analýza Duncanovým testem. Změny v koncentracích BA a v počtech sledovaných skupin mikroorganismů v průběhu zrání a skladování byly vyhodnoceny regresní analýzou. Testována byla průkaznost lineárního respektive kvadratického členu v celém průběhu zrání/skladování.

48

5 VÝSLEDKY 5.1 Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání a skladování fermentovaných salámů V rámci této práce byl hodnocen vliv výrobce, použité kořenící směsi, startovací kultury a probiotické kultury. Koncentrace biogenních aminů byly stanovovány metodou HPLC s UV detekcí u vzorků odebraných 0., 14., 28. a 49. den po naražení. U vzorků odebraných ihned po naražení a 14. den po naražení nebyly prokázány statisticky významné rozdíly (P > 0,05) mezi výrobci K a R, použitou kořenící směsí a přidanými startovacími kulturami z hlediska koncentrace histaminu. Počáteční hodnoty se pohybovaly pouze mezi 0 – 0,097 mg·kg -1. Na konci doby zrání (obrázek 3) a skladování (obrázek 4) byly zaznamenány nižší koncentrace histaminu u salámů výrobce K ve srovnání s výrobcem R, nižší koncentrace u salámů se startovací kulturou Pediococcus pentosaceus a dále nižší koncentrace u salámů s přídavkem probiotik ve srovnání s kontrolou.

Obrázek 3: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

49

Statisticky významné rozdíly byly zaznamenány především mezi jednotlivými startovacími kulturami 49. den (P < 0,01).

Obrázek 4: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

Koncentrace tyraminu se podobně jako u histaminu 0. den statisticky významně nelišila (P > 0,05) mezi salámy od dvou různých výrobců s odlišnou kořenící směsí a použitými startovacími kulturami, pouze počáteční koncentrace byly značně vyšší než u histaminu a pohybovaly se v rozmezí 2,18 – 8,13 mg·kg-1. Zatímco u použité kořenící směsi byly naměřeny podobné hodnoty po celou dobu pokusu, již od 14. dne byly zaznamenány statisticky významné rozdíly mezi výrobci K a R (P < 0,05), jak je patrno na obrázcích 5 a 6. V průběhu skladování se také zvětšoval rozdíl mezi použitými startovacími kulturami, kdy salámy se startovací kulturou Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus vykazovaly obecně vyšší koncentrace tyraminu než salámy s kulturou Pediococcus pentosaceus. Statisticky významný rozdíl byl zaznamenán na konci doby skladování (P < 0,01). Koncentrace tyraminu na konci pokusu dosahovala nejvyšších hodnot ze všech sledovaných biogenních aminů a u všech kontrolních skupin přesáhla hodnotu 200 mg·kg-1.

50

Obrázek 5: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

U všech sledovaných parametrů byly zvláště na konci doby skladování zjištěny statisticky významné rozdíly mezi kontrolou a salámy s přídavkem probiotik (P < 0,05), jak je patrné z obrázku 6.

51

Obrázek 6: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

Koncentrace 2-fenylethylaminu byla již od 0. dne statisticky vyšší u salámů od výrobce R než u salámů výrobce K (P < 0,01). Vliv použitého koření ani přidané startovací kultury na obsah 2-fenylethylaminu nebyl prokázán po celou dobu pokusu. Koncentrace 2-fenylethylaminu na konci zrání a na konci skladování jsou znázorněny v obrázcích 7 a 8.

52

Obrázek 7: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

Obrázek 8: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

53

Koncentrace kadaverinu byla 0. den srovnatelná s koncentrací tyraminu, v průběhu pokusu však nedošlo k tak významnému nárůstu, jak je patrno z obrázků 9 a 10. Po celou dobu pokusu byl zaznamenáván statisticky významný rozdíl (P < 0,01) mezi použitými startovacími kulturami, kdy salámy se startovací kulturou Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus vykazovaly obecně vyšší koncentrace kadaverinu než salámy s kulturou Pediococcus pentosaceus. Již od 0. dne byl také patrný rozdíl mezi výrobci; na rozdíl od jiných biogenních aminů byl však vyšší obsah kadaverinu zjišťován u salámů výrobce K. Salámy s přídavkem probiotik vykazovaly nižší koncentrace kadaverinu než salámy bez přídavku probiotik (kontrola); tento rozdíl byl však statisticky významný (P < 0,05) až na konci doby skladování (obrázek 10).

Obrázek 9: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

54

Obrázek 10: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

Koncentrace putrescinu dosahovaly po tyraminu druhých nejvyšších hodnot (viz obrázky 11 a 12). Vliv sledovaných faktorů byl v průběhu zrání a skladování značně proměnlivý. Rozdíl mezi výrobci K a R (vyšší koncentrace u salámů výrobce K) byl statisticky průkazný pouze u salámů testovaných ihned po naražení (P < 0,05), v dalších odběrech už dosahovaly salámy obou výrobců podobných hodnot. Naopak rozdíly mezi použitou startovací kulturou a rozdíly mezi kořením se projevily až od 14., respektive 28. dne po naražení.

55

Obrázek 11: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

Obrázek 12: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

56

Koncentrace ostatních polyaminů sperminu a spermidinu se v průběhu zrání a skladování salámů snižovala. U sperminu byl opět patrný rozdíl mezi použitými startovacími kulturami, který však nebyl statisticky průkazný (P > 0,05). Významné byly rozdíly mezi výrobci K a R 49. den a rozdíly mezi použitým kořením 28. den (P < 0,05). Hodnoty sperminu ve 28. a 49. den po naražení jsou uvedeny v obrázcích 13 a 14.

Obrázek 13: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

57

Obrázek 14: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

U koncentrací spermidinu byl opět patrný vliv použité startovací kultury, který byl však statisticky průkazný pouze 14. den pokusu (P < 0,05). Vliv kořenící směsi na obsah spermidinu nebyl zaznamenán v celém průběhu pokusu. Salámy výrobce K vykazovaly stejně jako u sperminu vyšší koncentrace než salámy výrobce R, tento rozdíl byl však statisticky významný (P < 0,05) pouze na konci skladování (49. den). Hodnoty spermidinu ve 28. a 49. den po naražení jsou uvedeny v obrázcích 15 a 16.

58

Obrázek 15: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A – průměry označené stejnými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně neliší (P > 0,05)

Obrázek 16: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby skladování (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

59

V obrázcích 17 a 18. jsou zobrazeny hodnoty celkové sumy sledovaných aminů na konci doby zrání (28. den) a na konci doby skladování (49. den). Mezi dvěma odlišnými výrobci nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl v celkovém obsahu biogenních aminů (P > 0,05), jak je patrné z předchozích grafů, některé aminy se vyskytovaly ve větší míře v salámech výrobce K (kadaverin, spermin, spermidin), jiné zase v salámech výrobce R (histamin, tyramin, 2-fenylethylamin). Naopak významné rozdíly byly po celou dobu pokusu zaznamenávány mezi startovacími kulturami (P < 0,05), kdy salámy s kmenem Pediococcus pentosaceus vykazovaly zřetelně nižší koncentrace BA než salámy s přídavkem směsné kultury Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus. Dále byl prokázán statisticky významný rozdíl mezi salámy vyrobenými s přídavkem kořenící směsi Herkules, respektive Paprikáš (P < 0,05), kdy salámy s kořenící směsí pro Paprikáš vykazovaly nižší koncentrace BA než salámy s kořenící směsí typickou pro Herkules.

Obrázek 17: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (28. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

60

Obrázek 18: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (49. den) k –kontrola (bez probiotika); K, R – výrobci; H – kořenící směs typu Herkules; P – kořenící směs typu Paprikáš; C- Pediococcus pentosaceus; F – Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus; BGP Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC Lactobacillus casei kmen 431; Definice porovnávaných souborů : např. pro faktor „výrobce“ všechny výrobky (salámy) daného výrobce bez ohledu na koření, startovací kulturu, probiotikum a dobu zrání byly posuzovány jako jeden soubor, n = 24; A,B,C,D – průměry označené různými písmeny v rámci daného faktoru se průkazně liší (P < 0,05)

5.2 Screening izolátů startovacích a probiotických kultur na přítomnost DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu a histidindekarboxylázu Dekarboxylační aktivita byla prokázána u obou startovacích kultur. U kmene Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus i Pediococcus pentosaceus byla prokázána schopnost tvořit tyramin, a to jak testováním v dekarboxylačním médiu, tak pomocí detekce metodou HPLC-UV a detekcí genu tyrosindekarboxylázy pomocí PCR. U probiotických

kmenů

L.

casei

nebyla

tyrosindekarboxylázová

a histidindekarboxylázová aktivita prokázána za použitích stejných metod jako v případě startovacích kultur.

61

5.3 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei ve fermentovaných salámech na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování V této práci byl sledován vliv dvou různých kmenů L. casei na koncentrace BA ve fermentovaných salámech: L. casei BGP 93 a L. casei 431. Z hlediska stanovených cílů jsou podrobněji popsány a znázorněny časové závislosti koncentrace BA s ohledem na použitý kmen L. casei za pomoci regresní analýzy. Koncenrace BA v průběhu zrání a skladování, prezentované z pohledu použitého probiotického kmene a kontroly bez probiotik, jsou znázorněny v obrázcích 19 až 26. Koncentrace všech BA se po celou dobu zrání a skladování zvyšovala s výjimkou sperminu a spermidinu, jejichž obsah se naopak v celém průběhu sledování průkazně (P<0,001) snižoval. U většiny BA (vyjma sperminu a spermidinu) potlačil přídavek probiotické kultury jejich tvorbu, což se projevilo nejvíce 28. a 49. odběrový den. K větší inhibici tvorby BA došlo v případě salámu s použitým kmenem L. casei BGP 93, rozdíly mezi oběma kmeny L. casei však nebyly statisticky významné (P > 0,05). Statisticky významné snížení tvorby bylo prokázáno u tyraminu (oba kmeny L. casei), kadaverinu (oba kmeny L. casei), histaminu (pouze kmen BGP 93), putrescinu (oba kmeny L. casei) a také u celkové sumy aminů (oba kmeny L. casei).

62

Obrázek 19: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci histaminu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Obrázek 20: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci tyraminu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

63

Obrázek 21: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci 2-fenylethylaminu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Obrázek 22: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci kadaverinu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

64

Obrázek 23: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci putrescinu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Obrázek 24: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci sperminu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

65

Obrázek 25: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci spermidinu v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Obrázek 26: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na celkovou sumu všech sledovaných biogenních aminů v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

66

5.3.1 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH a aktivity vody Jedním z cílů této práce bylo také posouzení vlivu přídavku probiotik na fyzikálněchemické parametry salámů (pH, aw). Vývoj pH v průběhu zrání a skladování je znázorněn v obrázku 27. Během prvních týdnů fermentace došlo k poklesu pH z původní hodnoty přibližně 6,0 až na hodnotu přibližně 4,5. Během dalšího zrání a skladování zůstalo pH víceméně konstantní. Mezi salámy s probiotiky a kontrolou nebyly zjištěny žádné průkazné rozdíly. Hodnoty pH se mírně lišily pouze mezi salámy jednotlivých výrobců (R > K) a mezi použitými startovacími kulturami (směs Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus > Pediococcus pentosaceus).

Obrázek 27: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. V grafu jsou zobrazeny průměrné hodnoty bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Hodnoty aw v průběhu zrání a skladování jsou znázorněny v obrázku 28. Aktivita vody se v průběhu celého pokusu snižovala až na úroveň 0,85 (kontrola), respektive 0,83 (probiotické salámy). Salámy s přídavkem probiotik vykazovaly ve srovnání s kontrolou prokazatelně nižší hodnoty aw (P < 0,05) již od 14. dne pokusu.

67

Obrázek 28: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty aktivity vody v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. V grafu jsou zobrazeny průměrné hodnoty bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

5.3.2 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů Koncentrace probiotických kultur v salámech byla sledována po celou dobu pokusu a výsledky těchto stanovení jsou uvedeny v obrázku 29. Suspektní kolonie L. casei byly konfirmovány metodou PCR (viz obrázek 30). Kmen L. casei 431 byl po celou dobu zastoupen v přibližně o 1 logaritmický řád nižším množství než kmen L. casei BGP 93. V průběhu zrání a skladování lze pozorovat pozvolný nárůst obou kmenů; počty L.casei BGP 93 se zvýšily z počátečního množství 5,62 log KTJ·g-1 na 6,83 log KTJ·g-1 a počty L.casei 431 dosáhly na konci skladování pouze hodnoty 5,83 log KTJ·g -1 (počáteční množství 4,62 log KTJ·g-1).

68

Obrázek 29: Počty probiotických kmenů L. casei v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Za účelem vyhodnocení možného vlivu mikrobiální kontaminace salámů na tvorbu BA je součástí této práce i doplňková mikrobiologická analýza, zahrnující stanovení celkového počtu mikroorganismů (obrázek 31), počtu bakterií mléčného kvašení (obrázek 32) a počtu enterokoků (obrázek 33).

Obrázek 30: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktu specifického pro L. casei (132 bp). Hodnoty CPM v prvních týdnech po vyrobení stouply z přibližně 6,6 log KTJ·g-1 přibližně o 1 logaritmický řád. Vrchol křivky časové závislosti celkového počtu

69

mikroorganismů, kolem 7,7 log KTJ·g-1, byl zjištěn v salámech přibližně po třech týdnech po vyrobení. V dalším průběhu zrání a skladování CPM klesly až na hodnoty 6,82 – 6,92 log KTJ·g-1. Mezi salámy s probiotiky a bez probiotik nebyly zaznamenány významné rozdíly (P > 0,05).

Obrázek 31: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na celkový počet mikroorganismů v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Počty BMK v průběhu zrání/skladování jsou uvedeny v obrázku 32. Přídavek probiotik se promítl do celkového počtu bakterií mléčného kvašení. Počty BMK stoupaly během prvních dvou týdnů, vrcholu křivky časové závislosti bylo dosaženo opět po zhruba třech týdnech po výrobě. Následně došlo k pozvolnému poklesu. Poměrně vysoká byla počáteční kontaminace salámů enterokoky, která dosáhla úrovně přibližně 3,75 log KTJ·g-1 (obrázek 33). V průběhu zrání a skladování počty enterokoků významně klesly (P < 0,001). Nejnižší úrovně dosáhly na konci skladování enterokoky v salámech s probiotickým kmenem L. casei BGP 93; rozdíl však ve srovnání s kontrolou nebyl statisticky významný (P > 0,05). Částečné inhibice enterokoků bylo dosaženo ve srovnání s kontrolou i při použití kmene L. casei 431.

70

Obrázek 32: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na počty bakterií mléčného kvašení v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

Obrázek 33: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na počty enterokoků v průběhu zrání. BGP – Lactobacillus casei kmen BGP 93; LC – Lactobacillus casei kmen 431; kontrola – průměr obou startovacích kultur bez probiotik. Všechny vzorky salámů byly posuzovány jako jeden soubor bez ohledu na výrobce, koření a startovací kulturu, n = 96

71

6 DISKUSE V této disertační práci byla mimo jiné hodnocena koncentrace biogenních aminů v závislosti na přídavku probiotik a dalších vybraných faktorů a to v průběhu zrání/skladování jednotlivých druhů salámů vyrobených s přídavkem kořenící směsi typu Herkules a Paprikáš od dvou výrobců K a R. Pozornost koncentracím biogenních aminů byla věnována zejména na konci doby zrání a skladování, kdy je koncentrace biogenních aminů důležitá z pohledu bezpečnosti výrobku pro konzumenta. Po celou dobu zrání i skladování salámů se koncentrace všech biogenních aminů zvyšovala, s výjimkou sperminu a spermidinu, jejichž obsah se naopak v celém průběhu pokusu snižoval. Tento průběh odpovídá i výsledkům jiných studií prováděných na typických českých salámech Herkules a Paprikáš (Komprda et al., 2004; Komprda et al., 2009). Koncentrace sperminu dosáhla na začátku pokusu 36 mg·kg-1, zatímco koncentrace spermidinu byla pouze 3,8 mg·kg-1. Vyšší obsah sperminu než spermidinu je pro potraviny živočišného původu a obzvláště maso obvyklý a byl zaznamenán i ve výše uvedených pracích. Vzhledem k tomu, že oba tyto biogenní aminy vznikají ve svalovině in vivo a jejich tvorba mikrobiální činností je omezená, či spíše žádná (Kozová et al.., 2008), jejich stejná koncentrace bez ohledu na přídavek probiotik není překvapivá a v dalších částech této kapitoly už nejsou do diskuze o biogenních aminech zařazovány. Kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem v salámech typu Paprikáš a Herkules byly na počátku skladování tyramin a kadaverin (4 mg·kg-1). Zatímco kadaverin stoupl na konci doby skladování pouze na 26 (probiotika) a 42 mg·kg-1 (kontrola), tyramin na konci doby skladování dosáhl hodnot 139 – 240 mg·kg-1. Druhým nejvíce kvantitativně zastoupeným aminem byl putrescin a třetím výše uvedený kadaverin. Toto pořadí koresponduje s výsledky studie provedené autory Latorre-Moratalla et al. (2008). Tito autoři stanovovali biogenní aminy v salámech z různých evropských států, vyrobených spontánní fermentací i s použitím startovacích kultur. Nejvíce zastoupen byl tyramin (průměrně 145 mg·kg-1), dále putrescin (51 mg·kg-1) a kadaverin (41 mg·kg 1). V naší studii však hodnoty putrescinu na konci skladování dosahovaly trojnásobně vyšších hodnot (119 – 155 mg·kg-1), než v diskutované studii. Koncentrace 72

putrescinu byla přitom v surovinách, respektive v salámech ihned po naražení poměrně nízká (2 mg·kg-1). K masivnímu nárůstu došlo tedy v průběhu zrání a skladování činností mikroflóry v salámech a důvodem není v našem případě špatná hygienická kvalita použitých surovin, se kterou je putrescin často spojován (Hernández-Jover et al., 1996). Ve studii Latorre-Moratalla et al. (2008) tyramin tvořil ⅓ až ½ z celkové sumy BA. V předkládané práci představoval zhruba polovinu. Hlavními producenty tyraminu v předkládané práci byly pravděpodobně startovací kultury. Tyramin, putrescin a kadaverin byly jako nejvýznamnější biogenní aminy zaznamenány i u Herkulesu a Poličanu ve studiích autorů Komprda et al. (2009) a Komprda et al. (2004). Tyramin, putrescin a kadaverin byly v salámech kvantitativně nejzastoupenější také v řadě jiných studií (např. Bover-Cid et al., 1999; Bover-Cid et al., 2001; Standara et al., 1994). Ve studii autorů Komprda et al. (2004) byl však obsah putrescinu vyšší než obsah tyraminu, podobně jako publikovali např. Standara et al. (1994). Histamin patřil ve studii autorů Latorre-Moratalla et al. (2008) stejně jako v naší studii k nejméně zastoupeným biogenním aminům. Obsah histaminu bývá spojován zejména s činností bakterií čeledi Enterobacteriaceae a u bakterií mléčného kvašení bývá méně častý (Vidal-Carou et al., 2007). Významným faktorem byla v našem případě jistě absence genu pro histamin-dekarboxylázu u startovacích a probiotických kultur, které byly dominujícími mikroorganismy. Vyšší koncentrace histaminu (v desítkách mg·kg-1) byly naopak zaznamenány např. u jiného typického českého fermentovaného salámu – Poličanu, a to hned ve dvou studiích (Komprda et al., 2001; Kameník et al., 2012). V těchto studiích byl naopak zaznamenán nižší obsah tyraminu (v desítkách mg·kg-1) než v naší práci. 2-fenylethylamin byl po histaminu druhým kvantitativně nejméně zastoupeným biogenním aminem. Ve srovnání s hodnotami publikovanými ve studii autorů LatorreMoratalla et al. (2008) byl však obsah 2-fenylethylaminu na konci skladování poměrně vysoký (13,1 – 14,5 mg·kg-1). Jeho tvorbu lze vztáhnout k intenzivní produkci tyraminu, kdy bakterie se silnou tyrosin-dekarboxylační aktivitou obvykle vykazují i střední schopnost dekarboxylovat fenylalanin (Bover-Cid et al., 2001; Vidal-Carou et al., 2007). 73

Vzhledem k tomu, že použití startovací kultury a délka zrání patří mezi hlavní faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů, je v předkládané práci srovnáván obsah BA zejména s výsledky studií prováděných na typických českých salámech. Tradiční salámy zejména jihoevropského typu, vyráběné spontánní fermentací a s delší dobou zrání jako je např. španělský salchichón (Ruiz-Moyano et al., 2011), často logicky obsahují vyšší koncentrace biogenních aminů. Z pohledu současné platné právní úpravy nelze koncentraci BA v analyzovaných salámech vyhodnotit pro neexistenci limitu pro tento typ výrobku. V minulosti byl legislativně stanoven limit pro vybrané BA v rybách, sýrech, pivu a vínu. V současnosti je v ČR platný pouze limit pro obsah histaminu v rybách a výrobcích z ryb podle Nařízení (ES) č. 2073/2005, v platném znění. Oproti tomu v USA je používán konzervativnější limit 50 mg·kg-1 v reprezentativním vzorku (Hungerford, 2010). Rauscher-Gabernig et al. (2009) navrhli používat v EU limity pro histamin 500 mg·kg-1 v salámech. V případě, že by vešel tento limit v platnost, bylo by možné konstatovat, že námi analyzované vzorky salámu by byly hodnoceny jako vyhovující, neboť koncentrace histaminu dosahovala v našem případě nízkých hodnot (max. 5 mg·kg-1). Podle autorů Karovičová and Kohajdová (2005) příjem histaminu v množství 5 – 10 mg už může vyvolat problémy u citlivých jedinců, dávka 10 mg je považována za přijatelný limit, 100 mg histaminu vyvolává mírnou toxicitu a 1000 mg je již vysoce toxických. Otázkou však zůstává posouzení z pohledu toxicity ostatních biogenních aminů. Dle autorů Nowak and Czyzowska (2011) je velmi obtížné stanovit úroveň toxicity BA, neboť je závislá na vlastnostech jednotlivých aminů a na individuální citlivosti konzumentů. V porovnání s výsledky, kterých bylo v rámci předkládané práce dosaženo, lze konstatovat, že z toxikologického hlediska se jevil být jako problematický tyramin a putrescin, jejichž hodnoty dosahovaly v naší práci kolem 200 mg·kg-1. U tyraminu je za toxické množství považováno 100–800 mg·kg-1 (Silla-Santos, 1996), z tohoto pohledu by námi testované salámy mohly ohrozit zdraví konzumentů. Hodnota 100 mg·kg-1 byla překročena u všech salámů již 14. den po naražení. Významná je i vysoká produkce putrescinu v salámech (119 – 155 mg·kg-1). I když o vlastní toxicitě putrescinu je známo málo, uvádí se, že putrescin potencuje toxický účinek tyraminu (Bover-Cid et al., 2000). O toxicitě ostatních biogenních aminů 74

existuje minimum informací, pouze Gardini et al. (2001) uvádí u fenylethylaminu jako toxickou dávku v potravinách 30 mg·kg-1. V případě našeho pokusu nebyla tato koncentrace v průběhu celého zrání a skladování dosažena.

6.1 Vliv vybraných faktorů na koncentraci biogenních aminů v průběhu zrání fermentovaných salámů Obsah biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích ovlivňuje celá řada faktorů. V průběhu pokusu byly na základě již publikovaných studií hodnoceny vybrané ukazatele, které by mohly mít vliv na snižování nebo zvyšování koncentrací BA. Nejdůležitějším faktorem je kvalita vstupních surovin (Eerola et al., 1998) a použitá startovací kultura (Gencellep et al., 2007, Gonzáles-Fernández et al., 2003, Komprda et al., 2009). Při hodnocení celkové sumy BA v rámci tohoto pokusu se ukázal být vliv výrobce na koncentraci BA jako statisticky neprůkazný. Při hodnocení koncentrací jednotlivých BA však byla tendence vyššího nárůstu BA zaznamenána u výrobce R. Statisticky průkazný rozdíl byl zaznamenán u tyraminu a 2-fenylethylaminu. Oproti tomu vyšší obsah kadaverinu byl statisticky průkazný u výrobce K. Tyto výsledky mohou být přisuzovány rozdílné počáteční mikrobiologické kvalitě suroviny, která byla získána od jiných dodavatelů, a z ní vyplývající odlišné počáteční množství BA, kdy podle autorů Latorre-Moratalla et al. (2008) je právě výběr hygienicky kvalitní suroviny pro tvorbu BA klíčový. Z hlediska celkového počtu mikroorganismů však mezi výrobci K a R nebyl 0. den zaznamenán žádný rozdíl. Byla však patrná masivnější kontaminace naraženého díla enterokoky u salámů výrobce K, což koresponduje s vyšším obsahem kadaverinu. Také technologie zpracování a výrobní podmínky v jednotlivých provozech mohly sehrát významnou roli v tvorbě BA, což potvrzují výsledky studie španělských fermentovaných salámů, kdy Miguélez-Arrizado et al. (2006) dospěli k závěru, že každý výrobní závod včetně technologických faktorů a charakteristické perzistující mikroflóry má významný vliv na obsah BA. Nejvyšší počáteční koncentrace ze sledovaných BA v předkládané práci byla zaznamenána u sperminu (36 mg·kg-1). Ostatní BA dosahovaly 0. den průměrné hodnoty do 5 mg·kg-1. Mezi hlavní indikátory hygienické kvality surovin a dodržování správné hygienické praxe patří histamin a kadaverin (Stadnik 75

and Dolatowski, 2010). Hernández-Jover et al. (1996) navrhl pro čerstvé maso jako přijatelnou hygienickou kvalitu index BA < 10 mg·kg-1 (index = suma histaminu, tyraminu, kadaverinu a putrescinu). Z tohoto pohledu byla surovina použitá pro výrobu námi analyzovaných salámů přijatelné hygienické kvality (index BA 9,56). Hodnoty BA naměřené 0. den jsou srovnatelné s výsledky studie autorů Komprda et. al. (2004). Přídavek startovací kultury patří mezi nejvýznamnější faktory ovlivňující obsah BA

ve

fermentovaných

salámech.

Přídavek

startovacích

kultur

s negativní

dekarboxylační aktivitou snižuje tvorbu BA v tradičních fermentovaných salámech (Bover-Cid et al., 2001; Latorre-Moratalla et al., 2010a), a to potlačením mikroorganismů se schopností tvořit BA (Suzzi and Gardini, 2003). Pokud jde o typické české fermentované salámy, v práci autorů Komprda et al. (2004) startovací kultura ovlivňovala významně obsah tyraminu, putrescinu a celkovou sumu BA v salámech Herkules a Paprikáš. V naší práci oba salámy se startovací kulturou Pediococcus pentosaceus vykazovaly statisticky nižší obsah histaminu, tyraminu, kadaverinu, putrescinu a celkové sumy BA ve srovnání se směsí Lactobacillus curvatus a Staphylococcus carnosus. Naopak ve studii autorů Komprda et al. (2001) nebyly mezi startovacími kulturami u salámu Poličan zaznamenány žádné rozdíly v koncentraci BA. Přínos startovacích kultur z hlediska tvorby BA spočívá v inhibici mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou. Účinnost jednotlivých kmenů může záviset např. na schopnosti konkurence s přítomnou mikroflórou nebo tvorbě bakteriocinů (Cocconcelli and Fontana, 2010). Další možností pozitivního působení startovacích kultur je schopnost degradovat BA. García-Ruiz et al. (2011) prokázali u řady bakterií mléčného kvašení včetně kmenů L. casei nebo P. pentosaceus schopnost degradovat tyramin, histamin a putrescin ve víně. Herrero-Fresno et al. (2012) prokázali schopnost rozkládat tyramin a histamin u celé řady kmenů L. casei izolovaných ze sýrů. Studiu degradace BA ve fermentovaných salámech se věnovali např. Leuschner and Hammes (1998), kteří detekovali schopnost degradovat tyramin u některých mikrokoků, ale jen v malé míře a za aerobních podmínek pod povrchem salámu. Gardini et al. (2002) prokázali degradaci histaminu v salámech díky použití startovací kultury S. xylosus, u tohoto kmene byla předtím potvrzena silná degradační aktivita in vitro. Aktivita aminooxidáz 76

je stimulována zvýšenými koncentracemi BA a v naší práci se projevila poklesem koncentrace BA na konci doby skladování (49. den) ve srovnání s koncem doby zrání (28. den). Dalším možným vysvětlením rozdílů mezi množstvím BA v salámech s odlišnými startovacími kulturami je jejich schopnost BA vytvářet. Schopnost syntetizovat BA je stejně jako schopnost BA degradovat specifická pro daný kmen a nejedná se o výhradně rodovou nebo druhovou záležitost (Herrero-Fresno et al., 2012). I když by startovací kultury měly být dekarboxyláza-negativní, schopnost tvořit BA byla prokázána u celé řady kmenů používaných jako startovací nebo probiotické kultury (Sládková a kol., 2007). Často se vyskytuje např. u kmenů S. xylosus, který patří mezi nejpoužívanější mikroorganismy ve startovacích kulturách (Even et al., 2010; Talon and Leroy, 2011). Dekarboxylační aktivita byla detekována i u kmenů rodu Pediococcus (Stadnik and Dolatowski, 2010). Z laktobacilů byla v práci autorů Bover-Cid et al. (2001) detekována schopnost produkce BA nejčastěji u L. curvatus – z 12 testovaných kmenů bylo 11 pozitivních na tvorbu tyraminu. Proto Stadnik and Dolatowski (2010) doporučují z hlediska prevence BA používat spíše L. sake než L. curvatus. Také v naší práci byla prokázána dekarboxylační aktivita u obou startovacích kultur. Třebaže výrobci deklarovali, že jejich produkty jsou negativní ohledně dekarboxyláz aminokyselin, u kmene L. curvatus, S. carnosus i Pediococcus pentosaceus byla prokázána schopnost tvořit tyramin, a to jak testováním v dekarboxylačním médiu, tak pomocí detekce metodou HPLC-UV a detekcí genu tyrosindekarboxylázy pomocí PCR. U kmenů s prokázanou produkcí biogenních aminů nelze tedy než doporučit při jejich použití důsledně kontrolovat koncentraci biogenních aminů ve finálním výrobku (Sládková a kol., 2007). Jako dalším důležitým faktorem ovlivňujícím koncentraci BA se na základě námi dosažených výsledků ukázala být použitá kořenící směs, což koresponduje s výsledky studií (Komprda et al., 2004; Komprda et al., 2009; Latorre-Moratalla et al., 2007). Kořenící směs určená pro salám Paprikáš statisticky významně snižovala obsah putrescinu a celkovou sumu BA. Nižší obsah BA u salámu Paprikáš ve srovnání se salámem Herkules byl zaznamenán i v práci autorů Komprda et al. (2004). Složení kořenící směsi Paprikáš bylo v obou pracích přibližně následující: červená paprika, 77

červená paprika oleoresin, pálivá paprika, černý pepř, isoaskorbát sodný, granulovaný česnek a v malém množství další esenciální oleje a oleoresiny (kmín, koriandr). Tyto látky se mohou vyznačovat antimikrobiální aktivitou, i když v práci Sládkové (2010) nebyly výsledky antimikrobiální aktivity testované in vitro pro žádnou ze složek významné. Přesné složení kořenící směsi pro salámy Herkules nebylo výrobcem poskytnuto, nicméně pro tento výrobek je typická podobná směs koření s výjimkou papriky (Kameník, 2011). Latorre-Moratalla et al. (2007) naopak prokázali nižší koncentrace BA v salámu Fuet (hlavní koření černý pepř) než v salámu s paprikou Chorizo (paprika, chilli, granulovaný česnek). Důvodem však mohla být zjištěná přítomnost biogenních aminů v paprice a česneku, zvláště tyraminu a putrescinu.

6.2 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH a aktivity vody v průběhu zrání Existuje mnoho studií zabývajících se zkoumáním jednoho působícího faktoru, ale je málo informací o kombinaci nebo vzájemné interakci těchto vlivů (Gardini et al., 2005). Z fyzikálně-chemických parametrů, které by mohly ovlivňovat obsah BA ve fermentovaných salámech, je posuzován zejména vliv pH a aw (Lorenzo et al., 2008). Klíčovým faktorem ovlivňujícím dekarboxylázovou aktivitu je pH, proto je též považováno za nejvýznamnější parametr ovlivňující tvorbu BA ve fermentovaných masných výrobcích. Již před více než 80 lety Koessler et al. (1928) vyslovili domněnku, že tvorba biogenních aminů je fyziologickou odpovědí na kyselé prostředí. Teodorovic et al. (1994) prokázali, že dekarboxylázy aminokyselin vykazují optimální aktivitu při pH 4,0 – 5,0. Kromě přímého vlivu na aktivaci dekarboxyláz a jejich aktivitu ovlivňuje pH tvorbu BA také nepřímo, a to svým vlivem na mikroflóru. Rychlé a prudké snížení pH během

fermentace

inhibuje

růst

některých

mikroorganismů

produkujících

dekarboxylázy, jako je čeleď Enterobacteriaceae (Bover-Cid et al., 2001). V naší práci došlo během prvních týdnů fermentace k poklesu pH z původní hodnoty přibližně 6,0 až na hodnotu přibližně 4,5. Během dalšího zrání a skladování zůstalo pH víceméně konstantní. Mezi salámy s probiotiky a kontrolou nebyly zjištěny 78

žádné průkazné rozdíly. Hodnoty pH se mírně lišily pouze mezi salámy jednotlivých výrobců a mezi použitými startovacími kulturami. Typ použité startovací kultury ovlivňoval pH salámů Herkules a Paprikáš i v práci autorů Komprda et al. (2004). Na druhou stranu probiotika mohou fungovat zároveň jako startovací kultura a snižovat svou činností hodnotu pH. Ruiz-Moyano et al. (2011) vyrobili salámy salchichón s přídavkem potenciálně probiotických kultur L. fermentum HL57 nebo P. acidilactici SP979 v množství 7,5 log KTJ·g-1. Tyto kmeny sloužily zároveň jako startovací kultura. Průměrná hodnota pH klesla u probiotických salámů během 7 dnů zrání z 6,25 na 5,7. Mimo pH se také aW jeví jako důležitý faktor tvorby biogenních aminů, protože jeho snížení potlačuje mikrobiální aktivitu a tudíž i tvorbu BA (Latorre-Moratalla et al., 2010a). Aktivita vody se v průběhu celého našeho pokusu snižovala až na úroveň 0,85 (kontrola), respektive 0,83 (probiotické salámy). Na základě námi dosažených výsledků lze konstatovat, že salámy s přídavkem probiotik vykazovaly ve srovnání s kontrolou prokazatelně nižší hodnoty aW již od 14. dne pokusu. Zatímco hodnoty pH a aW se v naší práci v průběhu zrání a skladování snižovaly, obsah BA naopak stoupal. Tento trend koresponduje s výsledky jiných prací. Ve studii autorů Lorenzo et al. (2008) týkající se tradičních španělských salámů hodnoty pH korelovaly s množstvím histaminu a spermidinu. Také byla prokázána negativní korelace mezi hodnotami aW a obsahem agmatinu, 2-fenylethylaminu a tyraminu. Podobně Sládková (2010) zjistila negativní korelaci mezi pH a obsahem tyraminu, 2fenylethylaminu a putrescinu, a dále negativní korelaci mezi aW a obsahem tyraminu.

6.3 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na sledované skupiny mikroorganismů Součástí předkládané práce byla i doplňková mikrobiologická analýza, zahrnující stanovení celkového počtu mikroorganismů, počtu bakterií mléčného kvašení a počtu enterokoků. Přídavek probiotik se nepromítl do celkového počtu mikroorganismů. Hodnoty CPM v prvních týdnech po vyrobení stouply z přibližně 6,6 log KTJ·g-1 o přibližně 1 79

logaritmický řád. Vrchol křivky časové závislosti celkového počtu mikroorganismů, kolem 7,7 log KTJ·g-1, byl zjištěn v salámech přibližně po třech týdnech po vyrobení. V dalším průběhu zrání a skladování CPM klesly až na hodnoty 6,82 – 6,92 log KTJ·g-1. Přídavek L. casei, který se řadí mezi bakterie mléčného kvašení, se částečně promítl do jejich celkového počtu. Počty BMK stoupaly během prvních tří týdnů po výrobě a následně

došlo

k pozvolnému

poklesu

podobně

jako

u celkového

počtu

mikroorganismů. Tento pokles byl zřejmě dán kombinací nízkého pH a snížením vodní aktivity pod přijatelnou mez vhodnou pro růst mikroorganismů (Koutsoumanis et al., 2010). Komprda et al. (2004) u salámů Herkules a Paprikáš neprokázali žádnou korelaci mezi počty mikroorganismů (CPM, bakterie mléčného kvašení, anaeroby, koliformní bakterie, kvasinky a plísně) a obsahem BA. V pozdější práci autorů Komprda et al. (2009) byla zjištěna korelace mezi počty mikroorganismů a obsahem sperminu a spermidinu, což však byla vzhledem k charakteru vzniku těchto látek, jak autoři sami přiznávají, patrně shoda okolností. V předkládané práci byla počáteční kontaminace salámů enterokoky poměrně vysoká, dosáhla úrovně přibližně 3,75 log KTJ·g-1. V průběhu zrání a skladování počty enterokoků významně klesly. Rozdíly mezi kontrolou a probiotickými salámy nebyly statisticky významné, nicméně salámy s přídavkem probiotického kmene L. casei BGP 93 vykazovaly nižší počty enterokoků (2,14 log KTJ·g-1 na konci skladování) než kontrola (2,64 log KTJ·g-1 na konci skladování). Částečné inhibice enterokoků bylo dosaženo ve srovnání s kontrolou i při použití kmene L. casei 431 (2,37 log KTJ·g-1 na konci skladování), jehož buněk bylo v salámech v celém průběhu zrání a skladování zhruba o 1 logaritmický řád méně než kmene L. casei BGP 93. I když byl patrný vliv probiotické kultury, snižování počtu enterokoků bylo z větší části dáno působením startovací kultury. Také v práci autorů Latorre-Moratalla et al. (2007) bylo prokázáno snížení enterokoků startovací kulturou L. sakei a S. xylosus v salámech španělského typu, a to z 2,48 log KTJ·g-1 na 2,14 log KTJ·g-1 (Fuet), a z 2,90 log KTJ·g-1 na 2,50 log KTJ·g-1 (Chorizo) za 21 dní. Při spontánní fermentaci se naopak počty enterokoků zvyšovaly. Možným vysvětlením potlačení enterokoků

80

startovací,

respektive

probiotickou

kulturou

jsou

vzájemné

vztahy

mezi

mikroorganismy, jako je kompetice o živiny a produkce bakteriocinů (Todorov, 2010). Enterokoky jsou považovány za nejčastější producenty tyraminu ve fermentovaných výrobcích (O’Brien et al., 2004). Potlačení enterokoků probiotickou kulturou v průběhu zrání a skladování však v předkládané práci nemělo patrně vliv na nižší koncentrace BA v těchto salámech, neboť přes počáteční poměrně vysoké počty enterokoků jejich počet v průběhu zrání a skladování klesal, zatímco koncentrace tyraminu a i jiných BA výrazně stoupala. Producenty tyraminu, jehož koncentrace na konci skladování dosahovala zdravotně rizikových hodnot (200 mg·kg-1), byly proto zřejmě jiné, více zastoupené skupiny mikroorganismů jako byly bakterie mléčného kvašení, včetně startovacích kultur.

6.4 Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci BA v celém průběhu zrání a skladování Výraznější snížení tvorby BA kmenem L. casei BGP 93 ve srovnání s kmenem L. casei 431 bylo v předkládané práci pravděpodobně dáno nižším počtem buněk kmene L. casei 431. Kmen L. casei 431 byl v naší studii po celou dobu zastoupen v přibližně o 1 logaritmický řád nižším množství než kmen L. casei BGP 93. Oba výrobci udávali shodnou koncentraci buněk v jejich preparátu. Nižší množství kmene L. casei 431 mohlo být zapříčiněno horší životaschopností této kultury či horším přizpůsobením tohoto kmene podmínkám ve fermentovaných salámech zkoumaného typu, ale i chybou při přídavku kultury do díla. Některé studie udávají slabé přežívání probiotik v prostředí fermentovaných masných výrobků (Fernández-Giné et al., 2005). V celém průběhu pokusu lze pozorovat pozvolný nárůst obou kmenů. Zatímco počty kmene L. casei 431 po celou dobu zrání a skladování nepřesáhly doporučené minimum 6 log KTJ·g-1, kmen L. casei BGP 93 dosáhl již 14. den počtu 6,45 log KTJ·g-1 a v průběhu dalšího zrání a skladování se počty držely na hodnotě 6,83 log KTJ·g-1. Terapeutické minimum vyjádřené jako množství probiotik v 1 gramu výrobku je vždy třeba určit podle velikosti běžné porce. Terapeutické minimum je nezbytné množství probiotik, které zaručí pozitivní účinky na lidský organismus. Většina autorů

81

uvádí jako nutný příjem minimální denní dávku 8 – 9 log buněk. Nicméně u některých kmenů bývají uváděna i větší množství, např. u L. rhamnosus DSM 6594 dávka 10 log buněk, u L. acidophilus NCFB 1748 dávka 11 log buněk a u L. rhamnosus GG dokonce dávka 12 log buněk (Bhadoria and Mahapatra, 2011). Podobný průběh změn v počtech probiotik zaznamenali i Ergönül and Kundakci (2011). Tito autoři použili Lactobacillus casei 431 jako startovací a probiotickou kulturu ve fermentovaném salámu. L. casei dobře přežíval ve výrobku a jeho počet stoupl ze 7,56 log KTJ·g-1 (po výrobě) na 8,18 log KTJ·g-1 (po 8 dnech zrání). Většina publikovaných studií také používá potenciálně probiotické kmeny, u nichž je ověřeno přežívání v trávicím traktu, adhezní schopnosti a podobné vlastnosti uváděné mezi požadavky pro probiotika. Neméně důležité je však prokázání prospěšných účinků na lidské zdraví, v kterémžto směru existuje jen málo klinických studií. Naopak námi použitý kmen L. casei 431, izolovaný ze stolice kojenců, je používán jako probiotikum v potravinách a potravinových doplňcích již od roku 1995. Jeho pozitivní účinky na lidské zdraví byly prokázány v mnoha studiích (Gaon et al., 2003; De Vrese et al., 2005; Rizzardini et al., 2011). Pokud jde o vliv probiotik na koncentrace biogenních aminů, v naší studii u většiny BA (vyjma sperminu a spermidinu) potlačil přídavek probiotické kultury jejich tvorbu. Největší rozdíly byly zaznamenány na konci doby zrání a na konci doby skladování, tedy v době, kdy je výrobek dostupný konzumentům. K výraznější inhibici tvorby BA došlo u salámů, ve kterých byl použit kmenem L. casei BGP 93. Významné snížení tvorby bylo prokázáno u tyraminu, kadaverinu a putrescinu, což se projevilo také snížením celkové sumy aminů. Studií týkajících se probiotických fermentovaných salámů není mnoho. Většina se zabývá pouze přežíváním probiotik v salámu v dostatečném množství, případně vlivem probiotik na patogenní mikroorganismy, ale jen minimum se zaměřuje na vliv probiotik na produkci biogenních aminů. Ve studii autorů Ergönül and Kundakci (2011) vykazovaly salámy s přídavkem probiotické kultury Lactobacillus casei 431, který jsme použili i v našem pokusu, po celou dobu zrání a následného skladování nízké koncentrace BA. Naopak Ruiz-Moyano et al. (2011) vyrobili fermentovaný trvanlivý salám španělského typu (salchichón) s pomocí potenciálně probiotické kultury 82

Pediococcus acidilactici SP979. Mezi kontrolou bez startovací kultury a salámy s L. fermentum nebo P. acidilactici nebyly prokázány statistické rozdíly v koncentraci BA na konci zrání výrobku (48 dní). Mechanismů, kterými probiotika snižují koncentrace BA, může být podobně jako u startovacích kultur celá řada. Asi nejpravděpodobnější je inhibice mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou (Cocconcelli and Fontana, 2010), i když výraznější snížení počtu sledovaných mikroorganismů v probiotických salámech bylo zaznamenáno jen u enterokoků. Další možností je schopnost degradovat BA, která byla u kmenů L. casei prokázána již ve víně (García-Ruiz et al., 2011) a u izolátů ze sýrů (Herrero-Fresno et al., 2012).

83

7 ZÁVĚR Obsah biogenních aminů (histaminu, tyraminu, 2-fenylethylaminu, kadaverinu a putrescinu) se v salámech v průběhu zrání a skladování zvyšoval, s výjimkou sperminu a spermidinu. Jak je patrno z regresních křivek, změny v koncentracích mají opačný průběh než u ostatních BA. U obou zkoumaných trvanlivých fermentovaných salámů s kořenící směsí typu Herkules a Paprikáš byly zaznamenány největší rozdíly v obsahu BA mezi použitými startovacími kulturami, kdy salámy s kulturou Pediococcus pentosaceus vykazovaly nižší

hladiny

BA

než

salámy

se směsnou

kulturou

Lactobacillus

curvatus

a Staphylococcus carnosus. Vzhledem k této skutečnosti a tomu, že u všech tří mikroorganismů byla potvrzena schopnost tvorby tyraminu, výsledky této práce potvrzují, že výběru startovací kultury, která se stává v salámech dominantní, je třeba věnovat velkou pozornost. Vliv ostatních sledovaných faktorů (výrobce, použitá kořenící směs) byl méně výrazný, i když u celkové sumy aminů byly zaznamenány průkazně nižší hodnoty u salámu s kořenící směsí typu Paprikáš než u salámu Herkules. Prokázali jsme, že přídavek probiotické kultury snížil obsah biogenních aminů v salámech s kořenící směsí typu Herkules a Paprikáš, a to zejména tří nejvíce zastoupených BA tyraminu, kadaverinu a putrescinu. Tento účinek byl patrný zejména na konci doby zrání a v průběhu skladování, kdy jsou salámy dostupné konzumentům. Vedle dalších blahodárných účinků použitých kmenů L. casei na lidské zdraví lze probiotické salámy tedy doporučit i z hlediska ochrany před toxickými účinky biogenních aminů, kdy lze upřednostnit salám s probiotickou kulturou před konzumací „konvenčního“ salámu. Mechanismus, jímž probiotika ovlivňují koncentrace BA v salámech, nebyl v této práci objasněn, neboť s výjimkou bakterií mléčného kvašení nebyl prokázán významný vliv probiotik na počty ostatních mikroorganismů v salámech, ani vliv na pH. Z výsledků předkládané práce dále plynou nižší hodnoty a w u salámu s probiotiky. Oba použité kmeny L. casei dobře přežívaly v prostředí typických českých fermentovaných salámů a jejich počet se v průběhu zrání a skladování mírně zvyšoval. Vzhledem k obecně doporučované dostatečné dávce pro probiotika 8 – 9 log a poměrně nízké porci 50 g, v jaké se salámy běžně konzumují, by bylo vhodné zvýšit přídavek 84

probiotické kultury do díla na množství minimálně 7 log buněk·g-1, aby bylo zaručeno přežívání probiotik v dostatečném množství v lidském střevě, kde působí. Zvýšení přídavku probiotik by však mělo být doprovázeno senzorickým hodnocením salámů, neboť by se mohlo negativně promítnout do jejich senzorického profilu vzhledem k fakultativně heterofermentativnímu metabolismu L. casei. Z hlediska možného negativního ovlivnění zdraví konzumentů biogenními aminy lze konstatovat, že již na konci zrání bylo dosaženo poměrně vysokých koncentrací tyraminu a putrescinu (nad 100 mg·kg-1), a to i u probiotických salámů. Vyšší přídavek probiotik v kombinaci s vhodnější startovací kulturou, či použití probiotické kultury zároveň jako kultury startovací, by mohl výrazněji snížit obsah BA v salámech. Z hlediska běžné porce však nelze očekávat ohrožení zdraví spotřebitelů konzumací námi analyzovaných salámů. Pro citlivé jedince např. léčené inhibitory aminooxidáz by však mohly být probiotické salámy bezpečnější alternativou.

85

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P., 1998: Základy buněčné biologie., 630 s. Andersen, L., 1998: Fermented dry sausages produced with the admixture of probiotic cultures. In: Proceedings of 44th IcoMST., s. 826-827. Arihara, K., Ota, H., Itoh, M., Kondo, Y., Sameshima, T., Yamanaka, H., 1998: Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria applied to meat fermentation. Journal of Food Science, vol. 63., s. 544-547. Aro Aro, J. M., Nyam-Osor, P., Tsuji, K., Shimada, K., Fukushima, M., Sekikawa, M., 2010: The effect of starter cultures on proteolytic changes and amino acid content in fermented sausages. Food Chemistry, vol. 119., s. 279-285. Bhadoria, P. B. S.and Mahapatra, S. C., 2011: Prospects, Technological Aspects and Limitations of Probiotics – A Worldwide Review. European Journal of Food Research & Review 1., s. 23-42 Bhardwaj, A., Gupta, H., Iyer, R., Kumar, N., Kumar Malik, R., 2009: Tyramineproducing enterococci are equally detected on tyramine production medium, by quantification of tyramine by HPLC, or by tdc gene-targeted PCR. Dairy Science and Technology, vol. 89., s. 601-611. Bhardwaj, A., Gupta, H., Kapila, S., Kaur, G., Vij, S., Maliket, R.K., 2010: Safety assessment and evaluation of probiotic potential of bacteriocinogenic Enterococcus faecium KH 24 strain under in vitro and in vivo conditions. International Journal of Food Microbiology, vol. 141., s. 156 – 164. Borchers, A.T., Keen, C.L., Gershwin, M.E., 2004: Probiotics and Prebiotics. In: Gershwin, M.E., Nestel, P., Keen, C.L. (Eds.) Handbook of Nutrition and Imunity., s. 213-242. Bover-Cid, S. & Holzapfel, W.H., 1999: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology

86

53., s. 33-41. Bover-Cid, S., Schoppen, S., Izquierdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C. 1999: Relationship between biogenic amine contents and the size of dry fermented sausages. Meat Science, vol. 51., s. 305-311. Bover-Cid, S., Hugas, M., Izquierdo-Pulido, M., & Vidal-Carou, M. C., 2000: Reduction of biogenic amine formation using a negative amino acid-decarboxylase starter culture for fermentation of fuet sausages. Journal of Food Protection, vol. 63., s. 237-243. Bover-Cid, S., Hugas, M., Izquierdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C. 2001: Amino acid-decarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages. International Journal of Food Microbiology, vol. 66., s. 185-189. Bover-Cid, S., Miguélez-Arrizado, M.J., Becker, B., Holzapfel, W.H., Carmen VidalCarou, M. 2008: Amino acid decarboxylation by Lactobacillus curvatus CTC273 affected by the pH and glucose availability. Food Microbiology, vol. 25., 269-277. Broll, H. 2010: Polymerase Chain Reaction. In: Popping, B., Diaz-Amigo, C., Hoenicke, K. (Eds.) Molecular Biological and Immunological Techniques and Applications for Food Chemists., s. 41-58. Burdichon, F., Casaregola, S., Farrokh, C., Frisvad, J.C., Gerds, M.L., Hammes, W.P., Harnett, J., Huys, G., Laulund, S., Ouwehand, A., Powell, I.B., Prajapati, J.B., Seto, Y., Schure, E.T., Van Boven, A., Vankerckhoven, V., Zgoda, A., Tuijtelaars, S., Hansen, E.B. 2012: Food fermentations: Microorganisms with technological beneficial use. International Journal of Food Microbiology, vol. 154., s. 87-97. Burdychová, R., Šulcerová, H. 2009: Application of probiotic L. casei in production of typical czech fermented sausages. Journal of International Research Publications: Materials, Methods & Technologies, vol. 3., s. 379-386. Cebrián, R., Baños, A., Valdivia, E., Pérez-Pulido, R., Martínez-Bueno, M., Maquedaet, M. 2012: Characterization of functional, safety, and probiotic properties of Enterococcus faecalis UGRA10, a new AS-48-producer strain. Food Microbiology, 87

vol. 30., s. 59-67. Cocconcelli, P.S., 2008: Starter Cultures: Bacteria. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of meat processing., s. 137-146. Cocconcelli, P.S., Fontana, C., 2010: Starter cultures for meat fermentation. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of meat processing., s. 199-218. Cocolin, L., Dolci, P., Rantsiou, K., 2008: Molecular methods for identification of microorganisms in traditional meat products. In: In: Toldrá, F. (Ed.) Meat Biotechnology., s. 91-127. Coton, E., Coton, M., 2005: Multiplex PCR for colony direct detection of Grampositive histamine- and tyramine-producing bacteria. Journal of Microbiological Methods, vol. 63., s. 296-304. Coton, E., Coton, M., 2009: Evidence of horizontal transfer as origin of strain to strain variation of the tyramine production trait in Lactobacillus brevis. Food Microbiology, vol. 26., s. 52-57. Čikoš, Š., Koppel, J., Kantíková, M., 2001: Polymerázová reťazová reakcia a jej použitie v biologickom výskume a diagnostike., 203 s. Dale, J.W., Von Schantz, M., Plant, N., 2012: From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology., 400 s. Danquah, A.O., Benjakul, S., Simpson, B.K., 2012: Biogenic Amines in Foods. In: Simpson, B.K. (Ed.) Food Biochemistry and Food Processing., s. 820-832. De las Rivas, B., Marcobal, A., Muñoz, R., 2005: Improved multiplex-PCR method for the simultaneous detection of food bacteria producing biogenic amines. FEMS Microbiology Letters, vol. 244., s. 367-372. De las Rivas, B., Marcobal., A., Carrascosa, A.V., Muñoz, R. 2006: PCR detection of foodborne bacteria producing the biogenic amines histamine, tyramine, putrescine, and cadaverine. Journal of Food Protection, vol. 69., s. 2509-2514.

88

De Mey, E., Drabik-Markiewicz, G., De Maere, H., Peeters, M.-C., Derdelinckx, G., Paelinck, H., Kowalska, T., 2012: Dabsyl derivatisation as an alternative for dansylation in the detection of biogenic amines in fermented meat products by reversed phase high performance liquid chromatography. Food Chemistry, vol. 130., s. 1017-1023. De Vrese et al., 2005: Probiotic bacteria stimulate virus-specific neutralizing antibodies following a booster polio vaccination. Eur.J.Nutr. 44., s. 406-413 De Vuyst, L., Falony, G., Leroy, F., 2008: Probiotics in fermented sausages. Meat Science, vol. 80., s. 75-78. Eerola, S., Roig-Sague´ s, A.X., Hirvi, T.K., 1998: Biogenic amines in Finnish dry sausages. Journal of Food Safety 18., s. 127-138. EFSA, 2011: Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed (2011 update). EFSA Journal, vol. 9., s. 12, 82 s. Ergönül, B. and Kundakçı A. 2011: Microbiological attributes and biogenic amine content of probiotic Turkish fermented sausage. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Volume 6, Number 1., s. 49-56 Erkkilä, S., Suihko, M.-L., Eerola, S., Petäjä, E., Mattila-Sandholm, T., 2001: Dry sausage fermented by Lactobacillus rhamnosus strains. International Journal of Food Microbiology, vol. 64., s. 205-210. Even, S., Leroy, S., Charlier, C., Zakour, N.B., Chacornac, J.-P., Lebert, I. Jamet, E., Desmonts, M.-H., Coton, E., Pochet, S., Donnio, P.-Y., Gautier, M., Talon, R., Le Loir, Y., 2010: Low occurrence of safety hazards in coagulase negative staphylococci isolated from fermented foodstuffs. International Journal of Food Microbiology, vol. 139., s. 87-95. FAO/WHO, 2001: Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria [cit. 2012-06-28]. Dostupné na: http://www.who.int/foodsafety/publications/fs_management/en/probiotics.pdf 89

Feiner, G., 2006: Meat products handbook: Practical science and technology., 648 s. Felis, G.E., Dellaglio, F., Torriani, S., 2009: Taxonomy of probiotic microorganisms. In: Charalampopoulos, D., Rastall, R.A. (Eds.) Prebiotics and Probiotics Science and Technology., s. 591-637. Fernández-Giné, J. M., Fernández-López, J., Sayas-Barberá, E., & Pérez-Alvarez, J. A., 2005: Meat products as functional foods: A review. Journal of Food Science, 70, s. 37-43. Flores, M., Toldrá, F., 2011: Microbial enzymatic activities for improved fermented meats. Trends in Food Science and Technology, vol. 22., s. 81-90. Fontana, C., Fadda, S., Cocconcelli, P.S., Vignolo, G., 2011: Lactic Acid Bacteria in Meat Fermentations. In: Lahtinen, S., Ouwehand, A. Salminen, S., Wright, A.V., (Eds.) Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects., s. 247-264. Franz, C.M.A.P., Huch, M., Abriouel, H., Holzapfel, W., Gálvez, A., 2011: Enterococci as probiotics and their implications in food safety. International Journal of Food Microbiology, vol. 151., s. 125-140. Gaon et al., 2003: Effect of Lactobacillus strains and Saccharomyces boulardii on persistent diarrhea in children. Medicina 63., s. 293-298 Garcia-Marino, M., Trigueros, A., Escribano-Bailon, T., 2010: Influence of oenological practices on the formation of biogenic amines in quality red wines. Journal of Food Composition and Analysis, vol. 23., s. 455-462. García-Ruiz, A., González-Rompinelli, E. M., Bartolomé, B., Moreno-Arribas, M. V., 2011: Potential of wine-associated lactic acid bacteria to degrade biogenic amines. Int. J. Food Microbiol. 148, s. 115-120. Gardini, F., Martuscelli, M., Caruso, M. C., Galgano, F., Crudele, M. A., Favati, F., Guerzoni, M. E., Suzzi, G., 2001: Effects of pH, temperature and NaCl concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of

90

Enterococcus faecalis. International Journal of Food Microbiology, 64., s. 105-117. Gardini, F., Martuscelli, M., Crudele, M.A., Paparella, A., Suzzi, G., 2002: Use of Staphylococcus xylosus as a starter culture in dried sausages: effect on the biogenic amine content. Meat Science 61., s. 275-281. Gardini, F., Zaccarelli A., Belletti N., Faustini F., Cavazza A., Martuscelli M., Mastrocola D., Suzzi G., 2005: Factors influencing biogenic amines production by a strain of Oenococcus oeni in a model system. Food Control, 16., s. 609-616. Gencellep, H., Kaban, G., & Kaya, M., 2007: Effects of starter cultures and nitrite levels on formation of biogenic amines in sucuk. Meat Science., 77, s. 424-430. González-Fernández, C., Santos, E.M., Jaime, I., Rovira, J., 2003: Influence of starter cultures and sugar concentrations on biogenic amine contents in chorizo dry sausage. Food Microbiol. 20, s. 275-284. Görner, F., Valík, L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín., 528 s. Gueimonde, M., Salminen, S. 2005: Microbiota of the intestine: Probiotics. In: Caballero, B. (Ed.) Encyclopedia of Human nutrition, Volume 3., s. 244-251. Hammes, W.P., Hertel, C., 2009: Genus I. Lactobacillus. In: Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W., Rainey, F.A., Schleifer, K.-H., Whitman, W.B. (Eds.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 3: The Firmicutes., s. 465-511. Hernández-Jover, T., Izquierdo-Pulido, M., Veciana-Nogue´ s, M. T., &Vidal-Carou, M. C., 1996: Ion-pair high-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in meat and meat products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, s. 2710-2715. Herrero-Fresno, A, Martínez N, Sánchez-Llan,a E, Díaz, M, Fernández, M, Martin MC, Ladero, V, Alvarez, MA., 2012: Lactobacillus casei strains isolated from cheese reduce biogenic amine accumulation in an experimental model. Int J Food Microbiol. 157, s. 297-304. 91

Huckle, B.D., Zhang, Z., : 2011: Maintenance and protection of probiotics. In: Liong, M.-T. (Ed.) Probiotics: Biology, Genetics and Health Aspects., s. 87-108. Hungerford, J.M., 2010: Scombroid poisoning: A review. Toxicon, vol. 56., s. 231-243. Champagne, C.P., Møllgaard, H., 2008: Production of Probiotic Cultures and Their Addition in Fermented Foods. In: Farnworth, E.R. (Ed.) Handbook of Fermented Functional Foods., s. 513-532. Chong, C. Y., Abu Bakar, F., Russly, A. R., Jamilah, B., Mahyudin, N. A., 2011: The effects of food processing on biogenic amines formation. International Food Research Journal, vol. 18, s. 867-876. Kalač, P., 2006: Biologically active polyamines in beef, pork and meat products: A review. Meat Science, vol. 73, s. 1-11. Kameník, J., Saláková, A., Bořilová, G., Pavlík, Z., Standarová, E., Steinhauser, L., 2012: Effect of Storage Temperature on the Quality of Dry Fermented Sausage Poličan. Czech J. Food Sci, vol. 30, s. 293-301. Kameník, J., 2011: Trvanlivé masné výrobky., 248 s. Kameník, J., Budig, J., 2010: Produkce trvanlivých fermentovaných salámů v Evropě. Potravinářská revue, 2010, č. 4, s. 9-15. Karovičová, J., Kohajdová, Z., 2005: Biogenic Amines in Food. Chemical Papers, vol. 59, s. 70-79. Kayser, F.H., 2003: Safety aspects of enterococci from the medical point of view. International Journal of Food Microbiology, vol. 88, s. 255-262. Khan, M.I., Arshad, M.S., Anjum, F.M., Sameen, A., Rehman, A., Gill, W.T., 2011: Meat as a functional food with special reference to probiotic sausages. Food Research International, vol. 44, s. 3125-3133. Klingberg, T.D., Axelsson, L., Naterstad, K., Elsser, D., Budde, B.B., 2005: 92

Identification of potential probiotic starter cultures for Scandinavian-type fermented sausages. International Journal of Food Microbiology, vol. 105, s. 419-431. Koessler, K.K., Hanke, M.T., Sheppard, M.S., 1928: Production of histamine, tyramine, brochospastic and arteriospastic substance in blood broth by pure cultures of microorganisms. Journal of Infectious Diseases 3, s. 363-377. Komprda, T., Neznalova, J., Standara, S., Bover-Cid, S., 2001: Effect of starter culture and storage temperature on the content of biogenic amines in dry fermented sausage polican. Meat Science 59, s. 267-272. Komprda, T., Smělá, D., Pechová, P., Kalhotka, L., Štencl, J. and Klejdus, B., 2004: Effect of starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausages. Meat Sci. 67, s. 607-616 Komprda, T., Sládková, P., Dohnal, V., 2009: Biogenic amine content in dry fermented sausages as influenced by a producer,spice mix, starter culture, sausage diameter and time of ripening. Meat Science, vol. 83, s. 534–542. Komprda, T., Dohnal, V. 2010: Amines. In: Nollet, L.M.L., Toldrá, F. Handbook of Dairy Foods Analysis., s. 865-882. Koutsoumanis, K., Tassou, C., Nychas, G.-J.E., 2010: Biogenic Amines in Foods. In: Juneja, V.K., Sofos, J.N.(Eds.) Pathogens and Toxins in Foods: Challenges and Interventions., s. 248-274. Kozová, M., P. Kalač, P., Pelikánová, T., 2008: Changes in the content of biologically active polyamines during beef loin storage and cooking. Meat Science 81, s. 607-611 Kröckel, L., 2006: Einsatz probiotischer Bakterien bei Fleischerzeugnissen, Mitteilungsblatt der Fleischforschung, s. 45, 173, 163-172. Ladero, V., Fernández, M., Calles-Enríquez, M., Sánchez-Llana, E., Cañedo, E., Cruz Martín, M., Alvarez, M.A., 2012: Is the production of the biogenic amines tyramine and putrescine a species-level trait in enterococci? Food Microbiology, vol. 30, s.

93

132-138. Landete, J.M., De las Rivas, B., Marcobal, A., Muñoz, R., 2007: Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods. International Journal of Food Microbiology, vol. 117, s. 258-269. Landete, J.M., De las Rivas, B., Marcobal, A., Muñoz, R., 2008: Updated molecular knowledge about histamine biosynthesis by bacteria. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 48, s. 697-714. Larqué, E., Sabater-Molina, M., Zamora, S., 2007: Biological significance of dietary polyamines. Nutrition, vol. 23, s. 87-95. Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., Aymerich, B.M., Vidal-Carou, M.C., 2007: Aminogenesis control in fermented sausages manufactured with pressurized meat batter and starter culture. Meat Sci. 75: s. 460-469. Latorre-Moratalla, M.L., Veciana-Nogués, T., Bover-Cid, S., Garriga, M., Aymerich, T., Zanardi, E., Ianieri, A., Fraqueza, M.J., Patarata, L., Drosinos, E.H., Lauková, A., Talon, R., Vidal-Carou, M.C., 2008: Biogenic amines in traditional fermented sausages produced in selected European countries. Food Chemistry, vol. 107, s. 912-921. Latorre-Moratalla, M.L., Bosch-Fusté, J., Lavizzari, T., Bover-Cid, S., VecianaNogués, M.T., Vidal-Carou, M.C., 2009: Validation of an ultra high pressure liquid chromatographic method for the determination of biologically active amines in food. Journal of Chromatography A, vol. 1216, s. 7715-7720. Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., Talon, R., Garriga, M., Zanardi, E., Ianieri, A., Fraqueza, M.J., Elias, M., Drosinos, E.H., Vidal-Carou, M.C., 2010a: Strategies to reduce biogenic amine accumulation in traditional sausage manufacturing. LWT – Food Science and Technology, vol. 43, s. 20-25. Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., Vidal-Carou, M.C., 2010b: Technological conditions influence aminogenesis during spontaneous sausage fermentation. Meat Science, vol. 85, s. 537-541.

94

Latorre-Moratalla, M.L., Bosch-Fusté, J., Bover-Cid, S., Aymerich, T., Vidal-Carou, M.C., 2011: Contribution of enterococci to the volatile profile of slightly-fermented sausages. LWT – Food Science and Technology, vol. 44, s. 145-152. Lee, Y.K., Salminen, S., 2009: Handbook of Probiotics and Prebiotics., 596 s. Leroy, F., De Vuyst, L., 2008: Fermentation and acidification ingredients. In: Tarté, R. Ingredients in Meat Products: Properties, Functionality and Applications., s. 227-252. Leuschner, R.G.K., Hammes, W.P., 1998: Tyramine degradation by micrococci during ripening of fermented sausages. Meat Science 49, s. 289-296. Lorenzo, J. M., Martínez, S., Franco, I., & Carballo, J., 2008: Biogenic amine contents inrelation to physico-chemical parameters and microbial counts in two kinds of Spanish traditional sausages. Archiv für Lebensmittelhygiene, 59, s. 70-75. Lorenzo, J.M., Cachaldora, A., Fonseca, S., Gómez, M., Franco, I., Carballo, J., 2010: Production of biogenic amines “in vitro” in relation to the growth phase by Enterobacteriaceae species isolated from traditional sausages. Meat Science, vol. 86, s. 684-691. Lu, S., Xu, X., Zhou, G., Zhu, Z., Meng, Y., Sun, Y., 2010: Effect of starter cultures on microbial ecosystem and biogenic amines in fermented sausage. Food Control, vol. 21, s. 444-449. Lücke, F.K., 2003: Fermented Meat Products. In: Caballero, B. (Ed.) Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition., s. 2338-2344. Makras, L., Avonts, L., De Vuyst, L., 2004: Probiotics, prebiotics, and gut health. In: Remacle, C., Reusens, B. (Eds.) Functional foods: Ageing and degenerative disease. Woodhead Publishing, Cambridge, s. 416-482. Marcobal, A., De las Rivas, B., Moreno-Arribas, M.V., Muñoz, R., 2005: Multiplex PCR method for the simultaneous detection of histamine-, tyramine-, and putrescineproducing lactic acid bacteria in foods. Journal of Food Protection, vol. 68, s.

95

874-878. Marianski, S., Marianski, A., 2009: The Art of Making Fermented Sausages., 274 s. Martín, B., Garriga, M., Hugas, M., Bover-Cid, S., Veciana-Nogués, M.T., Aymerich, T., 2006: Molecular, technological and safety characterization of Grampositive catalase-positive cocci from slightly fermented sausages. International Journal of Food Microbiology 107, s. 148-158. Miguélez-Arrizado, M. J., Bover-Cid, S., Latorre-Moratalla, M. L., & Vidal-Carou, M. C., 2006: Biogenic amines in Spanish fermented sausages as a function of diameter and artisanal or industrial origin. Journal of the Science of Food and Agriculture 86, s. 549-557. Muller, J.A., Ross, R.P., Fitzgerald, G.F., Stanton, C., 2009: Manufacture of Probiotic Bacteria. In: Charalampopoulos, D., Rastall, R.A. (Eds.) Prebiotics and Probiotics Science and Technology., s. 725-760. Muthukumarasamy, P., Holley, R.A., 2007: Survival of Escherichia coli O157:H7 in dry fermented sausages containing micro-encapsulated probiotic lactic acid bacteria. Food Microbiology, vol. 24, s. 82-88. Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Úřední věstník, L 338, 22.12.2005, 1 s. Nayak, S.K., 2011: Biology of Eukaryotic Probiotics. In: Liong, M.-T. (Ed.) Probiotics: Biology, Genetics and Health Aspects., s. 29-57. Nowak, A., Czyzowska, A., 2011: In vitro synthesis of biogenic amines by Brochothrix thermosphacta isolates from meat and meat products and the influence of other microorganisms. Meat Science 88, s. 571-574 Nueno-Palop, C., Narbad, A., 2011: Probiotic assessment of Enterococcus faecalis CP58 isolated from human gut. International Journal of Food Microbiology, vol. 145, s. 390-394. O’Brien, N.M., O’Connor, T.P., O’Callaghan, J.O., Dobson, A.D.W., 2004: Toxins in 96

cheese., s. 561-571 Ogier, J.-C., Serror, P., 2008: Safety assessment of dairy microorganisms: The Enterococcus genus. International Journal of Food Microbiology, vol. 126, s. 291-301. Ozdestan, O., Uren, A., 2010: Biogenic amine content of kefir: A fermented dairy product. European Food Research and Technology, vol. 231, s. 101-107. Patrinos, G.P., Ansorge, W., 2010: Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. In: Patrinos, G.P., Ansorge, W. (Eds.) Molecular Diagnostics., s. 1-12. Pessione, E., Pessione, A., Lamberti, C., Coïsson, D. J., Riedel, K., Mazzoli, R., Bonetta, S., Eberl, L., Giunta, C., 2009: First evidence of a membrane-bound, tyramine and b-phenylethylamine producing, tyrosine decarboxylase in Enterococcus faecalis: A two-dimensional electrophoresis proteomic study. Proteomics, vol. 9, s. 2695-2710. Pidcock, K., Heard, G.M., Henriksson, A., 2002: Application of nontraditional meat starter cultures in production of Hungarian salami. International Journal of Food Microbiology, vol. 76, s. 75-81. Rauscher-Gabernig, E., Grossgut, R., Bauer, F., Paulsen, P., 2009: Assessment of alimentary histamine exposure of consumers in Austria and development of tolerable levels in typical foods. Food Control, vol. 20, s. 423-429. Reis, J.A., Paula, A.T., Casarotti, S.N., Penna, A.L.B., 2012: Lactic Acid Bacteria Antimicrobial Compounds: Characteristics and Applications. Food Engineering Reviews, vol. 4, s. 124-140. Resch, M., Nagel, V., Hertel, C., 2008: Antibiotic resistance of coagulase-negative staphylococci associated with food and used in starter cultures. International Journal of Food Microbiology, vol. 127, s. 99-104. Rizzardini et al., 2011: Evaluation of the immune benefits of two probiotic strains Bifidobacterium animalis ssp. lactis, BB-12(R) and Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, L. casei 431(R) in an influenza vaccination model: a randomised, double-

97

blind, placebo-controlled study. Br.J.Nutr., s. 1-9 Ruiz-Capillas, C., Herrero, A.M., Jimenez-Colmenero, F., 2011: Reduction of biogenic amine levels in meat and meat products. In: Rai, M., Chikindas, M. (Eds.) Natural Antimicrobials in Food Safety and Quality., s. 154-166. Ruiz-Moyano, S., Martín, A., Benito, M.J., Hernández, A., Casquete, R., Córdoba, M., 2011: Application of Lactobacillus fermentum HL57 and Pediococcus acidilactici SP979 as potential probiotics in the manufacture of traditional Iberian dry-fermented sausages. Food Microbiology, vol. 28, s. 839-847. Ruiz, J., 2007: Ingredients. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of Fermented Meat and Poultry., s. 59-76. Sambrook, J., Russell, D.W., 2001: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2344 s. Sameshima, T., Magome, C., Takeshita, K., Arihara, K., Itoh, M., Kondo, Y., 1998: Effect of intestinal Lactobacillus starter cultures on the behaviour of Staphylococcus aureus in fermented sausage. International Journal of Food Microbiology, vol. 41, s. 1-7. Seitter, M., Geng, B., Hertel, C., 2011: Binding to extracellular matrix proteins and formation of biogenic amines by food-associated coagulase-negative staphylococci. International Journal of Food Microbiology, vol. 145, s. 483-487. Shalaby, A. R., 1996: Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Research International, vol. 29, s. 675-690. Silla-Santos, M. H., 1996: Biogenic amines: their importance in foods. In International Journal of Food Microbiology, 29, s. 213-231. Sládková, P., Komprda,

T., Burdychová,

R.,

2007: Skríning startovacích

a probiotických kultur určených pro výrobu fermentovaných masných výrobků na schopnost tvorby biogenních aminů. In MendelNet'07 Agro., 96 s. Sládková, P., 2010: Molekulární a biologické aspekty tvorby biogenních aminů ve 98

fermentovaných masných výrobcích. Disertační práce ( in MS, dep. knihovna MENDELU v Brně), MZLU v Brně, Brno, 138 s. Smělá, D., Pechová, P., Komprda, T., Klejdus, P., Kubáň, V., 2004: Chromatografické stanovení biogenních aminů v trvanlivých salámech během fermentace a skladování. Chemické listy, vol. 98, s. 432-437. Spano, G., Russo, P., Lonvaud-Funel, A., Lucas, P., Alexandre, H., Grandvalet, C., Coton, E., Coton, M., Barnavon, L., Bach, B., Rattray, F., Bunte, A., Magni, C., Ladero, V., Alvarez, M., Fernandez, M., Lopez, P., de Palencia, P.F., Corbi, A., Trip, H., Lolkema, J.S., 2010: Biogenic amines in fermented foods. European Journal of Clinical Nutrition, vol. 64, suppl. 3, s. 95-100. Sparo, M., Nuñez, G.G., Castro, M., Calcagno, M.L., García Allende, M.A., Ceci, M., Najle, R., Manghi, M., 2008: Characteristics of an environmental strain, Enterococcus faecalis CECT7121, and its effects as additive on craft dry-fermented sausages. Food Microbiology, vol. 25, s. 607-615. Stadnik, J., Dolatowski, Z.J., 2010: Biogenic amines in meat and fermented meat products. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 9, s. 251-263. Standara et al., 1994: Proceedings of ICOMST – citace v článku Kameník, Bořilová, Saláková 2012 Standarová, E., Borkovcová, I., Vorlová, L. 2008: Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě. Veterinářství, vol. 58, s. 735-739. Suzzi, G., Gardini, F., 2003: Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. International Journal of Food Microbiology, vol. 88, s. 41-54. Španová, A., Rittich, B., Kšicová, K., Dráb V., 2009: Identifikace bakterií mléčného kvašení (významných v mlékárenském průmyslu) pomocí polymerasové řetězové reakce. Mlékařské listy 116, s. 12-16. Talon, R, Leroy, S., 2011: Diversity and safety hazards of bacteria involved in meat

99

fermentations. Meat Science, vol. 89, s. 303-309. Talon, R., Leroy, S., Lebert, I., Giammarinaro, P., Chacornac, J.-P., Latorre-Moratalla, M.L., Vidal-Carou, C., Zanardi, E., Conter, M., Lebecque, A., 2008: Safety improvement and preservation of typical sensory qualities of traditional dry fermented sausages using autochthonous starter cultures. International Journal of Food Microbiology, vol. 126, s. 227-234. Teodorovic, V., S. Buncic, and D. Smiljanic., 1994: A study of factors influencing histamine production in meat. Fleisch-wirtschaft 74 s. 170-172. Todorov, S.D., 2010:. Diversity of bacteriocinogenic lactic acid bacteria isolated from boza, a cereal-based fermented beverage from Bulgaria. Food Control. 21, s. 1011-1021. Toldrá, F., 2004: Meat: Fermented meats. In: Smith, J.S., Hui, Y.H. (Eds.) Food Processing: Principles and Applications., s. 399-416. Toldrá, F., Nip, W.-K., Hui, Y.H., 2007: Dry-fermented Sausages: An Overview. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of Fermented Meat and Poultry., s. 321-326. Toldrá, F., 2008: Biotechnology of flavor generation in fermented meats. In: Toldrá, F. (Ed.) Meat Biotechnology., s. 199-216. Toldrá, F., Reig, M., 2011: Innovations for healthier processed meats. Trends in Food Science & Technology, vol. 22, s. 517-522. Työppönen, S., Petäjä, E., Mattila-Sandholm, T., 2003: Bioprotectives and probiotics for dry sausages. International Journal of Food Microbiology., vol. 83, s. 233-244. Vidal-Caroua, M.C., Veciana-Nogués, M.T., Latorre-Moratala,M.L., Bover-Cid, S., 2007: Biogenic amines: Risks and control. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of Fermented Meat and Poultry., s. 455-468. Vidal-Caroub, M.C., Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., 2009: Biogenic Amines. In: Nollet, L.M.L., Toldrá, F. Handbook of Processed Meats and Poultry Analysis., s.

100

665-686. Vidal-Carouc, M.C., Latorre-Moratalla, M.L., Bover-Cid, S., 2011: Biogenic amines. In: Nollet, L.M.L., Toldrá, F. (Eds.) Safety Analysis of Foods of Animal Origin., s. 399-420. Vignolo, G., Fontana, C., Fadda, S., 2010: Semidry and dry fermented sausages. In: Toldrá, F. (Ed.) Handbook of meat processing., s. 379-398. Votava, M., 2003: Lékařská mikrobiologie speciální., s. 136-137. Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 326/2001 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), g), h), i) a j) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů, pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich. Sbírka zákonů ČR, částka 126/2001, s. 7414. Zell, C., Resch, M., Rosenstein, R., Albrecht, T., Hertel, C., Götzel, F., 2008: Characterization of toxin production of coagulase-negative staphylococci isolated from food and starter cultures. International Journal of Food Microbiology, vol. 127, s. 246-251.

101

PŘÍLOHY

SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Růstové vlastnosti různých mikroorganismů podílejících se na fermentaci masa (Marianski and Marianski, 2009)...........................................................................16 Tabulka 2: Pozitivní účinky probiotik na zdraví (De Vuyst et al., 2008)........................20 Tabulka 3: Příklady kmenů, které jsou komerčně využívány jako probiotika (De Vuyst et al., 2008)......................................................................................................................21 Tabulka 4: Druhy rodu Lactobacillus využívané jako probiotika (Hammes and Hertel, 2009)................................................................................................................................22 Tabulka 5: Mikroorganismy produkující biogenní aminy (Vidal-Carou et al., 2007)....32

SEZNAM ILUSTRACÍ Obrázek 1: Schéma polymerázové řetězové reakce (Alberts et al., 1998)......................28 Obrázek 2: Chemická struktura biogenních aminů (A: histamin, B: tyramin, C: fenylethylamin, D: tryptamin, E: putrescin, F: kadaverin, G: spermidin, H: spermin, I: agmatin) (Koutsoumanis et al., 2010).............................................................................29 Obrázek 3: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................49 Obrázek 4: Vliv vybraných faktorů na koncentraci histaminu na konci doby skladování (49. den)...........................................................................................................................50 Obrázek 5: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................51 Obrázek 6: Vliv vybraných faktorů na koncentraci tyraminu na konci doby skladování (49. den)...........................................................................................................................52 Obrázek 7: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................53 Obrázek 8: Vliv vybraných faktorů na koncentraci 2-fenylethylaminu na konci doby skladování (49. den)........................................................................................................53 Obrázek 9: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................54 Obrázek 10: Vliv vybraných faktorů na koncentraci kadaverinu na konci doby skladování (49. den)........................................................................................................55 Obrázek 11: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................56 Obrázek 12: Vliv vybraných faktorů na koncentraci putrescinu na konci doby skladování (49. den)........................................................................................................56 Obrázek 13: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................57 Obrázek 14: Vliv vybraných faktorů na koncentraci sperminu na konci doby skladování (49. den)...........................................................................................................................58 Obrázek 15: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby zrání (28. den)..................................................................................................................................59 Obrázek 16: Vliv vybraných faktorů na koncentraci spermidinu na konci doby skladování (49. den)........................................................................................................59 Obrázek 17: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (28. den)..........................................................................................60 Obrázek 18: Vliv vybraných faktorů na celkovou sumu sledovaných biogenních aminů na konci doby zrání (49. den)..........................................................................................61 Obrázek 19: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci histaminu v průběhu zrání................................................................................................................63 Obrázek 20: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci tyraminu v průběhu zrání................................................................................................................63 Obrázek 21: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci 2fenylethylaminu v průběhu zrání.....................................................................................64 Obrázek 22: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci kadaverinu v průběhu zrání................................................................................................................64 Obrázek 23: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci putrescinu v průběhu zrání................................................................................................................65 Obrázek 24: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci sperminu v průběhu zrání................................................................................................................65

Obrázek 25: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na koncentraci spermidinu v průběhu zrání................................................................................................................66 Obrázek 26: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na celkovou sumu všech sledovaných biogenních aminů v průběhu zrání.............................................................66 Obrázek 27: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty pH v průběhu zrání.................................................................................................................................67 Obrázek 28: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na hodnoty aktivity vody v průběhu zrání................................................................................................................68 Obrázek 29: Počty probiotických kmenů L. casei v průběhu zrání.................................68 Obrázek 30: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktu specifického pro L. casei (132 bp)............................................................................................................................69 Obrázek 31: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na celkový počet mikroorganismů v průběhu zrání.....................................................................................70 Obrázek 32: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na počty bakterií mléčného kvašení v průběhu zrání...................................................................................................71 Obrázek 33: Vliv přídavku probiotických kmenů L. casei na počty enterokoků v průběhu zrání................................................................................................................71

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ACN

acetonitril

aw

aktivita vody

B.

Bifidobacterium

BA

biogenní aminy

BMK

bakterie mléčného kvašení

CFU

kolonie tvořících jednotek

CPM

celkový počet mikroorganismů

ČSN

česká technická norma

DAO

diaminoooxidáza

DCM

dekarboxylační médium

DNA

deoxyribonukleová kyselina

dNTP

deoxynukleosidtrifosfát

E.

Enterococcus

EDTA

kyselina ethylendiamintetraoctová

EFSA

Evropský úřad pro bezpečnost potravin

et al.

a jiní

GdL

glukono-deltalakton

h.

hodina

hdc

histidin dekarboxyláza

HMT

histidinmethyltransferáza

HPLC

vysokouúčinná kapalinová chromatografie

KEAA

agar s kanamycinem, eskulinem a azidem sodným

kol.

kolektiv

KTJ

kolonie tvořících jednotek

L.

Lactobacillus

ldc

lysin dekarboxyláza

log

dekadický logaritmus

MAO

monoaminooxidáza

min.

minuta

MRS

agar podle DeMana, Rogosiho a Sharpeho

např.

například

odc

ornithin dekarboxyláza

ot.

otáčky

P.

Pediococcus

PCR

polymerázová řetězová reakce

příp.

případně

QPS

bezpečné pro použití v potravinách

S.

Staphylococcus

s.

sekunda

Sb.

Sbírka

spp.

subspecies

TBE

tris-edta-borátový

TCA

kyselina trichloroctová

tdc

tyramin dekarboxyláza

tj.

to je

tzv.

tak zvané

UV/VIS

ultrafialové záření/viditelné záření

WHO

Světová zdravotnická organizace

ANOTACE Obsah biogenních aminů (BA) ve fermentovaných masných výrobcích může být ovlivněn celou řadou faktorů. Cílem této práce bylo vyhodnocení vlivu rozdílného výrobce, použité kořenící směsi, startovací kultury a zvláště probiotické kultury na obsah BA a doplňkové fyzikálně-chemické a mikrobiologické ukazatele v průběhu zrání (do 28. dne po naražení) a skladování při 15 °C (do 49. dne po naražení). Salámy byly vyrobené ve dvou výrobních závodech a s použitím dvou různých kořenících směsí (H: Herkules, P: Paprikáš). Od každého typu výrobku byly vyrobeny čtyři várky, každá s jinou kombinací startovací (C: Pediococcus pentosaceus, F: Lactobacillus curvatus + Staphylococcus carnosus) a probiotické kultury (Lactobacillus casei BGP 93 a Lactobacillus casei 431). Odběr vzorků probíhal 0., 14., 28. a 49. den po naražení. S výjimkou sperminu a spermidinu obsah BA stanovovaných metodou HPLC-UV v průběhu zrání a skladování stoupal. Nejvyšších hodnot dosáhl na konci skladování tyramin, putrescin a kadaverin. U těchto tří BA byly také prokázány statisticky významně (P < 0,05) nižší koncentrace v salámech s L.casei BGP 93 (139, 119 a 26 mg·kg-1) a L. casei 431 (173, 123 a 27 mg·kg-1) než u kontroly (240, 155 a 42 mg·kg-1). V celkové sumě aminů nebyly mezi salámy různých výrobců zaznamenány statisticky významné rozdíly, nicméně salámy s kořením P vykazovaly na konci skladování nižší koncentrace než salámy s kořením H (P < 0,05) a salámy se startovací kulturou C nižší koncentrace než salámy s kulturou F (P < 0,05). U všech salámů došlo v prvních týdnech fermentace k typickému poklesu pH z přibližně 6,0 až na průměrnou hodnotu 4,5. Hodnoty a w klesaly rychleji u probiotických salámů než u kontroly (P < 0,05). Přídavek probiotik se částečně promítl do počtu bakterií mléčného kvašení. K významnému ovlivnění celkového počtu mikroorganismů ani počtu enterokoků však nedošlo. Kmen L. casei BGP 93 vykazoval větší vliv na koncentrace BA v salámech než kmen L. casei 431, což bylo zřejmě dáno vyšším počátečním množstvím kmene BGP 93 (5,62 log KTJ·g-1) než kmene 431 (4,62 log KTJ·g-1). Oba kmeny L. casei dobře přežívaly ve zkoumaných salámech a jejich počty se v průběhu zrání a skladování zvýšily až na 6,83, respektive 5,83 log KTJ·g-1. Z hlediska pozitivních účinků na lidský

organismus by bylo vhodné množství probiotik v salámech zvýšit alespoň o 1 logaritmický řád. Prokázali jsme, že přídavek probiotické kultury snížil obsah biogenních aminů v trvanlivých fermentovaných salámech. Tento účinek byl patrný zejména na konci zrání a v průběhu skladování. Vyšší přídavek probiotik v kombinaci s vhodnější startovací kulturou (neprodukující BA) či použití probiotické kultury zároveň jako kultury startovací by mohl výrazněji snížit obsah BA v salámech.