Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Název bakalářské práce Hodnocení výtěžnosti bioetanolu při uplatnění různých postupů přípravy a zcukřování obilných rmutů
Vedoucí bakalářské práce:
Vypracoval:
Dr. Ing. Luděk Hřivna
Pavel Šťastný Brno 2008
1
2
3
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma „Hodnocení výtěžnosti bioetanolu při uplatnění různých postupů přípravy a zcukřování obilných rmutů“, vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
V Brně dne 12.5. 2008 Podpis diplomanta
4
PODĚKOVÁNÍ
Mé poděkování patří především mému vedoucímu bakalářské práce Dr. Ing. Luďku Hřivnovi za pomoc při tvorbě mé práce. Dále chci poděkovat Dr. Ing. Tomášovi Gregorovi za pomoc v laboratoři, a také mým rodičům, bez nichž by tato práce nemohla vzniknout.
5
Abstrakt
Tato práce se zabývá problematikou výroby bioetanolu. Je zde vypracováno využití různých surovin pro danou výrobu a jsou zde popsány různé technologie výroby. V praktické části se tato práce zabývá posouzením průběhu ztekucování a zcukřováním zápary pomocí kombinace třech specifických enzymů: Optimash – XL, spezyme – ethyl a
fermenzyme – ethyl s následným vyhodnocením výtěžnosti.
V pokusech bylo dokázáno, že tyto enzymy jsou vhodné pro přípravu sladkých zápar. Výtěžnost bioetanolu byla 32,9 la/100 kg sušiny, což je průměrný výsledek.
Abstract:
This thesis deals with bioethanol production. It provides an analysis of various raw materials utilized for bioethanol production, as well as a description of a number of the production technologies. The second and practical, part of the thesis is concerned primarily with one main issue. The issue studied evaluates the utilizing a combination of three specific enzymes: Optimash – XL, spezyme – ethyl a
fermenzyme – ethyl.
The experimentes have proved , that the enzymes are suitable for preparation of sweet solutions. The bioethanol extraction was 32,9 la/100 kg of dry mass, what is average issue.
Klíčová slova:
Keys words
bioetanol
bioethanol
suroviny
raw materials
obiloviny
cereals
enzymy
enyzmes
kvašení
fermentation
6
Seznam tabulek, obrázků a grafů
Tab. 1 Obsah monosacharidů a dalších cukrů v ovoci Tab. 2 Složení bramborové hlízy Tab. 3 Průměrné výnosy plodin a náklady na produkci lihu z jednotlivých plodin Tab. 4 Technologické znaky pro pšenici a tritikale Tab. 5 Obsah škrobu ve významných obilninách pro výrobu bioetanolu Tab. 6 Teploty mazovatění (želatinace) Tab. 7 Závislost barevné reakce roztoku jodu na délce amylosového řetězce Tab. 8 Bílkoviny obilovin a jejich složení Tab. 9 Působení enzymů používaných pro zcukřování škrobu Tab. 10 Složení výpalků Tab. 11 Dávkování enzymů a optimální podmínky ztekucování a zcukřování škrobu Tab. 12 Mechanické vlastnosti a chemické složení zrna pšenice Eurofit Tab. 13 Absolutní hodnoty obsahu sacharidů v průběhu přípravy zápary
Obr. 1 Působení α-amylázy Obr. 2 Působení β- amylázy Obr. 3 Působení glukoamylázy Obr. 4 Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy Obr. 5 Kvašení glukózy v alkalickém prostředí (Neubergovo schéma) Obr. 6 Buňka kvasinek Obr. 7 Kvasné křivky kvašení zápar
Graf č. 1 Odbourávání oligosacharidů Graf č. 2 Odbourávání maltotriózy Graf č. 3 Odbourávání maltózy Graf č. 4 Odbourávání glukózy
7
OBSAH
1.0 ÚVOD
11
2.0 LITERÁRNÍ PŘEHLED
12
2.1 Bioetanol a jeho produkce v ČR
12
2.2 Suroviny využitelné pro výrobu bioetanolu
12
2.2.1 Suroviny cukernaté
12
2.2.1.1 Ovoce
13
2.2.1.2 Cukrovka
13
2.2.1.3 Cukrová třtina
13
2.2.1.4 Melasa
14
2.2.1.5 Dextroner
14
2.2.1.6 Surový cukr
14
2.2.2 Škrobnaté suroviny
15
2.2.2.1 Brambory
15
2.2.2.2 Pšenice
16
2.2.2.3 Žito
16
2.2.2.4 Oves
16
2.2.2.5 Ječmen
16
2.2.2.6 Kukuřice
17
2.2.2.7 Tritikale
17
2.2.3 Lignocelulózové suroviny
17
2.3 Obiloviny jako surovina pro výrobu bioetanolu
18
2.3.1 Morfologická skladba zrna
19
2.3.1.1 Endosperm
19
2.3.1.2 Obalové vrstvy
19
2.3.1.3 Klíček
20
2.3.2 Chemické složení zrna
20
2.3.2.1 Voda
20
2.3.2.2 Sacharidy
20
2.3.2.3 Bílkoviny
22
8
2.3.2.4 Tuky
23
2.3.2.5 Minerální látky
23
2.3.2.6 Vitaminy
23
2.4 Výroba obilných zápar
23
2.4.1 Enzymy používané k zcukření polysacharidů obilného zrna
24
2.5 Prokvášení zápar
27
2.5.1 Mechanismus etanolového kvašení
27
2.5.2 Kvasinky v kvasném průmyslu
29
2.5.2.1 Morfologie a cytologie kvasinek
29
2.5.2.2 Chemické složení kvasinek
30
2.5.2.3 Výživa kvasinek
31
2.5.2.4 Činitelé ovlivňující činnost kvasinek
31
2.6 Průmyslová výroba lihu z obilovin
32
2.6.1 Příprava sladké zápary
32
2.6.2 Zakvašování a kvašení sladké zápary
32
2.6.3 Destilace zralé zápary
33
2.7 Produkty lihovarského průmyslu
34
2.8 Laboratorní kvasná zkouška
34
3.0 CÍL PRÁCE
35
4.0 MATERIÁL A METODIKA
36
4.1 Materiál
36
4.1.1 Charakteristika použité odrůdy pšenice
36
4.1.2 Charakterizace použitých enzymů
36
4.1.3 Kvasinky
37
4.2 Metodika
37
4.2.1 Rozbor zrna
37
4.2.2 Příprava zápary
38
4.2.3 Kvasná zkouška
39
4.3 Vyhodnocení výsledků
39
9
5.0 VÝSLEDKY A DISKUSE
40
5.1 Vyhodnocení kvality použité suroviny
40
5.2 Vyhodnocení průběhu zcukřování zápar
41
5.3 Vyhodnocení výtěžnosti
46
6.0 ZÁVĚR
47
7.0 LITERATURA
48
10
1.0 ÚVOD Výrobu lihových nápojů (víno, pivo) znali již staří Egypťané, od nichž se rozšířila do celého světa. Nicméně se nevědělo až do konce 17. století, z jakých látek etanol vzniká a jak probíhá jeho tvorba. Až koncem 17. století zjistil Becher, že alkoholické kvašení probíhá pouze ve sladkých tekutinách. Objasnit tvorbu alkoholu se podařilo až počátkem 19. století Gay – Lussakovi. U nás se etanol začal ve větším množství produkovat začátkem 19. století a to z brambor, později s rozvojem cukrovarnictví také z melasy, která měla vliv na vznik průmyslového lihovarnictví. Nejvyšší rozmach průmyslové výroby lihu v tehdejším Československu byl ve třicátých letech, kdy bylo zavedeno povinné mísení lihu s pohonnými hmotami. V posledním desetiletí naší doby dochází nejen u nás, ale i ve světě k rozvoji lihovarnického průmyslů a to z důvodu výroby bioetanolu, který má postupem času nahradit vyčerpatelná fosilní paliva. Další výhodou výroby bioetanolu je možnost zpracovávat havarované ovoce, námelové žito, namrzlé brambory, plesnivé obilí apod.. Nevýhodou zůstává fakt, že bioetanol lze snadno převést na potravinářský líh, a tak ho nezákonodárně lépe zpeněžit. V Evropě patří k nejvyšším producentům bioetanolu Francie, Polsko a Nizozemí. Nutno však poznamenat, že zemědělské plochy zatím nejsou pro výrobu bioetanolu v Evropě nijak vysoké, např. v roce 2005 země EU využili z celkové zemědělské plochy 25 milionů ha pouze 1,8 milionu ha této půdy. Z mimoevropských států je jedním z nejvyšších producentů Brazílie, kde se bioetanol vyrábí z cukrové třtiny a USA, kde se vyrábí bioetanol z kukuřice. Česká republika zatím ve výrobě biopaliv zaostává, přičemž nejvhodnějšími plodinami pro výrobu bioetanolu v našich podmínkách přichází pšenice, tritikale a nově také kukuřice. Tato práce se zabývá problematikou hodnocení výtěžnosti bioetanolu. Významnou roli totiž při získávání bioetanolu nehraje pouze surovina, ale také zvolené technologické postupy přípravy rmutu a právě touto problematikou se zabývá tato práce.
11
2.0 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Bioetanol a jeho produkce v ČR
Bioetanol je kvasný líh, který se využívá jako přídavek k benzínu a dále jej lze využívat také k farmaceutickým nebo chemickým účelům (www.biom.cz). V dnešní době se u nás začíná bioetanol vyrábět z podnětu Evropské unie. Tento podnět vychází ze směrnice č.2003/30/ES o mísení benzínu s bioetanolem, kdy má v ČR dosáhnout podíl bioetanolu v benzínu 2 % v roce 2005 (skutečnost byla 1,4 %), 4,25 % v roce 2008 a 5,75 % v roce 2010 (Jevič, 2006). U nás přichází v úvahu vyrábět bioetanol zejména ze pšenice, tritikale, kukuřice, brambor, cukrovky a havarovaného ovoce (Pelikán, 1996). Výhodou bioteanolu je oproti benzínu hořlavost při nižší teplotě a také to, že při hoření uvolňuje méně CO. Jeho nevýhodou je naopak, že má nižší výhřevnost a tím zvyšuje spotřebu. Další nevýhodou je prozatím jeho vysoká cena, a také to, že bioetanol lze snadno upravit na potravinářský líh (Kára, 2001).
2.2 Suroviny využitelné pro výrobu bioetanolu K výrobě lihu lze použít suroviny, obsahující přímo zkvasitelné cukry nebo polysacharidy, které lze převést enzymatickou hydrolýzou na zkvasitelné cukry. Tyto suroviny se dají rozdělit na cukernaté, škrobnaté a lignocelulózové (Tab.3) (Pelikán, 2001).
2.2.1 Suroviny cukernaté
Jedná se o suroviny, které obsahují přímo zkvasitelný cukr tj. zejména glukóza a fruktóza.
12
2.2.1.1 Ovoce
Ovoce se zpracovává na etanol pouze v letech nadúrody, při poškození sklizně škůdci nebo předčasném opadu. Jinak se ovoce zpracovává na výrobu ovocných pálenek (slivovice, meruňkovice atd.), a tedy s ním nelze pro výrobu bioetanolu běžně počítat (Hamrová, 1988). Ovoce
obsahuje
zejména
glukózu,
fruktózu
a
sacharózu,
kdy
poměr
těchto jednotlivých cukrů závisí zejména na druhu ovoce, a dále také na způsobu pěstování, klimatu a stupni zralosti viz. Tab.1 (Pelikán, 2001).
Tab. 1 Obsah monosacharidů a dalších cukrů v ovoci ( Velíšek, 2001)
Ovoce
Glukóza
Fruktóza
Sacharóza
cukry celkem
jablka
1,8
5,0
2,4
11,1
hrušky
2,2
6,0
1,1
9,8
meruňky
1,9
0,4
4,4
6,1
švestky
3,5
1,3
1,5
7,8
2.2.1.2 Cukrovka
Cukrovka obsahuje 17,5 % sacharózy. Tuto sacharózu lze využít pro výrobu bioetanolu buď ze zahuštěné šťávy, což by ale zdražilo výsledný produkt přibližně třikrát. Z tohoto důvodu se využívá k výrobě bioetanolu difúzní šťáva, čímž nám odpadá odpařování, a tedy výsledný produkt se nám třikrát nezdraží. Tento druhý postup nám umožňuje počítat s cukrovkou pro výrobu bioetanolu.
2.2.1.3 Cukrová třtina V dnešní době činí základ pro výrobu bioetanolu v Brazílii. Zisk z jednoho hektaru představuje přibližně 5300 – 6500 hl/ha (Petr, 2007). Její velkou výhodou je, že obsahuje přímo zkvasitelnou sacharózu a lze ji pěstovat po jednom výsevu po dobu 5 let. Nevýhodou je, že se jedná o teplomilnou plodinu, a tedy ji nelze v našich podmíkách při výrobě bioetanolu uplatnit. 13
Bioetanol vyrobený z této suroviny je ve srovnání s bioetanolem vyrobeným ze zemí mírného pásma podstatně levnější.
2.2.1.4 Melasa Melasa vzniká při výrobě řepného nebo třtinového cukru jako matečný sirob (Hamrová, 1988). Je to viskózní, tmavohnědá kapalina, která je pro další výrobu cukru neekonomická. Obsahuje nejméně 46 % sacharózy, 0,2 – 1 % rafinózy, invertní cukr 0,1 – 0,25 % a 30 % necukrů, které jsou tvořeny anorganickými látkami (10 %), nejvíce jev nich zastoupen draslík, v menší míře vápník, sodík a jiné minerální látky a látkami organickými (20 %), tj. kyselina asparagová, glutamová, betain a organické kyseliny a jejich soli. Melasa poskytuje velice dobré médium pro kvasinky při výrobě lihu, a proto se nejvíce využívá v průmyslových lihovarech (Pelikán, 2001). Její využití na biopalivo je ale nereálné z důvodu stále klesající produkce cukru v ČR.
2.2.1.5 Dextroner
Dextroner je matečný louh po krystalizaci glukózy, vyrobené kyselou nebo enzymovou hydrolýzou škrobu. Využívá se na výrobu lihu pouze v kombinaci s obilím nebo bramborami (Hamrová, 1988). Obsahuje 60 % sušiny, její pH má být 3 – 3,5 a z cukrů obsahuje převážně glukózu, proto je velmi snadno zkvasitelná (Pelikán, 2001).
2.2.1.6 Surový cukr
Jedná se o dražší produkt, lze jej tedy využívat pouze při nadbytku a to ve zpracování s ostatními surovinami. Pokud je nezbytné ho zpracovat samostatně, přidává se do zápary sladové mléko (Pelikán, 2001).
14
2.2.2 Škrobnaté suroviny
U těchto surovin je vždy nutné nejprve přeměnit pomocí enzymových preparátů nezkvasitelný škrob, popř. i celulózu
na zkvasitelné cukry, které posléze
mikroorganismy fermentují na etanol.
2.2.2.1 Brambory
Dříve byly u nás nejvyužívanější surovinou, ale dnes pro problémy s odpadní vodou a malou výtěžností vzhledem k obilí, se s nimi pro výrobu bioetanolu nepočítá (Petr, 2006). Jejich výhodou ovšem je, že lze zpracovat i brambory havarované nebo vytříděné při posklizňové úpravě konzumních brambor. Jejich škrobnatost nesmí být nižší než 16 % (Pelikán, 2001). Průměrně brambory obsahují 25 % sušiny a z toho připadá 2 % dusíkatých látek, 0,7 % vlákniny, 0,2 % tuku, 18 % škrobu a 1 % popelovin (Tab.2). Obsah se liší v závislosti na klimatu, odrůdě a technice pěstování (Adler, 1971).
Tab. 2 Složení bramborové hlízy ( Adler, 1971)
rozpětí % Voda
63,2 – 86,9
Sušina
13,1 – 36,8
Škrob
8,0 – 29,4
N – látky
0,7 – 4,6
Cukry celkem
0,1 – 8,0
Vláknina
0,2 – 3,5
Tuk
0,04 – 0,96
Minerální látky
0,4 – 1,9
15
2.2.2.2 Pšenice
Pšenice je velmi výhodná pro zpracování na bioetanol pro vysoký obsah škrobu a nahé obilky. Pšenice obsahuje v průměru 65 – 70 % škrobu v závislosti na odrůdě. Teoretická výtěžnost bioetanolu se pohybuje pro pšenici okolo 38 – 44 la na 100 kg sušiny zrna (Aufhamer, 1994), ale v praxi se dosahuje okolo 34 – 39 la na 100 kg sušiny zrna. Výhodnější pro zpracování jsou moučnatá zrna než sklovitá, protože dochází k uvolnění škrobových zrn z bílkovinné matrice (Lindhauer a Zwingelberg, 1997) .
2.2.2.3 Žito
Žito obsahuje průměrně okolo 58 – 60 % škrobu. Jeho výhodou je, že má nahé obilky, obsahuje málo vlákniny a je také ceněno pro nízký obsah bílkovin. Nevýhodou je velká viskozita připravené zápary pro vysoký obsah pentosanů. V současné době se s ním pro výrobu bioetanolu nepočítá, protože rentabilita výroby je při minimálním obsahu 65 % škrobu v obilce.
2.2.2.4 Oves
Oves se pro výrobu lihu využívá jen ojediněle, protože obsahuje vysoký podíl pluch (23 – 45 % hmotnosti zrna) (Hamrová, 1988). Obsah škrobu je také nízký a to pouze 40 %. Výhodou ovsa je, že obsahuje hodně tuku, a tedy zabraňuje pěnění zápar bez přidání jiných látek (Dyr, 1956).
2.2.2.5 Ječmen
Ječmen se na výrobu bioetanolu nehodí, protože má pluchaté obilky. Pluchy tvoří na zápaře tlustou vrstvu tzv. deku, čím dochází k prodloužení destilace a také ke kontaminaci nežádoucími mikroorganismy.
16
2.2.2.6 Kukuřice
Nejvíce je využívána pro tvorbu bioetanolu v USA, kde výroba představovala 42 milionů litrů bioetanolu v roce 2006. U nás se v dnešní době začíná o této plodině pro výrobu etanolu vážně uvažovat. Její hlavní výhodou je vysoký obsah škrobu v zrnu (až 75 %), který je tvořen glukózovými jednotkami s pravidelnými vazbami, což umožňuje snadné zcukření pomocí enzymových preparátů. Dále kukuřice obsahuje vyšší podíl tuku, což stejně jako u ovsa zabraňuje pěnění zápary bez přidání jiných látek. Její nevýhodou je ale vysoká náročnost vláhy, hnojiv a pesticidů ( Petr, 2007).
2.2.2.7 Tritikale
Jedná se o křížence pšenice a žita. Obsah škrobu je okolo 64 – 68 %. Na rozdíl od svých rodičů, má vyšší aktivitu amylotických enzymů, čímž dochází k rychlejšímu získávání vysoce extraktivních zápar (Wesenber, 1990). Velkou výhodou tritikale je, že není náročné na pěstování, a lze jej tedy využít i pro pěstování v horských oblastech (Petr, 2006).
2.2.3 Lignocelulózové suroviny V dnešní době se dostávají lignocelulózové suroviny do popředí zájmu, čemuž napomohla výroba obchodních celulázových preparátů, které hydrolyzují celulózu až na glukózu. Tyto enzymové preparáty jsou vyrobeny z geneticky modifikovaných hub, které umí velmi rychle a efektivně štěpit celulózu (Petr, 2007). Mimo těchto enzymů lze využít i enzymy z bakterie rodu Zymomonas a Escherichia Coli jak uvádí Zaldivar (2001). Jako suroviny lze uplatnit zejména slámu ze zemědělství a zbytky dřevozpracujících závodů (piliny, štěpky).
17
Tab. 3 Průměrné výnosy plodin a náklady na produkci lihu z jednotlivých plodin ( Petr, 2004)
Plodina
Výnos [t/ha]
Výnos škrobu
Výnos lihu
[t/ha]
[t/ha]
Náklady na 1ha [tis. Kč]
Náklady [na 1 t škrobu tis.
Náklady [na 1 t lihu
Kč]
tis. Kč]
Pšenice
4,8
2,8
1,3
17,7
6,3
11,1
Tritikale
4,1
2,4
1,1
15,9
6,6
11,4
Kukuřice
6,6
3,5
1,4
26,4
7,6
14,7
Brambory
23,0
4,6
2,2
44
9,6
15,7
Cukrovka
45,0
7,7
3,6
40,5
5,3
8,8
2.3 Obiloviny jako surovina pro výrobu bioetanolu V současné době obiloviny představují v našich podmínkách hlavní surovinu pro výrobu bioetanolu. Na to, která obilovina je nejvýhodnější pro výrobu bioetanolu, má hlavní vliv morfologické složení obilky a zejména její chemické složení. Tyto rozdíly jsou dány zejména druhem obiloviny, odrůdou dané obiloviny, v menší míře poté vlivem výživy, počasí a podnebí. Pro toto posouzení se využívají ukazatele lihovarnické kvality: •
Vlhkost – stanovuje se vážkově
•
Hmotnost tisíc zrn – stanovuje se odpočítáním 2 x 500 zrn
•
Objemová hmotnost – pomocí obilného měřiče
•
Podíl plných zrn – pomocí prosévadel např. Steineckerovo prosévadlo
•
N – látky – podle Kjehdala
•
Obsah škrobu – stanovuje se polarimetricky
•
Pádové číslo – stanovuje se v automatické viskolázni
•
Průběh mazovatění škrobu – pomocí amylografu
18
Pro každou surovinu jsou hodnoty jiné, jako příklad můžeme uvést hodnoty pro pšenici a tritikale (Tab.4):
Tab. 4 Technologické znaky pro pšenici a tritikale ( Diviš, Šimůnek, Voleský 2004)
Kritéria
Pšenice
Tritikale
Vlhkost % max.
14
14
obj. hmotnost kg/hl min.
73
68
příměsi v % max.
12
12
nečistoty v % max.
3
3
číslo poklesu v s
150 – 300
150 – 300
obsah škrobu v % min.
58
60
2.3.1 Morfologická skladba zrna
Každá obilka se skládá z endospermu, klíčku a obalových vrstev. Hmotnostní podíl jednotlivých částí zrna je rozdílný u jednotlivých obilovin (Pelikán, 2001).
2.3.1.1 Endosperm Zaujímá 84 – 86 % hmotnosti zrna a obsahuje zejména škrob, tedy tato část je pro výrobu bioetanolu velice důležitá. Dále také obsahuje bílkoviny, které jsou důležité pro pekařské využití (Kučerová, 2004).
2.3.1.2 Obalové vrstvy
Od endospermu jsou odděleny vrstvou aleuronových buněk, obsahujících bílkoviny, minerální látky, tuky a vitaminy. Obalové vrstvy tvoří 8 – 14 % hmotnosti zrna a mají dvě hlavní části oplodí a osemení. •
Oplodí (perikarp) tvoří pokožka (epidermis), buňky podélné (epikarp), buňky příčné (mesokarp) a buňky hadicové (endokarp).
•
Osemení (perisperm, testa) je tvořeno vrstvou barevnou a hyalinní (skelnou).
19
Vrstvy jsou složeny z vlákniny (celulózy a hemicelulózy) a minerálů, tedy jsou důležité z výživového hlediska (Zimolka, 2004).
2.3.1.3 Klíček
Jinými slovy embryo, představuje vlastní zárodek nové rostliny. Jeho velikost závisí na druhu obilného zrna a je nejvíce kolísající složkou zrna. Např. u pšenice tvoří 2,5 – 3,0 % hmotnosti zrna, naopak u kukuřice tvoří 12 – 15 % hmotnosti zrna. Obsahuje jednoduché cukry, bílkoviny, vitaminy B1, E a tuk, který je pro zpracování na bioetanol důležitý, protože jeho vysoký obsah snižuje pěnivost zápar. Nejvyšší podíl tuku v klíčku má oves a hlavně kukuřice (Pelikán, 2004).
2.3.2 Chemické složení zrna
Obilné zrno obsahuje vodu, sacharidy, dusíkaté látky, tuky, minerální látky a vitaminy.
2.3.2.1 Voda
Voda je nezbytnou složkou obilného zrna, protože se podílí na biochemických a fyziologických procesech, které probíhají během růstu, dozrávání a skladování (Pelikán, 2001). Na výrobu bioetanolu nemá zrno obsahovat více jak 14 % vody.
2.3.2.2 Sacharidy
V obilce se nacházejí ve formě monosacharidů, oligosacharidů a polysacharidů. Monosacharidy a oligosacharidy jsou zastoupeny glukózou, fruktózou, sacharózou a maltózou. Vyskytují se zejména v klíčku, kde poskytují energii klíčícímu zrnu a dále v periferních vrstvách endospermu (Zimolka, 2004 ). Polysacharidy jsou zastoupeny škrobem, který poskytuje zásobní energii pro rostliny. Každá rostlina má jiný obsah škrobu (Tab. 5). Nejvíce škrobu se nachází v amyloplastech, kde je uložen v nerozpustných micelách nazývaných škrobová zrna nebo také škrobové granule, které mají druhově specifický
20
tvar, což má důležitou vlastnost při mazovatění škrobu. Kruger (1989) uvádí, že škrob je druhý nejrozšířenější sacharid v přírodě. Škrob je složen z amylózy ( 20 – 25 %), což je lineární polysacharid, barvící se roztokem jodu do modra (Tab.7) a stáčející se do levotočivé šroubovice, v němž jsou zbytky
α-D-glukózy
spojeny
1→4
glykosidovými
vazbami
a
amylopektinu
(75 % – 80%), ve kterém se spojují kratší lineární řetězce α-(1→4) – glukanu vazbami (1→6), čímž vzniká větvená molekula. Amylóza je ve vodě rozpustná na rozdíl od amylopektinu, který pouze bobtná, a proto lze stanovovat mazovatění škrobu neboli maximální hodnotu želatinace v závislosti na teplotě (Tab.6). Kromě rozpustnosti je při výrobě bioetanolu důležitá vlastnost amylózy barvit se roztokem jodu modře, čímž lze snadno sledovat stupeň zcukření (Zehnálek, 2007). Dále se z polysacharidů vyskytují celulózy a hemicelulózy, a to v buněčných stěnách, kde fungují jako opěrné pletivo (Pelikán, 2001).
Tab. 5 Obsah škrobu ve významných obilninách pro výrobu bioetanolu ( Velíšek, 2002)
obilnina
škrob (%)
pšenice
59 – 72
žito
52 – 57
ječmen
52 – 62
oves
40 – 56
kukuřice
65 – 75
Tab. 6 Teploty mazovatění ( želatinace) ( Velíšek, 2002)
Teplota mazovatění ve °C Zdroj škrobu
počáteční
konečná
pšenice
52
64
kukuřice
62
72
21
Tab. 7 Závislost barevné reakce roztoku jodu na délce amylózového řetězce (Kosař, 2000)
počet glukózových jednotek
barevná reakce s jodem
45
modrá
40
modrofialová
36
fialová
31
červená
12
červenohnědá
9
žádná
2.3.2.3 Bílkoviny
Obsah bílkovin v obilném zrnu je 9 – 16 % a jsou obsaženy hlavně v endospermu a aleuronové vrstvě. V obilovinách se vyskytují tyto bílkoviny: protoplasmatické (albuminy a globuliny) a zásobní (prolaminy a gluteliny) (Tab. 8). Protoplasmatické bílkoviny jsou tvořeny bílkovinami katalytickými, enzymaticky aktivními a bílkovinami stavebními. Zásobní bílkoviny tvoří podstatnou část obilních bílkovin a určují technologickou, nutriční, krmnou a biologickou hodnotu zrna (Pelikán, 2001).
Tab.8 Bílkoviny obilovin a jejich složení (Velíšek, 2002)
obilovina
albuminy (%)
globuliny
prolaminy
gluteliny
pšenice
14,7
7,0
32,6
45,7
žito
44,4
10,2
20,9
24,5
ječmen
12,1
8,4
25,0
54,5
oves
20,2
11,9
14,0
53,9
kukuřice
4,0
2,8
47,9
45,3
22
2.3.2.4 Tuky
Vyskytují se nejvíce v klíčku a aleuronové vrstvě. Podíl 72 – 85 % tvoří nepolární tuky a kolem 15 – 26 % tvoří polární lipidy (Kučerová, 2004).
2.3.2.5 Minerální látky
Minerální látky se nacházejí v obilném zrně v rozmezí 1,5 % – 3,0 %. Největší množství minerálních látek se nachází v klíčku a obalových vrstvách. Nejvíce jsou zastoupeny K, P, Mg (Pelikán, 2001).
2.3.2.6 Vitaminy Katalyzují četné životně důležité biochemické procesy. Nejvíce vitaminů je v klíčku a v aleuronové vrstvě. Naopak endosperm je na vitaminy velmi chudý. Největší význam mají vitaminy B1, B2, kyselina nikotinová a vitamin E, který je v zrnu obsažen v poměrně značném množství, zejména v klíčku.
2.4 Výroba obilných zápar Při přípravě bioetanolu z obilovin je potřeba nejprve převést hydrolýzou nezkvasitelný škrob na zkvasitelné cukry, které jsou poté mikroorganismy fermentovány na etanol. Na průběh hydrolýzy má vliv granulace mletí, protože čím je granulace meliva hrubší, tím dochází k horšímu ztekucování a zcukřování škrobu. Rozklad škrobu lze provádět dvěma způsoby, a to
kyselou hydrolýzou nebo
enzymovou hydrolýzou, kdy výchozí rovnice je pro oba způsoby stejná: (C6H10O5)a + n H2O → n C6H12O6 Kyselá hydrolýza se dnes již nevyužívá, protože je obtížněji regulovatelná než hydrolýza enzymová, při které lze navíc využít i enzymy pro zcukření celulózy a tím zvýšit výtěžnost (Velíšek, 2002).
23
Pro vyšší účinek enzymů je důležité mechanické narušení struktury endospermu (Kreipe, 1981). Např. Kent a Evers (1994) uvádí, že při narušení struktury endospermu mletím, dochází k porušení bílkovinné matrice, uvolnění škrobových zrn a tím mohou být lépe zcukřeny pomocí enzymů. Jak již bylo výše naznačeno, dnes se pro výrobu bioetanolu využívá hydrolýza škrobu pomocí enzymů tzv. enzymová hydrolýza. Tato operace se provádí tzv. rmutováním, kdy se k rozemletému zrnu přidá voda a příslušné enzymy. Po procesu zcukření škrobu, popř. jiných polysacharidů, se připravená zápara zakvasí příslušným mikroorganismem. Po 72 h kvašení při teplotě 30°C se vzniklý etanol oddestiluje a zjistí se výtěžnost.
2.4.1 Enzymy používané k zcukření polysacharidů obilného zrna
K výrobě bioetanolu lze využít těchto enzymů (Tab.9) viz níže. α - amyláza (EC 3.2.1.1.) α-amyláza hydrolyzuje 1,4-α-D-glukosidové vazby uvnitř polysacharidové molekuly (Obr.1), takže vznikají dextriny o nízké molekulové hmotnosti, oligosacharidy a glukóza. Přičemž barva komplexu s jodem se mění přes fialovou, hnědou až k bezbarvé a zároveň klesá viskozita škrobového mazu. Tento enzym se také nazývá ztekucující nebo také endoamyláza, protože působí uvnitř makromolekuly škrobu (Hamrová, 1988). Komerčně jsou využívány α-amylázy produkované bakteriemi např. Bacillus subtilis nebo plísňové enzymy např.Aspergilus niger (Vodrážka, 1996). β - amyláza (EC 3.2.1.2)
Stejně
jako
α-amylázy
hydrolyzují
1,4-α-D-glukosidové
vazby,
ale
od
neredukujícího konce, takže odštěpují molekuly maltózy (Obr.2). Tento enzym se proto nazývá zcukřujícím enzymem. Na rozdíl od α-amylázy mají β-amylázy charakter exoenzymů.
24
Působení β-amyláz je popsáno v pokusu Maneliuse (1997), který podrobil směs lineárních a větvených dextrinů škrobu působení β-amylázy. Lineární dextriny byly hydrolyzovány až na maltózu, avšak amylopektiny nebyly téměř dotčeny.
Glukoamyláza (EC 3.2.1.3) Stejně jako β-amyláza je glukoamyláza exoenzym, hydrolyzují 1,4-α-D-glukosidové vazby od neredukujícího konce, ale navíc štěpí i vazby 1,6-α-D ve větveném amylopektinu (Obr.3). Tedy tímto enzymem je možno zcukřit škrob až na glukózu (Hamrová 1988). Komerčně se využívají enzymy např. z rodů Aspergillus a Endomycopsis.
Pululanázy (EC 3.2.1.41) a Izoamylázy ( EC 3.2.1.68)
Tyto enzymy štěpí vazby 1,6-α-D v amylopektinu. Pululanázy se dělí na pululanázy I a II, kde pululanáza typu II je schopna na rozdíl od pululanasy I štěpit i vazby 1,4-α-D v amyláze. Výhodou pululanázy II je, že dokáže rozštěpit škrob bez nutnosti nasazení jiných enzymů. Izoamylázy se liší od pululanáz neschopností hydrolyzovat pululan.
Celulázy
Tyto enzymy umí štěpit celulózu na zkvasitelné cukry, které jsou obsaženy zejména v obalových vrstvách. Tyto enzymy se dnes již běžně využívají a získávají se z geneticky modifikováných hub (Petr, 2007).
Proteázy
Kromě enzymů štěpící polysacharidy na jednoduché sacharidy se ještě přidávají proteázy, které štěpí bílkoviny, a dodávají tak pohotověji dusík pro výživu zkvašujících mikroorganismů.
25
Tab.9 Působení enzymů používaných pro zcukřování škrobu ( Antranikian, 1997)
Enzym
štěpené vazby
specifické reakce
výsledný produkt
α-amyáza
1,4-α-D
uprostřed molekuly
větvené oligosacharidy, lineární dextriny, lineární oligosacharidy a glukóza
β-amyláza
glukoamyláza
1,4-α-D
1,4-α-D a 1,6-α-D
od neredukujícího
maltóza a větvené
konce
polymery
od neredukujícího
glukóza
konce isoamyláza
1,6-α-D
náhodně
lineární dextriny
pululanáza I
1,6-α-D
náhodně
lineární oligosacharidy
pululanáza II
1,4-α-D a 1,6-α-D
náhodně
Obr. 1 Působení α-amylázy (Hamrová, 1988)
Obr.2 Působení β- amylázy ( Hamrová, 1988)
maltóza
26
maltóza, glukóza
Obr.3 Působení glukoamylázy ( Hamrová, 1988)
glukóza
2.5 Prokvášení zápar Jak bylo výše popsáno, připravená zápara se musí zakvasit příslušným mikroorganismem, který produkuje ze zkvasitelných cukrů etanol. Pro tento účel se využívá kvasinek popř. bakterií. Tento proces ovlivňuje celá řada podmínek zejména druh mikroorganismu, a dále přítomnost či nepřítomnost kyslíku, teplota a pH (Šilhánková, 2002).
2.5.1 Mechanismus etanolového kvašení
Pod pojmem kvašení se rozumí všechny reakce aerobních i anaerobních mikroorganismů, jejichž konečnými produkty jsou látky energeticky bohatší než voda a CO2. Tedy lze rozlišit dva typy kvašení a to, pravé kvašení a nepravé kvašení. Etanolová fermentace patří mezi kvašení anaerobní, při němž při využívání substrátu glukózy, se energie uvolňuje podle rovnice: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2. což lze také popsat pomocí Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy (Obr.4) Nutné je si při výrobě lihu uvědomit, jak poukazuje Pelikán (2001), že takto reakce běží pouze v kyselém prostředí, naopak v alkalickém prostředí se tvoří mimo etanolu také glycerol a octová kyselina (Obr.5). Mimo etanolu jsou přítomné i některé vyšší alkoholy, např. propanoly a butanoly, které vznikají z mastných kyselin a aminokyselin (Velíšek, 2002). Pokud chceme přeměnu popsat podrobně, musíme vyjít z mechanismu glykolýzy, kdy je glukóza přeměněna na pyruvát, který se v anaerobním prostředí pomocí enzymu pyruvátdekarboxyláza dekarboxyluje na acetaldehyd, který je následně pomocí alkoholdehydrogenázy redukován na etanol (Koutník, 2001).
27
Tento
anaerobní
proces
odbourávání
glukózy
používají
kvasinky
rodu
Sacharomyces. Vzhledem k tomu, že tyto mikroorganismy jsou fakultativně anaerobní, za přítomnosti kyslíku by se pyruvát odboural až na CO2 a H2O (Rychtera, 1991). Jsou-li pomocí kvasinek zkvašovány disacharidy, což se týká zejména sacharózy ve třtině pro výrobu bioetanolu viz výše, probíhá rovnice pro etanolové kvašení takto: C12H22O11 + H2O → 4 C2H5OH + 4 CO2 Co se týče fermentativních schopností anaerobních bakterií, tak velkou nevýhodou je, že při zkvašování tvoří mnoho vedlejších produktů, čímž snižují výtěžnost a jakost produktu.
Obr. 4 Embdenovo-Meyerhofovo schéma etanolové glykolýzy
Co se týče fermentativních schopností anaerobních bakterií, tak velkou nevýhodou je, že při zkvašování tvoří mnoho vedlejších produktů, čímž snižují výtěžnost a jakost produktu.
28
Obr. 5 Kvašení glukózy v alkalickém prostředí (Neubergovo schéma)
2.5.2 Kvasinky v kvasném průmyslu
V kvasném průmyslu lze využít kvasinek a bakterií, jak bylo popsáno. Ovšem nejvíce jsou využívány kvasinky. V lihovarské praxi se uplatňují pouze kmeny kvasinek, náležející k řádu Endomycetales do čeledi Endomycetaceae, rodu Saccharomyces a druhu cerevisiae. Je to z důvodu, že tyto kvasinky zaručují při optimálním vedení kvasných procesů maximální výtěžnost a dávají produkty prosté vedlejších produktů (Pelikán, 1996). Tyto kvasinky vždy zkvašují glukózu, sacharózu, maltózu, galaktózu a rafinózu. Jak uvádí Šilhánková můžeme kvasinky rozdělit následovně: •
zkvašuje – li kvasinka glukózu, zkvašuje i fruktózu a manózu
•
zkvašuje – li kvasinka manózu nezkvašuje laktózu
•
nezkvašuje – li kvasinka glukózu, tak nezkvašuje žádný cukr
•
zkvašuje – li kvasinka nějaký disacharid, zkvašuje i glukózu
2.5.2.1 Morfologie a cytologie kvasinek
Jedná se o jednobuněčné eukaryotní mikroorganismy (Obr.6), náležící mezi houby. Český název kvasinky dostaly pro schopnost zkvašovat monosacharidy, některé disacharidy a trisacharidy. Rozmnožují se převážně vegetativně pučením nebo pohlavně pomocí pohlavních spór.
29
Tvar buňky může být vejčitý, elipsoidní nebo kulovitý. Buňka je tvořena buněčnou stěnou, která je tvořena hemicelulózami, proteiny a tuky. Pod vlastní buněčnou stěnou je cytoplazmatická membrána, která je polopropustná a tvoří membránu pro vstup a výstup látek do buňky. Obsah buňky je tvořen cytoplazmou, ve které se nachází vakuoly, jádro, rezervní látky, mitochondrie, endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát. Jádro je kulovitá organela, ohraničená membránou, obsahující DNA. Rezervní látky mají funkci zásobárny látek pro buňku, jedná se o zrníčka glykogenu a kapiček tuku. Mitochondie představují dýchací centrum buňky, jejich tvar je kulovitý až vláknitý. Endoplazmatické retikulum je místo, ve kterém dochází k syntéze a metabolizmu bílkovin. Golgiho aparát má tvar měchýřku a má vztah k syntéze buněčných stěn (Šilhánková, 2002).
Obr. 6 Buňka kvasinek ( Šilhánková, 2002)
2.5.2.2 Chemické složení kvasinek
Kvasinky obsahují 65 – 85 % vody a 15 – 35 % sušiny. Sušina je tvořena přibližně z 50 % bílkovinami, 2 – 3 % tuku, 8 – 9 % minerálními látkami, z nichž téměř polovinu tvoří fosfor, dále to jsou draslík, hořčík, vápník, křemík, síra a železo. Významnou složkou sušiny jsou vitaminy, zejména vitaminy skupiny B, provitamin D (ergosterol), kyselina listová a biotin (Hamrová, 1988).
30
2.5.2.3 Výživa kvasinek
Jak poukazuje Pelikán (1996) je velmi důležité, aby v zápaře byl dostatek živin, protože při jejich nedostatku nedojde k pomnožení kvasinek a substrát zůstane neúplně prokvašen. Základem výživy kvasinek pro optimální průběh kvasných procesů jsou dusíkaté látky. V úvahu přicházejí peptidy, polypeptidy, amidy a aminokyseliny. Z těchto sloučenin získává buňka látky pro výstavbu svých enzymů a peptidů. Tyto dusíkaté látky představují pro buňku i zdroj uhlíku. Další důležitou složkou jsou minerální látky draslík, fosfor, hořčík, vápník, které se podílejí na látkové výměně a mangan, měď a železo, které jsou důležité pro funkci enzymů (Pelikán, 1996). 2.5.2.4 Činitelé ovlivňující činnost kvasinek
Jedná se o teplotu, koncentraci substrátu a pH prostředí.
Teplota Optimální teplota pro kvasnou činnost kvasinek se pohybuje mezi 27 – 30°C. Při vyšší teplotě se snižuje produkce etanolu kvasinkami, přičemž při teplotě 55°C dochází k usmrcení kvasinek.
Koncentrace substrátu
Při tvorbě zápary je potřeba připravit správnou koncentraci cukru v roztoku, a to 16 – 18 %, protože při vyšší koncentraci se prodlužuje doba kvašení a zvyšuje se množství neprokvašeného substrátu.
pH prostředí
pH zápary se má pohybovat mezi 4,6 – 5,6. Pokud působí vyšší pH, rozkládají se vlastní bílkoviny tzv. samotrávení a kvasinky odumírají. Navíc v alkalickém prostředí se začíná tvořit glycerol a kyselina octová na úkor etanolu (Pelikán, 2001). 31
2.6 Průmyslová výroba lihu z obilovin Dříve se využívala pro výrobu zápary metoda pařáková, kterou dnes nahradila metoda infúzní. Vzniklá zápara se zakváší vhodnými mikroorganismy a vzniklý etanol činností těchto mikroorganismů se oddestiluje.
2.6.1 Příprava sladké zápary
Tato infúzní metoda
se skládá ze čtyř fází: mechanické rozmělnění suroviny,
smísení s vodou, přidání enzymů (zcukření) a následné zchlazení zápary. Obilné zrno se rozemele na velikost 0,02 – 0,2 cm a smísí se s studenou vodou nejlépe v poměru 1:3 a vyšším (Wolf, 1994). Poté se směs zahřeje a při dané teplotě se přidají vhodné komerční enzymové preparáty, upraví se pH a směs ze zahřívá na určitou teplotu po určitou dobu než dojde ke zcukření. Konkrétní teploty a doby potřebné ke zcukření jsou popsány u jednotlivých preparátů.
2.6.2 Zakvašování a kvašení sladké zápary
Po zcukření následuje zchlazení na zákvasnou teplotu 30°C a následné zakvašení zápary vhodnými mikroorganismy ( Augustín, 1991). Při kvašení rozdělujeme tyto tři operace: rozkvašování, hlavní kvašení a dokvašování (Obr.7). Celý tento proces trvá 72 h při teplotě 30°C (Dyr, 1955). Rozkvašování nastává ihned, aniž to zjevně pozorujeme, protože vznikající CO2 se pohlcuje záparou. Na počátku pozorujeme zpravidla osychání povrchu, způsobené vystupujícím šrotem, teprve po nasycení zápary se objevuje silnější vývoj plynů. Hlavní kvašení nastupuje podle výše násadní teploty a to přibližně při prokvašení 35 – 45 % cukru. V tomto období již má zápara 4 – 5 % alkoholu, tedy rozmnožování kvasinek ustává. Dokvašování je posledním stádiem, kdy dochází ke konečnému prokvašení zápary.
32
Obr. 7 Kvasné křivky kvašení zápar (Pelikán, 2001)
2.6.3 Destilace zralé zápary
Po prokvašení se získává ethanol ze zralé zápary destilací, která je založena na různé těkavosti a tenzi par destilujících složek roztoku. U nás se provádí destilace pomocí kontinuálních destilačních přístrojů. Podle Pelikána (2001) lze pokládat prokvašenou záparu za směs vody a etanolu. Voda vře při 100°C a etanol při 78,3°C, to ovšem neznamená, že se nejprve odpaří etanol a poté voda, je to z důvodu, že směs vody a lihu vře mezi těmito dvěma hodnotami a tvoří tzv. azeotrop. Z tohoto důvodu nelze nikdy získat absolutní alkohol, a proto je nutná jeho rektifikace a deflegmace. Rektifikace je pochod, při němž se opakovanou destilací získává silnější destilát, který se zároveň čistí. U nás se provádí kontinuální destilací (Pelikán, 2001). Deflegmací rozumíme frakční kondenzaci parní směsi. Při ochlazení lihových par zkondenzuje nejdříve složka méně těkavá (voda) a tím se zvýší podíl etanolu v parách a následně i v kondenzátu (Hamrová,1988). Místo destilace lze uplatnit membránovou filtraci, extrakce různými rozpouštědly, extrakce pomocí CO2 nebo adsorpce na molekulových sítech. Ovšem tyto systémy nemohou zatím konkurovat používaným destilačním metodám (Rychtera, 1991).
33
2.7 Produkty lihovarského průmyslu Mezi produkty lihovaru patří zejména etanol. Vedlejším produktem jsou výpalky, které obsahují všechny nezkvašené látky (Tab.10). Jejich jakost závisí na složení suroviny a zejména na procesu výroby. Např. u obilovin činí asi 350 – 400 l na 100 kg obilovin a u brambor 110 – 120 l na 100 kg brambor (Pelikán, 2001). Nejdůležitější látkou jsou bílkoviny, dále vitaminy, minerální látky a tuk. Jejich využití je zejména na krmné účely, popř. se dají využít i jako hnojivo (Hamrová, 1988).
Tab. 10 Složení výpalků (www.bioetanol.cz ) název
obsah v sušině (%)
bílkoviny (F = 6,25)
27,80
škrob
3,20
lipidy
4,80
vláknina
41,20
popel
4,30
2.8 Laboratorní kvasná zkouška Laboratorní kvasná zkouška, je založena na zcukření, prokvašení zápary a následné destilaci. Dříve se provádělo zcukřování kyselou hydrolýzou, dnes se provádí výhradně enzymovými preparáty. Poté se provádí zakvašení vhodnými kvasinkami a po prokvašení se zápara destiluje pomocí jednoduché aparatury v laboratoři. Kvasné zkoušky jsou různě modifikovány, podle použité suroviny, vhodného dávkování enzymů a reakčních podmínek v pracích různých autorů (Pieper a Thomas, 1989).
34
3.0 CÍL PRÁCE
1. Vypracovat literární rešerši k problematice využití surovin pro výrobu bioetanolu se zaměřením na přípravu sladké zápary. 2. Na vybraném vzorku pšenice posoudit průběh ztekucování a zcukřování škrobu pomocí použití specifických enzymů. 3. Stanovit výtěžnost bioetanolu připravené zápary.
35
4.0 MATERIÁL A METODIKA
4.1 Materiál
4.1.1 Charakteristika použité odrůdy pšenice
Pro pokus byla vybrána odrůda pšenice Eurofit. Jedná se o středně ranou pekařskou odrůdu A, která je vhodná do všech oblastí pěstování. Doporučovaný výsevek je cca 4,0 miliony semen na hektar dle aktuálních půdních a klimatických podmínek. Je středně odolná proti poléhání, proto se doporučuje aplikovat růstové regulátory. Je vysoce odolná proti vyzimování a také má dobrou odolnost vůči chorobám. Poskytuje vysoké stabilní výnosy zrna ve všech oblastech pěstování. Odrůda Eurofit má velkou výhodu, že snížení počtu odnoží vlivem sucha je schopna kompenzovat vysokou produktivitou z jednoho klasu. (Registrace odrůdy v ČR 2006 a jejím udržovatelem je BOR s.r.o. Plzeň).
4.1.2 Charakteristika použitých enzymů
Spezyme – ethyl Jedná se o ztekucující termostabilní α-amylázu, která je funkční i při nízkém pH. Tato
α-amyláza je produkována geneticky modifikovaným kmenem Geobacillus
stearothermofilus. Velkou výhodou tohoto enzymu je, že je vysoce termostabilní i bez přidání vápenatých iontů a vysokou rychlostí ztekucování škrobu.
Fermenzyme L – 400 Jedná se o kombinaci zcukřujícího enzymu 1,4-α-D-glukan hydrolázu a proteázu, kdy oba tyto enzymy jsou produkovány specifickými kmeny Aspergillus niger. Hydroláza štěpí jak vazby 1,4-α-D tak vazby 1,6-α-D čímž zvyšuje následně alkoholovou výtěžnost. Proteáza má za úkol štěpit bílkoviny na aminokyseliny a následně při kvašení pohotově dodávat dusík kvasinkám.
36
Optimash XL Jedná se o celulázu a xylanázu, které štěpí celulózu, arabinoxylany a β – glukany. Tyto enzymy mají za úkol rychle snížit viskozitu roztoku a usnadnit tak ztekucování a zcukřování škrobu.
Všechny tyto enzymy jsou produkty firmy Genencor International. Bližší údaje o dávkování těchto enzymů a podmínkách působení jsou uvedeny v Tab.11.
Tab. 11 Dávkování enzymů a optimální podmínky ztekucování a zcukřování škrobu
Enzym
dávka na 100 g šrotu [μl]
pH
teplota [°C]
Optimash XL
25
4,5 –5,0
65– 70
Spezyme – ethyl
80
5,4 –5,8
83 – 95
Fermenzyme L – 400
50
3,8 – 4,5
60 – 65
4.1.3 Kvasinky
V laboratorních kvasných zkouškách byly použity sušené kvasinky kmene Saccharomyces cerevisiae uvarum s obchodním názvem SIHA – Amyloferm.
4.2 Metodika
4.2.1 Rozbor zrna
V rámci prováděných analýz byla u zrna odrůdy pšenice Eurofit stanovena: •
Vlhkost – stanovuje se vážkově
•
Objemová hmotnost – pomocí obilného měřiče
•
Podíl plných zrn – pomocí Steineckerova prosévadla
•
N – látky – pomocí přístroje Inframatic
•
Obsah škrobu – polarimetricky dle Ewerse
37
4.2.2 Příprava zápary
Vzorek byl pomlet na mlýnku OZAP, který umožňuje hrubší granulaci mletí. Následně byl ztekucen a zcukřen pomocí výše uvedených enzymů. V rámci ztekucování a zcukřování byly odebírány vzorky zápary (25 ml) po 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 100 minutách, 125 minutách a 150 minutách rmutování. Vzorky byly následně zfiltrovány a analyzovány na HPLC.
postup přípravy zápary •
Do rmutovací kádinky bylo naváženo 100g šrotu, přidáno 350 ml vody a míchadlem promícháno.
•
pH suspenze bylo upraveno na 5,5 pomocí 0,5M H2SO4
•
Do rmutovací kádinky vložené do rmutovací lázně vytemperované na 65°C bylo přidáno 25 µl enzymu Optimash XL. Při této teplotě za stálého míchání enzym působil 30 minut.
•
Poté byl přidán enzyme Spezyme ethyl (80 µl) a teplota rmutu se zvyšovala na 85°C. Dle potřeby bylo pH rmutu upravováno na 5,5 pomocí 0,5 M H2SO4. Při této teplotě byl rmut udržován po dobu 90 minut.
•
Po této době byl rmut postupně ochlazen na 60°C, pH upraveno na 4 pomocí 0,5M H2SO4 a následně přidáno 70 µl enzymu Fermenzyme L – 400 a docukřeno 30 minut.
38
4.2.3 Kvasná zkouška •
Vzniklá zápara byla zchlazena na 25-30°C a převedena do zvážené Erlenmayerovy baňky, a dovážena vodou na 500 g. Byl přidán odvážený 1 g kvasinek S. cerevisiae a kvašení proběhlo 96 h při 30°C.
•
Baňka s prokvašenou záparou byla zvážena a zfiltrována přes plátno.
•
250 g filtrátu bylo převedeno do destilační baňky, upraveno pH na 7 pomocí 0,5M NaOH, přidán odpěňovací roztok a destilováno do předlohy s 25 ml destilované vody.
•
Z předlohy byl roztok převeden kvantitativně do 200 ml odměrné baňky a doplněn destilovanou vodou po značku.
•
Po vytemperování roztoku na 20°C byla změřena hustotu roztoku pyknometricky a pomocí tabulek dohledán obsah etanolu v obj. %, který byl použit pro výpočet výtěžnosti.
Následně byl proveden výpočet výtěžnosti etanolu v la na 100 kg sušiny:
la bioetanol/ 100 kg sušina =
hmotnost zápary[g] ⋅ koncentrace bioetanolu [%] ⋅ 100 navážka šrotu [g] ⋅ sušina vzorku (%)
4.3 Vyhodnocení výsledků
Výsledky byly zpracovány do tabulek a grafů.
39
5.0 VÝSLEDKY A DISKUSE
Výtěžnost bioetanolu je ovlivněna chemickým složením obilného zrna. Svou roli zde sehrává také příprava rmutu, tj. granulace a použití specifických enzymů. Tato práce se zaměřila především na hodnocení průběhu zcukřování zápary při využití enzymatických preparátů firmy Genencor International. Hodnocena byla rychlost jejich účinku, efektivnost zcukřování a výtěžnost bioetanolu.
5.1 Vyhodnocení kvality použité suroviny
Podle Zimolky (2005), koreluje objemová hmotnost a podíl plných zrn s obsahem škrobu. Při vyšší objemové hmotnosti mají zrna nižší podíl obalových vrstev, což je výhodné pro zcukřování škrobu. U odrůdy Eurofit byla zjištěna hodnota 846,5 g/l, což je hodnota v porovnání s normou velmi vysoká, ale pokud to máme srovnat s obsahem škrobu, musíme konstatovat, že se nám nepotvrdila korelace s objemovou hmotností, protože obsah škrobu byl pouze 65,29 %, přičemž zrno pšenice může obsahovat i více jak 70 % škrobu. Stanovenou vysokou hodnotu objemové hmotnosti podporuje i vysoký podíl plných zrn, stanovených jako podíl nad sítem 2,5 a 2,8 mm. Z Tab. 12 vyplývá, že celkový podíl plných zrn u stanovovaného vzorku činil téměř 95 %, což můžeme považovat za velmi příznivou hodnotu. Bohužel se nepotvrdilo, že příznivé mechanické vlastnosti se pozitivně podílejí na vysokém podílu škrobu. Obsah
dusíku
podle
Šimůnka
(1996)
se
pohybuje
u
pšenice
mezi
9,25 % – 12,83 %. Pro výrobu bioetanolu je vhodnější nižší obsah N – látek, protože s jejich vyšší koncentrací klesá obsah škrobu. U našeho vzorku byla stanovena hodnota 12,3 %, což je možno považovat za méně příznivé a koresponduje to i s nižším obsahem škrobu. Přesto ale můžeme námi použitý vzorek považovat za vhodný pro výrobu bioetanolu, protože jak uvádí Zimolka (2005), pro výrobu bioetanolu je vhodná pšenice s minimálním obsahem škrobu 60%.
40
Tab. 12 Mechanické vlastnosti a chemické složení zrna pšenice Eurofit
obj.hmotnost [g/l]
846,5
škrob
65,29
N – látky
12,3
podíl plných zrn nad sítem 2,8 mm [%]
71,72
podíl plných zrn nad sítem 2,5 mm [%]
23,27
propad [%]
5,01
5.2 Vyhodnocení průběhu zcukřování zápar V rámci ztekucování a zcukřování byla prováděna analýza zápary. Po 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 100 minutách, 125 minutách a 150 minutách byly odebrány vzorky zápary (25ml) a stanoven u nich obsah jednotlivých sacharidů na HPLC. Výsledky v absolutních hodnotách jsou uvedeny v Tab. 13, ze které je možné vyčíst dynamiku změn jednotlivých sacharidů. Pro vyjádření dynamiky změn v obsahu jednotlivých sacharidů bylo použito grafické vyjádření.
Tab. 13 Absolutní hodnoty obsahu sacharidů v průběhu přípravy zápary
průběh
ztekucování / mg/100g
zcukření / mg/100g
cukr \ fáze (min)
0
30
60
90
100
125
150
oligosacharidy
6794
4829
2284
1812
626
281
187
maltotrióza
2607
2128
2984
843
415
379
288
maltóza
728
1628
2933
3976
4211
3621
2660
glukóza
62
1443
1568
3281
4682
5849
6507
suma
10191
10058
9829
10002
10034
10255
9792
41
Graf č. 1 Odbourávání oligosacharidů
odbourávání oligosacharidů 80 oligosacharidy [relativní %]
70 60 50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
čas [min]
Jak je vidět z grafu č.1, oligosacharidy jsou v průběhu přípravy zápary postupně odbourávány, což koresponduje s průběhem ztekucování a zcukřování škrobu. Za pozitivní můžeme považovat, že obsah oligosacharidů, které jsou nezkvasitelné, v průběhu rmutování klesl z 66,67 % na 1,91 %.
42
Graf č.2 Odbourávání maltotriózy
odbourávání maltotriózy 35
maltotrióza [relativní %]
30 25 20 15 10 5 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
čas [min]
U maltotriózy docházelo v prvních 60 minutách ke střídání nárůstu a poklesu štěpení maltotriózy, což bylo způsobeno nárůstem maltózy a glukózy. V dalších fázích procesu již obsah maltotriózy pouze klesal, což bylo způsobeno zpočátku přírůstkem maltózy a následně štěpnými procesy spojenými s tvorbou glukózy. Celkový pokles maltotriózy byl z 25,28 % na 2,94 %.
43
Graf č.3 Odbourávání maltózy
odbourávání maltózy 45
maltóza [ relativní %]
40 35 30 25 20 15 10 5 0 0
30
60
90
120
150
180
čas [ min]
Jak je vidět z grafu č.3 maltózy, v prvních 100 minutách vzrůstal její obsah, což bylo způsobeno štěpením oligosacharidů a maltotriózy. Po této době byl přidán zcukřující enzym, který štěpil maltózu na glukózu, a proto již docházelo ve zbývajícím čase pouze k poklesu obsahu maltózy. Obsah maltózy se zvýšil z 7,14 % na 27,17 %.
44
Graf č.4 Odbourávání glukózy
přírustek glukózy 70 glukóza [relativní %]
60 50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
čas [min]
Obsah glukózy v počátku rmutování byl nízký a odpovídal standartu chemického složení zrna. V průběhu 30 minut od počátku obsah glukózy mírně rostl. Největší nárust tvorby glukózy byl po přidání zcukřujícího enzymu, což koresponduje s průběhem zcukřování. Celkový obsah glukózy vzrostl z 6,08 % na 66,45 %. Tedy můžeme konstatovat, že obsah glukózy vzrostl více jak desetkrát oproti původní hodnotě. Podíl bez problému zkvasitelných sacharidů (maltóza a glukóza) na konci rmutování tvořil 93,62 % zápary.
45
5.3. Vyhodnocení výtěžnosti
Teoretická výtěžnost bioetanolu představuje při škrobnatosti 65,29 % v sušině maximální výtěžnost 43,5la/100 kg sušiny. Skutečný výtěžek bioetanolu byl pouze 32,9 la/100 kg sušiny, což lze považovat za průměrnou hodnotu. Příčiny nižšího výtěžku můžeme vidět v nedostatečném prokvašení zápary, ale zejména nedokonalým oddestilováním etanolu z prokvašené zápary, o čemž vypovídá i výtěžnost stanovená z prokvasu, která představuje 38 la/100 kg sušiny.
46
6.0 ZÁVĚR
V rámci bakalářské práce byla studována problematika výroby bioetanolu z různých surovin v závislosti na různé přípravě rmutů. Hlavní pozornost pak byla věnována produkci bioetanolu z obilovin, kde jsme se zaměřili zejména na způsoby přípravy obilných rmutů. V rámci těchto aktivit byl hodnocen průběh ztekucování a zcukřování zrna pšenice odrůdy Eurofit pomocí enzymatických přípravků firmy Genencor International. Na základě dosažených výsledků lze formulovat tyto závěry: •
U pšenice odrůdy Eurofit byly stanoveny tyto ukazatele lihovarnické kvality: Objemová hmotnost 846,5 g/l; podíl plných zrna jako podíl nad sítem 2,8 mm 71,72 % a podíl nad sítem 2,5 mm 23,27 % a propad 5,01 %; obsah dusíku 12,3 % a obsah škrobu 66,43 %. Podle zjištěných charakteristik byla surovina použitelná pro výrobu bioetanolu.
•
V průběhu ztekucování a zcukřování zápary byly hodnoceny změny v chemickém složení rmutu. Při použití enzymů pro ztekucování a zcukřování byly stanoveny následující změny v obsahu sacharidů: Nárůst glukózy z 6,08 % na 66,45 % a nárůst maltózy z 7,14 % na 27,17 %. Naopak pokles oligosacharidů byl z 66,67 % na 1,29 % a pokles maltotriózy byl z 25,58 % na 2,94 %. Z těchto hodnot lze vyvodit, že dané enzymy jsou vhodné pro přípravu zápar.
•
Výtěžnost bioetanolu byla 32,9 la/ 100 kg sušiny, kde teoretická výtěžnost byla maximálně 38 la/ 100kg sušiny, což značí průměrnou výtěžnost. Ztráty byly dány zejména neúplným oddestilováním prokvašené zápary.
47
LITERATURA
AUFHAMER, W. – PIEPER, H.J. – STÜTZEL, SCHÄFER, V. eignung von Korngut verschiedener Getreidearten zur Bioethanolproduction in Abhängigkeit von der Sorte und den Autwuchsbedingungen. Die Bodenkultur. Die Bodenkultur, 1994, 45, 2. s. 177- 187
BASAŘOVÁ G. pivovarsko – sladařská analytika 1. díl, Merkanta Praha, 1992, s. 385 DIVIŠ, J. Český lihovarský průmysl a bioetanol. Kvasný průmysl, 2004, (9)., s. 268-270
DYR, J. a kol. Lihovarství 1.díl. SNTL Praha, 1956, 320 s . DYR J. a kol. Lihovarství 2.díl. SNTL Praha, 1963, 402 s.
EXNAR, P. – GARAI, J. – MELZOCH, K. ET AL. Lihovarská příručka. Agrospoj Praha, 1998, s. 215
HAMROVÁ, L. Technologie zemědělského lihovarství. Alfa Bratislava, 1988, 185 s.
HAMPL, J. Cereální chemie a technologie. Nakladatelství technické literatury Praha, 1970 s. 51 - 142
JEŠETA, M. Úskalí biopaliv. Úroda, 2007, (6)., s. 41 – 43
JEVIČ, P. Výroba a tržní uplatnění motorových biopaliv. Agromagazín, 2006, (2)., s. 22 - 28 KÁRA J. Motorová paliva z biomasy v ČR, ÚZPI , 2001 KENT, L.N. – EVERS, D. A. Technology of cereals. 4th edition, Elsevier Science Ltd, Oxford, 1994, s.334
48
KOSAŘ, K – PROCHÁZKA. S. et al, : Technologie výroby sladu a piva, 2000, 398 s. ISBN 80 – 902658 – 6 –3
KOUTNÍK, V. BIOCHEMIE. SPŠCH Brno, 2001, s.60
KREIPE, H. Getreide – und Kartoffel – brennerei. Verlag ulmer Stuttgart, 1981, 358 S.
KRUGER J.E. Biochemistry of Preharvested Sprouting in Cereals 1989, s. 61-84.
KUČEROVÁ, J. Technologie cereálií. Skripta MZLU, 2004, 141 s.
LINDHAUER,
G.
M.
–
ZWINGELBERG,
H.
Weizen
für
besondere
Verwendungzwecke – 2. Mitt: Stärkegewinnung. Getreide Mehl und Brot, 1997, 51, 2, s. 67 –70.
MANELIUS, R. – ZHUQIN, - AVALL, A. – ANDTFOLK, H. – BERTROFT, E. the mode of action on granular wheat starch by bacterial α- amylase. Starch/Starke, 1997, 49, 4, s.142-147.
PELIKÁN, M. – DUDÁŠ, F. – MÍŠA, D. Technologie kvasného průmyslu. Skripta MZLU Brno, 1996, 135 s.
PELIKÁN, M. Jakost a zpracování rostlinných produktů. Skripta jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 231 s.
PETR, J. Biopaliva – produkce biomasy. Úroda, 2007, (3), s. 65 –67
PETR, J. Biopaliva – produkce lihu. Úroda, 2007, (2)., s. 71 - 73
PETR, J. Tritikale pro produkci bioetanolu. Úroda, 2006, (7)., s. 17 – 19
49
PIEPER, H. J. – THOMA, L. Vergleichende Untersucht zur amylolytichen Wirkung von
Handelsenzympräpareten
in
der
Alkoholproduktion
unter
Besonderer
Berücksichtigung druchloser Maischverfahren. Branntweinwirtschaft, 1989, 129, s 700 – 800
RYCHTERA, M. – UHER, J. – PÁSA, J. Lihovarství, drožďařství a vinařství I. a II. část. Skripta VŠCHT Praha, 1991, 351 s. ISBN 80 – 7080 – 117 – 4
ŠILHÁNKOVÁ, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology . Academia Praha, 2002, 332s. ISBN 80 – 200 – 1024 – 6
ŠIMŮNEK, P. Obiloviny pro výrobu lihu, Úroda, 1996 (7) S. 25
TREGUBOV, N. a kol. Technológia škrobu. Alfa Bratislava, 1986, 476 s.
VELÍŠEK, J. Chemie potravin I. díl. Ossis Tábor, 2002, s.171 – 235
VELÍŠEK, J. Chemie potravin II. díl. Ossis Tábor, 2002, s. 168
VODRÁŽKA, Z. – RAUCH, P. – KANIŠ, J. Enzymologie. Skripta VŠCHT Praha, 1991, 245 s.
VODRÁŽKA, Z. Biochemie. Academia Praha, 1996 515, s. ISBN 80 –200-0438-6
WESENBERG, J. Der drucklose enzymatische Strkeaufschu von Rohstoff fur die Getredebrennerei. Die Brannweinwirtscaft, 1990, 22, s. 162 – 168
ZEHNÁLEK, J. Biochemie. Skripta MZLU Brno, 195 s.
ZIMOLKA, J. Pšenice – pěstování, hodnocení a užití zrna. Profi Press Praha , 2005, s. 163
50
ZALDIVAR, J. Fuel ethanol production from lignocellulose a challenge for metabolic engineering and process integration. Applied microbiology and biotechnology. July 2001, v 56 (1/2). p. ISSN 0175 – 7598 Ambidg
Internetové odkazy: www.bioetanol.cz www.ekoenzym.cz www.novozym.com
51
