Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Mikrobiologická jakost průmyslového tvarohu Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
MVDr. Olga Cwiková
Navrátilová Zuzana Brno 2009
1
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikrobiologická jakost průmyslového tvarohu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne Podpis studenta
2
PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat MVDr. Olze Cwikové za metodické vedení při zpracování diplomové práce, za cenné rady a připomínky a za její podporu. Dále bych chtěla poděkovat MVDr. Jarmile Ondruškové za umožnění vykování diplomové praxe a získání potřebných výsledků pro diplomovou práci. Dále za její ochotu a pomoc při jejich získávání.
Zuzana Navrátilová
3
ABSTRAKT Cílem předložené diplomové práce bylo posoudit vliv výrobce a ročního období na počet vybraných skupin mikroorganizmů v průmyslovém tvarohu. Analyzovány byly vzorky průmyslového tvarohu od 8 různých výrobců v průběhu jednoho roku. U každého vzorku byl z mikrobiologických ukazatelů sledován počet kvasinek a plísní, Geotrichum candidum, počet jiných plísní, koagulázo-pozitivních Stafylokoků, bakterií rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, koliformních baktérií, mezofilních aerobních a anaerobních bakterií, Escherichia coli a Bacillus cereus. Bakterie rodu Salmonela, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus a koagulázo-pozitivní Stafylokoky nebyly v žádném vzorku prokázány. U kvasinek a plísní, Geotrichum candidum, koliformních bakterií a mezofilních aerobních i anaerobních bakteriích zjištěný počet nepřesahoval limit daný normou výrobce. Klíčová slova: průmyslový tvaroh, stanovení mikroorganizmů, vnější faktory ovlivňující počet mikroorganizmů
4
ABSTRACT The target of this presented diploma work was to explore the producer´s and the season´s influences on the quantity of microorganisms contained in the industrial curd. Samples of industrial curd has been analysed from 8 different producers.
From microbiology indicators on every sample was monitored quantity and occurrences of leavens and fungi, coagulation-positive Staphylococcus, filiations of Salmonea, Listeria monocytogenes, Geotrichum candidum, coli bacteria, mezophyll aerobe and anaeroble bacteria’s, Escherichia coli and Bacillus cereus. Bacteria of Salmonela, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus, coagulation-positive Staphylococcus was no inside it any specimen positive. Near leavens and gungi, coli bacteria, mezophyll aerobe and anaeroble bacteria’s ascentrained numer threshold laid standart producer. Used key words: Industrial curd, microorganism´s assignment, outside factors influences the quantity of microorganisms
5
Obsah 1 ÚVOD
11
2 CÍL PRÁCE
12
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
12
3.1 Základní pojmy a definice
13
3.2 Mléko jako základní surovina k výrobě tvarohu
13
3.2.1 Základní úpravy mléka před výrobou tvarohu
14
3.3 Čisté mlékařské kultury
14
3.4 Vlastnosti gelů pro výrobu tvarohu
15
3.5 Výroba průmyslového tvarohu
17
3.5.1 Kyselé srážení
17
3.5.2 Dvoutepelný způsob výroby
18
3.5.3 Jednotepelný způsob výroby
19
3.5.4 Termofilní způsob výroby
20
3.5.5 Kontinuální výroba průmyslového tvarohu
21
3.6 Biochemické změny při výrobě
23
3.7 Syrovátka
24
3.8 Zařazení tvarohu do skupiny kyselých sýrů
24
3.8.1 Kyselé a tvarohové sýry
25
3.9 Mikrobiální ukazatele průmyslového tvarohu
26
3.9.1 Fakulativně anaerobní G+ tyčinky
26
3.9.2 Fakuktativně anaerobní sporulující G+ tyčinky
27
3.9.3 Aerobní nebo fakultativně anaerobní G+ sporulující tyčinky
28
3.9.4 Fakultativně anaerobní koky
28
6
3.9.5 Kvasinky a plísně
28
3.9.6 Bakterie slizového mazu
29
3.9.7 Indikátorové bakterie
29
4 MATERIÁL A METODY
31
4.1 Materiál
31
4.2 Metody
31
4.2.1 Stanovení počtu koliformních bakterií
31
4.2.2 Průkaz bakterií rodu Salmonella
34
4.2.3 Stanovení počtu Bacillus cereus
34
4.2.4 Stanovení počtu Staphylococcus aureus
35
4.2.5 Stanovení počtu Escherichia coli
35
4.2.6 Průkaz přítomnosti Listeria monocytogenes
36
4.2.7 Stanovení kvasinek a plísní
38
4.2.8 Stanovení mezofilních sporotvorných mikroorganizmů
39
4.3 Statistické vyjádření výsledků
40
5 VÝSLEDKY A DISKUZE
40
5.1 Vliv výrobce na počet a výskyt sledovaných mikroorganizmů
41
5.1.1 Vliv výrobce na počet kvasinek
41
5.1.2 Vliv výrobce na počet Geotrichum cadidum
42
5.1.3 Vliv výrobce na počet mezofilních sporotvorných mikroorganizmů
43
5.1.4 Vliv výrobce na počet konformních bakterií
45
5.1.4 Vliv výrobce na počet plísní
46
7
5.2 Vliv ročního období na počet a výskyt sledovaných mikroorganizmů
46
5.2.1 Vliv ročního období na počet kvasinek
46
5.2.2 Vliv ročního období na počet Geotrichum .candidum
48
5.2.3 Vliv ročního období při sledování mezofilních sporotvorných mikroorganizmů
48
5.2.4 Vliv ročního období na počet koliformních bakterií
50
5.2.5 Vliv ročního období při sledování počtu plísní
51
6 ZÁVĚR
52
7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
54
8 SEZNAM OBRÁZKŮ
57
9 SEZNAM PŘÍLOH
58
8
1. ÚVOD Výroba tvarohu má u nás svou historickou tradici, obliba a spotřeba tvarohu a tvarohových výrobků je srovnatelná s ostatními zeměmi střední Evropy. Průmyslový tvaroh byl dlouhá léta považován za okrajový výrobek. Mlékárny disponující zařízením na výrobu tvarohu zpracovávaly pouze přebytky odstředěného mléka. Dnes se mléko sráží v tancích o objemu 30 000 litrů. Ke změnám došlo i v balení, chlazení a expedici průmyslového tvarohu. Mléko určené k výrobě tvarohu musí být podrobeno předběžnému ošetření v prvovýrobě a základnímu ošetření v mlékárně. Základní ošetření mléka v mlékárně se řídí druhem vyráběného tvarohu nebo tvarohových výrobků a způsobem výroby.
Tvaroh má hlavní význam jednak pro přímý konzum, dále pro přípravu tvarohových sýrů a specialit. V menším rozsahu se průmyslově zpracovává k výrobě Olomouckých tvarůžků, které zastupují skupinu kyselých sýrů (Lukášová a kol., 2001).
Mikrobiologie průmyslového tvarohu zabezpečuje jeho zdravotní nezávadnost a také určuje další možnosti jeho zpracování. Podle nařízení EK 2073/2005 se pro mléko a mléčné výrobky provádí stanovení počtu
baktérií z čeledi Enterobacteriaceae a
koagulázopozitivních Stafylokoků.
Dále se u průmyslového tvarohu stanovuje počet kvasinek, výskyt plísně Geotrichum candidum, počet jiných plísní, koliformních bakterií, mezofilních sporotvorných aerobních a anaerobních bakterií.
9
2. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo sledování mikrobiálních ukazatelů průmyslového tvarohu od 8 různých dodavatelů po dobu 12 měsíců. U každého vzorku byl sledován počet kvasinek, výskyt plísně Geotrichum candidum, počet jiných písní, koagulázo-pozitivních Stafylokoků, bakterií rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, koliformních bakterií, mezofilních aerobních a anaerobních bakterií, Escherichia coli a Bacillus cereus.
10
3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Základní pojmy a definice Podle vyhlášky Ministerstva Zemědělství č. 77/2003 Sb. ve znění pozdějších předpisů se rozumí:
Tvarohem - nezrající sýr získaný kyselým srážením, které převládá nad srážením pomocí syřidla.
Syrovátkou - mléčný výrobek vznikající jako vedlejší produkt při výrobě sýrů, včetně tvarohů a kaseinů.
Podle vyhlášky Ministerstva Zemědělství č.77/2003 Sb. ve znění pozdějších předpisů se tvaroh dělí: Tab.1 Rozdělení tvarohu na skupiny a podskupiny Druh
Skupina
Podskupina
měkký nebo odtučněný
termizovaný
nízkotučný nebo jemný Tvaroh
polotučný tvrdý nebo na strouhání nebo ke strouhání
3.2 Mléko jako základní surovina k výrobě tvarohu Mléko určené k výrobě tvarohu by mělo pocházet od zdravých dojnic a mělo by mít vysoký podíl kaseinových bílkovin. Na obsahu kaseinu je přímo závislá výtěžnost výroby tvarohu. Důležitým požadavkem na mléko pro výrobu tvarohu je celkově nízký počet mikroorganizmů
v mléce.
Kontaminující
mikroorganizmy
mohou
svými
antagonistickými vztahy nebo metabolickými produkty negativně působit nejen na
11
růstovou aktivitu čistých mlékařských kultur, ale i na kvalitu finálních produktů (Strmiska, 1991).
3.2.1 Základní úpravy mléka před výrobou tvarohu Tepelné ošetření mléka Pasterace mléka pro výrobu tvarohu je dána veterinárním zákonem č. 166/1999 Sb. a závisí na druhu vyráběného tvarohu. Pro tradiční výrobu
průmyslového tvarohu se
používá vysoká pasterace při teplotě 85 °C po dobu 15 - 20 sekund. Tato pasterace zničí maximální podíl vegetativních forem mikroorganismů, zároveň dochází ke zvýšené denaturaci bílkovin syrovátky, která zvyšuje vazbu vody (Strmiska, 1991).
Kyselost mléka Kyselost mléka má rozhodující vliv na dobu srážení, na jakost a charakter sraženiny a také ovlivňuje konzistenci tvarohu. Kyselost mléka má činit nejvýše 8 °SH. Nízkou kyselost mléka lze zvýšit vyšším přídavkem smetanového zákysu. Jeho dávka 0,5 % zvýší titrační kyselost o 0,2 °SH a pH se sníží o 0,03 - 0,04 (Strmiska, 1991).
Přídavek CaCl2 Přídavek rozpustných vápenatých solí má vliv na rychlost srážení mléka. Při přídavku CaCl2 je vzniklá sraženina pevnější a dochází k menším ztrátám sušiny v syrovátce a celkově se zlepšuje konzistence tvarohu. Při výrobě tvarohu se používá
dávka
maximálně 5 - 10 g CaCl2 na 100 litrů mléka.
3.3 Čisté mlékařské kultury pro výrobu tvarohu Účelem použití čistých mlékařských kultur při výrobě tvarohu je úprava kyselosti mléka před sýřením, dále tvorba kyseliny mléčné spolu s aromatickými chuťovými látkami a snížení pH mléka. Při výrobě se používají smetanové směsné kultury, jogurtová kultura a další na trhu dostupné kultury.
12
Smetanové směsné kultury Smetanové směsné kultury jsou základem výroby velmi širokého sortimentu mléčných výrobků. Mikroflóru tvoří kmeny streptokoků mléčného kvašení mezofilního charakteru, produkující dostatečné množství kyseliny mléčné, kam patří kmeny Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus cremoris, Lactococcus diacetilactis. Dále jsou důležité z hlediska produkce aromatických složek
kmeny aromatvorných
leukonostoků typu Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris a Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (Zadražil, 2002).
Směsné smetanové kultury jsou klasifikovány do 4 tříd a to do O, L, D, LD . O - kultury obsahují: Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris. L- kultury obsahují :
Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris
D- kultury obsahují:
Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp. diacetilactis
LD- kultury obsahují: Lactococcus lactis subsp. diacetilactis Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris
Aromatvorné druhy Lactococcus diacetilactis, Lactococcus lactis mají význam pro dosažení plnějšího aromatu tvarohu díky tvorbě diacetylu, částečně i acetaldehydu. Za podmínek technologického postupu výroby měkkého tvarohu kontinuálním způsobem, tj. je při vyšších kultivačních teplotách (28 °C) je v konečné fázi podpořena převaha bakterií využívajících citrát. Tvorba diacetylu vlivem působení leukonostoků je závislá na snížení pH až k 5,5 zatímco Lactococcus lactis produkuje diacetyl v celém rozsahu pH společně s CO2. Vedle toho vzniká acetát, diacetyl, acetoin a 2,3-butylenglykogen. Acetoin vzniká dekarboxylací z kyseliny acetomléčné a redukcí diacetylu, diacetyl je syntetizován přímo z aktivního acetaldehydu a acetyl-CoA. Při optimální kultivační teplotě 23 °C směsná smetanová kultura dosáhne titrační kyselosti 39 - 41 °SH, odpovídající pH 4,3 - 4,7 a obsahuje 0,7 - 1 % mléčné kyseliny. Při uvedené kultivační teplotě se tvoří také nejvíce diacetylu jako hlavní aromatvorné složky. Se zvyšováním kultivační teploty vzniká schopnost kultury tvořit aromatvorné látky, k nimž patří 13
acetaldehyd. Optimální tvorba aromatu nastává přibližně při pH 4,3. Ke hromadění aromatvorných látek dochází až pod pH 5,2 (Pavelka, 1996).
Jogurtová kultura Mikroflóru jogurtových kultur tvoří kmeny Lactobacillus delbrucki subsp. bulgaricus a Streptococccus salivarius, subsp. thermophilus v zastoupení
tyčinek ke kokům
v poměru 1:1 až 1:2. Základní složkou jogurtového aroma je acetaldehyd. V zahraničí jsou součástí jogurtových kultur kmeny bifidobakterií nebo kmeny dalších laktobacilů (Zadražil, 2002).
Streptococcus thermophilus má růstové optimum při teplotě 38 °C - 45 °C a mléko sráží za 24 hodin. Je poměrně velmi termorezistentní, virulentní kmeny snášejí záhřev 15 minut při teplotě 80 °C. Tvoří pravotočivou kyselinu mléčnou a jen nepatrně štěpí kasein. Lactobacillus delbrucki, subsp. bulgaricus má růstové optimum při 40 °C a je méně tepelně odolný. Jeho růstová aktivita je již nad 60 °C omezena. Tvoří levotočivou kyselinu mléčnou (Strmiska, 1991).
K výrobě tvarohu je využitelná též
acidofilní kultura
Lactobacillus acidophilus.
Vzhledem k rychlé prokysávací schopnosti a konečné vysoké kyselosti tvarohu se používá především v kombinaci s mezofilními streptokokovými kulturami. V poslední době se k výrobě tvarohu využívají i speciální bakterie patřící k intestinální mikroflóře, a to
Bifidobacterium bifidum (Strmiska, 1991).
Požadavky na vlastnosti kultur pro výrobu tvarohu Požadavky na vlastnosti kultur používaných při
výrobě tvarohu se liší podle
technologie a druhu vyráběného tvarohu. Hlavním požadavkem na čisté mlékařské kultury určené k výrobě tvarohu je, aby se již v prvních hodinách zaočkování mléka tvořilo dostatečné množství mléčné kyseliny, která je nutná pro snížení pH mléka, a to pod hodnotu 6,5 (Strmiska, 1991).
14
3.4 Vlastnosti gelů pro výrobu tvarohu Důležitou vlastností gelů pro výrobu tvarohů při jejich zpracování je jejich pevnost, tuhost, křehkost a tříštivost. Křehkost a tříštivost gelu se výrazně snižuje ohřevem. Ohřevem na vyšší teploty se zvyšuje synereze
a součastně nastává slepování
bílkovinných částic ve větší celky, tzv. konglomeráty. Při zpracování gelu za nižších teplot dochází k menší synkrezi. Výsledná sušina tvarohu je při stejných podmínkách lisování při nižších teplotách ohřevu menší než při vyšších teplotách. Podle některých údajů výslednou sušinu tvarohu příznivě ovlivňuje i výdrž po ohřevu sraženiny. Uvedenými závislostmi se zabýval Srtmiska a kolektiv (1991). Zjistil, že při ohřevu nesýřené tvarohové suspenze na teplotu 40 °C se lisováním 1 kg sraženiny tlakem závaží o hmotnosti 1 kg získá za 5 minut tvaroh o obsahu sušiny asi 18 %. Lisováním za stejných podmínek sraženiny zahřáté na teplotu 50 °C se získá tvaroh o obsahu sušiny 28 - 30 %. Ohřevem o každý stupeň nad teplotu 40 °C se tedy zvýší obsah sušiny přibližně o 1 %. Dále zjistil, že teplota ohřevu sraženiny nemá vliv na únik bílkovin do syrovátky a nemá podstatný vliv na výtěžnost.
3.5 Výroba průmyslového tvarohu Při výrobě průmyslového tvarohu je základem kyselé srážení šetrně pasterovaného odtučněného mléka (Lukášová a kol., 2001).
3.5.1
Kyselé srážení
Hodnota pH čerstvého mléka je 6,5 - 6,75. Sníží-li se pH vzniklou kyselinou mléčnou na hodnotu 4,6 kaseiny precipitují a po oddělení kaseinu (tvarohu) zbývá syrovátka (Velíšek, 2002).
Se snižováním pH klesá
velikost záporného náboje kaseinových micel, koloidní
kalcium fosfát přechází do vodní fáze a při pH nižším než 4,6 je zcela rozpuštěn. Součastně se zmenšuje hydratační obal. Destabilizace kaseinových micel nastává již při pH nižším než 5,5. Největší množství kaseinu se vysráží při pH 4,2 - 4,6 a teplotě
15
20 °C. Při vyšší teplotě se tvoří sraženina rychleji a má hrubší charakter. Teplota by neměla být ale vyšší než 40 °C, pak je vzniklá sraženina gumovitá. Při teplotě pod 6 °C se sraženina netvoří. Při pH pod 5,2 ztrácejí kaseinové micely koloidní kalcium fosfát, a tím i svoji soudržnost. Frakce β a κ kaseinu se uvolňují z micely. Při kyselosti okolo pH 4,6 uvolněné kaseiny získávají kladný náboj a readsorbují se na povrch negativně nabytého αS-kaseinu, což vede k tvorbě částic zřetelně jiného charakteru než původní micely. Při větším snížení pH se dále snižuje elektrický potenciál částic v důsledku zmenšení velikosti náboje kaseinu a nově vytvořené částice začínají agregovat ve formě řetězců a svazků s vytvořením gelu kysele sraženého mléka. Porušením struktury gelu (krájením, mícháním), případně zvýšením teploty se zvyšuje uvolňování syrovátky, což je využíváno při výrobě tvarohů a čerstvých sýrů (Gajdůšek, 1998).
Dle principu výroby se tvarohy rozdělují do dvou skupin. První skupinu tvoří tvarohy vyrobené bez přídavku syřidlových enzymů (syřidla), kdy je mléčná bílkovina vysrážena z mléka pouze kyselinou mléčnou, vznikající při mikrobiálním rozkladu laktózy. Tímto způsobem je vyráběn tvaroh na strouhání (tvrdý) a tvaroh průmyslový, sloužící jako základní surovina pro výrobu kyselých sýrů. Všechny ostatní tvarohy tvoří druhou skupinu. Vysrážení mléčných bílkovin z mléka se spoluúčastní syřidlové enzymy i kyselina mléčná vzniklá mléčným kysáním. Podle použité mechanizace hovoříme o tvarohu získaném diskontinuálním způsobem na sýrařských vanách a kontinuálním způsobem pomocí tvarohářských
odstředivek
(Pavelka, 1996).
Průmyslový tvaroh je možno vyrábět třemi různými způsoby, které se liší v přípravě sraženiny. Jedná se o dvoutepelný způsob, jednotepelný způsob a termofilní způsob výroby (Strmiska a kol., 1991).
3.5.2 Dvoutepelný způsob výroby průmyslového tvarohu
Pasterované mléko odstředěné a vychlazené na 22-30 °C se napustí do kotle, přidá se k němu 1 % smetanového zákysu a nechá se srážet. Při teplotě 22-30 °C se sraženina tvoří za 14 - 17 hodin a její kyselost je v rozmezí 24 - 28 °SH. Sraženina se promíchá a nechá 20 minut odstát, aby se vyloučila syrovátka. Pak se za stálého míchání přihřívá na teplotu 38 - 42 °C. Tvaroh se poté nechá v klidu, odčerpá se syrovátka a tvaroh se 16
napustí do tvarožníků, kde se po odkapání lisuje. Po vylisování se musí tvaroh zchladit na 10 °C a expeduje se (Strmiska a kol., 1991).
Odstředěné mléko ↓ Pasterace 74 - 76 °C 15 - 25 sekund ↓ Přídavek CaCl2
→
←
Zchlazení 22 - 30 °C
Přídavek Smetanový zákys
↓
0,5 - 2 %
Tvorba sraženiny 14 - 18 hodin 24 - 28 °SH ↓ Rozkrájení ↓ Dohřev sraženiny 38 - 42 °C ↓ Lisování ↓ PRŮMYSLOVÝ TVAROH
Obr. 1 Schéma výroby průmyslového tvarohu dvoutepelným způsobem
3.5.3 Jednotepelný způsob výroby průmyslového tvarohu
Od dvoutepelného způsobu výrovy se jednotepelný způsob liší tím, že se mléko v sýrařské vaně přihřeje na 32 - 30°C, zakysá se 1 % smetanovým zákysem a nechá se srážet. Požadované kyselosti 32 - 34 °SH se dosáhne za 7 - 10 hodin při teplotě 32 °C, při 38 °C za 12 - 14 hodin. Po dosažení kyselosti se sraženina pozvolna promíchá a s krátkými přestávkami se míchá 1 - 2 hodiny. Kyselost filtrované syrovátky má být
17
před vybíráním tvarohu 25 - 27 °SH. Tvaroh se ponechá v klidu, odpustí se syrovátka a tvaroh se expeduje. Při této výrobě je důležité vychlazení tvarohu před plněním, neboť má sklon k zapaření (Gajdůšek, 1998).
Odstředěné mléko ↓ Pasterace 74 - 76 °C 15 - 25 sekund ↓ Přídavek CaCl2
→
←
Zchlazení 33 - 38 °C
Přídavek termofilní zákys
↓
2%
Tvorba sraženiny 7 - 12 hodin 25 - 27 °SH ↓ Promíchávání 2 hodiny ↓ Lisování ↓ Chlazení ↓ TVAROH
Obr. 2 Schéma výroby průmyslového tvarohu jednotepelným způsobem
3.5.4 Termofilní způsob výroby průmyslového tvarohu
Při výrobě se používá odstředěné pasterizované mléko. Po odstředění a pasteraci se mléko napustí do sýrařské vany, upraví se jeho teplota na 38 - 40 °C a zakysá se 2 % termofilním zákysem. Termofilní zákys obsahuje Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis a Lactobacillus helveticus. Po dosažení
kyselosti
sraženiny
23 - 25 °SH, což je za 2 - 4 hodiny po zakysání, se sraženina opatrně promíchá a ponechá 5 - 10 minut v klidu. Pak se po krátkých intervalech znovu promíchává, aby
18
byla tvarožina náležitě tuhá. Vybírání tvarohu a jeho lisování by nemělo trvat déle než hodinu. Poté se tvaroh expeduje (Gajdůšek, 1998).
Podle Foxe se pro termofilní způsob výroby tvarohu pasterace mléka provádí při 96 °C po dobu 2 - 3 sekundy aniž by došlo k denaturaci mléčných proteinů.
Odstředěné mléko ↓ Pasterace 74 - 76 °C 15 - 25 sekund ↓ Přídavek
→
CaCl2
Zchlazení 33 - 40 °C ↓
←
Přídavek termofilní zákys 2%
Tvorba sraženiny 2 - 4 hodiny 23 - 25 °SH ↓ Promíchávání 30 minut ↓ Lisování ↓ Chlazení ↓ TVAROH
Obr. 3 Schéma výroby průmyslového tvarohu termofilním způsobem
3.5.5 Kontinuální výroba průmyslového tvarohu
Kontinuální výroba průmyslového tvarohu spočívá v oddělování tvarohoviny pomocí odstředivek. K odstřeďování sraženiny tvarohu od syrovátky se nedají použít běžné odstředivky pro měkký tvaroh. Vhodným typem pro výrobu průmyslového tvarohu jsou odstředivky dekantační - šnekové.
19
K výrobě průmyslového tvarohu odstřeďováním se používá pasterované odtučněné mléko, které se ohřeje na teplotu 26 - 30 °C, napustí se do koagulačních tanků a zakysá 1 - 1,5 % smetanovým zákysem. Koagulace probíhá do druhého dne. Po dosažení kyselosti syrovátky 26 - 28 °SH je možno sraženinu dále zpracovávat. Sraženina se po rozmíchání a přečerpání ohřeje na 50 °C s výdrží 3 - 5 minut ve vyrovnávací nádrži. Poté následuje odstředění v dekantační odstředivce.
Technologický postup výroby průmyslového tvarohu na lince s odstředivkou a regulací sušiny Výroba probíhá v sedmi na sebe navazujících krocích. 1. Koagulace mléka. K výrobě průmyslového tvarohu odstředivkovým způsobem se používá pasterované odtučněné mléko, které se ohřeje na teplotu 26 - 30 °C. Mléko se napustí do koagulačních tanků a zakysá se 1 - 1,5 % smetanovým zákysem. Koagulace probíhá do druhého dne. Po dosažení kyselosti syrovátky 26 - 28 °SH je možno sraženinu dále zpracovávat. 2. Čerpání sraženiny v deskovém ohřívači se provádí přímo bez jejího krájení. Při použití trubkového ohřívače je nutné sraženinu kontinuálně pokrájet strunovým kráječem. 3. Homogenizace sraženiny. Sraženinu je nutno před dalším zpracováním dokonale homogenizovat. Homogenizace se provádí přímo v koagulačním tanku. 4. Ohřev sraženiny. Sraženinu je nutno zahřát na teplou 45 - 55 °C, nejvhodnější je teplota 50 °C. Nižší teploty zhoršují odstřeďování doprovázené únikem bílkovin do syrovátky a snižuje se výtěžnost. 5. Teplotní výdrž. Aglomerace bílkovinných částic znamená tvorbu tvarohového zrna. Aglomerace začíná po 1 - 2 minutách po ohřevu sraženiny. Aby se ve vzniklém zrnu zachytily veškeré bílkoviny, je třeba ponechat sraženinu po ohřevu 3 - 5 minut v klidu. 6. Odstřeďování sraženiny. Odstřeďováním vzniká pevná a kapalná fáze. Kapalnou fází je syrovátka. Snížení Sušinu
sušiny tvarohu se provádí
zkrácením
tvarohu vycházejícího z odstředivky lze také regulovat
doby odstřeďování. teplotou
ohřevu
odstřeďované sraženiny. Při vyšších teplotách odstřeďování se zvyšuje sušina tvarohu v rozsahu od 27 - 37 %. Při vyšší odstřeďovací teplotě odchází též méně bílkovin do syrovátky a její sušina se snižuje. Při teplotě sraženiny 50 °C se získá odstředěním tvaroh o dostatečně vysokém obsahu sušiny a syrovátka je čirá, bez sedimentu. Dochází
20
již k dokonalému fázovému dělení sraženiny. Teploty nad 50 °C již ale nejsou vhodné, protože se snižuje počet mléčných bakterií v tvarohu. 7. Chlazení tvarohu. Tvaroh je nutné co v nejkratší době zchladit, aby se zabránilo jeho překysání. Snižování teploty se provádí dvojím způsobem: a) tvaroh se chladí ihned po odstředění, například vakuově b) tvaroh se dochladí v přepravních nádobách a ty se uloží v chladírně (Strmiska, a kol., 1991).
3.6 Biochemické změny při výrobě průmyslového tvarohu Technologickým postupem jsou usměrňovány a připravovány vhodné podmínky důležité pro růst a činnost mikrobů v jednotlivých fázích výroby a zrání. Během výroby průmyslového tvarohu dochází k těmto biochemickým změnám: - k mléčnému kysání - k oxidaci kyseliny mléčné - k rozkladu bílkovin Kyselina mléčná která se tvoří činností baktérií mléčného kysání váže z komplexu kasein za tvorby mléčnanu vápenatého a volného kaseinu. Fosforečnan vápenatý, který je nerozpustný, mění kyselina mléčná na kyselý fosforečnan vápenatý. Mléčnan vápenatý a kyselý fosforečnan vápenatý jsou rozpustné soli a přecházejí do syrovátky. Jakmile je dosaženo isoelektrického bodu kaseinu (4,7 pH) vypadne kasein jako nerozpustná bílkovina a mléko se srazí. Při výrobě průmyslového tvarohu musí být celý proces usměrněn tak, aby mléčné kysání bylo zastaveno tehdy, kdy to jakost průmyslového tvarohu vyžaduje. Kyselost tvarohu při jeho výrobě, obsahuje-li 32 % sušiny, má kolísat v rozsahu 110 - 120 °SH a jeho pH má být v rozmezí 4,4 - 4,6. Během dalších manipulačních prací musí být tvaroh ošetřen a uložen tak, aby nedocházelo k rozvoji nežádoucí mikrofóry
a tím k nežádoucím biochemickým
změnám. Tvaroh se musí vychladit na teplotu 10 - 15 °C a po naplnění do přepravních nádob na teplotu 5 °C, aby se zastavilo další kysání. Není-li tvaroh dobře udusán a nacházejí-li se v něm vzduchové prostory, rozmnoží se v něm při vhodných teplotních podmínkách sporogenní aerobní baktérie - Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus brevis, Bacillus pulmilis, které rozkládají jednotlivé složky tvarohu za exotermických
21
procesů, při nichž se uvolňuje energie ve formě tepla a tvaroh se zapaří (Gajdůšek, 1999).
3.7 Syrovátka Při výrobě tvarohu vzniká jako vedlejší produkt syrovátka. Vzhledem ke své nutriční hodnotě se stala v poslední době cennou surovinou v potravinářském průmyslu. Její složení je závislé na druhu vyráběného výrobku a na složení zpracovávaného mléka a na technologii výroby. Největší množství syrovátky vzniká právě při výrobě tvarohu (kyselá syrovátka). Tato syrovátka může obsahovat od 0,01 - 0,7 % tuku. Obsah bílkovin v syrovátce se pohybuje 0,6 - 0,8 %. Syrovátkové bílkoviny jsou fyziologicky cennější než kasein pro vysoký obsah aminokyselin, a to pro cystin a cystein, které obsahují síru.
Obsah laktózy v syrovátce je jen 1,5 - 3,5 % a obsah kyseliny mléčné je 0,8 %. Popeloviny kyselé syrovátky tvoři 0,5 - 0,8 %. Žlutozelené zbarvení
syrovátky
způsobuje vitamín B2. Syrovátka obsahuje také vitamín C. Syrovátka je velmi málo udržitelná tekutina, pro vysoký obsah mikroorganismů, které do ní přecházejí z výroby sýrů a tvarohu
a pro značný obsah zředěných živin a
substrátů (Lukášová, a kol., 2001).
V současné době se většina syrovátky zpracovává na řadu zahuštěných a sušených produktů, které mají široké využití. Syrovátka se suší v nativním stavu případně demineralizovaná. Používá se na výrobu laktózy, koncentrátů syrovátkových bílkovin, připravuje se sušená syrovátka s hydrolyzovanou laktózou využívá se k výrobě nápojů, je vhodným substrátem pro fermentaci k výrobě ethanolu, kyseliny mléčné nebo citrónové (Simeonovová, 2003).
3.8 Zařazení tvarohu do skupiny kyselých sýrů Základní surovinou pro výrobu kyselých sýrů
je
tvaroh, získaný samovolným
vysrážením mléka. Toto vysrážení mléka je v podstatě vylučování kaseinu kyselinou mléčnou, která se vytvoří mikrobiálním rozkladem laktózy. Tvaroh je však nejen
22
surovinou, ale také finálním produktem , určeným k přímé spotřebě. Rozeznáváme tyto druhy tvarohu: 1) Tvaroh měkký. Je mléčná bílkovina, získaná z mléka pasterizovaného, zakysaného smetanovým zákysem a syřidlem. Vysrážený tvaroh
se plní do textilií, nebo do
silonových pytlů a nechá se samovolně nebo za mírného lisování odkapat. 2) Tvaroh tvrdý. Získává se z mléka mléčným kysáním bez přídavku syřidla. 3) Tvaroh průmyslový. Vyrábí se s menšími obměnami jako předchozí druhy. Používá se hlavně
jako surovina pro výrobu některých druhů kyselých sýrů jako jsou
Olomoucké tvarůžky (Spitzer, 1974).
3.8.1 Kyselé a tvarohové sýry
Pod pojmem kyselé sýry rozumíme takové sýry, při jejichž výrobě se kasein sráží kyselinou mléčnou bez významného působení syřidla (Görner,Valík, 2004).
Výroba kyselých sýrů je historicky starší než výroba sýrů sladkého sýrařství. Základní surovinou k výrobě kyselých sýrů je tvaroh, který je však též výrobkem určeným k přímé spotřebě. Mléko se sráží zpravidla činností bakterií mléčného kvašení, homofermentativních nebo heterofermentativních streptokoků, někdy i mezofilních a termofilních tyčinek (Pavelka, 1996).
Olomoucké tvarůžky
Jsou hlavními zástupci skupiny kyselých sýrů. K jejich výrobě se používá krátkodobě a dlouhodobě skladovatelný průmyslový tvaroh s obsahem 4 - 4,5 % soli. Tvaroh je chráněn před přístupem vzduchu, s možností odvodu dodatečně uvolněné syrovátky. Kyselost směsi tvarohů se upravuje na 110 - 115 °SH přídavkem uhličitanu sodného a vápenatého. Obsah soli se upravuje na 4 - 5 %. Tvaroh s přísadami se pomele a formuje na tvarovacích strojích. Tvarůžky se poté nechají zrát. Vyrábějí se i různé obdoby kyselých sýrů zrajících z povrchu, například kyselé sýry plísňové, s plísní Penicillium camemberti, které se podobají měkkým sýrům plísňovým (Lukášová, a kol., 2001).
23
Tvarohové sýry Tvaroh nebo tvarohový sýr je měkký čerstvý sýr vyrobený pomocí kyselého srážení s vysokodohřívanou sraženinou o pH 4,6.
Je připravován z pasterizovaného
plnotučného nebo polotučného mléka. Tvarohové produkty s přídavkem ovoce nebo zeleniny se připravují stejným způsobem. Tvarohové sýry jsou obsaženy v menším množství v dresincích a omáčkách, používaných jako náplně do pečiva (Gunasekaran, 1957).
Základní surovinou pro výrobu tvarohových sýrů je mléčný koagulát získaný převážně kyselým srážením mléka biologickou cestou. Pro výrobu tvarohových sýrů se tvaroh standardizuje na obsah 40 % tuku v sušině směšováním se smetanou. Takto v podstatě upravené tvarohy, po přidání soli, eventuálně jiných přísad, například zeleninových, se po promíchání a balení expedují (Lukášová, a kol., 2001).
3.9 Mikrobiální ukazatele u průmyslového tvarohu Podle nařízení EK 2073/2005 se u mléka a mléčných výrobků provádí stanovení počtu bakterií z čeledi Enterobacteriaceae a koagulázopozitivních Stafylokoků. Dále se u průmyslového tvarohu stanovuje počet kvasinek, výskyt plísně Geotrichum candidum, počet jiných plísní, koliformních bakterií, mezofilních sporotvorných aerobních a anaerobních bakterií podle normy výrobce.
3.9.1 Fakultativně anaerobní gramnegativní tyčinky
Čeleď Enterobacteriaceae Rod Escherichia Druh Escherichia coli
Vlastnosti: Gramnegativní tyčinky fermentující laktózu za tvorby kyseliny mléčné, kyseliny octové a plynů CO2 aH2. Nefermentuje sorbitol ani β-glukoronidázu. Bakterie
24
snáší kyselé i zásadité prostředí pH (4,4 - 9,0) a jsou schopny růst o při 5%koncentraci NaCl. Neroste při vodní aktivitě pod 0,95. Výskyt: Přirozený mikroorganizmus v lidském a zvířecím organizmu. V přírodě se poté vyskytuje v sekundární podobě ve formě fekálií, jedná se o saprofytický MO, indikátor sanitace a zachování hygieny v potravinářství (Forsythe, 2000).
Čeleď Enterobacteriaceae Rod Salmolella Skupina S. typhi, S. paratyphi: Hlavní rezervoárem salmonel je střevní trakt zvířat a lidí. V půdě a vodě zástupci přežívají i několik týdnů, a tím vznikají podmínky pro jejich šíření povrchovými vodami. Vlastnosti: Jsou odolné nízkým teplotám, které sice zpomalují jejich metabolizmus, ale neničí je. Rostou v rozmezí teplot +5 až 47 °C a při pH 4,0 až 9,0. Teplota nad 70 °C je ničí. Salmonely vyvolávají střevní infekce. Minimální afekční dávka (rozmezí 102 – 105 KJT) způsobuje prostřednictvím endotoxinu akutní gastroenteritidy (Burdychová, Sládková, 2007).
3.9.2 Fakultativně anaerobní grampozitivní sporulující tyčinky
Čeleď Listeraceae Rod Listeria Druh Listeria monocytogenes
Vlastnosti: Fakultativně anaerobní až aerobní mikroorganizmů, jsou pohyblivé tyčinky, izolované v krátkých řetízcích, u starších kultur tvoří vlákna. Fermentuje glukózu za tvorby kyselin bez plynu, je pozitivní na katalázu. Teplota pro optimální růst 37 °C až po teplotu 2,5 °C, přežívá v 20 % NaCl při 4 °C osm týdnů. Revitalizace nastává při 58 °C až 59 °C za 10 minut. Výskyt: Volně v přírodě, ve vodě, v bahně, odpadních vodách, ve výkalech lidí i zvířat. Přenáší se na člověka kontaktem s infikovaným zvířetem a nebo nepřímo kontaminací potravinami, zeleninou. Může způsobit i smrtelné onemocněné především u dětí a starých lidí nebo těhotných žen (Anonym, 2009).
25
3.9.3 Aerobní nebo fakultativně anaerobní grampozitivní sporulující tyčinky
Čeleď Enterobacteriaceae Rod Bacillus Druh Bacillus cereus
Vlastnosti: Mezofilní katalázo-pozitivní delší tyčinky, štěpící bílkoviny za vzniku amoniaku, sacharidy fermentující s méně výraznou tvorbou kyselin, někdy i s tvorbou plynu, redukují dusičnany. Růst v pH 5,5 až 8,5 při teplotě 7 až 49 °C. Bacillus cereus produkuje nebezpečné enterotoxiny vyvolávající alimentární intoxikace. Výskyt: V půdě,
na rostlinách, v tepelně upravených a nedostatečně vychlazených
pokrmech (Klaban, 1993)
3.9.4 Fakultativně anaerobní koky (grampozitivní)
Čeleď Streptococcaceae Rod Staphylococcus Druh Staphylococcus aureus
Vlastnosti: Kokovité buňky zvláštně uspořádané do hroznovitých útvarů, jsou nepohyblivé. Dobře rostoucí na agarových mediích, některé tvoří žlutý až oranžový pigment. Jsou silně katalázo pozitivní, halotolerantní (10 % NaCl ), redukují dusičnany. Fermentují sacharózu. Staphylococcus aureus je potenciální patogen. Optimální růst je při 37 °C, rostou i při 10 °C až 45 °C. Nesnáší kyselé prostředí.
Výskyt a význam: Na pokožce, v nosohltaně, v hnisavých ranách, nachází se v půdě i vodě. Koagulázo a termonukleázo pozitivní kmeny produkují enterotoxin snášející půlhodinový var. Způsobují stafylokokové enterotoxikózy (Žižka, 1992).
3.9.5 Kvasinky a plísně
Kvasinky mají v potravinářské technologii dvojí význam. Jsou technologicky využitelné při výrobě potravin a nebo způsobují jejich kažení.
26
Vlastnosti: Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík.
Mají ale schopnost
přeměnit svůj metabolizmus za anaerobních podmínek na fermentační. Rostou v širokém rozmezí pH a i v širokém rozmezí teplot 0 – 48 °C (Janderová, 1999).
Čeleď Endomycetaceae Rod Geotrichum Druh Geotrichum candidum
Plísně tohoto rodu se rozmnožují rozpadem hyf na oidie, které mají takřka obdélníkový tvar. Plíseň je enzymově velmi aktivní, rozkládá sacharidy, tuky i bílkoviny. Vyznačuje se oxidační činností, dobře roste na půdách i s vyšším pH (do 7). Na polotuhých mediích tvoří bílé kruhové kolonie rozbíhající se ze středu. Na sladině tvoří žlutobílý, nepravidelný vráskovitý povlak. Na mléčných výrobcích roste v podobě chlupatého povlaku, který se mění na žlutý slizovitý (Jesenská, 1987). Výskyt: ubikvitárně v půdě, ve vodě, ve vzduchu, v potravinářství v mlékařství je velmi rozšířená. Na starším tvarohu tvoří povlaky, vytváří zvrásněný povrch, nebo jemný povlak. V potravinářství se může vyskytovat také na povrchu nedostatečně ošetřených potravinářských strojů (Görner, Valík, 2004).
3.9.6 Bakterie sýrového mazu
Mazová kultura bývá složena z proteolytických halofilních bakterií Brevibacterium linens a Geotrichum candidum. Proteolytické bakterie vyžadují pro svůj růst neutrální prostředí. Brevibacterium linens se vyznačuje růstem v striktně aerobním prostředí a na odkyseleném povrchu sýrů (Görner, Valík, 2004).
3.9.7 Indikátorové baterie
Indikátorové bakterie a jejich počet informují o primární a sekundární kontaminaci surovin a potravin: • počet koliformních bakterií Indikátorové bakterie a jejich počet informující o kažení potravin: • počet kvasinek a plísní 27
•
počet aerobních sporotvorných bakterií
• počet anaerobních sporotvorných bakterií Indexové bakterie informující o možné přítomnosti choroboplodných bakterií: • Escherichia coli Indikátorový význam koliformních bakterií: Pod pojmem koliformní bakterie se rozumí bakterie laktózo-pozitivní, oxidázonegativní bakterie, které se na živných půdách chovají podobně jako druh Escherichia coli. Základní vlastností koliformních bakterií na polotuhých mediích je fermentace laktózy za tvorby kyselin a přechodných metabolitů, v tekutých půdách pak tvorba plynu a kyselin. Obsah koliformních bakterií
v potravinách se hodnotí jako indikátor
zachování
správných technologických postupů, zpracování a případně chlazení surovin, dále k ověření čistění a dekontaminace technologického nářadí a zařízení (Vassila 2001). Nejčastějším zdrojem kontaminace tvarohu je nářadí a zařízení používané při jeho výrobě, voda používaná v provozu a
kontaminovaný vzduch. Při nevyhovujících
hygienických podmínkách se může
pomnožit choroboplodná bakterie Listeria
monocytogenes. Z mikrobiologického hlediska jsou tvarohy mimořádně náchylné ke kažení zvýšeným obsahem plísní a kvasinek.
Jako indikátor poukazující na
nedostatečné dodržování hygienických požadavků se v tvarohu sleduje přítomnost a obsah koliformních bakterí, kvasinek a plísní. Za nepřítomnosti mezofilních bakterií mléčného kvašení se mohou rozmnožovat bakterie z rodu Pseudomonas a z čeledi Enterobacteriaceae. Při skladování
o teplotě vyšší
než 5 °C je umožněn růst
psychrofilních bakterií, zejména Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi a Pseudomonas putila. Z enterobakterií se mohou rozmnožovat Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans a Escherichia coli. Bakterie z rodu Pseudomonas jsou aerobní mikroorganizmy a proto dominují na povrchu tvarohu. Některé koliformní bakterie jsou fakultativně anaerobní a proto se nacházejí i uvnitř produktů. Jejich růst a metabolizmus spolu s kvasinkami a plísněmi způsobuje nežádoucí změny tvarohu jako nečistou, hnilobnou, žluklou, ovocnou a kvasnou chuť a vůni (Görner, Valík, 2004).
28
4. MATERIÁL A METODIKA
4.1 Materiál K mikrobiologické analýze byl brán jako hodnotící materiál průmyslový tvaroh dodaný výrobcem. Vzorky tvarohu byly dodány v chladících boxech, aby nebyl porušen chladící řetězec. Každý vzorek byl uložen v mikrotenovém sáčku a řádně označen. Vzorky byly přijímány po dobu 12 měsíců a to od osmi výrobců. Dva výrobci byli ze zahraničí. Vzorky byly k analýze dodávány v nepravidelných intervalech a různém početním zastoupení jednotlivých výrobců.
4.2 Metody Mikrobiální analýzy se prováděly na SVÚ v Olomouci pod vedením MVDr. Jarmily Ondruškové. Po přijetí vzorku, jeho zapsáním a evidováním se vzorky analyzovaly. Před vlastní analýzou se vzorek nejdříve homogenizoval v dodaném mikrotenovém sáčku. Z homogenizovaného materiálu
se za sterilních podmínek odebralo 10 g
vzorku, vložilo se do nového sterilního sáčku a provedlo se dekadické ředění pomocí 90 ml fyziologického roztoku. Z takto připraveného laboratorního vzorku se poté provádělo následné dekadické ředění dle potřeb stanovení. U každého vzorku byl sledován počet kvasinek, výskyt plísně Geotrichum candidum, počet jiných plísní, koagulázo-pozitivních Stafylokoků, bakterií rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, koliformních bakterií, mezofilních aerobních a anaerobních bakterií, Escherichia coli a Bacillus cereus. 4.2.1 Stanovení počtu koliformních bakterií
Stanovení koliformních bakterií bylo provedeno podle normy ČSN ISO 5541/1 Tato norma poskytuje všeobecné podmínky pro stanovení počtu koliformních bakterií ve výrobcích určených pro lidskou výživu. Principem je technika počítání kolonií vyrostlých v pevné selektivní půdě po inkubaci při 30 °C, 35 °C nebo 37 °C, přičemž konkrétní teplota je předmětem dohody mezi zůčastněnými stranami.
29
Podstata zkoušky 1) Do dvou misek jsem naočkovala 1 ml
zkušebního vzorku. Inokulum jsem zalila
agarovou selektivní kultivační půdou. 2) Naočkované plotny jsem dala inkubovat při 37 °C po dobu 24 hodin. 3) Počet koliformních baktérií v mililitru nebo gramu vzorku jsem stanovila z počtu charakteristických kolonií vyrostlých na plotnách vybraných k hodnocení.
Jako živnou půdu jsme použila agar s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a laktózou. Při použití agaru s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučovými solemi a laktózou byly kolonie koliformních bakterií jasně růžové, se světlým okrajem, precipitátem pod koloniemi v podobě růžových skvrn nebo úzké zóny kolem kolonií. Velikost kolonií byla 1 - 3 mm.
Vyjádření výsledků Při počítání vyrostlých kolonií jsem použila výpočet pro více než 150 charakteristických kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Bylo potřeba, aby aspoň jedna z misek obsahovala 15 charakteristických kolonií. Počet N koliformních bakterií na 1 mililitr nebo gram výrobku jsem vypočítala podle následující rovnice:
kde
je součet charakteristických kolonií spočítaných na vybraných plotnách n1 je počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění n2 počet ploten použitých pro výpočet ze druhého ředění d první pro výpočet použité ředění
Výsledek jsem zaokrouhlila tak, aby obsahoval pouze dvě číslice různé od nuly.
30
4.2.2 Průkaz bakterií rodu Salmonella
Stanovení bylo provedeno podle ČSN ISO 6579. Podstata zkoušky 1)Přemnožení v neselektivní tekuté půdě Do zkumavky s tlumivou peptonovou vodou o pokojové teplotě jsem inokulovala zkušební vzorek a poté jej dala inkubovat při 37 °C po dobu 18 hodin. 2) Pomnožení v selektivní tekuté půdě Kulturu získanou v neselektivní tekuté půdě jsem inokulovala
na agarové plotny
modifikované polotuhé půdy podle Rappaporta a Vassileadise (MSRV). Plotny jsem dala inkubovat při 41,5 °C po dobu 24 hodin ( pokud byla i po 24 hodin plotna negativní, inkubace se prodloužila o dalších 24 hodin). 3) Vyočkování a identifikace Každou z kultur získaných v neselektivní tekuté půdě a v selektivní tekuté půdě jsem vyočkovala
na dvě
deoxycholanem (XLD).
pevné selektivní půdy a to na agar s xylózou, lyzinem a Jako druhou pevnou selektivní půdu jsem použila agar
s krystalovou violetí, neutrální červení, žlučí a laktózou (VRBL). Agar XLD jsem inkubovala při 37 °C a přítomnost suspektních kolonií jsme zjišťovala po 24 hodinách. VBRL jsem inkubovala při 30 °C po dobu 24 hodin.
Typické kolonie bakterií rodu Salmonella vyrostlé na agaru XLD mají černý střed, jsou téměř průsvitné a jejich barva je narůžovělá v důsledku změny barvy indikátoru. H2S negativní varianty baktérií rodu Salmonella (např. Salmonella Paratyphi A) vyrůstají na agaru XLD v růžových koloniích s tmavším středem. Laktózopozitivní baktérie rodu Salmonella vyrůstají na agaru XLD ve žlutých koloniích, které mají nebo nemají černý střed.
31
předmnožení v neselektivní tekuté půdě ↓ 1ml vzorku + 9 ml peptonové vody o pokojové teplotě ↓ inkubace při 37 °C po dobu 18 hodin ↓ selektivní pomnožení ↓ 0,1ml vzorku + 10 ml MSRV tekuté půdy ↓ inkubace při 41,5 °C po dobu 24 hodin ( při negativním výsledku dalších 24 hodin) ↓ vyočkování
agar XLD
agar VRBL
↓
↓
inkubace při 37 °C po dobu 24 hodin
inkubace při 30 °C po dobu 24 hodin
Obr. 4 Schéma postupu zkoušky při průkazu Salmonela typhi (dle ČSN 6579)
4.2.3
Stanovení počtu mikroorganismu Bacillus cereus
Stanovení počtu mikroorganismu Bacillus cereus bylo provedeno podle ČSN ISO 7932. Tato norma specifikuje horizontální metodu stanovení počtu životaschopných presumptivních jako příslušníci druhu Bacillus ceseus a to technikou počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C.
Podstata zkoušky 1) Na povrch tuhé selektivní kultivační půdy v Petriho miskách jsem naočkovala 1ml zkušebního vzorku.
32
2) Naočkované plotny jsem inkubovala aerobně při 30 °C po dobu 18 hodin až 48 hodin 3) Počet Bacillus cereus v gramu nebo mililitru vzorku jsem vypočítala z počtu konfirmovaných kolonií vyrostlých na plotnách z ředění zvolených tak, aby poskytly platný výsledek.
Pro stanovení jsem použila žloutkový agar s chloridem sodným polymyxin-B sulfátem a trifenyltetrazolium chloridem a krevní agar. U žloutkového agaru s chloridem sodným polymyxin-B sulfátem a trifenyltetrazolium chloridem byly kolonie okrouhlé, červené, lesklé velikosti 2 - 3 mm, s prstencem bílého precipitátu. Při použití krevního agaru
vyrostly
kolonie velké, drsné, ploché,
s prstencem betahemolýzy.
Počítání kolonií Po ukončení inkubace jsem vybrala plotny, přednostně očkované dvěma po sobě následujícími ředěními, na nichž vyrostlo méně než 150 kolonií. Kolonie presumptivního Bacillus cereus jsem spočítala na každé z ploten zvlášť.
4.2.4
Stanovení koagulázo-pozitivních Stafylokoků
Stanovení počtu Staphylococcus aureus se provádí podle ČSN ISO 6888-1
Jako živnou půdu jsem používala Baird-Parkerův agar, slaný manitolový agar a krevní agar. U Baird-Parkerova agaru
vznikají typické kolonie drobné, černé, se zónou
projasnění. Při vzniku drobných černých kolonií, ale bez vzniku zóny projasnění jde o atypické kolonie. U slaného manitolového agaru vznikají žluté kolonie a u krevního agaru vzniká hemolýza. Teplota inkubace byla 35 - 37 °C po dobu 24 - 48 hodin.
4.2.5 Stanovení počtu Escherichia coli
Stanovení počtu Escherichia coli bylo provedeno podle ČSN ISO 16649-1. Tato norma specifikuje horizontální metodu stanovení počtu β-glukoronidázopozitivních Escherichia coli ve výrobcích určených k lidské výživě. Využívá techniku
33
počítání kolonií vykultivovaných při 44 °C na pevné půdě obsahující substrát pro průkaz enzymu β- glukoronidázy. Kmeny Escherichia coli, které nerostou při teplotě 44 °C a jsou β-glukoronidázonegativní nejsou touto metodou zjištěny.
Podstata zkoušky 1) Vždy souběžně do dvou Petriho misek jsem inokulovala 1 ml zkušebního vzorku. Inokulum jsem zalévala agarem s tryptonytem, žlučovými solemi a glukoronidem (agar TBX). Naočkované plotny jsem inkubovala po dobu 18 až 24 hodin při 44 °C a poté jsem zjišťovala přítomnost a počet kolonií, které se na základě svých znaků považují za kolonie β- glukoronidázopozitivních Escherichi coli. 2) Počet jednotek vytvářejících kolonie β- glukoronidázopozitivních Escherichia coli v mililitru nebo gramu vzorku jsem stanovila výpočtem.
Počítání polonií Po ukončení specifikované doby inkubace jsem spočítala typické kolonie β-glukoronidázopozitivních Escherichia coli, a to na každé plotně obsahující méně než 150 typických kolonií a méně než 300 všech kolonií (typických a atypických).
Jako živnou půdu jsem použila chromogenní agar s glukuronidem. Vzniklé kolonie způsobily pozitivní modré zbarvení. Inkubační teplota je 44 °C a doba inkubace byla 18 - 24 hodin.
4.2.5
Průkaz přítomnosti Listeria monocytogenes
Stanovení bylo provedeno podle ČSN ISO 11290-1. Tato norma specifikuje horizontální metodu průkazu Listeria monocytogenes ve výrobcích určených k lidské výživě.
Podstata zkoušky 1) Primární pomnožení v tekuté selektivní půdě sníženou koncentrací inhibičních složek (tzv . poloviční bujon podle Frasera).
34
Zkušební vzorek jsem inokulovala do tekuté selektivní půdy pro primární pomnožení, který obsahoval jeden objemový díl roztoku chloridu lithného a polovinu objemových dílů roztoku akriflavinu a roztoku kyseliny nalidixové. Tuto půdu jsem použila rovněž jako ředící roztok zkušebního vzorku. 2) Sekundární pomnožení v tekuté půdě s plnou koncentrací inhibičních složek. Kulturu získanou z primárního pomnožení jsem inokulovala v selektivní půdě pro sekundární pomnožení. Takto inokulovaný bujon dle Frasera jsem inkubovala při 35 °C nebo při 37 °C po dobu 48 hodin. 3) Kultury získané z primárního a sekundárního pomnožení jsem vyočkovala na 2 tuhé selektivní půdy a to na agar pro listerie podle Ottavianoho a Agostiho. Agar pro listerie podle Otttavianiho a Agostiho jsem inkubovala při 37 °C po dobu 24 hodin (v případě potřeby bylo možno dobu prodloužit o 24 hodin). Poté jsem zjišťovala přítomnost charakteristických kolonií suspektních jako kolonie L. monocytogenes. Za pozitivní kolonie L.monocytogenes se považovaly modrozelené kolonie obklopené neprůhlednou zónou. Některé kmeny mohou vytvářet velmi slabou zónu či ji nevytvářet vůbec.
35
zkušební vzorek + selektivní půda pro primární pomnožení (poloviční bujon dle Frasera) ↓ inkubace při 30 C°po dobu 24 h
0,1 ml kultury v 10 ml sekundární půdy
vyočkování
↓ inkubace při 35 °C,nebo 35 °C po dobu 48 hodin ↓ agar pro listerie podle Ottaviho a Agostiho
agar pro listerie podle Ottaviho a Agostiho
vyočkování
inkubace agaru pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho při 37 °C po dobu 24 hodin, v případě potřeby dalších 24 hodin ↓ inkubace druhé 2 selektivní půdy podle výběru
Obr. 5 Schéma postupu zkoušky při průkazu Listeria monocytogenes dle ČSN 11290
4.2.7 Stanovení kvasinek a plísní Stanovení kvasinek a plísní bylo provedeno podle ČSN ISO 6611 Tato norma určuje všeobecné pokyny pro stanovení počtu životaschopných kvasinek a plísní ve výrobcích určených pro lidskou výživu. Kvasinky a plísně jsou mikroorganismy, které při 25 °C tvoří kolonie v selektivní půdě za specifikovaných podmínek. Podstata zkoušky 1) 1 ml připraveného zředěného vzorku jsem inokulovala na Petriho misku. Inokulum jsem zalila určenou selektivní kultivační půdou. Jako živnou půdu jsem použila půdu
36
s kvasničným extraktem, glukózou a oxyteracyklinem (lze používat i
půdu
s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem). Inkubační teplota byla 25 °C a vzorek se inkuboval 5 dní.
2) Počet kvasinek a plísní v gramu nebo mililitru vzorku jsem stanovila z počtů kolonií vyrostlých na plotnách z ředění zvolených tak, aby počty těchto kolonií poskytly hodnotitelný výsledek. Výpočet jsem provedla stejně jako v kapitole 4.2.2 (strana 33).
4.2.8 Stanovení mezofilních aerobních a anaerobních sporotvorných mikroorganismů
Stanovení mezofilních aerobních sporotvorných mikroorganizmů Vzorek jsem kultivovala za aerobních podmínek po usmrcení nesporulujících mikroorganismů zahřátím na 85 °C po dobu 10 minut. Metodou jsem prokázala počet živých spor, které by byly schopny vyklíčit a tvořit kolonie. Jako živnou půdu jsem použila Plate Count Agar (další možnost by byl agar s glukózou, tryptonem a kvasničným extraktem). Inkubace vzorku probíhala při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin. Za pozitivní výsledek byl považován vznik kolonií.
Stanovení mezofilních anaerobních sporotvorných mikroorganizmů Stanovení přítomnosti anaerobních sporotvorných mikroorganismů jsem prováděla Weinzirlovým testem. Do připravených zkumavek s 10 ml živné půdy
jsem
napipetovala 10 ml vzorku. Jako živnou půdu jsem použila želatinový agar ( nebo sterilní mléko). Zkumavku jsem zazátkovala a nechala zahřát na teplotu 85 °C po dobu 10 minut. Vychlazenou zkumavku jsem nechala inkubovat 5 dní při teplotě 37 °C. Za pozitivní výsledek se považovalo vytlačení parafínové zátky do různé výše zkumavky.
Mikrobiologické
požadavky
na
mikroorganismy
(dle
zpracovatele) Koliformní bakterie: Počet koliformních bakterií 1 g vzorku musí být negativní. Plísně: Norma nepřipouští výskyt plísní v 1 g vzorku.
37
normy
Stapfylococcus aureus: V 1 g vzorku nesmí být zjištěn výskyt tohoto mikroorganismu. Listeria monocytogenes: Průkaz Listeria monocytogenes v 25 g vzorku musí být negativní. Baktérie rodu Salmonela: Vzorek nesmí v 25 g obsahovat tuto baktérii. Escherichia coli: Výskyt Escherichia coli v 1 g musí být negativní. Bacillus cereus: Výskyt tohoto mikroorganismu musí být v 1 g vzorku negativní. Kvasinky: Výskyt kvasinek ve vzorku by měl být méně než 10 KTJ/g Mezofilní mikrokoky aerobní sporotvorné: Výskyt by měl být méně než 100 KTJ/g. Mezofilní mikrokoky anaerobní sporotvorné: V 1 g vzorku musí být výskyt negativní
4.3 Statistické vyjádření výsledků Výsledky byly statisticky vyhodnoceny pomocí programu Microsoft Excel. U kvasinek a Geotrichum candidum byla použita základní statistická charakteristika průměr a směrodatná chyba průměru a pro průkazný rozdíl mezi vzorky byl použit Dunkenův test. U ostatních mikroorganizmů byla použita metoda mediánu. Medián je odhad středních hodnot, proto lze posuzovat statistickou průkaznost u vzorků bez vyjádření směrodatné chyby.
5. VÝSLEDKY A DISKUZE K mikrobiologickému rozboru byl použit průmyslový tvaroh od osmi výrobců dodaný zpracovatelem, který jej používá pro výrobu kyselých sýrů. Vzorky průmyslového tvarohu byly sledovány po dobu 12 měsíců.
U každého vzorku byl vždy sledován počet kvasinek a plísní, koagulázo-pozitivních Stafylokoků bakterií rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, Geotrichum candidum, koliformních bakterií, mezofilních aerobních a anaerobních bakterií, Escherichia coli a Bacillus cereus.
38
5.1 Vliv výrobce na počet a výskyt sledovaných mikroorganizmů
5.1.1 Vliv výrobce na počet kvasinek
K vyhodnocení byly brány průměry zjištěných hodnot za celý rok. Žádný výrobce podle normy nepřekročil limit pro počet kvasinek a to 10 log KTJ g-1. Nejvyšší průměrný počet kvasinek byl zjištěn u výrobce č. 7 a to 8,17 log KTJ g -1. Nejnižší průměrný počet kvasinek byl zjištěn u výrobce č. 1 a to 3,01 log KTJ g-1.
počet kvasinek (log KTJ g-1)
9
A,B
A
A,B
A,B
3
4
5
6
8 7
B
6 5
B
4 3 2 1 0 1
2
7
8
výrobci
Obr.6 Porovnání počtu kvasinek u jednotlivých výrobců za celé sledované období (průměry označeny A,B se průkazně liší (P < 0,05) ), u výrobce č. 7 a 8 nemohlo být provedeno statistické vyhodnocení ( n=1)
Zvýšená výskyt kvasinek u výrobce č. 4 svědčí o tom, že výrobce zřejmě nedodržel správnou výrobní praxi a hygienu při výrobě průmyslového tvarohu. Proto u něj byl zjištěn vyšší počet kvasinek oproti výrobcům č. 1 a 2. Tvaroh mohl být kontaminován buď z nářadí a nebo se počet kvasinek zvýšil při nesprávném skladování již vyrobené suroviny (Görner, Valík, 2004) .
Podle Šilhánkové (2002) kvasinky rostou v širokém rozmezí teplot 0 – 48 °C, proto je při výrobě
v širokém rozmezí
průmyslového tvarohu důležité i dodržení
správných teplot během přepravy k odběrateli.
39
V potravinářství mají kvasinky význam pozitivní ale i negativní. Kvasinky mohou být původci kažení potravin a také jsou indikátorem mikrobiologické Jakosti potravin. Kvasinky se vyznačují významnou proteolytickou, lipolitickou a sacharolitickou činností, malou náročností na složení živin, oproti bakteriím mají menší nároky na přítomnost vody (rostou při nižší aktivitě vody ) a mají zpravidla nižší optimální růstové teloty a někdi značnou termorezistenci (Jesenská, 1987).
V kyselých mléčných produktech z hlediska primární a sekundární kontaminace kvasinky nahrazují indikátorovou úlohu koliformních bakterií, které v kyselém prostředí nerostou. Růst a metabolizmus kvasinek v průmyslovém tvarohu způsobuje nežádoucí senzorické změny jako nečistou, hnilobnou, žluklou, ovocnou a kvasničnou chuť a vůni (Görner, Valík, 2004).
5.1.2 Vliv výrobce na počet Geotrichum candidum
K vyhodnocení byly brány průměry zjištěných hodnot za celý rok. Nejvyšší ( P < 0,05) počet Geotrichum candidum byl zaznamenám u výrobce č. 7 a to 7,3 log KTJ g -1. Nejnižší počet u Geotrichum candidum byl zaznamenán u výrobce č. 3 a to 1,24 log KTJ g-1. Trend v nejnižším počtu Geotrichum candidum byl u výrobce č. 8.
počet G.candidum ( log KTJ g-1)
9
B
8 7
A
6
A
5
A
4
A A
A
3
4
3 2 1 0 1
2
5
6
7
8
Obr.7 Porovnání výrobců v počtu Geotrichum candidum za celé sledovan období (A,B = průměry označeny různými písmeny se průkazně (P < 0,05 liší )), u výrobce č. 8 byl dodán pouze jeden vzorek a proto nemohlo být provedeno statistické vyhodnocení.
40
Geotichum candidum se v mlékařkém průmyslu označuje jako mléčná plíseň. Je indikátorem nedostatečné úrovně čistoty při výrobě potravinářských surovin. Původně se pro kmene tohoto druhu používal název Oidium lactis. Kontaminované zařízení má osobitý charakteristický zápach. Sliz se zachytává na povrchu dřeva, gumy i kovech. V případě výskytu je potřeba veškeré lokality vyčistit, aby nedošlo k přenosu na vyráběnou potravinu. Povlak má bílou barvu a je přilnavý k povrchu na kterém se objeví. Při silné a řádné sanitaci se výrazně sníží počet zárodků této plísně. Při zanedbání sanitace se již za 17 dnů může počet zárodků zvýšit až 20x (Jesenská, 1987). U výrobce č.7 došlo k výraznému pomnožení Getrichim candidum oproti ostatním výrobcům. Pravděodobně byla nedodržena správná sanitace a hygiena při výrobě průmyslového tvarohu. Nejpravděpodobněji mohl být tvaroh kontaminován výrobním nářadím a zařízením jak uvádí Görner a Valík. Na
starším tvarohu tvoří povlaky, vytváří zvrásněný povrch, nebo jemný povlak.
V potravinářství se může vyskytovat také na povrchu nedostatečně ošetřených potravinářských stojů (Görner, Valík, 2004).
5.1.3 Vliv výrobce na počet mezofilních sporotvorných aerobních a anaerobních mikroorganizmů
K vyhodnocení byly brány naměřené
hodnoty
z nichž byla vytvořena funkce
mediánu. Podle normy zpracovatele by výskyt aerobních mikroorganizmů neměl být vyšší než 100 KTJ g-1 a anaerobních mikroorganizmů by v 1 g vzorku neměl být počet více než 10 KTJ g-1. U výrobce č. 2,3,4,5 a 8 byl zjištěn zvýšený počet mezofilních aerobních sporotvorných mikroorganizmů, ale normu nepřekročil. U výrobce č. 7 byl zvýšený počet anaerobních sporotvorných mikroorganizmů (méně než 100) a to nad limit normy zpracovatele.
41
počet mikroorganizmů (log KTJ g -1)
2,5 2 1,5
aerobní MO anaerobní MO
1 0,5 0 1
2
3
4
5
6
7
8
výrobci
Obr.8 Počet aerobních a anaerobních mikroorganizmů u jednotlivých výrobců.
Mezofilní mikroorganizmy mají optimální růst při 30 až 40 °C, což poukazuje na nedostatečné zchlazení tvarohu při výrobě a nebo nesprávnému skladování (zvýšená teplota). Přítomnost a počet aerobních sporotvorných bakterií (AES) indikuje stupeň primární kontaminace a sekundární kontaminace surovin, poživatin a předmětů používaných při výrobě potravin. Vyšší počet aerobních mikroorganizmů může být způsoben přenosem spór zvýšený počet také
z vnějšího prostředí například vzduchem, prachem. Jejich bývá u potravin tepelně upravovaných (terminovaných,
pasterizovaných), které byly delší čas uchovávány bez náležitého zchlazení. Většina AES má významné proteolytické vlastnosti, proto je možné z jejich počtu v potravinách sledovat skladovatelnost (Salyers, 2001).
Anaerobní sporotvorné baktérie (ANS) nejsou v potravinářství všeobecné vítané. Spóry ANS na rozdíl od vegetativních forem snáší vzdušný kyslík dobře, bez omezení schopnosti klíčit a měnit se ve vegetativní formy. Jejich antagonistou jsou bakterie mléčného kvašení se pro nedostatek zkvasitelných sacharidů pomalu a nebo vůbec nemnoží a neprodukují mikrobicidní kyselinu mléčnou (Görner, Valík, 2004).
42
5.1.4 Vliv výrobce na počet koliformních bakterií U všech výrobců byl počet koliformních bakterií menší než 10 KTJ g-1, což odpovídá
počet koliformních bakterií (log KTJ g-1)
normě zpracovatele.
1,5
1
0,5
0 1
2
3
4
5
6
7
8
výrobci
Obr. 9 Poet koliformních bakterií u jednotlivých výrobců za celou dobu sledování
Počet koliformních bakterií
v potravinách se hodnotí jako indikátor
zachování
správných technologických postupů, zpracování a případně chlazení surovin, dále k ověření čistění a dekontaminace technologického nářadí a zařízení. Všichni výrobci tedy dodrželi správné technologické postupy a řádnou sanitaci a hygienu. Koliformní bakterie jsou termolabilní, v potravinářství slouží jako indikátor spolehlivé pasterace mléka. V mléku a mléčných výrobcích, mléčných surovinách je určité množství koliformních bakterií běžnou součástí mikroflóry (Görner, Valík, 2004).
43
5.1.5 Vliv výrobce na počet plísní
U všech výrobců
byl počet plísní menší než 10 KTJ g-1 což odpovídá normě
zpracova
počet plísní (log KTJ g-1)
1,5
1
0,5
0 1
2
3
4
5
6
7
8
výrobci
Obr.10 Počet plísní u jednotlivých výrobců za celou dobu sledování
Plísně nejčastěji kontaminují průmyslový tvaroh z vnějšího prostředí (Görner, Valík, 2004). Zdrojem bývá cirkulovaný vzduch přiváděný do provozu ventilací. Dalším možností kontaminace je nářadí a zařízení. Plísně jsou z potravinářsko technologického hlediska organizmy, které tvoří na potravinách a zařízeních
povlaky (viditelné
mycelium) složené z jednotlivých vláken (Görner, Valík, 2004).
5.2 Vliv ročního období na počet a výskyt sledovaných mikroorganizmů 5.2.1 Vliv ročního období na počet kvasinek
K vyhodnocení byly brány průměry naměřených hodnot obdobích. Nejnižší
v jednotlivých ročních
počet kvasinek byl zjištěn v I.čtvrtletí a to 4.01 log KTJ g-1.
Nejvyšší počet kvasinek byl zjištěn ve III. čtvrtletí a to 6,85 log KTJ g-1.
44
počet kvasinek (log KTJ g-1)
10 9
A
A
II.čtvrletí
III.čtvrletí
A,B
8 7
B
6 5 4 3 2 1 0 I.čtvrletí
IV.čtvrletí
výrobci
Obr. 9 Počet
kvasinek v jednotlivých ročních obdobích, A,B = průměry označeny
různými písmeny se průkazně liší (P < 0,05).
Z obrázku 9 lze vidět, že nejnižší počet kvasinek byl zjištěn v prvním čtvrtletí tedy v měsících leden, únor a březen a to 4,01 log KTJ g-1. Vliv vnějšího faktoru teploty (následné zvyšování teploty v dalších měsících) podpořil výskyt kvasinek. Kvasinky se mohly do výroby dostat z vnějšího prostředí. Jako nejčastější zdroj uvádí Görner a Valík (2004) nářadí a zařízení používané při jeho výrobě, vodu používanou v provozu a kontaminovaný vzduch. Teploty, při nichž mohou kvasinky růst jsou v rozmezí asi -2 °C až 48 °C. Psychrofilní kvasinky, pomnožující se při teplotách -2 °C až 20 °C, se nemnoží při teplotách vyšších (např. druhy rodu Candida). Naprostá většina kvasinek patří mezi mezofilní (růst a množení při teplotách 0 až 48 °C). Termofilní kvasinky se nemnoží při teplotách nižších než 20 °C. Maximální teplota, při které některé kvasinky přežívají, se pohybuje kolem 57 až 59 °C (Janderová, 1999)
Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík. Mají ale schopnost přeměnit svůj metabolizmus za anaerobních podmínek na fermentační (Janderová, 1999).
45
5.2.2 Vliv ročního období na počet plísně Geotrichum candidum
K vyhodnocení byly brány průměry naměřených hodnot
v jednotlivých ročních
obdobích. Trend nejvyššího počtu Geotrichum candidum byl zaznamenán v II. čtvrtletí.
počet G.candidum (log KTJ g-1)
6 A 5 A 4 A 3 A 2 1 0 I.čtvrletí
II.čtvrletí
III.čtvrletí
IV.čtvrletí
Obr. 10 Počet Geotrichm candidum v jednotvilých ročních obdobích, A = průměry označeny písmem A se průkazně neliší (P < 0,05 ).
Optimální teplota pro růst Geotrichum candidum je 28 °C, ale plíseň se může rozmnožovat i při teplotě 4 až 38 °C. Je potřeba dbát na správnou hygienu a sanitaci během těchto i následujících měsíců (Jesenská, 1987). Tvaroh může být kontaminován výrobním nářadím a zařízením (Görner, Valík, 2004) a je indikátorem nedostatečné úrovně čistoty při výrobě potravinářských surovin.
5.2.3 Vliv ročního období na počet na počet mezofilních aerobních a anaerobních mikroorganizmů
K vyhodnocení byly použity naměřené
hodnoty a jejich medián. U anaerobních
mikroorganizmů byl zjištěn počet > 100 KTJ v g-1 v II, III i IV. čtvrtletí. Podle normy zpracovatele by počet anaerobních mikroorganizmů neměl překročit více jak 10 KTJ v g-1.
46
počet MO (log KTJ g-1)
2,5 2 1,5
mezofilní AES mezofilní ANS
1 0,5 0 I č tvrtletí
II č tvrtletí
III č tvrtletí
IV č tvrtletí
Obr.č 11 Porovnání počtu mezováních aerobních a anaerobních mikroorganizmů za rok
Z obrázku 11 vypívá, že v
II, III i IV čtvrtletí byl zvýšený počet mezofilních
anaerobních mikroorganizmů. Zvýšený nárůst
mohl být způsoben nedostatečným
zchlazením vyrobené suroviny, nedodržení správné teploty během přepravy a nedodržení skladovacích teplot. Mezofilní mikroorganizmy mají své růstové optimum v 30-40 °C (Görner, Valík, 2004), lze tedy předpokládat jejich zvýšený počet v letních obdobích. K vnějším faktorům ovlivňující růst a množení bakterií patří teplota vlhkost, složení atmosféry (O2, N2, CO2), přístup světla (Komprda, 2004). Mikroorganizmy jsou schopny se přizpůsobit vnějším podmínkám. Stanovení minimální teploty pro růst mikroorganizmů je poměrně obtížné, neboť s klesající teplotou klesá postupně i rychlost rozmnožování (Šilhánková, 1995).
47
5.2.3 Vliv ročního na počet koliformních bakterií
Při stanovení počtu koliformních bakterií v jednotlivých období nebyl zjištěný vliv období na celkový počet. Limit pro počet koliformních mikroorganizmů daný normou
počet koliformních mikroorganizmů (log KTJ g-1)
zpracovatele nebyl překročen v žádném období.
1,5
1
0,5
0 I.č tvrletí
II.tvrletí
III.tvrletí
IV.tvrletí
Obr.č 12 Počet koliformních bakterií v jednotlivých obdobích roku
Koliformní bakterie jsou převážně příslušníci rodu Enterobacteriaceae. Optimální teplota pro jejich růst je 30 – 37 °C (Burdychová a Sládková, 2007). Jejich původním výskytem je dolní část zažívacího traktu teplokrevných živočichů, kde jsou součástí jejich střevní mikroflóry. Odtud se dostávají do vnějšího prostředí, přizpůsobují se změněných podmínkám a podle druhu v něm kráktodobě nebo dlouhodobě přežívají (Görner, Valík, 2004).
48
5.2.3 Vliv ročního na počet plísní
Při stanovení počtu plísní v jednotlivých období nebyl zjištěný vliv období na jejich počet. Limit pro počet plísní daný normou zpracovatele nebyl překročen v žádném období.
počet plísní(log KTJ g-1)
1,5
1
0,5
0 I.čtvrletí
II.tvrletí
III.tvrletí
IV.tvrletí
Obr.č 13 Počet plísní v jednotlivých období roku
Plísně nejčastěji kontaminují průmyslový tvaroh z vnějšího prostředí (Görner, Valík, 2004). Zdrojem bývá cirkulovaný vzduch přiváděný do provozu ventilací. Dalším možností kontaminace je nářadí a zařízení.
Optimální teplota pro růst plísní
(Burdychová, Sládková, 2007) je kolem 25 °C. Některé plísně ale mohou růst i při teplotě -10 °C ( Šilhánková, 2002). Plísně jsou z potravinářsko technologického hlediska organizmy, které tvoří na potravinách a zařízeních povlaky (viditelné mycelium) složené z jednotlivých vláken (Görner, Valík, 2004).
49
6 ZÁVĚR Tématem předložené diplomové práce bylo sledování mikrobiálních ukazatelů u průmyslového tvarohu. Byly sledovány vzorky průmyslového tvarohu od osmi různých dodavatelů v průběhu 12 měsíců. U každého vzorku byl sledován počet kvasinek, výskyt plísně Geotrichum candidum, počet jiných plísní, koagulázo-pozitivních Stafylokoků, bakterií rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, koliformních baktérií, mezofilních sporotvorných
aerobních a anaerobních baktérií, Escherichia coli a
Bacillus cereus. Cílem této práce bylo zjistit jaký vliv má roční období na počet a výskyt sledovaných mikroorganizmů a
jak se podílí samotný výrobce na výslednou mikrobiologickou
jakost průmyslového tvarohu. Počet kvasinek
byl zvýšený
u některých výrobců. Zjištěné hodnoty kvasinek u
žádného výrobce nepřekročily limit daný normou zpracovatele. Při sledování vnějších vlivů (teploty) byl snížený počet kvasinek v I. čtvrtletí, tedy v méně příznivějších podmínkách pro růst kvasinek. U G.candidum byl průkazně zjištěn zvýšený počet u výrobce č.7. Při sledování vnějších vlivů (teploty) nebyl zjištěný průkazný rozdíl mezi jednotlivými ročními obdobími. Bakterie rodu Salmonella, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus a koagulázo-pozitivní Stafylokoky nebyly ve vzorku prokázány. Koliformní bakterie a jiné plísně byly ve vzorcích prokázány, ale nebyl zjištěn vliv výrobce na jejich případný zvýšený počet. Také nebyl prokázán vliv ročního období na jejich růst. U výrobce č. 7 byl zjištěn zvýšený počet mezofilních sporotvorných anaerobní a byl překročen limit daný normou zpracovatele. Při porovnání počtu mezofilních aerobních mikroorganizmů byl zvýšený počet u výrobců č. 2,3,4,5, a 8. Limit daný nornou zpracovatele pro mezofilní aerobní sporotvorné mikroorganizmy nebyl překročen. Při porovnání počtu mezofilních mikroorganizmů v jednotlivých ročních období byl zjištěn zvýšený počet mezofilních sporotvorných aerobních mikroorganizmů v II, III a IV čtvrtletí a opět překročen limit daný normou zpracovatele. Při výrobě průmyslového tvarohu je tedy nezbytné dodržovat správnou hygienickou a výrobní praxi, provádět důslednou sanitaci zařízení a technického vybavení potřebného k výrobě. Další složkou je kontrola teplot v celém průběhu výroby, správné zchlazení
50
suroviny před skladováním, kontrola teploty během skladování a dodržení tepot během expedice a přepravy.
51
7 SEZNAM LITERATURY BURDYCHOVÁ, - SLÁDKOVÁ, P.: Mikrobiologická analýza potravin, MZLU v Brně, expediční středisko, 2007, 218 stran, ISNB 978-80-7375116-6 ČSN ISO – 6611 Stanovení kvasinek a plísní tvořící kolonie ČSN ISO – Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes ČSN ISO – 16649-1 Horizontální metoda stanovení počtu β-glukoronidázopozitivních Escherichia coli ČSN ISO – 7931 Mikrobiologie potravin a krmiv- Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus ČSN ISO –6579 Horizontální metoda průkazu baktérií rodu Salmonella ČSN ISO –5541-1 Stanovení počtu koliformních baktérií ČSN ISO – 6888-1 Horizintální metoda počítání koagulázo pozitivních stafylokoků DRBOHLAV, J – VODIČKOVÁ, M.: Tabulky látkového složení mléka a mléčných výrobků, ÚZPI Praha 2001 FOX, P – Mc SWEENEY, P – COGAN, T – GUINEE, T.: Cheese chmistry, Physics and Mikrobiology.1 General Aspekt, 2004, 431 stran FORSYTHE, S.J.: The mikrobiology of safe food, Sci. At Nottingham university, 2000, 412 stran GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II. MZLU v Brně, expediční středisko, 1998, 142 stran, ISBN 80-717-342-6 GAJDŮŠEK, S.: Mlékařství II (cvičení). MZLU v Brně, expediční středisko, 1999, 92 stran, ISBN 80-7157-278-0 GUNASEKARAN, S.:Cheese Gheology and texture. Neumet AK, 1957, 429 stran
52
GOLDEN, D.: Modern Food Mikrobiology. University of Tenesee, 2003, 203 stran GÖRNER, F. – VALÍK, L´.: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. Bratislava. Malé centrum, 2004, 528 stran,ISBN 80-967064-9-7 HAMPL, B.: Potravinářská mikrobiologie.SNTL, Praha, 1968, 276 stran JAY, J., M., LOESSNER . M., J., GOLDEN. D., A. Modern food microbiology. 7. vydání. New York: Springer. 2005. 790 s. Food science text series. ISBN 0-387-23180-3. JANDEROVÁ, B – BENDOVÁ, O.: Úvod do biologie kvasinek. Karolinum Praha, 1999, ASBN 80-7184-990-1, 108 stran JIČÍNSKÁ, E – HAVLOVÁ, J.: Metody detekce mikroorganizmů v potravinách. ÚZPI Praha 1996, 115 stran
patogenních
JESENSKÁ, Z.: Mikroskopické houby v poživatinách a v krmivech. ALFA Bratislava, 1987, 320 stran KLABAN, V.: Svět mikrobů. Gaudeamus, Hradec králové,1993, 303 stan KŇEZ, V.: Výroba sýrů. Praha, SNTL, 1960 KOMPRDA, T.: Hygiena potravin. MZLU v Brně, expediční středisko, 1997, 180 stran, ISBN 80-7157-276-4 LUKÁŠOVÁ, J a kol.: Hygiena a technologie mléčných výrobků. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2001, 180 stran, ISBN 807305-415-9 NAŘÍZENÍ EK 2073/ 2005 pro mléko a mléčné výrobky PAVELKA, A.: Mléčné výrobky pro Vaše zdraví. Litera, 1996 PODNIKOVÁ NORMA A.W – OS- 704 SALYERS, A., WHIT, D.: Mikrobiology: diversiti, discase and the enviroment Fizgerald Science Press. Inc., ISB 1-891786-01-6, 608 stran
53
SIMEONOVOVÁ, J. – INGR, I. – GAJDŮŠEK, S.: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů. MZLU v Brně, expediční středisko, 2004, 124 stran STIPZER, G. – ZÁMEČNÍK, A.: Hygiena a technológia potravin. Bratislava, 1990, 236 stran STRMISKA, J . a kol.: Výroba tvarohu a tvarohových specialit. Nové technologie. Praha. SNTL, 1991 ŠILHÁNKOVÁ L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia Praha, 2002, 363 stan, ISBN 80-200-1024-6 VASSILA, E., BADEKA, A., KONDYLI, E., SAVVADIS, I.: Chemical and mikrobiologacal changes in fluid milch as affected by packaging conditions. International Dairy Journa,. 2001 VELÍŠEK, J.: Chemie potravin I. Tábor, OSSIS, 2002, 344 stran, ISBN 8086659-003 Vyhláška MZe č. 77/2003. Sb.: Požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mléčné výrobky, mražené krémy jedlé tuky a oleje www. SZPI.cz ŽIŽKA, B., KORBELOVÁ, M.: Mikrobiologei I, Praha, 1992, 195 stran
54
8 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1 Schéma výroby průmyslového tvarohu dvoutepelnám způsobem Obrázek 2 Schéma výroby průmyslového tvarohu jedntepelným způsoem Obrázek 3 Schéma výroby průmyslového tvarou termofilním způsobem Obrázek 4 Schéma ostupu zkoušky při průkazu Salmonelli typhi Obrázek 5 Schéma postupu zkoušky při průkazu Listeria monocytogenes Obrázek 6 Porovnání výrobců v počtu kvasinek Obrázek 7 Porovnání výrobců v počtu Geotrichum candidum Obrázek 8 Porovnání výrobců v počtu vybraných mikroorganizmů Obrázek 9 Porovnání počtu kvasinek za rok Obrázek 10 Porovnání počtu Geotrichum candidum za rok Obrázek 11 Porovnání počtu vybraných mkroorganizmů za rok Obrázek 12 Salmonella enterica ssp. entericia Obrázek 12 Bacillus cereus Obrázek 13 Staphylococcus aureus ssp.aureus Obrázek 14 Escherichia coli Obrázek 15 Escherichai coli Endův agar
55
9 SEZNAM PŘÍLOH Příloha č. 1 Fotografie mikroorganizmů
56
Příloha č. 1 Fotografie mikroorganizmů
Obr.12 Salmonella enterica ssp.entericia serovar Enteritidis CCM 4420 MC Conkey agar 37 °C m 24 hodin kultivace
Obr.13 Bacillus cereus CCM 2010 Masopeptonový agar, 24 hodin kultivace
57
Obr.14 Staphylococcus aureus ssp.aureus CCM 885 Masopeptonový agar, 48 hodin kult
Obr.15 Escherichia coli CCM 5172 Médium 1, 37 °C, 24 hodin kultivace
58
