MENDELOVA UNIVERZITA V BRN AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁ SKÁ PRÁCE
BRNO 2014
ELIŠKA VRÁNOVÁ
Mendelova univerzita v Brn Agronomická fakulta
Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zví at
Využití modelu virginní mléčné žlázy jalovice ke studiu imunologických vlastností bun k obranného systému mléčné žlázy skotu. Bakalá ská práce
Vedoucí práce: prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D.
Vypracovala: Eliška Vránová
____________________________________________________________ Brno 2014 2
Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: „Využití modelu virginní mléčné žlázy jalovice ke studiu imunologických vlastností bun k obranného systému mléčné žlázy skotu.“ vypracoval/a samostatn a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zve ejn na v souladu s § 47b zákona č. 111/1řřŘ Sb.,o vysokých školách ve zn ní pozd jších p edpis a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si v dom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 1Ň1/Ň000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brn má právo na uzav ení licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že p ed sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou Ěsubjektemě si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že p edm tná licenční smlouva není v rozporu s oprávn nými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit p ípadný p ísp vek na úhradu náklad spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brn dne:………………………..
…………………………………………………….. podpis
8
Pod kování
Tímto chci pod kovat vedoucímu mé bakalá ské práce prof. MVDr. Zbyšku Sládkovi, Ph.D. za jeho cenné rady, odborné informace a pomoc p i získávání podklad k bakalá ské práci.
8
Abstrakt Mléčná žláza je hlavním produkčním orgánem v chovech dojeného skotu. V současnosti jsou aktuálním problémem mastitidní onemocn ní mléčné žlázy, která mají znatelný ekonomický dopad. Bakalá ská práce se ve stručnosti zabývá anatomickou stavbou virginní mléčné žlázy neb ezích jalovic a pojednává o využití modelu virginní mléčné žlázy jalovice ke studiu imunologických vlastností bun k. Popisuje jeho první využití, protože použitá metodika je základem pro následné výzkumy provád né na virginní mléčné žláze. Práce má také za cíl sumarizovat využití modelu ve výzkumné praxi. Výzkumy se zabývaly ultrastrukturou a funkční charakteristikou bun k p ed a v období indukovaného zán tu, jeho intenzitou a dobu rezoluce dle použitého činitele. Dále pak hodnotí klady a zápory ve využití virginní mléčné žlázy, oproti adultní mléčné žláze v období involuce, či laktace. Klíčová slova: jalovice, virginní mléčná žláza, LPS, polymorfonukleární leukocyty, makrofágy
Abstract The mammary gland is the main production body in dairy cattle breeding. These days are current problems of mastitis disease of the mammary gland, which have an appreciable economic impact. Bachelor thesis briefly describes the anatomical structure of virgin mammary gland of non-pregnant heifers and discusses the use of model virgin mammary gland of heifers to study the immunological properties of the cell. Describes its first use, because the methodology used is the basis for subsequent work performed on virgin mammary gland. The work also aims to summarize the use of the model in research practice. Research reviewed the ultrastructure and functional characteristics of the cells before and during induced inflammation, its intensity and time of resolution by used agents. Furthermore, evaluating the pros and cons of using virgin mammary gland, compared to the adult mammary gland during involution, or lactation. Key words: heifer, virgin bovine mammary gland, LPS, polymorphonuclear leukocytes, macrophage
8
OBSAH 1
ÚVOD............................................................................................................. 8
2
MORFOGENEZE MLÉČNÉ ŽLÁZY SKOTU ............................................ 9
3
4
2.1
Prenatální vývoj mléčné žlázy ................................................................ 9
2.2
Postnatální vývoj mléčné žlázy ............................................................... 9
ůNůTOMIE MLÉČNÉ ŽLÁZY ................................................................. 10 3.1
Žláznaté t leso ....................................................................................... 10
3.2
Struk ...................................................................................................... 11
3.3
Záv sný aparát ...................................................................................... 12
3.4
Cévní zásobení ...................................................................................... 13
3.5
Lymfatický systém ................................................................................ 13
3.6
Nervový systém ..................................................................................... 14
3.7
ůnatomie virginní mléčné žlázy ........................................................... 14
BU KY IMUNITNÍHO SYSTÉMU ........................................................... 17 4.1
Bu ky nespecifické imunity mléčné žlázy ............................................ 17
4.1.1 Neutrofilní granulocyty ..................................................................... 18 4.1.2 Eosinofilní granulocyty ..................................................................... 18 4.1.3 Monocyty ........................................................................................... 18 4.2
Bu ky specifické imunity ..................................................................... 19
4.2.1 NK bu ky .......................................................................................... 19 5
MODEL VIRGINNÍ MLÉČNÉ ŽLÁZY ů JEHO VYUŽITÍ ..................... 20 5.1
Virginní mléčná žláza ........................................................................... 20
5.2
Mléčná žláza v involuci ........................................................................ 22
5.3
Využití virginní MŽ ve výzkumu ......................................................... 24
5.3.1 Morfologická charakteristika bun k obranného systému .................. 25 5.3.1.1 Studium bun k pomocí optického mikroskopu .......................... 25
8
5.3.1.2 Studium bun k pomocí elektronového mikroskopu ................... 27 5.3.2 Funkční charakteristika bun k obranného systému ........................... 32 5.3.3 Charakteristika zán tlivé odpov di virginní mléčné žlázy skotu ...... 33 5.3.4 Infekce virginní mléčné žlázy ........................................................... 35 5.3.5 Limity využití modelu virginní MŽ .................................................. 37 6
ZÁV R ......................................................................................................... 38
7
SEZNůM POUŽITÉ LITERůTURY .......................................................... 39
8
SEZNůM OBRÁZK , TůBULEK ............................................................. 43
8
1
ÚVOD
Mléčná žláza ĚMŽě je vývojov vysoce specializovaná kožní žláza určená primárn k výživ mláďat. Šlecht ním na mléčnou produkci byla mléčná žláza skotu p em n na v mohutný orgán sloužící k produkci jedné z hlavních složek výživy člov ka - mléko. Tyto morfologické zm ny vedly ke snížení její obranyschopnosti, která klesá se zvyšováním mléčné užitkovosti. Snížená imunita pak vede k čast jšímu výskytu mastitidních onemocn ních. Je jisté, že mastitidy mají citelný negativních dopad na ekonomiku chovu dojeného skotu. Vzhledem k tomuto faktu a současn
pot eb
kvalitního, patogen prostého mléka je nezbytn nutné porozum t imunitnímu systému mléčné žlázy. Páte imunity bovinní MŽ tvo í rezidentní obranné mechanismy nespecifické obranné prost edky - k že, sliznice a bun čná imunita. Somatické bu ky jsou velmi d ležité. Nejpočetn ji jsou zastoupeny neutrofilními granulocyty, makrofágy, lymfocyty a NK - bu ky. Ke studiu funkce a míry exprese konstitutivních
fenotypických znak
jednotlivých druh imunitních bun k MŽ je využívána buď pln vyvinutá laktující mléčná žláza, nebo virginní mléčná žláza jalovic. Zavedení modelu virginní mléčné žlázy je výsledkem snahy v dc o jednoduchý systém získávání dostatečn velkého množství imunitních bun k pro in vitro studium. Model lze použít bez pot eby dojení a zárove má virginní MŽ již zcela dokončený vývin a luminizaci struku, mléčné cisterny a mlékovod , kde m že být kdykoliv proveden výplach pro zjišt ní množství, typu a funkčních charakteristik zkoumaných bun k.
8
2
MORFOGENEZE MLÉČNÉ ŽLÁZY SKOTU
2.1 Prenatální vývoj mléčné žlázy Lze pozorovat samotný vývoj mléčné žlázy začínající již v prenatálním období, z ektodermu a mezodermu a to u obou pohlaví. Již p i velikosti embrya 1,4-1,7 cm (34. den gravidity) lze pozorovat dv tzv. mléčné čáry, které se tvo í na ventrální stran trupu v celé jeho délce od t íselné krajiny až k podpažní jamce ĚLawrence, Ň00Ňě. Ty dále zesilují mezi pupkem pánevními končetinami, vytvá ejí mléčné lišty, které se následn p íčn d lí ĚMarvan et al., 1řřŇě. Po 4Ň. dni, kdy embryo nar stá do velikosti asi 2 cm, lze pozorovat již samostatné mléčné hrbolky, jeden pro každý budoucí struk. Pod t mi se dále množí bu ky sm rem do mezodermu a vytvá í tak primární čepy, které lze zjistit p i velikosti plodu asi 1Ň-15cm (Mustafa, 2001). Primární čepy se dále zv tšují a d lí na sekundární a pozd ji na terciární čepy. Soub žn s množením bun k čep se množí vazivové bu ky, které čepy obklopují. Ty budou v budoucnu tvo it vazivové stroma vemene (Marvan et al., 1992). S dalším vývojem se primární čep protahuje, tvo í strukový kanálek a mlékojem, jež p ed porodem luminizuje. Sekundární čepy dávají vzniknout hlavním mlékovod m, které jsou v dob porodu luminizovány a z terciárních čep vznikají pak v mlékovody menší, neluminizované (Lawrence, 2002).
2.2 Postnatální vývoj mléčné žlázy P i narození má tele vyvinuty z každého mléčného hrbolku jednu jednoduchou mléčnou žlázu. Ta je patrná jen jako krátké struky a zatím velmi nepatrn vyvinutý tukový polštá na její bázi ĚMarvan et al., 1řřŇ). Mléčná žláza se u samic do v ku asi ň m síc zv tšuje izometricky, tj. adekvátn ke zv tšování hmotnosti a velikosti t la, p ičemž nejvíc roste tukový polštá . V této fázi bývá označována jako juvenilní mléčná žláza. Pozd ji, vlivem puberty, začínají na vaječníku dozrávat folikuly, a začíná produkce estrogenu. Jeho vlivem dochází k proliferaci vaziva, tukové tkán a r stu epiteliálních čep . Mimoto dochází k jejich v tvení a tím ke vzniku menších mlékovod . Poté se proliferace zastavuje a to až do zab eznutí ĚKönig a Liebich, Ň00Ňě. Mléčná žláza v tomto stupni vývoje je označována jako virginní.
9
3
ANATOMIE MLÉČNÉ ŽLÁZY
3.1 Žláznaté t leso Hlavní součástí každé čtvrt je žláznaté t leso Ěcorpus mammaeě uložené nad bází struku. Každé t leso se skládá z parenchymu tvo eného žlázovými laloky Ělobi mammariiě ledvinovitého, čast ji však ovoidního tvaru o velikosti 2-5mm. Ty jsou tvo eny z menších- primárních lal čk Ělobuli mammarii) velkých 0,5-1mm. Žlázový parenchym spojuje na všech úrovních intersticiální vazivo (Marvan et al., 1992). St edem každého primárního lal čku prochází intralobulární vývod, do kterého se otevírá krátkými sekrečními tubuly 100-Ň00 sekrečních alveol o velikosti 150-Ň50 μm. Alveoly a tubuly jsou vystlány jednovrstevným sekrečním epitelem. Z vn jší strany jsou pokryty tenkou bazální membránou, kterou obklopují myoepiteliální bu ky schopné kontrakcí, čímž napomáhají vytlačování secernovaného mléka dál do vývodných cest ĚKomárek a Dvorský, 1řřřě. Další vývodné cesty jsou interlobulární vývody, které se sbírají do tzv. sekundárních mlékovod Ěduktus lactiferi). Sekundární mlékovody se spojují do 8-15 hlavních mlékovod odvád jících mléko do mlékojemu Ěsinus lactiferi). Ve st n vývodných cest nacházíme myoepiteliální bu ky a siln jších hladkosvalové sv rače zadržující mléko do začátku dojení/sání ve vyšších oddílech MŽ ĚReece, Ň011ě. Mlékojem je dutina o objemu 0,5-Ň,5 litru skládající se ze Ň částí. Dorzáln obrácená, rozší ená část, která je uložena ve ventrální části parenchymu mléčné žlázy, tedy žlázová část mlékojemu (pars glandularis sinus lactiferi) vyklenující se v četné dutiny, do kterých ústí mlékovody. Ventráln pak mlékojem p echází zúženým otvorem do 5-6 cm dlouhé strukové části Ěpodle Marvan et al., 1992).
10
Obrázek 1: ůnatomie laktující MŽ
(Budras a Habel, 2003)
3.2 Struk Struk (papilla mammae) je 5-10 cm dlouhý 2,5-ň cm široký mírn kuželovitý, ke konci zahrocený útvar na ventrálním konci každé čtvrt vemene ĚKönig a Liebich, 2002). Hrot struku a vývod strukové části mlékojemu spojuje strukový kanálek Ěductus papillaris) 8-10 mm široký, 6-7 mm dlouhý. Ve ventrální části kanálku se nachází sv rač Ěm. sphincter papillare) (Komárek a Dvorský, 1999).
11
Obrázek 2: Sagitální ez strukem
(König a Liebich, 2002, snímek poskytl dr. S. Reese, Mnichov)
3.3 Záv sný aparát Vemeno je fixováno ve své poloze a tvaru záv sným ústrojím Ěapparatus suspensorius mammariusě, které je složeno ze dvou list mediálních a dvou laterálních. Mediální část záv sného ústrojí odstupuje v kraniální části ze žluté b išní povázky Ětunica flava) v kaudální z ventrální strany pánevní spony (Dvorský et al., 1999). Jedná se o dva listy tvo ené kolagenním elastickým vazivem. Vzájemn se pojí ídkým vazivem, čímž splývají v jediný mediální list (lamina medialis) (Najbrt, 1982). Z laterální strany je vemeno upev ováno laterálními listy odstupujícími ze žluté b išní povázky, obalujícími t lesa mléčné žlázy p i bázi struk a sr stající ve strukovou st nu. Od t chto dvou hlavních částí se dále odpojuje 7-10 menších vazivových lamel (lamellae mediales et lateralesě ĚČerný, Ň00Ňě, které pronikají do parenchymu mléčné žlázy a částečn jej tímto rozd lují na n kolik polokruhovitých lalok , p ičemž se pevn spojují s intersticiálním vazivem (Marvan et al., 1992).
12
3.4 Cévní zásobení Majoritní zdroj krve pro vemeno p ivádí zevní stydká tepna Ěa. pudenda externa), která p ivádí krev do kaudální oblasti b išní dutiny k MŽ. Dále p echází v menší kraniální vemennou tepnu (a. mammaria cranialis) a u krávy a klisny prochází dorzáln nad vemenem ve ventrální části b išní st ny ĚČerný, Ň00Ňě. Z vemenné tepny dále odstupují vemenné v tve Ěrr.mammarii) zásobící kraniální část vemene. Mimo výše popsané je část kaudálních čtvrtí vemene zásobena krví z vnit ní stydké tepny ( pudenda interna) (Komárek, Dvorský 1999). Odvod krve z vemene zabezpečují vemenné žíly a ze struk 4 strukové žíly Ěvv. papillares) jdoucí od hrotu, p es vazivo až ke strukové bázi a tvo í tak plexus papillaris. Strukové žíly dále probíhají společn s tepnami mezi laloky mléčného t lesa a postupn se vlévají do hlavní žíly odvád jící krev z vemene (König a Liebich, 2002). To zabezpečuje kraniální vemenná žíla Ěs.v. mammaria cranialis), která prochází základnou vemene a „klikat “ pokračuje kraniálním sm rem. Kraniální vemenná žíla se pak spojuje s povrchovou kraniální nadb išní žílou do tzv. mléčné žíly Ěv. epigastica caudalis superficialisě, která dále sm uje k mečové krajin , kde v úrovni Ř. žebra na tzv. mléčné studánce vstupuje do dutiny b išní. Zde se vlévá do zadní duté žíly a dále do srdce. Na opačnou stranu tzn. kaudálním sm rem zabezpečuje odtok krve zevní stydká žíla Ěv. mammaria caudalisě, sm ující do krajiny hráze ĚČerný, Ň00Ň; Marvan et al., 1992).
3.5 Lymfatický systém Jelikož je strukový kanálek snadným vstupem patogen do dutinového systému MŽ, musí mít vemeno vyvinutý mízní systém. Tento systém vede od struk , p es intersticium žláznatých t les a k ži. Mízu odvádí do nadvemenných mízních uzlin (inn. mammari), které jsou 6-10 cm dlouhé a 2-4 cm široké ĚMarvan et al., 1řřŇě. Jsou vyvinuty dv nadvemenní mízní uzliny pro každou polovinu vemene, p ičemž jedna z nich dor stá pouze čtvrtinové až poloviční velikosti. Krom t chto uzlin nalezneme ve vemeni u 60 % krav nitrovemenné mízní uzliny, nacházející se podél žlázového oddílu mlékojemu, v tšinou v počtu 1-5 ks. (Komárek a Dvorský, 1999; Frandson, et al., 2009)
13
3.6 Nervový systém Na inervaci vemene se podílí nervy odstupující z bedrok ížové pleten . Bederní oblast inervuje kraniální nerv a centrální část MŽ inervuje pohlavn stehenní nerv Ěn. genitofemoralis), který vychází z 2., 3. a 4. bederního nervu ĚČerný, Ň00Ňě. K vemeni vstupuje t íselným kanálem. Krom
senzitivních vláken jdoucích od receptor
strucích obsahuje sliznice mlékojemu podél mlékovod
ve
vlákna sympatická, která
p echázejí do vemene podél tepen, kde inervují hladkou svalovinu, sekreční a myoepiteliální bu ky (Komárek a Dvorský, 1999). K ži v kraniální části inervuje kyčeln b išní nerv Ěn. iliohyppogastricus) a kyčeln t íselný nerv Ěn.ilioinguinalis), které odstupují jako ventrální v tve 1. a 2. bederního nervu (Najbrt, 1982). Mediální část inervuje skrytý nerv (n. saphenus) a kaudální část v tve stydkého nervu (ramus mammarius pudendi), které inervují nadvemenní asu ĚKomárek a Dvorský, 1999). Je s podivem, že v obdobné literatu e neexistuje dostatečné množství prací o anatomii virginní MŽ skotu.
3.7 Anatomie virginní mléčné žlázy V porovnání s laktující MŽ se virginní MŽ liší nižším stupn m diferenciace vývoje struktur. Jedinou viditelnou strukturou jsou struky, které jsou delší u p edních čtvrtí. Pr m rná délka je Ň-ň cm a ší ka 1 cm Ěviz obrázek 4). Na hrotu struku je patrný vstup do strukového kanálku. Vemeno neprominuje nad povrch ve stydké krajin a ztrácí se v ochlupení (viz obrázek 3). Z dutinového systému lze pozorovat již zcela vyvinuté následující struktury. Jsou jimi strukový kanálek, struková a žlázová část mlékojemu a mlékovody hlavní i menší Ěviz obrázky 5 a 6ě. Již jsou tedy luminizovány primární, sekundární i terciární čepy. Sekreční parenchym zatím zcela chybí, jeho vývoj prob hne až v posledním trimestru b ezosti. Jak je patrné hlavn na obr. č. 5, z tkání virginní MŽ dominuje tukové a intersticiální Ě ídké kolagenníě vazivo zabírající více než 60 % prostoru.
14
Obrázek 3: Virginní MŽ neb ezí jalovice, poled z levé strany
(Vránová, 2014) Obrázek 4: Virginní MŽ neb ezí jalovice, pohled zezadu
(Vránová, 2014)
15
Obrázek 5: ez pravou polovinou virginní MŽ s nást ikem dutinového systému
(Vránová, 2014) Obrázek 6: Detail dutinového systému pravé kaudální mléčné žlázy
(Vránová, 2014)
16
4
BU KY IMUNITNÍHO SYSTÉMU
Bu ky imunitního systému MŽ se nazývají bílé krvinky, leukocyty. Jsou to jaderné bu ky, které se d lí podle p ítomnosti či nep ítomnosti granul v cytoplazm
na
granulocyty a agranulocyty ĚTrávníček a Kroupová, Ň00ňě. Granulocyty jsou d leny na ň typy podle schopnosti granulí barvit se kyselým barvivem (eozin-červenýě tzv. eozinofily, nebo zásaditým barvivem Ěhematoxylinmodrý) tzv. basofily a poslední neutrofily, které se výrazn nebarví žádným barvivem, ačkoliv ob barviva slab p ijímají ĚMarvan et al., 1řřŇ, Trávníček a Kroupová, 2003) ůgranulocyty granule neobsahují. Mají pom rn velké ledvinovité či kulovité jádro. Jsou rozd leny na Ň skupiny a to na monocyty, jež jsou nejv tší bu ky krve se schopností fagocytózy, proto je nazýváme makrofágy a lymfocyty, které se liší velikostí, místem vzniku, životností a
schopností zprost edkovat a distribuovat
informace po organismus (Reece, 2011). Tabulka 1: Počet leukocyt v litru krve skotu Živočišný druh
Celkem leukocyt [G/l]?
skot
7-10
Neutrofily [%]
Lymfocyty [%]
Monocyty [%]
Eozinofily [%]
Bazofily [%]
25-30
60-65
5
2-5
<1
(dle Reece, 2011)
4.1 Bu ky nespecifické imunity mléčné žlázy Na imunitní obran mléčné žlázy skotu se primárn nepodílí všechny skupiny bun k imunitního systému. Hlavn díky vysoké prom nlivosti prost edí má nejd ležit jší funkci nespecifická imunita, kdy jsou bu ky schopné velice rychle reagovat na cizorodé podn ty nacházející se v krvi a orgánech ĚFrandson, Ň00řě. Tyto bu ky zahrnují: neutrofilní granulocyty (mikrofágy), eosinofilní granulocyty a monocyty (makrofágy) zajišťující nespecifickou bun čnou imunitu a také NK bu ky, což je subpopulace velkých cytotoxických lymfocyt , která zajišťuje specifickou humorální imunitu ĚKová , Ň00ňě.
17
Všechny tyto bu ky odpovídají v rámci minut až hodin na proteinové, lipidové a cukerné struktury unikátní pro bakteriální bun čné st ny a na další látky charakteristické pro tumorové bu ky ĚReece, Ň011ě. Jejich p sobení je zprost edkováno fagocytózou a komplementovým systémem, p ičemž bu ky, které jsou jimi napadeny, umírají hlavn osmotickou lýzou, nebo apoptózou. Cytokininy produkované bu kami nespecifické imunity také aktivují bu ky specifické imunity ĚKová , Ň00ňě. 4.1.1 Neutrofilní granulocyty V literatu e tyto bu ky najdeme také pod názvy polymorfonukleární leukocyty (dále jen PMNě či neutrofily. Jsou to jedny z hlavních obranných bun k mléčné žlázy skotu. Mají kulovitý až ovoidní tvar, tyčinkovité či segmentované jádro v závislosti na stá í bu ky (Toman, 2009). V jejich cytoplasm jsou p ítomná granula, barvící se r žov , stejn jako cytoplasma. Díky své velikosti 9-1Ň μm a schopnosti fagocytózy jsou též nazývány mikrofágy (Frandson et al, 2009). Zralý neutrofilní granulocyt nese molekuly CD15, CD33 a částečn CD1ň. Od eozinofil se liší vyšší mírou výskytu molekul CD15 a CD13 (Krejsek a Kopecký 2004). PMN likvidují mikroorganismy p i zán tlivých procesech, diapedézou, jsou schopny p estoupit p es endotelové výstelky cév do tkán , kde sm r jejich pohybu udává chemotaxe ĚKová , Ň00ňě. Ve tkáni p ežívají 4-5 hodin. P i fagocytóze jsou mimo jiné schopny vyloučit enzymy zp sobující lokální zán t a také produkovat značné množství cytokin ĚFrandson et al., Ň00řě. 4.1.2 Eosinofilní granulocyty Eosinofilní granulocyty jsou u skotu zastoupeny v nižším množství než neutrofily a p i obran
MŽ mají menší význam. Vyznačují se améboidním pohybem a pomalejší
selektivn jší imunitní aktivitou. Jejich podíl se v periferní krvi zvyšuje p i alergické reakci a p i parazitárním onemocn ní (Ková , Ň00ňě. Jejich primární funkce je stimulace alergické reakce fagocytózou komplex antigen-protilátka, nebo její regulace potlačením n kterých mediátor , nap . histaminu ĚFrandson et al., Ň00řě. 4.1.3 Monocyty Monocyt po p esunu z krve do tkání vyzrává v makrofág (MAC) (Toman, 2000). Makrofágy, stejn jako neutrolily, jsou schopny na základ chemotaxe prostupovat do
18
tkání, kde je mikrobiální napadení ĚMarvan, 1řřŇě. Tyto bu ky mají širokou paletu membránových receptor pro identifikaci velkého počtu cizorodých agens. Monocyty určitý čas cirkulují v krvi, až jsou jako zralé vyplaveny na periferii. V té dob v nich probíhají specifické zm ny v expresi povrchových molekul. Nakonec jsou zachycovány v orgánech a p em ovány na tká ové makrofágy ĚKrejsek a Kopecký Ň00řě. Krom fagocytózy, mají makrofágy hlavní roli v regulaci zán tlivých reakcí vylučováním n kterých složek komplementu, interleukin
a interferon
(Frandson et al, 2009).
4.2 Bu ky specifické imunity 4.2.1 NK bu ky Jsou to velké granulární lymfocyty s ledvinovitým jádrem a načervenalými granulemi v cytoplasm . Podílejí se, produkcí cytokin , na narušení nádorových bun k a bun k napadených virem. NK bu ky nesou specifické molekuly. První je CD56, označovaná NCAM-1 (Neutral Cell Adhesion Molecule-1ě odpov dná za homotypické adhezní interakce s bu kami, dále CD16, která slouží jako nízkoafinitní receptor pro IgG. Na základ této vazby jsou pak NK bu ky schopny identifikovat a usmrcovat napadené bu ky. Tato schopnost je označována jako cytotoxicita závislá na protilátce ĚůDCC Antibody Dependent Cell Cytotoxicityě. Výskyt t chto dvou specifických molekul se liší v r zných částech t la ĚKrejsek a Kopecký Ň004ě. Somatické bu ky mají význam pro zachování homeostázy a zdraví MŽ, což je podmínkou pro zisk kvalitního a zdravotn nezávadného mléka. Proto je d ležité tyto bu ky studovat. Metodicky je jednodušší studovat krevní bu ky oproti mammárním, jelikož jejich izolace z krve je snadná. V p ípad MŽ však interferuje mléčný tuk a kaseinové micely. To vyžaduje odstran ní t chto komponent ze vzork pro použití metod jako je nap íklad pr toková cytometrie, ELISů, atd. Nabízí se tak možnost získat k analýze bun k obranného systému MŽ bu ky z dutinového systému nelaktující, tedy zaprahlé vysokob ezí dojnice a nebo z MŽ neb ezí jalovice, tzv. virginní MŽ. Využití t chto žláz k získání imunitních bun k k v deckému zkoumání je p edm tem následných kapitol.
19
5
MODEL VIRGINNÍ MLÉČNÉ ŽLÁZY A JEHO VYUŽITÍ
5.1 Virginní mléčná žláza Poprvé byla virginní MŽ použita v roce 1ř75 týmem mikrobiolog z University of Saskachewan, vedená Richardem C. Wardleyem. Tato pilotní studie byla zam ena pouze na získávání bun k po stimulaci MŽ jalovic, jakožto možnost získávání bun k k in vitro studiím. Vzhledem k tomu, že se jednalo o první studii tohoto druhu, na kterou navázali další v dečtí pracovníci, je dále podrobn vysv tlena. Pro sv j pokus využili Wardley a jeho spolupracovníci Ě1ř76ě 5 zdravých jalovic. Dv z jalovic byly plemene Hereford, jedna Holštýnského plemene a jedna k íženka t chto dvou plemen, všechny ve stá í Ň-4 let. P ed pokusem byly struky, stejn
jako infuzní katetr desinfikovány 70 %
etanolem. Následn bylo pomocí katetru vpraveno strukovým kanálkem do každé čtvrti 5 μg lipopolysacharidu ĚLPSě (sérotyp 0128:B12, Difco labratories, Detroit) rozpušt ného v 5 ml media dr. Pucka. O 6 hodin pozd ji bylo vpraveno dalších 10 ml media dr. Pucka, provedena masáž vemene a následný odb r laváže z každé čtvrti zvlášť. První, t etí, čtvrtý a pátý den byly jednotlivé čtvrt opakovan vyplachovány 10 ml media dr. Pucka. Pro získání bun k byl celý vzorek odst ed n a následn Ňx promyt media dr. Pucka a resuspendován v roztoku RPMI 1640 dopln ným 10% fetálním sérem (FCS). Životaschopné bu ky byly počítány hemocytometrem a následn
odst ed ny
centrifugou. Takto získané bu ky byly barveny metodou dle Wright-Giemsa. Pro identifikaci jednotlivých typ bun k bylo pot eba počítat minimáln ň00 bun k ve vzorku. ůplikace LPS vedla ke zvýšení totálního počtu bun k 6 hodin po stimulaci až na 4200×106 v mililitru. Ve v tšin p ípad byly nalezeny neutrofily, kdežto makrofágy a lymfocyty byly zastoupeny v menšin . První zjišt nou zajímavou skutečností byla p ítomnost dvou odlišných typ makrofág : kulatý monocytární typ bun k s pr m rem 10-Ň5μm, s kulatým až oválným jádrem obarveným tmav
fialovomod e s nejasným chromatinem a slab
basofilní,
nevakuolizovanou cytoplasmou. Druhým typem nalezených bun k byly již pln vakuolizované mononukleární fagocyty, takzvané makrofágy. Tyto makrofágy jsou 20
bu ky s pr m rem 1Ř-40 μm, ledvinovitým či laločnatým jádrem, velkým množstvím cytoplasmy s granuly a dlouhými pseudopodii a s velkým množstvím vakuol. Krom uvedených dvou typ , bylo možné sledovat značné množství jejich p echodných forem. Množství a pom r obou typ se zvyšoval s prodlužujícím se časem od stimulace MŽ pomocí LPS. Po stimulaci p evládaly bu ky monocytárního typu, jejichž množství v ň. až 4. den dosahovalo Ř0-90% zastoupení a byly tam nalezeny i mononukleární makrofágy, které tvo ily asi 10-20% z celého počtu bun k tohoto typu. Dále bylo v dci pozorováno, že první den po vpravení LPS dominovaly ve výplachu z ř0 % neutrofily, bu ky s laločnatým jádrem a granuly v cytoplasm . Mononukleární fagocyty, makrofágy a lymfocyty se zde nacházely po 5 %, tento pom r se však tak ka diametráln zm nil v následujících t ech dnech. T etí den se množství neutrofil snížilo na ň0 %, lymfocyty se zvýšily na Ň0 %, monocyty a makrofágy na 50% a čtvrtý den dokonce na 65 % (viz tabulka 2). Tabulka 2: Procentické zastoupení jednotlivých typ bun k získaných po stimulaci LPS Bu ky čas po stimulaci: neutrofily leukocyty monocyty makrofágy
6-24 hod 90 % 5% 5%
čas po stimulaci: 72 hod 30 % 20 % 50 %
96 hod 20 % 20 % 65 % Z toho až ř0 % makrofágy
(dle Wardley et al., 1976) Tímto pokusem tedy Wardley et al. Ě1ř76ě demonstrovali vhodnost využitím modelu pro snadné získání početné a navíc čisté populace imunitních bun k. Odb r m že být provád n opakovan , bez jakéhokoliv poškození zdraví MŽ. V závislosti na čase mohou být úsp šn získávány početné populace p evážn neutrofil prvý den, nebo mononukleárních fagocyt , a to t etí a čtvrtý den po stimulaci. Na druhou stranu nevýhodou tohoto postupu je možné ovlivn ní bun čných struktur využitím LPS, což je silný chemoatraktant s prozán tlivým účinkem. Proto lze použít ke stimulaci MŽ relativn imunologicky inertní fyziologický roztok ĚPBSě.
21
5.2 Mléčná žláza v involuci Jak bylo uvedeno výše, vedle virginní MŽ je možné využít MŽ v období stání na sucho. V tomto období není dojnice dojena a MŽ není funkčn
exploatována. Proto se
z funkčního hlediska nabízí srovnání virginní mléčné žlázy s mléčnou žlázou v involuci. MŽ v involuci použili Desiderio a Campbell (1980) z Cornell University v Ithace v roce 1980. D vodem porovnání MŽ v rozdílném funkčním stavu je využití nelaktující mléčné žlázy. Žláza netvo í mléko, které tedy ne edí výslednou suspenzi bun k a rovn ž výsledky neovliv uje p ítomnost dalších složek mléka, jako jsou kapénky mléčného tuku, cytokiny, chemotaktiny, protilátky, atd. Desiderio a Campbell Ě1řŘ0ě využili pro získání bun k dosp lé krávy období stání na sucho. Postup odb ru: jako prevence proti zavlečení infekce byl použit sterilní katetr a struk omyt 70 % etanolem. Do MŽ byl katetrem vpraven sterilní isotonický roztok o objemu 50 ml do každé čtvrt . Následn prob hla masáž vemene a sb r vzniklé suspenze do sterilní zkumavky. Dále bylo použito 5 ml Media 199 (Grand Island Biological Supply Co, Grand Island, NY) spolu s Hankovou bází dopln nou 0,25% hydrolyzát laktalbuminu, 100 U/ml streptomycinu, 100 U/ml penicilinu a 25 U/ml mykostatinu. Roztoku bylo upraveno pH na 7,4 p idáním 7,5% hydrogenuhličitanu sodného. Následn byl celý vzorek odst ed n p i 250 g po dobu 15 minut. Po dekantaci supernatantu byla získaná peleta bun k op tovn resuspendována do 10 ml Media 199. ůby bylo možné získat standardizovanou suspenzi bun k Ěo známé koncentraciě byly takto na ed né bu ky, pro zjišt ní jejich počtu, obarveny pomocí trypanové mod i. Následn byl vzorek bun k na ed n Mediem 1řř tak, aby byla získána p esná koncentrace 2.106 makrofág /ml. Z vytvo ené standardizované suspenze byly odebrány vzorky o objemu 1 ml, naneseny do kultivačních kom rek a byly inkubovány p i ň7°C v prost edí 5 % oxidu uhličitého. Po hodin
byly vzorky promyty fyziologickým roztokem ĚPBSě pro
odstran ní neadherovaných bun k a detritu. K vrstv makrofág byl p idán 1ml Media Ň0, jenž je složením tém
totožné s výše zmín ným Mediem 199. Navíc toto médium
obsahovalo 20 % BFS (bovinní fetální sérum) a celý vzorek byl p i již zmín ných podmínkách inkubován p es noc. Tímto zp sobem byla instilace, výplach a následná kultivace opakována po dobu 10 dní. Výplachem MŽ v involuci byla získána smíšená 22
populace neutrofil , makrofág , lymfocyt , erytrocyt a neidentifikovaného bun čného detritu. Pokus demonstroval možnost získání velkého množství makrofág , kdy se jejich zastoupení po stimulaci zv tšovalo od 5. dne až na počet asi 6.106 makrofág /ml získaných mezi 7. -8. dnem. Pomocí adherence na sklíčko a promytím bylo získáno až 99 % čisté populace makrofág . ůbsolutní počty bun k v pr b hu pokusu znázor uje graf na obrázky 7. Procentické zastoupení jednotlivých typ bun k získaných 1. a 8. den je zaznamenáno na obr. č. Ř.
počet bun k *106/ml
Obrázek 7: Zm ny množství neutrofil a makrofág v jednotlivých dnech pokusu
8 7 6 5 4 3 2 1 0
neutrofily makrofágy 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
dny
(Desiderio a Campbell, 1980) Obrázek 8: Relativní procentické zastoupení bun k 1. a 8. den 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1. den 8. den
(Desiderio et al. 1980) Dominantní výskyt neutrofil
byl zaznamenán první až čtvrtý den, zatímco
v druhé polovin trvání pokusu byly majoritními bu kami makrofágy Ěviz obrázek 8) Z graf jasn vyplývá, že dominantními bu kami obranného systému mléčné žlázy jsou makrofágy, zejména 5. - 10. den po stimulaci MŽ. Pro studium morfologických struktur 23
byly bu ky barveny pomocí metody May-Grunwald-Giemsa. MAC byly nepravideln okrouhlé bu ky o velikosti pr m rn 35µm. P i cytochemické analýze u nich byla zjišt na aktivita lysozomové fosfatázy a serinové esterázy, avšak aktivita peroxidázy zaznamenána nebyla. Po 8denní stimulaci MŽ bylo zjišt no, že životaschopnost makrofág je více než ř5 %. Po hodinové inkubaci na sklíčku byly u adherovaných makrofág pozorovány typické morfologické rysy. Bu ky m ly excentricky umíst né protáhlé jádro s jasn patrným chromatinem ídce rozptýleným v jád e. Rovn ž byly pozorovány značné rozdíly v množství cytoplasmy, kdy část bun k byla na cytoplasmu velmi bohatá, zatímco jiná část jí m la jen malé množství. V p ípad fagosom bylo sledováno jejich rozmíst ní na periferii bu ky a okolo jádra. Další zm ny byly pozorovány po Ň4 hod kultivaci. Bu ky se začaly reorganizovat, fagosomy se p esouvaly k pól m jádra a celé bu ky se prodlužovaly do v etenovitého tvaru v délce 200-250 µm a tvo ily pseudopodia. Popsaná metoda stimulace a výplachu MŽ v involuci je jednoduchá, rychlá a nevyžaduje žádný zásah do tkán mléčné žlázy. Ten je b žný p i jiných metodách získáváni imunitních bun k zejména u laboratorních zví at. Z ejm
nejd ležit jší
výhodou této procedury je využití fyziologického roztoku (PBS) ke stimulaci MŽ. Tímto postupem se zajistí získání bun k ve stavu nejbližším jejich fyziologickému stavu. Model byl použit k ov ení možnosti získat bu ky pro studie a také byly t mito pokusy stanoveny technické a biologické limity. Je z ejmé, že ob MŽ-virginní a involovaná p inášejí možnost získat populace bun k obranného systému k in vitro studiím. Virginní MŽ má oproti involované MŽ p ednost v tom, že vysokob ezí zví e se nachází ve zcela jiném fyziologickém stavu. A dále je v tomto období MŽ vnímav jší k infekci ĚRyšánek, 1řŘ7ě.
5.3 Využití virginní MŽ ve výzkumu Virginní mléčná žláza jalovic byla podrobena studiu jak v oblasti jejího vývoje, tak ke studiu jejího obranného systému. V p ípad studia vývoje virginní MŽ se jednalo nap íklad o expresi významných gen , uplat ujících se p i mammogenezi samotné mléčné žlázy. Nap . byla studována 24
exprese gen pro r stové faktory TGF-α a TGF-1β ĚPlath et al., 1řř7ě, r stový faktor fibroblast ĚPlath et al., 1998), insulin-like growth factor - 1 (IGF-1, Plath-Gabler et al., 2001), nebo leptin a to v souvislosti se syntézou mléčných bílkovin a tuku (Feuermann et al., Ň004ě. Ve výše uvedených pracích byla virginní mléčná žláza použita jako jedno ze stádií mammogeneze spolu s ostatními vývojovými stádii, tedy laktující mléčnou žlázou a mléčnou žlázou v involuci. Vedle toho se v literatu e objevují práce, které pojednávají o mammogenezi. Počty t chto prací a jejich stručná charakteristika však p ekračují rozsah bakalá ské práce. Ve výše uvedených pracích byla virginní mléčná žláza použita jen jako jedno z vývojových stádií mammogeneze. Nejednalo se tedy o použití mléčné žlázy jako zdroje bun k obranného systému. Vedle toho byla virginní MŽ použita v imunologických studiích. Jednalo se o práce, které se zaobíraly základní morfologickou charakteristikou bun k obranného systému. Byla podrobn popsána struktura bun k, jejich terminální stavy- nekróza a apoptóza a dále základní funkční charakteristika t chto bun k. Vedle toho byla podrobena analýze samotná zán tlivá odpov ď virginní MŽ vyvolaná inetrními, prozán tlivými a infekčními činiteli. 5.3.1 Morfologická charakteristika bun k obranného systému Oproti laktující mléčné žláze, kde byla ultrastruktura bun k zpracována již v 80. letech minulého století Ěnap . Lee et al., 1řŘ0ě, nebyla ultrastruktura bun k virginní mléčné žlázy d íve studována.
5.3.1.1 Studium buněk pomocí optického mikroskopu Jako první byla studována morfologie imunitních bun k pomocí optického mikroskopu. Krom práce - Wardley et al. (1976), provedli podrobnou a rozsáhlou strukturální charakteristiku bun k virginní MŽ auto i Sládek a Ryšánek Ě1řřřě. Pokus byl provád n na vzorku 40 jalovic k íženek holštýnského a českého strakatého plemene ve v ku 151Ř m síc . Z celkového počtu 160 mléčných žláz bylo 1ň5 ĚŘ4,4%ě neinfikovaných nesecernujících, 7 Ě4,4%ě neinfikovaných aberantn infikovaných, které byly z výzkumu vy azeny.
25
secernujících a 1Ř Ě11,Ň%ě
Vzorky byly získány výplachem dutinového systému MŽ roztokem PBS, metodou dle Wardley et al. Ě1ř76ě. Následn byly zjišťovány absolutní a diferenciální počty somatických bun k z laváže Ěviz tabulka 3 a obrázek řě, procento lyzovaných bun k a morfologická charakteristika jednotlivých p ítomných typ bun k. Tabulka 3: Diferenciální počty fagocyt virginní MŽ Mléčná žláza
aberantn secernující
nesecernující
PMN
7,6
13,7
PMN normální
5,0
12,4
PMN lyzované
2,6
1,3
Pom r PMN n: l
2:1
10:1
MAC
72,0
56,4
MAC normální
43,5
50,3
MAC lyzované
28,5
6,1
Pom r MůC n:l
3:2
1:9
PMN : MAC
1:9
1:4
Ěpodle Sládek, Ryšánek 1řřřě
procentické zastoupení
Obrázek 9: Procentuální zastoupení PMN, MAC a lymfocyt 80
72 56.4
60 40 20
nesecernující MŽ
28.6 7.6
3 0.3
0 PMN
secernující MŽ
17.4
13.7 MAC
lymfocty ostatní bu ky
ĚSládek a Ryšánek, 1řřřě Popisovaná práce uvádí, že sledované PMN o velikosti 7,ň-9,5 μm jsou oválného, až eliptického tvar. Jádro je rozd leno na ň-5 segment poskládaných do tvaru C, S, 26
nebo L. Chromatin obarven tmav fialov a p evážn homogenní cytoplasma, zbarvená od sv tle r žova do sv tle červena s p ítomností r žových, či pr hledných granulí. Cytoplasmatická membrána tvo í pseudopodia. Krom
normálních neutrofil
byly
rovn ž zaznamenány r zné odchylky od normální struktury, jako nep ítomnost granulí, ztráta pseudopodií, či degenerace tvaru bu ky. Strukturální abnormalita PMN je práv to nové, co bylo touto studií objeveno. Oproti Wardley et al. (1976) bylo v této studii použito mnohem více zví at, výplach byl proveden inertním agens- PBS a byly popsány strukturální abnormality bun k. Makrofágy byly pozorovány ve dvou typech (viz str. 11, studie Wardley et al., 1976) a to nevakuolizované, vakuolizované a značné množství jejich p echodných stádií. Hlavní d vod pro tak značnou heterogenitu je proces maturace a fagocytární funkce makrofág . Nevakuolizované bu ky byly stejné morfologické struktury jako makrofágy krve, tudíž byly oválné, s velikosti 10-15 μm, s kulatým až oválným modrofialov se barvícím jádrem. Cytoplasma t chto bun k byla sv tle fialové barvy a byla p ítomna ve v tším množství než hmota jádra. Vakuolizované MůC byly u nesecernujících žláz p edstavitelem degenerujících MůC. U aberantn secernujících m ly tyto MůC p novou strukturu, kterou tvo ily fagocytované tukové částice, což odpovídá struktu e podobné jako u MůC laktující MŽ. Studie Sládek a Ryšánek Ě1řřřě tedy dále rozvinula poznatky, jež poprvé popsali Wardley et al. (1976) ve své práci. Výsledky mají v tší vypovídající schopnost, protože bylo použito mnohem více zví at. Výzkum pokračoval studiem ultrastruktury bun k virginní MŽ.
5.3.1.2 Studium buněk pomocí elektronového mikroskopu Charakteristické struktury imunitních bun k juvenilní MŽ byly dále mapovány pomocí elektronového mikroskopu. V literatu e jsou dostupné t i práce na toto téma. První výzkum v této oblasti provedli Sládek a Ryšánek v roce 1999, což bylo až Ň4 let po prvním použití modelu, kde byly tyto bu ky popsány. Další výzkumy již zmín ných autor následovaly v letech 2001 a 2005. Zájem byl sm ován k poznání a popsání struktur zejména PMN a MAC. Vzorky byly získány dle již výše popisovaného modelu, kdy byla k získání bun k použita laváž MŽ pomocí PBS a následná kultivace in vitro. K pokusu byly využity neb ezí k íženky holštýnského a českého strakatého plemene ve v ku 15-1Ř m síc . 27
Jak bylo popsáno výše, u strukturáln normálních, ovoidních až nepravidelných PMN bylo pozorováno segmentované jádro s denzním heterochromatinem, částečn adherovaným na membránu jádra. Sv tlý, jemn zrnitý euchromatin se nacházel ve st edu segment . V cytoplasm se nacházela výrazná granula rovnom rn rozmíst ná v celé ší i bu ky se znateln vyšší hustotou v oblasti konkávní strany jádra (viz obr. 10a, Sládek, Ryšánek, 1řřřě. Dále bylo zjišt no, že podle velikosti, tvaru a hustoty mohou být granula rozd lena na azurofilní a specifická. Početn jší- azurofilní granula o velikosti 0,3-0,7 μm byla kulatého, oválného, až činkovitého tvaru, hustá a homogenní. Mén početná specifická granula byla 0,1-0,ňμm velká, tvaru oválného až podlouhlého. V neposlední ad
byly v bu kách pozorovány mitochondrie, glykogenové částice
a fagosomy. Na povrchu bun k byla charakteristická pseudopodia ĚSládek a Ryšánek, 1999). Z pozorování vyplývá, že ultrastruktura neutrofil
virginní mléčné žlázy je
totožná s ultrastrukturou neutrofil laktující a zaprahlé mléčné žlázy ĚScham et al. 1ř71; Paape a Wergin, 1977; Lee et al, 1980; McDonald a Anderson, 1981; Paape et al, 2003). Jediným rozdílem je absence fagocytovaného tuku. Krom t chto normálních bun k, byly pozorovány degenerované PMN s kulatým jádrem či bez pseudopodií Ěviz obrázek 10b, Sládek, Ryšánek 1řřřě.
28
Obrázek 10: Ultrastruktura normálního a degenerovaného neutrofilu
Obrázek 10 (a) Normální PMN s vyznačenými specifickými Ěsě a azurofilními Ězě granulemi. (b) Degenerovaný PMN, ztráta pseudopodií. M ítko- 1μm. ůuto i dále popisovali ultrastrukturu makrofág . Stejn
jako v p edchozích
pracích Ěnap . Wardley et al., 1ř76ě byly zde pozorovány dva strukturáln odlišné typu. Nevakuolizované makrofágy, kulatého až ovoidního tvaru o velikosti 12-15 μm s ledvinovitým jádrem homogenní struktury (Sládek a Ryšánek, 1řřř; Sládek et al., 2006). Jaderný heterochromatin se nacházel v granulích na periferii jádra a lehce
29
granulovaný euchromatin v centru. Mohutný Golgiho komplex zabíral velkou část konkávní strany jádra. Krom výše zmín ných granulí obsahovala cytoplasma značné množství granul z endoplasmatického retikula, podlouhlé mitochondrie a glykogenové částice. Cytoplasmatická membrána tvo ila krátká pseudopodia Ěviz obr.11a, Sládek, Ryšánek, 1řřřě. Vakuolizovaný typ makrofág
byl nejv tším typem bun k v laváži. Bu ky
dosahovaly velikosti 20-40 μm. V cytoplasm se nacházelo značné množství denzních částic o velikosti 1,5 µm. Ve srovnání s nevakuolizovaným typem obsahoval menší Golgiho komplex, endoplasmatické retikulum a mén mitochondrií. Stejn jako u PMN byly i zde zjišt ny degenerované formy s částečn , či pln
chyb jící bun čnou
strukturou (viz obrázek 11b, Sládek, Ryšánek, 1řřřě. Z výsledk plyne, že ultrastruktura makrofág virginní MŽ je ekvivalentní ke struktu e MůC laktující a zaprahlé MŽ ĚScham et al. 1ř71; Paape a Wergin, 1977; Lee et al, 1980; McDonald a Anderson, 1981; Paape et al, 2003). Jediným rozdílem je pak absence fagocytovaného tuku.
30
Obrázek 11: Ultrastruktura normálního a degenerovaného makrofágu
Obrzek 11 (a) Nevakuolizovaný MAC s vyznačenými lysozomy (b) vakuolizovaný MAC, v cytoplasm denzní vakuoly Ědvě. M ítko- 1μm.
Ělě.
Na rozdíl od nesecernujících MŽ, kde byly dominantním typem nevakuolizované makrofágy; vakuolizované makrofágy byly v majoritním množství získány z mléčných žláz aberantn secernujících, kde fagocytovaly korpuskulární částice aberantní mléčné plasmy. MůC t chto žláz byly v tší, dosahovaly ň0-50 µm, m ly nepravidelný tvar, menší jádro excentricky umíst né na periferii bu ky a byly charakteristické ztrátou
31
pseudopodií. V cytoplasm
se nacházely vakuolizované tukové globule s dvojitou
membránou ĚSládek a Ryšánek, 1řřřě. Funkční charakteristika bun k obranného systému
5.3.2
Stejn jako morfologické zm ny bun k p i p echodu z krve do MŽ, je d ležitá znalost jejich reakce na antigen a fagocytární schopnost. Paape et al. (1978) dosp l k záv ru, že zvýšení výskytu klinických mastitid u laktujících krav je spojeno s nízkou účinností fagocytózy. Další auto i studující laktující MŽ se domnívali, že r zná fagocytární aktivita PMN m že být vhodným markerem pro určení resistence MŽ proti mastitidním onemocn ní ĚPaape et al., 1ř7Ř; Williams et al 1řŘ4ě. Miller et al., (1985) poukazovali na spojitost mezi množstvím produkovaného mléka a koncentrací opsoninu. P edpokládali, že p i stejném množství opsoninu u dojnic s menším nádojem a dojnicím s vyšším nádojem dochází k edícímu efektu. Zde by pak nižší množství opsoninu m lo odpovídat sníženému účinku fagocytózy. ůuto i Naidu a Newbould Ě1ř7ňě p edpokládali, že snížená schopnost fagocytózy PMN je zp sobena i nižším obsahem glukózy v mléce, což vede ke snížení glykogenu v bu kách, až o 38%. V této souvislosti byla také zjišt na zvýšená účinnost fagocytózy po p idání glukózy do média v in vitro ĚNewbould, 1ř7ňě. Taktéž bylo zjišt no, že baktericidní schopnost fagocyt v mléce je oproti krvi snížena i nízkou tenzí kyslíku, neboť mléko obsahuje až stokrát nižší koncentraci kyslíku, než krevní plazma ĚKlebanoff a Hamon, 1975). U studia virginní MŽ se tomuto tématu v novalo n kolik autor . První práci zam enou na fenotypovou funkční charakteristiku PMN MŽ neb ezí jalovice po indukované zán tlivé reakci publikovali v roce Ň001 Ryšánek et al. (2001). Tematicky tak navázali na své p edchozí výzkumy zabývající se ultrastrukturou imunitních bun k virginní mléčné žlázy ĚSládek a Ryšánek, 1řřřě. V této práci auto i porovnávali funkční charakteristiku PMN získaných výplachem MŽ oproti PMN získaným z krve. Variabilita charakteristik byla značná. Značný
rozdíl
byl
pozorován
v
p ípad baktericidní
aktivity
(P<0,05)
a chemiluminiscence kyslíkových radikál . U PMN získaných z dutinového systému MŽ byla pozorována vyšší fagocytární aktivita, rozdíl však nebyl statisticky významný. Z pokusu vyplývá, že nejv tší rozdíly funkční charakteristiky PMN po aplikaci činitele
32
indukujícího zán tlivou odpov ď byly mezi jednotlivými zví aty a nikoliv v p vodu PMN daného zví ete, krve, či MŽ, či jednotlivých čtvrtí. Z dalších pokus ĚWardley et al., 1ř67; Desierio a Caampbell, 1řŘ0; Sládek a Ryšánek, Ň001ě je z ejmé, že doba od aplikace činitele indukujícího zán tlivou odpov ď je významným zdrojem variability (P<0,01ě. Rovn ž činitel indukující zán tlivou odpov ď ovliv uje charakteristiku vzorku, kdy Ň4 hod po stimulaci bylo zjišt no ± ňx vyšší množství bun k zán tu po stimulaci LPS, než na PBS ĚP<0,05ě ĚRyšánek et al, 2001). 5.3.3 Charakteristika zán tlivé odpov di virginní mléčné žlázy skotu Zán t je jedním z nejvýznamn jších a fylogeneticky nejstarších obranných mechanism . Jedná se o složitou, vývojem získanou reakci na poškození tkání vyšších organism . Tento obranný mechanismus byl popsán již v období starého íma v díle De Medicina ĚCelsus, p eložil Spencer, 1řň5ě. Zán t se projevuje bezprost ední reakcí bun k nespecifické imunity a klinicky se projevuje čty mi základními znaky: ruborzarudnutí zp sobené p ekrvením tkán , calor - zah átí zán tlivého ložiska, dolor bolestivost, zp sobená biochemickými, fyzikáln -chemickými a mechanickými zm nami v zán tlivém ložisku, tumor - zdu ení zán tlivého ložiska. ůž kolem roku 1ř40 R. Wirchov popsal pátou fázi zán tu, tzv.: functio laesa, což je rezoluce zán tu, nebo naopak proces porušení funkce postiženého orgánu ĚHo ejší a Bart
ková, Ň005ě.
Pro sv j význam v produkčním systému je zdravá MŽ zárukou rentability chovu. Proto jsou zán tlivá onemocn ní MŽ významným p edm tem studia. U laktující MŽ je studium zán tlivé reakce ovlivn no tvorbou mléka a nutností jeho vydojování. Navíc je jak u laktující, tak u zaprahlé MŽ pom rn riskantní nap . použití experimentální infekce. O studiu bun k je možné nalézt r zné publikace, kdy se auto i zam ili na celkové a diferenciální počty bun k, zejména u lakujících MŽ (nap . Miller, Paape, 1991), nebo MŽ v involuci ĚDesiderio a Campbell, 1řŘ0, Nickerson, 1řŘŘě. ůuto i studovali imunitní odpov ď a vlastnosti MAC a PMN po stimulaci dutinového systému MŽ PBS ĚSládek a Ryšánek, Ň000, Ň001ě, nebo LPS ĚSládek, Ryšánek, Ň001, Ň00Ňě. ůnalýza bun k byla provád na pomocí barvení dle Pappenheima v optickém a rovn ž v elektronovém mikroskopu ĚSládek a Ryšánek, Ň000 a Ň001ě, p ípadn v pr tokové cytometrii (Sládek et al., 2002) 33
Prvním sledovaným ukazatelem byla rychlost migrace PMN z krve a jejich akumulace v dutinovém systému MŽ. Tato migrace- nebo-li zán tlivá odpov ď má za úkol eliminovat patogenní mikroorganismy pomocí fagocytózy. ůuto i Sládek a Ryšánek ĚŇ000ě uvád jí, že po stimulaci MŽ
následoval masivní influx PMN
vrcholící po 24 hodinách (51,4±3,25×106 v ml) (Sládek a Ryšánek, Ň000, Ň001ě. Současn byly pozorovány známky apoptózy neutrofil . Dále byl výplach provád n každých Ň4 hod. Ve stejnou dobu Ěpo Ň4 hodináchě se začaly objevovat makrofágy s fagocytovanými apoptickými neutrofily v cytoplasm . P ítomnost fagocytovaných apoptických PMN v makrofázích byla detekována myeloperoxidázovým testem (MPO). Jejich počet vrcholil 4Ř hodin po stimulaci PBS ĚSládek, Ryšánek, Ň000ě a 72 hod po aplikaci LPS ĚSládek, Ryšánek, Ň00Ňě a poté začal klesat. Nejnižší procento bylo zaznamenáno ř6 hod po influxu. Byly rovn ž pozorovány nekrotické PMN, které však nep ekročily ň% z celkového množství pozorovaných PMN. Na začátku pokusu byly z kontrolního vzorku všechny makrofágy MPO negativní ĚMPO-), tzn., neobsahovaly fagocytované apoptické PMN. Další testy prokázaly 10 % MPO pozitivních ĚMPO +) makrofág po prvých Ň4 hodinách a ňŘ,6±5,ř% MPO+ po osm a čty iceti hodinách. V tšina MPO+ MůC obsahovala více než 1 fagocytovaný apoptický PMN ĚSládek a Ryšánek, Ň000ě. Dále byla využitím pr tokové cytometrie zjišťována exprese molekuly CD14. Tato molekula p sobí jako ko-receptor (spolu s TLR 4 a MD-2) a hraje klíčovou roli p i detekci bakteriálního lipopolysacharidu (LPS). CD14 váže LPS v p ítomnosti lipopolysacharid-vázajícího proteinu (LBP) (Tapping a Tobias, 2000; Kitchens, 2000). Výsledky ukazují, že rezoluce zán tu vyvolané PBS nebo LPS byla doprovázena výraznou aktivaci fagocyt , což bylo patrné z nár stu podílu CD14+ bun k. Výsledky korespondovaly s p edcházejícími výzkumy ĚSládek a Ryšánek, Ň00Ňě. P i dokumentování zán tlivé reakce byla sledována i rezoluce zán tu a s ní související návrat p vodního počtu bun k v dutinovém systému MŽ. Snižováním počtu zán tlivých neutrofil probíhalo dv ma zp soby. S dostatkem energie programovanou bun čnou smrtí-apoptózou a následnou fagocytózou apoptických bun k MůC. Byly zaznamenány morfologické zm ny, které jsou charakteristické pro apoptózu: karyopyknosis, zeiosis a rozpad bun k na apoptická t líska. Pro karyopyknosis je charakteristická zm na tvaru bu ky na kulový, doprovázená ztrátou pseudopodií a kulové jádro s hust kondenzovaným chromatinem. Rovn ž byla pozorována ztráta části 34
granulí a mitochondrií. Bu ky ve stádiu zeiozis vytvá ely na svém povrchu r zn tvarované výčn lky a v cytoplazm bylo možno pozorovat značné množství vezikul zp sobujících deformaci tvaru bu ky. Následoval rozpad na apoptická t líska o velikosti do 3 μm, která mohla být následn fagocytována MůC ĚSládek a Ryšánek, 2001). V nep ítomnosti energie v bu ce probíhala nekróza a následná lýza bun k. S tím m že být spojená op tovná aktivace dalších PMN, protože cytoplazma PMN obsahuje granula obsahující značné množství trávících enzym , které se v p ípad nekrózy bu ky vylijí do tkán . Tato situace nenastane, je-li u PMN aktivovaná programovaná bun čná smrt-apoptóza. 5.3.4 Infekce virginní mléčné žlázy Infekce virginní MŽ studovali v ČR Ryšánek et al. Ě1řřřě. Pro zjišt ní počtu infikovaných juvenilních MŽ byl proveden výplach PBS Ň04 mléčných žláz 5Ň nep ipušt ných jalovic. Ryšánek et al. Ě1řřřě použili pro výzkum k íženky holštýnského a českého strakatého plemene. Z celkového počtu Ň04 MŽ bylo 16ň (78,4 %) prostých infekce, 34 (16,3 %ě MŽ infikováno minoritními patogeny, 5 (2,4 %) environmentálními patogeny a 2 (1 %ě kontagiózním patogenem, což znamená, že bylo v danou chvíli celých 19,7 % MŽ infikovaných. Čty i MŽ byly vyloučeny pro nepr chodnost strukového kanálu. Pokusem byl zjišt n absolutní Ěviz obrázek 12) a diferenciální počet somatických bun k Ěviz obrázek 13). V tomto ohledu je tedy vhodné využít analýzu MŽ ke zjišt ní stavu MŽ jalovice p ed jejím za azením do plemenitby. Díky znalosti zdravotního stavu MŽ m že být ušet eno značné množství komplikací a ekonomických ztrát, jelikož mastitida je jedním z nejrozší en jších a nejnákladn jších onemocn ní dojnic. Infekce MŽ má vliv i na plodnost. To se projevuje snížením zab ezávání a tím zvýšení inseminačního indexu, zvýšením embryonální mortality. Dále také nedostatečným vývojem folikul produkce luteinizačního hormonu a estrogen (Kuprová el al., 2005).
35
a poklesem
což vede k výskyt m tichých
íjí
Obrázek 12: ůbsolutní počty somatických bun k výplachu standardizovaného na 20ml mléčných žláz neinfikovaných a infikovaných dle p vodu patogenu 3.267
počet bun k *106/ml
3.5
3.267
3
2.5
Neinfikované
2.138
Minoritní patogeny
2
1.5 1
Environmentální patogeny
0.966
Kontagiózní patogeny
0.5 0
Obrázek 13: Diferenciální počty PMN, MůC a lymfocyt
neinfikovaných a
počet bun k v %
infikovaných MŽ 100 62.2
66.6
50
neinfikované
26.5
14.2
13.2
4.5
infikované
0 MAC
PMN
LYM
ĚRyšánek et al., 1řřřě. Oproti výše uvedeným fakt m uvád jí Trinidad a Nickerson Ě1řř0ě že neb ezí jalovice m ly vyšší procento infikovaných čtvrtí (86,7 %) ve srovnání celkovým pr m rem pro b ezí jalovice (70 %). Dále výzkum z roku 2009 (Fox, 2009), který shrnuje literaturu zabývající se subklinickými a klinickými infekcemi MŽ. Prevalence infekce čtvrtí se pohybovala rozmezí ŇŘ,ř až 74,6 % p ed porodem, 1Ň,ň až 45,5 % v dob porodu. Obecn platí, že patogeny, které zp sobují mastitidy jalovic, jsou stejné jako ty, které zp sobují infekce u starších krav ĚFox, Ň00řě. Tyto patogeny jsou nap . Staphylococcus chromogenes, S. aureus, S. uberis, S. hominis, S. caseolyticus, Enterococcus faecalis, Micrococcus spp, Serratia spp. a další.
36
5.3.5 Limity využití modelu virginní MŽ Stejn jako každá metoda analyzující část živého organismu má i model virginní mléčné žlázy své fyziologické limity. Ty souvisí jednak s menší imunologickou pam tí mladého 15-18-ti m síčního organismu, v d sledku nižšího počtu zán t
MŽ
v minulosti a jednak se slabší obranyschopností dutinového systému virginní mléčné žlázy. Výše uvedené problémy jsou d sledkem ne zcela vyvinuté mléčné žlázy. Tyto skutečnosti ve svém d sledku omezují využití tohoto modelu ve sm ru studia pr b hu mastitidních onemocn ní 100% totožných s t mi, které pozorujeme u laktujících krav. Rozdíly mezi t mito fázemi mohou být pozorovány v celkovém množství bun k získaných výplachem a zm nách morfologických struktur somatických bun k v iniciaci a rezoluci zán tu. Nicmén model je vhodným systémem ke studiu postnatálního vývoje imunitního systému mléčné žlázy a také pro snadné získávání imunitních bun k skotu pro studium in vitro, v kterékoliv fázi indukovaného zán tu.
37
6
ZÁV R
Mléčná žláza je vývojov vysoce specializovaná kožní žláza určená primárn k výživ mláďat. Šlecht ním na mléčnou produkci byla mléčná žláza skotu p em n na v mohutný orgán sloužící k produkci jedné z hlavních složek výživy člov ka. Současn se zvýšením mléčné užitkovosti došlo k vyšší mí e výskytu mastitidních onemocn ní. Tento aspekt posunul MŽ do pop edí zájmu v dc a následovaly studie zabývající se funkční charakteristikou imunitních bun k, jejich absolutními a diferenciálními počty a mírou imunitní odpov di na rozdílné činitele indukující zán tlivou odpov ď. Pro studium imunitních bun k je za pot ebí získat velké množství bun k k in vitro studiím. Z toho d vodu byl hledán zp sob jejich snadného získávání. Proto se tato práce zam ila na využití modelu virginní MŽ, kdy je využita MŽ neb ezí jalovice. Není pot eba ji pravideln vydojovat, čímž nedochází k edícímu efektu vzniklé suspenze bun k. To souvisí také s mnohem snadn jším zpracováním vzork , kdy není pot eba p ed vyhodnocením odstra ovat složky mléka jako kapénky mléčného tuku, cytokiny či chemotaktiny. Dále se pak nabízelo srovnání modelu virginní MŽ s využitím MŽ v období stání na sucho. Zmín né srovnání vedlo k záv ru, že virginní MŽ má oproti involované p ednost v tom, že vysokob ezí zví ata se nachází ve zcela odlišném fyziologickém stavu. Rovn ž je v tomto období MŽ vnímav jší k infekcím. P i zpracovávání bakalá ské práce bylo zjišt no, že v dostupné odborné literatu e neexistuje dostatečné množství informací o anatomické struktu e virginní MŽ, proto byla anatomie virginní MŽ pro pot eby práce popsána podle získaných fotografií. Práce podrobn ji pojednává o metodice a zavedení modelu virginní MŽ do v decké praxe. ůčkoliv tento model byl prezentován jako jeden ze snadných zdroj pro získávání a analýzu somatických bun k bovinní MŽ ĚWardley et al., 1ř75ě, jeho využívání není nijak rozší ené. Model totiž neposkytuje informace o všech funkčních pochodech adultní MŽ, která je základní produkční jednotkou v chovu dojeného skotu. Biologické limity modelu jsou menší imunologická pam ť a slabší imunizace dutinového systému, což je d sledek zatím nedokončeného vývoje mléčné jednotky. Jeho využití je vhodné pro studium morfologických a funkčních charakteristik somatických bun k. Současn je také velmi dobrým objektem ke sledování pr b hu a charakteristik indukovaných zán t pomocí r zných činitel .
38
7 1.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Budras, K.D., Habel R.E. 2003: Bovine anatomy, An illustrated text. Hannover, Germany: Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG, 144 p., ISBN 389993-000-2
2.
Celsus, A. C.: De medicina / with an English translation by W. G. Spencer, 1935, Cambridge, Mass. : Harvard university press ; London : W. Heinemann, ltd.
3.
Černý H. Ň00Ň: Veterinární anatomie pro studium a praxi. Noviko, Brno 528 s. ISBN 80-86542-01-7
4.
Desiderio, J.V., Campbell, S.G. 1980: Bovine mammary gland macrophage: Isolation, morphological features, and cytophilic immunoglobulins Am. J. Vet. Res, 41(10). 1595-1599.
5.
Dvorský, P. 1999: Koldův atlas veterinární anatomie. 1. vyd. Editor Viera Postníková. Praha: Grada, 701 s. ISBN 80-716-9352-9.
6.
Fox, L. 2009: Prevalence, incidence and risk factors of heifer mastitis. Veterinary Microbiology. vol. 134, 1-2, s. 82-88. doi: 10.1016/j.vetmic.2008.09.005.
7.
Frandson, R., W. Wilke, A.D. Fails. 2009: Anatomy and physiology of farm animals. 7th ed. Ames, Iowa: Wiley-Blackwell, xiii, 512 p., [8] p. of plates. ISBN 08-138-1394-8.
8.
Ho ejší V., L. Bart
ková, Ň005: Základy imunologie. 3. vyd. Praha: Triton, 279
s. 9.
Jelínek, P., K. Koudela. 2003: Fyziologie hospodářských zvířat. 1. vyd. Brno: Mendelova zem d lská lesnická univerzita, 409 s. ISBN 80-715-7644-1.
10.
Kitchens, R.L. 2000: Role of CD14 in cellular recognition of bacterial lipopolysaccharides. Chem. Immunol. Chemical Immunology and Allergy 74: 61–82. doi:10.1159/000058750
11.
Kőnig, H.E., H.G. Liebich. 2002: Anatomie domácích savců. Bratislava: H, s. 347-351. ISBN 80-88700-57-4.
12.
Ková , F. Ň00ň: Imunitní systém, s 67-68. In: Fyziologie hospodářských zvířat. 1. vyd. Mendelova zem d lská lesnická univerzita, Brno, 409 s.
39
13.
Krejsek, J, O. Kopecký. 2004: Klinická imunologie. 1. vyd. Hradec Králové: NUCLEUS HK, 941 s. ISBN 80-862-2550-X.
14.
Kuprová V. et al. 2006: Vliv mastitidy na mléčnou užitkovost dojnic. In: [online]. [cit. 2014-04-01]. Dostupné z: http://www.agris.cz/Content/files/main_files/75/153040/48_06.pdf
15.
Lawrence, T.L.J., V.R. Fowler. 2002: Growth of farm animals. 2nd ed. New York: CABI Pub., xii, 347 p. ISBN 08-519-9484-9.
16.
Marvan et al. 1992: Morfologie hospodářských zvířat. Vyd. 4. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze v nakl. Brázda, 2007 ISBN978-80-213-1658-4.
17.
Miller et al., 1985: Factors affecting ability of skim milk to support phagocytosis by bovine polymorphonuclear leukocytes. J. Dairy Sci. 68(11):3087-94.
18.
Miller. R.H., Paape M.J., Fulton L.A., 1991: Variation in milk somatic cells of heifers at first calving., J. Dairy. Sci., 74, 3782-3790
19.
Mustafa, A. 2001: Development of the Mammary Gland. MUSTAFA. [online]. MC Gill University, Quebec, Canada, [cit. 2014-02-09]. Dostupné z: http://animsci.agrenv.mcgill.ca/courses/460/topics/4/text.pdf
20.
Najbrt R. et al. (1982): Veterinární anatomie 2. SZN Praha 596 s. ISBN 07-00682
21.
Naidu T.G., F.H. Newbould, 1973: Glycogen in leukocytes from bovine blood and milk. Can. J. Comp. Med.;37(1):47-55.
22.
Newbould F.H. 1973: The effect of added serum and glucose, and some inherent factors, on phagocytosis in vitro by milk leukocytes from several cows. Can. J. Comp. Med. 37(2):189-194
23.
Nickerson S.C. 1988: Immunological aspect of mammary involution. In: Nickerson S.C. (ed.): Dairy Res. Report. Homer, USA, Louisiana Agricultural Experimental Station. 231-251
24.
Paape, M.J., Wergin, W.P., 1977: The leukocyte as defense mechanism. J. Am. Vet. Med. Assoc. 170, 1214-1223
25.
Reece, W.O. 2010: Fyziologie funkční anatomie domácích zvířat. 1. české vyd. Praha: Grada, ISBN 978-80-247-3282-4. 40
26.
Ryšánek, et al. 1999: Intramammary infections of mammary glands in unbred heifers: absolute and differential somatic cell counts. Vet. Med-Czech, 44 (7): 199-203
27.
Ryšánek, D, Sládek, Z, Ň000: Apoptosis of polymorphonuclear leukocytes of the juvenile bovine mammary gland during induced influx. Vet. Res. 31: 553-563
28.
Ryšánek et al. Ň001: Variations among unbred heifers in the activities of polymorphonuclear leucocytes from the mammary gland and blood J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.48 (1): 31-41.
29.
Sládek Z, Ryšánek D., 1řřř: Morphological characteristic of somatic cells from mammary glands of unbred heifers. Vet. Med 44 (7): 205-214
30.
Sládek Z, Ryšánek D., 2001: Neutrophil apoptosis during the resolution of bovine mammary gland injury. Res. Vet. Sci. 70 (1): 41-46.
31.
Sládek Z, Ryšánek D., 2001: Apoptosis of neutrophilic granulocytes of bovine virgin mammary gland in scanning electron microscopy. Vet. Med.-Czech, 46 (78): 185-189
32.
Sládek Z, Ryšánek D, Ň00Ň: Activation of phagocytes during initiation and resolution of mammary gland injury induced by lipopolysaccharide in heifers. Vet. Res. 33: 191-204
33.
Sládek, et al. 2006: Macrophafes of the bovine heifer mammary gland: Morphological features during initiation and resolution of the inflammatory response. Anat. Histol. Embriol.-J. Vet. Med. C 35 (2):116-124
34.
Tapping RI, Tobias P.S. 2000: Soluble CD14-mediated cellular responses to lipopolysaccharide. Chem. Immunol. Chemical Immunology and Allergy 74: 108–21. doi:10.1159/000058751
35.
Toman, M. 2000: Veterinární imunologie. 1. vyd. Praha: Grada, 413 s. ISBN 80716-9727-3.
36.
Trávníček, J., V. Kroupová Ň00ň: Tělní tekutiny, s 44-48. In: Fyziologie hospodářských zvířat. 1. vyd. Mendelova zem d lská lesnická univerzita, Brno, 409 s.
41
37.
Trinidad, P.,Nickerson, S.C., Alley, T.K., 1990: Prevalence of intramammary infection and teat canal colonization in unbred and primigravid dairy heifers. J. Dairy Sci.,73,107-114
38.
Vránová, E., Ň014: foto virginní MŽ, školní statek Žabčice
39.
Wardley, R.C., B.T. Rouse, and L.A. Babiuk, 1976: The mammary gland of the ox:
convenient source for the repeated collection of neutrophils and
macrophages. J. Reticuloendothel. Soc. 19, 29-36
42
8
SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK:
Obrázek 1: ůnatomie laktující MŽ ................................................................................... 4 Obrázek Ň: Sagitální ez strukem ...................................................................................... 5 Obrázek ň: Virginní MŽ neb ezí jalovice, poled z levé strany ......................................... 8 Obrázek 4: Virginní MŽ neb ezí jalovice, pohled zezadu ................................................ 8 Obrázek 5: ez pravou polovinou virginní MŽ s nást ikem dutinového systému ........... 9 Obrázek 6: Detail dutinového systému pravé kaudální mléčné žlázy .............................. 9 Obrázek 7: Zm ny množství neutrofil a makrofág v jednotlivých dnech pokusu ...... 16 Obrázek Ř: Relativní procentické zastoupení bun k 1. a 8. den ..................................... 16 Obrázek 9: Procentuální zastoupení PMN, MůC a lymfocyt ..................................... 19 Obrázek 10: Ultrastruktura normálního a degenerovaného neutrofilu ........................... 22 Obrázek 11: Ultrastruktura normálního a degenerovaného makrofágu .......................... 24 Obrázek 12: ůbsolutní počty somatických bun k výplachu standardizovaného na Ň0ml mléčných žláz neinfikovaných a infikovaných dle p vodu patogenu ............................ 29 Obrázek 13: Diferenciální počty somatických bun k neinfikovaných ........................... 29
Tabulka 1: Počet leukocyt v litru krve skotu…………………………………………. 10 Tabulka Ň: Procentuální zastoupení jednotlivých typ bun k získaných po stimulaci LPS…………………………………………………………………………………….. 14 Tabulka ň: Diferenciální počty fagocyt virginní MŽ…………………………............ 19
43
