Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin. Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin

Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství Bakalářská práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D.

Brno 2013

Vypracovala: Markéta Rozsypalová

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Úloha a význam plísní a kvasinek v mlékařství“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………. podpis autora….………………………….

PODĚKOVÁNÍ

Ráda bych touto cestou poděkovala paní doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení mé bakalářské práce, za poskytnuté literární prameny a cenné rady, které mi velmi pomohly při vypracování mé závěrečné práce. Také bych chtěla poděkovat mé rodině a všem mým blízkým za podporu během celého mého studia.

ABSTRAKT

Tato bakalářská práce pojednává o významu plísní a kvasinek využívaných v mlékárenském průmyslu. První část je soustředěna na obecnou charakteristiku plísní, jejich specifické využití pro výrobu mléčných výrobků, zejména plísňových sýrů a na jejich možný negativní vliv. V druhé části je popsána stejně jako u plísní, charakteristika

kvasinek

mléčných výrobků

a

jako

jejich

mikroorganismů,

možný

nežádoucí

jejich

využití

charakter.

při

V závěrečné

výrobě části

se tato bakalářská práce věnuje oblasti mikrobiologické kontroly kvasinek a plísní v mléce a mléčných výrobcích.

Klíčová slova: plíseň, kvasinky, mlékařství, sýr, mikrobiologie

ABSTRACT

This thesis discusses the importance of molds and yeasts used in the dairy industry. The first part focuses on general characteristics of fungi, their specific use for the production of dairy products, especially blue cheese and their possible negative impact. The second part is described as well as fungi, such as yeasts characteristic of microorganisms, their use in the manufacture of dairy products and their possible undesirable character. In the final part of the thesis deals with the microbiological control of yeasts and molds in milk and dairy products.

Keywords : mold, yeast, dairy, cheese, microbiology

OBSAH

1

ÚVOD ....................................................................................................................... 7

2

CÍL PRÁCE ............................................................................................................. 8

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................ 9

3.1

Charakteristika plísní .......................................................................................... 9

3.2

Rozmnožování plísní .......................................................................................... 10

3.3

Vlastnosti plísní .................................................................................................. 10

3.4

Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní ........................... 11

3.5

Význam plísní z potravinářského hlediska...................................................... 11

3.6

Plísňové kultury využívané v mlékárenském průmyslu ................................. 12

3.7

Úloha a význam plísní při výrobě sýrů ............................................................ 16

3.7.1

Metabolismus laktátu.................................................................................... 16

3.7.2

Lipolytické enzymy plísní ............................................................................ 17

3.7.2.1 Methylketony ............................................................................................. 18 3.7.3

Proteolytické enzymy plísní ......................................................................... 18

3.7.4

Klasifikace plísňových sýrů ......................................................................... 19

3.7.4.1 Sýry s plísní v těstě .................................................................................... 19 3.7.4.2 Sýry s plísní na povrchu ............................................................................ 23 3.7.4.3 Sýry dvouplísňové ..................................................................................... 25 3.8

Plísně jako možné příčiny kažení mléčných výrobků..................................... 27

3.8.1 3.9

Plísně kontaminující sýry ............................................................................. 27

Metabolické produkty plísní ............................................................................. 28

3.9.1

Mykotoxiny .................................................................................................. 28

3.9.1.1 Mykotoxiny v sýrech produkované plísněmi ............................................. 29 3.10

Ochrana proti růstu nežádoucích plísní .......................................................... 31

3.11

Charakteristika kvasinek .................................................................................. 32

3.12

Rozmnožování kvasinek .................................................................................... 32

3.13

Vlastnosti kvasinek ............................................................................................ 33

3.14

Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek...................... 33

3.15

Význam plísní z potravinářského hlediska...................................................... 35

3.16

Kvasinkové kultury využívané v mlékárenském průmyslu ........................... 35

3.17

Úloha kvasinek při výrobě sýrů zrajících pod mazem ................................... 36

3.17.1

Klasifikace sýrů zrajících pod mazem .......................................................... 37

3.17.1.1 Sladké sýry zrající pod mazem .................................................................. 37 3.17.1.2 Kyselé sýry zrající pod mazem .................................................................. 38 3.18

Úloha kvasinek při výrobě sýrů s plísní ........................................................... 39

3.18.1

Sýry s plísní na povrchu ............................................................................... 39

3.18.1.1 Geotrichum candidum............................................................................... 40 3.18.2

Sýry s plísní uvnitř........................................................................................ 41

3.19

Úloha kvasinek při výrobě másla ..................................................................... 41

3.20

Úloha kvasinek při výrobě kefírů ..................................................................... 42

3.20.1

Mikrobiální metabolismus ............................................................................ 43

3.20.1.1 Lipolytické enzymy kvasinek ..................................................................... 43 3.20.1.2 Proteolytické enzymy kvasinek.................................................................. 43 3.20.1.3 Metabolické dráhy kvašení ....................................................................... 44 3.21

Úloha kvasinek při výrobě kumysů .................................................................. 44

3.22

Úloha kvasinek při výrobě jogurtového sýru Laban (Labneh) ..................... 45

3.23

Kvasinky jako možné příčiny kažení mléčných výrobků............................... 46

3.23.1

Kvasinky kontaminující sýry ........................................................................ 46

3.24

Ochrana proti růstu nežádoucích kvasinek..................................................... 47

3.25

Biologický inhibitor nežádoucích kvasinek a plísní v mléčných výrobcích .. 47

3.26

Mikrobiologická kontrola obsahu kvasinek a plísní v mléce a mléčných……. výrobcích ............................................................................................................ 48

3.26.1

Živná média pro kultivaci a stanovení počtu plísní a kvasinek v mléčných výrobcích...................................................................................................... 49

4

ZÁVĚR ................................................................................................................... 52

5

POUŽITÁ LITERATURA ................................................................................... 53

5.1

Internetové zdroje .............................................................................................. 58

6

SEZNAM OBRÁZKŮ ........................................................................................... 61

7

SEZNAM TABULEK ........................................................................................... 63

1

ÚVOD

Plísně a kvasinky řadíme mezi eukaryotní mikroorganismy patřící do říše nižších hub.

Obě

skupiny

Podílí se na mineralizaci,

mají

velký

rozkladu

význam

z hlediska

odumřelých

částí

životního rostlin

a

prostředí. živočichů,

čímž významně přispívají ke koloběhu biogenních prvků. Český název „plísně“ zavedl v 19. století přírodovědec Jan Svatopluk Presl. Charakteristickým znakem výskytu plísní je tvorba viditelného mycelia na substrátu nejrůznější povahy, což je způsobeno jejich vysokou adaptabilitou na podmínky prostředí. S tím je však spojený jejich nežádoucí vliv. Plísně způsobují kažení potravin, jelikož produkují aktivní enzymy, které rozkládají sacharidy, bílkoviny a tuky. Současně tak dochází ke zhoršení nutriční hodnoty a senzorických vlastností. Je však velmi důležité zmínit jejich významnou úlohu v potravinářském průmyslu a dalších biotechnologiích. Roku 1928 bylo objeveno první účinné antibiotikum Penicilin skotským lékařem Alexandrem Flemingem z plísně Penicillium natatum. Toto období

se

tak

stalo

důležitým

mezníkem

počátku

výzkumu

plísní.

Plísně se dále používají pro produkci některých organických látek, důležitých enzymů, vitamínů a pigmentů. Nejpodstatnější úloha plísní však spočívá v potravinářském průmyslu, zejména při výrobě plísňových sýrů. Kvasinky byly poprvé jednotlivě pozorovány nizozemským přírodovědcem Antoni van Leeuwenhoek. Podobně jako plísně jsou i kvasinky známými původci kažení potravin. Jejich využití však spočívá zejména ve schopnosti zkvašovat sacharidy, čehož se využívá v potravinářství. Kvasinky patří celosvětově mezi nejvíce průmyslově využívané mikroorganismy. Již po tisíce let jsou používány pro výrobu alkoholických nápojů. Další využití nacházejí v oblasti kynutého pekařského droždí, vína, piva, produkci organických kyselin, vitamínů, medicíny a v krmivářském průmyslu. Kromě kvasného průmyslu jsou hojně využívané také v mlékárenských technologiích, převážně pro výrobu některých fermentovaných mléčných výrobků a sýrů.

7

2

CÍL PRÁCE

Cílem mé bakalářské práce bylo prostudovat odbornou literaturu zabývající se problematikou výskytu a využití plísní a kvasinek v mlékárenském průmyslu, zejména při výrobě sýrů. Dále se seznámit s metodami mikrobiologické kontroly výskytu kvasinek a plísní v mléce a mléčných výrobcích. Při zpracování se zaměřit především na cizojazyčnou odbornou literaturu a nové literární prameny a na tomto na základě vypracovat literární rešerši.

8

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Charakteristika plísní

Plísněmi které se řadí

nazýváme mezi

houby

eukaryotní

mikroskopické

vláknité

(Fungi),

(ŠILHÁNKOVÁ,

2002,

mikroorganismy, PARIJA,

2009).

V mikrobiologické praxi se často používá termín Mikromycety, tedy mikroskopicky pozorovatelné houby (LÁSZTITY, 2009). Jedná se o vícebuněčné, ubikvitární neboli všudypřítomné mikroorganismy, které se mohou vyskytovat v ovzduší, vodě, půdě, na odumřelých či živých organismech a v neposlední řadě i v potravinách. Plísně jsou charakteristické tvorbou viditelného mycelia (podhoubí) složeného z jednotlivých vláken (hyf) o průměru 5 až 10 µm. Mycelium tak prorůstá substrátem a následně vytváří uvnitř či na povrchu viditelný vláknitý povlak (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Tyto

vláknité

mikroorganismy se

vyznačují

velmi

rychlým

růstem

a jsou schopny pokrýt několik centimetrů plochy během dvou až tří dnů (JAY, 2005).

Obr. 1 - Stavba Penicillium roqueforti (RUDYPAV, 2012).

9

3.2 Rozmnožování plísní

Plísně se rozmnožují dvěma způsoby a to pohlavně a nepohlavně (WALSTRA, 2006). Při pohlavním rozmnožování se vytváří spory meiózou ve vřecku, neboli v asku, či odškrcením koncových buněk ve výtrusorodé vrstvě plodnice. Nepohlavní spory vznikají

ve

fruktifikačních

orgánech,

sporangioforu

a

konidioforu,

nebo na vegetativních hyfách (GÖRNER, VALÍK, 2004). Spory nacházející se uvnitř fruktifikačních orgánů se nazývají endospory. Spory, které jsou vně těchto orgánů, nazýváme exospory (konidie), (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Dle způsobu vzniku rozlišujeme oidie, neboli artrospory,tvořící se rozpadem hyf. Dále konidie vznikající v konidioforu ze základní buňky. Některé plísně vytváří tzv. blastospory, které vznikají pučením (WALSTRA, 2006).

3.3 Vlastnosti plísní

Dle nároků na výživu plísně náleží do heterotrofních mikroorganismů, vyžadujících přítomnost organických látek (zdroj C, H či energie) v živném prostředí. Dle způsobu získávání energie patří do chemoheterotrofních mikroorganismů, vyznačující se oxidací organických

látek

za

účelem

zisku

energie

(ŠILHÁNKOVÁ,

2002).

Tyto mikroorganismy vyžadují přítomnost volného kyslíku, proto je nejčastěji nacházíme na povrchu kontaminovaných potravin. Plísně jsou všeobecně velmi adaptabilní organismy na různé podmínky prostředí. Převážná část plísní má optimální teplotu růstu pohybující se mezi 25 až 30 oC. Z tohoto důvodu se řadí k mezofilním mikroorganismům (LÁSZTITY, 2009). Nicméně je třeba poznamenat, že některé plísně jsou schopné růstu i při mrazírenských teplotách v rozmezí -15 až -18 (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

10

o

C

3.4 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní

Dle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování jsou potravinářsky významné plísně systematicky rozděleny do tří základních taxonomických jednotek (JAY, 2005).

Tab. 1 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní (TEWARI, 2009).

Taxonomická jednotka

Mycelium

třída Zygomycota

neseptované mycelium

Způsob rozmnožování pohlavní rozmnožování se uskutečňuje pomocí zygospor pohlavní rozmnožování probíhá

podkmen Ascomycota

podkmen Deuteromycota

septované

za tvorby askospor tvořených

mycelium

v asku (vřecku)

septované

známé je pouze nepohlavní

mycelium

rozmnožování pomocí exospor

3.5 Význam plísní z potravinářského hlediska

Na jedné straně jsou plísně známé jako organismy způsobující kažení potravin. Na straně druhé jsou však velmi významné pro využití v potravinářském průmyslu. Jejich schopnost značně měnit vůni, chuť i texturu je využívána zejména v mlékárenských technologiích při výrobě sýrů, kde tvoří tzv. sekundární mikroflóru. Označujeme je jako plísně ušlechtilé (LÁSZTITY, 2009). Hlavním předpokladem využití plísní při výrobě sýrů je obsah proteolytických a lipolytických enzymů (WHITEHURST, OORT, 2009). Spolupůsobením těchto enzymů tak dochází ke změnám určitých vlastností a souhrnně se tento proces označuje jako maturace,

11

neboli zrání (BERESFORD, 2001). Kvalita sýrů je určena především jeho chutí a texturou,

proto

je

hlavní

pozornost

věnována

hlavně

mikrobiologickým

a biochemickým změnám, ke kterým dochází právě v průběhu zrání (FOX, 2000).

3.6 Plísňové kultury využívané v mlékárenském průmyslu

Mikrobiální startovací kultury využívané v potravinářství jsou rozmnožování schopné a přesně definované mikroorganismy, které se přidávají do surovin či potravin s cílem zlepšit či vyrobit jejich konzistenci, vůni, chuť, vzhled a trvanlivost. Plísňové kultury

se

v mlékárenském

průmyslu

účastní

procesu

zrání

sýrů.

Způsobují zejména chemické, fyzikální a mikrobiologické změny mléčného tuku a bílkovin. Jejich metabolické a štěpné produkty přispívají ke vzniku cílených senzorických a reologických vlastností (GÖRNER, VALÍK, 2004). Na zrání plísňových sýrů se podílejí zejména zástupci rodu Penicillium, podle nichž se sýry rozdělují do příslušné skupiny. Mezi tyto plísně patří Penicillium roqueforti a Penicillium

camemberti

patří k nejrozsáhlejšímu

(BERESFORD,

rodu

plísní

a

2001).

obsahuje

Rod

celkem

asi

Penicillium 150

druhů.

Systematicky se řadí do podkmene Ascomycota. Tvoří kolonie, které se na povrchu substrátu vyskytují ve formě sametového, zeleného až moučnatého povlaku (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

1.) Plísňové kultury využívané k výrobě sýrů s plísní v těstě K výrobě sýrů tohoto typu patří kultura plísní Penicillium roqueforti a Penicillium glaucum.

Jedná se o

Charakteristickým

plíseň

znakem

je

rostoucí tvorba

a fermentující modrozelených

vnitřní žilek

hmotu uvnitř

sýrů. hmoty.

Tato plíseň vykazuje výraznou biochemickou aktivitu, projevující se typickým aroma. Roste dobře v přítomnosti menšího obsahu kyslíku, který však nesmí klesnout pod 5 %, při vyšším obsahu soli a hodnotě aw 0,94 až 0,91 (GÖRNER, VALÍK, 2004).

12

Obr. 2 - Penicillium roqueforti (ALLPOSTERS, 2012).

2.) Plísňové kultury využívané k výrobě sýrů s plísní na povrchu K nejznámějším sýrům tohoto druhu patří Brie, Camembert a Geramont (LEClERCQ-PERLAT, 2011). Od nich jsou například odvozené sýry Encián (Plesnivec) a Hermelín (GÖRNER, VALÍK, 2004). K výrobě těchto sýrů se používá kamembertská kultura obsahující nejčastěji dva zástupce prospěšných plísní, Penicillium camemberti a Penicillium caseicolum. Ty vytváří na povrchu sýrů bělavý povlak (BOURDICHON, 2012). K jejich optimálnímu růstu je potřeba vyšší obsah kyslíku, z tohoto důvodu se tedy vyskytují na povrchu substrátu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Spolupůsobením těchto plísní vzniká jemnější aroma a chuť, než kdyby působila každá zvlášť (BOURDICHON, 2012).

13

Obr. 3 - Elektronová mikroskopie plísně Penicillium camemberti tvořící sekundární mikroflóru sýrů typu Camembert a Brie (LAW, TAMIME, 2010).

Plíseň Penicillium nalgiovensis můžeme nalézt v Ellischau neboli v Nalžovském sýru (HUTKINS, 2006). Dle studie, která byla provedena za spolupráce studentů Vyšší odborné školy potravinářské, Střední průmyslové školy mlékárenské v Kroměříži a odborných pracovníků, se zjistilo, že tato plíseň vykazuje podobné charakteristické vlastnosti, jako plísně tradičně používané pro výrobu sýrů s plísní na povrchu. Obdobné výsledné senzorické vlastnosti tak umožňují použití plísně Penicillium nalgiovensis jako zajímavou alternativu pro výrobu sýrů tohoto druhu (MRÁZEK et al., 2009). Dle

14

experimentu, který provedl Doležálek (1962), bylo zjištěno, že během výrobního procesu tvoří tato kultura velmi málo amoniaku, což způsobuje vznik jemné chuti sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Verticillium lecanii a Penicillium album jsou využívané pro výrobu speciálních druhů sýrů s šedou či bílošedou plísní. Plíseň Verticillium lecanii se používá pro výrobu sýrů francouzského typu Tomme (LAW, TAMIME, 2010).

Obr. 4 - Penicillium nalgiovensis (DIJITALIMAJ, 2012).

3.) Plísňová kultura podílející se na zrání sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou Kulturní plíseň Penicillium viridicatum se podílí na zrání sýrů holandského typu s nízkodohřívanou sýřeninou. Za vhodných podmínek zabraňuje vysychání povrchu sýrů. Před expedicí se ze sýrů tato vrstva plísně ovšem odstraňuje. Po uschnutí se sýr potahuje parafínem (GÖRNER, VALÍK, 2004).

15

3.7 Úloha a význam plísní při výrobě sýrů

V procesu výroby sýrů se plísně účastní zrání, které je doprovázeno biochemickými a

mikrobiologickými

změnami.

Zrání

sýrů

rozdělujeme

na

předběžné,

kdy dochází k přeměně laktózy na kyselinu mléčnou a zrání vlastní, při kterém probíhá rozklad bílkovin, částečně i hydrolýza tuku. Ta je nejvýraznější právě u plísňových sýrů. Výsledkem je vznik charakteristické vůně, chuti a textury, typické pro konkrétní druh vzniklého sýru (FOX, 2000). Doba zrání trvá zpravidla od dvou týdnů až do dvou i více let (SIMPSON et al., 2012). Podstatou využití plísní v procesu zrání je obsah proteolytických a lipolytických enzymů (FOX, 2000). Primární biochemické změny během zrání sýrů zahrnují proteolýzu, lipolýzu, metabolizmus zbytku laktózy, laktátu a citrátu. Mezi sekundární biochemické změny patří metabolismus mastných kyselin a aminokyselin (FOX et al., 2004). Nezbytnou součástí procesu výroby plísňových sýrů je následná mikrobiologická kontrola, která zajišťuje kvalitu výsledných produktů (LAW, 1997). Vzhledem k rozmanitosti přítomné mikroflóry plísňových sýrů jsou veškeré biochemické pochody způsobující zrání složitější a rozsáhlejší (ROGINSKI et al., 2003).

3.7.1

Metabolismus laktátu

Metabolismus

laktátu

je

nejdůležitějším

procesem

u

plísňových

sýrů,

zrajících od povrchu (FOX et al., 2004). Laktóza neboli mléčný cukr, je velmi rychle metabolizována v počátečních fázích zrání na laktát (sůl kyseliny mléčné). Laktát je důležitým prekurzorem pro řadu probíhajících reakcí, jako je například mikrobiální

metabolismus

(ESKIN,

SHAHIDI,

2012).

Metabolismus

laktátu

je nejdůležitější v průběhu dozrávání sýrů s plísní na povrchu typu Camembert a Brie. Povrch

těchto

sýrů

je

kolonizován

mikroorganismy

(FOX

et

al.,

2004).

Nejdříve kvasinkami rodu Geotrichum candidum a poté ušlechtilou plísní Penicillium camemberti. Ty oxidačně metabolizují laktát na CO2 a O2. Tím dochází k odkyselování povrchu těchto sýrů do tří týdnů (BERESFORD, 2001). V důsledku zvýšení pH na povrchu dojde k vysrážení a migraci fosforečnanu vápenatého od středu směrem k povrchu sýru. Zvýšení pH, snížení koncentrace

16

fosforečnanu vápenatého a proteolýza jsou hlavní příčinou měknutí původně pevné a křehké vnitřní vrstvy camembertského sýru (FOX et al., 2004).

Obr. 5 - Schematické znázornění změn, ke kterým dochází v průběhu zrání sýru Camembert v důsledku růstu Penicillium camemberti na povrchu (FOX et al., 2004).

3.7.2

Lipolytické enzymy plísní

Při zrání sýrů se uplatňují především lipolytické enzymy tzv. lipázy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejvyšší lipolytickou aktivitu vykazují zejména lipázy plísní, významně se tak podílejí na vzniku charakteristické chuti sýrů (FOX et al., 2004). Nejoptimálnější hodnota pH pro tyto lipázy se pohybuje v rozmezí 5 – 5,5 při teplotě 30 až 30 oC. Při těchto hodnotách je aktivita lipáz nejvyšší. Lipolytická aktivita plísní je nejvýraznější u sýrů s plísní v těstě, kam řadíme například Roquefort. Velké množství enzymů lipáz produkují zejména zástupci plísní rodu Penicillium. Konkrétně se jedná o Penicillium

camemberti,

Penicillium

roqueforti

a

Penicillium

nalgiovensis

(GÖRNER, VALÍK, 2004). Lipázy katalyzují syntézu, ale i rozklad mléčného tuku na glycerol a volné mastné kyseliny (PRASAD, 2011). Následně vznikají karbonylové sloučeniny, aldehydy a ketony. Na typické chuti a vůni plísňových sýrů se podílejí zejména methylketony (GÖRNER, VALÍK, 2004).

17

3.7.2.1 Methylketony Methylketony se řadí mezi alifatické ketony, které vznikají jako sekundární látky z lipidů

reakcí

nazývanou

Tvoří žádoucí aromatické

ketonové

složky

žluknutí

plísňových

sýrů

(GÖRNER, (FUQUAY

VALÍK, et

al.,

2004). 2011).

Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti metabolizují mastné kyseliny částečnou β-oxidací. Penicillium roqueforti dominuje dvěma silnými lipázami způsobující lipolýzu v sýrech s modrou plísní, ve kterých je zaznamenána nejvyšší hladina

volných

mastných

kyselin

ze

všech

sýrů.

Tvorba

methylketonů

je zde nejvýraznější (TAYLOR, LINFORTH, 2010). Z nejvýznamnějších methylketonů se v plísňových sýrech nachází především 2-heptanon a 2-nonanon, které vytváří charakteristickou chuť. Dále aceton, pentan-2-on a undekan-2-on (VELÍŠEK, 2009).

Obr. 6 - Methylketony (VELÍŠEK, 2009).

3.7.3

Proteolytické enzymy plísní

Proteolýza (degradace) bílkovinných molekul na aminokyseliny je nejdůležitější primární biochemickou reakcí. Má přímý vliv na výslednou chuť sýrů. Během zrání proteolýzu katalyzují proteázy, které dělíme na proteinázy a peptidázy. Jeden ze šesti zdrojů těchto enzymů jsou právě plísně Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti, jejichž proteolytický systém je velmi podobný. Proteázy štěpí při zrání sýrů mléčnou bílkovinu kasein na albumosy, peptony, polypeptidy, dipeptidy a následně až na volné aminokyseliny, amoniak, těkavé kyseliny a sirovodík. Hlavní úlohu při proteolýze plní zejména enzym plísně Penicillium roqueforti, aspartát-proteináza či enzym plísně Penicillium camemberti, metaloproteináza. Proteolytická aktivita plísní se výrazně uplatňuje především u sýrů s plísní na povrchu (FOX et al., 2004).

18

Proteolýza

uskutečňována

enzymy

plísně

Penicillium

camemberti

probíhá

z převážné části na povrchu. Ve vnitřní vrstvě je aktivita podstatně nižší (LAW, 1997).

Obr. 7 - Zjednodušené schéma rozkladu kaseinu (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.7.4

Klasifikace plísňových sýrů

Dle druhu

plísně podílející

se na zrání

sýrů,

spadají

plísňové sýry

do dvou základních kategorií (BERESFORD, 2001). První kategorii tvoří povrchově zrající sýry, u kterých plíseň Penicillium camemberti tvoří povlak na jejich povrchu. Tyto sýry (Camembert, Brie) označujeme jako sýry s bílou plísní (CABALLERO et al., 2003). Do druhé kategorie řadíme sýry s modrou plísní (Roquefort), u nichž plíseň Penicillium roqueforti prorůstá vnitřní hmotu a vytváří tak charakteristické modré žilky. Existují však sýry, které se vyrábí za použití kombinace Penicillium camemberti a Penicillium roqueforti. Tyto sýry tak nesou bílou plíseň na povrchu a modrou plíseň uvnitř substrátu (FOX, 2000).

3.7.4.1 Sýry s plísní v těstě Mezi tři nejvýznamnější zástupce sýrů s modrou plísní patří Roquefort, Gorgonzola a Stilton. Nejdůležitějším aspektem výroby sýrů s plísní v těstě je zajistit optimální růst 19

použité kulturní plísně. Toho se dosáhne nejčastěji propichováním hmoty sýrů pomocí speciálních jehel (GÖRNER, VALÍK, 2004). Výrobní proces sýrů s plísní v těstě K výrobě těchto sýrů je důležitá homogenizace mléka. Tukové kuličky tak získávají větší povrch, což má za následek rychlejší průběh lipolýzy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Anaerobní zrání uskutečňuje mezofilní mikroflóra Lactococcus lactis ssp. lactis a Leuconostoc ssp. Mléko je zaočkováno sporami plísní Penicillium roqueforti, které se účastní aerobního zrání (LUND, 2000). Množství spor je 103 až 104 na 1 ml mléka. Zaočkování se provádí buď rozprašováním na sýřeninu, nebo formou vodné suspenze, která se do mléka přidává před jeho koagulací syřidlem (GÖRNER, VALÍK, 2004). Koagulované mléko se krájí a drobí na zrno. Vzniká sýřenina, která se zahřívá na teplotu kolem 26 až 37 oC, při které se udržuje po dobu 30 minut. Za neustálého pohybu sýřeniny následuje odpouštění syrovátky, solení a formování (CALLEC, 2002). Několik dní se ponechává při teplotě 21 až 27 oC, během toho dochází k dofermentování veškeré laktózy. Hodnota pH se mění na 4,8 až 4,9. Roquefortské typy sýrů se solí jak v zrně u mladých sýrů, tak i na sucho po formování. Následuje propíchávání. Za 2 až 4 měsíce by mělo dojít k optimálnímu růstu plísní a dosažení požadovaných vlastností. Relativní vlhkost vzduchu zracích prostor je 90 až 95 % (GÖRNER, VALÍK, 2004). Během lipolýzy při zrání těchto sýrů se vzniklé volné mastné kyseliny působením oxidativní dekarboxylázy přeměňují na methylketony, které dodávají sýrům jejich typické aroma (FOX et al., 2004). Během zrání se na povrchu vytváří maz, který se

musí

odstraňovat.

Dochází

k rozvoji

i

některých

kvasinek,

konkrétně Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis a Candida ssp. (ROGINSKI et al., 2003).

20

Obr. 8 - Výrobní schéma sýru Roquefort (FOX, 2000).

Obr. 9 - Sýr Roquefort (KUCHENGOTTER, 2012).

21

Tab. 2 - Přehled některých významných sýrů s plísní v těstě (LIKLER, KOPÁČEK, 2007). Země původu Francie

Zástupce

Charakteristika

Roquefort Abeille Les Templiers Baragnaudes

Bělavá, jemně lesknoucí kůrka, vnitřní hmota bílá, prorostlá modrými žilkami ušlechtilé plísně

Bleu de Gex Bleu des Causses Velká Británie

Stilton

Blue stilton White stilton

Irsko Itálie

Až 55 % tuku v sušině, tmavě žlutá barva kůrky i vnitřní hmoty

Blue Stuart Jersey Blue Cashel Blue Gorgonzola Gorgonzola dolce

Průmyslový druh Plíseň světlá, jemná konzistence smetanová chuť

Gorgonzola picante

Dánsko Německo Španělsko Řecko Izrael Rusko Švédsko Česká republika

Tradiční druh Plíseň tmavší a znatelnější, chuť výraznější 50 až 60 % tuku v sušině Chuť méně výrazná, smetanová

Denablue Edelpilzkäse Österzolla Queso Cabrales DO Picón DE Kopanisty Galil Syr rokfor Ädelost

Výrazná chuť

Niva

Smetanové až sýrově žluté zbarvení, výrazná modrozelená plísňová oka Plíseň prorůstající vnitřní hmotu i povrch

Modřenín

22

3.7.4.2 Sýry s plísní na povrchu Při výrobním procesu sýrů s bílou plísní se přidávají do mléka nejčastěji spory kulturní

plísně

Penicillium

či

camemberti

Penicillium

caseicolum

(LAW,

TAMIME, 2010). Výrobní proces sýrů s plísní na povrchu Pro sýry typu Camembert je charakteristická doba zrání jen asi 1 až 2 týdny. Obsah tuku v sušině se zde pohybuje od 20 % do 65 % (LUND et al., 2000). Anaerobní zrání se uskutečňuje prostřednictvím mezofilního zákysu Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris přidávaného k mléku vyhřátého na 30oC

(GÖRNER,

VALÍK,

2004).

Tím

je

zaručeno

kysání

sýřeniny.

Přídavkem syřidla bílkoviny mléka koagulují. Sýřenina se může krájet a drobit s následným plněním do tvořítek. Poté probíhá odkapávání a kysání sýřeniny do druhého dne (CALLEC, 2002). Hodnota pH by měla být 4,8 až 4,6. To je velmi důležité pro růst kvasinkové a bakteriální mikroflóry, jejichž hlavní úloha spočívá zejména v prvním stádiu zrání těchto sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tato mikroflóra částečně ovlivňuje výsledné aroma a chuť, kterou nejvíce dotváří plíseň Penicillium camemberti. Penicillium camemberti se podílí zejména na proteolýze (LAW, 1997). Konečným produktem proteolýzy je amoniak vzniklý deaminací aminokyselin. Tento děj vede ke zvýšení pH a vzniku charakteristické chuti (FOX et al., 2004). Po formování, kysání a zisku optimální konzistence následuje solení na sucho nebo v solné lázni (GÖRNER, VALÍK, 2004). Následně

se

po

osolení

provádí

zaočkování

kmenem

kulturní

plísně

a nastupuje aerobní zrání. Při tomto procesu je velmi důležité obracení, aby byl přístup kyslíku rovnoměrný. Ve zracím prostoru je relativní vlhkost vzduchu nižší než u sýrů s plísní v těstě a to 80 až 85 %. Penicillium camemberti umožňuje rozklad bílkovin. Stejně jako Penicillium roqueforti se podílí i na hydrolýze tuku, při které dochází k tvorbě methylketonů. Během zrání se tvoří i některé kvasinky, které ve větším množství mohou znemožňovat růst plísně kulturní. Asi po 3 týdnech zrání následuje balení sýrů a jejich skladování při teplotě kolem 5 oC (GÖRNER, VALÍK, 2004).

23

Obr. 10 - Výrobní schéma sýrů Camembert a Brie (FOX et al., 2004).

Obr. 11 - Sýr Camembert (CURDNERD, 2012).

24

Tab. 3 - Přehled některých významných sýrů s plísní na povrchu (FOX et al., 2004).

Země původu

Zástupce

Francie

Camembert

Charakteristika

Brie

Měkká, krémová konzistence, vnitřní hmota slámové barvy

Carré de l' Est

Pikantní chuť

Coulommier

Měkká konzistence, podobné vlastnosti jako Brie

Německo

Geramond

Měkká konzistence

Slovensko

Plesnivec

Smetanově krémová konzistence

Česká republika

Hermelín

Napodobenina francouzského sýru Camembert

3.7.4.3 Sýry dvouplísňové Specifikum dvouplísňových sýrů spočívá v kombinaci bílé plísně na povrchu a modré plísně uvnitř hmoty. Dalším charakteristickým rysem je poměrně vysoký obsah tuku v sušině a to až 70 %. Za původní dvouplísňový sýr je považován sýr německého typu Cambozola. Jedná se o kombinaci sýrů Gorgonzola a Camembert. U nás se jako dvouplísňový sýr vyrábí Sedlčanský Vltavín (GURMETKLUB, 2013).

Obr. 12 - Sýr Cambozola (GURMETKLUB, 2013).

25

Tab. 4 - Taxonomický a fylogenetický přehled výskytu plísní izolovaných ze sýrů (ROPARS et al., 2012). Substrát izolátu

Druh plísně Chrysosporium sulfureum Fusarium domesticum Lecanicillium lecanii Penicillium biforme Penicillium camemberti

Sýry Sýry, švýcarské raclette sýry, prostředí sýrů Prostředí sýrů Francouzské sýry, prostředí sýrů Francouzské sýry typu Camembert Penicillium camemberti var. rogeri Penicillium camemberti var. caseicola

Penicillium caseifulvum Penicillium crustosum Penicillium chrysogenum Penicllium fuscoglaucum Penicillium nalgiovense Penicillium nordicum

Sýry typu Camembert Sýry typu Camembert Dánské sýry Denablue Prostředí sýrů Sýry Prostředí sýrů Ellischau (Nalžovské) sýry Prostředí sýrů

Penicillium palitans

Nizozemské sýry

Penicillium paneum Penicillium roqueforti Penicillium solitum Scopulariopsis brevicaulis Scopulariopsis candida

Prostředí sýrů Sýry typu Roquefort a Cheddar, prostředí sýrů Prostředí sýrů Sýry Francouzské sýry, povrch sýrů, prostředí sýrů Francouzské sýry Cental, prostředí sýrů Prostředí sýrů

Scopulariopsis flava Scopulariopsis fusca Sphaerosporium equinum

Sýry, povrch ovčích sýrů

Sporendonema casei

Sýry, prostředí sýrů

26

V této studii je zaznamenán taxonomický a fylogenetický přehled nejdůležitějších plísní podkmene Ascomycota, poskytnutých výrobci sýrů a startovacích kultur pro výrobu sýrů. Pro stanovení těchto izolátů byla použita molekulární metoda (LSU rRNA),

která

je

založena

na

sekvenční

analýze

genu.

Metoda

ukázala,

že plísně používané pro výrobu sýru se řadí do dvou tříd. První třída se nazývá Eurotiomycetes, kam řadíme rod Penicillium. Druhou třídou je Sordariomycetes, zahrnující zejména rod Scopulariopsis (ROPARS et al., 2012).

3.8 Plísně jako možné příčiny kažení mléčných výrobků

Plísně tvoří širokou škálu mikroorganismů kontaminující mléko a mléčné výrobky. Růst

nežádoucích

plísní

zapříčiňuje

nevhodnost

produktů

ke

spotřebě

a z hlediska výrobce podstatnou ekonomickou ztrátu (GROVE, 1998).

3.8.1

Plísně kontaminující sýry

Plísně se mohou vyskytovat na vlhkých místech mlékárenského závodu, a pokud nejsou zavčas odstraněny, může docházet k přenosu spor plísní na sýry. Důsledkem je plesnivění povrchu sýrů. Nejčastějším faktorem umožňující kontaminaci povrchu sýrů je přítomnost kyslíku. U sýrů balených je tento nežádoucí růst omezen, avšak některé formy jsou schopné růstu i za nepřítomnosti vzdušného kyslíku. Mezi takové se řadí nejčastěji rod Penicillium ssp. a Cladosporium. U sýrů, které nepotřebují během zrání kyslík, se proti plesnivění používají látky vytvářející z části nepropustnou vrstvu. Nebo se sýry balí do fólií z plastických hmot (GÖRNER, VALÍK, 2004). Je identifikováno až 371 plísní způsobujících kažení sýrů, z nichž svými 91 % převládá právě rod Penicillium ssp. Nejčastějším zástupcem tohoto rodu je Penicillium jsou Fausarium,

commune

(GROVE,

Scopulariopsis,

již

1998). zmíněný

Dalšími rod

zástupci

těchto

Cladosporium,

plísní

Aspergillus

a Verticillium (GÖRNER, VALÍK, 2004). Na kažení krémových sýrů se podílí tepelně

27

rezistentní plíseň Byssochlamys nivea, která je schopna růstu při koncentraci kyslíku nižší než 0,5 % (SPERBER, DOYLE, 2009).

Obr. 13 - Penicillium commune

Obr. 14 - Byssochlamys nivea

(MICROFUNGI, 2012).

(ENCYKLOPEDIA OF LIFE, 2013).

3.9 Metabolické produkty plísní

3.9.1

Mykotoxiny

Velké množství hub produkuje sekundární metabolity zvané mykotoxiny. Obecně se jedná o látky mutagenních a karcinogenních vlastností. I přesto, že toxicita některých mykotoxinů pro člověka nebyla zcela prokázána, jejich vliv na testovaných zvířatech ponechává jen málo pochybností o potenciální i skutečné toxicitě pro člověka (JAY et al., 2005). Jedním z nejznámějších producentů mykotoxinů z řad plísní patří rod Penicillium (COULTATE, 2002). Mykotoxiny se do mléčných výrobků mohou

dostat

dvěma

způsoby.

Prvním

je

nepřímá

kontaminace,

kdy dojnice přímo zkonzumuje zdroj mykotoxinu či přímou kontaminací, kdy dochází k náhodnému nebo záměrnému růstu plísní (SENGUN et al., 2008).

28

3.9.1.1 Mykotoxiny v sýrech produkované plísněmi Tab. 5 - Přehled některých mykotoxinů produkovaných plísněmi izolovaných ze sýrů (SENGUN et al., 2008, HOCKING, 2006, ROBERTS, 2005).

Plíseň

Produkovaný mykotoxin

Typ sýru

Penicillium roqueforti

Patulin, Kyselina penicilová

Cheddar

Kyselina mykofenolová, Patulin, PR toxin Kyselina mykofenolová, Kyselina penicilová

Sýr s modrou plísní

Roquefortin C Penicillium camemberti

Kyselina cyklopiazonová

Camembert

Byssochlamys nivea

Kyselina mykofenolová

Krémové sýry

Penicillium casei

Ochratoxin A

Švýcarské tvrdé sýry

Penicillium nordicum

Ochratoxin A

Švýcarské tvrdé sýry

Kyselina cyklopiazonová Představuje jeden z nejdůležitějších mykotoxinů produkovaných plísní Penicillium camemberti nalezených v sýrech typu Camembert. Výskyt kyseliny cyklopiazonové je z převážné části v kůře. Nedozrálé sýry skladované v chladnějším prostředí neobsahují více než 500 µg kyseliny cyklopiazonové na 1 kg. K výraznému nárůstu dochází zejména při vyšších teplotách skladování a to až na 5000 µg na kg. Proto je důležité

dodržovat

podmínky

skladování

tohoto mykotoxinu (WEIDENBÖRNER, 2001).

29

pro

zabránění

růstu

Obr. 15 - Kyselina cyklopiazonová (WIKIPEDIE, 2013).

PR toxin Penicillium roqueforti-toxin je považován za nejvíce akutně toxický toxin. Tvoří se za nízké koncentrace NaCl, při nízkém pH, v přítomnosti sacharózy a za optimálního množství kyslíku (ABBAS, DOBSON, 2011). PR toxin funguje jako inhibitor

proteinové

syntézy

a

nukleových

kyselin.

V prostředí

sýrů

s modrou plísní je však nestabilní a mění se na méně toxický PR-imin a PR-amindein, jejichž stabilita je také velmi malá (FOX et al., 2004).

Roquefortin Nejčastějším metabolitem Penicillium roqueforti v sýrech s modrou plísní je dále mykotoxin Roquefortin C, který je velmi často doprovázen Roquefortinem A. Roquefortin B se vyskytuje jen v menší míře (FOX et al., 2004). Stejně jako PR toxin i Roquefortin je v prostředí sýrů poměrně nestabilní a tudíž nepředstavuje závažné zdravotní riziko pro spotřebitele. Z hlediska bezpečnosti je však lepší používat jako startovací kulturu Penicillium roqueforti, která s sebou nepřináší riziko sekundárních metabolitů (ABBAS, DOBSON, 2011).

30

Obr. 16 - Roquefortin C (ADIPOGEN, 2013).

3.10 Ochrana proti růstu nežádoucích plísní

Nárůst nekulturních plísní má za následek znehodnocení výrobků s možností tvorby mykotoxinů a negativní vliv na zdraví konzumenta (GROVE, 1998). Proti růstu nežádoucích plísní na sýrech se využívají potravinářská antimykotika s přídavkem aktivních látek a to natamycin a sorban draselný. Z hlediska chuti je výhodnější používat natamycin, který oproti sorbanu draselnému difunduje do vnitřní vrstvy sýrů jen zlehka a nemění tak chuť. Vůči sorbanu draselnému jsou některé plísně rodu Penicillium rezistentní. Vážný problém způsobuje degradace kyseliny sorbové a sorbanu draselného, které metabolizují za vzniku trans-1,3-pentadienu, který v sýrech vyvolává pach po kerosinu (petroleji). Obsah kyseliny sorbové by v sýrech neměl překračovat hodnotu 2000 mg.kg-1 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Převážná část plísní je zničena během pasteračního režimu. Je však důležité použití i další metody zabraňující opětovné kontaminaci. Jako ochrana proti rekontaminaci se používá metoda modifikované atmosféry (MAP), která prokazatelně zpomaluje, až inhibuje růst těchto plísní. Tato metoda je založena na určité koncentraci CO2, O2 a N2 v přímé závislosti na baleném produktu (GROVE, 1998). Pro plísňové sýry je nejúčinnější použití vyšší koncentrace CO2 v řízené atmosféře (SPERBER, DOYLE, 2009).

31

3.11 Charakteristika kvasinek

Kvasinky jsou eukaryotní mikroskopické organismy náležející stejně jako plísně do říše hub. Jejich název je odvozený dle schopnosti velké části kvasinek zkvašovat některé monosacharidy, disacharidy a trisacharidy za vzniku oxidu uhličitého a ethanolu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

3.12 Rozmnožování kvasinek

Růst kvasinek je charakteristický zejména koloniemi, které se vytváří z buněk o průměru 5 až 10 µm. Rozmnožování se dělí obdobně jako u plísní na pohlavní a nepohlavní (GÖRNER, VALÍK, 2004). Pohlavní rozmnožování probíhá spájením dvou haploidních buněk (konjugace) a spájením jader buněk (karyogamie), přičemž vzniká jádro diploidní. Následuje redukční dělení diploidního jádra neboli meióza. Následně vznikají čtyři haploidní jádra, která tvoří základ spory. Vegetativní množení se děje převážně pučením. Dochází ke vzniku dceřiné buňky (pupenu), která je spojena kanálkem s buňkou mateřskou. V pupenu se syntetizuje endoplazmatické retikulum, vytváří se buněčná stěna, dochází k vzrůstu pupenu a spojení několika vakuol ve vakuolu jedinou. V této fázi je pučení ukončeno a následuje oddělení dceřiné buňky od buňky mateřské (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).

32

Obr. 17 - Životní cyklus kvasinek (WIKIPEDIE, 2013).

3.13 Vlastnosti kvasinek

Ke

svému

růstu

potřebují

kvasinky

přítomnost

vzdušného

kyslíku.

Schopnost kvasinek spočívá v přeměně metabolismu za anaerobních podmínek na metabolismus fermentační za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého. Růst kvasinek je možný v širokém rozmezí teplot od 0 až do 45 oC a pH o hodnotách 3 až 11. Je však důležité poznamenat, že některé druhy kvasinek jsou schopné růstu i za velmi nízkých teplot kolem -10 oC, pH 1,5, za přítomnosti vysokých koncentrací chemických konzervantů, cukru i soli (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.14 Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek

Kvasinky využívané v potravinářství se rozdělují dle způsobu rozmnožování do dvou základních skupin. První skupinu zastupují kvasinky vytvářející askospory, nazývané Endomycetales (kvasinky perfektní). Druhou skupinu tvoří kvasinky sporogenní,

zvané

Cryptococcales

(kvasinky

33

imperfektní).

Pro

přehlednost

jsem rozdělení

potravinářsky

využívaných

kvasinek

zaznamenala

do

tabulky

(GÖRNER, VALÍK, 2004).

Tab. 6 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek (GÖRNER, VALÍK, 2004, NARANG, 2008).

Endomycetales

Cryptococcales

rod Schizosaccharomyces

rod Geotrichum

rod Saccharomycopsis

rod Candida

rod Saccharomycodes

rod Cryptococcus

rod Hanseniaspora

rod Malassezia

rod Sacharomyces

rod Kloeckera

rod Zygosaccharomyces

rod Brattanomyces

rod Debaryomyces

rod Rhodotorula

rod Kluyveromyces

rod Sporobolomyces podrod Pichia podrod Hansenula

rod Dekkera rod Metschnikowia rod Torulaspora

34

3.15 Význam plísní z potravinářského hlediska

Kvasinky jsou důležité mikroorganismy využívané v pekárenském průmyslu, v kvasném průmyslu pro výrobu piva či vína a v neposlední řadě v mlékárenském průmyslu pro výrobu sýrů, másla a fermentovaných mléčných výrobků, zejména kefírů a kumysů. Schopnost kvasinek růst za nízkých hodnot pH, teploty, nižší vlhkosti, vyšší koncentraci

cukru

a

soli,

v kombinaci

s jejich

enzymatickou

aktivitou

je předurčuje pro využití v mlékařství (DILIP et al., 2004). Mezi nejvíce využívané kvasinky pro výrobu mléčných výrobků řadíme: Debaryomyces hansenii, Galactomyces geotrichum, Geotrichum candidum, Candida lipolytica, Kluyveromyces marxianus, Candida kefir, Kluyveromyces lactis var. lactis, Candida famata, Saccharomyces cerevisiae, Candida robusta a další (ROGINSKI et al., 2003).

3.16 Kvasinkové kultury využívané v mlékárenském průmyslu

Dle charakteru použití kvasinek v mlékařství dělíme kvasinkové kultury na: 1.) kvasinkové kultury pro výrobu sýrů zrajících pod mazem, 2.) kvasinkové kultury pro výrobu sýru s plísní, 3.) kvasinkové kultury pro výrobu másla, 4.) kvasinkové kultury pro výrobu kefírů a dalších nápojových kultur.

1.)

Kvasinkové kultury pro výrobu sýrů zrajících pod mazem Tato kultura obsahuje kvasinky Kluyveromyces lactis, Candida utilis a Torulopsis

candida. Jejich úlohou je oxidace kyseliny mléčné na povrchu mladých sýrů, čímž vytvářejí optimální podmínky pro růst Brevibacterium linens. Mají schopnost přežívat vyšší koncentrace NaCl, jehož roztokem se omývá povrch sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004).

35

2.)

Kvasinkové kultury pro výrobu sýrů roquefortského typu Jedná se o kvasinkovou kulturu skládající se z rodů Torulopsis candida a

Kluyveromyces lactis. Významně se podílejí na vzniku typického aroma tvorbou pěti až devíti uhlíkatých methylketonů a ethanolu, který s volnými mastnými kyselinami dávají vznik aromatických esterů (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.)

Kvasinkové kultury pro výrobu másla Pro prodloužení trvanlivosti másla a zlepšení jeho jakosti se využívá kvasinková

kultura obsahující druhy Cryptococcus laurenti a Torulopsis candida (GÖRNER, VALÍK, 2004).

4.)

Kvasinkové kultury pro výrobu kefírů a dalších nápojových kultur Kefírová kvasinková kultura je složena z druhů Candida kefir, Torulopsis lactis

var. condensi a Kluyveromyces fragilis. Tyto kvasinky se účastní fermentace mléka společně

s

Lactobacillus

delbrueckii

ssp.

lactis,

Lactobacillus

delbrueckii

a Lactobacillus acidophilus, při čemž dochází k fermentaci laktózy (DILIP et al., 2004).

3.17 Úloha kvasinek při výrobě sýrů zrajících pod mazem

Sýry zrající pod mazem jsou rozšířeným typem sýrů s výraznou proteolytickou aktivitou

(GÖRNER,

VALÍK,

2004).

Výroby

se

účastní

mazová

kultura

složená zejména z Brevibacterium linens, Arthrobacter a kvasinek Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum a Candida lipolytica (ROGINSKI et al., 2003). Výrobní proces sýrů zrajících pod mazem Výchozí surovinou je plnotučné mléko zaočkované mezofilním zákysem s následným srážením pomocí syřidla. Očkování se provádí rozprašováním suspenze mazové kultury, samovolným očkováním v prostředí sýrárny nebo omýváním slanou vodou.

Po

krájení

a

drobení

následuje

36

odpouštění

části

syrovátky.

Přidá se teplá voda pro zlepšení synereze sýrového zrna a zředění laktózy, čímž se zabrání

vzniku většího

množství

kyseliny mléčné.

Kyselina mléčná

by zhoršovala průběh proteolytického aerobního zrání. Poté se provádí formování a může se provádět i lisování. Následuje solení v solné lázni a zrání ve zracím prostoru při relativní vlhkosti 90 až 95 % a teplotě 13 až 15 oC (GÖRNER, VALÍK, 2004). Význam kvasinek během výrobního procesu Hlavní úloha kvasinek spočívá v rozkladu kyseliny mléčné a mléčnanů, v přítomnosti vzdušného kyslíku na CO2 a H2O. To má za následek zvyšování hodnot pH, jak ve vnitřní vrstvě substrátu, tak i na povrchu. Odkyselením povrchu sýrů je umožněn

růst

mazové

mikroflóry

Arthrobacter

a

Brevibacterium

linens.

Hodnota pH na povrchu pro optimální růst mazové kultury by neměla být kyselejší než 5,5. Další úlohou kvasinek je produkce vitamínů, které také podporují růst mazové kultury. Z produkovaných vitamínů je to konkrétně niacin, riboflavin a kyselina pantotenová (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.17.1 Klasifikace sýrů zrajících pod mazem Zástupci

sýrů

zrajících

podle typu probíhajícího zrajících pod mazem

pod

srážení.

je Romadur,

mazem

se

Hlavními Pepin

rozdělují

do

představiteli

a Romadůžek,

dvou

skupin

sladkých

sýrů

které charakterizuje

sladké srážení (ROBINSON, 2005). Představitelem kyselých sýrů zrajících pod mazem s využitím kyselého srážení jsou u nás Olomoucké tvarůžky. Ze zahraničních zástupců může být zmíněn například Limburger, Herve a Livarot (VLKOVÁ et al., 2006).

3.17.1.1 Sladké sýry zrající pod mazem Romadur Výroby sýrů typu romadúr se účastní kvasinky Geotrichum candidum, Candida lipolytica,

Candida

vini,

Candida

krusei

a

Debaryomyces

hansenii,

které degradují kyselinu mléčnou. Dochází ke zvýšení pH na neutrální hodnoty. Tím se připravují vhodné podmínky pro růst Brevibacterium linens a Micrococcus a současně i zamezení růstu nežádoucích plísní (ROBINSON, 2005).

37

Pepin Na zrání se podílí kvasinková mikroflóra skládající se z rodu Kluyveromyces a Geotrichum, které zajišťují optimální růst mazové kultury Bravibacterium a Staphylococcus xylosus (ROBINSON, 2005). Romadůžek Kvasinková kultura je složena z kvasinek Kluyveromyces a Debaryomyces hansenii. Jejich úloha při zrání sýrů je obdobná jako u předešlých zástupců (ROBINSON, 2005).

Obr. 18 - Debaryomyces hansenii

Obr. 19 - Sýr Romadur

(LAW, TAMIME, 2010).

(WIKIPEDIE, 2013).

Na snímku (obr. 14) je zobrazena elektronová mikroskopie Debaryomyces hansenii (4 µm) vyzrálého sýru Romadur (LAW, TAMIME, 2010).

3.17.1.2 Kyselé sýry zrající pod mazem Olomoucké tvarůžky Řadí se mezi kyselé sýry, při jejichž výrobě se uplatňuje kyselé srážení. Výchozí surovinou je tvaroh, který má kyselost 120 až 160 oSH. Vysokou kyselost způsobuje obsah kaseinu v tvarohu a kyseliny mléčné. Přídavek uhličitanu sodného či vápenatého snižuje kyselost tvarohu na 115 oSH. Aby mohlo proběhnout vlastní zrání proteolytickými enzymy bakterií je kyselost stále vysoká. To je moment, kdy se využívá schopnosti

kvasinek

rodu

38

Candida

a

Torulopsis

oxidovat

o

kyselinu mléčnou na CO2 a H2O. Reakce probíhá při teplotě 18 až 45

C,

při které tvarůžky vysychají až do získání hodnot pH 6,4 a obsahu sušiny 36 %. Proto se tento proces s využitím kvasinkové kultury nazývá sušení (GÖRNER, VALÍK, 2004).

Obr. 20 - Candida utilis

Obr. 21 - Olomoucké tvarůžky

(POBIOEGLOOS, 2007).

(INOVAČNÍ PODNIKÁNÍ, 2013).

3.18 Úloha kvasinek při výrobě sýrů s plísní Kvasinky tvoří důležitou složku výroby sýrů s plísní na povrchu či s plísní v těstě. Společně s kulturními plísněmi se podílí za zrání (BERESFORD, 2001).

3.18.1 Sýry s plísní na povrchu U sýrů s plísní na povrchu, činností proteolytických a lipolytických enzymů kvasinek,

vznikají

Kvasinky mají schopnost

sloučeniny asimilace

difundující laktátu,

do

vnitřní

produkce

vrstvy

alkalických

sýrů.

sloučenin,

které odkyselují vnitřní a povrchovou vrstvu sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Saccharomyces

cerevisiae,

Kluyveromyces

lactis,

Geotrichum

candidum

a

Debaryomces hansenii stimulují růst rodu Lactococcus lactis a následně i Penicillium camemberti. Největší nárůst kvasinek, plísní a Lactococců je během prvních čtyř dnů zrání

(BERESFORD,

sýrů s plísní na povrchu

2001).

Ačkoliv

nejdominantnější

39

kvasinky

nejsou

mikroflórou,

mají

z hlediska podstatnou

výroby úlohu

v navozování interakcí v průběhu zrání s plísněmi a zejména s bakteriemi mléčného kvašení

(CORSETTI

et

al.,

2001).

Nejvýznamnějším

zástupcem

kvasinek,

které se vyskytují téměř ve všech povrchově zrajících sýrech v počáteční fázi zrání, je Geotrichum candidum (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005, SATYANARAYANA, KUNZE, 2009).

3.18.1.1 Geotrichum candidum Zařazení

rodu

Geotrichum

Jedna část odborné literatury

řadí

candidum rod

není

zcela

Geotrichum

jednoznačné.

mezi

kvasinky,

jiná jako přechod mezi kvasinkami a plísněmi. To je zapříčiněno širokou rozmanitostí jeho genotypu a fenotypu (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005). Jeho vysoká biochemická aktivita je využívána pro výrobu sýrů, kde pomáhá vytvářet strukturu, soudržnost a tloušťku vrchní vrstvy sýrů (ROGINSKI et al., 2003). Vyskytuje

se

volných mastných

zejména kyselin.

na

povrchu

Tvorbou

sýrů,

lipáz

které

mění

obsahují

jejich

profil.

vyšší

obsah

Z triglyceridů

uvolňují kyselinu olejovou a další nenasycené mastné kyseliny (ROGINSKI et al., 2003). Tato

kvasinka

se

vyznačuje

také

vyšší

proteolytickou

aktivitou.

Produkuje dva typy proteináz, extracelulární a intracelulární (FUQUAI et al., 2011). Extracelulární

proteolytická

Extracelulární proteinázy a rychleji se inaktivují

rodu při

organoleptických vlastností snižuje hořkost

aktivita

prostřednictvím

nižší

Geotrichum

pH má

je

také

4,0.

ve

srovnání

candidum

Významný

tvorba

aminopeptidáz.

peptidáz. Ty

s intracelulární.

jsou podíl

termolabilní na

utváření

Geotrichum

candidum

hydrolyzují

nižší

peptidy

pocházející z degradace β-kaseinu působením Penicillium camemberti. Je prokázané, že v závislosti na použitém kmenu Geotrichum candidum lze výrazně snížit hořkost beze změny vzhledu sýru a chuti. Nebo lze snížit hořkost, změnit vzhled a posílit příchuť, která je charakteristická pro tradiční sýr Camembert (BOUTROU, GUÉGUEN, 2005). Geotrichum candidum se však dle studií nepodílí jen na zrání sýrů tohoto typu. Tento rod také vykazuje vysokou schopnost inhibice nežádoucích mikroorganismů kontaminující plísňové sýry, jako je například Penicillium commune. Tato schopnost byla prokázána na laboratorním médiu (sýr Camembert), kde se jako startovací kultura 40

zvolil rod Geotrichum a jako mikrobiální kontaminant Penicillium commune (NIELSEN et al., 1998).

Obr. 22 - Elektronová mikroskopie sýru zrajícího od povrchu zobrazující růst Geotrichum candidum (2 µm), (LAW, TAMIME, 2010).

3.18.2 Sýry s plísní uvnitř Kvasinky

se

podílí

na

zrání

sýrů

s plísní

uvnitř,

konkrétně

sýrů

roquefortského typu. Jejich činností lipolytických enzymů, při které dochází k degradaci mléčného

tuku,

vznikají

aromatické

rozkladné

produkty

methylketony.

Produkují také ethanol, který reaguje s volnými mastnými kyselinami za vzniku aromatických esterů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tvorba plynu heterofermentativní mikroflórou, zejména rodem Leuconostoc, je stimulována právě kvasinkami. To má za následek zpřístupnění vnitřní vrstvy sýru a snadnější vývoj Penicillium roqueforti (BERESFORD, 2001).

3.19 Úloha kvasinek při výrobě másla

Kvasinková kultura složená z druhů Cryptococcus laurenti a Torulopsis candida dává

vznik

redukujících

látek.

Spotřebou

vzdušného

kyslíku

v másle

dochází k zabránění nežádoucí oxidace tuku. Tím se eliminuje vznik chemických chyb

41

v dlouhodobě skladovaném mraženém másle. Výsledkem je prodloužení trvanlivosti a zlepšení jakosti másla (GÖRNER, VALÍK, 2004).

3.20 Úloha kvasinek při výrobě kefírů

Kefírem se rozumí kysaný mléčný výrobek s malým obsahem alkoholu, jehož základem jsou kefírová zrna (HUI et al., 2007). Pro výrobu kefírů se používá kvasinková kefírová kultura složená zejména z druhů Candida kefir, Torulopsis lactis var. condensi a Kluyveromyces fragilis (DILIP et al., 2004). Působením enzymatické aktivity kvasinkové mikroflóry společně s působením mikroflóry

Lactobacillus

delbrueckii

ssp.

lactis,

Lactobacillus

delbrueckii

a Lactobacillus acidophilus vznikají typické chuťové a aromatické vlastnosti kefírů (RENNENBERG, 2008). Výrobní proces kefírů Hlavní

význam

bakterií

při

výrobě

kefírů

je

koagulace

kaseinu

a poměrně rychlá tvorba kyseliny mléčné. V přítomnosti kvasinek je podporován jejich růst (GÖRNER, VALÍK, 2004). Hlavní úlohou kvasinek je fermentace laktosy za současné produkce CO2 a ethanolu (DILIP et al., 2004). Produkcí CO2 jsou kefírová zrna vyplavovány na povrch mléka. Koagulovaný kasein se přichytí na jejich povrch a vytváří se tak kaseinová vrstva, kde probíhá další množení a metabolické procesy příslušné mikroflóry. Mléko se fermentuje 1 až 2 dny kefírovou kulturou při teplotě 18 až 22 oC. Dosažená kyselost zralého kefíru je v rozmezí 36 až 44 oSH (GÖRNER, VALÍK, 2004). Při

výrobě kefírových

mlék

se

používá opět

teplota

18

až

22

o

C

a požadovaná kyselost je 36 až 40 oSH. Hlavní rozdíl mezi kefírem a kefírovým mlékem spočívá v rozdílném množství použitých kvasinek. U kefírů se používá řádově 104 kvasinek, u kefírového mléka je počet nižší a to 102 (GÖRNER, VALÍK, 2004).

42

3.20.1 Mikrobiální metabolismus Literatura uvádí, že mechanismy zodpovědné za degradaci složek mléka a tvorbu aromatických a chuťových sloučenin, jsou výsledkem mikrobiálního metabolismu použitých kultur (HOFRICHTER, 2010). 3.20.1.1 Lipolytické enzymy kvasinek Výsledkem lipolýzy mléčné tukové složky je tvorba volných mastných kyselin, které jsou prekurzory chuťových složek kefírů. Mezi tyto složky zahrnujeme ketony, alkoholy, laktony, methylestery a estery. Lipolýza

a dekarboxylace volných mastných kyselin

způsobená

kvasinkami

vede k tvorbě methylketonů, nonan-2-on a heptan-2-on, které tvoří základní aromatickou složku sýrů s modrou plísní (HOFRICHTER, 2010).

Obr. 23 – nonan-2-on (MERCK CHEMICAL, 2013).

Obr. 24 - heptan-2-on (MERCK CHEMICAL, 2013).

3.20.1.2 Proteolytické enzymy kvasinek Činností proteolytických enzymů jsou kvasinky schopny degradace kaseinu na peptidy a volné aminokyseliny, které se dále rozkládají na aldehydy, alkoholy, těkavé kyseliny, estery a sirné sloučeniny. Ze sirných sloučenin je nutné zmínit

43

zejména dimethyldisulfid Aminokyseliny

a

dymethyltrisulfid,

které

řetězcem

s rozvětveným

vytvářejí

jsou

typické

prekurzory

aroma.

některých

aromatických složek, jako isobutyrát, isovalerát, 2-methylpropanal, 3-methylbutanal a 2-methylbutanal (PARK, 2009).

3.20.1.3 Metabolické dráhy kvašení Kvasinky

metabolizují

z nichž nejvýznamnější

je

široké

spektrum

metabolismus

organických

sacharidů.

Ten

substrátů,

kvasinky

využívají

jako hlavní zdroj energie. Metabolismus sacharidů je charakterizovaný dvěma dráhami. První dráha je aerobní, při nichž probíhají oxidační procesy a získávání energie. Druhá dráha je

anaerobní,

při

které

se

spotřebovává

energie,

a probíhají

redukční procesy vedoucí k biosyntéze nového buněčného materiálu. Rozklad laktosy a následně

pyruvátu

dehydrogenázami.

je

uskutečňován

Tento

jako alkoholové kvašení.

typ

metabolismu

Hlavními

Způsob metabolismu sacharidů

u

působením

produkty kvasinek

kvasinkových

označujeme

sacharidů jsou

použitých

C2H5OH pro

enzymů

a

CO2.

výrobu

kefírů

je právě anaerobní fermentace (PARK, 2009).

3.21 Úloha kvasinek při výrobě kumysů

Kumysem se rozumí fermentovaný mléčný nápoj připravený za použití mikroflóry skládající se z kvasinek fermentující laktózu, rodu Saccharomyces ssp., Candida koumiss, Kluyveromyces marxianus var. marxianus a kvasinek nefermentující laktózu, Saccharomyces rodu Mycoderma a Lactobacillus

cartilaginosus. ssp.

a

acidophilus

Další

bakterie (DILIP

součásti

mikroflóry

jsou

Lactobacillus

delbrueckii

ssp.

et

al.,

2004).

Kvalita

kvasinky bulgaricus

kumysů

závisí

zejména na použitém kobylím mléku a obsahu bioaktivních složek vznikajících během interakce mezi bakteriemi a kvasinkami (TAMIME, 2006). Příslušné bakterie mléčného kvašení jsou schopné produkovat laktáty z laktózy, čímž podporují růst kvasinek.

44

Úloha kvasinek spočívá v produkci vitamínů a dalších stimulačních látek, které vytváří vhodné prostředí pro optimální růst bakterií (PARK, 2009). Výrobní proces kumysů Základem je kobylí nebo kozí mléko, které je fermentované příslušnou mikroflórou (BELITZ et al., 2004). Po přidání startovací kultury se provádí inkubace při teplotě 26 až 28 oC po dobu 50 až 60 minut. Po následné homogenizaci je fermentát zchlazen na teplotu 20 oC a zabalen. Následuje další inkubace při teplotě 18 až 20 oC po dobu 1,5 až 2 hodiny. Před expedicí jsou výrobky skladovány při teplotě 4 až 6 oC po dobu 12 až 24 hodin (TAMIME, 2006).

3.22 Úloha kvasinek při výrobě jogurtového sýru Laban (Labneh)

Laban je fermentovaný mléčný výrobek arabského původu patřící do skupiny jogurtových sýrů. Tento sýr je z velké části známý zejména pro jeho delší trvanlivost než je u jogurtů (TAMIME, 2007). Jeho mikroflóra je složena z bakterií rodu Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc lactis, kvasinek Saccharomyces cerevisiae a Kluyveromyces fragilis. Během fermentace kvasinky produkují převážné množství acetaldehydu a menší množství ethanolu (HUI, FRIBERG, 2004). Výrobní proces sýru Laban Tradiční Laban se vyrábí z kravského mléka, ale je možné ho nahradit i kozím mlékem (TAMIME, 2007). V průběhu výroby jogurtového sýru Laban je důležité stabilizovat mléko na teplotu fermentace a to 42 oC. Následuje příprava mléka zaočkováním startovací kulturou. Aby se získala dobře homogenizovaná směs, provádí se důkladné míchání. Asepticky se plní a uzavírá do spotřebitelských obalů. Poté se výrobky inkubují při teplotě 42 oC v řízené atmosféře. Závěrečnou operací je chlazení za účelem zastavené probíhající fermentace (HUI, FRIBERG, 2004).

45

Obr. 25 - Saccharomyces cerevisiae

Obr. 26 - Jogurtový sýr Laban

(MICROBEOFTHEWEEK, 2013).

(OLIVEFIGGRAPE, 2013).

3.23 Kvasinky jako možné příčiny kažení mléčných výrobků

Kvasinky jsou hlavní příčinou kažení kysaného mléka, sýrů a jogurtů, ve kterých nízké

hodnoty

pH

vytváří

optimální

prostředí

pro

jejich

růst.

V těchto produktech jsou kvasinky schopny metabolizovat diacetyl, čímž dochází ke vzniku kvasnicové chuti indikující zkažený výrobek. Mezi hlavní zástupce kvasinek kontaminující mléčné výrobky řadíme Geotrichum candidum, Saccharomyces cerevisiae a Hansenula anomala (SPERBER, DOYLE, 2009).

3.23.1 Kvasinky kontaminující sýry Hlavními kvasinkami způsobující kažení sýrů patří Kluyveromyces marxianus, Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii, Pichia ssp. a Candida ssp (PITT, HOCKING, 2009). Nízké pH, povrchová vlhkost, obsah kyseliny mléčné, peptidů a aminokyselin, podporují rychlý růst kvasinkové mikroflóry. Mnoho kvasinek produkuje alkoholy a CO2. V důsledku velkého množství vyprodukovaného CO2 dochází ke zvýšení plynatosti a vzniku vyboulenin u sýrů balených ve vakuu či v modifikované atmosféře. To se považuje za charakteristický znak přítomnosti nežádoucích kvasinek. Aktivitou lipolytických enzymů vznikají mastné kyseliny 46

s krátkým řetězcem, které v kombinaci s athanolem dávají vznik ovocných esterů. Některé

kvasinky

svými

proteolytickými

enzymy

zapříčiňují

vznik

sulfidů,

což se projevuje zápachem po vejcích (HUI, FRIBERG, 2004). Pokračující hydrolýza bílkovin a tuku způsobená přítomností nekulturních kvasinek ve výrobcích také zapříčiňuje hořkou až žluklou chuť a měknutí textury (FLEET, 1990).

3.24 Ochrana proti růstu nežádoucích kvasinek

Preventivním opatřením je dodržování požadovaných hygienických podmínek ve výrobních a zracích prostorách. Nezbytné je odstranění přebytečné vlhkosti prostředí,

aby

nedocházelo

k nežádoucímu

množení

kvasinek

(GÖRNER,

VALÍK, 2004). Stejně jako v případě plísní se používá metoda modifikované atmosféry inhibující nekulturní kvasinky (MULLAN, 2012). Dále se používá aplikace antimykotik s obsahem kyseliny sorbové (ADAMS, MOSS, 2000). Debaryomyces hansenii je však vůči kyselině sorbové rezistentní. Je schopna růstu i při koncentraci 3 mg a přeměňuje kyselinu sorbovou na trans-1,3-pentadien, který, jak už bylo zmíněno u plísní, vykazuje pach po kerosinu (FOX, 2000).

3.25 Biologický inhibitor nežádoucích kvasinek a plísní v mléčných výrobcích

Proti

růstu

nežádoucích

kvasinek

a

plísní

na

mléčných

výrobcích,

převážně v sýrech a jogurtech, je dle nejnovějších poznatků možné použití biologického inhibitoru Williopsis saturnus var. saturnus (LIU, TSAO, 2010). Jedná se o kvasinku vylučující toxin, který vykazuje antimykotickou aktivitu. Tato charakteristická vlastnost umožňuje použití Williopsis saturnus var. saturnus jako novou alternativu pro inhibici některých nežádoucích mikroorganismů na biologické bázi (ANKE, WEBER, 2009).

47

Toxin

produkovaný

kvasinkou

Williopsis

saturnus

var.

saturnus

je schopen inhibovat růst laktózu fermentující a galaktózu fermentující kvasinky Candida

kefir

a

Kluyveromyces

marxianus.

Dále

laktózu

nefermentující,

ale galaktózu fermentující kvasinky Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus. Inhibuje také růst některých plísní, mezi které řadíme zejména Byssochlamys, Penicillium a Eurotium (LIU, TSAO, 2009).

Obr. 27 - Williopsis saturnus var. saturnus (NCYC, . 2013).

3.26 Mikrobiologická kontrola obsahu kvasinek a plísní v mléce a mléčných výrobcích

Hlavní

příčinou

výskytu

nadměrného

množství

kvasinek

a

plísní

v mléčných výrobcích je jejich nenáročnost na životní podmínky. Tyto mikroskopické houby

jsou

schopné

nízkých hodnot pH

a

růstu při

za

nízké

nízké

teploty, vodní

při

vyšší

aktivitě

koncentraci daného

soli,

prostředí.

Jejich enzymatické vybavení jim umožňuje vysokou adaptabilitu na jakýkoliv substrát (GÖRNER, VALÍK, 2004). Co se právních předpisů mikrobiologické kontroly potravin týká, není stanovení počtu kvasinek a plísní striktně vyžadováno, ale doporučováno ČSN 56 9609 u některých mléčných výrobků. Mezi tyto výrobky patří například smetanové krémy, tvarohové krémy, sušené mléčné výrobky pro dětskou a kojeneckou výživu, pomazánky z másla a máslo (STANDAROVÁ et al., 2011).

48

3.26.1 Živná média pro kultivaci a stanovení počtu plísní a kvasinek v mléčných výrobcích Pro stanovení plísní a kvasinek jsou používány selektivní kultivační média, která současně potlačují růst bakteriální mikroflóry (HUI, FRIBERG, 2004). Základem jsou média s nízkou hodnotou pH, jako je například sladinový agar (SL) nebo média s antibiotiky, kam řadíme například GKCH (půda s glukózou, kvasničným extraktem

a

chloramfenikolem).

Pro

stanovení

počtu

kvasinek

a

plísní

bylo do nedávné doby vyžadováno normou ČSN ISO 7954 použití GKCH agaru (STANDAROVÁ et al., 2011). Dnes se pro stanovení kvasinek a plísní používají příslušné ISO metody. Uplatňuje se metoda za použití chloramfenikolového agaru s bengálskou červení a dichloranem (DRBC), a metoda využívající dichloran glycerolový agar (DG18), (DOWNES, ITO, 2001). U těchto metod se využívá závislost na aktivitě vody aw. Inkubace na agarech probíhá aerobně po dobu 5 dní a při teplotě 25 oC. Důležitým kritériem při výběru kultivačního media je hodnota aw v testované potravině. DG18 agar je používán pro potraviny s nižším obsahem vody, u nichž je aw ≤ 0,95. U mléčných výrobků je vhodnější využití agaru DRBC, který se používá u potravin s vyšším obsahem vody, u nichž je hodnota aw ˃ 0,95 (STANDAROVÁ et al., 2011).

Obr. 28 - Znázorněný růst plísně Penicillium roqueforti na agaru DRBC a DG 18 (STANDAROVÁ et al., 2011).

49

Obr. 29 - Znázorněný růst kvasinky Saccharomyces cerevisiae na agaru DRBC a DG 18 (STANDAROVÁ et al., 2011).

Obr. 30 - Znázorněný růst kvasinky Geotrichum candidum na sladinovém a GKCH agaru (STANDAROVÁ et al., 2011).

50

Tab. 7 - Složení médií pro kultivaci plísní a kvasinek (STANDAROVÁ et al., 2011).

Kultivační médium Složení (g, ml) GKCH

SL

DRBC

DG 18

Glukóza

20

-

10

10

Chloramfenikol

0,1

-

0,05

0,1

Chlortetracyklin chlorhydrát

-

-

0,05

-

KH2PO4

-

-

1

1

MgSO4 .7 H2O

-

-

0,5

0,5

Dichloran

-

-

1

1

Polypepton

-

-

5

-

Pepton

-

-

-

5

Glycerol

-

-

-

220

Bengálská červeň

-

-

0,025

-

CuSO4. 5 H2O

-

-

0,005

-

ZnSO4. 7 H2O

-

-

0,01

-

Tergitol

-

-

1

-

Sladinový extrakt

-

20

-

-

15

20

12,4

13

1000

1000

1000

1000

6,6 ± 0,2

5,4 ± 0,2

5,6 ± 0,2

5,6 ± 0,2

Agar Destilovaná voda pH

GKCH - Glukózový agar s kvasničným extraktem a chloramfenikolem SL – Sladinový agar DRBC – Dichloranový agar s bengálskou červení a chloramfenikolem DG18 – Dichloran glycerolový

51

4

ZÁVĚR

Cílem mé bakalářské práce bylo prostudování odborné literatury, převážně světové a na jejím základě se seznámit s využitím a úlohou plísní a kvasinek v mlékárenských technologiích. Zaměřila jsem se zejména na jejich využití při výrobě sýrů. Kulturní kmeny kvasinek a plísní tvoří nepostradatelnou složku výrobního procesu některých známých mléčných výrobků. Podstata jejich využití spočívá v obsahu bioaktivních enzymů, které jsou schopny degradace bílkovin, tuků a sacharidů. Dochází tak k biochemickým procesům, které vedou ke vzniku výsledné chuti a vůně výrobku. Plísňové kultury nalezly využití zejména ve výrobě sýrů s plísní v těstě, s plísní na povrchu a dvouplísňových sýrů. Mezi tyto hlavní zástupce patří zejména Penicillium

camemberti

a

Penicillium

roqueforti.

Na

základě

studie,

která byla provedena studenty Vyšší odborné školy potravinářské, Střední průmyslové školy mlékárenské v Kroměříži a odborných pracovníků byla objevena možná nová kulturní plíseň Penicillium nalgiovensis, která by mohla být používána pro výrobu sýrů s plísní na povrchu. Pro sýrařský průmysl se tak může stát zajímavou marketingovou alternativou. Kvasinky

mají

v mlékařství

poměrně

širší

využití.

Obsah

enzymů

a schopnost zkvašovat některé sacharidy je nedílnou součástí výroby zejména kefírů, kumysů a sýrů zrajících pod mazem. Zajímavým kmenem je Geotrichum Candidum, jehož zařazení mezi plísně či kvasinky není zcela jednoznačné. Významně se podílí na utváření

struktury

a

senzorických

vlastnostech

sýrů

typu

Camembert,

kde hraje významnou roli. Působením aminopeptidáz má Geotrichum Candidum schopnost snižovat hořkost sýrů Camembert vzniklou nižšími peptidy. Dle nových poznatků mohou tyto mikroorganismy působit i jako ochrana proti množení nežádoucích plísní či kvasinek v mléčných výrobcích. Produkcí toxinu vykazující antimykotickou aktivitu lze použít kvasinku Williopsis saturnus var. saturnus jako biologický inhibitor. Nové studie a poznatky v oblasti mikrobiologie umožňují stále širší využití plísní a kvasinek. Jejich úloha a význam tak nachází podstatně významnější uplatnění v mlékárenských technologiích.

52

5

POUŽITÁ LITERATURA

ABBAS, A., DOBSON, A. D. W., 2011: Penicillium roqueforti. Encyklopedia of Dairy Sciences. 2. vyd. Academia Press, 3200 s. ISBN 9780123744074. ADAMS, M. R., MOSS, M. O., 2000: Food Microbiology. 2. vyd. Royal Society of Chemistry, 479 s. ISBN 08-540-4611-9. ANKE, T., WEBER, D., 2009: Physiology and genetics: selected basic and applied aspects. The mycota. Berlin: Springer, 410 s. ISBN 978-364-2002-854. BELITZ, H. D., GROSCH, W., SCHIEBERLE, P., 2004: Food Chemistry. 3. vyd. Springer, 1070 s. ISBN 35-404-0818-5. BERESFORD, P. T., 2001: Recent Advances in Cheese Microbiology. International Dairy Journal. 11: 259-274. BOURDICHON, F. (ed.), 2012: Food fermentations: Microorganisms with technological beneficial use. International Journal of Food Microbiology. 154: 87-97. BOUTROU, R., GUÉGUEN, M., 2005: Interests in geotrichum candidum for cheese technology. International Journal of Food Microbiology. 104: 1-20 s. CABALLERO, B., FINGLAS, P., TRUGO, L., 2003: Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. 2. vyd. Amsterdam: Academic Press, ISBN 978-0-12-227055-0. CALLEC, CH., 2002: Encyklopedie sýrů. 1. vyd. Čestlice: Rebo, 256 s. ISBN 80-723-4225-8. CORSETTI, A., ROSSI, J., GOBBETTI, M., 2001: Interactions between yeasts and bacteria in the smear surface-ripened cheeses. International Journal of Food Microbiology. 69: 1-10 s. COULTATE, T. P., 2002: FOOD: The Chemistry of its Components. 4. vyd. Royal Society of Chemistry, 432 s. ISBN 08-540-4615-1.

53

DILIP, K. A., BRIDGE, D. P., BHATNAGAR, D., 2004: Fungal Biotechnology in Agricultural, Food, and Environmental Applications. 2. vyd. Marcel Dekker, 592 s. ISBN 08-247-4018-1. DOWNES, F. P., ITO, K., 2001: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 4. vyd. American Public Health Association, 676 s. ISBN 97808-755-3175-5. ESKIN, N. A. M., SHAHIDI, F., 2012: Biochemistry of Foods. 3. vyd. Academic press, 584 s. ISBN 97-801-224-2352-9. FLEET, G. H., 1990: Yeast in dairy product. Journal of Applied Mycrobiology. 68: 199-211 s. FOX, P., 2000: Fundamentals of cheese science. Gaithersburg, MD: Aspen Pub., 587 s. ISBN 08-342-1260-9. FOX, P. F., MCSWEENEY, P. L. H., COGAN T. M., GUINEE, T. P., 2004: Cheese : chemistry, physics, and microbiology /. General aspects . 3. vyd. Amsterdam: Elsevier, 617 s. ISBN 0-12-263651-1. FOX, P. F., MCSWEENEY, P. L. H., COGAN, T. M., GUINEE, T. P., 2004: Cheese: chemistry, physics and microbiology /. Major groups. 3. vyd. Amsterdam: Elsevier, 456 s. ISBN 0-1226-3653-8. FUQUAY, J. W., FOX, P. F., MCSWEENEY, P., 2011: Blue Mold Cheese. Encyclopedia of Dairy Sciences. Boston: Elsevier, 3968 s. ISBN 978-012-3744-029. GÖRNER, F., VALÍK, L., 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín: princípy mikrobiológie požívatín, potravinársky významné mikroorganizmy a ich skupiny, mikrobiológia potravinárskych výrob, ochorenia mikrobiálneho povodu, ktorých zárodky sú prenášané požívatinami. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, 528 s. ISBN 80967-0649-7. GROVE, T. M., 1998: Use of antimycotics, modified atmospheres, and packaging to affect mold spoilage in dairy products. Dissertation. In MS, Faculty of the Virginia, Blacksburg, Virginia, 71 s.

54

HOCKING, A. D., 2006: Advances in food mycology. New York: Springer, 371 s. ISBN 978-038-7283-852. HOFRICHTER, M., 2010: Industrial applications. The Mycota. 2. vyd. New York: Springer, 485 s. ISBN 978-3-642-11458-8. HUI, Y. H. (ed.), 2007: Handbook of Food Products Manufacturing. 2. vyd. John Wiley and Sons, 2308 s. ISBN 04-700-4964-2. HUI, Y. H., FRIBERG, S., 2004: Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology. CRC Press, 1000 s. ISBN 08-247-5122-1. HUTKINS, R. W., 2006: Microbiology and technology of fermented foods. 1. vyd. Ames, Iowa: Blackwell Pub., 473 s. ISBN 978-081-3800-189. JAY, J. M., LOESSNER J. M., GOLDEN A. D., 2005: Modern Food Microbiology. 7. vyd. New York: Springer, 790 s. ISBN 03-872-3413-6. LÁSZTITY, R., 2009: Food microbiology. Food Quality and Standards. 3. vyd. Oxford, U.K.: Eolss Publishers, 358 s. ISBN 978-1-84826-943-9. LAW, B. A. 1997: Microbiology and biochemistry of cheese and fermented milk. 2. vyd. London: Blackie Academic, 365 s. ISBN 07-514-0346-6. LAW, A. B., TAMIME A., 2010: Technology of cheesemaking. 2. Vyd. Malden, MA: Blackwell, 482 s. ISBN 978-140-5182-980. LEClERCQ-PERLAT, M., N. 2011: Camembert, Brie, and Related Varieties. Encyclopedia of Dairy Sciences. 2. vyd. Academic press, 3200 s. ISBN 978-012-3744074. LIKLER, L., KOPÁČEK, J., 2007: Pojednání o sýrech s ušlechtilou plísní uvnitř hmoty. Potravinářská revue, (4): 27-33. LIU, Q. S., TSAO, M., 2009: Inhibition of spoilage yeasts in cheese by killer yeast Williopsis saturnus var. saturnus. International Journal of Food Microbiology. Databáze online [cit. 7. 3. 13]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160509001597

55

LUND, B., M., BAIRD-PARKER, T., C., GOULD, G., 2000: The microbiological safety and quality of food. Springer, 2080 s. ISBN 08-342-1323-0. MRÁZEK, J., BŘEZINA, P., POSPÍŠIL, M., TYKVARTOVÁ, D., 2009: Plíseň Penicillium nalgiovensis jako alternativa k výrobě plísňového sýra. Potravinářská revue. (6): 53-55. MULLAN, W. M. A., 2012: Modified Atmosphere and Active Packaging Technologies. CRC Press, 806 s. ISBN 14-398-0044-8. NARANG, S. P., 2008: Food Microbiology. APH Publishing, 260 s. ISBN 8176487406. NIELSEN, M. S., FRISVAD, J. C., NIELSEN, P. V., 1998: Protection by fungal starters against growth and secondary metabolite production of fungal spoilers of cheese. International Journal of Food Microbiology. 42: 91-99 s. PARIJA, S. CH., 2009: Textbook of Microbiology and imunology. Elsevier India, 700 s. ISBN 8131221636. PARK, Y. W., 2009: Bioactive components in milk and dairy products. Ames, Iowa: Wiley-Blackwell, 440 s. ISBN 08-138-1949-0. PITT, J. I., HOCKING, A. D., 2009: Fungi and food spoilage. New York: Springer, 519 s. ISBN 03-879-2206-7. PRASAD, N. K., 2011: Enzyme Technology : Pacemaker of Biotechnology. PHI Learning Pvt. Ltd., 360 s. ISBN 81-203-4239-9. RENNENBERG, R., 2008: Biotechnology for Beginners.Elsevier, 349 s. ISBN 0123735815. ROBERTS, T. A., 2005: Microorganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. 2. vyd. Springer, 776 s. ISBN 03-872-8801-5. ROBINSON, R. K., 2005: Dairy microbiology handbook. New York. ISBN 9780471723950, 9780471385967. URL: http://dx.doi.org/10.1002/0471723959.

56

ROGINSKI, H., FUQUAI, J. W., FOX, P. F., 2003: Encyklopedia of Dairy Science. New York: Academic Press, 2799 s. ISBN 01-222-7235-8. ROPARS, J., CRUAUD, C., LACOSTE, S., DUPONT, J., 2012: A taxonomic and ecological overview of cheese fungi. International Journal of Food Microbiology. 155: 199-210 s. SATYANARAYANA, T., KUNZE, K., 2009: Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. Springer, 744 s. ISBN 14-020-8292-4. SENGUN, Y. I., YAMAN, D. B., GONUL, S. A., 2008: Mycotoxins and mold contamination in cheese: a review. World Mykotoxin Journal. (3): 291-298 s. SIMPSON, B. K., NOLLET, L. M. L., TOLDRÁ, F., BENJAKUL, S., PALIYATH, G., HUI, Y. H., 2012: Food Biochemistry and Food Processing. 2. vyd. John Wiley Blackwell, 912 s. ISBN 978-0-8138-0874-1. SPERBER, W. H., DOYLE, M. P., 2009: Compendium of the Microbiological Spoilage of Foods and Beverages. New York: Springer, 367 s. ISBN 14-419-0826-9. STANDAROVÁ E., NECIDOVÁ L., DUŠKOVÁ M. 2011: Živná média pro stanovení a kultivaci plísní a kvasinek izolovaných z mléčných výrobků. Mlékařské listy. 128: 10-12 s. ŠILHÁNKOVÁ, L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. TAYLOR, A. J., LINFORTH, R. S. T., 2010: Food Flavour technology. 2. vyd. Willey-Blackwell, 376 s. ISBN 14-443-1778-4. TAMIME, A. Y., 2006: Fermented milks. Oxford: Blackwell Science/SDT, 262 s. ISBN 0-632-06458-7. TAMIME, A. Y., 2007: Structure of Dairy Products. Blackwell Publishing, 304 s. ISBN 04-709-9591-2.

57

TEWARI, J. P., 2009: Veterinary mycology. Veterinary Science. Databáze online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://www.eolss.net/Sample-Chapters/C10/E5-15A25.pdf VELÍŠEK, J., 2009: Chemie potravin. 3. vyd. Tábor: OSSIS, 623 s. ISBN 978-8086659-17-6. VLKOVÁ, E., RADA, V., KILLER, J., 2006: Potravinářská mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 168 s. ISBN 80-213-1583-0. WALSTRA, P., WOUTERS J. T., GEURTS, T., 2006: Dairy Science and Technology. 2. vyd. CRC/Taylor, Boca Raton, 782 s. ISBN 08-247-2763-0. WEIDENBÖRNER, M., 2001: Encyclopedia of food mycotoxins. New York: Springer, 294 s. ISBN 35-406-7556-6. WHITEHURST, R. J., OORT, M., 2009: Enzymes in Food Technology. 3. vyd. Willey-Blackwell, 384 s. ISBN 14-443-0994-3.

5.1 Internetové zdroje

ALLPOSTERS, 2012: Penicillium roqueforti. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://www.allposters.co.uk/-sp/Penicillium-Roqueforti-Is-a-Fungus-Which-ProducesBlue-Cheese-Hyphae-and-Spores-are-Shown-Posters_i6016117_.html ADIPOGEN, 2013: Roquefortine C. Online [cit. 29. 1. 13]. Dostupné na: http://www.adipogen.com/ag-cn2-0002/roquefortine-c.html CURDNERD, 2012: Camembert. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://curdnerd.wordpress.com/category/camembert/

58

DIJITALIMAJ, 2012: Penicillium nalgiovensis. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na:

http://www.dijitalimaj.com/alamyDetail.aspx?img=%7B81D6C8AF-4156-44FE-

BCC0-137E930A896D%7D ENCYKLOPEDIA OF LIFE, 2013: Byssochlamys nivea. Online [cit. 6. 3. 13]. Dostupné na: http://eol.org/pages/21320/overview GURMETKLUB, 2013: Cambozola. Online [cit. 30. 1. 13]. Dostupné na: http://www.gurmetklub.cz/test-cambozola.html INOVAČNÍ PODNIKÁNÍ, 2013: Olomoucké tvarůžky. Online [cit. 5. 2. 13]. Dostupné na : http://www.inovacnipodnikani.cz/aktuality/dusevni-vlastnictvi/?id=65 KUCHENGOTTER, 2012: Roquefort. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://www.kuechengoetter.de/rezepte/warenkunde/13336/Roquefort.html MERCK CHEMICAL, 2013: 2-nonanon. Online [cit. 5. 2. 13]. Dostupné na: http://www.merckmillipore.com/czech-republic/2-nonanon/MDA_CHEM818790/p_oNeb.s1LD_gAAAEWheEfVhTl MERCK CHEMICAL, 2013: 2-heptanon. Online [cit. 5. 2. 13]. Dostupné na: http://www.merckmillipore.com/czech-republic/2-heptanon/MDA_CHEM818711/p_oNeb.s1LD_gAAAEWheEfVhTl MICROBEOFTHEWEEK, 2013: Saccharomyces cerevisiae. Online [cit. 3. 3. 13]. Dostupné na: http://yourweeklymicrobe.blogspot.cz/2011/04/yeast-leader-in-libationsking-of.html MICROFUNGI, TRUMAN STATE UNIVERSITY, 2012: Penicillium commune. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://microfungi.truman.edu/index.php MURRAYS, 2013: Cambozola. Online [cit. 30. 1. 13]. Dostupné na: http://www.murrayscheese.com/cambozola-black-label.html NCYC, . 2013: Williopsis saturnus var. saturnus. Online [cit. 7. 3. 13]. Dostupné na: http://www.ncyc.co.uk/print-photo-ncyc-CBS5761A.html

59

OLIVEFIGGRAPE, 2013: Labneh. Online [cit. 7. 2. 13]. Dostupné na: http://olivefiggrape.blogspot.cz/2009/07/labneh-love-letter.html POBIOEGLOOS, 2007: Candida utilis. Online [cit. 3. 3. 13]. Dostupné na: http://pobio.egloos.com/3894241 RUDYPAV, 2012: Penicillium roqueforti. Online [cit. 12. 11. 12]. Dostupné na: http://rudypav.blogspot.cz/2012/08/penicilinum-roqueforti.html WIKIPEDIE, 2013: Cyclopiazonic acid. Encyklopedie online [cit. 29. 1. 13]. Dostupné na: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Cyclopiazonic_acid.svg WIKIPEDIE, 2013: Romadur. Encyklopedie online [cit. 5. 2. 13]. Dostupné na: http://cs.wikipedia.org/wiki/Romadur WIKIPEDIE, 2013: Životní cyklus kvasinek. Encyklopedie online [cit. 4. 2. 13]. Dostupné na: http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Zivotnicykluskvasinky.P

60

6

SEZNAM OBRÁZKŮ

Obrázek č. 1 - Stavba Penicillium roqueforti (str. 9) Obrázek č. 2 - Penicillium roqueforti (str. 13) Obrázek č. 3 - Elektronová mikroskopie plísně Penicillium camemberti tvořící sekundární mikroflóru sýrů typu Camembert a Brie (str. 14) Obrázek č. 4 - Penicillium nalgiovensis (str. 15) Obrázek č. 5 - Schematické znázornění změn, ke kterým dochází v průběhu zrání sýru Camembert v důsledku růstu Penicillium camemberti na povrchu (str. 17) Obrázek č. 6 - Methylketony (str. 18) Obrázek č. 7 - Zjednodušené schéma rozkladu kaseinu (str. 19) Obrázek č. 8 - Výrobní schéma sýru Roquefort (str. 21) Obrázek č. 9 - Sýr Roquefort (str. 21) Obrázek č. 10 - Výrobní schéma sýrů Camembert a Brie (str. 24) Obrázek č. 11 - Sýr Camembert (str. 24) Obrázek č. 12 - Sýr Cambozola (str. 25) Obrázek č. 13 - Penicillium commune (str. 28) Obrázek č. 14 - Byssochlamys nivea (str. 28) Obrázek č. 15 - Kyselina cyklopiazonov (str. 30) Obrázek č. 16 - Roquefortin C (str. 31) Obrázek č. 17 - Životní cyklus kvasinek (str. 33) Obrázek č. 18 - Debaryomyces hansenii (str. 38) Obrázek č. 19 - Sýr Romadur (str. 38) Obrázek č. 20 - Candida utilis (str. 39) Obrázek č. 21 - Olomoucké tvarůžky (str. 39) Obrázek č. 22 - Elektronová mikroskopie sýru zrajícího od povrchu zobrazující růst Geotrichum candidum (2 µm) (str. 41) Obrázek č. 23 - 2-nonanon (str. 43) Obrázek č. 24 - 2-heptanon (str. 43) Obrázek č. 25 - Saccharomyces cerevisiae (str. 46) Obrázek č. 26 - Jogurtový sýr Labneh (str. 46)

61

Obrázek č. 27 - Williopsis saturnus var. saturnus (str. 48) Obrázek č. 28 - Znázorněný růst plísně Penicillium roqueforti na agaru DRBC a DG 18 (str. 49) Obrázek č. 29 - Znázorněný růst kvasinky Saccharomyces cerevisiae na agaru DRBC a DG 18 (str. 50) Obrázek č. 30 - Znázorněný růst kvasinky Geotrichum candidum na sladinovém a GKCH agaru (str. 50)

62

7

SEZNAM TABULEK

Tabulka č. 1 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných plísní (str. 11) Tabulka č. 2 - Přehled některých významných sýrů s plísní v těstě (str. 22) Tabulka č. 3 - Přehled některých významných sýrů s plísní na povrchu (str. 25) Tabulka č. 4 - Taxonomický a fylogenetický přehled výskytu plísní izolovaných ze sýrů (str. 26) Tabulka č. 5 - Přehled některých mykotoxinů produkovaných plísněmi izolovaných ze sýrů (str. 29) Tabulka č. 6 - Taxonomické rozdělení potravinářsky významných kvasinek (str. 34) Tabulka č. 7 - Složení médií pro kultivaci plísní a kvasinek (str. 51)

63