Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

Diplomová práce

Syndrom polycystických ovárií (PCOS) u žen – výsledky IVF

Vedoucí práce:

Vypracoval:

prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc.

Eva Blahová

Brno 2010

1

Mendelova univerzita v Brně Ústav chovu a šlechtění zvířat

Agronomická fakulta 2009/2010

ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autorka práce:

Eva Blahová

Studijní program:

Zemědělské inženýrství

Obor:

Všeobecné zemědělství

Název tématu:

Syndrom polycystických ovárií (PCOS) u žen - výsledky IVF ca 45 stran, 15 tabulek, 5 grafů

Rozsah práce:

Zásady pro vypracování: 1.

Studium doporučené literatury a zpracování jejího přehledu

2.

Získávání a vyhodnocení podkladů k hodnocení kvality oocytů u žen

3.

Periodické zpracovávání vzorků

4.

Vyhodnocení frekvence výskytu REM po IVF

5.

Vyhodnocení úspěšnosti použití IVF

6.

Vyhodnocení dosažených výsledků statistickými metodami

7.

Sepsání diplomové práce podle pokynů vedoucího DP a její předání k oponentuře

Seznam odborné literatury: 1.

VĚŽNÍK, Z. Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy. Brno: VÚVel Brno, 2004. 192 s.

2.

HÁJEK, Z. Rizikové a patologické těhotenství. Praha: Grada Publishing a.s., 2004. 444 s. ISBN 80-247-0418-8.

3.

Odborné časopisy a příspěvky v elektronické podobě např.Časopis ženských lékařů Gynekolog, atd.

Datum zadání diplomové práce:

říjen 2007

Termín odevzdání diplomové práce:

duben 2010

Eva Blahová Autorka práce

prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vedoucí práce

prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vedoucí ústavu

prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU

2

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Syndrom polycystických ovárií (PCOS) u žen – výsledky IVF vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

Dne ………………………………………. Podpis diplomanta ……………………….

3

Děkuji prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, DrSc. za odborné vedení diplomové práce, rady a připomínky. Děkuji prof. MUDr. Zdeňkovi Malému, CSc., přednostovi kliniky Unica spol. s r. o. za poskytnutá data.

4

Děkuji Ing. Radkovi Filipčíkovi, Ph.D. za pomoc při statistickém vyhodnocení výsledků.

ABSTRAKT Práce je zaměřena na ženy se syndromem polycystických ovárií z pohledu neplodnosti a léčby pomocí asistované reprodukce – IVF. V navazujících kapitolách jsou hodnoceny jednotlivé sledované parametry související s léčbou neplodnosti. Sledovaný soubor PCOS je porovnán a zhodnocen se souborem kontrolním, který zahrnuje ženy, které byly léčeny v programu asistované reprodukce z jiných příčin než je syndrom polycystických ovárií. Materiálem pro tuto diplomovou práci byl soubor 477 pacientek, které se léčily pomocí IVF na klinice Unica v letech 2006 – 2008. Analýza byla zaměřena na počet získaných oocytů při punkci ovariálních folikulů, jejich kvalitu z pohledu zralosti oocytů, fertilizaci oocytů pomocí mikromanipulační techniky ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie), počet embryí, chemická gravidita, klinická gravidita, pokračující těhotenství a následný porod. V závěru práce jsou zhrnuty výsledky a popsány zjitěné skutečnosti. Z rozboru dat lze řící, že ženám se syndromem polycystických ovárií přináší léčba IVF velmi dobré výsledky v počtu dosažených gravidit a je v mnoha případech jediným řešením naplnění touhy po vlastním dítěti.

Klíčová slova: neplodnost, syndrom polycystických ovárií, oocyt, ICSI, gravidita.

5

ABSTRACT This work is focused on women with polycystic Ovary Syndrome from the perspective of infertility and treatment with assisted reproduction (in vitro fertilzation) - IVF. The next chapters are evaluated each reference parameters associated with treatment of infertility. The watched set of PCOS is reviewed and compared with the control group, which includes women who were treated in a program of assisted reproduction, causes other than polycystic ovary syndrome (non-PCOS Women). Material for this thesis was a set of 477 patients that were treated by IVF at the clinic Unica in 2006-2008. The analysis focused on the number of oocytes retrieved during puncture of ovarian follicles, their quality, fertilization of oocytes by micromanipulation techniques ICSI (intracytoplasmic sperm injection), the number of embryos, a chemical pregnancy rate, clinical pregnancy rate, ongoing pregnancy rate and the subsequent birth. Described findings and results are included in the end. An analysis of data, we can say, that women with PCOS IVF treatment brings excellent results achieved in the number of pregnancies and in many cases the only solution to fulfill the desire for their own child.

Keywords: infertility, polycystic ovary syndrome, oocytes, ICSI, pregnancy

6

OBSAH 1 ÚVOD

10

2 CÍL PRÁCE

11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED

12

3.1 Ženské reprodukční orgány – ovaria, děloha, vejcovody

12

3.1.1 Ovaria

12

3.1.2 Děloha

15

3.1.3 Vejcovody

16

3.2 Vývoj a zrání oocytů (oogeneze)

16

3.2.1 Prenatální a postnatální vývoj oocytů

16

3.2.1.1 Prenatální vývoj oocytů

16

3.2.1.2 Postnatální vývoj oocytů

17

3.2.2 Zrání a morfologie oocytu

17

3.2.2.1 Zrání oocytu (meioza)

17

3.2.3 Morfologie oocytu

21

3.3 Spermatogeneze a morfologie spermie

24

3.3.1 Spermatogeneze

24

3.3.2 Morfologie spermie

26

3.3.3 Morfologické metody vyšetření spermatu

27

3.4 Oplození (fertilizace)

30

3.5 Blastogeneze

31

3.5.1 Rýhování

32

3.5.2 Implantace a nidace

33

3.5.3 Fáze embryonálního vývoje

33

3.6 Ženská neplodnost

34

3.6.1 Léčba ženské neplodnosti v programu asistované reprodukce 3.7 Syndrom PCOS

34 36

3.7.1 Známky a symptomy PCOS

37

3.7.2 PCOS a plodnost

38

3.8 Metody asistované reprodukce – oplození in vitro 7

39

3.8.1 Laboratorní techniky IVF

39

4 MATERIÁL A METODIKA

40

4.1 Materiál

40

4.2 Metodika

41

4.2.1 Stimulace vaječníků

41

4.2.2 Punkce ovariálních folikulů

42

4.2.3 Příprava spermií pro IVF

42

4.2.4 Embryologické metody asistované reprodukce

44

4.2.5 Kultivace embryí v asistované reprodukci

45

4.2.6 Hodnocení kvality embryí

46

4.2.7 Potvrzení těhotenství

49

5 VÝSLEDKY

50

5.1 Průměry a statistické vyhodnocení sledovaného souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) v porovnání s kontrolním souborem žen

50

5.1.1 Průměrné hodnoty a statistické zhodnocení rozdílu průměrného věku mezi sledovaným souborem žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) a kontrolním souborem (175 žen vs. 302 žen) žen

50

5.1.2 Statistické zhodnocení rozdílu procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií v ejakulátu mužů v souboru PCOS a kontrolního souboru (175 mužů vs. 302 mužů)

51

5.1.3 Statistické zhodnocení rozdílu počtu získaných oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen)

53

5.1.4 Statistické zhodnocení počtu zralých oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen)

54

5.1.5 Statistické zhodnocení počtu oplozených oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen) 55 5.1.6 Statistické zhodnocení počtu embryí na transfer u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 transferů vs. 302 transferů)

57

5.1.7 Průměrné hodnoty gravidit a porodů ve sledovaném souboru PCOS vs. kontrolní

58 8

5.2 Průkaznosti sledovaných hodnot souborů PCOS a kontrolního

62

6 DISKUZE

65

7 ZÁVĚR

68

8 SEZNAM LITERATURY

71

9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ

74

9.1 Seznam obrázků

74

9.2 Seznam tabulek

74

9.3 Seznam grafů

75

9

1 ÚVOD Syndrom polycystických ovarií (PCOS) je poměrně časté endokrinní onemocnění u žen ve fertilním věku, které je charakterizováno anovulací, infertilitou a hyperandrogenismem. Klíčovým faktorem patogeneze PCO je inzulínová rezistence. Mezi PCOS a syndromem inzulínové rezistence je řada podobností. Ženy se syndromem polycystických ovárií májí významně vyšší riziko rozvoje diabetes mellitus 2. typu a kardiovaskulárních chorob. Je zřejmě jedním z nejčastějších endokrinních onemocnění žen ve fertilním věku. PCOS je stav, při kterém jsou ovaria zvětšena s hladkou, ale zbytnělou povrchovou membránou. Povrch pokrývá velké množství cyst, které samy o sobě nejsou nebezpečné, ale mohou být příčinou amenorhey nebo oligomenorhey a následně neplodnosti. Neplodností trpí v naší populaci asi 12 % párů, která zahrnuje i páry, které tvoří ženy se syndromem polycystických ovárií a představuje významný problém z hlediska psychologického, medicínského, společenského i finančního. Řešením pro tyto ženy, které chtějí mít vlastní dítě je léčba pomocí asistované reprodukce (IVF).

10

2 CÍL PRÁCE Práce je zaměřena na výskyt syndromu polycystických ovárií (PCOS) u žen v souvislosti s léčbou pomocí in vitro fertilisatio (IVF) - oplozením vajíčka mimo organismus a následný přenos vzniklých embryí do dělohy. Cílem diplomové práce je porovnat úspěšnost léčby pomocí asistované reprodukce u žen s PCOS ve srovnání s ženami, které se léčí pro jinou příčinu neplodnosti. Práce je zaměřena především na neplodnost ze strany ženy. Faktor neplodnosti ze strany muže je zde zmíněn a vyhodnocen jen okrajově. V práci jsou hodnoceny následující parametry: věk žen, počet a kvalita oocytů z hlediska zralosti (fáze MII), jejich fertilizace, morfologie spermií u mužů - partnerů, počet transferovaných embryí, počet gravidit, průběh gravidit a následný porod.

11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Ženské reprodukční orgány – ovaria, děloha, vejcovody

3.1.1 Ovaria

Ovaria jsou reprodukční orgány mandlovitého tvaru, umístěné po obou stranách dělohy na bočních stěnách malé pánve. Ovaria produkují estrogen a progesteron, hormony odpovědné za sekundární pohlavní znaky a řízení průběhu těhotenství (Moore, 1998).

Ovariální cyklus

Cyklické změny na ováriu vyvolávají folikulostimulační hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH). FSH podporuje vývoj ovariálních folikulů a produkci estrogenů ve folikulárních buňkách. LH slouží jako „spouštěč“ ovulace (uvolnění sekundárního oocytu) a stimuluje folikulární buňky a žluté tělísko k produkci progesteronu. Oba tyto hormony též podporují růst endometria (Moore, 1998). Histologicky lze rozeznat ve zralém folikulu několik útvarů. Vajíčko na povrchu s homogenním obalem – zona pellucida. Kolem vajíčka se řadí folikulární buňky do několika vrstev, ve kterých se tvořit dutiny vyplněné tekutinou, které později splynou v dutinu jedinou folikulární (antrum folliculi). Tekutinou jsou folikulární buňky zatlačeny na periferii. Kolem vajíčka se nakupí několika vrstev granulózových buněk. Současně s kavitací se diferencuje vazivové stroma kolem folikulu. Tuto diferenciaci řídí folikulostimulační hormon (FSH), luteinizační hormon (LH) a signály z vajíčka. Vrstvu folikulárních buněk odděluje od vazivových obalů membrána (theca folliculi). Zralý folikul má přes 20 mm a zráním se mění jeho poloha v kůře ovaria. Zralý folikul (Graafův folikul) se tlačí k bílé slupce (tunica albuginea) tvořící povrch ovaria, kterou nadzvedává. Na povrchu ovária se vytváří zřetelný hrbol.

12

Velikost folikulu se dá přesně změřit pomocí ultrazvukového vyšetření (folikulometrie). Ovulace nastává v pravidelném cyklu u ženy 12. až 14. den od prvního dne poslední menstruace. Po ovulaci se vajíčko dostává do vejcovodu. Po odtoku folikulární tekutiny tlakem okolních tkání dutina folikulu kolabuje. Z popudu FSH se na místě folikulu vytvoří proliferační stádium žlutého tělíska. Z periferie vrůstá mezi luteální buňky vazivo, krevní a mízní cévy, které se bohatě větví – stádium vaskularizační, to přechází ve stádium sekreční. Vrcholu sekreční činnosti dosahuje žluté tělísko asi 20. až 22. den cyklu, tj. asi šest dní po ovulaci. Kromě malého množství estrogenů produkuje zejména progesteron. Je-li vajíčko v době ovulace oplodněno, mění se menstruační žluté tělísko (corpus luteum menstruationis) v těhotenské žluté tělísko (corpus luteum graviditatis). Činnost žlutého tělíska v menstruačním cyklu trvá šest dní, zcela ustává za osm dní. Vytvoří se jizva, která se projeví vtažením tkáně vaječníku a vznikne bílé tělísko (corpus albicans).

Ovariální cyklus má dvě fáze: -

fázi folikulární, která trvá 12 – 14 dní a zraje v ní folikul, tvořící především estrogenní (folikulární) hormony

-

fázi luteální, ve které žluté tělísko produkuje hormon progesteron a malá množství estrogenů (Kobilková, 2005).

13

Obr. 1: Morfologie ovaria Zrání folikulu Folikuly v kůře ovária rostou autonomně bez stimulace hypofyzárních hormonů asi do 10 let. Ovarium v dětském věku je necitlivé na gonadotropiny, protože vazebná místa jak pro FSH, tak pro LH jsou inaktivní. Autonomně může růst primordiální folikul do stádia primárního folikulu (Trávník, 2009). Druhou fází růstu je stimulace FSH v pubertě. Folikuly vyzrávají do folikulu II. a III. řádu. V kůře ovaria je neustálý pohyb. Jedny folikuly rostou, jiné zanikají. Folikuly v kůře ovaria rostou stimulací hypofyzárních hormonů. Hypofýza má dvě části: přední lalok a zadní lalok. Přední lalok hypofýzy (adenohypofýza) obsahuje tři druhy buněk, které se od sebe histologicky liší: buňky bazofilní, eozinofilní a buňky chromofobní. Bazofilní buňky jsou zdrojem látek, které řídí cyklické děje v ovariu. Produkují dva gonadotropní hormony, které jsou bílkovinné povahy, chemickým složením glykoproteiny: folikulostimulační hormon (FSH), luteinizační hormon (LH) a prolaktin (PRL), hormon luteotropní. Gonadotropní hormony, FSH a LH, se tvoří pod kontrolou hypotalamických hormonů. Jsou uloženy v buňkách hypofýzy v sekrečních granulých. Granule se dostávají k buněčné membráně, přes ní do perikapilárních prostor a dále do krve.

14

Nejsou vázány na proteinové nosiče. FSH stimuluje primordiální a primární folikul v ovariu. Účinkem se vytváří ve folikulu dutina (antrum). Podpoří k proliferaci folikulární buňky. Luteinizační a folikulostimulační hormon působí na folikul ovaria společně. Gonadotropiny stimulují činnost buněk vnitřní vazivové vrstvy (theca interna) a buněk mezi folikuly (intersticia), které vytvářejí estrogeny. Oba hormony se podílejí na ovulaci a na jeho změnách po ovulaci. Tyto hormony cirkulují v těle, mají však schopnost vazby jen na určité tkáně a buňky, váží se na receptory cílových tkání. V cytoplazmě buněk ovaria se vytvoří hormon-receptorový komplex, který putuje do jádra buňky, ve kterém vyprovokuje řadu biochemických procesů. V souhře má však své místo i oocyt. Existuje určitá interakce mezi oocytem a folikulárními buňkami (Kobilková, 2005).

Obr. 2: Ovariální cyklus

15

3.1.2 Děloha

Děloha je silnostěnný svalový orgán hruškovitého tvaru, jehož velikost kolísá v poměrně širokém rozmezí. Děloha je v průměru 7 – 8 cm dlouhá, ve své horní části 5 – 7 cm široká a její tloušťka činí 2 – 3 cm. Skládá se ze dvou hlavních částí: z těla (corpus), tvořící horní dvě třetiny a z krčku (cervix), cylindrické třetiny dolní. Stěnu děložního těla tvoří tři vrstvy: perimetrium, tenká vrstva zevní, myometrium, silná vrstva hladké svaloviny a endometrium, tenká vrstva vnitřní. Hormony vylučované ovariálním folikulem a žlutým tělískem (estrogen a progesteron) provokují cyklické změny endometria (Moore, 1998).

3.1.3 Vejcovody

Vejcovody, o průměru 1 cm a délce 10 - 12 cm, odstupují od děložních rohů. Vejcovody přepravují oocyty z ovárií a spermie z uteru k místu oplození v ampule vejcovodu. Tuba též dopravuje dělící se zygotu do dělohy. Oba vejcovody ústí proximálně do děložních rohů a opačnými konci do peritoneální dutiny (Moore, 1998).

3.2 Vývoj a zrání oocytů (oogeneze) Oogenezí nazýváme běh událostí, jimiž se primitivní zárodečná buňka zvaná oogonie transformuje ve zralý oocyt. Tento maturační proces začíná před narozením a končí dosažením pohlavní zralosti v pubertě. Ženské pohlavní buňky vajíčka čili oocyty se vyvíjí v ováriu. Vývoj vajíček probíhá analogickým způsobem. Vývoj vajíček začíná již v období embryonálním množením kmenových buněk oogonií (Moore, 1998).

3.2.1 Prenatální a postnatální vývoj oocytů

3.2.1.1 Prenatální vývoj oocytů

16

V embryonálním ováriu se tvoří oogonie. Jejich dělení dává vzniknout oocytům I. řádu, které jsou obaleny jednou vrstvou folikulárních buněk a spolu tvoří primordiální folikul. Oocyt prvního řádu zastaví své dělení v tzv. diplotenním stádiu což je profáze prvního zracího dělení. Kdy jsou homologní chromosomy odděleny, jádro vstupuje do klidového stádia. V tomto stádiu zůstávají oocyty až do zahájení puberty. Výskyt prvních buněk byl poprvé popsán na začátku 3. týdne vývoje embrya ve žloutkovém váčku, odkud v průběhu asi 14 dní putují cestou dorsálního mesenteria k základům pohlavních žláz. Ještě u embryí starých 6 týdnů jsou aktivně améboidně pohyblivé a přeměňují se v oogonie, které jsou v této době přítomny v počtu kolem 26 000. Jejich množství vzroste na asi 250 000 v 9. týdnu vývoje plodu, kdy cestují nediferencované buňky do kůry vyvíjejícího se ovaria. Ve 12. týdnu tvoří oogonie skupiny synchronních mitóz. Vzniku oocytů tedy předchází vlna proliferace oogonií, která automaticky přechází do profáze meiózy. Liší se od ostatních mitóz rytmickým průběhem a silnou synchronizací. Oogonie zůstávají spojeny cytoplazmatickými můstky. Po ukončení proliferační fáze proběhne v oocytech poslední, premeiotická S-fáze. Ve 13. týdnu jsou v kůře početné oocyty, které vstoupily do profáze meiózy. Na počátku 5. měsíce se v kůře vytváří zóna obsahující skupiny oocytů, které vstoupily do tvorby folikulů. Meióza se přerušuje v diplotenní fázi, kdy jsou homologní chromosomy odděleny a jen v místech s chiasmaty zůstávají spojeny. Jádro vstupuje do klidového stadia a oocyt zformuje spolu s folikulárními buňkami po ukončení diplotenního stadia primordiální folikul. Mezi 6. - 7. měsícem vývoje je primordiálními folikuly rovnoměrně obsazena celá kůra. Během proliferace oogonií a leptotenního a pachytenního stadia dochází k úbytku pohlavních buněk, jen část se stává součástí folikulů, k dalšímu poklesu počtu dochází do porodu, kdy zůstávají 1 až 2 miliony primordiálních folikulů (Trávník, 2009).

3.2.1.2 Postnatální vývoj oocytů

Postnatálně ještě před zahájením puberty folikuly s oocyty zanikají a při dosažení pohlavní zralosti se jejich počet pohybuje okolo 200 000 v každém ováriu.

17

Folikulogeneze patří do postnatální fáze vývoje oocytu. Je založena na proliferaci buněk a cytodiferenciaci. Jde u ženy o dlouhý proces, který potřebuje asi jeden rok, aby se primordiální folikul vyvinul do ovulačního stadia (Trávník, 2009).

3.2.2 Zrání a morfologie oocytu

3.2.2.1 Zrání oocytu (meioza)

Meióza zajišťuje konstantní počet chromosomů a je důležitou součástí zrání oocytu. Je důležitým zdrojem diverzity genomu. Mezi meiotickými děleními již nedochází k S-fázi (chybí syntéza DNA) a jejím výsledkem jsou 4 buňky s haploidním počtem (u člověka 23) chromosomů, každá z nich obsahuje bezprostředně po ukončení meiózy II 1n množství DNA. Je to způsob dělení, při němž probíhá meiotické dělení – meióza I a meióza II (Trávník, 2009).

Meióza I

Profáze I Během profáze se homologní chromosomy párují a za účasti kohesinů formují synaptonemální komplexy, které spojují sesterské (pocházející od téhož rodiče) chromatidy, zatímco nesesterské chromatidy vytvářejí chiasmata. Párované chromosomy se nazývají bivalenty, každý obsahuje jeden chromosom otcovského a jeden mateřského původu a je složen ze čtyř chromatid (tetráda). Profáze I probíhá ve čtyřech fázích: -

Leptotene = dochází ke kondenzaci chromozomů a jejich párování.

-

Zygotene = formuje se synaptomenální komplex, (viz obr. 3a ).

-

Pachytene = je ukončena synapse, objevují se rekombinační uzlíky, jeden nebo několik, reprezentující body crossing over. Obsahují emzymy potřebné pro rekombinaci a opravu DNA.

18

Obr. 3: a) Zygotene -

b) Pachytene

Diplotene = rekombinace DNA je hotová, synaptonemální komplex se začíná rozvolňovat.

Prometafáze I Mizí jaderný obal, formují se kinetochory a připojují chromosomy k mikrotubulům dělícího vřeténka tak, aby se obě sesterské chromatidy dostaly k jednomu pólu.

Metafáze I Bivalenty, každý složený ze dvou chromosomů (čtyř chromatid) vytvářejí metafázovou ploténku. Jejich orientace vzhledem k pólům dělicího vřeténka je náhodná, takže pravděpodobnost, že otcovský nebo mateřský chromosom přejde do jedné nebo druhé budoucí buňky je stejná.

Anafáze I Kohesiny uvolní chiasmata, chiasmata se oddělí, chromosomy (každý složený ze dvou sesterských chromatid – avšak změněných v důsledku crossing over) se pohybují k opačným pólům.

Telofáze I

19

Pokud jde o meiózu v průběhu spermatogenezy, zformuje se jaderný obal, u oogeneze přechází rovnou do meiózy II.

Cytokinéza Je podobná mitóze, při spermatogeneze se vytvoří dvě rovnocenné buňky, při oogeneze oocyt II řádu a 1. pólocyt. Výsledkem meiózy I jsou dvě buňky s haploidním počtem chromosomů. Každý chromosom obsahuje dvě chromatidy.Chromatidy nejsou rovnocenné, protože došlo k výměně částí chromatid při crossing over (Trávník, 2009).

Meióza II

Cytokinéza není následována S-fází a následuje meióza II, která má obdobné fáze jako mitóza. V anafázi II se oddělí sesterské chromatidy a jako samostatné chromosomy putují v telofázi k opačným pólům dělícího vřeténka. Při meióze II vznikají z každé buňky dvě haploidní dceřiné, v nichž každý chromosom je složen z jedné chromatidy (obsah DNA je 1n). Během preantrální periody vzroste průměr primárního foliulu z 25 na 120 µm, což souvisí s reaktivací genomu oocytu. Jsou aktivovány geny pro proteiny zona pellucida. Tyto proteiny začínají vytvářet na povrchu oocytu zonu. Vytvářejí se spojení (gap junctions) mezi oocytem a folikulárními buňkami. Pík LH (luteinizační hormon) vyvolá 1. zrací dělení – výsledkem je oocyt v metafázi II. Po oplození dojde k dokončení meiózy II Po dokončení meiózy II a po oplození oocytu spermií, dochází k dělení (rýhování) embrya. Nastává mitóza buněk - normální buněčné dělení (Trávník, 2009).

20

Obr. 4: Meióza a normální buněčné dělení (mitóza)

21

3.2.3 Morfologie oocytu

Oocyt je samičí pohlavní buňka, která vzniká na vaječnících postupným zráním Graafova folikulu. V přirozeném cyklu ženy nastává ovulace, prasknutí Graafova folikulu a uvolnění zralého vajíčka (stádium MII), schopného oplození.

Při léčbě IVF jsou vaječníky ženy stimulovány pomocí gonadotropinů. Při hormonální stimulaci dochází k růstu více folikulů na obou vaječnících. Po odběru vajíček při léčbě IVF je možné najít vajíčka (oocyty) v různém stádiu zralosti. Vajíčko (oocyt) je obklopeno kumulárními buňkami (corona radiata).

Obr. 5: Vajíčko obklopené kumulárními buňkami Po denudaci (mechanickém očištění vajíčka) se hodnotí zralost oocytu. Pro IVF se použijí jen oocyty ve stádiu MII, tedy oocyt s vyděleným pólovým tělískem v perivitelinním prostoru. Stádia oocytů (vajíček) získaných po punkci ovariálních folikulů: GV (Germinal Vesicle) – plně nezralé vajíčko (se zárodečným váčkem) Zárodečný váček – je meioticky nezralý uprostřed nebo na okraji ooplazmy je sférický, obsahuje velké refraktilní jadérko (nucleolus) Ooplazma – je tmavá, granulovaná a nepravidelného tvaru.

22

Obr. 6: Plně nezralé vajíčko (GV) GVBD (Germinal Vesicle Break Down) – fáze MI, vajíčko v půli nebo těsně před ukončením procesu dozrání (ve stádiu metafáze I. Zárodečný váček – již není patrný (došlo k jeho breakdownu). Pólové tělísko – ještě není extrudované. Ooplazma – jasná a homogenně granulovaná.

Obr. 7: Vajíčko ve fázi MI

PB (Polar Body) – plně zralé vajíčko s extrudovaným pólovým tělískem s chromosomy ve stadiu metafáze II (MII). Ooplazma - hladká světle zbarvená. Zona pellucida – má 2 jasné vrstvy: vnější porózní, vnitřní kompaktní.

Obr. 8: Plně zralé vajíčko s pólovým tělískem (MII)

23

3.3 Spermatogeneze a morfologie spermie 3.3.1 Spermatogeneze

Vývoj mužských pohlavních buněk – spermií začíná v pubertě a pokračuje celý život, i když v pozdním věku může být kvalita spermií zhoršena. Spermie se vyvíjí v semenotvorných kanálcích varlete z kmenových buněk spermiogonií. V pubertě se začínají kmenové spermiogonie ležící na samé periferii kanálků mitoticky množit. Mitózami kmenových spermiogonií vznikají jednak další kmenové buňky s dlouhým buněčným cyklem, které doplňují populaci kmenových spermiogonií, jednak spermiogonie, které zůstávají v průběhu mitózy spojeny mezibuněčnými můstky zvané spermiogonie typu A. Spermiogonie typu A mají krátký buněčný cyklus, rychle se opakovaně mitoticky dělí v několik populací (klonů), které se liší od kmenových buněk strukturou jádra. Buňky poslední populace (klonu) spermoiogonií A se z bazálních partií kanálků posunují směrem k luminu a vstupují jako spermiogonie typu B do prostorů vytvořených spojením výběžků Sertoliho buněk. Spermiogonie B v kontaktu se Sertoliho buňkami se přestávají mitoticky dělit a vstupují do profáze meiózy, během níž se zvětšují ve velké buňky spermiocyty. Sertoliho buňky jsou mezi sebou spojeny zvláštním typem mezibuněčných těsných kontaktů, specifických pro tyto buňky. Specifické typy mezibuněčných těsných kontaktů Sertoliho buněk tvoří bariéru mezi vyvíjejícími se pohlavními buňkami a intersticiálním prostorem, bariéru krev-pohlavní buňky. Vzhledem k přítomnosti této bariéry nemohou pronikat proteiny produkované vyvíjejícími se pohlavními buňkami do intersticiálního prostoru, odtud do krve a indukovat tvorbu protilátek proti pohlavním buňkám. Porušení bariéry může být příčinou neplodnosti antigenní povahy. Stádium spermiocytů zahrnuje profázi I. zracího dělení. Tímto dělením vzniká další generace buněk zvaných prespermatidy, které již mají haploidní počet chromozomů (23). Po prvním zracím dělení následuje po krátké pauze bez interfáze a bez replikace chromozomů II. zrací dělení, kterým se prespermatidy rozdělí v malé buňky spermatidy, jejichž jádra mají haploidní počet jednoduchých chromozomů a poloviční obsah DNA.

24

Spermatidy zůstávají uloženy na okraji lumina semenoplodných kanálků v záhybech Sertoliho buněk a přeměňují se v bičíkovité buňky spermie. Z jádra spermatidy vznikne hlavička spermie, buněčná organela (dvojice centriolů a mitochondrie) vytvoří krček a bičík, kterým se spermie pohybuje. Největší z váčků Golgiho komplexu se přesune na jádro a jako akrozomální váček povlékne přední dvě třetiny hlavičky spermie. Po dokončení přeměny spermatidy ve spermii se spermie uvolňují z vzájemného spojení odškrcením většiny cytoplazmy v podobě reziduálních tělísek a vstupují do lumina kanálků. Jeden cyklus určitého vývojového stádia trvá přibližně 16 dnů. Vývoj zralé spermie zahrnuje čtyři cykly, tj. přibližně 64 dní. Na spermiogenezi působí hypofyzární folikulostimulační hormon (FSH) a androgeny. Nejvyznamnější z androgenů je testosteron, který vylučují ve varleti Leydigovy intersticiální buňky. Činnost intersticiálních buněk stimuluje hypofyzární luteinizační hormon (LH). Působení LH na intersticiální buňky je podmíněno přítomností specifického receptoru. Testosteron je nezbytný pro přeměnu spermiocytů v prespermatidy a jejich další vývoj. Působení testosteronu na spermogenezi sprostředkují Sertoliho buňky. Na přeměnu spermatid ve spermie působí FSH (Vacek, 2006).

25

Obr. 9: Spermatogeneze 3.3.2 Morfologie spermie Spermie tvoří nejdůležitější složku ejakulátu. Jejich velikost a tvar jsou druhově rozdílné a společným hlavním znakem je pohyblivost a schopnost oplození (Jelínek, 2003). Lidská spermie je 50 - 60 µm dlouhá buňka, 40 - 50 µm z toho připadá na bičík. Skládá se z hlavičky, z bičíku. Na celém povrchu je spermie pokryta buněčnou membránou. Hlavička spermie je zpředu nazad oploštělá, při pohledu zpředu má tvar oválný, při pohledu ze strany hruškovitý. Obsahuje genetickou výbavu spermie. Pod buněčnou membránou na hlavičce spermie je uložen akrozomální váček (akrozom). Obsahuje enzymy uplatňující se při oplození (Vacek 2006). Na povrchu buněčné membrány jsou vázány proteiny a glykoproteiny antigenní povahy, které mají významnou úlohu pro oplozující schopnost spermie. Stabilizují buněčnou membránu nad akrozomálním váčkem a zabraňují předčasnému uvolnění enzymů

26

z akrozomálního váčku, chrání spermie před fagocytózou buňkami ženských pohlavních orgánů a zabraňují shlukování spermií v ejakulátu (Vacek, 2006). Bičík spermie představuje pohybové ústrojí spermie. Je spojen s hlavičkou krčkem. Bičík je tvořen spojovacím oddílem, středním oddílem a koncovým (terminálním) oddílem. Střední oddíl spermie je složen z krčku a z tzv. spojovacího oddílu. Spojovací oddíl plní úlohu energetického centra spermie. Jsou v něm nahromaděny mitochondrie zabezpečující energetickou bilanci oxidačními fosforylacemi pro funkci spermie. Na aktivitě mitochondriálních enzymů spermie závisí pohyblivost spermií – motilita (Jelínek, 2003).

Obr. 10: Morfologie spermie

Obr. 11: Řez spojovací částí spermie

Morfologie spermie je jeden z nejdůležitějších parametrů, který se hodnotí před léčbou IVF. A je hlavním kritériem při výběru vhodné spermie použité u metody ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie do cytoplazmy oocytu).

3.3.3 Morfologické metody vyšetření spermatu

Poznatky o morfologii spermií a o morfologických abnormalitách mohou přispět ke zjištění příčin neplodnosti mužů. Využívá se při tom zdokonalené mikroskopické 27

techniky

a

různých

způsobů

barvení.

Laboratornímu,

morfologickému

a

cytochemickému vyšetření musí být podrobeno sperma čerstvé. Všechny pomůcky, které přijdou do styku se spermatem, musí být sterilní, chemické čisté. Roztok k naředění ejakulátu nesmí vyvolat sekundární změny. Nejvhodnější je fyziologický roztok NaCl (Louda, 2001).

Při vzniku vadných spermií se uplatňuje řada vlivů genetických a negenetických (fyzikálně chemických, vliv výživy, toxicko infekčních, vliv věku a další).

Podle místa vzniku se změny spermií rozdělují na primární a sekundární:

Primární změny spermií

Tyto vady vznikají v průběhu spermatogenního cyklu. Patří sem degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě, změny na akrozómu, tvarové změny bičíku a další vývojové anomálie (Louda, 2001).

Sekundární změny spermií

Tyto změny nastávají při dlouhém pobytu spermií v ocasu nadvarlete, dále v průběhu ejakulace, špatnou manipulací s odebraným spermatem, nesprávné přípravě preparátů. Tyto změny jsou projevem kvalitativních změn v semenné plazmě a nesprávného technologického postupu při zpracování spermatu. Patří sem změny hlavičky, změny akrozómu, torze bičíku (Louda, 2001).

Při posuzování morfologických změn na spermiích rozdělujeme patologické formy spermií do následujících skupin:

Vývojové tvarové anomálie degenerativního charakteru

28

Počítáme všechny formy spermií, které se vyvinuly atypicky a nemají normální diferenciaci, hlavičku s akrozómem, spojovací část bičíku a bičík samotný. Nejčastěji jde o atypický tvar hlaviček. Řadíme sem i takové spermie, u nichž se nevytvořil normální bičík, ale místo bičíku pouze vakovitý nebo kyjovitý útvar, dále spermie s dvojitým bičíkem nebo se zdvojenou hlavičkou a jiné. Vyšší procento takto utvářených spermií je ukazatelem vážnější poruchy spermatogeneze (Louda, 2001).

Patologické formy ve tvaru hlaviček

Změny jsou nejčastějšími odchylkami při poruchách spermiogeneze a provázejí nejčastěji vznik generativních nebo zánětlivých procesů ve varlatech. Nejčastěji se vyskytují hlavičky zúžené, hruškovité, abnormálně velké, asymetrické, ovoidní, oválné, dále spermie s abnormální strukturou hlavičky, která může být proláklá, plošná, příliš široká nebo s úzkým klenutím. Všechny tyto změny patří mezi změny primární (Louda, 2001).

Změny na akrozómu

Nejčastější anomálií je akrozóm zbobtnalý. K této změně dochází i při manipulaci se spermatem. Akrozóm obvykle praskne a akrozómová hmota se vylije do prostředí. Mezi další změny vnitřní struktury akrozómu patří kondenzace akrozómové hmoty k přednímu okraji hlavičky, zřasení předních okrajů hlaviček, různé granulace v akrozómové substanci a jiné, které bývají obvykle sekundárního charakteru (Louda, 2001).

Změny v zadní části hlavičky

Jde převážně o změny v nerovné tinktorické schopnosti kalíšku nebo výskyt různých granulačních tělísek (Louda, 2001).

Změny na spojovací části

Rozpoznání těchto změn vyžaduje již poměrně značné zkušenosti a citlivost oka, aby byly zachyceny jemné změny, mezi které patří hlavně zkrácení spojovací části, jejich 29

prodloužení, ztluštění, zúžení, přerušení spojovací části v některém úseku, ve kterém probíhá pouze holé osové vlákno, nebo rozvázání mitochondriální spirály, která se jeví jako vinoucí se nitkový závit (Louda, 2001).

Patologické změny na bičících

Nejčastěji se jedná o stočení bičíku kolem protoplazmatické kapky, obvykle na konci spojovací části bičíku. Může to být stočení bičíku do tvaru houslového klíče, zavinutí bičíku do klubka. Řadíme sem i tzv. Dag-defekt. Tato anomálie je popisována jako změna s dědičnou predispozicí. Dále sem patří abaxiální upevnění bičíku, kdy bičík nevychází ze středu, ale z okraje hlavičky (Louda, 2001).

Nezralé spermie

Jedná se o spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou na krčku – proximální nebo v průběhu spojovací části – distální. Při vyšším výskytu nezralých spermií v ejakulátu je třeba sledovat výskyt dalších vývojových vad (Louda, 2001).

Změny v nukleoplazmě

Tyto změny se posuzují při použití speciálního barvení, znázorňujícího jadernou substanci. Mezi nejčastější změny patří miliární vakuoly při předním okraji hlavičky, makrovakuoly, nepravidelné uspořádání DNA v jádře nebo slabá barevná reakce nukleoplazmy (Louda, 2001).

Obr. 12: Abnormální spermie

30

3.4 Oplození (fertilizace) Po ovulaci je vajíčko zachyceno rozšířeným břišním ústím vejcovodu a za součinnosti rytmických stahů hladké svaloviny vejcovodu a míhání řasinek epitelových buněk sliznice vejcovodu je neseno směrem k děloze. V ampulárním úseku vejcovodu se vajíčka setkávají se spermiemi. Spermie se po setkání s vajíčkem shlukují na jeho povrchu, obráceny hlavičkou směrem k vajíčku a snaží se proniknout mezi folikulárními buňkami corona radiata k zona pellucida. Při proniknutí spermií mezi folikulární buňky jim napomáhá rozrušování

mezibuněčných

kontaktů

enzym

hyaluronidáza,

uvolňován

z akrozomálního váčku, i vlastní bičíkovitý pohyb. Při vazbě spermií k povrchu zona pellucida se uplatňují specifické membránové receptory oocytu, mají charakter glykoproteinů (zona protein, ZP-3). Receptorům oocytu odpovídají molekuly specifického proteinu, zvaného bindin, lokalizované v plazmalemě spermie. Pro řádný průběh akrozomální reakce jsou nezbytné kalciové kationty. Při akrozomální reakci splyne zevní membrána akrozomálního váčku s plazmalemou spermie na vrcholu hlavičky v jednotnou membránu. Ta se rozpadá a aktivované enzymy akrozomálního váčku pronikají do zona pellucida. Hyaluronidáza se uplatňuje zejména při rozrušování mezibuněčných kontaktů folikulárních buněk corona radiata a jejich uvolňovánín ze spojení se zona pellucida. Dalším enzymem je akrozin, který rozpouští zona pellucida a usnadňuje cestu spermií k buněčné membráně oocytu. Hlavička spermie se při pronikání skrze zona pellucida prodlouží ve výběžek pokrytý zbytky membrány a sekretem akrozomálního váčku. Jakmile pronikne spermie do vajíčka, ihned se rozvine kortikální reakce, která zabrání vstupu další spermie do vajíčka. Podstatou kortikální reakce je stabilizace oolemy a přilehlé vrstvy zona pellucida, které se tak stanou nepropustnými, neproniknutelnými pro další spermie. Takto stabilizovaný obal oplozeného vajíčka se nazývá fertilizační membrána. Kortikální reakcí součastně ztrácejí vazebnou schopnost proteinové receptory v zona pellucida, takže nemohou vázat další spermie. Hlavní význam oplození spočívá v obnovení diploidní sady chromozomů (46), z nichž polovina pochází od matky, druhá od otce, a v určení pohlaví nového jedince, jehož vývoj oplozením začíná (Vacek, 2006).

31

3.5 Blastogeneze Blastogeneze zahrnuje časné období vývoje od vzniku zygoty, její rýhování v morulu, přeměnu moruly v blastocystu až po diferenciaci zárodečných listů. Časově se jedná o období začínající několik hodin po oplození až asi dokonce 2 týdne po oplození. Jde o rozdělení umělé, z důvodu didaktických, blastogeneze se netýká jen vývoje vlastního zárodku, pokračuje součastně i diferenciace trofoblastu, utvářejí se základy cévního systému (Vacek, 2006).

3.5.1 Rýhování

Podstatou rýhování je řada po sobě následujících mitóz. Oproti běžné mitóze buněk je však rozdíl v tom, že dceřiné buňky, zvané blastomery, v relativně krátké interfázy po replikaci chromozómů, nenabývají velikosti mateřské buňky a vstupují ihned do další mitózy, takže se postupně zmenšují. Rýhování tak zabezpečuje postupné obnovení velikosti buněk, charakteristický pro příslušný druh živočišné tkáně (Vacek, 2006).

Rýhování lidského vajíčka

Prvním rýhovacím dělením se oplozené vajíčko (zygota) rozdělí na 2 téměř stejné blastomery, uložené uvnitř zona pellucida. Dvoubuněčného stádia je dosaženo za 24-30 hodin po oplození. Čtyřbuněčného stádia je dosaženo asi za 40-50 hodin po oplození. Blastomery do osmi až dvanáctibuněčného stádia jsou od sebe zřetelně odděleny. Mitotickým dělením vznikají další blastomery, součastně se mezi blastomerami v povrchové vrstvě utvářejí těsné mezibuněčné kontakty – vzniká morula, která nabývá kompaktnějšího vzhledu. Až doposud byly všechny blastomery zcela identické. Zatímco blastomery povrchové vrstvy jsou mezi sebou spojeny těsnými kontakty (tight junctions), mezi blastomerami uvnitř útvaru se vytvoří „kanálkovité spojení“ (gap 32

junctions). Rozdíly v propustnosti mezibuněčných kontaktů se uplatňují v prvém pochodu diferenciace. Zevní blastomery se přemění v buňky zevní obalové vrstvy – příští trofoblast, blastomery uvnitř útvaru vytvoří vnitřní buněčnou masu – příští embryoblast. Obě dvě tkáně se liší strukturou, funkcí i genovou expresí. Trofoblast má schopnost syntetizovat hormon zvaný choriový gonadotropin (hCG) a podílet se na tvorbě steroidů. Zvýšeným příjmem tekutiny z okolí, která prostupuje zonou pellucidou a hromadí se mezi buňkami vnitřní buněčné masy a obalovou vrstvou, vznikne uvnitř blastocysty dutina (blastocel). Buňky vnitřní buněčné masy se přitom přeskupí jako embryoblast k jednomu pólu vzniklého váčku zvaného nyní blastocysta. Na povrchu je ohraničena jednou vrstvou plochých buněk obalové vrstvy, zvané nyní trofoblast. Postupným zvětšováním objemu blastocysty v důsledku hromadění tekutiny uvnitř embrya dochází k postupnému ztenčování zona pellucida. Vzniklý tlak uvnitř blastocysty naruší zevní obal embrya (zona pellucida) a to vzniklým otvorem „vycestuje“ a uhnízdí se v děložní sliznici. Tento vývoj od oplození až k vycestování blastocysty trvá cca 5-6 dní od oplození oocytu (Vacek, 2006).

3.5.2 Implantace a nidace

Po vycestování ze zona pellucida se buňky trofoblastu dostávají do přímého kontaktu s epitelem děložní sliznice. Blastocysta se přikládá k povrchu děložní sliznice tím pólem, kde je přiložen embryoblast. Děložní sliznice se v této době nachází v plné sekreční fázi. V zóně kontaktu blastocysta s povrchem děložní sliznice se rozvine intenzivní interakce. Morfologicky se projeví intenzivním dělením buněk trofoblastu a jejich splýváním v jazykovité výběžky syncytiotrofoblastu. Primární trofoblast se tak diferencuje v buněčný cytotrofoblast, jehož buňky se nadále mitoticky dělí a splýváním buněčných hranic zajišťují rozrůstání syncytiotrofoblastu do děložní sliznice. Syncytiotrofoblast stále více prorůstá v podobě nepravidelných jazyků a syncytiálních mas do hloubky sliznice. Devátý den je již celá blastocysta zanořena do povrchové vrstvy kompakty a dosahuje průměru 2-3 mm. Implantační otvor v děložní 33

sliznici se uzavře fibrinovým koagulem, přes které přeroste tenká vrstvička děložní sliznice včetně epitelu. Dvanáctý den po ovulaci je blastocysta zcela implantována a prosvítá malým hrbolkem děložní sliznice. Tím byl ukončen proces nidace (Vacek, 2006).

3.5.3 Fáze embryonálního vývoje

Vývoj člověka může být rozdělen do tří fází, které jsou do jisté míry navzájem spolu spjaté: -

první fází je růst (zvětšování velikosti), jež zahrnuje dělení buněk a vytváření buněčných produktů.

-

druhou vývojovou fází je morfogeneze (vývoj tvaru), která v sobě zahrnuje množství buněčných pohybů. Pohyb buněk umožňuje jejich vzájemnou interakci běhen formování tkání a orgánů.

-

třetí fází je pak diferenciace (zrání fyziologických pochodů). Dovršení diferenciace má za následek vznik tkání a orgánů, které jsou schopny zastávat specializované funkce (Moore, 1998).

3.6 Ženská neplodnost Neplodností trpí v naší populaci asi 12 % párů a představuje významný problém z hlediska psychologického, medicínského, společenského i finančního. Za neplodný se považuje pár po roce neúspěšné snahy o otěhotnění. Sterilita na straně ženy může vznikat z mnoha příčin. Na neplodnosti ženy se mohou podílet faktory ovariální, tubární, uterinní, cervikální, vaginální, psychické poruchy, extragenitální a příčiny neznámého původu. Faktor ovariální je nejčastější poruchou neplodnosti.

3.6.1 Léčba ženské neplodnosti v programu asistované reprodukce

34

Stimulace vaječníků u metod asistované reprodukce

Základem pro léčbu je stimulace ovárií pomocí hormonálních preparátů. Reakce na stimulaci vaječníků je u jednotlivých žen odlišná a závisí především na věku (reaktivita vaječníků s věkem klesá). Dále se pak odvíjí od schopnosti dozrávajících vajíček (folikulů) reagovat na stimulaci hormonem gonadotropinem. Mezi gonadotropiny počítáme folikulostimulační hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH), oba nezbytné pro normální průběh steroidogeneze (produkce pohlavních hormonů) a folikulogeneze (proces dozrávání vajíček). K nim přistupuje ještě choriový gonadotropin (hCG), jehož podání ve stimulačních protokolech nahrazuje ovulační vzestup LH a umožňuje optimální časování léčebného cyklu. Při léčbě neplodnosti umělým oplodněním. in vitro fertilisatio (IVF), je nezbytná kontrola ovariální hyperstimulace pacientek. Hlavními požadavky hormonální ovariální stimulace je zisk většího (ale bezpečného) počtu oocytů, optimální kvalita (zralost) získaných oocytů a minimální zásah do luteální fáze cyklu. Stimulační protokoly asistované reprodukce prodělaly v posledních letech značný vývoj. Zcela se ustoupilo od původní stimulace klomifencitrát + gonadotropiny (hMG/FSH) a v současné době se užívají již jen analoga nebo antagonisté gonadoliberinů (aGnRH) s gonadotropiny (hMG.u.FSH nebo rec.FSH) spolu s preovulační aplikací hCG. Mezi standard posledních let patří stimulace aGnRH+hMG/FSH+hCG v krátkém, dlouhém nebo ultrakrátkém protokolu (Suchá, 2004).

Krátký protokol využívá počátečního flare.up efektu aGnRH (vzplanutí endogenní sekrece hypofýzou) i gonadotropinů a současně periovulačního supresivního působení analoga na hypofýzu.

Dlouhý protokol využívá supresi hypotalamo, hypofýzo-ovariální osy, tzv. down regulaci, která nastupuje při dlouhodobé aplikaci analoga a následně se přidává stimulace gonadotropiny.

Ultrakrátký protokol se užívá méně často, a sice u tzv. low responders (pacientky málo reagující na stimulaci), zde se využívá pouze flare.up efektu aGnRH.

Gonadotropiny, dnes užívané pro ovariální stimulaci, jsou buď vysoce čištěné preparáty 35

s FSH získané z moči menopauzálních žen(u.FSH), nebo rekombinantní (rec.FSH) získané genovou manipulací po biotechnologické inkorporaci humánního genu kódujícího syntézu FSH do buněčné linie čínského křečka. Rec.FSH oproti u.FSH preparátùm mají vyšší bioaktivitu přes podobnou nebo nižší sérovou imunoaktivní FSH koncentraci, nenesou LH aktivitu a mají minimální kontaminaci non.FSH proteiny (Suchá, 2004).

3.7 Syndrom PCOS Syndrom polycystických ovarií (PCOS) je poměrně časté endokrinní onemocnění u žen ve

fertilním

věku,

které

je

charakterizováno

anovulací,

infertilitou

a

hyperandrogenismem. Klíčovým faktorem v patogenezi PCOS je inzulinová rezistence (IR). Mezi PCOS a syndromem inzulinové rezistence je řada podobností. Ženy se syndromem polycystických ovarií mají významně vyšší riziko rozvoje diabetes mellitus 2. typu a kardiovaskulárních chorob (Heijnen, 2006). U žen se syndromem polycystických ovárií byla popsána řada metabolických odchylek, ale inzulínová rezistence a kompenzační hyperinzulinémie je z nich nejvýznamnější. Zdá se, že rezistence na inzulin u PCOS vyplývá z porušeného působení inzulinu na transport glukózy, na lipolýzu v adipocytech a pravděpodobně i ve svalech, součastně s normální inzulinovou vazbou. Z toho vyplývající kompenzační hyperinzulinémie zase vede k přehnanému účinku insulinu na ostatní tkáně, které normálně odpovídají v menší míře, včetně stimulace androgenní sekrece thekálními buňkami ovaria. Inzulínová rezistence je podkladem androgenních rysů této poruchy a podávání léků snižujících inzulínovou rezistenci zlepšuje klinické, endokrinologické a metabolické charakteristiky u mnoha žen s PCOS (DeUgarte, 2005). PCOS je stav, při kterém jsou ovaria zvětšena s hladkou, ale zbytnělou povrchovou membránou. Povrch pokrývá velké množství cyst, které samy o sobě nejsou nebezpečné, ale mohou být příčinou amenorhey nebo oligomenorhey a následně

36

neplodnosti.

Klinické znaky Diagnostickým kritériem pro

PCOS je nález polycystických vaječníků při

ultrazvukovém vyšetření.

Obr. 13: Ultrazvukový obraz polycystických vaječníků Tento nález mohou provázet další příznaky a nálezy, jejichž společným znakem je hyperandrogenismus, tj. vývoj charakteristických mužských pohlavních znaků u žen. Při vyšetření je pak nalezeno zvýšení sérového LH (luteinizačního hormonu) obvykle nad 10 IU/l a může být zvýšena hladina testosteronu.

3.7.1 Známky a symptomy PCOS •

Zvýšené hladiny LH (sérové LH >10 IU/l).

•

Nízké nebo normální hladiny FSH (i pokud jsou normální, jsou pravděpodobně stále nižší, než by bylo potřebné pro normální vývoj folikulů).

•

Zvýšený poměr LH/FSH (>2:1 nebo 3:1).

•

Zvýšená hladina androgenů/testosteronu.

•

Zvětšená ovaria s mnohočetnými cystami.

•

Mnohočetné nezralé folikuly ve vaječnících (obvykle 2 až 8 mm).

•

10 folikulů a více v jednom vaječníku

37

•

Nepravidelné menses a chybějící ovulace.

•

Hirsutismus (nadměrné tělesné ochlupení) a akné; následek nadbytku mužských pohlavních hormonů.

•

Obezita (Rotterdam Revised consensus on diagnostic kriteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome, 2003)

Ačkoliv je PCOS často sdružena s androgenními příznaky, jako je hirsutismus nebo obezita, nejsou tyto příznaky pro diagnózu nezbytné.

3.7.2 PCOS a plodnost PCOS je zřejmě jedním z nejčastějších endokrinních onemocnění žen ve fertilním věku, postihuje okolo 5- 10 % této populace. U nejmírnějších forem PCOS nemusí mít postižené ženy žádné poruchy menstruace a mohou mít normální ovulaci, často jim však trvá déle, než otěhotní a jsou více ohroženy spontánními potraty. U středních forem PCOS jsou přítomny menstruační nepravidelnosti, jako oligomenorhea nebo sekundární amenorhea a selhávání ovulace. Nejtěžší forma PCOS je charakterizována obezitou, hirsutismem, amenorheou a následně samozřejmě neplodností.

OHSS (hyperstimulační syndrom) OHSS je vážná komplikace u žen podstupujících léčbu IVF hyperstimulací ovarií, spočívající v exogenním podávání gonadotropinů. Vlivem zevního podávání hormonů podporujících růst a zrání oocytů (hCG – choriogonadotropní hormon, lidský choriový gonadotropin, těhotenský hormon – a LH – luteinizační hormon) dochází ve vaječnících k uvolňování vazoaktivních látek, které vedou ke zvýšené propustnosti kapilár. Z intravaskulárního prostoru uniká tekutina obsahující bílkovinu a hromadí se v břišní

38

nebo pohrudniční dutině. U pacientky vzniká ascites, pleurální až perikardální výpotek. Dochází k hemokoncentraci (Vegetti, 2006).

Léčba u pacientek s PCOS v IVF

Léčba OHSS je symptomatická a názory na možnosti prevence OHSS ať primární či sekundární se liší. Nejčastěji používanou možností sekundární prevence je casting, tzn. přerušení podávání FSH do žádoucího poklesu hladiny sérového estradiolu (E2). Nevýhodou tohoto postupu může být nízký počet zralých oocytů. Rizikový moment pro možný rozvoj OHSS je růst další kohorty (malých) folikulů v pozdní folikulární fázi. V současnosti se jako nový terapeutický postup ukazuje využití luteinizačního hormonu a choriogonádotropního hormonu LH / hCG ke konci folikulárního zrání, které selektivně indukuje atrézií malých folikulů, ale stimuluje pokračování růstu folikulů velkých. Průběh stimulace vaječníků se sleduje ultrazvukem. Hodnotí se velikost rostoucích folikulů, charakter a výška děložní sliznice.

3.8 Metody asistované reprodukce – oplození in vitro Metody asistované reprodukce zahrnují všechny léčebné postupy a techniky vyžadující manipulaci se zárodečnými buňkami (vajíčky nebo spermiemi). Poznatky, které byly získány výzkumem fertilizace se využivají při oplození oocytu in vitro.

3.8.1 Laboratorní techniky IVF Na počátku byla velkým objevem fertilizace lidského oocytu in vitro a transfer embrya do dělohy (IVF-ET). Louisa Brown, první dítě počaté po oplození metodou IVF – ET, se narodila v roce 1978 v Oldhamu v Anglii. Přestože je jméno Louisu Brownové často spojováno s počátkem IVF, pravdou je, že k prvnímu lidskému IVF -ET vedla dlouhá cesta, která začala v Edinburghu ve Skotsku již o 20 let dříve. Robert Edwards v r. 1962 39

popsal stádia zrání lidského vajíčka ve zkumavce. Ve stejné době, tedy v r. 1962 byla také poprvé popsána embryonální kmenová buňka (R.Edwards, J. Paul a R. Cole), která se diferencovala in vitro. První fertilizaci lidského oocytu, který dozrál in vitro popsal Barry Bavister. Asistovaná reprodukce se neustále vyvíjí a zdokonaluje. V současnosti metodu IVF-ET velmi úspěšně doplňují tzv. mikromanipulační techniky jako je intracytoplasmatická injekce spermie – ICSI. Výkon, při kterém je pod mikroskopem vždy jedna spermie zavedena tenkou skleněnou kapilárou přímo do oocytu (první dítě po ICSI se narodilo v r. 1993 v Belgii- A. C.van Steirteghem). Asistovaný hatching – AH, mechanické, chemické či laserové narušení obalu embrya, které usnadní vycestování embrya ze zona pellucida, které je nutné před uhnízděním do děložní sliznice (AH byl poprvé publikoval Cohen at al. v r. 1990). Kryoembryotransfer – KET, přenos rozmraženého embrya do dělohy. Mikrochirurgická aspirace spermií z nadvarlete – MESA, při uzávěru chámovodů (používá se speciální punkční jehla a výkon se provádí pod lupou). Extrakce spermií z varlete – TESE (z cca 5-ti milimetrových incisí na varleti se extrahují semenotvorné kanálky, v nichž embryolog při preparaci pod mikroskopem hledá spermie). Po MESA či TESE vždy následuje ICSI. Dalšími speciálními mikromanipulačními technikami je odběr jedné blastomery embrya pro preimplantační genetickou diagnostiku – PGD, odběr pólového těliska u zralého oocytu pro genetickou diagnostiku. Dokonalejší techniky asistované reprodukce, kvalitnější média, která umožňují delší kultivaci embryí v laboratorních podmínkách, kvalitnější přístroje, laboratorní vybavení a v neposlední řadě účinnější hormonální přípravky nezbytné k navození růstu a zrání vajíček na vaječnících ženy, to vše se podílí na zvyšující se úspěšnosti léčby neplodnosti.

4 MATERIÁL A METODIKA

4.1 Materiál

40

Materiálem pro tuto práci jsou ženy, které se léčily pomocí asistované reprodukce na Klinice Unica v Brně. Na klinice jsou specializovaná pracoviště ambulancí, operačních sálů a laboratoří zaměřená na diagnostiku a léčbu ženské a mužské neplodnosti. Je zde dostupná veškerá léčba v oboru asistované reprodukce jak po stránce odborné tak i technické. Hodnocený soubor zahrnuje 477 párů, které v letech 2006 – 2008 absolvovaly léčbu na klinice Unica. Všechny páry byly vyšetřeny a podstoupily léčbu IVF. Léčba zahrnovala gynekologické vyšetření ženy, zhodnocení spermiogramu muže, páru byla odebrána krev na infekční, imunologické a genetické vyšetření, byla stanovena hladina hormonů a dle výsledků byla stanovena strategie léčby. U 175 žen byl zjištěn, jako příčina neplodnosti syndrom polycystických ovárií. Jako kritérium pro tuto diagnostiku byla vysoká hladina androgenů a ultrazvukový obraz polycystických vaječníků. Kontrolní skupinu tvořily ženy, které se léčily pro jinou příčinu neplodnosti (neprůchodnost vejcovodů, endometriosa, pozitivní protilátky proti spermiím, operace vaječníků, snížená funkce vaječníků, atd.). Tento kontrolní soubor zahrnoval 302 párů. Průměrný věk sledovaných žen byl 30,7 let. U všech párů byla použita hormonální stimulace vaječníků. Po odběru oocytů byla použita metoda ICSI a embrya byla přenesena 3 – 5 den kultivace.

4.2 Metodika Ultrazvuková kontrola stimulovaných vaječníků, vlastní odběr i vyšetření zárodečných buněk se uskutečnilo v prostorách kliniky pro léčbu neplodnosti a ženských nemocí UNICA. Soubory byly statisticky vyhodnoceny pomocí analýzy rozptylu - Anova testu, Kruskal - Wallis testu a pomocí Pearsonových korelací.

4.2.1 Stimulace vaječníků

Stimulace vaječníků se řídí vyšetřením ženy na funkčnost vaječníků a určením typu protokolu.

41

Ženy se syndromem polycystických ovárií byly stimulovány dlouhým protokolem. Iniciální dávka FSH (folikulostimulačního hormonu) byla u každé pacientky nastavena individuálně, po zvážení předpokládané reaktivity ovárií a rizika OHSS (ovariální hyperstimulační syndrom). Dlouhý protokol u žen s PCOS byl modifikován využitím hCG (choriogonádotropní hormon) od sedmého dne stimulace pokud vaječník vykazoval na ultrazvuku nadměrnou produkci folikulů. Jako hranice byl stanoven počet 25 folikulů na obou vaječnících. Aplikace hCG zabránila rozvoji folikulů menších než 12 mm a umožnila růst folikulů větších. Kontrolního soubor byl vytvořen ženami, které byly stimulovány pomocí dlouhého protokolu, které splňovaly podmínku alespoň 25 folikulů v průběhu stimulace. U obou skupin bylo podáno 5000 jednotek hCG, když velikost většiny rostoucích folikulů dosáhla 20 mm v průměru.

4.2.2 Punkce ovariálních folikulů

Odběr oocytů byl proveden transvaginální punkcí po 34 hodinách od aplikace hCG. Jednotlivé folikuly byly odsávány do sterilní zkumavky a folikulární tekutina byla v embryologické laboratoři prohlížena po stereomikroskopem Nicon, při 100-násobném zvětšení

na přítomnost oocytů. Nalezené oocyty byly pomocí Pasteurovy pipety

promyté od folikulární tekutiny popř. krve. Přeneseny do kultivačního média a umístěny v kultivačním boxu Heracell, kde byly ponechány 2 hodiny. Následně byly použity pro ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie).

4.2.3 Příprava spermií pro IVF

Ejakulát odebraný do sterilní kádinky se nechal po dobu třiceti minut zkapalnit ve vyhřívacím boxu Heraeus při teplotě 37 ± 0,1°C. Po zkapalnění byl stanoven objem a následně bylo provedeno mikroskopické hodnocení.

Postup přípravy ejakulátu pro mikroskopické hodnocení:

42

Do skleněné zkumavky byl 5 ml stříkačkou odměřen 1 ml fyziologického roztoku, automatickou pipetou Eppendorf s rozmezím 50 – 200 µl bylo přidáno 50 µl zkapalněného ejakulátu. Zředěný ejakulát byl promíchán pipetou třikrát opakovaným nasátím a vypuštěním a pomocí skleněné kapiláry přenesen do Bürkerovy komůrky. Hodnocení probíhalo mikroskopicky pomocí mikroskopu Nicon E 200. Koncentrace a motilita spermií se hodnotila při 400 násobném zvětšení, morfologie spermií při 600 násobném zvětšení. Spermie se hodnotily v padesáti vybraných čtvercích, v jedné vrstvě, uvnitř čtverce a na dvou protilehlých stranách čtverce. U každého z vyšetřovaných ejakulátů byla zjišťována viskozita, objem, koncentrace spermií, motilita spermií, morfologie spermií. V této práci byla zohledněna morfologie spermií jako klíčová hodnota spermiogramu. Všechny zralé oocyty byly oplozovány metodou ICSI, proto hodnoty jako byl počet spermií a procento pohyblivých spermií nebyly v tomto případě brány jako důležité.

Hodnocení morfologie

Při hodnocení morfologie se počítá procentuální zastoupení normálně utvářených spermií, spermií s patologicky utvářenými hlavičkami, krčky a bičíky.

N=

N

×100

[%]

– procentuální zastoupení normálně utvářených spermií

n – počet normálně utvářených spermií HS – hodnocené spermie

PH =

×100

[%]

PH – procentuální zastoupení spermií s patologicky utvářenými hlavičkami 43

hl – počet spermií s patologicky utvářenými hlavičkami HS – hodnocené spermie

PK

=

×100

[%]

PK – procentuální zastoupení spermií s patologicky utvářenými krčky kr – počet spermií s patologicky utvářenými krčky HS – hodnocené spermie

PB =

×100

[%]

PB – procentuální zastoupení spermií s patologicky utvářenými bičíky b – počet spermií s patologicky utvářenými bičíky HS – hodnocené spermie

Normální hodnota morfologie spermií dle WHO (World Health Organisation, 2002) je 30 % normálně utvářených spermií v 1 mililitru ejakulátu.

4.2.4 Embryologické metody asistované reprodukce

Oocyty byly po uplynutí doby dvou hodin od odběru denudovány (mechanicky čištěny) pod stereomikroskopem (Nicon, 100x) na vyhřívané ploše ve fertilizačním médiu převrstveném minerálním olejem v laminárním boxu, který zajišťuje odpovídající čistotu vzduchu. 44

Po denudaci (mechanickém očištění vajíček) je zhodnocena morfologie a zralost oocytů. Všechny zralá vajíčka byla použita na metodu ICSI.

Metoda ICSI, která byla prováděna na mikromanipulátor Eppendorf NK2 s invertovaným mikroskopem Nicon, je speciální mikromanipulační technika, kdy se zhodnotí morfologie získaného a od kumulárních buněk očištěného oocytu a morfologie spermie pod 400 násobném zvětšení na invertovaném mikroskopu. Pomocí skleněné pipety se imobilizuje spermie přerušením tubulů v bičíku, nasaje se do pipety a injikuje do cytoplazmy vajíčka.

Obr. 14: Intracytoplazmatická injekce spermie do cytoplazmy zralého vajíčka

Oocyty (vajíčka) oplodněné pomocí metody ICSI jsou přeneseny do cleavage (dělícího) média a umístěny do kultivačního boxu Heracell.

Asistovaný hatching (AH) je mikromanipulační technika, kde se pomocí tenké skleněné kapiláry nařízne zona pellucida (mikromanipulátor Eppendorf NK2, invertovaný mikroskop Nicon, 400x). Narušením obalu je usnadněno pro vyvíjející se embryo ve stádiu blastocysty vycestovat ze zony pellucidy.

Obr. 15: Narušení obalu (zona pellucida) embrya, asistovaný hatching (AH)

45

4.2.5 Kultivace embryí v asistované reprodukci

Embrya vzniklá in vitro jsou kultivována v laboratorních podmínkách v kultivačních boxech 2 - 5 dnů. Každý den je kontrolován jejich vývoj a kvalita. Po uplynutí doby kultivace jsou embrya přenesena do dělohy ženy. Následující den po vpichu spermie do cytoplazmy vajíčka (ICSI) se ve středu objevují dvě jádra (pronukleáry) což je známkou, že došlo k oplození (fertilizaci). Oplozené oocyty jsou odděleny od neoplozených a přeneseny do čerstvého média. Za 48 hodin po vpichu spermie do oocytu se embryo začne dělit má 2 až 4buňky (blastomery). Po dalších 72 hodinách 8 až 12 buněk. Za 96 hodin již přepážky mezi jednotlivými buňkami splývají a embryo přechází do stádia kompaktované moruly. Pátý den kultivace se embryo formuje do stádia blastocysty. Třetí nebo čtvrtý den kultivace byl u embryí dobré kvality proveden asistovaný hatching – AH (naříznutí zona pellucida).

Jednotlivá stádia embryí jsou v průběhu kultivace hodnocena a následně 1 až 2 embrya vykazující nejlepší kvalitu přenesena do dělohy. Nadbytečná embrya dobré kvality je možné zamrazit a uchovat v tekutém dusíku při -196°C pro další použití v asistované reprodukci.

Obr. 16: Vývoj embrya od druhého do pátého dne kultivace

4.2.6 Hodnocení kvality embryí

Embrya se hodnotí podle vývoje v průběhu kultivace - stádium (počet blastomer), kvalita. Kvalita je hodnocena stupněm A, B, C, kde A je nejlepší, B dobrá a C špatná kvalita.

46

Embrya jsou od druhého dne kultivace hodnoceny dle tabulky: viz tabulka č.1

Tab. 1: Hodnocení embryí v průběhu kultivace od druhého do čtvrtého dne STUPEŇ

DEN 2

DEN 3

DEN 4

A

≥ 4 blastomery

≥ 6 blastomer

fragmentace

fragmentace

0 - 10%

0 – 10%

Částečná/kompaktní morula fragmentace 0 – 10%

B

≥ 4 blastomery

> 6 blastomer

fragmentace

fragmentace

10 - 25 %

10 -25%

< 4 blastomery

4-6 blastomer

fragmentace

fragmentace

0 – 10%

0 – 10%

Částečná/kompaktní morula fragmentace 10 – 25%

B

≥ 8 blastomer fragmentace 0 – 10%

47

C

Nerýhovaná embrya

< 4 blastomery bez ohledu na frag.

≤ 4 blastomery

< 8 blastomer bez ohledu na frag. ≥ 8 blastomer

4-6 blastomer fragmentace

fragmentace fragmentace

10 – 25%

10 – 25%. 10 – 25%

embryo s fragmentací nad 25%

embryo s fragmentací nad 25%

embryo s fragmentací nad 25%

Pátý den kultivace jsou embrya ve stádiu blastocysty a jsou hodnocena:

ČB (časná blastocysta) – blastocel (tekutinou naplněná dutina) je menší než půlka velikosti embrya. B (blastocysta) – blastocel je stejný nebo větší než půlka velikosti embrya. EB (expandovaná blastocysta) – blastocel vyplňuje celé embryo, dochází k zvětšení embrya a ztenčení zony pelucidy. HB (hatchující blastocysta) – embryo již opouští obal zona pellucina

Blastocel rozdělí buňky do dvou skupin: Inner cell mass (ICM, vnitřní buněčná masa) - základ vlastního embrya Trophectoderm (TM, trofektoderm) – vývoj extraembryonálních struktur 48

Hodnocení: ICM A: velké množství buněk těsně zformovaných B: volné skupinky několika buněk C: velmi málo buněk TM A: mnoho buněk formovaného kohezivního epitelu B: málo buněk formovaného epitelu C: velmi málo velkých buněk

4.2.7 Potvrzení těhotenství

Potvrzení a pokračování těhotenství bylo rozděleno do 4 fází:

1. Odběr krve a stanovení hladiny hCG – chemická gravidita. 2. Verifikace gravidity ultrazvukovým vyšetřením čtyři týdny po transferu. Bylo hodnoceno těhotenství s akcí srdeční – klinická gravidita. 3. Verifikace gravidity ultrazvukovým vyšetřením 12. týden po transferu. Byla hodnocena prosperita těhotenství – pokračující těhotenství. 4. Porod – informace odeslané pacientkou. V práci byl hodnocen porod jako narození donošeného živého dítěte.

49

5 VÝSLEDKY

5.1 Průměry a statistické vyhodnocení sledovaného souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) v porovnání s kontrolním souborem žen

5.1.1 Průměrné hodnoty a statistické zhodnocení rozdílu průměrného věku mezi sledovaným souborem žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) a kontrolním souborem (175 žen vs. 302 žen) žen

Zjištěné průměrné hodnoty zastoupení věku žen ve sledovaném souboru PCOS vs. kontrolní soubor jsou uvedeny v tabulce č. 2. Soubor žen se syndromem polycystických ovárií byl zastoupena počtem 175 žen a soubor kontrolní počtem 302 žen.

50

Průměrný věk žen v souboru PCOS byl 30,5 ± 2,82 let. Průměrný věk žen v kontrolním souboru byl 30,9 ± 2,89 let.

Tab. 2: Srovnání průměrného zastoupení věku žen dvou sledovaných souborů, PCOS vs. kontrolní soubor PCOS (175 žen)

Věk žen

Průměrné zastoupení věku žen

jednotka roky

± sx 30,5 ± 2,82

Kontrolní skupina (302 žen) ± sx 30,9 ± 2,89

Zjištěné hodnoty sledovaného a kontrolního souboru byly vyhodnoceny pomocí statistických testů Anova a Kruskal-Wallis. Po vyhodnocení statistické významnosti, které uvádí graf č. 1 je patrné, že zde není žádná statistická významnost (p > 0,05) ve vztahu k věku žen se syndromem polycystických ovárií a žen z kontrolního souboru. Graf 1: Grafické statistické zhodnocení procentuálního zastoupení věku pacientek u dvou souborů PCOS vs. kontrolní

51

5.1.2 Statistické zhodnocení rozdílu procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií v ejakulátu mužů v souboru PCOS a kontrolního souboru (175 mužů vs. 302 mužů)

Tabulka č. 3 srovnává průměrné procentuální zastoupení morfologicky normálně utvářených spermií. U vyšetřovaných mužů v souboru žen se syndromem polycystických ovárií byla průměrná hodnota 13,1 ± 10,9 % normálně utvářených spermií a u mužů z kontrolního souboru sledovaných žen 12,5 ± 10,8 % normálně utvářených spermií. Tyto hodnoty jsou vypočítané jako průměr z celkového počtu hodnocených spermií.

Tab. 3: Srovnání průměrného procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií u dvou skupin mužů sledovaných žen. PCOS vs. kontrolní soubor Morfologie spermií

soubor PCOS (175 mužů) jednotka ± sx

Průměrné procentické zastoupení morfologicky normálních spermií

%

13,1 ± 10,9

Kontrolní (302 mužů) ± sx 12,5 ± 10,8

Zjištěné hodnoty sledované a kontrolní skupiny byly vyhodnoceny pomocí statistických testů Anova a Kruskal -Wallis. Po vyhodnocení statistické významnosti, které uvádí graf č. 2 je patrné, že zde není statistická významnost (p > 0,05) v procentuálním zastoupení normálně utvářených spermií v souboru PCOS vs. kontrolní soubor.

Graf 2: Grafické statistické zhodnocení procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií u dvou skupin mužů, muži žen se syndromem polycystických vaječníků – pcos vs. kontrolní skupina - kontrola 52

5.1.3 Statistické zhodnocení rozdílu počtu získaných oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen)

Tabulka č. 4 srovnává počet získaných oocytů při punkci ovariálních folikulů. V souboru PCOS byl celkový počet získaných oocytů 4384 (175 cyklů IVF) vs. 7365 (302 cyklů IVF) v kontrolním souboru. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS 25,1 ± 7,7 oocytů a v kontrolním souboru 24,5 ± 7,0 oocytů.

Tab. 4: Srovnání počtu získaných oocytů, průměrný počet oocytů na jednu ženu dvou souborů, PCOS vs. kontrolní Počet získaných oocytů

Počet získaných oocytů Průměrný počet získaných

jednotka ks jednotka ks 53

soubor PCOS (175 žen) 4384 ± sx 25,1 ± 7,7

Kontrolní skupina (302 žen) 7365 ± sx 24,5 ± 7,0

oocytů na jednu pacientku

Z grafu č. 3 je patrné, že zjištěné hodnoty sledované a kontrolní skupiny v počtu získaných oocytů, vyhodnocené pomocí testů Anova a Kruskal-Wallis, byly statisticky nevýznamné (p > 0,05).

Graf 3: Grafické statistické zhodnocení počtu získaných oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní

54

5.1.4 Statistické zhodnocení počtu zralých oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen)

V tabulce č. 5 je uveden počet zralých oocytů (fáze MII). U souboru PCOS byl počet zralých oocytů 2812 (175 cyklů IVF) vs. 4745 (302 cyklů IVF) u kontrolního souboru. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS 16,1 ± 6,1 zralých oocytů a v kontrolním souboru 15,7 ± 5,3 zralých oocytů.

Tab. 5: Srovnání počtu zralých oocytů, průměrný počet zralých oocytů na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní Počet zralých oocytů

Počet zralých oocytů

jednotka ks jednotka

soubor PCOS (175 žen) 2812 ± sx

Kontrolní skupina (302 žen) 4745 ± sx

Průměrný počet zralých oocytů na jednu pacientku ks 16,1 ± 6,1 15,7 ± 5,3 Zjištěné hodnoty sledovaného a kontrolního souboru byly vyhodnoceny pomocí statistických testů Anova a Kruskal-Wallis. Po vyhodnocení statistické významnosti, které uvádí graf č. 4 je patrné, že počet zralých oocytů v souboru PCOS vs. kontrolní je statisticky nevýznamný (p > 0,05).

Graf 4: Grafické statistické zhodnocení počtu zralých oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní

55

5.1.5 Statistické zhodnocení počtu oplozených oocytů (vajíček) u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 žen vs. 302 žen)

V tabulce č. 6 je uveden počet oplozených oocytů.

U souboru PCOS byl počet

oplozených oocytů 2321 (175 cyklů IVF) vs. 3739 (302 cyklů IVF) u kontrolního souboru. Průměrně bylo oplozeno 13,3 ± 5,6 oocytů na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS. V kontrolním souboru byl průměrný počet oplozených oocytů 12,4 ± 5,1.

Tab. 6: Srovnání počtu oplozených oocytů, průměrný počet oplozených oocytů na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní

Počet oplozených oocytů

Počet oplozených oocytů Průměrný počet oplozených oocytů na jednu pacientku

jednotka ks jednotka

soubor PCOS (175 žen) 2321 ± sx

ks

13,3 ± 5,6 56

Kontrolní skupina (302 žen) 3739 ± sx 12,4 ± 5,1

Graf č. 5 hodnotí statistickou významnost ve srovnání počtu oplozených oocytů v PCOS souboru vs. kontrolní. Zjištěné hodnoty sledovaného a kontrolního souboru v počtu oplozených oocytů, vyhodnocené pomocí testů Anova a Kruskal-Wallis, byly statisticky nevýznamné (p > 0,05).

Graf 5: Grafické statistické zhodnocení počtu oplozených oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní

5.1.6 Statistické zhodnocení počtu embryí na transfer u dvou sledovaných souborů žen, PCOS a kontrolní (175 transferů vs. 302 transferů)

V tabulce č. 7 je uveden počet embryí na transfer (ET). U souboru PCOS bylo přeneseno celkem 351 embryí (175 transferů), počet přenášených embryí u kontrolního souboru byl 594 (302 transferů). Průměrný počet embryí na jeden transfer v souboru PCOS byl 2,01 ± 0,25 embryí, v kontrolním souboru 1,96 ± 0,27 embryí.

57

Tab. 7: Srovnání počtu transferovaných embryí, průměrný počet transferovaných embryí na jeden transfer v souboru PCOS vs. kontrolní Počet transferovaných embryí

Počet transferovaných embryí Průměrný počet embryí na jeden transfer

soubor PCOS (175 žen) 351 ± sx

jednotka ks jednotka ks

2,01 ± 0,25

Kontrolní skupina (302 žen) 594 ± sx 1,96 ± 0,27

Graf č. 6 hodnotí statistickou významnost srovnáním počtu transferovaných embryí na jeden transfer v souboru PCOS (175 transferů) vs. kontrolní (302 transferů). Hodnoty byly vyhodnoceny pomocí statistických testů Anova a Kruskal-Wallis. V počtu transferovaných embryí na jeden transfer mezi soubory PCOS vs. kontrolní není statistický významný rozdíl (p > 0,05).

Graf 6 : Grafické statistické zhodnocení počtu přenášených embryí na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní

58

5.1.7 Průměrné hodnoty gravidit a porodů ve sledovaném souboru PCOS vs. kontrolní

Po přenosu embryí byl sledován průběh gravidity a hodnoceny následující parametry:

Chemická gravidita (odběr krve na potvrzení těhotenství) Klinická gravidita (těhotenství detekovatelné pomocí ultrazvuku) Pokračující těhotenství (pokračující po 12. týdnu gravidity, ultrazvuková kontrola) Porod (porod živého donošeného dítěte, počet živě narozených dětí)

Chemická gravidita

59

Po čtrnácti dnech od přenosu embryí se provádí kontrola implantace embrya odběrem krve na hCG (choriogonádotropní hormon). Pokud je výsledek pozitivní, jedná se o chemickou graviditu. Ve sledovaném souboru žen s PCOS byla chemická gravidita 58 % vs. 46 % u souboru kontrolního (viz.graf č. 7). Graf 7: Procentuální srovnání chemické gravidity v souboru žen PCOS vs. kontrolní

Klinická gravidita

Za 28 dní od přenosu embryí byla provedena ultrazvuková kontrola na potvrzení přítomnosti gestačního váčku v děloze a akci srdeční. Pokud byl výsledek pozitivní, jednalo se o klinickou graviditu. Procentuální vyjádření výsledků souboru žen s PCOS vs. kontrolní bylo dosaženo 53 % klinických gravidit u žen s PCOS vs. 42 % klinických gravidit v kontrolním souboru (viz. graf č. 8).

Graf 8: Procentuální srovnání klinické gravidity v souboru žen PCOS vs. kontrolní

60

Pokračující gravidita

Po uplynutí 12 týdnů od transferu embryí byla u žen ve sledované skupině PCOS a kontrolní, provedena druhá ultrazvuková kontrola ke zjištění prosperity těhotenství. V souboru žen PCOS pokračovalo všech 53 % těhotenství. V souboru kontrolním pokračovalo těhotenství už jen u 36 % žen (viz. graf č. 9)

Graf 9: Procentuální srovnání pokračujícího těhotenství u souboru PCOS vs. kontrolní

Porod

61

Ukončení těhotenství porodem bylo hodnoceno jako porod živého donošeného dítěte. Ve sledovaném souboru PCOS bylo těhotenství zakončeno porodem živého dítěte v 47 % vs. 35 % u kontrolního souboru (viz. graf č. 10). Graf 10: Procentuální zastoupení uskutečněných porodů v souboru PCOS vs. kontrolní

V grafu č. 11 je uvedeno procentuální zastoupení počtu narozených dětí na porod, zda byl porod ukončen porozením jednoho nebo dvou dětí. V souboru PCOS byl porod jednoho dítěte zastoupen ve 33 % vs. 25 % u kontrolního souboru. Porod dvojčat u PCOS souboru byl 14 % vs. 10 % v kontrolním.

V tabulce č. 8 jsou uvedeny procentuální hodnoty jednotlivých fází gravidity od implantace embrya až do samotného porodu. Z výsledku je patrné, že soubor žen se syndromem polycystických ovárií v léčbě asistovanou reprodukcí (IVF) dosahuje příznivějších výsledků z hlediska gravidit a porodu dítěte než soubor kontrolní.

Tab. 8: Procentuální zastoupení průběhu gravidit a porodu ve skupině PCOS vs. kontrolní

62

chemická Soubor gravidita 58% PCOS 46% Kontrolní

pokračující klinická gravidita gravidita 53% 53% 42% 36%

porod 47% 35%

Graf 11: Procentuální srovnání počtu porodů a počtu živě narozených dětí na jeden porod v sledovaném souboru PCOS vs. kontrolní

5.2 Průkaznosti sledovaných hodnot souborů PCOS a kontrolního Všechna data, která byla použita pro hodnocení jednotlivých fází léčby u souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) a kontrolního souboru žen, byla zhodnocena pomocí Pearsonových korelací (viz. tabulka č. 9). Z tabulky č. 9 je možné zjistit několik zajímavých výsledků Průkaznost byla prokázána mezi procentuálním zastoupením morfologicky normálně utvářených spermií a počtem oplozených oocytů. Čím je vyšší procento morfologicky normálně utvářených spermií, tím je větší počet oplozených oocytů (vysoce signifikantní pro **p ≤ 0,001). Dále byla průkaznost prokázána mezi počtem oplozených vajíček, pokračující graviditou a porodem. Čím vyšší je počet oplozených vajíček tím více těhotenství po přenosu embryí pokračuje do 12. týdne gravidity

63

(signifikantní pro *p ≤ 0,05) a více těhotenství je ukončeno porodem donošeného živého dítěte (signifikantní pro *p ≤ 0,05). Zvyšující se počet získaných a zralých vajíček nepřináší pozitivní efekt v počtu dosažených gravidit a následného porodu. Není zde žádný průkazný rozdíl.

Vysvětlivky zkratek k tabulce č. 9: pcos/ kontr.: soubor žen se syndromem polycystických ovárií /kontrolní soubor n získaných oo.: počet získaných oocytů n zralých oo.: počet zralých oocytů n oplozených oo.: počet oplozených (fertilizovaných) oocytů n embryí na ET: počet přenášených embryí do dělohy ongoing: pokračující gravidita po 12. týdnu n živě naroz. dětí: počet živě narozených donošených dětí

64

Tab. 9: Průkaznost všech sledovaných parametrů pcos /kontr.

ročník

věk

n získaných oo.

n zralých oo.

n oplozených oo.

n embryí na ET

morfologie spermií %

chemická gravidita

klinická gravidita

ongoing

porod

n živě naroz. dětí

*

*

*

pcos/kontr. ročník věk n získaných oo. n zralých oo. n oplozených oo.

**

n embryí na ET morfologie spermií % chemická gravidita klinická gravidita ongoing porod n živě naroz. dětí

65

6 DISKUZE Celkem bylo hodnoceno 477 žen, 175 žen ve sledovaném souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) a 302 žen v souboru kontrolním. Průměrný věk žen v souboru PCOS byl 30,5 ± 2,82 let. Průměrný věk žen ve skupině kontrolní byl 30,9 ± 2,89 let. Věk sledovaných žen s PCOS byl statisticky vyhodnocen v porovnání s kontrolním souborem žen. Srovnáním obou souborů zde není statisticky významný rozdíl. U vyšetřovaných mužů v souboru žen se syndromem polycystických ovárií bylo průměrné procentuální zastoupení normálně utvářených spermií 13,1 ± 10,9 %. Muži z kontrolního souboru sledovaných žen měli procentuální zastoupení normálně utvářených spermií 12,5 ± 10,8 %. Norma dle WHO (World Health Organisation, 2002) je 30% normálně utvářených spermií v 1 mililitru ejakulátu. Průměrně se tedy jednalo o muže s teratospermií. Zjištěné hodnoty sledovaného a kontrolního souboru byly statisticky vyhodnoceny a mezi soubory v procentuálním zastoupení normálně utvářených spermií nebyl statisticky významný rozdíl. V souboru žen se syndromem polycystických ovárií byl celkový počet získaných oocytů 4384 (175 cyklů IVF) vs. 7365 (302 cyklů IVF) v souboru kontrolním. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS 25,1 ± 7,7 oocytů a v kontrolním souboru 24,5 ± 7,0 oocytů. Počet získaných oocytů v obou souborech byl statisticky vyhodnocen, nebyl zde žádný statisticky významný rozdíl. U sledovaného souboru žen se syndromem polycystických ovárií byl počet zralých oocytů 2812 (175 cyklů IVF) vs. 4745 (302 cyklů IVF) zralých oocytů v kontrolním souboru. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru žen s PCOS 16,1 ± 6,1 zralých oocytů a v kontrolním souboru žen 15,7 ± 5,3 zralých oocytů. Zjištěné hodnoty sledovaného a kontrolního souboru byly vyhodnoceny pomocí statistických testů Anova a Kruskal-Wallis. Po vyhodnocení není ve sledovaném souboru PCOS a kontrolním v počtu získaných oocytů a v počtu zralých oocytů statistická významnost. Jak uvádí Heijnen et al. (2005) ve své meta-analýze, která srovnává ženy s PCOS a konvenčně léčené ženy v programu asistované reprodukce byl počet zralých oocytů signifikantně vyšší v souboru žen s PCOS než souboru konvenčním. Rozdílný výsledek je pravděpodobně v důsledku velikosti sledovaného

66

souboru žen. Počet žen sledovaných v této práci je 477. Heijnen et al. (2005) sledoval soubor 1152 žen. U souboru žen se syndromem polycystických ovárií byl počet oplozených oocytů 2321 (175 cyklů IVF) vs. 3739 (302 cyklů IVF) u kontrolního souboru. Průměrně bylo oplozeno 13,3 ± 5,6 oocytů na jednu ženu ve sledovaném souboru žen s PCOS . V kontrolním souboru byl průměrný počet oplozených oocytů 12,4 ± 5,1. Po statistickém zhodnocení zde nebyl signifikantní rozdíl v počtu oplozených oocytů mezi souborem žen s PCOS a kontrolním souborem. Stejný výsledek uvádí i Heijnen et al. (2005). U souboru PCOS bylo přeneseno celkem 351 embryí (175 transferů), počet přenášených embryí u kontrolního souboru byl 594 (302 transferů). Průměrný počet embryí na jeden transfer v souboru žen s PCOS byl 2,01 ± 0,25 embryí, v kontrolním souboru 1,96 ± 0,27 embryí. Průměrný počet přenášených embryí byl statisticky nevýznamný v souboru žen s PCOS versus kontrolní soubor. Výsledky implantace embryí a průběhu gravidity byly srovnány na několika úrovních. V sledovaném souboru žen s PCOS byla chemická gravidita 58 % vs. 46 % u souboru kontrolního. Klinických gravidit bylo u žen se syndromem polycystických ovárií dosaženo v 53 %. V kontrolním souboru bylo 42 % klinických gravidit. Gravidit, které pokračovaly po 12. týdnu v souboru žen se syndromem polycystických ovárií bylo 53 %. V souboru kontrolním pokračovalo těhotenství už jen u 36 % žen. Z výsledku je patrné, že soubor žen se syndromem polycystických ovárií má lepší prognózu v prosperitě gravidity. Heijnen et al. (2005) uvádí ve své práci, že nebyl signifikantní rozdíl v průběhu gravidit mezi souborem žen s PCOS a kontrolním souborem. Ve sledovaném souboru PCOS bylo těhotenství zakončeno porodem živého dítěte v 47 % vs. 35 % u kontrolního souboru. Z výsledků uskutečněných porodů, vykazuje sledovaný soubor žen s PCOS lepší prognózu porodu donošeného dítěte než ženy z kontrolního souboru. V počtu dosažených porodů, nebyl dle Heijnena et al. (2005) mezi soubory signifikantní rozdíl.

Pomocí Pearsonových korelací byly zhodnoceny všechny sledované parametry. Po vyhodnocení lze říci, že kvalita spermií hraje klíčovou úlohu v počtu oplozených vajíček. Čím vyšší je procento normálně utvářených spermií, tím je vyšší počet 67

fertilizovaných vajíček (vysoce signifikantní pro **p ≤ 0,001). Je tedy zřejmé, že i když je morfologie spermie zhodnocena imerzním mikroskopem a pro metodu ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie do cytoplazmy oocytu) vybrány spermie s normální morfologií, je výsledek oplození vajíček závislý od procentuálního zastoupení normálně utvářených spermií. Høst et al. (1999) uvádí přímou souvislost kvality spermií s počtem oplozených oocytů. Dále byla prokázána průkaznost mezi počtem oplozených vajíček, pokračující graviditou a porodem. Čím vyšší je počet oplozených vajíček tím více těhotenství po přenosu embryí pokračuje do 12. týdne gravidity (signifikantní pro * p ≤ 0,05) a více těhotenství je ukončeno porodem donošeného živého dítěte (signifikantní pro *p ≤ 0,05). Gardner et al. (2004) uvádí stejné výsledky.

Zajímavé je, že zvyšující se počet získaných oocytů nepřináší pozitivní efekt v počtu dosažených gravidit a následného porodu. Není zde žádný průkazný rozdíl. Gardner et al. (2004) ve své publikaci uvádí, že dosahovat zbytečně vysokými dávkami gonadotropinů vyššího počtu oocytů vede k vyššímu výskytu abnormálních oocytů a nezvyšuje úspěšnost léčby.

68

7 ZÁVĚR Diplomová práce je zaměřena na porovnání vybraných parametrů, které byly hodnoceny v průběhu léčby asistovanou reprodukcí (IVF) u sledovaného souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) a kontrolního souboru žen, které se léčí pro neplodnost z jiné příčny. Celkem bylo hodnoceno 477 žen, 175 žen ve sledovaném souboru a 302 žen v souboru kontrolním. Cílem této práce bylo zjistit, zda ženy postižené syndromem polycystických ovárií dosahují podobných výsledků v léčbě IVF jako konvenční pacientky. Po provedeném hodnocení byly zjištěny následující výsledky: 1. Srovnání věkového zastoupení v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - Průměrný věk žen v souboru PCOS byl 30,5 ± 2,82 let. Průměrný věk žen ve skupině kontrolní byl 30,9 ± 2,89 let. 2. Procentuální zastoupení normálně utvářených spermií u mužů žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - U vyšetřovaných mužů v souboru žen se syndromem polycystických ovárií bylo průměrné procentuální zastoupení normálně utvářených spermií 13,1 ± 10,9 % , u mužů z kontrolního souboru sledovaných žen bylo12,5 ± 10,8 % normálně utvářených spermií. 3. Počet získaných oocytů (vajíček) v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - V souboru PCOS byl celkový počet získaných oocytů 4384 (175 cyklů IVF) vs. 7365 (302 cyklů IVF) v kontrolním souboru. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS 25,1 ± 7,7 oocytů a v kontrolním souboru 24,5 ± 7,0 oocytů. 4. Počet zralých oocytů (vajíček) v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - U souboru PCOS byl počet zralých oocytů 2812 (175 cyklů IVF) vs. 4745 (302 cyklů IVF) u kontrolního souboru. Průměrně bylo získáno na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS 16,1 ± 6,1 zralých oocytů a v kontrolním souboru 15,7 ± 5,3 zralých oocytů. 5. Počet oplozených oocytů (vajíček) v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: 69

- U souboru PCOS byl počet oplozených oocytů 2321 (175 cyklů IVF) vs. 3739 (302 cyklů IVF) u kontrolního souboru. Průměrně bylo oplozeno 13,3 ± 5,6 oocytů na jednu ženu ve sledovaném souboru PCOS .V kontrolním souboru byl průměrný počet oplozených oocytů 12,4 ± 5,1. 6. Průměrný počet transferovaných embryí v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - U souboru PCOS bylo přeneseno celkem 351 embryí (175 transferů), počet přenášených embryí u kontrolního souboru byl 594 (302 transferů). Průměrný počet embryí na jeden transfer v souboru PCOS byl 2,01 ± 0,25 embryí, v kontrolním souboru 1,96 ± 0,27 embryí. 7. Procentuální zastoupení dosažené chemické gravidity v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - Ve sledovaném souboru žen s PCOS byla chemická gravidita 58 % vs. 46 % u souboru kontrolního. 8. Procentuální zastoupení dosažené klinické gravidity v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - V souboru žen s PCOS bylo dosaženo 53 % klinických gravidit vs. 42 % klinických gravidit v souboru kontrolním. 9. Procentuální zastoupení pokračující gravidity v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - V souboru žen PCOS pokračovalo všech 53 % těhotenství. V souboru kontrolním pokračovalo těhotenství už jen u 36 % žen. 10. Procentuální zastoupení uskutečněných porodů v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - Ve sledovaném souboru PCOS bylo těhotenství zakončeno porodem živého dítěte v 47 % vs. 35 % u kontrolního souboru. 11. Procentuální zastoupení počtu narozených dětí v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - V souboru PCOS byl porod jednoho dítěte zastoupen ve 33 % vs. 25 % u kontrolního souboru. Porod dvojčat u PCOS souboru byl 14 % vs. 10 % v kontrolním souboru. 12. Průkaznost morfologie spermií na počet oplozených oocytů (vajíček): - Průkaznost byla prokázána mezi procentuálním zastoupením morfologicky normálně utvářených spermií a počtem oplozených oocytů. Čím je vyšší procento morfologicky

70

normálně utvářených spermií, tím je větší počet oplozených oocytů (vysoce signifikantní pro **p < 0,001). 13. Průkaznost počtu oplozených vajíček na počet pokračujících gravidit a následný porod v souboru žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) vs. kontrolní soubor žen: - průkaznost prokázána mezi počtem oplozených vajíček, pokračující graviditou a porodem. Čím vyšší je počet oplozených vajíček tím více těhotenství po přenosu embryí pokračuje do 12. týdne gravidity (signifikantní pro *p < 0,05) a více těhotenství je ukončeno porodem donošeného živého dítěte (signifikantní pro *p < 0,05). Závěrem lze říci, že léčba žen se syndromem polycystických ovárií (PCOS) pomocí asistované reprodukce (IVF) dosahuje velmi dobrých výsledků a je srovnatelná s léčbou pacientek, které se léčí v programu asistované reprodukce a není u nich diagnostikován jako příčina neplodnosti syndrom polycystických ovárií. V procentuálním srovnání gravidit a počtu porodů dosahuje soubor žen s PCOS dokonce lepších výsledků ve srovnání s kontrolním souborem.

Léčba IVF ženám se syndromem polycystických ovárií, které nemohou spontáně otěhotnět, přináší velmi dobré výsledky v počtu dosažených gravidit a následně porodu zdravého dítěte.

71

8 SEZNAM LITERATURY

BRINSDEN, P. R., et al.: Textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction. 3rd edition, Informa UK, 2007, 974 s

DE UGARTE, C. M., et al.: Jak nejlépe diagnostikovat inzulínovou rezistenci a hyperizulinémii? Gynekologie po promoci, 2005, 4, 22 s

FRANKS, S., STARK, J., HARDY, K.: Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update, 2008, 14, 367-378 s GARDNER, D. K., WEISSMAN, A., HOWLES, C. M., SHOHAM, Z.: Textbook of Assisted Reproductive Techniques, Laboratory and Clinical Perspectives. Secon Edition, Taylor & Francis, 2004, 984 s

HØST, E., et al.: Sperm morphology and IVF, Embryo quality in relation to sperm morphology following the WHO and Krüger's strict kriteria, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 1999,78, 526 - 529 s

GINAROLI, L.,PLACHOT, M., MAGLI, C.: Atlas of embryology. Human Reproduction, Oxford University Press, 2000, 77 s

HEIJNEN, E. M. E., et al.: A Met- Analysis of outcome of conventional IVF in women with polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update, 2006, 12, 13-21 s

http://www.are.cz/ -staženo 20.2.2010 s laskavým souhlasem autora prof. MUDr. P. Trávníka, DrSc

ChRISTIN-MAITRE, S., HUGUES, J. N.: A comparative randomized multicentric study comparing the step-up versus step- down protocol in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction, 2003, 18, 1626 – 1631 s

72

JELÍNEK, P., KOUDELA, K. et al. : Fyziologie hospodářských zvířat. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003, 409 s

JONES, K. T.: Meiosis in oocytes: predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age. Human Reproduction Update, 2008, 14, 143 – 158 s

KOBILKOVÁ, J. et al.: Základy gynekologie a porodnictví, Galén, 2005, 368 s

LOUDA,

F.

et

al.:

Inseminace

inseminace

hospodářských

zvířat

se

základy

biotechnologických metod. ČZU Praha, 2001, 255 s

MOORE, K. L., PERSAUD,T. N.: The Developing Human: Clinically Oriented Embryology. 6th edition, W. B. Sauders Company, Philadelphia, 1998, 564 s

THE ROTTERDAM ESHRE/ASRM-sponsored PCOS konsensus workshop group: Revised 2003 consensus on diagnostic kriteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS). Human Reproduction, 2004, 19, 41-47 s SEPILIAN, V. P., CROCHET, S. R., NAGAMANI, M.: Serum soluble leptin receptor levels and free leptin index in women with polycystic ovary syndrome: relationship to insulin rezistence and androgens. Fertility and Sterility, 2006, 85, 1448-1451 s

PALOMBA, S. et al.: Uterine effects of metformin administrativ in anovulatory women with polycystic ovary syndrome. Human Reproduction , 2006, 21, 457 – 465 s

SUCHÁ, R. et al.: Dlouhý a krátký stimulační protokol v IVF, hormonální hladiny ve folikulární tekutině a v séru. Praktická gynekologie, 2002 / 4, 22-25 s

VACEK, Z.: Embryologie. Grada, Praha, 2006, 255 s

VEECK, L. L.: An Atlas of Human Gametes and Conceptuses. The Parthenon Publishing Group, 1999, 251 s

73

VEECK, L. L., ZANINIVIĆ, N.: An Atlas of Human Blastocyst. The Parthenon Publishing Group, 2003, 286 s

VEGETTI, W., ALAGNA, F.: FSH and foliculogenesis: from fysiology to ovarian stimulation. Reproductive BioMedicine Online 2006,12, 684-691 s

WORLD HEALTH ORGANISATION: WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm. Cambridge University Press, 2002

74

9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ

9.1 Seznam obrázků

Obr. 1: Morfologie ovaria Obr. 2: Ovariální cyklus Obr. 3: a) Zygotene, b) Pachytene Obr. 4: Meioza a normální buněčné dělení (mitoza) Obr. 5: Vajíčko obklopené kumulárními buňkami Obr. 6: Plně nezralé vajíčko (GV) Obr. 7: Vajíčko ve fázi MI Obr. 8: Plně zralé vajíčko s pólovým tělískem (MII) Obr. 9: Spermatogeneze Obr. 10: Morfologie spermie Obr. 11: Řez spojovací částí spermie Obr. 12: Abnormální spermie Obr. 13: Ultrazvukový obraz polycystických vaječníků Obr. 14: Intracytoplazmatická injekce spermie do cytoplazmy zralého vajíčka Obr. 15: Narušení obalu (zona pellucida) embrya, asistovaný hatching (AH) Obr. 16: Vývoj embrya od druhého do pátého dne kultivace

9.2 Seznam tabulek

Tab. 1: Hodnocení embryí v průběhu kultivace od druhého do čtvrtého dne Tab. 2: Srovnání průměrného zastoupení věku žen dvou sledovaných souborů, PCOS vs. kontrolní Tab. 3: Srovnání průměrného procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií u dvou skupin mužů sledovaných žen. PCOS vs. kontrolní soubor Tab. 4: Srovnání počtu získaných oocytů, průměrný počet oocytů na jednu ženu dvou souborů, PCOS vs. kontrolní Tab. 5: Srovnání počtu zralých oocytů, průměrný počet zralých oocytů na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní 75

Tab. 6: Srovnání počtu oplozených oocytů, průměrný počet oplozených oocytů na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní Tab. 7: Srovnání počtu transferovaných embryí, průměrný počet transferovaných embryí na jeden transfer v souboru PCOS vs. kontrolní Tab. 8: Procentuální zastoupení průběhu gravidit a porodu ve skupině PCOS vs. kontrolní Tab. 9: Průkaznost všech sledovaných parametrů

9.3 Seznam grafů

Graf 1: Grafické statistické zhodnocení procentuálního zastoupení věku pacientek u dvou souborů PCOS vs. kontrolní Graf 2: Grafické statistické zhodnocení procentuálního zastoupení morfologicky normálních spermií u dvou skupin mužů, muži žen se syndromem polycystických vaječníků – pcos vs. kontrolní skupina - kontrola Graf 3: Grafické statistické zhodnocení počtu získaných oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní Graf 4: Grafické statistické zhodnocení počtu zralých oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní Graf 5: Grafické statistické zhodnocení počtu oplozených oocytů u žen v souboru PCOS vs. kontrolní Graf 6 : Grafické statistické zhodnocení počtu přenášených embryí na jednu ženu v souboru PCOS vs. kontrolní Graf 7: Procentuální srovnání chemické gravidity v souboru žen PCOS vs. kontrolní Graf 8: Procentuální srovnání klinické gravidity v souboru žen PCOS vs. kontrolní Graf 9: Procentuální srovnání pokračujícího těhotenství u souboru PCOS vs. kontrolní Graf 10: Procentuální zastoupení uskutečněných porodů v souboru PCOS vs. kontrolní Graf 11: Procentuální srovnání počtu porodů a počtu živě narozených dětí na jeden porod v sledovaném souboru PCOS vs. kontrolní

76