Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Bílkoviny v mléce Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Brno 2013
Marie Poláčková
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Bílkoviny v mléce vypracovala samostatně a použila pouze pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne…………………………………... podpis bakaláře ……………………...
PODĚKOVÁNÍ
Tímto bych chtěla poděkovat paní doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady, které mi poskytovala během zpracování bakalářské práce a zároveň za čas, který věnovala konzultacím.
ABSTRAKT Bílkoviny mléka tvoří kaseinové, syrovátkové a ostatní bílkoviny. Kasein tvoří čtyři frakce (αs1-, αs2-, β- a κ-kasein) a jednu frakci vzniklou štěpením β-kaseinu (γ-kasein). Do syrovátkových bílkovin patří α-laktalbumin, β-laktoglobulin, bovinní sérový albumin a imunoglobuliny. K ostatním bílkovinám patří např. laktoferin, enzymy, aj. Kaseiny se v mléce nacházejí v podobě kaseinové micely. Většina kaseinů jsou fosfoproteiny. Pouze κ-kasein je glykoprotein. Množství mléčných bílkovin závisí na mnoha faktorech.
Klíčová slova: mléko, bílkoviny mléka, kaseinové bílkoviny, syrovátkové bílkoviny, kaseinová micela, genetický polymorfismus, alergie.
ABSTRACT Milk proteins are casein, whey and other proteins. Casein consists of four fractions or casein (αs1-, αs2-, β- and κ-casein) and one fiction caused cleavage of β-casein (γ-casein). To include whey protein α-lactalbumin, β-lactoglobulin, bovinne serum albumin and imunoglobulins. The other proteins include lactoferrin, enzymes, etc. The caseins in milk are in the from of casein micelles. Most caseins are phosphoproteins. Only κ-casein is a glykoprotein. The amount of milk protein dependes on many factors.
Key words: milk, milk proteins, casein proteins, whey proteins, casein micelles, genetic polymorphism, allergy.
Obsah 1
ÚVOD ....................................................................................................................... 9
2
CÍL PRÁCE ........................................................................................................... 10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................... 10
3.1 Mléko...................................................................................................................... 11 3.1.1
Složky mléka................................................................................................... 12
3.2 Bílkoviny ................................................................................................................ 12 3.2.1
Charakteristika bílkovin z chemického hlediska ............................................ 12
3.2.2
Struktura bílkovin ........................................................................................... 13
3.2.2.1
Primární struktura .................................................................................. 13
3.2.2.2
Sekundární struktura............................................................................... 13
3.2.2.3
Terciální struktura................................................................................... 14
3.2.2.4
Kvarterní soustava .................................................................................. 14
3.2.3
Rozdělení bílkovin .......................................................................................... 14
3.2.3.1
Podle složení ........................................................................................... 14
3.2.3.2
Podle nebílkovinného podílu, který se váže na polypeptidový řetězec ... 15
3.2.3.3
Podle biologické funkce, kterou v organismu vykonávají ....................... 15
3.3 Mléčné bílkoviny ................................................................................................... 15 3.3.1
Význam mléčných bílkovin ............................................................................ 16
3.3.2
Tvorba a sekrece mléčných bílkovin .............................................................. 17
3.3.3
Celkový kasein ................................................................................................ 18
3.3.3.1
Struktura kaseinové micely ..................................................................... 20
3.3.3.2
α-kaseiny ................................................................................................. 23
3.3.3.3
β-kaseiny ................................................................................................. 25
3.3.3.4
κ-kasein ................................................................................................... 27
3.3.3.5
γ-kasein ................................................................................................... 29
3.3.4
Syrovátkové bílkoviny .................................................................................... 29
3.3.4.1
β-laktoglobulin ........................................................................................ 30
3.3.4.2
α-laktalbumin .......................................................................................... 33
3.3.4.3
Imunoglobuliny ....................................................................................... 34
3.3.4.4
Serumalbumin ......................................................................................... 35
3.3.5
Ostatní mléčné bílkoviny ................................................................................ 36
3.3.5.1
Bazické bílkoviny .................................................................................... 36
3.3.5.2
Enzymy a lipoproteiny............................................................................. 36
3.3.5.3
Proteoso-peptony .................................................................................... 37
3.3.5.4
Laktoferin ................................................................................................ 37
3.4 Druhy mlék ............................................................................................................ 39 3.4.1
Rozdělení mlék podle vzájemného zastoupení hlavních druhů bílkovin ....... 39
3.4.1.1
Mléko kravské ......................................................................................... 39
3.4.1.2
Mléko ovčí ............................................................................................... 40
3.4.1.3
Mléko kozí ............................................................................................... 41
3.4.1.4
Mléko buvolí ........................................................................................... 42
3.4.2
Rozdělní mlék podle rozdílů ve vlastnostech a složení během laktace .......... 43
3.4.2.1
Mléka aberantní ...................................................................................... 43
3.4.2.2
Mlezivo .................................................................................................... 43
3.5 Faktory podílející se na množství bílkovin ......................................................... 44 3.5.1
Plemeno .......................................................................................................... 44
3.5.1.1
Skot.......................................................................................................... 45
3.5.1.2
Ovce ........................................................................................................ 45
3.5.1.3
Kozy ........................................................................................................ 45
3.5.1.4
Buvoli ...................................................................................................... 45
3.5.2
Stádium laktace ............................................................................................... 46
3.5.2.1
Kolostrální období .................................................................................. 46
3.5.2.2
Období produkce zralého mléka ............................................................. 46
3.5.2.3
Produkce starodojného mléka ................................................................. 46
3.5.3
Denní kolísání složek mléka ........................................................................... 46
3.5.4
Stáří dojnice .................................................................................................... 47
3.5.5
Vliv sezóny ..................................................................................................... 47
3.5.6
Vliv výživy ..................................................................................................... 47
3.5.7
Zdravotní stav ................................................................................................. 48
3.5.7.1
Vliv mastitidy .......................................................................................... 48
3.6 Genetický polymorfismus mléčných bílkovin .................................................... 50 3.7 Alergie na mléčnou bílkovinu .............................................................................. 52 3.7.1
Atopie.............................................................................................................. 55
3.7.2
Neatopická cesta ............................................................................................. 55
4
ZÁVĚR .................................................................................................................. 56
5
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ................................................................. 58
1
ÚVOD
Mléko již od pradávna slouží k výživě člověka. Je velmi vhodnou potravinou z nutričního hlediska, jelikož obsahuje esenciální aminokyseliny a je plnohodnotným zdrojem vápníku. Z výživového hlediska jsou významná mléka kaseinová, tedy mléka s obsahem kaseinových bílkovin více než 75 % z celkového obsahu bílkovin, ačkoli v přírodě se vyskytují více mléka albuminová. Z hlediska produkce je na prvním místě mléko kravské, které je následováno mlékem buvolím, kozím, ovčím a mlékem dalších druhů zvířat. Bílkoviny mléka se dělí do dvou hlavních skupin, definovaných podle rozpustnosti při okyselení mléka na hodnotu pH 4,6. Jedná se o kaseiny a syrovátkové bílkoviny. Kaseinové bílkoviny tvoří během srážení nerozpustnou sraženinu, zatímco syrovátkové bílkoviny mají hydrofilní povahu a odcházejí do syrovátky. Kaseiny jsou tvořeny čtyřmi frakcemi (αs1-, αs2- β- a κ-kasein) a jednou odvozenou frakcí (γ-kasein), která vzniká v důsledku štěpení β-kaseinu pomocí plazminu. S výjimkou κ-kaseinu, který se řadí mezi glykoproteiny, jsou kaseinové frakce fosfoproteiny. Kyselina fosforová je v molekulách kaseinů estericky vázána. Syrovátkové bílkoviny jsou tvořeny β-laktoglobulinem, α-laktalbuminem, bovinním sérovým albuminem a imunoglobuliny. Dále se v mléce nacházejí v minoritním poměru ostatní bílkoviny. Jedná se o bazické bílkoviny, proteoso-peptony, enzymy, lipoproteiny a laktoferin. Proteoso-peptony vznikají při štěpení β-kaseinu. Laktoferin je významným zdrojem železa. Všechny bílkoviny mléka jsou polymorfní. Existuje mnoho genetických variant jednotlivých bílkovin. Množství jednotlivých bílkovin je závislé na druhu zvířete, od kterého mléko pochází a na mnoha dalších faktorech. Mléčné bílkoviny mohou způsobovat u některých jedinců alergie. Mezi nejvýznamnější alergeny mléka patří κ-kasein a β-laktoglobulin. Mnohem menší procento alergických reakcí vyvolávají α-laktalbumin a bovinní sérový albumin.
9
2
CÍL PRÁCE
Cílem bakalářské práce bylo prostudovat odbornou literaturu o struktuře bílkovin obsažených v mléce, zastoupení aminokyselin v kaseinových a syrovátkových bílkovinách mléka. Nastudovat rozdíly v zastoupení bílkovin v mléce kravském, ovčím, kozím a buvolím. Zaměřit se při studiu odborné literatury na faktory ovlivňující složení a obsah bílkovin v mléce.
10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Mléko Už od pradávna je mléko jednou ze základních potravin určených k výživě lidí (BERANOVÁ, 2011). Základní definice mléka je uvedena v Codex Alimentarius: „Mléko“ je sekretem mléčné žlázy zvířat, které produkují mléko, získaný dojením, do kterého nebylo nic přidáno ani z něho nic odebráno, který je určený pro konzumaci v tekutém stavu, nebo určený pro další zpracování. V USA je mléko definováno jako mléčný sekret, který neobsahuje mlezivo a je získaný úplným vydojením jedné nebo více zdravých krav, který obsahuje minimálně 8,25 % tukuprosté sušiny a nejméně 3,25 % mléčného tuku. „Syrovým mlékem“ se pak rozumí mléko, které je produkované díky sekreci v mléčné žláze hospodářských zvířat, které nebylo vystaveno ohřevu přesahujícímu 40 °C, a nebylo ani ošetřeno žádným způsobem s rovnocenným účinkem (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Mléko tvoří základní zdroj výživy především pro mláďata, která z něj získávají potřebné protilátky a vitamíny pro upevnění své imunity. Konzumace mléka je u mláďat omezena na dobu, dokud nejsou schopna sama přijímat a trávit pevnou stravu. U lidí konzumace mléka funguje obdobně s tou výjimkou, že dospělá populace konzumuje mléko od rozličných hospodářských zvířat. Člověk je jediným živočichem, který je schopen řádně trávit mléčné bílkoviny i ve stáří (KOPÁČEK a ELLMANN, 2009). Mléko má tři hlavní funkce, kterými jsou nutriční funkce, imunologická a fyziologická funkce (GREPPI a kol., 2008). Nutriční hodnota mléka spočívá v poskytování esenciálních aminokyselin, které jsou nezbytné pro správný vývin svaloviny a jiných tkání mláďat savců (FOX a MCSWEENEY, 1998). Ve vyspělých představují mléčné bílkoviny 30 % z celkového příjmu bílkovin (GREPPI a kol., 2008). Největší význam konzumace mléka je v dobře využitelném zdroji vápníku. Vápník, který se nachází v mléce, je velmi dobře vstřebatelný a zůstává zadržený v kostech a nedochází k jeho vyloučení v moči. Jeho obsah v mléce je poměrně vysoký (KOPÁČEK a ELLMANN, 2009). Množství vápníku v mléce se pohybuje v rozmezí 120 - 130 mg.100 ml-1 (ŠUSTOVÁ, 2012). Ve vyspělých zemích tvoří až 75 % spotřeby vápníku (GREPPI a kol., 2008). 11
3.1.1
Složky mléka
Hlavní složku mléka tvoří voda. Její procentuální zastoupení se podle původu mléka pohybuje ve velmi širokém rozmezí. Zbytek poté tvoří sušina. Sušina se dále dělí na tukuprostou sušinu (TPS) a tuk v sušině (TvS). TPS zahrnuje zbylé složky mléka, kterými jsou laktóza, enzymy, hormony, vitamíny, minerální látky a nebílkovinné látky dusíkaté povahy. Obsah jednotlivých složek je závislý na druhu mléka a jiné řadě faktorů, které jsou detailněji popsány v kapitole 7.
Tabulka 1 Obsah hlavních složek v mléce (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012) Savec
Sušina (%)
Tuk (%)
Bílkoviny (%)
Laktosa (%)
Minerální látky (%)
Člověk
12,2
3,8
1,0
7,0
0,2
Skot
12,7
3,7
3,4
4,8
0,7
Buvol
16,8
7,4
3,8
4,8
0,8
Koza
12,3
4,5
2,9
4,1
0,8
Ovce
19,3
7,4
4,5
4,8
1,0
Kůň
11,2
1,9
2,5
6,2
0,5
Osel
11,7
1,4
2,0
7,4
0,5
Sob
33,1
16,9
11,5
2,8
3.2 Bílkoviny 3.2.1
Charakteristika bílkovin z chemického hlediska
Bílkoviny jsou vysokomolekulární látky, které jsou složeny z aminokyselin. Ty se skládají v polypeptidové řetězce (INGR, 2007). Ve své molekule obsahují bílkoviny více než 100 aminokyselin. Mimo peptidickou vazbu hrají významnou roli na vytváření struktury proteinů ještě disulfidové, esterové a amidové vazby (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
12
3.2.2
Struktura bílkovin
Molekuly bílkovin jsou natolik velké, že pojem struktura je nutno chápat z mnohem širšího hlediska než jak je tomu u jednodušších organických sloučenin (MCMURRY, 2007). V řadě případů je ovšem nezbytné také znát detailnější strukturu proteinů (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
Podle McMurryho (2007) existují čtyři úrovně struktury •
primární
•
sekundární
•
terciální
•
kvarterní
3.2.2.1 Primární struktura Jedná se o uspořádání aminokyselin v polypetidovém řetězci (INGR, 2007). Mluvíme o tzv. sekvenci aminokyselin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). 3.2.2.2 Sekundární struktura Polypeptidové řetězce nativních bílkovin mají v různých částech řetězce určitou sekundární strukturu, určitou konformaci, která je dána jejich primární strukturou a fixována nevazebnými interakcemi funkčních skupin aminokyselin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Tato struktura tedy označuje uspořádání jednotlivých úseků polypeptidového řetězce (MCMURRY, 2007). Nejvýznamnějšími prvky sekundární struktury jsou helikální struktury, které vzniknou stočením řetězce nebo jeho části do helixu, neboli do šroubovice. Šroubovice může být levotočivá i pravotočivá. V přírodě se, až na výjimky objevují jen pravotočivé helixy. Významnými sekundárními strukturami jsou α-helix a β-struktura, která se objevuje ve formě skládaného listu nebo hřebenu (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). KLOUDA (2000) uvádí, že další β-strukturou jsou tzv. klubka. Tyto struktury poté tvoří asi polovinu průměrné globulární bílkoviny. Na rozdíl od α-helixu nebo struktury skládaného listu se jedná o strukturu neopakující se.
13
3.2.2.3 Terciální struktura Celkovou konformaci polypeptidového řetězce určuje terciální struktura. Jednotlivé úseky v bílkovinném řetězci, které mají různou sekundární strukturu, nejsou rovinné útvary. Ale mohou být různým způsobem prohnuté, svinuté a navzájem spojené. U mnoha proteinů je terciální struktura dnes již známa (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ2009). Zjednodušeně, terciální struktura popisuje, jak je celá molekula bílkoviny orientovaná v trojrozměrném prostoru (MCMURRY, 2007). 3.2.2.4 Kvarterní soustava Řada molekul proteinů není tvořena jedním, nýbrž několika identickými nebo odlišnými polypeptidovými řetězci. Tyto řetězce pak tvoří komplexní strukturu, tzv. kvarterní struktury bílkoviny. Ta vzniká působením kovalentních vazeb, především těch disulfidických, a nevazebných interakcí (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Kvarterní soustava popisuje způsob, jakým je několik molekul bílkovin spojeno do velkých agregátů (MCMURRY, 2007). 3.2.3
Rozdělení bílkovin
3.2.3.1 Podle složení Podle McMurryho (2007) se bílkoviny podle složení dělí: •
jednoduché
•
složené neboli konjugované
Jednoduché mléčné bílkoviny, ve kterých jsou obsaženy pouze aminokyseliny, jsou řazeny do skupiny globulárních bílkovin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Globulární proteiny nebo také sféroproteiny, kam se řadí mléčný laktalbumin, mají svoji molekulu oblou až kulovitou. Nepolární funkční skupiny jsou uvnitř molekuly, polární funkční skupiny poté tvoří obal molekuly, na nějž se váží molekuly vody, proto jsou proteiny vesměs rozpustné ve vodě nebo v zředěných roztocích solí a tvoří koloidní soustavy (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
14
3.2.3.2 Podle nebílkovinného podílu, který se váže na polypeptidový řetězec •
glykoproteiny
•
fosfoproteiny
Mezi glykoproteiny patří z mléčných bílkovin κ-kasein. Glykoproteiny obsahují ve své molekule sacharid, spojený s aminokyselinami bílkovinného řetězce kovalentní vazbou. Do skupiny fosfoproteinů se řadí z mléčných bílkovin zbylé frakce kaseinu. Fosfoproteiny vznikají spojením bílkoviny, na kterou je pomocí esterové vazby navázána kyselina fosforečná (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). 3.2.3.3 Podle biologické funkce, kterou v organismu vykonávají •
strukturní
•
katalytické
•
transportní
•
pohybové
•
obranné
•
zásobní
•
senzorické
•
regulační
•
výživové
Mléčné bílkoviny se řadí mezi proteiny obranné, kam patří např. imunoglobuliny syrovátkových bílkovin, a výživové proteiny, kam spadají jednotlivé frakce kaseinů a syrovátkové bílkoviny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
3.3 Mléčné bílkoviny Studie o systému mléčných bílkovin probíhá již více než 100 let, a představuje poměrně obtížnou záležitost (FORMAGGIONI a kol., 1999). Původně se věřilo, že jsou bílkoviny mléka pouze jednoduchou homogenní skupinou. Až mnohem později se zjistilo, že se jedná o velmi komplikovanou heterogenní skupinu (PHADUNGATH, 2005).
15
Mléčné bílkoviny neboli také čistá bílkovina je součástí hrubé bílkoviny, jinak označované jako dusíkaté látky, které tvoří nejkomplexnější složku mléka (GAJDUŠEK, 1993). Jsou charakteristické svou velkou rozmanitostí a přítomností několika izoforem u různých druhů přežvýkavců (RONCADA a kol., 2012). Mléčné bílkoviny se dělí do dvou velkých skupin v závislosti na jejich chování při okyselování mléka na hodnotu pH 4,6. Rozpustné frakce se označují jako syrovátkové bílkoviny a jsou tvořeny několika frakcemi, z čehož mezi nejdůležitější bílkoviny patří α-laktalbumin a β-laktoglobulin. Frakce, které jsou nerozpustné, se nazývají celkový kasein a jsou složeny ze čtyř různých nativních kaseinových frakcí (FORMAGGIONI a kol., 1999). Dále mléko obsahuje dusíkaté frakce nebílkovinného původu, kam spadají volné aminokyseliny, vitamíny skupiny B, kreatin, amoniak, nukleotidy, sulfokyanid, kyselina orotová a další látky. Nebílkovinné dusíkaté frakce tvoří 0,13 - 0,25 % z celkové bílkoviny mléka (ZADRAŽIL, 2002). Syrovátkové bílkoviny jsou v mléce přítomny ve formě rozpustných látek, které přecházejí do syrovátky, zatímco kaseiny jsou přítomny v micelární podobě. Kromě toho je část celkového obsahu bílkovin vázána na membrány tukových globulí mléčného tuku (RONCADA a kol., 2012). 3.3.1
Význam mléčných bílkovin
Význam bílkovin mléka spočívá: a) v nutriční hodnotě, b) ve fyziologické úloze, kterou plní některé z proteinů mléka, jakými jsou imunoglobuliny, laktoferin, laktoperoxidáza, vitamíny které váží protein, biologicky aktivní peptidy aj., c) z hlediska technologie, mají nezastupitelnou úlohu v následujících mlékárenských technologiích: •
při výrobě sýrů a kysaných mléčných výrobků, podmiňují správný průběh technologických procesů, reologické vlastnosti daného výrobku a vazbu vody,
•
při výrobě UHT (ultra heit technologie, jedná se, jak již vyplývá s názvu, o mléčný výrobek, který byl vystaven tepelnému záhřevu o vysoké teplotě pohybující se v rozmezí 135 - 150 °C, po krátkou dobu a u kterého došlo ke zničení mikroorganismů včetně jejich spor, přičemž výrobek neztratil téměř nic 16
ze svých nutričních vlastností), (ŠUSTOVÁ a SÝKORA, 2013), pasterovaných a sterilizovaných mléčných výrobků, je tepelná stabilita mléčných proteinů důležitá (NAVRÁTILOVÁ a kol, 2012). 3.3.2
Tvorba a sekrece mléčných bílkovin
Syntéza bílkovin probíhá na buněčné úrovni a začíná na ribozomech granulárního endoplazmatického retikula (JELÍNEK a kol., 2003), konkrétně v jeho lumenu. Polypeptidy poté putují dále do Golgiho aparátu. Od nějž se následně odškrcují malé váčky. Poté polypeptidy putují k apikálnímu pólu buňky (FOX a MCSWEENEY, 1998). V průběhu celého procesu sekrece zásobují mitochondrie buňku energií, která se získává štěpením adenozintrifosfátu (ATP) pomocí enzymu adenozintrifosfatázy. Jedná se o enzym, který hraje, mimo poskytnutí energie pro transport iontů, také významnou roli v procesu vlastního vyloučení sekretu. Tvorba mléka je nerovnoměrná. U skotu bývá nejintenzivnější tři hodiny po vydojení (JELÍNEK a kol., 2003). Většina proteinů mléka je syntetizována v mléčné žláze z aminokyselin krevní plazmy (SEDMÍKOVÁ, 2006). V krvi, která přitéká do mléčné žlázy, je obsaženo o 30 – 40 % volných aminokyselin více než v krvi, která z mléčné žlázy odtéká. Jedná se o arteriovenózní rozdíl, který lze rovněž zaznamenat i v obsahu složek krevní plazmy. Dále se syntézy mléčných bílkovin účastní i peptidy a některé zaměnitelné aminokyseliny, které se tvoří přímo ve vemeni dojnice (JELÍNEK a kol., 2003). Další aminokyseliny pro syntézu proteinů mléka pocházejí rovněž z degradace buněčného a vnitrobuněčného proteinu (TANČIN a kol., 2001). Zdrojem fosfátů, který se vyskytuje v kaseinu v podobě kyseliny serinfosforečné, jsou anorganické fosfáty z krve (ZADRAŽIL, 2002). Globuliny jsou obsaženy v krvi, z níž přecházejí do mléka (URBAN, 1997). Pro tvorbu mléka je nezbytný přísun esenciálních a neesenciálních aminokyselin (SEDMÍKOVÁ, 2006). U přežvýkavců tvoří zdroj těchto aminokyselin z části i bachorová mikroflóra (ZADRAŽIL, 2002). U těchto zvířat jsou aminokyseliny, které jsou nepostradatelné, tvořeny za pomoci syntézy mikroorganismů v předžaludku. Ovšem tyto aminokyseliny nejsou pro tvorbu mléčných bílkovin dostačující. Proto mléčná žláza odebírá z krve ještě měnící se množství globulinu, glykoproteinů, fibrinogenu, albuminu a dusíkatých nebílkovinných látek. Nejdůležitější zdroje uhlíku, které slouží pro tvorbu strukturální kostry aminokyselin, které jsou syntetizovány 17
v mléčné žláze, jsou u přežvýkavců těkavé mastné kyseliny, mezi které patří především kyselina octová, propionová a máselná (JELÍNEK a kol., 2003). Dále se na tvorbě kostry podílejí vyšší mastné kyseliny. Jedná se o kyselinu palmitovou a olejovou (PAVLÍK a SLÁMA, 2011). U monogastrů se jedná navíc ještě o glukózu (JELÍNEK a kol., 2003). Na transportu aminokyselin se podílejí červené krvinky. Epitelové buňky mléčné žlázy extrahují aminokyseliny z krve ve velmi širokém rozmezí, které činí 5 - 69 % a na transmembránový přesun aminokyselin do cytoplazmy užívají několik transportních systémů. Aminokyseliny z krve po svém přechodu do buněčné alveoly mléčné žlázy vytvoří v cytoplazmě zásobu volných aminokyselin (TANČIN a kol., 2001). Aminové skupiny důležité pro transaminaci pocházející především z cystinu, glycinu, příp. dalších aminokyselin. Monogastrická zvířata jsou oproti přežvýkavcům odkázána na přísun esenciálních aminokyselin ve formě potravy (JELÍNEK a kol., 2003). Kasein není složkou krevního séra, jeho syntéza probíhá v mléčné žláze, podobně je tomu i u α-laktalbuminu a β-laktoglobulinu. Imunoglobuliny a sérové albuminy tvoří složku krevního séra a přecházejí do mléka beze změny (JELÍNEK a kol., 2003). Mléčné proteiny jsou z alveol mléčné žlázy transportovány pomocí děje, který označujeme jako exocytóza (FOX a MCSWEENEY, 1998). Krátce po otelení již začíná sekrece mléčných bílkovin (JELÍNEK a kol., 2003).
3.3.3
Celkový kasein
Kasein kravského mléka se skládá z několika frakcí, které se od sebe navzájem liší strukturou (NENTWICH a kol., 2004). Obsah kaseinu v kravském mléce je v rozmezí 26 - 37 g.l-1, v mléce koz je jeho obsah 22 - 28 g.l-1 (GREPPI a kol, 2008). Kaseiny vykazují velkou variabilitu, zejména pak β- a α-kaseinové frakce (RONCADA a kol., 2012). Množství bílkovinných frakcí u kravského mléka je v procesu celé laktace (normovaná laktace trvá 305 dní) velmi nestálé (JELÍNEK a kol., 2003). Unikátní schopností kaseinů je jejich posttranslační modifikace, která vyplývá z fosforylace na zbytky serinu nebo treoninu (PHADUNGATH, 2005). 18
Mléko je směs heterogenní skupiny čtyř frakcí kaseinů. Jedná se o αs1-, αs2-, βa κ-kasein. Jejich podíl v kravském mléce je 45, 10, 34 a 11 % z celkového obsahu kaseinu v kravském mléce (NINTWICH a kol., 2004). Všechny kaseinové frakce jsou schopné vázat na svém povrchu vápník. Obsah navázaného vápníku přímo závisí na množství fosfoproteinových zbytků v molekule. Proto kapacita vazby u jednotlivých kaseinů postupně klesá. Klesá od αs2-kaseinu a pokračuje přes αs1-, β-kasein až po κ-kasein (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Kasein se od většiny ostatních bílkovin velmi liší. Jedná se o hydrofobní bílkovinu, která má poměrně vysoký náboj, hodně prolinu a zbytky cystinu (WALSTRA a kol., 2006). Je řazen mezi nejdůležitější mléčné bílkoviny a je významný z hlediska technologického a nutričního aspektu (LUKAŠOVÁ, 1999). Kasein představuje dobrý zdroj aminokyselin. Dalšími jeho funkcemi jsou i různé fyziologické účinky. Ty vykonávají peptidy, které jsou odvozené od kaseinových frakcí a obohacené o fosforečnou skupinu. Nazývají se fosfopeptidy (CPP). Jejich funkce spočívá v přenosu minerálních látek a zabránění vysrážení iontu vápníku ve formě fosforečnanu vápenatého nebo fytátu, čímž dochází ke zvýšení podílu vápníku pro absorpci v tenkém střevě. Fosfoproteiny se tvoří in vivo při trávení z αs1-, αs2- a β-kaseinu pomocí gastrointestinálních proteáz a in vitro podle tryptické nebo chymotryptické fragmentace bovinního kaseinu (FERRARETTO a kol., 2003). Kaseiny jsou heterogenní skupina fosfoproteinů (ZADRAŽIL, 2002) s výjimkou κ-kaseinu, který se řadí mezi glykoproteiny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
Jedná
se o hlavní bílkovinu mléka, mluvíme – li o mléce kaseinovém. Je syntetizován mléčnou žlázou, jak bylo zmíněno výše, a tvoří v mléce přežvýkavců převážnou část bílkovin (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Známe jeho aminokyselinovou stavbu i strukturu (GAJDŮŠEK, 2003). Z aminokyselin u kaseinu chybí cystin a hydroxyprolin (ZADRAŽIL, 2002). Z mléka se kasein vysráží pomocí okyselení na izoelektrický bod 4,6 pH a při teplotě 20 °C (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Celkový kasein zahrnuje asi 30 různých a rozdílných frakcí fosfoproteinů, které tvoří hlavní složku disperzní fáze mléka. V mléce je vázán na vápník. Vápenatou sůl, kaseinát vápenatý, lze z mléka vysrážet za pomoci etanolu (GAJDŮŠEK, 2003). Jedním z dělení pro kaseiny, je dělení, které se provádí na základě stanovení úplné primární struktury a rozdílného stupně fosforylace. Dřívější klasifikace, jakými jsou 19
klasifikace na základě rozpustnosti v močovině a charakterizace na základě pohyblivosti elektroforetických frakcí ve škrobovém gelu, jsou v současnosti jen doplňujícími kritérii. Kasein je v mléce rozptýlen ve formě koloidního roztoku (TUINIER a DE KRUIFT, 2002), což způsobuje typické bílé zbarvení mléka (BLÁHA a ŠREK 1999). V mléce se vyskytuje ve formě kaseinové micely. Celkový kasein je v kravském mléce obsažen v 78 - 85 %. Fosfor v molekule kaseinu je vázán pomocí esterické vazby na kasein hydroxyskupinami serinu a treoninu. V kaseinových frakcích chybí z 21 esenciálních aminokyselin pouze cystin, ten je obsažen v bílkovinách mléčného séra. Kasein je bílkovina s kyselou povahou. Tato povaha je zapříčiněna karboxylovou skupinou (ZADRAŽIL, 2002). Jednotlivé frakce jsou zastoupeny v mléce v určitém poměru. Jejich kolísání je u dojnic zapříčiněno genetickými rozdíly. Jednotlivé kaseinové frakce se od sebe navzájem odlišují hodnotami poměrné molekulové hmotnosti, elementárním složením, dále hodnotou izoelektrického bodu a obsahem aminokyselin (LUKAŠOVÁ, 1999). Kasein má dvě primární úlohy, transport vápníku z mateřského mléka mláďatům a sdružování fosforečnanu vápenatého v koloidní podobě (TAMINE, 2007). 3.3.3.1 Struktura kaseinové micely Označení kaseinová micela bylo představeno v roce 1921. Před tím, v roce 1918, se kaseinová micela označovala jako kaseinát vápenatý s částicemi fosforečnanu vápenatého. Do roku 1960 byly oba termíny zaměňovány. Ovšem od roku 1960 se používá výhradně označení kaseinová micela. Původní označení "micela“ bylo navrženo již v roce 1877. Jednalo se o označení mikročástic celulózy v rostlinných buňkách, které byly viditelné pod mikroskopem. Postupem času bylo toto označení vztažené i pro jiné typy agregátů (FOX a BRODKORB, 2008). Kaseinové micely kravského mléka jsou polydisperzní, více či méně sférické bílkovinné částice (HOLT a kol., 2003). Kaseinová
micela
je
tvořena
komplikovanými
strukturami
uspořádanými
do kulovitých částic s množstvím kanálků a dutinek, které jsou vyplněny vodou, čímž se vysvětluje vysoká hydratace kaseinové micely. Kaseinová micela je schopna přijmout 2 - 2,5 g vody na 1 g bílkoviny (ZADRAŽIL, 2002). V roce 2004 pomocí nových elektronových rastrovacích mikroskopů s vysokým rozlišením pole emisí, které prozkoumávají povrch kaseinové micely, se podařilo 20
objevit, že povrch micely má mnohem složitější strukturu, než jak se tomu věřilo dříve. Povrch kaseinové micely není hladký, ale obsahuje mezery mezi spodními vrstvami (DALGLEISH a kol., 2004). Kaseinová micela kravského mléka obsahuje přibližně 200 molekul kaseinů (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Jedná se o zvláštní sférickou supramolekulární strukturu, koloidní partikule. Skládají se z mnoha podjednotek, které se označují jako submicely (URBAN, 1997).
Velikost submicel se pohybuje v průměru kolem
12 - 15 nm (WALSTRA, 1999). Submicely jsou udržovány v houbovité struktuře hydrofobními interakcemi bílkovin, koloidním kalcium fosfátem (CCP), stabilizované disulfidickými můstky a vodíkovými můstky. Při dialýze, přidáním močoviny, nebo okyselením, dochází k odstranění CCP a tím i k rozpadu micel na jednotlivé submicely (ZADRAŽIL, 2002). Kaseinové submicely mají tvar rotačního elipsoidu (NAVRÁTILOVÁ, 2012). V průměru obsahuje jedna kaseinová submicela 20 - 25 molekul kaseinu (WALSTRA, 1999). Povrchová vrstva micely, která je tenká 5 - 10 nm, je velmi bohatá na obsah κ-kaseinového makropeptidu. Jádro kaseinové micely je poté tvořeno vápenatými a fosforečnými ionty a převážně α- a β-kaseiny (ZADRAŽIL, 2002). Micelu tvoří asi z 93 % kaseiny, 3 % vápenaté ionty, 3 % anorganický fosfát, 2 % fosfát vázaný ve formě fosfoserinu, 0,4 % citrátu, asi do 0,5 % sodné, draselné a hořečnaté ionty (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Díky náboji na povrchu kaseinových micel jsou vázány soli koloidního kalcium fosfátu a molekuly vody (GAJDŮŠEK, 2003). Průměr micel kravského mléka se pohybuje mezi 50 - 500 nm (TAMINE, 2007). Nejvíce zastoupené bývají micely s průměrem 150 nm. Velikost kaseinových micel je závislá na obsahu αs-kaseinu a κ-kasein. Nejmenší částice obsahují asi 50 % α-kaseinu a 15 % κ-kaseinu. Největší částice obsahují asi 42 % α-kaseinu, 26 % κ-kaseinu a obsah β-kaseinu činí zhruba 30 % (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Počet micel se pohybuje kolem 1×1012 v 1 ml kravského mléka (GAJDŮŠEK, 2003). Klíčovou roli při vytváření struktury kaseinové micely má κ-kasein (RONCADA a kol., 2012). κ-kasein díky svojí hydrofilní povaze glykoproteinu udržuje strukturu ostatních hydrofobních kaseinů v prostředí vápenatých iontů mléčného séra. Tato frakce kaseinu vytváří trojrozměrnou strukturu micely tím, že lineární polymery αs1-kaseinu a β-kaseinu spojuje do trojrozměrné struktury. Na povrchu micely jsou hydrofobní 21
polární struktury, které nesou solvátový, hydratační vodný obal se záporným nábojem. Ten při nativní rovnováze brání spojování kaseinových micel. Hydrofobní části bílkovin jsou směrovány směrem dovnitř kaseinové micely. Při sýření působí syřidlo na ochranný obal makropeptidu κ-kaseinu, který je poté z většiny odstraněn. Proto dochází ke shlukování molekul kaseinu. Odstranění této povrchové vrstvy vede ke vzniku souvislé sýřeniny, čehož se využívá při výrobě sýrů (ZADRAŽIL, 2002). Struktura kaseinové micely je neustále zkoumána. Existují její různé modely (HORNE, 2006).
Vlastnosti kaseinové micely byly zkoumány u skotu, ovcí, koz,
buvolů, velbloudů a klisen. BUCHHEIM a kol. (1989) zjistili, že nejmenší kaseinová micela je micela mateřského mléka (64 nm). Modely kaseinové micely byly vytvořeny v průběhu posledních 30 let. Na základě fyzikálních a chemických vlastností micel byly modely rozděleny do 3 skupin. Jedná se o model obalu kaseinového jádra, modely dílčích micel a modely vnitřní struktury (PHADUNGAHT, 2005). Nejznámějším modelem je model, navržený v roce 1966 Morrem (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Četným pozorováním se podařilo dokázat, že kaseinové micely nejsou pevné struktury. Změnami v pH, teplotě, vodní aktivitě a dalších podmínkách dojde k rozdělení velikosti a podílu volných micel (WALSTRA, 1999). Koloidní kalcium fosfát je velmi důležitý z biologického hlediska, jelikož je nezbytný pro správnou mineralizaci kostí a zubů. Kaseinová micela obsahuje koloidní kalcium fosfát v rozpustné a biologicky dostupné formě (RASMUSSEN a kol., 1999). Jeho obsah v kaseinové micele tvoří asi 7 % (HOLT a kol., 2003). Asi 80 – 95 % kaseinu je v mléce přítomno v podobě kaseinové micely (FOX a MCSWEENEY, 1998).
22
Obrázek 1: Kaseinová micela pod elektronovým rastrovým mikroskopem (měřítko 200 nm), (DALGLEISH a kol., 2004) 3.3.3.2 α-kaseiny Hlavní složkou kaseinové frakce jsou αs-kaseiny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). αs-kasein se sráží roztokem chloridu vápenatého (CaCl2) při teplotě 20 °C (ZADRAŽIL, 2002). Má nejvyšší obsah fosforu (FORMAGGIONI a kol, 1999). Na škrobovém gelu vykazuje nejvyšší mobilitu (ZADRAŽIL, 2002). V kravském mléce se vyskytují tyto následující fosfoproteidy αs1-kasein, αs2-kasein (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Oba dva α-kaseiny se od κ-kaseinu odlišují výrazným sklonem k vytváření sraženin v přítomnosti vápentých iontů (FORMAGGIONI a kol., 1999). αs1-kasein Tato bílkovina má osm genetických variant. Jedná se o genetické varianty A - H. Varianty A a B byly prokázány u Bos taurus v roce 1962 v USA elektroforézou škrobového gelu při alkalickém pH. Varianta C mezi lety 1962 a 1963 opět v USA, varianta D ve Francii v roce 1966, varianta E byla objevena u Bos grunniens v roce 1974 v Nepálu a u Bos javanicus v roce 1981 v Austrálii, varianta F v roce 1992 v Německu, G v témže roce v Itálii a varianta H v Čadu v roce 1999 (FROMAGGIONI a kol., 1999). V mléce je nejvíce zastoupena frakce αs1-kasein B (FROMAGGIONI, 1999; GAJDŮŠEK, 2003). Genetická varianta B je u skotu predominantní (ZADRAŽIL, 2002). Frekvence výskytu B varianty je u většiny plemen 90 - 95 %, někdy i 100 %. 23
Pouze u některých plemen, jako je Jersey a další je 75 - 85 % (FROMAGGIONI a kol., 1999). Procentuální vyjádření se u jednotlivých autorů velmi různí. Izoelektrický bod leží v rozmezí pH 4,44 - 4,76 (ZADRAŽIL, 2002). Primární struktura αs1-kaseinu B se skládá ze 199 aminokyselin (FROMAGGIONI, 1999, VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Sekundární a terciální strukturu se u této bílkoviny doposud nepodařilo objasnit (FROMAGGIONI a kol., 1999). αs1-kasein se skládá ze dvou podjednotek, jedné velké a jedné malé. Malá část se skládá z fosfátové skupiny, která je spojená s velkou jednotkou této kaseinové frakce přes serin v polypeptidovém řetězci. Celkově mají obě genetické varianty vyšší obsah fosfátových skupin, než jak je tomu u κ-kaseinu (FORMAGGIONI a kol., 1999). Molekula αs1-kaseinu obsahuje osm zbytků kyseliny fosforečné, která je vázaná na aminokyselinu serin. Majoritní většina estericky vázané kyseliny fosforečné se nachází mezi 40. a 80. aminokyselinou, což je příčinou toho, že právě v této oblasti je αs1-kasein hydrofilní (BUŇKA a kol., 2009). Je ale méně hydrofilní než β-kasein (FORMAGGIONI a kol., 1999). Jeho ostatní části se vyznačují jako hydrofobní. Vysoký obsah estericky vázané kyseliny fosforečné se považuje za příčinu vysoké citlivosti tohoto kaseinu k vápenatým iontům. V přítomnosti vápenatých iontů dochází následně k vysrážení αs1-kaseinu (BUŇKA a kol., 2009). V mléce koz se αs1-kasein vyskytuje v mnohem menším zastoupení, než jak je tomu u mléka kravského. Zároveň má tato kaseinová frakce velký význam při výrobě sýrů z kozího mléka. Tyto sýry mají tužší konzistenci v porovnání se sýry, které jsou vyrobeny z mléka obsahující malý nebo dokonce žádný podíl této frakce kaseinu (FANTOVÁ, 2012). U kozího mléka je αs1-kasein nejzajímavějším a nejvíce prostudovaným z hlediska genetického polymorfismu. Polymorfismus této kaseinové frakce ovlivňuje míru extrakce αs1-kaseinu do mléka. V roce 2008 lokus αs1-kaseinu popisoval 17 alel, které se podle stupně exprese dělí do skupin na silné, střední, slabé a nulové. Nulová skupina obsahuje 0 - 3,5 g.l-1 této frakce kaseinu. Genotyp αs1-kaseinu ovlivňuje celkový obsah bílkovin, celkového kaseinu a obsah tuku. Dále souvisí s technologickými vlastnostmi mléka. Mléko od slabých alel není vyhledáváno pro technologické zpracování, ale pro dietetické účely, jelikož je stravitelnější pro svůj nižší obsah bílkovin (MARKOVÁ a kol., 2008).
24
αs2-kasein Tato bílkovina se řadí do rodiny proteinů, kam spadá αs2-, αs3-, αs4- a αs6-kasein, se stejnou primární strukturou, které se navzájem liší pouze obsahem fosfátových skupin (FORMAGGIONI a kol., 1999). Jeho procentuální zastoupení z celkového podílu kaseinu v mléce činí 10,5 % (LUKAŠOVÁ, 1999). Primární struktura je určena 207 aminokyselinami (FROMAGGIONI, 1999, GAJDŮŠEK, 2003). Počet zbytků kyseliny fosforečné, která je estericky vázaná na aminokyselinu serin, se pohybuje v rozmezí 10 - 13 (FORMAGGIONI a kol.; 1999; BUŇKA a kol., 2009). Kyselina fosforečná se nachází mezi 1. a 20. aminokyselinou a mezi 50. a 70. aminokyselinou v peptidickém řetězci. Z toho vyplývá, že tato kaseinová frakce má dva hydrofilní a dva hydrofobní segmenty (BUŇKA a kol., 2009). αs2-kasein je složen z jedné větší složky, která se označuje jako αs1-kasein a několika dalších menších složek. Tato frakce kaseinu má největší elektroforetickou pohyblivost a sráží se pomocí roztoku CaCl2, při teplotě přesahující 20 °C a obsahuje nejvyšší podíl fosforu ze všech kaseinových frakcí (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Molekula tohoto kaseinu obsahuje dva zbytky cystinu. Omezené množství prolinu určuje nižší hydrofobní povahu αs2-kaseinu oproti ostatním kaseinovým frakcím. Je mnohem citlivější než zbylé kaseinové frakce na přítomnost vápenatých iontů, což je zapříčiněno jeho vysokým stupněm fosforylace (FORMAGGIONI a kol, 1999). Jsou zaznamenány čtyři genetické varianty αs2-kaseinu (FROMAGGIONI a kol., 1999; ZADRAŽIL, 2002). Všechny genetické varianty byly prokázány v roce 1976. Varianta A a B v Nepálu u Bos indicus a Bos taurus, varianta C v Monglosku u Bos grunnies, D ve Francii u Bos taurus (FORMAGGIONI a kol., 1999). 3.3.3.3 β-kaseiny β-kasein se v kravském mléce nachází ve velkém množství. Jedná se o silný alergen (ALEXANDROS a kol., 2011). Polypeptidový řetězec β-kaseinu se skládá z 209 aminokyselinových zbytků (FROMAGGIONI a kol., 1999; VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009; HOLDER a kol., 2013). Toto složení je známé již od roku 1972 (ZADRAŽIL, 2002). Stejně jako αs-kaseiny se řadí mezi fosfoproteiny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Ovšem v porovnání s αs-kaseinem obsahuje méně fosforu (ZADARŽIL, 2002). Ve své molekule obsahuje pět zbytků kyseliny fosforečné, která se nachází mezi 1. a 40. 25
aminokyselinou. Tato část je proto hydrofilní (BUŇKA a kol., 2009).
Nepolární
postranní řetězce aminokyselin jsou poté rozmístěny v polohách 136 - 209 (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Polymorfismus této kaseinové frakce je poměrně složitý. První důkaz polymorfismu u β-kaseinu se datuje do roku 1961. První tři genetické varianty (A, B a C) byly objeveny Aschaffenburgem pomocí papírové elektroforézy v zásaditém prostředí. V roce 1966 bylo elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v kyselém prostředí objeveno, že genetická varianta A má ještě tři další varianty (A1, A2 a A3), (FORMAGIONI a kol, 1999). Nejčastějšími bílkovinami kravského mléka ze skupiny β-kaseinů jsou β-kasein A1 a A2 (SUKOVÁ, 2009). β-kasein se vyskytuje celkem v devíti genetických variantách (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Je velmi citlivý na ionty vápníku při pokojové teplotě (FORMAGGIONI a kol., 1999). S ionty vápníku poskytuje β-kasein sůl, která je rozpustná při teplotách 1 °C a nižších, při vyšších teplotách je tato sůl nerozpustná (VELIŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Z odstředěného mléka jej lze získat pomocí iontů vápníku při teplotě kolem 35 °C. Jeho obsah v mléce činní průměrně 25 - 35 % z celkových bílkovin mléka (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Izoelektrický bod je situován v okruhu pH mezi 5,20 - 5,85 (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). V roce 2008 posuzoval úřad EFSA (Europen Food Safety Authority) nezávadnost bílkovin v mléčných výrobcích. Důvodem pro tuto studii byly výsledky, které byly publikovány a prokazovaly spojitost s autismem, schizofrenií, kardiovaskulárními chorobami, diabetem typu I a nesnášenlivostí mléka. Podle těchto studií měl být β-kasein A1, ze kterého následně jeho štěpením vzniká β-kosomorfin-7, škodlivý, oproti tomu β-kasein A2 nezpůsobuje žádné zdravotní problémy. V únoru roku 2009 uzavřel úřad EFSA studii závěrem, který zní "neexistuje vztah příčiny a důsledku mezi β-kosomorfinem-7, příbuznými peptidy a jejich bílkovinnými prekurzory a nepřenosnými chorobami " (SUKOVÁ, 2009). Spolu s micelárním kaseinem slouží β-kasein jako prekurzor funkčních peptidů. Peptidy vznikají z β-kaseinu a micelárního kaseinu hydrolýzou a využívají se v potravinářství nebo pro výrobu léčiv (HOLDER a kol, 2009).
26
3.3.3.4 κ-kasein V roce 1956 byl κ-kasein objeven jako stabilizující protein v kaseinové micele (FOX a BRODRB, 2008). Objevení polymorfismu trvalo podstatně déle oproti jiným frakcím (ZADRAŽIL, 2002). Nejprve byly objeveny genetické varianty A a B, které byly objeveny v roce 1964. Dlouho se věřilo, že to jsou jediné varianty κ-kaseinu. A to až do roku 1978, kdy byla objevena genetická varianta C. Postupem času byly objevovány další genetické varianty (FROMAGGIONI a kol., 1999). Do současné doby bylo u tohoto kaseinu nalezeno 11 genetických variant (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Molekula genetické varianty A je složena ze 169 aminokyselinových zbytků (BUŇKA a kol., 2009). Varianta A je u většiny známých plemen predominatní (ZADRAŽIL, 2002). Molekula genetické varianty A obsahuje pouze jeden zbytek kyseliny fosforečné, která je estericky vázaná na aminokyselinu serin. Což se považuje za hlavní příčinu toho, že se tato kaseinová frakce nesráží v přítomnosti vápenatých iontů (BUŇKA a kol., 2009). Primární sekvence genetické varianty B se rovněž skládá ze 169 aminokyselin (FORMAGGIONI a kol., 1999). Molekuly genetické varianty B se vyskytují jako trimery a vyšší oligomery, které jsou navzájem propojeny pomocí disulfidických vazeb (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). κ-kasein je hlavní bílkovinou složkou, která je štěpena za pomoci enzymu chymozinu (FORMAGGIONI a kol., 1999). K štěpení dochází mezi aminokyselinami v poloze 105 a 106 (FORMAGGIONI a kol., 1999; WALSTRA a kol., 2006). Tedy mezi fenylalaninem a metioninem (BUŇKA a kol., 2009), za pomoci proteolytických enzymů (WALSTRA a kol., 2006), na dvě části. První částí je hydrofobní para-κ-kasein, který zůstává v sýřenině, a druhou částí je hydrofilní glukomakropeptid, který odchází do syrovátky (ŠUSTOVÁ, 2012). Jedná se o jedinou frakci kaseinu, která je glykolyzována. Tento proces probíhá přes hydroxylovou skupinu treoninu. Zpravidla na 131. nebo 133. aminokyselině v peptidickém řetězci (BUŇKA a kol., 2009). Tento kasein má ve své molekule sacharidy (FORMAGGIONI a kol., 1999). Na rozdíl od výše zmíněných kaseinů jsou v molekulách κ-kasienu přítomny sacharidy D-galaktopyranosa, N-acetyl-D-galaktosoamin, N-acetylneuraminová kyselina společně s galaktózou (FORMAGGIONI a kol., 1999; VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Hlavní složku κ-kaseinu a to z 56 % tvoří rozvětvený tetrasacharid, v menším množství, který 27
představuje 18,5 %, se vyskytují κ-kaseiny, jež mají vázaný rozvětvený trisacharid. S lineárním trisacharidem se vyskytuje asi 18,4 % κ-kaseinu, s disacharidem se poté vyskytuje 6,3 % κ-kaseinu a s vázaným N-acetyl-D-galaktosoaminem potom jen velmi nepatrné procento, konkrétně 0,8 %. Tyto cukry jsou vázány na bílkovinu pomocí glykosidické vazby prostřednictvím N-acetyl-β-D-galaktosoaminu. S vápenatými ionty poté κ-kaseiny tvoří rozpustné soli, které stabilizují αs1-kasein, β-kasein v mléce za přítomnosti iontu vápníku (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). V podstatě se tato frakce kaseinu skládá z jedné hlavní, bezcukerné jednotky a minimálně šesti malých složek. Jedná se o směs polymerů, která je navzájem spojená intermolekulárními disulfidickými můstky (ZADRAŽIL, 2002). κ-kasein ve své molekule obsahuje dva zbytky cystinu. V mléce se vykytuje jako oligomer, který je složený z 5 - 11 monomerů (WALSTRA a kol., 2006). Jedná se o jedinou frakci kaseinu, která obsahuje i sirné aminokyseliny cystin a methionin (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Tvoří 8 - 15 % z celkového obsahu bílkovin mléka (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Jedná se tedy o minoritní složku v mléce. Jeho funkcí je chránit ostatní kaseiny v mléce před precipitací. Hraje velmi významnou roli při stavbě struktury kaseinové micely. A to díky své vlastnosti vázat frakce kaseinu do trojrozměrné sítě. Nalezneme jej převážně na povrchu kaseinových micel (URBAN, 1997). Jako jediná kaseinová frakce se nesráží působením vápenných iontů. Izoelektrický bod κ-kaseinu je 5,37 pH (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). V současnosti se stále více dostává do popředí význam genetické charakteristiky především u býků v inseminaci, pokud se jedná o varianty kaseinového lokusu s ohledem na využití tohoto proteinu v mlékařství a sýrařství. κ-kasein je geneticky polymorfní, proto se výrazně zvýšil zájem o jeho genetickou strukturu. Byl potvrzen vztah mezi jeho alelou B a požadovanými technologickými vlastnostmi mléka, které je využíváno pro sýrařské zpracování. Mléko typu B κ-kaseinu umožňuje získávat sýry s mnohem lepšími organoleptickými vlastnostmi. Je velmi zajímavé, že výskyt alely A tohoto kaseinu je mnohem častější než výskyt B alely. Výběr plemenných býků, určených pro inseminaci, u nichž je potvrzeno, že jsou nositelem B κ-kaseinu, je proto preferován v oblastech, kde je zpracování mléka dojnic za účelem získání sýrů jedním z nosných směrů využití mléka (URBAN, 1997).
28
3.3.3.5 γ-kasein γ-kasein je produktem hydrolýzy β-kaseinu. Konkrétně je výsledkem jeho postupné hydrolýzy za účasti plazminu (FORMAGGIONI a kol., 1999; WALSTRA a kol., 2006), nebo bakteriálních proteáz (LUKAŠOVÁ, 1999). Odštěpením zbytku polypeptidového řetězce s aminokyselinami 1 - 28 vznikne γ1-kasein a proteosopepton značený jako PP8F. Odštěpením zbytku polypeptidového řetězce s aminokyselinami 1 - 105 vznikne γ2-kasein, při odštěpení zbytku aminokyselin 1 - 107 z polypeptidového řetězce vzniká následně γ3-kasein (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). γ-kaseiny tvoří jen malé procento celkových bílkovin obsažených v mléce. Jedná se o 3 - 7 %. Byly izolovány frakce, u kterých byly doposud zjištěny 2 - 4 genetické varianty. Má mnohem vyšší izoelektrický bod než ostatní frakce kaseinu (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1993). Izoelektrický bod γ-kaseinu se nachází v rozmezí 5,8 - 6,0 pH (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Tato kaseinová frakce je poměrně dobře rozpustná v etanolu (WALSTRA, a kol., 2006). 3.3.4
Syrovátkové bílkoviny
Syrovátkové, neboli globulární bílkoviny, se v mléce vyskytují ve formě koloidního roztoku (KADLEC a kol., 2009). Tyto bílkoviny mají vyšší nutriční hodnotu, což je zapříčiněno vyšším obsahem aminokyseliny cystinu (NAVRÁTILOVÁ, 2012). Hlavní dva druhy syrovátkových bílkovin (α-laktalbumin a β-laktoglobulin) vykazují vysoký stupeň rozdílného obsahu v závislosti na druhu zvířete (RONCADA a kol., 2012). Většina syrovátkových bílkovin obsahuje ve své molekule značný podíl α-helixové struktury a
β-struktury skládaného listu. Rozležení náboje proteinu je poměrně
homogenní (WALSTRA a kol., 2006). Syrovátkové bílkoviny získáme po vysrážení kaseinu při okyselení mléka na izoelektrický bod pH 4,6. Jedná se o hydrofilní část mléčných bílkovin, která odchází do roztoku (GURCAN, 2011). Tyto bílkoviny v nativní formě vytvářejí kompaktní globulární konformaci (URBAN, 1997). Tato struktura se během tepelného opracování mléka mění. Dochází k jejímu rozvinutí, tedy k denaturaci (KADLEC a kol., 2009). Denaturací těchto proteinů nedochází k jejich agregaci, ale navázání na kaseinovou micelu. Jedná se 29
o velmi komplikovanou reakci (WALSTRA a kol., 2006). Denaturace probíhá při teplotách 60 - 70 °C. Rozbalením terciální struktury dochází k odkrytí funkčních skupin aminokyselin, především thiolové. Tato skupina vyvolává vařivou chuť mléka po vysokotepelném ošetření. Thiolová skupina může sloužit jako oxidační činidlo, čehož se využívá na snížení rizika oxidačního žluknutí mléčného tuku (KADLEC a kol., 2009).
Podle Zadražila (2002) mezi základní syrovátkové bílkoviny patří •
β-laktoglobulin
•
α-laktalbumin
•
imunoglobuliny IgG, IgA, IgM, IgE
•
BSA (bovinní sérový albumin)
Tabulka 2 Přehled bílkovin mléčného séra skotu (KADLEC a kol., 2009) Frakce α-laktalbumin
Obsah v g.kg-1 mléka 1,2
β-laktoglobulin
3,2
Imunoglobuliny
0,8
Sérový albumin
0,4
Charakteristika
Teplená denaturace, vazba na κ-kasein; zdroj thiolové skupiny pro chemické reakce Antibakteriální účinky; aglutininy (slouží proti shlukování tukových kuliček, urychlení vyvstávání mléčného tuku v chladu) hydrolýzy
0,8
Heterogenní produkty kaseinu, tepelně stabilní
některých
Laktoferin
0,1
Váže Fe, inhibice sporotvorných bakterií
Transferin
0,1
Proteoso-peptonová frakce
3.3.4.1 β-laktoglobulin Jedná se o nejvýznamnější syrovátkovou bílkovinu kravského mléka (FORMAGGIONI a kol., 1999; NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Jeho koncentrace v kravském odstředěném
30
mléce činí 2 - 4 g.l-1. Bovinní β-laktoglobulin se v mléce vyskytuje v mnoha izoformách, mezi nimiž jsou nejznámější izoformy A a B (LOCH a kol., 2011). Tato syrovátková bílkovina se nevyskytuje v mléce některých savců, např. v mateřském mléce nebyla prokázána (FORMAGGIONI a kol., 1999). V kravském mléce jeho obsah činí 50 % z celkových syrovátkových bílkovin (TAMIN, 2007). Jeho sekundární i terciální struktura je velmi dobře známá. Obsahuje dvě thiolové skupiny (WALSTRA a kol., 2006). Ve své molekule obsahuje dva zbytky tryptofanu (LOCH a kol., 2011). Dále jeho molekula neobsahuje fosfor a zcela postrádá aminokyselinu hydroxyprolin (ZADRAŽIL, 2002). V mléce se přirozeně vyskytuje ve formě dimeru. Obě molekuly drží pohromadě díky hydrofobním interakcím. Tato forma se rozpadá až za účinku vysokých teplot. Při pH nižší než je hodnota 5,5 se vyskytuje ve formě oktameru, ačkoli menší agregáty se také vyskytují. Při neustálém okyselování až na hodnotu pH pod 3,5 jeho asociace již neexistují, vyskytuje se pouze v podobě monomeru. Při pH nad 7,5 existuje β-laktoglobulin také jen jako monomer (WALSTRA a kol., 2006). Jeho syntéza probíhá v mléčné žláze a je hlavní bílkovinou mléčné syrovátky (ZADRAŽIL, 2002). β-laktoglobulin byl první bílkovinou, u které byl prokázán polymorfismus. Genetické varianty A a B byly objeveny již v roce 1955 ve Velké Británii Aschaffenburgem a Drewrym pomocí papírové elektroforézy v alkalickém prostředí (FORMAGGIONI a kol., 1999). Doposud je u skotu známo 13 geneticky polymorfních variant této bílkoviny. Jedná se o varianty A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, W, DR a KB (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). U ovcí byly popsány 3 genetické varianty A, B a C. Přítomnost alely C je poměrně vzácná a nachází se převážně u plemene Merino. U sicilských ovcí byla dokázána převaha alely B (AMIGO a kol., 2000; MICHALCOVÁ a KRUPOVÁ, 2009). Je zajímavostí, že např. mléko jaka obsahuje pouze 1 genetickou variantu β-laktoglobulinu. β-latoglubulin není rozpustný v čisté vodě, naopak se rozpouští ve zředěných roztocích neutrálně reagujících solí. Isoelektrický bod je při pH 5,12 (ZADARŽIL, 2002). Bovinní β-laktoglobulin se řadí do skupiny lipokalinů (LOCH a kol., 2011). Lipokaliny jsou malé proteiny, které vykazují velkou afinitu k lipofilním molekulám, jako jsou mastné kyseliny, cholesterol, retinoidy a prostaglandiny (COSTA a kol., 2010). 31
V mléce se vyskytuje rozpuštěný a to ve formě monomolekulárního koloidního roztoku, který má hydrofilní povahu. Oproti α-laktalbuminu je méně kyselý. β-laktoglobulin je přenášen z krve do mléka imunitními vlastnostmi a bývá velmi často ztotožňován s protilátkami obsaženými v mléce.
Velmi vysoký obsah této frakce
syrovátkových bílkovin je v mlezivu. Zde jeho obsah dosahuje až hranice 8 %, zatímco ve zralém mléce se jeho hodnota pohybuje v rozmezí 0,1 - 0,3 %. Vysoký obsah je rovněž zaznamenán v mléce masožravců (ZADARŽIL, 2002). Navzdory intenzivnímu studiu jeho biologických, chemických a fyzikálních vlastností,
není
jeho
biologická
funkce
zcela
objasněna.
Pravděpodobným
předpokladem je, že napomáhá ukládání a přepravě mastných kyselin a retinoidů z žaludku, kam se tyto látky dostávají po konzumaci mléka (LOCH a kol., 2011). Váže a přenáší vitamín A. Nejedná se o jeho základní funkci, jelikož mléko některých zvířat a i člověka obsahuje jen velmi nepatrné nebo žádné množství tohoto proteinu (URBAN, 1997). Studie prokázaly, že je schopen vázat nasycené a nenasycené mastné kyseliny. Váže nasycené mastné kyseliny s 12 - 20 atomy uhlíku v řetězci a celou řadu nenasycených mastných kyselin s 14 - 20 atomy uhlíku v řetězci (LOCH a kol., 2011). Bovinní β-laktoglobulin může navázat 1 mol kyseliny palmitové a 2 moly retinolu na 1 mol dimerního proteinu. Tato vlastnost je spojená s biologickou úlohou tohoto proteinu. Tím je přenášení těchto substancí novorozeným mláďatům. Mimo jiné je schopen vázat ještě celou řadu dalších látek, jakými jsou například triglyceraldehydy, alkany, ketony, ionty a některé proteiny (URBAN, 1997). β-laktoglobulin je známý jako bílkovina s vysokou afinitou, ale nízkou specificitou vazby. Spoustu let byl považován za potenciální přenašeč bílkovin pro různé hydrofobní ligandy (LOCH a kol., 2011). Polypeptidový řetězec je tvořen 162 aminokyselinami (FORMAGGIONI a kol., 1999). V kravském mléce se vyskytuje běžně jako dimer (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Při záhřevu a rovněž v přítomnosti vysoké koncentrace iontů vápníku a v prostředí o pH vyšším než je 8,6 nevratně denaturuje (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Způsobuje tzv. "vařivou chuť" mléka (ZADRAŽIL, 2002), která je zapříčiněna denaturací bílkoviny a obnažení thiolové skupiny na aminokyselině cystinu. Při tepelném ošetření mléka na teploty od 65 °C disociuje β-laktoglobulin na monomery, které
díky
již
zmiňované
thiolové
skupině
reagují
společně
s κ-kaseinem
(NAVRÁTILOVÁ a kol, 2012). Vznikají dimery, které jsou spojeny pomocí 32
disulfidické vazby (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Vznik těchto dimerů zapříčiňuje změny povrchových vlastností kaseinové micely, snížení schopnosti srážení mléka a změny v tepelné stabilitě mléka (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 3.3.4.2 α-laktalbumin Jedná se o druhý, v pořadí nejvíce zastoupený, syrovátkový protein v kravském mléce. Jeho obsah činní 20 % z celkového obsahu syrovátkových bílkovin (TAMIN, 2007). Je stejně jako β-laktoglobulin syntetizován v mléčné žláze (ZADRAŽIL, 2002). Primární struktura nejčastěji se vyskytující
genetické varianty B je dána
123 aminokyselinami (FORMAGGIONI a kol., 1999). α-laktalbumin byl v pořadí druhá bílkovina, u které byl prokázán genetický polymorfismus a to v roce 1958. Tehdy byly objeveny varianty A a B v Nigérii. Varianta C byla objevena až v roce 1981 v Austrálii (FORMAGIONI a kol., 1999). U skotu jsou popsány tyto 3 genetické varianty (FORMAGIONI a kol., 1999; ZADRAŽIL, 2002; NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). U ovcí byly objeveny dvě genetické varianty této syrovátkové bílkoviny (AMIGO a kol., 2000). Dále α-laktalbumin vykazuje velmi vysokou biologickou hodnotu, která je určena vysokým obsahem tří esenciálních aminokyselin, kterými jsou cystin, tryptofan a lysin. Vykazuje kyselou reakci (ZADRAŽIL, 2002). Molekula této syrovátkové bílkoviny obsahuje osm cystinových zbytků (FORMAGGIONI a kol., 1999). Na rozdíl od β-laktoglobulinu je rozpustný v čisté vodě. Je nejstabilnější proti působení tepla. Není citlivý k syřidlovému enzymu. Syřidlem se nesráží, jelikož neobsahuje žádný fosfor. Protože se skládá z více frakcí, pohybuje se jeho izoelektrický bod v rozmezí hodnot 4,5 - 5,2 pH (URBAN, 1997). α-laktalbumin je součást enzymatického systému, jehož úkolem je syntéza laktózy (URBAN, 1997; FORMAGGIONI a kol., 1999). Spolu s galaktosyltransferázou vytváří enzym laktázu (ZADARAŽIL, 2002). Při jeho srážení nestačí pouze okyselit mléko na oblast izoelektrického bodu, zároveň je nutné současné zvýšení teploty nad 65 °C. K úplnému vysrážení bílkovin dojde až při teplotě 85 °C případně 95 °C (ZADARŽIL, 2002). Mléka masožravců, všežravců a monogastrických býložravců obsahují oproti mléku kravskému vyšší procentuální zastoupení tohoto syrovátkového proteinu. Z tohoto důvodu jsou také tato mléka označována za mléka albuminová. Jestliže naopak dojde 33
k tomu, že se obsah α-laktalbuminu zvýší v mléce, jedná se o příznak onemocnění dojnice (ZADRAŽIL, 2002). Jedná se o malý protein, kompaktně složený, jehož tvar molekuly je více či méně kulovitý. Na svém povrchu obsahuje specifické místo pro navázání iontu vápníku, který je na tomto místě pevně vázán a stabilizuje konformaci bílkoviny. Odstraněním vápenného iontu nebo okyselením asi na hodnotu pH kolem 4, což je hodnota, která je schopná odstranit vápník z molekuly α-laktalbuminu, vede k rozvinutí globulární struktury na lineární. V tomto stavu je již bílkovina ve stavu nevratné denaturace a její zpětný návrat do globulární struktury je již nemožný (WALSTRA s kol., 2006). 3.3.4.3 Imunoglobuliny Jedná se o minoritní, ale biologicky významné proteiny mléka. Imunoglobuliny jsou vysokomolekulární globulární glykoproteiny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Mají heterogenní strukturu a to dokonce v rámci jedné podtřídy (WALSTRA a kol., 2006). Jedná se o součást antibakteriálního systému mléka. Zpomalují růst kontaminující mikroflóry v mléce, které je čerstvě nadojené (KADLEC a kol., 2009). Vzhledem k extrémní heterogenitě se imunoglobuliny od ostatních bílkovin obsažených v mléčném séru výrazně liší. Identifikace imunoglobulinů je založena primárně na imunochemických kritériích a také na vzájemné reaktivitě s referenční bílkovinou, která je lidského původu. Systém nomenkaltury je shodný s lidským imunoglobulinem. Z 5 tříd, které se vyskytují u savců, byly v mléce prokázány 4 třídy (ZADARŽIL, 2002). Imunoglobuliny u savců lze rozeznávat jako IgG1, IgG2, IgA a IgM. IgM je pentamer (KADLEC a kol., 2009). Imunoglobulin A je specifický pro mléko a vyskytuje se především u člověka a primátů a i v malém množství u přežvýkavců. U přežvýkavců ale naopak převažují imunoglobuliny G a M (LUKAŠOVÁ, 1999). Imunoglobuliny jsou tvořeny v různých sekrečních buňkách, které mohou produkovat různé peptidové řetězce. Navíc část molekuly je schopná tvořit tzv. hypervariabilní část. Jedná se o místo, kde je imunoglobulin schopen tvořit specifický antigen (WALSTRA a kol., 2006). Všechny třídy imunoglobulinů se vyskytují jako polymery i monomery. IgG se dělí na dvě podtřídy (IgG1 a IgG2), které mohou být vzájemně antigenně rozlišeny.
34
I když krevní sérum u skotu obsahuje ekvivalentní množství IgG1 a IgG2, kolostrum, konkrétně prekolostrální sekrety, obsahuje až dvacetinásobek IgG1 oproti IgG2. Při přechodu kolostra ve zralé mléko hladina IgG1 zůstává 4 - 7× vyšší než je hladina podtřídy IgG2. Pokud by došlo ke zvýšení hladiny IgG2, jedná se počátek mastitidy, tedy zánětu mléčné žlázy (ZADARŽIL, 2002). Různé třídy imunoglobulinů jsou význačné, včetně G (gamaglobulinu), A a M (makroglobulinu), které jsou obsaženy v mléce. Každá molekula IgG se skládá ze dvou lehkých a ze dvou těžkých řetězců. Molekula má dvě identické reaktivní místa pro specifický antigen. Antigen je zapojený celý nebo jen jeho malá část přesně do těchto vazebných míst na povrchu imunoglobulinu (WALSTRA a kol., 2006). Imunoglobuliny hrají významnou roli v obranném systému mláďat savců proti gastrointestinálním infekcím (LUKAŠOVÁ, 1999). Koncentrované imunoglobuliny v kolostru dojnic jsou dobře skladovatelné při chladírenských teplotách a to až několik týdnů. Jsou dlouhou dobu velmi stabilní při mražení a lyofilizaci. Dále jsou termostabilní. Zahříváním na 70 °C po dobu 30 minut dojde k denaturaci 89 % všech imunoglobulinů (LUKAŠOVÁ, 1999). Shlukování tukových globulí v syrovém mléce, které způsobuje vznik větších částic a následně vrstvy smetany na povrchu mléka, není způsobeno koalescencí globulí, ale specifickým minoritním proteinem makroglobulinem, který se řadí do skupiny aglutininů a podílí se na vytvoření příčných vazeb mezi membránami tukových globulí. Tento jev nastává při teplotách pod 15 °C (KADLEC a kol., 2009). Při záhřevu mléka nad 100 °C, tedy inaktivaci aglutininu, po dobu několika minut má za následek koagulaci tohoto proteinu a prevencí vzniku vyvstání tukových globulí na povrchu pasterovaného a jinak tepelně ošetřeného mléka ve formě vrstvy smetany v chladném prostředí (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
Takto ošetřené mléko
nevytváří rychle na svém povrchu vrstvu smetany, vytváří ji pomaleji (KADLEC a kol., 2009). 3.3.4.4 Serumalbumin Serumalbumin, neboli také sérový albumin, je zastoupen jen velmi malým množstvím z celkového počtu syrovátkových bílkovin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Bovinní sérový albumin izolovaný z mléka dojnice je po imunologické
35
i fyzikální stránce stejný s krevním sérovým albuminem (ZADRAŽIL, 2002). Primární struktura je tvořena 582 aminokyselinami (FOX a MCSWEENEY, 1998). Jeho molekula obsahuje tři kulovité domény, což vede k jeho prodlouženému tvaru o rozměrech 3 × 12 nm (WALSTRA a kol., 2006). Molekula má tedy eliptický (FOX a MCSWEENEY, 1998). Bovinní sérový albumin ve své molekule obsahuje 17 thiolových vazeb (WALSTRA, 2006). Tvoří asi 5 % syrovátkových bílkovin. Jeho biologická funkce spočívá s největší pravděpodobností
v
nosičství
malých
molekul
např.
mastných
kyselin
(NAVRÁTILOVÁ, 2012). 3.3.5
Ostatní mléčné bílkoviny
3.3.5.1 Bazické bílkoviny Mezi minoritní podíl bílkovin mléčného séra patří tzv. bazické bílkoviny. Byl izolován β-2-mikroglobulin tzv. lactollin. Je mnohem více zastoupen v kolostru než ve zralém mléce. Jeho primární struktura je dána 98 aminokyselinami. Má pozitivní přínos na antigenní aktivitu. Dále se podařilo izolovat metaloprotein, tzv. černý protein (ZADARŽIL, 2002). 3.3.5.2 Enzymy a lipoproteiny Mezi ostatní bílkoviny mléka se řadí lipoproteiny a enzymy (ZADRAŽIL, 2002). Lipoproteiny spadají do skupiny komplexních lipidů. Jádro lipoproteinů je tvořeno lipidy, které prezentují polární část molekuly, zatímco obal je tvořen nepolárními proteiny (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Enzymy
ve
své
nativní
formě
jsou
v
mléce
tvořeny
bílkovinnými
makromolekulami, které jsou specializované na katalýzu určitého typu reakcí (ZADRAŽIL, 2002). Z chemického hlediska jsou řazeny mezi bílkoviny (ŠUSTOVÁ, 2012). Původ enzymů je z leukocytů a buněk mléčné žlázy. Aktivita těchto enzymů je závislá na pH a teplotě. Stanovení úrovně aktivity enzymů je rovněž využíváno k posouzení zdravotního stavu mléčné žlázy, dále získání a ošetřování mléka a k technologickému hodnocení (ZADARŽIL, 2002).
36
3.3.5.3 Proteoso-peptony Dále jsou v mléce zastoupeny peptidy a nízkomolekulární proteiny, které označujeme jako peptosy a peptony. Tyto peptosy a peptony mají izoelektrický bod v rozmezí 3,3 - 3,7 pH (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Proteoso-peptony jsou fosfoproteiny, které jsou tepelně stabilní do teploty 100 °C. Jejich obsah je v kravském mléce v rozmezí 2 - 6 % z celkového obsahu bílkovin (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Vznikají štěpením β-kaseinu (FORMAGGIONI a kol., 1999). 3.3.5.4 Laktoferin K mléčným bílkovinám se řadí i laktoferin (WALSTRA a kol., 2006). Laktoferin je glykoprotein, který na své molekule váže molekulu železa (LöNNERDAL a IYER, 1995; GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). Molekula laktoferinu je tvořena jednoduchým polypeptidovým řetězcem, který obsahuje 689 aminokyselin a N-vázané glykany (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012).
Laktoferin se řadí do skupiny proteinů
transferinu, kam rovněž spadá sérový transferin, ovotransferin, melanotransferin (FARNAUT a EVANS, 2003) a inhibitor kyrboxygenázy (GONZÁLES-CHÁVE a kol., 2009). Molekula je tvořena dvěma globulárními jednotkami a každá jednotka váže jeden Fe3+ (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Každá z molekul laktoferinu se skládá ze dvou sférických laloků, N-koncového a C-koncového laloku (GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009), které jsou navzájem spojeny šroubovicí. V nativním stavu je laktoferin saturován železem jen částečně (15 - 20 %). Laktoferin, který obsahuje 5 % železa, se nazývá apolaktoferin. Laktoferin, který je nasycený železem, nese označení holo-laktoferin. Saturace laktoferinu ionty železa je poměrně nízká u mateřského mléka (6 - 8 %), v porovnání s mlékem kravským, kde saturace činní až 20 - 30 %. Schopnost laktoferinu vázat železo je závislá na přítomnosti malého množství hydrogenuhličitanu. Ionty železa disociují v kyselém prostředí o hodnotách pH v rozmezí 3 - 5, nebo za přítomnosti sloučenin, které rovněž vážou železo (citrátové ionty), (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). V mléce se vyskytují dva druhy železa, které váží proteiny- transferin, který je s největší pravděpodobností identický se sérovým transferinem, a laktoferin, který je typický pro mléko a žlázy s vnější sekrecí. Laktoferin je syntetizován v mléčné žláze a jiných žlázách s vnější sekrecí (LUKAŠOVÁ, 1999). Jeho obsah je značně zvýšený 37
v mlezivu, (WALSTRA a kol., 2006), kde je jeho množství až 7 g.l-1. Jeho obsah je vysoký i v mléce, což z něj dělá druhou nejzastoupenější bílkovinu mléka hned po kaseinech (FARNAUT a EVANS, 2003; GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). Oproti mléku mateřskému, kde je jeho obsah značně vysoký na počátku laktace a později klesá, je jeho obsah v kravském mléce nižší a zvyšuje se při onemocnění dojnice mastitidou (LUKAŠOVÁ, 1999). S výjimkou mléka se vyskytuje rovněž ve slinách, slzách, pankreatické šťávě aj. (LUKAŠOVÁ, 1999; GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). Antibakteriální působení se projevuje u laktoferinu ve formě bakteriostatické (zastavení
množení
mikroorganismů)
nebo
baktericidní
aktivity
(usmrcení
mikroorganismů), (LUKAŠOVÁ, 1999). Antibakteriální účinek platí pro široké spektrum bakterií, hub, kvasinek, virů a parazitů. Antimikrobiální účinek laktoferinu je zkoumán a dokumentován in vivo a in vitro proti Gram+ a Gram- negativním bakteriím a některým kyselino-alkohol odolným bakteriím (GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). Bylo prokázáno, že železo je základní živinou pro růst téměř všech bakterií (FARNAUT a EVANS, 2003). Bakteriostatický účinek je dán vazbou železa, díky níž je nedostupný pro bakterie. Tento efekt je znám především proti Escherichia coli. Baktericidní účinek laktoferinu je zapříčiněn přítomností laktofericinu, který vzniká u laktoferinu jeho částečnou hydrolýzou (LUKAŠOVÁ, 1999). Lakterofericin působí přímo na buněčnou stěnu a to následně vede k poškození napadené buňky (LUKAŠOVÁ, 1999; GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009; JENSEEN a HANCOCK, 2009). Poškození buněčné
stěny
bakterií
bylo
prokázáno
v roce
1988.
Laktoferin
reaguje
-
s lipopolysacharidy v buněčné stěně Gram bakterií (GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). Tuto reakci a následné poškození bakteriální buňky mají na svědomí velké plochy kationtů na povrchu molekuly laktoferinu.
Jedná se o kationty vápníku
a hořčíku (JENSSEN a HANCOCK, 2009). Antimikrobiální efekt laktoferinu proti Gram+ bakteriím je založen na navázání kationtů na povrchu laktoferinu na anionty, které jsou na povrchu buněčné membrány bakterie, jako lipoteichové kyseliny, což má za následek snížení záporného náboje na buněčné stěně bakterií a dojde k enzymatickému účinku, který vede ke zničení G+ bakterie (GONZÁLES-CHAVÉS a kol., 2009). Bovinní laktoferin má významný nutriční aspekt a je využíván v řadě států k fortifikaci, tedy obohacení, kojenecké výživy (LUKAŠOVÁ, 1999). laktoferin
v organismu
protizánětlivý
a
antikarcinogenní
enzymatických funkcí (GONZÁLES-CHÁVES a kol., 2009). 38
účinek
Dále má a
několik
Laktoferin má vysokou biologickou hodnotu díky aminokyselinovému složení a dále je laktoferin významným zdrojem železa (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012).
3.4 Druhy mlék 3.4.1
Rozdělení mlék podle vzájemného zastoupení hlavních druhů bílkovin
Všechna mléka pocházející od různých druhů zvířat lze podle jejich chemického složení zařadit do odlišných skupin. Zásadní klasifikací mlék pro zařazení do skupin je však podle vzájemného zastoupení hlavních druhů bílkovin. Podle této klasifikace rozeznáváme: a) mléka kaseinová, která jsou produkována přežvýkavci a obsah kaseinu činní nejméně 75 % z celkového obsahu bílkovin b) mléka albuminová, produkovaná monogastrickými býložravci, masožravci a všežravci Albuminová mléka jsou v přírodě nejzastoupenější, ale kaseinová mléka mají o mnoho větší praktický význam (DUŠEK a kol., 1964). Z celosvětové produkce mléka tvoří přibližně 83,5 % mléko kravské, 12,7 % mléko buvolí, 2,3 % mléko kozí, 1,4 % mléko ovčí a 0,2 % mléko od velbloudů (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Různé druhy savců vykazují značné rozdíly v obsahu bílkovin (RONCADA a kol., 2012). 3.4.1.1 Mléko kravské Kravské mléko obsahuje v průměru 3,2 - 3,5 % bílkovin z celkové tukuprosté sušiny (GAJDŮŠEK, 2003). Kaseiny v kravském mléce zastupují 80 % (NENTWICH a kol., 2004). Podle statistických údajů 14 produkčních oblastí ve světě produkuje až 82 % z celosvětové produkce mléka. Jedná se o Kanadu, Mexiko, USA, Argentinu, Brazílii, EU, Rumunsko, Rusko, Ukrajinu, Indii, Čínu, Japonsko, Austrálii a Nový Zéland. EU tvoří až ¼ z celkového objemu mléka. Oproti tomu Afrika se podílí na produkci kravského mléka jen z necelých 5 % (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Kravské mléko se liší od mléka kozího a ovčího výrazně obsahem aminokyselin, jak tomu dokazuje i následná tabulka 3. Limitujícími aminokyselinami v kravském mléce jsou sirné aminokyseliny a izoleucin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009).
39
Tabulka 3 Obsah AK v proteinech mléka (v g vztaženo na 16 g dusíku), (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009) Aminokyselina
Kravské mléko
Kozí mléko
Ovčí mléko
Alanin
3,5
2,7
3,2
Arginin
3,3
1,3
2,9
Asparagin
7,7
7,6
7,0
Cystin
0,8
1,6
1,4
Glutamin
22,2
18,3
22,1
Glycin
2,0
1,4
1,9
Histidin
2,7
3,6
2,5
Isoleucin
4,4
5,2
4,6
Leucin
9,5
9,2
9,3
Lysin
7,8
5,2
7,2
Methionin
2,5
1,3
1,6
Fenylalanin
5,4
3,8
4,9
Prolin
9,1
8,3
10,8
Serin
5,8
4,1
5,6
Treonin
4,5
4,4
3,7
Tryptofan
1,4
1,3
1,9
Tyrosin
4,8
3,2
5,0
Valin
5,8
6,5
6,2
3.4.1.2 Mléko ovčí Ovčí mléko obsahuje 15 - 20 % sušiny, bílkoviny tvoří 5 - 7 % z celkového množství sušiny (KUCHTÍK, 2007). Konkrétní obsah celkových bílkovin se značně liší, což je zapříčiněno proměnlivou koncentrací obsahu αs1-kaseinu, který kolísá v rozmezí 0 - 26 % z celkového množství kaseinu (RONCADA a kol., 2012). 40
Ačkoliv je obsah bílkovin u mléka ovcí vyšší, než je tomu u mléka kravského a kozího, poměr mezi kaseiny a syrovátkovými bílkovinami mléka je velmi podobný mléku kravskému. Podíl kaseinu tvoří přibližně 75 - 80 %. Mezi nejvýznamnější bílkoviny mléka ovcí je řazen αs1-kasein, αs2-kasein, β-kasein, κ-kasein α-laktalbumin a β-laktoglobulin. Oproti kravskému mléku, obsahuje mléko ovcí více močoviny, kyseliny močové a méně volných aminokyselin. Ovčí mléko je chudší na obsah aminokyselin než kozí mléko (KUCHTÍK, 2007), což dokazuje i tabulka 3. Částice
kaseinu
jsou
na
rozdíl
od
mléka
kravského
mnohem
menší
(NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Limitujícími aminokyselinami jsou, stejně jako u mléka kravského, sirné aminokyseliny a izoleucin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). Ovčí mléko má díky vyššímu obsahu bílkovin a vápníku velmi dobrou sýřitelnost, díky čemuž je vyšší výtěžnost sýrů při zpracování ovčího mléka na sýry (ŠVEJCAROVÁ a kol., 2011). 3.4.1.3 Mléko kozí Kozí mléko je hodnotnou, zdravou a lehce stravitelnou potravinou. Z hlediska výživové hodnoty a obsahu sušiny je téměř identické s mlékem kravským (PŘIDALOVÁ a kol., 2009). Kozí mléko se řadí na třetí místo ve spotřebě mléka. Hned po kravském a buvolím (GUO, 2003). V posledních letech stoupá zájem spotřebitelů o kozí mléko z hlediska alternativy pro jedince trpící alergií na kravské mléko (TZIBOULA, 2002). Kozí mléko obsahuje v průměru okolo 12,6 % sušiny, 3,4 % bílkoviny, 3,8 % tuku, 4,3% laktosy a 0,8% minerálních látek (KALHOTKA a kol., 2010). Bílkovinami kozího mléka jsou stejně jako u mléka kravského α-laktalbumin, β-laktoglobulin, κ-kasein, β-kasein a αs1-kasein, sérový albumin, imunoglobuliny, které se od bílkovin mléka kravského liší genetickým polymorfismem (AMIGO a FONTECHA, 2011). Koza sánská spolu s naší Bílou kozou krátkosrstou mají obsah kaseinu v mléce poměrně nízký. Na rozdíl od těchto dvou plemen mléko kozy maltézké, která je chována v Itálii, obsahuje vysoké procento kaseinu. Při porovnání bílkovin mléka pocházejícího od kozy a od krávy je zřejmé, že v bílkovině kozího mléka je vyšší obsah esenciálních aminokyselin. Tento ukazatel svědčí o mírně vyšší biologickonutriční hodnotě kozího mléka (FANTOVÁ, 2012). 41
Velikost kaseinové micely je mnohem menší, pouhých 30 - 60 nm oproti micele kravského mléka o rozměru 30 - 300 nm. Je výrazně vyšší i obsah volných peptidů a aminokyselin. Kasein kozího mléka je méně termostabilní, než jak je tomu u kaseinu kravského mléka. Z tohoto důvodu je nezbytné volit šetrnější způsoby pasterace. V kozím mléce chybí nebo se objevuje oproti mléku kravskému jen ve velmi malém množství αs1-kasein, což je důvod, proč organismus velké části lidí, kteří trpí alergií na bílkoviny kravského mléka, snáší bez problémů kozí mléko. Podstatné rozdíly mezi kravským a kozím mlékem jsou i v obsahu aminokyselin (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). V poslední době je zaměřen výzkum na polymorfismus mléčných bílkovin, konkrétně na jejich účinek, kvalitu a kvantitu kozího mléka. Cílem je poté nové poznatky využít pro vytvoření populací koz produkující mléko o různé kvalitě, která by byla vyhovující dietetickým požadavkům různých skupin spotřebitelů (FANTOVÁ, 2012). Limitujícími aminokyselinami jsou u kozího mléka sirné aminokyseliny a lysin (VELÍŠEK a HAJŠLOVÁ, 2009). 3.4.1.4 Mléko buvolí Buvolí mléko slouží k výživě člověka v tropických oblastech, které díky svému klimatu umožňují výskyt a chov buvolů (MOMANI a ŠÁDA, 2010). Pokud srovnáme složení mléka kravského a mléka buvolího, buvolí mléko obsahuje hlavní složky ve vyšších koncentracích. Většina studií, která je zaměřená na složení buvolího mléka, se zabývá studiem plemena Murrah. Mléko většiny plemen buvola vykazuje ovšem podobné složení (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Obsah bílkovin buvolího mléka je vyšší, než jak tomu je u mléka krav (SINDHU a ARORA 2011). Pohybuje v rozmezí 3,8 - 4,3 %. Kasein tvoří 80 % celkového obsahu bílkovin. Převážná část kaseinu se nachází v podobě kaseinové micely. Kaseinová micela má rozměr 80 - 250 nm. Stejně jako v mléce krav se i u buvolího mléka nacházejí frakce αs, β- a κ-kasein. Jednotlivé frakce se v buvolím mléce nacházejí v následujícím pořadí: 40 % připadá na αs1-kasein, 6 - 9 % na αs2-kasein, 37 % β-kasein a 12 % κ-kaseinu. Genetické varianty byly zatím popsány pouze u κ-kaseinu. V buvolím mléce se nachází 8,4 % α-laktalbuminu a 6,4 % β-laktoglobulinu z celkového obsahu bílkovin. V mlezivu buvolů byly identifikovány čtyři třídy imunoglobulinů: IgG, IgA1, 42
IgA2 a IgM. Laktoferin se vyskytuje ve vyšších koncentracích (0,32 mg.ml-1), (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 3.4.2
Rozdělní mlék podle rozdílů ve vlastnostech a složení během laktace
S výjimkou druhových rozdílů je u mléka možné též zaznamenat typické rozdíly ve složení a vlastnostech mléka během období tvorby mléka, tedy vlastní laktace. Dle tohoto hlediska se rozlišují: a) mléka nezralá – mlezivo a mléka aberantní b) mléka zralá – jedná se o normální druhové mléko, které se tvoří v období laktace, kdy se již netvoří mlezivo (DUŠEK a kol., 1964). 3.4.2.1 Mléka aberantní Mléka aberantní jsou sekrety, které se podobají mléku a jsou vylučovány za nenormálních okolností. Jedná se o mléko čarodějné, samčí. Panenské a zapříčiněné nemocí dojnice aniž by byla spojená laktace s graviditou. •
Čarodějné mléko se někdy vyskytuje u novorozených mláďat.
•
Mléko samčí, které se vzácně vyskytuje u kozlů, beranů, býků, oslů, skopců, jelenů, srnců, dokonce i mužů. Nejčastěji se objevuje u kozlů.
•
Panenské mléko se vyskytuje u samic, které ještě nezabřezly.
•
Tvorba mléka podnícená onemocněním se vyskytuje jen vzácně. Jedná se o důsledek rakoviny mléčné žlázy případně i jiných onemocnění. Je to ojedinělý sekret.
U všech sekretů byly analýzou naměřeny hodnoty, které se jen velmi málo lišily od hodnot normálního mléka (DUŠEK a kol., 1964). 3.4.2.2 Mlezivo Kolostrum neboli mlezivo je sekret, který je produkován mléčnou žlázou již před samotným porodem (předběžné mlezivo) a následně v určitém časovém horizontu po porodu (pravé mlezivo), (DUŠEK a kol., 1964). Mlezivo má mnoho prospěšných účinků pro mláďata savců z hlediska svého složení a ochranných látek (COROIAN a kol., 2013). 43
Od zralého mléka se mlezivo liší v mnoha směrech. Je hustší, lepkavé, nažloutlé až hnědé barvy, typického pachu a mírně slané chuti. Obsahuje vysoké procento sušiny, které se zvýší díky vyššímu obsahu bílkovin v mlezivu oproti mléku zralému. Obsah laktózy a kaseinu je malý. Mlezivo naopak obsahuje více tuku a téměř dvojnásobek solí než zralé mléko. Zvýšený je obsah fosforu, železa a jódu (DUŠEK a kol., 1964). Dále obsahuje všechny důležité bílkoviny obsažené v mléce, ale v jiném vzájemném poměru. Před samotným otelením připadá na imunoglobuliny, albumin a kaseiny více než polovina z celkového počtu bílkovin. První dny po otelení dochází ke zvýšení
syntézy
a
sekreci
α-kaseinu,
β-kaseinu,
κ-kaseinu,
α-laktalbuminu,
β-laktoglobulinu a γ-globulinu. Imunitní složky se dostávají do mléka z krve. V mlezivu z prvního dojení bývá maximální množství imunoglobulinu, které činí až 70 %, oproti tomu je obsah sérového albuminu, α-laktalbuminu a β-laktoglobulinu malý. Po týdnu laktace připadá na imunoglobuliny již pouze 19,5 % a procento ostatních bílkovinných frakcí narůstá (JELÍNEK, a kol., 2003).
3.5 Faktory podílející se na množství bílkovin Na množství, složení a vlastnostech mléka se podílí nesmírná řada různých činitelů (LUKAŠOVÁ, 1999), které se často překrývají nebo jsou jen velmi málo postřehnutelné. Mezi vnější faktory se řadí výživa a krmení, technologie chovu, systém ustájení, technika dojení, úroveň odchovu a další.
K vnitřním faktorům se řadí
plemenná příslušnost, plemenná hodnota rodičů, pořadí laktace, stáří dojnice, zdravotní stav dojnice, ukazatelé reprodukčního cyklu (VANĚK a kol., 2002). U koz se navíc jedná o živou hmotnost a tělesné rozměry zvířete, velikost a tvar vemene, období porodů, četnost vrhů, teplota prostředí (FANTOVÁ a NOHEJMOVÁ, 2009). 3.5.1
Plemeno
Vliv plemene patří mezi důležité činitele, které ovlivňují užitkovost dojnice (LUKAŠOVÁ, 1999). Má značný vliv na složení mléka a to mezi jednotlivými plemeny, ale i v rámci jednoho plemene (MICHALCOVÁ a KRUPOVÁ, 2009).
44
3.5.1.1 Skot Plemena skotu u nás nejvíce chována, jsou Holštýnsko-fríský skot s mléčnou užitkovostí a Český strakatý skot (ČESTR), který má kombinované využití na maso a mléko (LUKAŠOVÁ, 1999). Černostrakatý skot, nebo také Holštýnsko-fríský skot byl vyšlechtěn v Nizozemí. V roce 2000 bylo v USA v kontrole užitkovosti dosaženo produkce 9769 kg mléka za laktaci o obsahu bílkovin 3,12 %, v Kanadě 9162 kg mléka s obsahem bílkovin 3,22 %, ve Švédsku 8936 kg mléka a obsah bílkovin činil 3,28 %. Dále se v menším procentu v České republice chová Ayrshirský skot. Toto plemeno se vyznačuje mléčnou užitkovostí, která činí v průměru nad 6500 kg mléka za laktaci, přičemž obsah bílkovin činí 3,3 %. Jedná se o plemeno skotu, které má velmi tučné mléko 4 % a více (VANĚK a kol., 2002). 3.5.1.2 Ovce U ovcí se na mléčnou produkci chová ovce Východofríská, která byla vyšlechtěna v Německu a má vysokou mléčnou užitkovost. Mléčná užitkovost u těchto ovcí za laktaci činí 300 - 400 l (HORÁK a kol., 2004). 3.5.1.3 Kozy Chov koz má v České republice dlouholetou tradici. Nejčastěji chovaným plemenem je Bílá koza krátkosrstá (PŘIDALOVÁ a kol., 2009).
Jedná se o plemeno domácí
(FANTOVÁ, 2012). Dojivost koz činní 800 - 1000 kg mléka za laktaci, obsah bílkovin činní 2,7 % (BABIČKA a KOUŘIMSKÁ, 2006). Dalším u nás nejvíce chovaným plemen koz s mléčnou produkcí je Koza hnědá krátkosrstá. Zmíněné plemeno patří rovněž k našim domácím plemenům (FANTOVÁ, 2012). Dojivost tohoto plemene činní 800 – 900 kg mléka za laktaci, obsah bílkovin je rovněž 2,7 %, jak tomu bylo již u předešlého plemene (BABIČKA a KOUŘIMSKÁ, 2006). 3.5.1.4 Buvoli V Indii se chová převážně již zmiňované plemeno Murrah, dále Surti a Jafarabadi. V Pákistánu se jedná o plemena Nili a Ravi. Mezi plemena s mléčnou užitkovostí patří rovněž menší plemena egyptská a dále plemena v Iráku, Rusku, Itálii, Bulharsku, 45
Řecku, bývalé Jugoslávii a Turecku. V Indii produkují mléčná plemena buvolů v průměru 682 - 727 kg mléka za laktaci (MOMANI a ŠÁDA, 2010). 3.5.2
Stádium laktace
Stádium laktace výrazně ovlivňuje nejen produkci mléka, ale i zastoupení jednotlivých hlavních složek mléka, jeho fyzikálně-chemické vlastnosti a technologické vlastnosti. Normovaná laktace u skotu činní 305 dní a dělí se na 3 období. Jedná se o kolostrální období, které trvá v průměru 5 dní, období produkce zralého mléka, a období produkce starodojného mléka (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 3.5.2.1 Kolostrální období Kolostrum obsahuje oproti mléku mnohem vyšší množství celkových bílkovin, imunoglobulinů a kaseinu (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 3.5.2.2 Období produkce zralého mléka V období, kdy je produkováno zralé mléko, dosahují dojnice maxima užitkovosti v období 3 - 8 týdnů po porodu. Jedná se o období, které se označuje jako rozdojování a je rozhodující pro dosažení vysoké produkce mléka během laktace. V období, kdy dochází ke zvyšování nádoje nastává pokles obsahu bílkovin (LUKŠOVÁ, 1999). 3.5.2.3 Produkce starodojného mléka Vysokobřezí dojnice bývají označovány jako „starodojné“ a jejich mléko je tedy také tak označováno. Před zaprahnutím dochází ke změnám ve složení a vlastnostech mléka. Dochází ke změnám v zastoupení jednotlivých bílkovin. Nastává pokles kaseinu a nárůst syrovátkových bílkovin (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 3.5.3
Denní kolísání složek mléka
Během dne se mění obsah mléčných složek v mléce. Pokud jsou intervaly mezi jednotlivým dojením delší než 15 hodin, můžeme pozorovat změny ve složení nádoje. Vedle poklesu nádoje se jedná o vzestup tuku, syrovátkových bílkovin, sodíku a chlóru za současného snížení tukuprosté sušiny, laktózy a draslíku (LUKAŠOVÁ, 1999).
46
3.5.4
Stáří dojnice
U dojnice je dosaženo maxima dojivosti ve věku 4. - 5. laktace. Od 6. laktace odchází opět ke snížení užitkovosti. Obsah bílkovin je nejvyšší v období mezi 4. - 6. laktací. Při stáří dojnice dochází k poklesu obsahu bílkovin (LUKAŠOVÁ, 1999). 3.5.5
Vliv sezóny
Obsah bílkovin se během roku výrazně mění. Sezónnost se projevuje ve výživě dojnic. V létě je obsah bílkovin nižší, než je tomu v zimním období. Což je zapříčiněno přechodem na jiné krmné dávky na jaře a v létě. Nejvyššího obsahu bílkovin dosahuje mléko krav v prosinci až únoru (ŠUSTOVÁ, 2012). ELICH a kol. (2004) prováděli výzkum, ve kterém zkoumali vliv na obsah složek mléka v průběhu laktace. Kozí mléko bylo zkoumáno v období od dubna do srpna a to u plemen Bílá koza krátkosrstá a Hnědá koza krátkosrstá. Během těchto měsíců se obsah bílkovin u Bílé kozy krátkosrsté jen velmi nepatrně zvyšoval a u Hnědé kozy krátkosrsté výsledky během studie kolísaly. Právě vlivem výrazného rozptylu výsledků nebyl prokázán statistický význam ve složení kozího mléka mezi jednotlivými odběry. Oproti tomu u ovčího mléka došlo k významnému zvýšení nejen bílkovin, ale všech složek mléka. 3.5.6
Vliv výživy
Výživa u dojnic je jeden z limitních faktorů pro mléčnou užitkovost, složení a jakost mléka. Značný vliv má kvalita používaných krmiv, poměr mezi jednotlivými živinami a jejich výdejem (LUKAŠOVÁ, 1999). V současné době díky modernizaci krmných dávek došlo ke změně krmné dávky, původně založené na objemné píci, na fermentovaná glycidová krmiva, které respektují nárůst produkce u vysokoprodukčních dojnic. Zkrmují se siláže s vysokým obsahem kyselin, nízkým obsahem vlákniny a vysokými dávkami jadrných koncentrátů. V dnešní době se do krmné dávky přidávají probiotika, kterými jsou např. kmeny kvasinek. Jedná se konkrétně o kmen Saccharomyces cerevisiae, které pozitivně ovlivňují mikrobiální bachorový metabolismus. Zvyšuje příjem sušiny v krmné dávce a má příznivý vliv na obsah bílkovin a tuku (SEYDLOVÁ a SNÁŠELOVÁ, 2009).
47
Proteiny v krmné dávce dojnice mají jen velmi malý vliv na celkový obsah bílkovin v mléce. Při nadměrném množství bílkovin dochází ke zvýšení obsahu nebílkovinného dusíku, především močoviny. Na druhou stranu při jejich nedostatku v krmené dávce, dochází ke snížení nádoje spojené s poklesem obsahu bílkovin v mléce. Pro tvorbu bílkovin hraje důležitou roli také energetická složka krmiva. Energie, která je potřebná pro syntézu bílkovin z aminokyselin, se spotřebovává během látkové výměny. Obsah bílkovin v mléce je možné zvýšit pomocí zvýšeného obsahu energie v krmné dávce a zkrmováním silážemi s kvalitnější fermentací či kukuřičnými silážemi o vyšším obsahu šrotu (LUKAŠOVÁ, 1999). 3.5.7
Zdravotní stav
Při onemocnění dojnice dochází ke změnám v množství nadojeného mléka, jeho vlastností a množství obsahových látek mléka. Změny jsou méně výrazné, jedná-li se o lehčí formu onemocnění. Při dlouhodobém a závažném onemocnění klesá mléčná užitkovost skotu až o 50 a více % (LUKAŠOVÁ, 1999). Při zdravotních poruchách dochází ke změnám ve struktuře kaseinových micel, poměru vápníku a fosforu a následně ke zhoršení syřitelnosti a technologického využití mléka (ŠUSTOVÁ, 2012). Dobré zdraví hospodářských zvířat se odráží v obsahu mléčných složek. V mléce se vyskytují majoritní složky, díky kterým lze posuzovat zdravotní stav dojnice. Majoritními složkami jsou myšleny bílkoviny, tuk, laktóza a počet somatických buněk. Obsah
kaseinu
a
obsah
hrubých
bílkovin
může
být
využit
v kombinaci
s korespondujícím obsahem močoviny k posouzení energetické dotace dojnice (HANUŠ a kol., 2011). 3.5.7.1 Vliv mastitidy Mastitida skotu je hlavní onemocnění, které vede k ekonomickým ztrátám. Dochází ke snížení produkce mléka. Mastitida může být klinická nebo subklinická, tedy bez objevení příznaku. U subklinické mastitidy je značně náročná diagnostika (RONCADA a kol., 2012). Pod označením mastitida chápeme zánět mléčné žlázy, který je kromě fyzikálních, chemických a mikrobiálních změn doprovázen i zvýšeným počtem somatických buněk a patologickými změnami v tkáni mléčné žlázy (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). 48
Během mastitidy dochází ke změně v obsahu bílkovin. Změny v obsahu bílkovin ovšem během mastitidy nejsou jednoznačné. V některých případech byl prokázán lehký nárůst v obsahu, u jiných naopak nebyly změny v obsahu bílkovin prokázány. Během onemocnění dojnice mastitidou dochází ke snížení obsahu z nutričního hlediska nejvýznamnějšího proteinu, kaseinu (LUKAŠOVÁ, 1999). Během mastitidy dochází k narušení sekreci a syntéze kaseinu. Další příčinou snížení jeho obsahu v mléce dojnice nakažené mastitidou je, že během tohoto onemocnění
dochází
k
postsekretorické
degradaci
činností
proteáz
kaseinu
(NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). V mléce je kasein obsažen z 96 % v podobě kaseinové micely. Tento podíl micelárního kaseinu během mastitidy klesá až na 46 % (LUKAŠOVÁ, 1999). U dojnice při tomto onemocnění obsahuje mléko mnohem menší kaseinové micely. Mléko se tedy nesráží, malé micely obtížně vytvářejí prostorovou strukturu s vápníkem (ŠUSTOVÁ, 2012). HOGHARTH a kol., (2004) provedl studii, kde porovnával hladinu syrovátkových bílkovin u mléka od zdravých dojnic a od mastitidních dojnic pomocí proteomitiky. Výsledkem byla zvýšená koncentrace obsahu bílkovin krevního séra, zatímco obsah hlavních syrovátkových bílkovin (β-laktoglobulinu a α-laktalbuminu) se snížil. Změny v obsahu bílkovin krevního séra a syrovátkových bílkovin jsou poměrně v rovnováze, tudíž se tyto změny neodráží v celkovém množství bílkovin mléka (LUKAŠOVÁ, 1999). Při mastitidě dochází ke snížení biologické a nutriční hodnoty mléka a zhoršuje se i jeho technologická zpracovatelnost (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012).
Tabulka 4 Změny v obsahu bílkovin v důsledku mastitidy (LUKAŠOVÁ, 1999) Složka
Normální hodnota
Koeficient změny
(mg.ml-1) αs1-kasein
13,3
0,50
α-laktalbumin
1,03 - 1,22
0,50
β-laktoglobulin
4,0
0,74
Imunoglobuliny
0,25 - 0,30
10,0
Serumalbumin
0,24
2,7
49
3.6 Genetický polymorfismus mléčných bílkovin Polymorfismus mléčných bílkovin byl poprvé zmíněn v roce 1957 (GURKAN, 2011). Od této doby je sledován a to především jako důsledek vývoje populační genetiky šlechtění (MICHALCOVÁ a KRUPOVÁ, 2009). Ale i v současné době je předmětem výzkumu, jelikož existuje vztah mezi kvalitou a kvantitou mléka, jeho složením a technologickými vlastnostmi (HORÁK a kol., 2008). Genetický polymorfismus definuje skutečnost, že každá mléčná bílkovina představuje dvě nebo více forem, které jsou geneticky stanovené podle autozomálních a kodominantních alel (FORMAGGIONI a kol, 1999). Jednotlivé genetické varianty jsou definovány jako vyskytující se formy dané bílkoviny, které se od sebe navzájem liší geneticky předávanými rozdíly v jejich aminokyselinové sekvenci. Tyto mutace jsou výsledkem, který vznikl na bázi substituce jednotlivých aminokyselin nebo vymazání jednotlivého aminokyselinového úseku (MARKOVÁ a kol., 2008). Dříve byl význam zaměřen na zjištění nových polymorfních variant proteinů a na rozdíly ve frekvenci alel u různých plemen. Mnohem později byl objeven vztah k technologické jakosti mléka a kvantitativním ukazatelům mléčné užitkovosti. Zpracovatelské vlastnosti mléka mohou být v pozitivním smyslu ovlivněny zavedením selekčního chovu na požadované alely mléčných proteinů. Možnost šlechtění, ve které je zahrnuta selekce specifických alel jednotlivých genů, je závislá na frekvenci alel v populaci skotu (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Genetický polymorfismus značně ovlivňuje kvalitu produkce a složení mléka (FORMAGGIONI a kol., 1999; MICHALCOVÁ a KRUPOVÁ, 2009). Bílkoviny mléka jsou všechny polymorfní, v součastné době je prozatím popsáno na 30 genetických variant, které se od sebe navzájem liší primární strukturou. Rozdílná primární struktura jednotlivých genetických variant mléčných bílkovin je zapříčiněna substitucí, inzercí nebo delekcí aminokyselin v peptidickém řetězci. Jejich heterogenita je zapříčiněna kodominancím působením alel autozomálních genů. Geny pro kaseiny tvoří jednu vazebnou skupinu umístěnou na 6. chromosomu. Na tomto chromosomu byl
50
lokalizován rovněž lokus pro bovinní sérový albumin. Lokus laktoglobulinu byl nalezen na 11. chromosomu (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012). Genetický polymorfismus má značný význam ze spousty důvodu, mezi něž patří i detekce případných vlivů na vlastnosti mléka z hlediska výživy a technologie (FORMAGGIONOI a kol., 1999). Polymorfismus kaseinů je klíčový pro vlastnosti daného kaseinu. Konkrétně v sýrařství (RONCADA a kol., 2012). Bylo
prokázáno,
že
mléko,
které
obsahuje
značné
množství
varianty
β-laktoglobulinu, κ-kaseinu a β-kaseinu má lepší koagulační vlastnosti při sladkém srážení, a proto jsou vhodnější pro výrobu sýrů (FROMAGGIONI a kol., 1999), jak tomu dokazuje tabulka 5.
51
Tabulka 5: Vztah mezi genetickým polymorfismem mléčných bílkovin a sýrařsky významnými vlastnostmi mléka (NAVRÁTILOVÁ a kol., 2012) lokus
Alela A
B
měkká
αs1-kasein
C
D
tuhá
jakost sýřeniny β-kasein doba sýření
-
kratší
synereze
-
rychlejší
pevnost sýrového zrna
-
pevnější
výtežnost
-
vyšší
κ-kasein
A
B
obsah bílkovin
-
vyšší
kaseinové číslo
-
vyšší
doba sýření
-
kratší
synereze
-
rychlejší
pevnost sýrového zrna
-
vyšší
výtěžnost
-
vyšší
β-laktoglobulin
A
B
obsah kaseinu
-
vyšší
obsah
-
nižší
pevnost sýrového zrna
-
vyšší
výtěžnost
-
vyšší
kaseinové číslo
-
vyšší
syrovátkových
kratší
pevnější
C
D
jako A
jako A
bílkovin
3.7
Alergie na mléčnou bílkovinu
Alergické onemocnění se obecně výrazně zvýšilo v posledních dvaceti až třiceti letech a představuje rostoucí zdravotní problém v západních i rozvojových zemích (HODGKINSON, 2011).
52
Alergie na kravské mléko je v celé Evropě nejrozšířenější alergií vůbec. Tato alergie postihuje lidi všech věkových kategorií, hlavně děti v prvním roce života (FUCHS, 2005). U dětí se jedná o nejčastější alergii vůbec. V průměru postihuje 2 – 6 % populace dětí (VILLOSLADA a kol., 2005). Vzhledem k velké konzumaci kravského mléka, které obsahuje až trojnásobek bílkovin oproti mateřskému mléku, došlo k rozvoji nesnášenlivosti na kravské mléko. Složení kravského mléka neodpovídá svým složením mléku mateřskému. Poměr kaseinu k syrovátkovým bílkovinám je 4:1 (80 % kaseinu, 20 % syrovátkových bílkovin). U mléka mateřského je to právě naopak a výsledný poměr mezi kaseiny a syrovátkovými bílkovinami je 2:3. Kasein je pro člověka hůře stravitelný. Syrovátkové bílkoviny mají hodnotnější biologické vlastnosti. Tohoto poznatku se využívá při adaptaci kravského mléka pro potřeby umělé výživy kojenců. U těchto výrobků je snahou snížit obsah kaseinů a naopak zvýšit obsah syrovátkových bílkovin. Alergie je ve své podstatě patologický stav. Tedy přehnaná reakce organismu na daný podnět. Proti bílkovinám obsaženým v kravském mléce se začnou tvořit protilátky. Jedná se o imunoglobuliny typu E (IgE). V některých případech nejsou ovšem IgE na vině, ale zdrojem a zároveň nosičem alergické informace se stávají buňky, které nazýváme tzv. imunity. Mezi imunity jsou řazeny bílé krvinky. V případě že se v organismu tvoří větší množství izotopu IgE, hovoříme o IgE alergické přecitlivělosti, tedy atopii. V případě aktivity bílých krvinek bez vyšší tvorby izotopu IgE mluvíme o non-IgE alergické přecitlivělosti (FUCHS, 2005). U dětí alergie vzniká v důsledku přechodu z kojení na umělou výživu, která se skládá z kravského mléka (KVASNIČKOVÁ, 1998). Po přechodu kojence na umělé mléko se v období dnů až týdnů projeví alergie na bílkoviny kravského mléka trávicími problémy. Jedná se o bolesti v břišní oblasti, zvracení, průjem s příměsí krve. Tyto symptomy nabývají na intenzitě a závažnosti a s postupem času se stupňují. Velmi častým doprovodným jevem alergie na mléčnou bílkovinu bývá u dětí kojenecký ekzém. Dále se mohou vyskytnout dýchací potíže (GREGORA a ZÁKOSTELECKÁ, 2009). V některých případech může skončit až úmrtím jedince (VILLOSLADA a kol., 2005). V případě, že je potvrzena diagnóza, podává se kojenci mléko s vysokým stupněm štěpení mléčné bílkoviny, tzv. hypoalergenní mléko (HA). Jedná se o extenzivní hydrolyzáty, jejichž alergicita je v porovnání s nenaštěpenými bílkovinami výrazně nižší. Hydrolyzáty jsou chuťově velmi odlišné, vzhledem k vysokému stupni naštěpení 53
bílkovin. Tento fakt kojencům nevadí, jelikož si na chuť hydrolyzátů zvyknou (GREGORA a ZÁKOSTELECKÁ, 2009). K alergii na kravské mléko ovšem může dojít i tehdy, je-li dítě kojeno (KVASNIČKOVÁ, 1998). Postihuje 0,5 % kojených dětí. Důvod pro vznik alergie je přechod
syrovátkové
bílkoviny
kravského
mléka,
které
matka
konzumuje,
do mateřského mléka (GREGORA a ZÁKOSTELECKÁ, 2009). Jedná se konkrétně o obsah β-laktoglobulin (KVASNIČKOVÁ, 1998). Ačkoliv se jedná o stopová množství, může vyvolat u kojence alergii. Alergie se projeví buď do tří měsíců věku od narození, nebo se klinické příznaky neprojeví. Pokud se klinické příznaky neprojeví, zdá se, že dítě netrpí alergií na kravské mléko, ale postupem času dojde k řetězci reakcí, které způsobí alergické projevy po požití první porce potraviny z kravského mléka. Potíže se poté objeví do prvního týdne po požití potraviny. V případě průkazu alergie v tomto období, je řešením výlučné kojení s vyloučením mléka a mléčných výrobků ze stravy matky nebo zavedení extenzivního hydrolyzátu, tedy hypoalergenní mléka (GREGORA a ZÁKOSTELECKÁ, 2009). Alergie na kravské mléko nepostihuje pouze děti, ale i dospělé jedince. U dospělých jedinců ovšem není obvyklá (KVASNIČKOVÁ, 1998). Z hlediska alergie jsou nejvýznamnějšími bílkovinami kravského mléka kasein a β-laktoglobulin (FUCHS, 2005).
Minoritními alergeny kravského mléka jsou
α-laktalbumin a bovinní sérový albumin. Ostatní složky mléka jsou méně významné z hlediska alergie na kravské mléko. Spadají sem bovinní imunoglobuliny, β2-mikroglobulin, transferin, laktoferin, laktoperoxidáza, alkalická fosfatáza a kataláza. Dále mohou jako alergeny působit i produkty Maillardovy reakce. Jakými jsou i např. konjugáty laktóza-protein. Mnoho postižených jedinců je alergických na více než jeden protein (KVASNIČKOVÁ, 1998). Pokud se alergie na bílkoviny v kravském mléce objeví a je lékařsky potvrzená v prvním roce života dítěte, má tendenci až z 80 % případů vyhasnout. Alergie na syrovátkové bílkoviny má tendenci vyhasínat mnohem snáze a častěji než alergie na kaseinovou bílkovinu. Do 3 let věku alergie vymizí až z 90 - 95 % případů. Oproti tomu alergie na kasein vyhasíná odhadem jen v 60 % do 3 let věku (FUCHS, 2005). Určité procento populace trpí alergií na αs1-kasein. Pro tyto jedince je vhodné konzumovat kozí mléko, které obsahuje této kaseinové frakce jen velmi nepatrné množství, nebo jej neobsahuje vůbec (FANTOVÁ, 2012).
54
3.7.1
Atopie
Atopie je dána geneticky. Dítě s atopickou dispozicí má mezi přímými příbuznými někoho, kdo trpí nějakou z forem alergie (ILIKOVÁ a kol., 2009). Atopie je nepřiměřená reakce na vnější podnět, což je v tomto případě po požití bílkoviny či bílkovin kravského mléka. Pravá atopie na bílkoviny kravského mléka je ztráta schopnosti tyto bílkoviny tolerovat. Jedná se o geneticky založenou příčinu, která postihuje až 5 % dětí do věku 3 let. Prokazuje se na základě nepřiměřené hladiny alergických protilátek izotopu IgE proti bílkovinám či bílkovině kravského mléka (FUCHS, 2005). 3.7.2
Neatopická cesta
Jedná se o nejobtížnější cestu. Projevy této přecitlivělosti jsou pozdní, nejsou v bezprostřední vazbě na požití mléka. Projevy nebývají specifické. Mohou být vleklé, nejasné, nezřetelné. Neexistuje laboratorní krevní test ani kožní test, který by tuto cestu uspokojivě potvrdil. Postihuje asi až 2 % malých dětí. U dospělých lidí se vyskytuje asi do 1 % (FUCHS, 2005).
55
4
ZÁVĚR
Bakalářská práce zjišťovala strukturu bílkovin obsažených v mléce, zastoupení aminokyselin v kaseinových a syrovátkových bílkovinách, rozdíly v zastoupení bílkovin v mléce kravském, ovčím, kozím a buvolím, faktory ovlivňující složení a obsah bílkovin v mléce. Mléčné bílkoviny jsou dobrým zdrojem esenciálních aminokyselin. Některé z nich jsou zdrojem minerálních látek, jako například laktoferin, který obsahuje molekulu železa. Bílkoviny mléka jsou tvořeny dvěma skupinami, které jsou definovány dle rozpustnosti při okyselení mléka na hodnotu izoelektrického bodu 4,6 pH. Jedná se o kaseiny a syrovátkové bílkoviny. Kaseiny se v mléce vyskytují ve formě kaseinové micely, která se skládá z menších podjednotek tzv. submicel. Kaseinové micely můžeme sledovat pod elektronovým mikroskopem.. Tato struktura je již mnoho let předmětem zkoumání. V kravském mléce se vyskytuje kasein z 80 - 95 % ve formě kaseinové micely. Zbylá procenta tvoří volný kasein. V mléce jsou obsaženy čtyři kaseinové frakce. Jedná se o αs1-,αs2- β- a κ-kasein. Dalším z kaseinů je γ-kasein, který vzniká degradací β-kaseinu za účasti plazminu. κ-kasein je jedinou kaseinovou frakcí, která je glykolyzována. Ve své molekule obsahuje na rozdíl od zbylých frakcí, které se z chemického hlediska řadí mezi fosfoproteiny, molekulu polysacharidů. Jedná se tedy z chemického hlediska o glykoprotein. Syrovátkové bílkoviny tvoří α-laktalbumin, β-laktoglobulin, bovinní sérový albumin, imunoglobuliny. Dále se do mléčných bílkovin řadí laktoferin, který má bakteriostatický a baktericidní účinek, enzymy, bazické bílkoviny, proteoso-peptony, enzymy a lipoproteiny. Podle obsahu dvou již zmíněných skupin bílkovin se rozeznávají u savců mléka albuminová, s obsahem méně než 75 % kaseinových bílkovin z celkového obsahu všech bílkovin, a mléka kaseinová, kde je celková bílkovina tvořena 75% a více kaseinovými bílkovinami. Z hlediska výživy lidí jsou dominantními mléka kaseinová. Ačkoliv v přírodě se více vyskytují mléka albuminová. Z hlediska produkce se na první místo řadí mléko kravské, které je následované mlékem buvolím a dále mlékem kozím a ovčím. 56
Všechny bílkoviny mléka jsou polymorfní. Polymorfismus mléčných bílkovin výrazně ovlivňuje technologické vlastnosti a složení mléka. Na množství bílkovin v mléce se podílí značný počet faktorů. Jedná se o faktory endogenní a exogenní. V práci byly zmíněny jen nejhlavnější z těchto faktorů. Jako jsou plemeno, vliv zdravotního stavu, vliv výživy, sezónnost, denní kolísání, vliv věku a stádium laktace. Mléčné bílkoviny mají mimo svůj pozitivní význam z hlediska nutričního a biologického aspektu, i negativní význam. Tímto negativním vlivem je alergie na bílkovinu kravského mléka. Tato alergie se objevuje u dětí i dospělých jedinců. Mezi nejvýznamnější alergeny kravského mléka patří kaseiny a β-laktoglobulin, α-laktalbumin a bovinní sérový albumin tvoří méně výraznou skupinu alergenů. Alergie na kasein vyhasíná mnohem méně než alergie na syrovátkové bílkoviny.
57
5
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ALEXANDROS, A., GUILLAUME, H., CLAIRÉ, A., GUILLAUME, Y., GHARBI, T., 2011: Simple method for detection of extremely diluted anti beta-casein antibodies from glass bead based receptors. Talanta, 8 (5), p. 632-637.
AMIGO, L., FONTECHA, J., 2011: Milk | Goat Milk. Encyklopedia of Diary Science (Sekond Edition), p. 484-493.
AMIGO, L., RECIO, I., RAMOS, M., 2010: Genetic polymorphism of ovine milk proteins: its influence on technological properties of milk - a review. International Dairy Journal, 10 (3), p. 135-149.
BERANOVÁ, M., 2011: Jídlo a pití v pravěku a ve středověku. Academia, Praha, 511 s.
BLÁHA, L., ŠREK, F., 1999: Suroviny pro učební obor Cukrář, Cukrářka. Informatorium, Praha, 213 s.
BUCHHEIM, W., LUND, S., SCHOSTISSCH, J., 1989: Verschiende Untersucungen zur Struktur und Grösse von Caseimicellen in der Milch verschienders Species. Kiler Milchw Forsch, 41, p. 253-265.
BUŇKA, F., BUŇKOVÁ, L., KRÁČMÁR, S., 2009: Základní principy výroby tavených sýrů. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 70 s.
COROIAN, A., ERLER, S., MATEA, C. T..,MIREAN, V., RDUCU, C., BELE, C., COROIAN, C. O., 2013: Seasonal changes of buffalo colostrum: Physicochemical parameters, fatty acids and cholesterol variation. Databáze online [cit. 2013-03-19]. Dostupné na: http://journal.chemistrycentral.com/content/7/1/40
COSTA, D., BITSCHI, R., NEGRINI, S., TASSO, R., CANCEDA, R., DESCALZI, F., PENNESI, G., TAVELLA, S., 2010: Lipocalin-2 controls the experssion of SPF-1 and the number of responsive cells in bone. Cytokine, 51 (7), p. 47-52. 58
DALGLEISH, D. S., SPANGNUOLO, P. A., GOFF, H. D., 2004: A possible structure of casein micelle based on high-resolution field-emission scanning elektron microscopy. International Dairy Journal, 14 (12), p. 1025-1031.
DUŠEK, B., ŠEBELA, F., PAVEL, J., 1964: Mlékařství. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 328 s.
ELICH, O., SNÁŠELOVÁ, J., CICVÁREK, J., 2008: Změny složení ovčího a kozího mléka v průběhu laktace. Mlékařské listy, 111 (12), p. 25-28.
FANTOVÁ, M., 2012: Chov koz. Brázda, Praha, 2012, 231 s.
FANTOVÁ, M., NOHEJMOVÁ, L., 2009: Vybrané kapitoly z chovu koz. Powerprint, Praha, 73 s.
FARNAUT, S., EVANS, R. W., 2003: Lctoferrin-a multifunctional protein with antimicrobial proprieties. Molecular Imunologie, 40 (11), p. 395-405.
FERRARETTO, A., GRAVAGHI, C., FIORILLI, A., TETTAMANT, G., 2003: Caseinderived bioactive phosphopeptides: role of phosphorylation and primary structure in promoting kalcium uptake by HT-29 tumor cells. Febs Letter, 561 (9), p. 92-98.
FORMAGGIONI, P., SUMMER, A., MALACARNE, M., MARIANI, P., 1999: Milk protein polymorphism: Detection and diffusion aft he genetic variants in Bos genus. Databáze online [cit. 2013-03-16]. Dostupné na: http://www.unipr.it/arpa/facvet/annali/1999/formaggioni/formaggioni.htm
FOX, P. F., BRODKORB, A., 2008:The casein micelle: Historial aspects, current concepts and signigicance. International Dairy Journal, 18 (7), p. 677-684.
FOX, P., MCSWEENEY, P., 1998: Dairy chemistry and biochemistry. Blackie Academic, New York, 1998, 478 p.
59
FUCHS, M., 2005: Alergie číhá v jídle a pití: kuchařka pro alergiky. Adéla, Plzeň, 189 s.
GAJDŮŠEK, S., 2003: Laktologie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 2003, 78 s.
GAJDŮŠEK, S., KLÍČNÍK, V., 1993: Mlékařství. Vysoká škola zemědělská, Brno, 1993, 128 s.
GONZÁLES-CHÁVES, S. A., ARÉVALO-GALLEGOS, S., RASCÓN-CRUZ, Q., 2009: Lactoferrin: structure, function and application. International Journal of Antimicrobial Agents,33, (4), p. 301. e1-301. e8.
GREGORA, M., ZÁKOSTELECKÁ, D., 2009: Jídelníček kojenců a malých dětí. Grada Piblishing, Praha, 176 s.
GREPPI, G., RANCADA, P., FORTIN, R., 2008: Protein components of goat´s milk. Dairy goats feeding and nutrition, 2, p. 71-94.
GUO, M., 2003: GOAT | Milk, Encyklopedia of Food Science and Nutrition (Second Edition). p. 2944-2949.
GURCAN, E. K., 2011:Association between milk protein polymorphism and milk production traits in Black and White dairy cattle in Turkey. African Journal of Biotechnology 10 (6), p. 1044-1048.
HANUŠ, O., MANAG, I., VYLETĚLOVÁ, M., GENČUROVÁ, V., KOPECKÝ, J., JEDELSKÁ, R., 2011: Význam sledování minoritních složek mléka pro zdraví zvířat a analytické možnosti jejich monitoring., Mlékařské listy, 22, 127, s. XIV-XIX.
HODGINSON, A. J., MCDONALD, N. A., KIVITIS, L. J., HURFORD, D. R. a kol: 2012: Allergic responses induced by goat milk αs1-casein in a murime model of gastrointestinal atopy. Journal of Dairy Science, 95 (1), p. 83-90.
60
HOGARTH, C. J., FITZPATRIK, J. L., NOLAN, A. M., YOUNG, F. J., PITT, A., ESKERSALL, P. D., 2004: Differantie protein composittiom of bovinne whey: a composittion of whey from heathy animals and from those with clinical mastitis. Proteomics, 4 (7), p. 2094-2100.
HOLDER, A., BIRKE, A., EISELE, T., KLAIBER, I., FISCHER, L., HINRICHS, J., 2013: Selective isolationof angiotensin-I-converting enzyme-inhybitory peptides from micellar casein and β-casein hydrolysates via ultrafiltration. Databáze online [cit. 2013-03-17]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694612002579#
HOLT, C., DE KRUIF, C. G., TUINIER, R., TIMONS, P. A., 2003:Substructure of bovine casein micelles by small-age X-ray and neutron scattering. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 213, (2-3), p. 275-284.
HORÁK, F., (ed), 2004: Ovce a jejich chov, Brázda, Praha, 303 s.
HORÁK, F., KONRÁD, R., MALÁ, G., MAREŠ, Š., MÁTLOVÁ, V., MILERSKI, M., SEDLÁK, J., SZTAMNOÓVA, Z., 2008: 80 let užitkovosti koz v České republice 19282008. Svaz chovatelů ovcí a koz v ČR, Brno, 150 s.
HORNE, D. S., 2006: Casein micelle structure: Models and muddles. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 11 (6), p. 148-153.
CHARVÁTOVÁ, R., KOUŘIMSKÁ, L., 2006: Požadavky na chov koz. s. 30-35, In BABIČKA, L., KOUŘIMSKÁ, L., Praktikum pro faremní zpracovatele mléka, Hygienické požadavky pro faremní zpracovatele mléka. Česká zemědělská univerzita, Praha, 48 s.
ILIKOVÁ, O., NEČASOVÁ, L., DAŇKVÁ, Z., 2009:Zdravá výživa malých dětí. Portál, Praha, 192 s.
INGR, I, 2007: Základy konzervace potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 137 s. 61
JELÍNEK, P., 2003: Laktace, s. 343-361, In. JELÍNEK, P., KOUDELA, K., (eds), 2003:Fyziologie hospodářských zvířat. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 409 s.
JENSSEN, H, HANCOCK, R., E., W., 2009: Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochemie, 91, (1), p. 19-29.
KLOUDA, P., 2000: Základy biochemie, Ostrava, 155s.
KALHOTKA
L.,
ŠUSTOVÁ,
K.,
KVASNIČKOVÁ,
B.,
LUŽOVÁ,
T.,
HAVLÍČKOVÁ, Š., 2010: Změny mikroflóry syrového kozího mléka v průběhu laktace. Mlékařské listy, 119 (21), s. 14-17.
KOPÁČEK, J., ELLMANN, M., 2009: Mléko a sója – dva zcela odlišné produkty. Mlékařské listy, 113/114, s. 2-4.
KUCHTÍK, J., 2007: Chov ovcí. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 110 s.
KVASNIČKOVÁ, A., 2001: Alergie z potravin. Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 60 s.
LOCH, J., POLIT, A., GÓRECKI, A., BONAREK, P., KURPIEWSKA, K., DZIEDZICKA - WASYLEWSKA, M., LEWINSKI, K., 2011: Two mode sof faty acis indig to bovine β-lactoglobulin-crystalographyc and spectoscopis studie. Journal of Molecular Recognition, 24 (4-5), p. 341-349.
LöNNERDAL, B., IYER, S., 1995: Lactoferrin: Molecular Structure and Biological Function.
Databáze
online
[cit.
2013-03-10].
Dostupné
na:
http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.nu.15.070195.000521
LUKAŠOVÁ, J., 1999: Hygiena a technologie produkce mléka. Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 101 s. 62
MARKOVÁ, M., PECHÁČKOVÁ, M., MÁTLOVÁ., V., SZTANKÓOVÁ, Z., SNÁŠELOVÁ, J., 2008: Fermentovaný nápoj na bázi kefíru z kozího mléka dvou variant αs1-kaseinu. Mlékařské listy, 109, (8), s. 8-11. MCMURRY, J., 2007: Organická chemie. VUTIUM: Brno, 1176 s.
MICHALCOVÁ, A., KRUPOVÁ, Z., 2009: Vplyv genotypu β-laktoglobulinu na zloženie a produkciu mlieka slovenských plemien oviec. Acta fytotechnica et zootechnikca, Mimoriadné číslo, s. 438-446.
MOMANI, S. M., ŠÁDA, I., 2010: Základy chovu zvířat v TS I. Česká zemědělská univerzita, Praha, 272 s.
NAVRÁTILOVÁ, P., KRÁLOVÁ, M., JANŠTOVÁ, B., PŘIDALOVÁ., H., CUPÁKOVÁ, Š., VORLOVÁ, L., 2012: Hygiena produkce mléka. Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 129 s.
NINTWICH, I., SZPFALUSI, Z. S., KUNZ, C., SPUERGING, P., URBÁNEK, P., 2004: Antigenicity for Humans of Cow Milk Caseins, Casein Hydrolysate and Casein Hydrolysate Fractions. Acta Veterinaria, Brno, 73, 291-298 p.
PAVLÍK A., SLÁMA, P., 2011: Morfologie a fyziologie hospodářských zvířat. Mendelova univerzita, Brno, 142 s.
PHADUNGATH,
CH.,
2005:
Casein
micelle
structure:
a
concise
review.
Songklanakarin Journal Science Technologie, 27 (1), p. 201-212.
PŘIDALOVÁ, H., JANŠTOVÁ, H., DRÁČKOVÁ, M., NAVRÁTILOVÁ, P., VORLOVÁ, L., 2009: Sledování vybraných parametrů mléka Bílých koz krátkosrstých ze dvou farem v České republice. Mlékařské listy, 116, s. 23-27.
63
RASMUSSEN, L. K., JOHNSEN, L. B., TSIORA, A., SORENSEN, E. S., THOMSEN, J. K., NIELSEN, N. C., JAKOBSEN, H. J., PETERSEN, T. E., 1999: Disulphide-linked caseins and casein micelles. International Dairy Journal, 9 (3-6), p. 215-218.
RONCADA, P., PIRAS, CH., SOGGIU, A., TURK, R., URBANI, A., BONIZZI, L., 2012: Farm animal milk proteomics. Journal of Proteomic, 75, (14), p. 4259-4274.
SEDMÍKOVÁ, M., 2006:Biologické základy mléčné užitkovosti a masné užitkovosti, s. 17- 31, Bouška, J, a kol., Chov dojeného skotu. Profi Press, Praha, 186 s.
SEYDLOVÁ, R., SNÁŠELOVÁ, J., 2009: Vliv suplementace probatických kmenů kvasinek ve výživě dojnic na kvalitu mléka. Mlékařské listy, 117, s. 25-27.
SINDHU, J. S., ARORA, S., 2011: Milk| Buffalo milk. Encyclopedia of Dairy Science (Sekond Edition), p. 503-511.
SUKOVÁ, I., 2009: EFSA posoudil β-kasein A1-A2. Mlékařské listy, 117, s. 18.
ŠTĚTINA, J., 2009: Technologie mléka a mlékárenských výrobků. s. 227-226, In KADLEC, P., (ed), Co byste měli vědět o výrobě potravin?: technologie potravin. Key Publishing, Ostrava, 536.
ŠUSTOVÁ, K.., 2012: Laktologie (přednášky). Mendelova univerzita, Brno.
ŠUSTOVÁ, K., SÝKORA, V., 2013: Mlékárenské technologie. Mendelova univerzita, Brno, 223 s.
ŠVEJCAROVÁ, M., ELICH, O., PECÁČKOVÁ, M., MALÁ, G., 2011: Vliv způsobu dojení a fáze laktace na technologické parametry ovčího mléka a kvalitu výrobku. Mlékařské listy, 127 (22), s. I-IV.
TAMINE, A., 2007: Structure of dairy products. Blackwell Pub., Oxford, 288 p.
64
TANČIN, V., HLUCHÝ, S., MIHINA, Š., UHRINČAŤ, M.,HETÉNYI, L., 2001: Fyziológia získavania mlieka a anatómia vemena. Nitra: Výskumný ústav živočíšnej výroby, 289 s.
TUINIER, R., DE KRUIF, C. G., 2002: Stability of casein micelles in milk. Journal of chemical physics, 117 (3), p. 1290-1295.
TZIBOULA-CLARKE, A., 2002: Goat milk. Encyklopedia of Diary Science, p. 1270-1279.
URBAN, F., 1997: Chov dojeného skotu. Apros, Praha, 289 s.
VANĚK, D., ŠTOLC, L., BOUŠKA, J., DOLEŽAL, O., JEŽKOVÁ, A., NOVÁ., V., STÁDNÍK, L., TOUŠOVÁ, R., 2002: Chov skotu a ovcí. ISV, Praha, 199 s.
VELÍŠEK, J., HAJŠLOVÁ, J., 2009: Chemie potravin. Ossis, Havlíkův Brod, 602 s.
VILLOSLADA, F. M., OLIVARES, M., XAUS, J., 2005: The balance between caseins and whey proteins in cow´s Milk determines its allergicity. Journal of Dairy Science, 88 (5), p. 1654-1660.
WALSTRA, P., 1999: Dairy technology: principles of milk properties and processes. Marcel Dekker, New York, 727 p.
WALSTRA, P., 1999: Casein sub-micelles. do Theyky exist? International Dairy Journal, 9 (3-6), p. 189-192.
WALSTRA, P., WOUTERS, J. T. M.,GEURTS, T. J., 2006: Dairy science and technology. Taylor & Francis Group, New York, 782 s.
ZADRAŽIL K., 2002: Mlékařství. Česká zemědělská univerzita a IS, Praha, 127 s.
65
