Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat
Hodnocení patomorfologických změn spermií různých plemen psů Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Martin Hošek, Ph.D.
Bc. Alice Krátká Brno 2013
1
Mendelova univerzita v Brně Ústav chovu a šlechtění zvířat
Agronomická fakulta 2012/2013
ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autorka práce: Studijní program: Obor: Název tématu:
Bc. Alice Krátká Zootechnika Zootechnika
Hodnocení patomorfologických změn spermií různých plemen psů
Rozsah práce:
50-60 stran textu a přílohy
Zásady pro vypracování: 1 Studentka se zaměří na problematiku hodnocení patomorfologických změn spermií v ejakulátech psů . různých plemen. 2 Posoudí získané preparáty pomocí různých metod barvení spermií a doporučí odborné a chovatelské . veřejnosti vhodnou metodu barvení pro psí spermie. 3 Dále bude sledovat zastoupení hlavních skupin patomorfologických změn spermií a vyhodnotí jejich . vztah k plemeni, věku, využití psa apod. 4 Získané výsledky vyhodnotí vhodnými matematicko-statistickými metodami a vhodnou formou je . předá chovatelům, resp. chovatelské veřejnosti.
Datum zadání diplomové práce: Termín odevzdání diplomové práce:
říjen 2011 duben 2013
Bc. Alice Krátká Autorka práce
Ing. Martin Hošek, Ph.D. Vedoucí práce
prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vedoucí ústavu
2
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma“hodnocení patomorfologických změn spermií různých plemen psů“, vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. Dne…………………………………. Podpis diplomanta…………………..
3
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi, Ph.D., za poskytnuté konzultace, cenné rady a za odborné vedení v průběhu zpracování diplomové práce.
4
Abstrakt: V diplomové práci jsme sledovaly kvalitu ejakulátu a patomorfologické vady spermií v ejakulátu psů deseti různých plemen. Celkem bylo hodnoceno 115 ejakulátů od 43 psů. Byla hodnocena kvalita ejakulátu a výskyt morfologických abnormalit spermií v ejakulátu ve vztahu k plemeni, FCI skupině a věku. Nejlepší výsledky ejakulátu byly zaznamenány u pikardských ovčáků, naopak nejhorší průměrné výsledky kvality ejakulátu byly zaznamenány u krátkosrstých německých ohařů. Největší objem ejakulátu byl zaznamenán u kříženců. Naproti tomu, největší aktivita byla zjištěna u skupiny FCI I – ovčáci, nejvyšší koncentrace pak u skupiny FCI VII – ohaři. Dalším hodnoceným faktorem byl věk, kde jsme zjistili, že s věkem se objem ejakulát, aktivita spermií a procento normálních spermií zvyšovalo, a naopak klesala koncentrace spermií v ejakulátu. Jak ukazují námi zjištěné výsledky, chovatelé by se měli při výběru plemeníka věnovat nejen exteriéru a pracovní výkonnosti, ale také kvalitě ejakulátu daného plemeníka, protože jedině tak se může dočkat kvalitního potomstva. Klíčová slova: psí ejakulát, morfologie, objem ejakulátu, aktivita, koncentrace
Abstract: In this diploma thesis we are focused on ejaculate quality and pathomorfological changes in ejaculates ten different breeds of dogs. Totaly was evaluated 115 ejaculates from 43 dogs. Except ejaculates quality was evaluated relation to breed, FCI group and age too. Best ejaculates had pikard shepherds, worst average results was in shorthaired german setters. Biggest volume of ejaculate had crossbreds, highest motility was in gruop FCI I – shepherds, highest concentration of sperms in ejaculate was in FCI VII – setters. With next evaluated parameter – age – increase ejaculate volume, motility of sperms and number of normal sperm, but decrease sperm concentration. When we need best breeding dogs, our results show, that is not necessary find only dogs with top exterior and working ability, but with high quality of ejaculates too. Key words: dog ejaculate, morphology, ejaculate volume, motility, concentration
5
OBSAH 1
ÚVOD ................................................................................................................................................ 8 1.1
2
CÍL PRÁCE: ................................................................................................................................. 9
LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................................................................ 10 2.1
POHLAVNÍ ÚSTROJÍ PSA ............................................................................................................. 10
2.1.1
Varlata ........................................................................................................................... 10
2.1.2
Nadvarlata...................................................................................................................... 11
2.1.3
Chámovod ...................................................................................................................... 11
2.1.3.1
2.1.4
Prostata .................................................................................................................................... 12
Pyj .................................................................................................................................. 12 2.1.4.1.1
2.2
Pohlavní dospělost ............................................................................................................... 13
ONEMOCNĚNÍ POHLAVNÍCH ORGÁNŮ ......................................................................................... 13
2.2.1
Rakovina varlat............................................................................................................... 13
2.2.2
Krvácení z penisu ............................................................................................................ 13
2.2.3
Fimóza: .......................................................................................................................... 14
2.2.4
Zánět předkožky: ............................................................................................................. 14
2.2.5
Zánět varlat a šourku: ..................................................................................................... 15
2.2.6
Zbytnění prostaty: ........................................................................................................... 15
2.2.7
Kryptorchismus: ............................................................................................................. 15
2.3
ZÍSKÁVÁNÍ A VYŠETŘENÍ EJAKULÁTU ........................................................................................ 16 Ejakulát .......................................................................................................................... 16
2.3.1 2.3.1.1
Objem ...................................................................................................................................... 16
2.3.1.2
Aktivita .................................................................................................................................... 16
2.3.1.3
Barva ....................................................................................................................................... 16
2.3.1.4
Pach a konzistence.................................................................................................................... 16
2.3.1.5
Koncentrace ............................................................................................................................. 17
2.3.1.6
Složení ejakulátu ...................................................................................................................... 17
2.3.1.7
Frakce ejakulátu ....................................................................................................................... 17
2.3.2
Spermie .......................................................................................................................... 18
2.3.3
Odběr semene ................................................................................................................. 18
2.3.3.1
Příčiny neúspěchu při odběru ejakulátu .................................................................................... 19
2.3.4
Vyšetření ejakulátu.......................................................................................................... 20
2.3.5
Konzervace ..................................................................................................................... 21
2.3.6
Inseminace...................................................................................................................... 22
2.4
PATOMORFOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ EJAKULÁTU............................................................................ 23 Morfologie spermií.......................................................................................................... 23
2.4.1 2.4.1.1
Nátěr ........................................................................................................................................ 23
2.4.1.2
Metody barvení ....................................................................................................................... 23
2.4.1.2.1
Metoda barvení podle Bydgoště ........................................................................................... 23
2.4.1.2.2
Metoda barvení podle Čeřovského: ...................................................................................... 24
2.4.1.2.3
Metoda barvení spermatu podle B.T. Farellyho ..................................................................... 25
6
2.5 3
4
2.4.1.3
Hodnocení morfologie .............................................................................................................. 25
2.4.1.4
Faktory ovlivňující morfologicky změněné spermie ................................................................... 26
2.4.1.5
Rozdělení morfologických změn patologických forem spermií .................................................. 27
2.4.1.6
Využití techniky k hodnocení psího ejakulátu ............................................................................ 28
CYTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ ........................................................................................................ 29
MATERIÁL A METODIKA .......................................................................................................... 30 3.1
ROZDĚLENÍ SKUPIN DLE PLEMENE ............................................................................................. 30
3.2
ROZDĚLENÍ PSŮ DLE FCI SKUPIN ............................................................................................... 30
3.3
PSI BYLY ROZŘAZENI DO SKUPIN PODLE VĚKU ............................................................................ 30
3.4
ZPŮSOB ODBĚRU A HODNOCENÍ EJAKULÁTU............................................................................... 30
3.5
STATISTICKÉ ZHODNOCENÍ ........................................................................................................ 30
VÝSLEDKY A DISKUZE .............................................................................................................. 31 4.1
HODNOCENÍ EJAKULÁTŮ DLE PLEMENE ...................................................................................... 31
4.1.1
Objem ejakulátu, aktivita a koncentrace spermií v ejakulátu psů dle plemena ................... 31
4.1.2
Výskyt morfologicky normálních a patologických spermií v ejakulátech podle plemen ..... 32
4.1.3
Výskyt poškozených hlaviček a akrozomů spermií v ejakulátech psů podle plemene .......... 33
4.1.4
Výskyt poškozených spojovacích částí a bičíků spermií v ejakulátech psů podle plemene .. 35
4.1.5
Výskyt nezralých a degenerovaných spermii v ejakulátu psů dle plemene ......................... 36
4.2
HODNOCENÍ EJAKULÁTU PODLE VĚKU PSŮ ................................................................................. 38
4.3
HODNOCENÍ EJAKULÁTU DLE POŘADÍ ODBĚRU ........................................................................... 40
4.4
HODNOCENÍ EJAKULÁTU PODLE FCI SKUPIN .............................................................................. 42
5
DOPORUČENÍ PRO CHOVATELE ............................................................................................. 44
6
ZÁVĚR ............................................................................................................................................ 45
7
LITERATURA ................................................................................................................................ 47
7
1
ÚVOD V ČR je chováno asi 2 mil. psů velkého počtu plemen. Nejčastěji je pes chován jako
společník, velmi často však své uplatnění nachází také jako pomocník člověka v nejrůznějších oblastech jeho činnosti jako je myslivost, ochrana majetku nebo pasení stád dobytka a také jako týmový kolega v nejrůznějších kynologických sportech. V dnešní době je chovateli vyvíjen velký tlak na kvalitu jedinců po exteriérové a povahové stránce, ale opomíjí se jejich reprodukční chovnosti zejména u samců. Jedním ze základních předpokladů úspěšné chovatelské práce je zvládnutí reprodukce psů. Nedílnou součástí reprodukce je produkce kvalitního ejakulátu. Tím je vyvolán zájem o kvalitativní vyšetření psů – samců z hlediska jejich fertility pro významnou frekvenci subfertilních jedinců (VĚŽNÍK et al., 2004).
8
1.1 Cíl práce: Cílem diplomové práce bylo: -
získání ejakulátu psů různých plemen,
-
zhodnotit kvalitu ejakulátu a výskyt patomorfologických spermií v ejakátu psů dle plemen,
-
zhodnotit kvalitu ejakulátu a výskyt patomorfologických spermií v ejakátu psů dle věku
-
zhodnotit kvalitu ejakulátu a výskyt patomorfologických spermií v ejakátu psů dle FCI skupiny.
9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Pohlavní ústrojí psa Samčí pohlavní ústrojí tvoří: varlata, vývodné cesty – nadvarlaty a chámovody, přídatné pohlavní žlázy - prostata a kopulační orgán - pyj. 2.1.1 Varlata Varlata jsou párový orgán uložený v šourku, ve tvaru rotačního elipsoidu s rozdílnou délkou (Věžník a kol, 2004). Párová varlata jsou uložena v šourku, jsou vejčitého tvaru (Kvapil, Kvapilová, 2007). Varlata mají kulovitý tvar (Kliment a kol., 1983). Varlata jsou oválného tvaru, uložená v šourku nejdelší osou dorzokaudálním směrem (Gamčík, Kozumplík et.al.1984). Základní funkcí varlat je funkce sekreční – produkce spermií a funkce inkreční – tvorba pohlavních hormonů semenotvorných kanálcích se
-
androgenů
(Věžník a
kol.,2004).
V točitých
vytvářejí spermie a v intersticiálních buňkách
Leydigových se vytvářejí androgeny (Gamčík, Kozumplík et.al.1984). Povrch varlete je potažen serózním povlakem, který je srostlý pevně s tuhým fibrózním obalem, které je označováno jako varietní pouzdro. Do hloubky varlete od varietního pouzdra vznikají paprskovitě uspořádané vazivové přepážky, které rozdělují parenchym varlete na jednotlivé lalůčky, které jsou tvořeny ze stočených semenotvorných kanálků vystlaných zárodečným epitelem a Sertoliho buňkami. Stočené kanálky vzájemně anastomozují a přecházejí v přímé kanálky, které vytvářejí síť varlete, ze kterých na hlavovém konci vystupuje asi 15 – 20 vývodných kanálků, které postupují do hlavy nadvarlete (Gamčík, Kozumplík et.al.1984). V šourku je tenká kůže, která je pigmentovaná, pokryta jemným ochlupením a má potní žlázy.Velikost varlat závisí na velikosti plemene průměrně jsou velká 3 x 2 x 1,5 cm (Čtyroká, 2002).. Teplota v šourku by měla být o 3 - 5°C níž, něž je tělesná teplota (Svoboda, senior et.al. 2001). V šourku je nízká teplota, pro správný vývoj spermií (Čtyroká, 2002). Pro vývoj spermií je nutná teplota varlat nižší oproti teplotě v dutině břišní o 4 – 5 °C. Varlata sestupují do šourku až po narození tříselným kanálem (Kvapil, Kvapilová, 2007). Do dvou měsíců stáří štěněte nemusejí být varlata sestouplá do šourku, ale mohou se nacházet v tříselném kanálu, nebo v břišní dutině. Pokud varlata nesestoupí do šourku po druhém měsíci věku, poté se jedná o abnormální stav (Svoboda, senior 10
et.al. 2001). Pokud varlata nejsou sestouplá v šourku, jedná se o kryptorchismus, jedno nebo oboustranný. Psi jsou vyřazováni z chovu, protože se jedná o dědičnou vadu, ale jejich sestry se z chovu nevyřazují – udržují se v populaci (Kvapil, Kvapilová, 2007). 2.1.2 Nadvarlata Na povrchu varlat nasedají nadvarlata. Nadvarle je tvořeno stočeným kanálkem, ve kterém můžeme rozeznat tři části. První část je hlava nadvarlete, kterou tvoří 15 – 20 vývodných kanálků, které vystupují z varletní sítě a opouštějí varle na jednom jeho pólu, které se postupně slévají do nadvarletního vývodu. Husté meandrovité kličky vytvářejí tělo a ocas nadvarlete. Další části nadvarlete je tělo a ocas ( Komárek a kol.,1971). V nadvarleti je zahušťováno sperma a zajišťuje výživu pro zralé spermie, které čekají na dobu páření. V době klidu dochází k tzv. anabióze, tzn. zimnímu spánku spermií. Pokud dojde ke krytí, rychle se vzbudí a jsou připraveny splnit svou úlohu, pokud ne, tak po 1-2 měsících zaniknou a dojde k jejich resorpci (Marvan, 2007). V nadvarleti se hromadí a zrají spermie (Kvapil, Kvapilová, 2007). V nadvarleti spermie dozrávají a získávají schopnost pohybu (Věžník a kol., 2004). V nadvarleti si spermie uchovávají životnost a oplozovací schopnost, především díky nižší hladině kyslíku a vyšší hladině oxidu uhličitého, tím pádem je látkový metabolismus spermií snížen na minimum (Komárek a kol.,1971) 2.1.3 Chámovod Chámovod jako samotný vývod je tvořen sliznicí, svalovinou a serózou. Vystupuje z ocasu nadvarlete, dostává se tříselným kanálem po stěně břišní dutiny do pánevní dutiny na dorzální plochu močového měchýře (Gamčík, Kozumplík, 1976). Chámovod je párová silnostěnná trubička, která má tloušťku stébla až brku a spojuje vývod nadvarlete s močovou trubicí. Slouží také k aktivnímu transportu spermií do močové trubice, spermie jsou v chámovodu míseny se semennou plazmou. Při odběru ejakulátu může dojít pouze k odběru plazmy bez spermií. Pokud nedojde k tvorbě správných a přirozených reflexů potřebných pro uvolnění spermií z nadvarlat do chámovodů a to se může přihodit například při umělém odběru semene pro inseminaci, např. pokud je pes ve stresu. (Čtyroká, 2002). Chámovod odvádí spermie do močové roury (Kvapil, Kvapilová, 2007).. 11
2.1.3.1 Prostata Prostata je nepárová předstojná žláza a leží na začátku močové trubice, kaudálně od vyústění chámovodů a měchýřkovitých žláz (Marvan, 2007).Prostata jako jediná, důležitá a nepárová přídatná pohlavní žláza. Produkuje sekret, který ředí spermie, upravuje pro ně prostředí v močové rouře a v pochvě (Čtyroká, 2002). Prostata se nachází v pánvi a obklopuje močovou rouru asi 1 cm za jejím vyústěním z močového měchýře. Prostata je rozdělená na dvě poloviny a je symetrická. V dospělosti dosahuje velikosti 1,4 – 1,9 cm až 2,5 – 2,8 cm. Úkolem prostaty během ejakulace je vytvářet sekret, který vytváří pro spermie příznivé prostředí v močové rouře a v pohlavním aparátu feny (Kvapil, Kvapilová, 2007) 2.1.4 Pyj Pyj psa je tvořen dlouhým žaludem, houbovitým a topořivým tělesem a je doplněný pyjovou kostí. Pyj je kopulační orgán, kterým prochází močová trubice. Pyjová kost, tvoří podpěru penisu a může dosahovat až 10 cm délky. Topořivé těleso při krytí zajišťuje svázání psa s fenou. Pyj je důležitý pro vpravení spermatu do pochvy. Při páření jsou důležitá dvě topořivá tělesa, která jsou uložena na zadním konci pyjové kosti, tzv. žaludové uzly. Pyj je uložen v předkožce, která plní ochrannou funkci pro tento orgán (Čtyroká, 2002).
(Rambousek, 2013)
12
2.1.4.1.1 Pohlavní dospělost Pohlavní dospělost je dána schopností produkovat oplození schopné spermie. U psů nejčastěji nastává pohlavní dospělost o 2 měsíce později než u fen, v 9 – 12 měsících (Kvapil, Kvapilová, 2007). Velikost varlat je závislá na velikosti těla psa, s velikostí varlat významně koreluje celková produkce spermií. 1 g varletní tkáně denně produkuje 15-19 mil spermií (Čtyroká, 2002).
2.2 Onemocnění pohlavních orgánů 2.2.1 Rakovina varlat Varlata jsou nejčastějším orgánem postiženým rakovinou u psů-samců. Varle by nemělo být na pohmat příliš měkké, nemělo by obsahovat žádné ztvrdlé shluky. Pokud by se v jednom varleti objevil rakovinový nádor, stane se nefunkční a druhé varle ho plně nahradí a pes zůstává plodný. Veterinární vyšetření varlete se provádí ultrazvukem a při podezření na nádor se provádí biopsie. V ejakulátu se přítomnost nádoru nepozná, protože spermie leží dlouhou dobu v nadvarleti a změny se poznají až za 1 - 2 měsíce. Pokud je zvýšená tvorbě poškozených, nefunkčních spermií a sníží se počet spermií, může to být důsledkem horečnatých onemocnění, při vyčerpání psa, nadměrném zatížení organismu, nebo při vážném zranění. Pokud jsou varlata zdravá mohou být stejně velká, ale obvykle bývá jedno menší než druhé a jedno bývá v šourku uloženo o trochu výš. V dospělosti by se velikost varlat, tvar a uložení nemělo výrazně pozměnit. Pokud je varle zmenšené znamená to zmenšení hmoty semenotvorných kanálků, proto je vytvořen menší prostor pro tvorbu spermií a dochází ke snížení plodnosti psa. Zvětšování varlete může být způsobeno nádorovým bujením, otoky spojenými, které jsou spojeny se záněty z různých příčin. (Čtyroká, 2002). 2.2.2 Krvácení z penisu Může jít o onemocnění, a nebo vzniká důsledkem poranění při pohlavním styku, nejvíce se to stává u dlouhosrstých zvířat. Nebo to může být příznakem u akutního zánětu močového měchýře, při onemocnění prostaty, při výhřezu a poranění močové roury.
13
Léčba:Pokud jde o krátkodobé krvácení, tak můžeme ošetřit pomocí desinfekčního roztoku. Pokud by se jednalo o krvácení přetrvávající, a nebo by vzrůstala jeho intenzita, potom je nutné vyhledat veterinárního lékaře, který vede další léčbu a doporučí vhodnou péči o pacienta (Sova, 1987 ). 2.2.3 Fimóza: Jedná se o přilepení, nebo srůst předkožky s hlavou pyje. Fimóza se projevuje již u štěňat a zhruba ve třech měsících věku lze ověřit možnost přetažení předkožky přes hlavu pyje. Následkem mohou být zánětlivé stavy, které způsobují bolestivé potíže při močení, zánět způsobující svědění a víceméně znemožňují pohlavní akt., pokud dojde k brzkému zjištěním fimózy majitel psa tak předejde vážným komplikacím a možnému poranění v dospělosti psa Léčba: Chirurgický zákrok (Naxera 2006 ). 2.2.4 Zánět předkožky: Předkožka udržuje hlavu penisu vlhkou, to je důležité pro pohlavní styk. Na vnitřním listu předkožky se nachází žlázky, které vylučující sekret a ten spolu s odloupanými buňkami epitelu snadno podléhá bakteriálnímu rozkladu a tím provokuje následný zánět předkožky. Zánět předkožky je velice častý, ale není nebezpečný a neohrožuje život psa. Příznaky jsou: výtok žlutobílého hnisavého sekretu, olizování okolí penisu a otok a zbytnění kůže přirození. Možná příčina zánětu může být nedostatečný hygiena, nedokonalé utváření předkožkového vaku a infekční nemoci (psinka) . Léčba: základní pravidla hygieny, ostříhání srsti na kůži konce přirození. Výplach předkožkového vaku vlažným roztokem hypermanganu. Onemocnění se většinou vrací, recidivuje, projevy jsou velmi svízelně léčitelné. Pokud by nebyla domácí léčba úspěšná, je potřeba zajít k veterinárnímu lékaři a provést laboratorní vyšetření pomocí stěrů, ze kterých se určí způsob další léčby např. pomocí antibiotických nebo sulfonamidových preparátů (Naxera, 2006 ).
14
2.2.5 Zánět varlat a šourku: Často bývá následkem úrazu, uskřinutí, pohmoždění nebo nádoru, může provázet i jiná infekční horečnatá onemocnění. Příznaky jsou bolestivost, zvětšení objemu varlat v šourku, neochota k pohybu a sednutí, zvýšená teplota a nechutenství. Léčba: Chladivé obklady. Je zapotřebí vyhledat veterinárního lékaře (Sova, 1987). 2.2.6 Zbytnění prostaty: Prostata je nepárová přídatná pohlavní žláza. Podle plemene a stáří psa se velikost prostaty pohybuje od rozměrů lískového oříšku ke kaštanu. Prostatou je vyměšován sekret, který je podstatnou součástí ejakulátu. Ke zvětšení, zbytnění prostaty můžu mít několik důvodů: zánětlivé změny na tkáni prostaty nebo nádorová bujení, čímž vytváří tlak na močovou trubici a znesnadňuje močení. Příznaky mohou být problémy při močení, bolestivost v oblasti malé pánve, zácpy, neochota k pohybu, zánět tkáně a nádorové bujení. Léčba: Podávání dobře stravitelné potravy s větším podílem vlákniny. Pravidelné procházky a venčení. Konsultace s veterinárním lékařem (Naxera, 2006 ). 2.2.7 Kryptorchismus: Pokud varlata nejsou sestouplá v šourku, jedná se o kryptorchismus, jedno nebo oboustranný. Psi jsou vyřazováni z chovu, protože se jedná o dědičnou vadu, ale jejich sestry se z chovu nevyřazují – udržují se v populaci (Kvapil, Kvapilová, 2007). Pro správnou funkci pohlavního ústrojí je nezbytné, aby obě varlata sestoupla plně do šourku. K sestupu varlat dochází hned po narození, může však být zpožděn až o několik týdnů či měsíců. Umístění varlat mimo tělo je fyziologicky podmíněno potřebou prostředí s nižší teplotou, než mají ostatní vnitřní orgány. Pokud jedno nebo obě varlata nesestoupí z dutiny břišní, kde prodělávají svůj vývoj, tříselním kanálem do šourkového vaku, hovoříme o monarchismu, respektive kryptorchismu. Tato vada je geneticky podmíněna a jedinci i v případě úspěšné léčby jsou vyloučení z chovu. Léčba: Konzultace s veterinárním lékařem. Speciální masáž tříselné partie, pomoci hormonální, napomoci sestoupení varlete. Pokud nedochází k žádnému efektu, nebo zůstává-li varle v dutině břišní, nebo v tříslech poté následuje chirurgické řešení. Pokud nedojde k chirurgickému ošetření může k dojít možnému nádorovému bujení, kdy vznikne nežádoucí tlak v tříslech (Svoboda, 2001). 15
2.3 Získávání a vyšetření ejakulátu 2.3.1 Ejakulát Ejakulát tvoří spermie a sekret přídatných pohlavních žláz, u psa jde o sekret prostaty. 2.3.1.1 Objem Objem ejakulátu je variabilní a kolísá podle plemene, věku, velikosti psa, frekvence krytí a stupně vydráždění. Běžný objem ejakulátu je ( 1-20 ml do 20 kg, 2- 45 ml. přes 20 kg) (Kvapil, Kvapilová, 2007). Doležel a (kol.,2001), uvádí, že objem může být od 2 do 50 ml. Objev závisí na výživě, způsobu odběru, ročním období a zdravotním stavu ( Gamčík, Kozuplík a kol.,1992). 2.3.1.2 Aktivita Aktivita patří mezi nejvýznamější ukazatele fertilizační schopnosti čerstvého ejakulátu. Progresivní pohyb vpřed za hlavičkou je znakem funkční plnohodnosti spermií, který se vyjadřuje v procentech (Louda a kol.,2001). Aktivita by se měla pohybovat u psů 85% (Čtyroká, 2002). Aktivita se pohybuje kolem 75 – 85 % pod 60% není normální. 2.3.1.3 Barva Barva závisí na hustotě a konzistenci ejakulátu pohybuje se v odstínech od šedivé až bílé barvy (Kvapil, Kvapilová, 2007). Semeno psa by mělo mít šedobílou až bílou barvu (Vežník, a kol.2004). 2.3.1.4 Pach a konzistence Zdravé sperma má slabý specifický pach připomínající pach kravského mléka. Sperma zelené má pach moči. Hnis má pach hniloby (Louda a kol.,2001) Nevýrazný nebo psí zápach, mléčnou až smetanovitou konzistenci (podle získaných frakcí) a nemělo by obsahovat žádné příměsi (Doležel a kol.,2001).
16
2.3.1.5 Koncentrace Koncentrace spermií 60 - 300 mil/ml. Koncentrace v ejakulátu 1,5 mld. (Čtyroká, 2002). Ejakulát může obsahovat 22 mil. - 6 mld. spermií. Průměr se pohybuje 500 – 900 mil. U středních plemen se 200 mil. bere jako nenormální počet (Seagerovou, 1986). Hustota spermií je jedním z ukazatelů biologické plnohodnotnosti ejakulátu, která se vyjadřuje počtem spermií v 1 mm3 ejakulátu nebo v 1 ml. V ejakulátu celkové množství spermií získáme vynásobením objemu ejakulátu s počtem spermií v 1 mm3. Koncentrace spermií v ejakulátu psa je silně variabilní, záleží zda se při odběru získala pouze frakce spermatická nebo i postspermatická. Mezi další faktory, které mohou ovlivnit koncentraci spermií je plemenná příslušnost, stáří, velikost varlat, sexuální aktivita. Velká plemena psů mívají celkové množství spermií v ejakulátu větší než plemena, která jsou malá. Počet spermií nejčastěji zjišťujeme pomocí hemocytometrické metody, ve které se spermie počítají v Bürkerové komůrce. Před počítáním se semeno naředí podle potřeby 1 : 20 až 1 : 100 (hustější ejakulát má intenzivnější bílé zabarvení, proto by se mělo použít vyšší ředění). Koncentrace spermií zdravého psa se pohybuje 300 x 10 6/ml až 800 x 106 /ml, celkový ejakulát by měl obsahovat 300 × 106 až 1000 × 106 spermií (Doležel a kol.,2001). 2.3.1.6 Složení ejakulátu Detaily složení semene psa: sušina 3,8%, bílkoviny 2,1 mg/100ml, fruktóza do 1 mg/100ml, sorbitol do 1 mg/100ml. (Čtyroká, 2002). 2.3.1.7 Frakce ejakulátu Ejakulát u psů se skládá ze tří na sobě závislých a ne zcela zřetelně oddělitelných frakcích. 1. prespermatická frakce přestavuje 0,2 - 3,0 ml nažloutlé tekutiny z prostaty, která se vylučuje v průběhu kopulačních pohybů psa po dobu 5 - 20 sekund. Tato frakce neobsahuje spermie nebo pouze ojediněle. 2. spermatická frakce představuje 0,5 - 2,0 ml bílé až mléčné tekutiny. K jejímu uvolňování dochází po ukončení kopulačních pohybů a po zklidnění psa, při
17
maximálně zduřelém pyji a vylučování trvá 30 sek - 4 minuty. Tato frakce obsahuje spermie. 3. postspermatická frakce představuje 2 -30 ml mírně zkalené tekutiny z prostaty. Vylučuje se v průběhu svázání 5 -15 min a tato frakce už většinou neobsahuje spermie. 2.3.2 Spermie Je nejdůležitější složkou ejakulátu. Jsou 50 - 80 μm dlouhé (Jelínek, 2003) Spermie má délku 55 - 70 μm, hlavička 7 x 5 μm, spojovací část bičíku asi 11 μm a zbytek bičíku asi 50 μm. Ke kapacitaci potřebuje 7 hod. Enzymy spermie akrozomové čepičky naleptají obal vajíčka a spermie pronikne dovnitř, vně zanechá bičík a tím zamezí proniknutí další spermie. 2.3.3 Odběr semene U citlivých jedinců může výjimečně docházet, a to i při zachování všech pohlavních reflexů (erekce, pulzace uretry), k částečné nebo úplné retrográdní ejakulaci směrem k močovému měchýři Úspěšné odebrání semene je základní parametr pro vykonání úspěšné inseminace. U psa je možné semeno odebrat třemi různými způsoby - masáží pyje (masturbací), umělou pochvou nebo elektroejakulací. Odběr semene provádíme v klidném prostředí. K vzrušení psa nedojde v některých případech z důvodů blízkosti cizího člověka nebo manipulace s pyjem. U takových psů je dobré, aby odběr semene zvládnul sám majitel psa. Odběr semene je dobré provádět v přirozeném vzrušení psa za přítomnosti hárající feny. Za přítomnosti feny se semeno odebírá po vzeskoku psa nebo na stojícím psovi těsně za
fenou. Psi, kteří jsou odebírání poprvé můžeme očekávat ztížený odběr
semene. Kvalita semene se zhoršuje při nadměrné exploataci. Při prvním až třetím odběru po dlouhém pohlavním klidu. Při dlouhodobém odebírání je přiměřený jeden odběr za 48 hodin. Při nárazovém každodenním odběru je třeba psovi umožnit po třech dnech nejméně dva dny odpočinku. Pokud je odběr proveden dvakrát v jednom dni, rovněž by měl následovat dvoudenní odpočinek. Masturbace se využívá k odběru semene u malých plemen psů a u lehce vzrušivých psů. Zprvu se masíruje pyj přes předkožkový vak a po erekci se pulzačně tiskne za bulbem nebo se dále masíruje rukou v gumové rukavici potřené nespermicidní mastí. 18
Ejakulát se sbírá do široké skleněné nádoby s objemem nejméně 10 - 15 ml (např. Petriho miska) při pokojové teplotě. Není potřeba speciální ohřívání sběrače, protože spermie psa nejsou citlivé na chladový šok. Při inseminaci čerstvým semenem lze odebrat celý ejakulát. Pro konzervaci je však potřeba odebrat v maximální míře pouze střední semennou frakci bohatou na spermie, protože sekret prostaty negativně působí na přežitelnost konzervovaných spermií. Začátek ejakulace doprovázejí kopulační (pánevní) pohyby a druhá frakce bohatá na spermie obvykle začíná zklidněním psa a trvá po několik (3 - 5) minut. Včasné zakončení odběru na začátku třetí frakce je možné na základě průběžné adspekční kontroly odebíraného semene a zjištění přeměny hustého mléčného charakteru semene na řídký, vodnatý. Proto sběrače by měly být průhledné. U středních a velkých plemen psů se nejčastěji k odběru semene používá umělá pochva. V našich podmínkách se nejčastěji využívá typ dvoustěnné gumové trubice o průměru kolem 8-10cm a délce 15 - 20 cm, ke které se na konci připevňuje skleněný sběrač nebo sáček z umělé hmoty s objemem nejméně 10 - 15 ml. Vnitřní stěna umělé pochvy se ohřeje na teplotu 40 - 42 0C napuštěním teplé vody mezi stěny umělé pochvy a vnitřní stěna v přední části umělé pochvy se vymaže sterilní vazelínou. Podle velikosti psa se upraví vnitřní průměr umělé pochvy nafouknutím vzduchu mezi stěny. Umělá pochva se zavádí na pyj po erekci v přítomnosti hárající feny, při vzeskoku na fenu nebo po předchozí masturbaci. Po zavedení je vhodné umělou pochvou imitovat frikční pohyby do nastoupení vlastních kopulačních pohybů psa. Obdobně jako u předcházejícího způsobu odběru je vhodné odběr zakončit při nástupu třetí semenné frakce. Elektroejakulace se běžně u psů neprovádí. Jde o pulzační dráždění křížobederní oblasti přes rektum elektrickým proudem o 5 - 10 V a 50 - 100 mA. Je nezbytné ji provádět v celkové anestézii. Bezprostředně po odběru se semeno makroskopicky a mikroskopicky posoudí. Mikroskopicky by mělo semeno vykazovat vysoké procento progresivně se pohybujících spermií. Přímočarý pohyb za hlavičkou by měl být minimálně u 70 % spermií (Vežník, a kol.2004). 2.3.3.1 Příčiny neúspěchu při odběru ejakulátu Na neúspěchu při odběru kvalitního vzorku ejakulátu se může podílet řada příčin. Mezi nejběžnější příčiny patří špatná technika vlastního odběru, získávání semene od neobvykle nervózního a přecitlivělého samce a abnormální zasahování majitele 19
v průběhu odběru. Mezi běžné chyby v technice odběru patří nedostatky v předčasném vybavení pyje z předkožky, nedostatečné přetažení předkožky až za bulbus glandis, abnormální stisk penisu, používání studených pomůcek (umělá pochva) a doteky na sliznici pyje. Většinou se těmto technickým problémům dá předejít. Dalším běžným důvodem neúspěchu je odběr v neznámém prostředí, zvláště bez přítomnosti majitele a také odběr v přítomnosti agresivní feny. Opakovaná návštěva nebo několikahodinový pobyt v cizím prostředí může snížit strach a následně umožnit odběr. Odběr by se měl provádět v klidné světlé místnosti, na neklouzavé podlaze a za přítomnosti co nejmenšího počtu lidí. Někteří psi se dají odebrat pouze majitelem, jiní pouze doma a u dalších musí majitel opustit místnost. Řada přidružených poruch a onemocnění může taktéž znemožnit odběr. Problémem bývá i odběr u psů se slabým libidem, při bolestivých stavech (chronická arthritis, orchitis) a při abnormálním chování z důvodu předchozí negativní sexuální zkušenosti (Doležel a kol.,2001) 2.3.4 Vyšetření ejakulátu Vyšetření ejakulátu se provádí nejčastěji při podezření na subfertility nebo infertilit u psů samců. Provádí se v případech, kdy fena (feny) špatně po určitém plemeníkovi zabřezávají, to znamená, je-li méně než 75 % fen březích a nebo v případech opakovaného nezabřeznutí různých fen v krátkém časovém období, zvláště když předtím problémy nebyly zaznamenány. Odběr a vyšetření ejakulátu se může také provádět u mladých psů před zařazením do plemenitby, jako pravidelná kontrola. U starších psů používaných v plemenitbě, v průběhu umělé inseminace, před konzervací ejakulátu, po dlouhodobém onemocnění a po použití léků. Důkladné vyšetření se doporučuje u psů se suspektní prostatitídou, orchitídou nebo epididymitídou. Protože téměř ve všech ejakulátech jsou přítomné živé spermie, je nutné šetrné zacházení po odběru, aby nedošlo ke zkreslování výsledků. Nešetrnou manipulací se zvyšuje procento mrtvých a morfologicky poškozených spermií, snižuje se jejich motilita a závěrečný výsledek vyšetření je pak nesprávný. Ejakulát by měl být vyšetřen bezprostředně po odběru, nemělo by při manipulaci docházet k výrazným teplotním výkyvům a semeno by se mělo skladovat při 37 oC.
20
Při vyšetřování se musí dodržovat zásady přísné hygieny. Všechny pomůcky, které přicházejí do kontaktu se semenem, musí být důkladně omyté, opláchnuté destilovanou vodou a vysterilizované. Použitý laboratorní materiál by měl být zahřátý, čistý, sklíčka neznečistěná alkoholem či jinými desinfekčními roztoky. (Doležel a kol.,2001). 2.3.5 Konzervace Ředidla ke krátkodobé nebo dlouhodobé konzervaci semene obsahují především složky, které vykazují ochranný účinek na spermie, dodávají energii a udržují konstantní pH, osmotický tlak i koncentraci elektrolytů. Pro mražení jsou nezbytné látky s kryoprotektivním účinkem, které chrání spermie před poškozením zmrazováním nebo rozmrazováním. K ředění semene psa se používají nejčastěji žloutkocitrátová ředidla, případně s přídavkem bikarbonátu, glukózy nebo fruktózy (nebo laktózy především v případě mražení), dále TRIS ředidlo se žloutkem nebo pasterované mléko. Obsah žloutku v uvedených ředidlech se pohybuje kolem 20 %. Pro delší přechovávání se přidávají antibiotika k zabránění množení mikroflóry. Jako kryoprotektivum se používá glycerol v procentuálním zastoupení 4 - 10 %. Pro ředění semene psa je třeba používat pouze druhou semennou frakci bohatou na spermie. Přítomnost 1. a 3. frakce ve větším množství negativně ovlivňuje přežívání konzervovaných spermií. Seminální plazmu lze odstranit jako supernatant po odstředění. Ředění je třeba provádět pomalu vždy způsobem přidávání ředidla do semene. Míra ředění a počet naředěných dávek závisí na kvalitě ejakulátu. Z jednoho odběru je možné získat 1 - 20 inseminačních dávek. Pro krátkodobou konzervaci se většinou semeno ředí v poměru 1 : 5 až 1 : 10. Většinou se ředí tak, aby jeden mililitr obsahoval 150-600 miliónů spermií s progresivním pohybem. Za minimální počet živých spermií v pohlavních cestách feny pro oplození se považuje 100 - 200 miliónů. Krátkodobá konzervace se provádí ředěním semena a snížením jeho teploty nejlépe ve skleněných nádobách. Jako příklad složení ředidel lze uvést 3,025 g TRIS + 1,7 g kyselina citrónová + 1,25g fruktóza + destilovaná voda do 100 ml + 20 % žloutek + 1 mg/ml benzylpenicilin a 1 mg/ml dihydrostreptomycin sulfát nebo pasterizované mléko s 0,1 % tuku + 20 %
žloutek + 1 mg/ml benzylpenicilin a 1 mg/ ml
dihydrostreptomycin sulfát. Snížení teploty má být pozvolné v průběhu 30 - 60 minut. Teplota se obvykle snižuje na teplotu v chladničce (3-5 0C) nebo na konstantní teplotu
21
mezi 5 – 15 0C. Takto lze semeno skladovat do pěti dnů. Při transportu by semeno mělo být v termoboxu s konstantní teplotou nepřevyšující 10 0 C. Pro dlouhodobou konzervaci se používají výše uvedená ředidla s přídavkem glycerolu (nejčastěji 6-8 %). Doba ekvilibrace při teplotě 4 0C je 2 - 3 hodiny. Tradiční způsob představuje mražení na suchém ledě ve formě pelet. Nověji se mražení provádí v ampulích nebo 0,5 ml pejetách automaticky řízeným chlazením pomalou (0,5 0C/min. do -20 0C a dále 2 0C/min. do -70 0C nebo 1-2 0C/min. do –15 0C a dále 3-5 0C/min. do –50 0C) nebo rychlou metodou (12 - 24 0C/min. do – 70 0C). Je možné rovněž po ekvilibraci pejety umístit do kovového válce vychlazeného parami dusíku na -80 až –90 0
C na 10 minut a poté přemístit pejety do tekutého dusíku. Při srovnávání různých
rychlostí mražení vzhledem ke kvalitě semene po rozmražení byla za nejlepší označena rychlost 30
0
C/min. Po zmražení je semeno uloženo do tekutého dusíku a zde
skladováno do použití. Rozmražení inseminačních dávek bezprostředně před inseminací se obvykle provádí při teplotě 55 0C po dobu 6 sekund, případně při 70 0C po dobu 5 sekund (Doležel a kol.,2001). 2.3.6 Inseminace Jestliže je malý objem (pod 5 ml lze semeno před inseminací pomalu zředit 37 0C teplým fyziologickým roztokem do maximálního poměru 1 : 1. Vhodný objem pro umělou inseminaci čerstvým semenem je 5 - 15 ml. Nadměrně velký objem může fenu dráždit a je tak vytlačován zpět z pohlavních cest. Umělá inseminace nebo další zpracování semene by mělo být provedeno do 10 minut po odběru. Orientační mikroskopické vyšetření (motilita, živostnost) před inseminací by mělo být vždy provedeno i při použití konzervovaného semene. Motilita by neměla být nižší než 40-50 % u krátkodobě konzervovaného semene a 30 % u mraženého semene (Doležel a kol.,2001). K inseminaci se používá čerstvý ředěný ejakulát nebo hluboce mražené dávky. (Kvapil, Kvapilová, 2007).
22
2.4 Patomorfologické vyšetření ejakulátu 2.4.1 Morfologie spermií K přípravě vzorku k mikroskopické analýze se používá ředěný i neředěný ejakulát. Základním předpokladem pro získání objektivních výsledků při morfologickém vyšetření je správné zhotovení nátěru vyšetřovaného ejakulátu. Nátěr má být jemný, souvislý a nepoškozený. Při zhotovení nátěru je důležité, aby byla správně připravena podložní sklíčka (odmaštěna). Při nesprávném postupu mohou vznikat artefakty, které by se mohla pokládat za morfologické malformace spermií (Gamčík, Kozumplík, 1976). 2.4.1.1 Nátěr Nátěr zhotovujeme rozetřením malé kapky ejakulátu na podložním sklíčku po úhlem 45o, aby nedošlo k poškození spermií, rozetřeme kapku za hranou sklíčka tak, aby se semeno nedostalo pod hranu sklíčka, jinak by mohlo dojí k poškození spermií. Nátěr po uschnutí na ohřívací desce s teplotou 38oC. (Gamčík, Kozumplík, 1976) 2.4.1.2 Metody barvení K barvení nátěrů psích ejakulátu pro patomorfologické vyšetření se využívají, tyto metody barvení. 2.4.1.2.1 Metoda barvení podle Bydgoště Metoda barvení podle Bydgoště se používá pro znázornění primárních změn hlavičky a bičíku spermie. Hlavička má zbarvení podobné květu černého bezu a bičík je tmavofialový. Reagencie:
0, 20 g metylénové modři, 0,75g genciánové violeti, 5,00 ml glycerolu, 100 ml vody
1% roztok eosinu
96% etanol
Pracovní postup: 1) Naředění sperma s citrátem sodným v poměru 1 : 1 – 3, dle hustoty ejakulátu 2) Zhotovení nátěru a usušení na vyhřívací plotýnce 3) Fixace nátěru v 96% roztoku etanolu ( 30 sekund) 23
4) Opláchnutí preparátu vodou a fixace roztokem eosinu ( 15 – 30 sekund) 5) Důkladné opláchnutí proudem vody a fixace barvivem Bygošť (15 sekund – 2 minuty) 6) Opláchnutí preparátu vodou a jeho usušení 7) Mikroskopické posouzení preparátu při 1000 – 1500 násobném zvětšení za použití olejové imerze Pomůcky: mikroskop, vyhřívací stolek, citrát sodný, pinzeta, roztěrová sklíčka, podložní sklíčka, imerzní olej (Gamčík, Kozumplík, 1976) 2.4.1.2.2 Metoda barvení podle Čeřovského: Je to pohotová a
jednoduchá metoda, která se používá ke stanovení výskytu
abnormálních spermií. Vlivem diferencovaného barvení jednotlivých částí spermie umožňuje rozeznávání konveční vady na spermiích. Reagencie: Nasycený roztok kongo červeně Roztok krystalické violeti Pracovní postup: 1) Na hodinovém sklíčku zředíme 1 kapku psího spermatu s 10 kapkami fyziologického roztoku 2) Na podložním sklíčku provedeme tenký nátěr naředěného spermatu a nechá se zaschnout při laboratorní teplotě 3) Suchý nátěr ponoříme na 15 sekund do nasyceného roztoku kongo červeně 4) Vyjme se a opláchne slabým proudem vody 5) Nechá se zaschnout a barví se asi 4 sekundy v 0,5 % roztoku krystalické violeti 6) Opět opláchneme slabým proudem vody a necháme oschnout 7) Po zaschnutí vyšetřujeme pod mikroskopem při zvětšení 1000x s olejovou imerzí – posuzuje se min. 200 spermií Pomůcky: mikroskop, fyziologický roztok, kapátka, hodinové sklíčko, dóza na mikroskla, roztěrová sklíčka, podložní sklíčka, imerzní olej. (Gamčík, Kozumplík, 1976) 24
2.4.1.2.3 Metoda barvení spermatu podle B.T. Farellyho Metoda je vhodná k diferenciaci patologických a nezralých spermií, k vyšetření akrozómu a střední části bičíku. Výhoda je rychlost barvení. Reagencie: 10% roztok 35% formaldehydu ve fyziologickém roztoku NaCl 5% roztok anilinové modři v destilované vodě 0,5% roztok krystalické violeti v destilované vodě Postup práce: 1) Sperma zředěné na předehřátém hodinovém sklíčku nebo ve zkumavce s fyziologickým roztokem v poměru 1:1 až 1:20 dle hustoty ejakulátu a opatrné promíchání krouživým pohybem. 2) Zhotovení nátěru zředěného ejakulátu a usušení preparátu 3) Fixace preparátu v roztoku formaldehydu (15 sekund) 4) Opláchnutí slabým proudem vody 5) Barvení preparátu roztokem anilinové modři ( 15 sekund) 6) Opláchnutí slabým proudem vody 7) Usušení preparátu na vyhřívací podložce 8) Mikroskopické posouzení preparátu při 1000 – 1500 násobném zvětšení, za použití imerzního oleje Pomůcky: mikroskop, vyhřívací stolek, fyziologický roztok, kapátka, hodinové sklíčko, pinzeta, roztěrová sklíčka, podložní sklíčka, imerzní olej. (Louda, 2001) 2.4.1.3 Hodnocení morfologie Obarvený preparát se hodnotí při 1000 - 1500 násobném zvětšení pod imerzí. Je nutné posoudit minimálně 200 spermií na různých místech stěru. Při výskytu několika změn na jedné spermii se hodnotí závažnější a pokud se současně vyskytuje primární a sekundární anomálie, pak se hodnotí pouze primární. Při vyšším výskytu anomálií je potřeba provést opakované odběry a hodnocení. (Gamčík, Kozumplík, 1976)
25
2.4.1.4 Faktory ovlivňující morfologicky změněné spermie Všechny změny, které jsou v ejakulátu hodnoceny, jakékoliv odchylky od normálního tvaru a struktury jsou považovány za abnormální. Abnormality jednotlivých částí spermií se dělí na primární (vývojová, major) a sekundární (získané, minor), umožňuje to lepší orientaci při určování místa a času vzniku abnormalit (Věžník et al. 2001). Na vzniku defektních spermií se podílí celá řada faktorů – genetické a negenetické ( fyzikálně chemické, vliv výživy, toxické, infekční, vliv věku ….). V závislosti na intenzitě a místě účinku může dojít ke zvýšené tvorbě poškozených spermií. Podle místa poškození spermie se rozdělují: primární a sekundární Primární změny spermií vznikají v průběhu spermiogeneze ve varleti až po průnik spermií do ocasu nadvarlete. Řadíme k nim degenerativní formy hlavičky, změny tvaru hlavičky, změny na akrozómu, změny v nukleoplazmě, abaxiální nasazení bičíku, spermie s proximálně uloženou protoplasmatickou kapkou, tvarové změny na mitochondriálním oddíle atd.. ( Doležel a kol., 2001). Sekundární změny jsou nespecifické a vznikají při dlouhodobém pobytu spermií v ocasu nadvarlete. Dále změny, které vznikají při průchodu vývodnými cestami při ejakulaci, artefakty vznikající špatnou manipulací a při nesprávném zhotovení preparátu. Mezi tyto změny patří změny hlavičky - zduřelé, uvolněné, roztrhnutý akrozóm, na bičíku jeho torze, ulomení atd.. ( Doležel a kol., 2001). U zdravého psa by neměl počet morfologicky změněných spermií přesáhnout hranici 30 %. Spermií s primárními změnami by mělo být méně než 10 % a spermií se sekundárními změnami méně než 20 %. U psů bohužel nebyla ve větší míře zjišťována korelace mezi procentem změněných spermií a koncepcí.
U psů s více jak 60 %
morfologicky normálními spermiemi bylo zjištěno zabřezávání v 61 % a u psů s méně než 60 % morfologicky normálními spermiemi bylo zabřezávání jen 13 % ( Doležel a kol., 2001). Faktory vnitřního a vnějšího prostředí můžou ovlivňovat produkci buněčné populace v ejakulátu. Podíl abnormálních buněk ve spermatu je spojen s oplodňovací kapacitou. Morfologické abnormality spermií u různých zvířecích druhů byly hodnoceny v souvislosti s poklesy plodnosti řadou autorů (Hancock 1959; držené et al, 1991;. Oettlé 1993). 26
Mezní hodnoty pro výskyt morfologicky abnormálních spermií ve spermatu byly stanoveny podle konvence u jednotlivých druhů hospodářských zvířat, nebo u lidské bytosti, a jsou variabilní. Johnston et al. (2001) a Stockner a Bardwick (1991) skupina procenticky morfologicky abnormálních spermií v ejakulátu u psa je normální pod 20%. Threlfall (2003) se domnívá, že je přijatelné, když ejakulát obsahuje více než 70% morfologicky normálních spermi. Věžník et al. (2003) souhlasil s touto hodnotou, s podmínkou, že primární vady v ejakulátu by neměly překročit 10%. Podle Oettlé (1993), úrodnost čerstvého ejakulátu psa se výrazně sníží, pokud je procento morfologicky abnormální buněk v ejakulátu vyšší než 40%. V ejakulátu, se mohou morfologicky abnormální spermie pohybovat pod 40%, rychlost 61%. Kryokonzervace kvalitu ejakulátu snižuje (Johnston et al. 2001). Feldman a Nelson (1987) se domnívají, že ejakulát vhodný pro kryokonzervaci by měl obsahovat více než 70% morfologicky normálních spermií a méně než 20% spermií s primární defekty, apk je vhodný pro kryokonzervaci. 2.4.1.5 Rozdělení morfologických změn patologických forem spermií 1. Vývojové tvarové anomálie degenerativního charakteru: všechny spermie, kt. jsou vyvinuty atypicky a nemají normální diferenciaci, hlavičkuj s akrozómem, spojovací část na bičíku a samotný bičík. Převážně se objevují atypické tvary hlaviček, hlavička bývá menší a abnormálně barvitelná. Do této kategorie patří i spermie, u kterých se nevytvořil normální bičík, ale místo něj pouze vakovitý nebo kyjovitý tvar, nebo spermie dvojitým bičíkem, se zdvojenou hlavičkou atd. Vyšší procento než 5% těchto změn v ejakulátu je ukazatelem vážnější poruchy spermiogeneze.. 2. patologické formy ve tvaru hlaviček: při poruchách spermiogeneze, kt. často provází vnik degenerativních nebo zánětlivých procesů ve varlatech.Výskyt těchto anomálií by neměl překročit 5%. Hlavičky spermií jsou často zúžené, hruškovité, abnormálně veliké, abnormálně malé, asymetrické ovoidní, oválné, citronovité, s abnormální strukturou hlavičky, která může být prosáklá, plošná, příliš široká nebo z úzkým klenutím. Tyto změny patří k změnám primárním. 3. změny na akrozómu: Akróm zbotnalý, k této změně dochází při manipulaci se spermatem, hlavně když se do sběrače dostane voda. Akrozóm často praskne a akrozómová hmota se vylije do prostředí. Kondenzace akrozómové hmoty k přednímu
27
okraji hlavičky, zřasení předních okrajů hlaviček, různé granulace v akrozómové substanci a jiné, které bývají obvykle sekundárního charakteru. 4. změny v zadní části hlavičky: změny v nervové tinktorické schopnosti nebo o výskyt různých granulárních tělísek. 5. změny na spojovací části: zkrácení spojovací části, její prodloužení, zlustění, zúžení, přerušení spojovací části v některém úseku. 6. patologické změny na bičících: stočení bičíku kolem plazmatické kapky, obvykle na spojovací části bičíku. Může se jednat o stočení bičíku do tvaru houslového klíče, zavinutí bičíku do klubka. Řadíme se sem i tzv. Dag-defekt, dochází k abnormálnímu vyvinutí bičíku. Abaxiální upevnění bičíku, kdy bičík nevychází ze středu, ale z okraje hlavičky a dekapitace = oddělení hlaviček od bičíků. Často jde o artificiální změny, které vznikají při nesprávném zhotovení nátěru. 7. nezralé spermie: spermie se zadrženou plazmatickou kapkou na krčku – proximální, nebo v průběhu spojovací části – distální. 8. změny v nukleoplazmě: tyto změny se posuzují při použití speciálního barvení, znázorňující jadernou substanci. Nejčastější změny jsou miliární vakuoly při předním okraji hlavičky, makrovakuoly, nepravidelné uspořádání DNK v jádře nebo slabá barevná reakce nukleoplazmy. V ejakulátu nemá být více než 15% těchto anomálií. ( Doležel a kol., 2001). 2.4.1.6 Využití techniky k hodnocení psího ejakulátu Byla zkoumána možnost využití přístroje
SQA IIc pro rutinní hodnocení psího
ejakulátu. Podle Přinosilové a kol. (2005) bylo cílem výzkumu ukázat, že je důležité morfologické vyšetření, se zaměřením na stanovení sekundárních odchylek spermií a charakterizovat je jako poškození na akrozomu. Je důležité sledovat parametry analýzy spermií při testu přežitelnosti, aby se předvídala kvalita semene i po rozmrazení. Hodnocení morfologie spermií, zejména spermií s membránovými změnami v akrozomální oblasti. Podle práce Přinosilové a kol. (2005) byl odebrán opakovaně ejakulát ruční manipulací do plastových zkumavek bez přítomnosti feny od 15 psů ve věku 2 – 11 let (průměr 5 let), plemena Afgánský chrt, basset, beagle, dobrman, Yorkshire terrier, labrador, Německý ovčák, rottweiler, leonberger, sheltie, Irský vlkodav. Celkem bylo 28
odebráno
30
čerstvých
ejakulátů
a
následně
konzervovány
v tris-fruktose-
kys.citrónové-žloutku s ředidlem s obsahem 6% glycerolu. Ejakulát byl vyšetřen metodami rutinní spermatoanalýzy a přístrojem SQA IIc. SQA IIc byl vyvinut pro vyšetření lidského spermatu. Přístroj vyhodnocuje kvalitu spermatu vytvořením parametru SMI (index pohyblivosti spermií). Zařízení stanuvuje koncentraci spermií, procento pohyblivých spermií a procento spermií s normální morfologií, které jsou odvozeny z hodnot SMI (Comodo a kol., 1997). Vyšetření ejakulátu bylo zaměřené na hodnocení parametrů určující kvalitu membrán spermie. Byl ověřen význam sledování parametrů spermatoanalýzy v průběhu krátkodobého testu přežitelnosti pro predikci kvality ejakulátu psa po rozmrazení. Byla doložena významnost
posouzení
morfologie
ejakulátu,
především
zastoupení
spermií
s membránovými změnami v oblasti akrozomu. Bylo potvrzeno, že přístroj SQA analyzuje kvalitu ejakulátu na základě hodnocení masy pohybujících se buněk. Pro potřeby hlubší spermatologické diagnostiky semene psa, zaměřené hlavně na morfologickou analýzu ejakulátu, se jeví výsledky poskytnuté přístrojem SQA IIc jako nedostačující (Přinosilová a kol. 2005).
2.5 Cytologické vyšetření Cytologické vyšetření se provádí nátěrem, neředěného ejakulátu, který je možno obarvit např. Methylenovou modří a vyloučit tak přítomnost zánětlivých buněk a bakterií. Příležitostný záchyt nepoškozených zánětlivých buněk (neutrofily, lymfocyty, makrofágy, plasmatické buňky), erytrocytů a baktérií se běžně vyskytuje i v ejakulátu zdravých psů jako následek kontaminace ejakulátu v uretře. Také výskyt epiteliálních buněk je normální obzvláště u psů, kteří nebyli dlouhodobě sexuálně využíváni. Při výskytu enormního množství těchto typů buněk současně s výskytem baktérií v buňkách uvažujeme o zánětlivém procesu. Na druhé straně, pokud se tyto buňky v ejakulátu nebudou vyskytovat, nedá se zcela jednoznačně zánět vyloučit. Velký výskyt mononukleárních buněk může svědčit o imunitní orchitídě (Doležel a kol.,2001).
29
3
MATERIÁL A METODIKA Pro výzkum bylo odebráno celkem 115 ejakulátů od 43 psů 10-ti plemen:
3.1 Rozdělení skupin dle plemene Německý ovčák, krátkosrstý německý Ohař, belgický ovčák Malinois, belgický ovčák Tervueren, belgický ovčák Groenendael, Irský setr, Australský ovčák, kříženec, border kolie, Pikardský ovčák.
3.2 Rozdělení psů dle FCI skupin 1.
FCI I.- ovčáci
2.
FCI VII. – ohaři
3.
NO FCI
3.3 Psi byly rozřazeni do skupin podle věku 1.
do 2 roky
2.
2-6 let
3.
nad 6let
3.4 Způsob odběru a hodnocení ejakulátu Psi byli odebíráni způsobem manuální stimulace. Ihned po odběru bylo provedeno vyšetření ejakulátu makroskopické, mikroskopické. Byl zjišťován objem ejakulátu – pomocí kalibrační nádoby, aktivita spermií podle procenta pohyblivých spermií v nativním preparátu při zvětšení 200 x , koncentrace spermií byla zjišťována hemocytometrickou metodou v Bürkerově komůrce. Dále jsme prováděli morfologické vyšetření z nátěrů ejakulátu dle metody barvení Farellyho (Louda, 2001). U morfologického vyšetření byli vyhodnoceny, morfologicky normální spermie, nezralé spermie a % patomorfologicky změněných spermií.
3.5 Statistické zhodnocení Následně bylo provedeno statistické vyhodnocení získaných dat prostřednictvím programu STATISTICA, verze 9.0. Sledované znaky byly vyjádřeny váženým průměrem a směrodatnou odchylkou.
30
4
VÝSLEDKY A DISKUZE
4.1 Hodnocení ejakulátů dle plemene 4.1.1 Objem ejakulátu, aktivita a koncentrace spermií v ejakulátu psů dle plemena V tabulce 1 jsou uvedeny zjištěné objemy, aktivity a koncentrace dle plemenné příslušnosti a statisticky průkazné rozdíly. Tabulka 1: Kvalitativní ukazatele ejakulátu psů. Objem (ml) Plemeno
OVČÁK BELGICKÝ OVČÁK
A
10
B
9
C
20
D
11
BORDER KOLIE
E
10
NĚMECKÝ OVČÁK
F
12
PIKARDSKÝ OVČÁK
G
8
MALINOIS BELGICKÝ OVČÁK TERVUEREN
NĚMECKÝ OHAŘ KRÁTKOSRSTÝ
21,00 BCDEFHIJ
GROENENDAEL BELGICKÝ OVČÁK
(103 .mm -3)
n X
AUSTRALSKÝ
Koncentrace
Aktivita (%)
H
12
SETR
I
10
KŘÍŽENEC
J
13
A 10,00 A 11,00 Aj 5,55 A 7,35 A 8,92 2,5 AJ 5,13 AJ 3,35 13,62
±
SX
±
10,61
±
4,33
±
4,93
±
2,62
±
5,72
±
2,07
±
0
±
2,35
±
1,75
±
8,83
X HI 81,50 HI 70,00 HI 74,25 HI 73,64 HI 72,00 HI 78,33 HI 90,00 42,50 ABCDEFGJ
GHId
HI 45,00 70,00 ABCDEFGJ
±
SX
±
11,8
±
0
±
11,73
±
8,09
±
9,19
±
6,51
±
0
±
22,61
±
26,77
±
8,16
±
SX
G
±
10,12
Gi
±
12,5
G
±
127,9
G
±
67,01
G
±
108,46
G
±
50,27
±
83,45
G
±
55,76
bgj
±
243,6
Gi
±
37,02
X
120,50 83,33 164,75 142,18 165,50 165,00 437,50 ABCDEFHJi
140,00 243,00 80,7692
ABCDEFGHIJ – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abcdefghij – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
31
Nejvyšší objem ejakulátu byl zjištěn u australských ovčáků, a to 21 ml naopak nejnižší objem byl zjištěn u pikardských ovčáků a to 2,5 ml. Jelínek a kol. 2003 uvádí jako průměrný objem u psího ejakulátu 7 ml, tato hodnota byla zjištena u border kolií. Australští ovčáci měli vysoce průkazně vyšší objem ejakulátu oproti ostatním sledovaným plemenům. Druhým sledovaným znakem byla aktivita spermií. Nejvyšší aktivita byla zaznamenána u pikardských ovčáků, a to 90 %, následoval australský ovčák s aktivitou spermií 81,5 %. Aktivita nad 70%, kterou uvádí Věžník a kol. (2004) pro normální psí ejakulát byl zaznamenán u všech plemen mimo setrů a německých krátkosrstých ohařů. Setři a němečtí krátkosrstí ohaři měli vysoce průkazně nižší aktivitu než ostatní sledovaná plemena. Koncentrace spermií se pohybovala od 80,76.103.mm-3 u kříženců až po 437,50.103.mm-3 u pikardských ovčáků, kteří měli statisticky vysoce průkazně vyšší koncentraci spermií než ostatní sledovaná plemena psů. Jelínek a kol. (2003) uvádí jako průměrnou koncentraci spermií v psím ejakulátu 120.103.mm-3 , což dosahují všechna námi sledovaná plemena mimo Belgických ovčáků groenendaelů a kříženců. Věžník a kol. (2004) uvádí koncentraci pro normální psí ejakulát minimálně 200.10 3.mm-3, tato koncentrace byla zjištěna u setrů a pikardských ovčáků. 4.1.2 Výskyt morfologicky normálních a patologických spermií v ejakulátech podle plemen V tabulce 2 je uvedeno procento morfologicky normálních spermií dle plemene. Nejvíce morfologicky normálních spermií bylo zjištěno u pikardských ovčáků, a to 77,75 %. Nejméně morfologicky normálních spermií bylo zjištěno u německého krátkosrstého ohaře, a to 36,58 %. Věžník a kol. (2004) uvádí jako dostačující pro normální ejakulát minimálně 70 % morfologicky normálních spermií, tato hodnota byla zaznamenána u všech sledovaných plemen, mimo německého krátkosrstého ohaře, setra a belgického ovčáka malinoa, který dosáhl 69,8 % morfologicky normálních spermií. Přinosilová a kol. (2005) ve své práci zjistila 73 % morfologicky normálních spermií, velmi podobný výsledek byl zjištěn u border kolie a německých ovčáků (73,10 respektive 72,92 % morfologicky normálních spermií v ejakuátu). Statisticky průkazné rozdíly jsou uvedeny v tabulce 2.
32
Tabulka 2: Vyšetření ejakulátu psů na morfologicky normální spermie a celkovou patologii. Morfologicky normální Plemeno
spermie (%)
n
±
SX
±
5,74
±
4,9
69,8H
±
15,31
H
±
8,23
±
7,62
±
7,23
±
3,96
±
30,03
X AUSTRALSKÝ OVČÁK
A
10
B
9
C
20
D
11
BORDER KOLIE
E
10
NĚMECKÝ OVČÁK
F
12
PIKARDSKÝ OVČÁK
G
8
H
12
BELGICKÝ OVČÁK GROENENDAEL BELGICKÝ OVČÁK
Hi 76,4 H 75,44
MALINOIS BELGICKÝ OVČÁK TERVUEREN
NĚMECKÝ OHAŘ KRÁTKOSRSTÝ
70,91 H 73,10 H 72,92 Hi 77,75 36,58 ABCDEFGJi
SETR
I
10
KŘÍŽENEC
J
13
Patologické spermie (%)
aghj 56,10 Hi 76,54
±
SX
Hi
±
5,74
H
±
4,9
H
±
15,31
H
±
8,23
H
±
7,62
H
±
7,23
Hi
±
3,96
±
30,03
±
8,62
±
8,15
X
23,60 24,56 30,20 29,09 26,90 27,08 22,25 63,42 ABCDEFGJi
±
8,62
±
8,15
aghj 43,90 Hi 23,46
ABCDEFGHIJ – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abcdefghij – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
4.1.3 Výskyt poškozených hlaviček a akrozomů spermií v ejakulátech psů podle plemene Změny na hlavičce a akrozomu jsou uvedeny v tabulce 3. Nejvíce změněných hlaviček bylo nalezeno u německých krátkosrstých ohařů, a to 13,25 %, naopak nejméně poškozených hlaviček bylo zaznamenáno u australských ovčáků, a to 4,40 %. Mezi plemeny nebyly zaznamenány statisticky průkazné rozdíly. Filipčík a kol. (2011) ve své 33
práci uvádí poškození hlaviček v rozmezí 4 až 11,5 %, což odpovídá mnou zjištěným hodnotám. Nejvíce vad na akrozomu bylo zjištěno u australských ovčáků, a to 3,90 %. Poškozený akrozom nebyl zjištěn u pikardských ovčáků a kříženců a pouze 0,11 % poškozených akrozomů bylo zjištěno u belgických ovčáků groenendaelů. Filipčík a kol. (2011) uvádí poškození akrozomů v rozmezí 0,5 až 3,0 %. Hodnoty, které byli zjištěny se pohybují ve větším rozptylu, a to od 0,0 do 3,9 %. Průkazné rozdíly jsou uvedeny v tabulce 3. Tabulka 3: Všetření ejakulátu psů na změny na hlavičce a změny na akrozomu
Plemeno
AUSTRALSKÝ OVČÁK
n
Změny na hlavičce (%) X
±
SX
Změny na akrozomu (%) ±
SX
JBGdeh
±
1,79
A
±
0,33
X
A
10
4,4
±
2,59
B
9
12
±
3,81
C
20
11
±
14,63
1,65
±
2,01
D
11
7,27
±
3,13
a 0,82
±
0,87
BORDER KOLIE
E
10
10,4
±
0,52
a 0,50
±
0,85
NĚMECKÝ OVČÁK
F
12
8,33
±
3,34
2
±
5,12
PIKARDSKÝ OVČÁK
G
8
8,38
±
1,77
A
±
0
H
12
13,25
±
6,85
a 0,50
±
0,9
SETR
I
10
6
±
3,56
1,2
±
1,23
KŘÍŽENEC
J
13
11,38
±
1,12
±
0
BELGICKÝ OVČÁK GROENENDAEL BELGICKÝ OVČÁK MALINOIS BELGICKÝ OVČÁK TERVUEREN
NĚMECKÝ OHAŘ KRÁTKOSRSTÝ
3,90 0,11
0,00
A 0,00
ABCDEFGHIJ – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abcdefghij – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
34
4.1.4 Výskyt poškozených spojovacích částí a bičíků spermií v ejakulátech psů podle plemene V tabulce 4 uvádím procento poškozených spojovacích částí a bičíků. Tabulka 4: Všetření ejakulátu psů na změny na spojovací části bičíku a změny na bičíku
Plemeno
n
Změny na spojovací části bičíku (%) ±
SX
3,4
±
2,46
X AUSTRALSKÝ OVČÁK
A
10
B
9
h 2,00
±
0,87
C
20
3,75
±
4,99
D
11
4,09
±
3,05
BORDER KOLIE
E
10
2,5
±
1,35
NĚMECKÝ OVČÁK
F
12
H
±
1,37
PIKARDSKÝ OVČÁK
G
8
3,88
±
1,64
H
12
FIJb
±
SETR
I
10
KŘÍŽENEC
J
13
BELGICKÝ OVČÁK GROENENDAEL BELGICKÝ OVČÁK MALINOIS BELGICKÝ OVČÁK TERVUEREN
NĚMECKÝ OHAŘ KRÁTKOSRSTÝ
1,67
6,58 H 1,10 H 1,54
± ±
Změny na bičíku (%) ±
X HI
±
5,15
HI
±
4,8
HI
±
3,39
HI
±
6,57
HI
±
7,73
HI
±
3,95
HI
±
2,17
ABCDEFGJ
±
17,45
ABCDEFGJ
±
9,67
HI
±
7,99
8,90 9,67 10,30 10,27 11,00 7,83 6,13
4,23 32,25 0,99 28,80 0,78
SX
8,77
ABCDEFGHIJ – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abcdefghij – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
Nejvíce poškozených spojovacích částí bylo zaznamenáno, a to 6,58 %, u krátkosrstého německého ohaře. Nejméně poškozených spojovacích částí bylo nalezeno u setrů, a to 1,10 %. Průkazný rozdíl byl zjištěn u německého krátkosrstého ohaře a belgického ovčáka groenendaela. Vysoce průkazný rozdíl byl zjištěn u německého 35
krátkosrstého ohaře a kříženců, setrů a německých ovčáků. Filipčík a kol. (2011) ve své práci uvádí rozmezí poškozených spojovacích částí spermií v ejakulátu psů v rozsahu 2,86 až 4,50 %. Tyto hodnoty byli zjištěny u australských ovčáků, belgických ovčáků tervuerenů, belgických ovčáků malinoisů a pikardských ovčáků. Nižší hodnoty byli zjištěny u kříženců, setrů, německých ovčáků, border kolií a belgických ovčáků groenendaelů. Naopak vyšší hodnoty než uvádí Filipčík a kol. (2011) byli zjištěny pouze u německého krátkosrstého ohaře. Nejvíce poškození bičíků spermií bylo zjištěno u německých krátkosrstých ohařů, a to celých 32,25 %, následovali setři s 28,80 %. Naopak nejméně poškozených bičíků spermií bylo zjištěno u pikardských ovčáků, a to 6,13 %. Podobné výsledky uvádí i Filipčík a kol. (2011). Vysoce průkazný rozdíl byl zjištěn mezi setry a německými krátkosrstými ohaři a ostatními sledovanými plemeny. 4.1.5 Výskyt nezralých a degenerovaných spermii v ejakulátu psů dle plemene V tabulce 5 je uvedeno procento nezralých a degenerovaných spermií v ejakulátu. Nezralé spermie byli zjištěny v rozmezí 1,70 až 7,25 % spermií. Nejvíce nezralých spermií bylo zjištěno u německých krátkosrstých ohařů a naopak nejméně u border kolíí a australských ovčáků. Naše výsledky jsou až o 2,5 % lepší, než uvádí ve své práci Filipčík a kol. (2011), který uvádí až 9,75% nezralých spermií v ejakulátu psů. Zjištěné statisticky průkazné rozdíly jsou uvedeny v tabulce 5.
36
Tab.5: Vyšetření ejakulátu psů na nezralé spermie a degenerované spermie. Plemeno
n
Nezralé spermie (%) X
AUSTRALSKÝ OVČÁK
Hf
±
SX
±
1,42
±
0,78
A
10
B
9
C
20
h 2,90
±
2,25
D
11
6
±
3,61
BORDER KOLIE
E
10
Hf
±
0,82
NĚMECKÝ OVČÁK
F
12
±
5,38
PIKARDSKÝ OVČÁK
G
8
3
±
1,2
H
12
AEJbc
±
BELGICKÝ OVČÁK
1,70 fh 1,89
GROENENDAEL BELGICKÝ OVČÁK MALINOIS BELGICKÝ OVČÁK TERVUEREN
NĚMECKÝ OHAŘ KRÁTKOSRSTÝ SETR
I
10
KŘÍŽENEC
J
13
1,70 Jabe 6,58
7,25
4,16
Degenerované spermie (%) ±
SX
H
±
0,63
H
±
0,33
H
±
0,75
H
±
0,65
H
±
0,32
H
±
0,79
H
±
0,93
±
2,27
H
±
1,05
H
±
0
X
1,20 0,11 0,65 0,73 0,10 0,58 1,00 3,33 ABCDEFGIJ
5,8
±
4,34
FH
±
1,41
1,85
1,00 0,00
ABCDEFGHIJ – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abcdefghij – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých sloupcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
Degenerované spermie byli nalezeny u 0,00 až 3,33 % spermií v ejakulátu. Degenerované spermie nebyli zjištěny u kříženců, naopak nejvíce degenerovaných spermií byli zjištěny u německého krátkosrstého ohaře. Filipčík a kol. (2011) ve své práci uvádí degenerované spermie v ejakulátu v rozmezí 0,25 až 2 % případů. Menší hodnoty než uvádí Filipčík a kol. (2011) jsem zjistila kříženců, border kolií a belgických ovčáků groenendaelů. Naopak vyšší hodnota byla zaznamenána u něm. krátkosrstého ohaře. Statisticky průkazné rozdíly mezi plemeny jsou uvedeny v tabulce 5.
37
4.2 Hodnocení ejakulátu podle věku psů Objem ejakulátu byl nejvyšší u psů nad 6 let věku, a to 11,97 ml. Nejnižší objem ejakulátu byl zjištěn u psů ve věku do dvou let, a to 7,97 ml. Zjištěné hodnoty byly značně vyšší, než uvádí Věžník a kol. (2004) pro normální psí ejakulát, a to 2 ml. Jelínek uvádí jako průměrný objem ejakulátu u psů je 7 ml, což se blíží hodnotě která byla zjištěna u nejmladší skupiny psů, starší psi měli objem ejakulátu vyšší. Doležel a kol.(2001) uvádí, že objem může být od 2 do 50 ml. Námi zjištěné hodnoty se pohybují v první čtvrtině udávaného rozmezí. Aktivita byla u nejmladších psů pouze 66,96 % což neodpovídá hodnotě kterou uvádí Věžník a kol. (2004) pro normální psí ejakulát, a to 70 %. Tuto hodnotu dosáhli psi starší 2 let. Koncentrace spermií byla nejvyšší u nejmladších psů, a to 178,14.10 3.mm-3 , naopak nejnižší koncentrace spermií byla zjištěna u psů starších 6 let, a to 135,25.103.mm-3 . Přinosilová a kol. (2005) zjistila koncentraci spermií v rozmezí 51 až 1226.10 3.mm-3 , Jelínek a kol. (2003) uvádí, že průměrná koncentrace spermií v psím ejakulátu je 120.103.mm-3, což odpovídá zjištěným hodnotám. Psi do 2 let měli průkazně nižší procento morfologicky normálních spermií v ejakulátu, a to 64,35, než starší psi. Věžník a kol. (2004) uvádí 70 % morfologicky normálních spermií v normálním psím ejakulátu. Psi ve od 2 do 6 let a psi nad 6 let měli procento morfologicky normálních spermií v ejakulátu 70,09 a 73,80%, což odpovídá požadavkům, které uvádí Věžník a kol. (2004). Přinosilová a kol. (2005) zjistila 73 % morfologicky normálních spermií v ejakulátu psů, tato hodnota se rovná hodnotě, která byla zjištěna u psů nad 6 let.
38
Tabulka 6: Hodnocení ejakulátu psů podle věku Věk Úroveň faktoru
do 2 let
2 až 6 let
nad 6 let
A
B
C
51
44
20
n
±
X
SX 4,94
±
SX
9,23
±
8,51 20,11
X
Objem
7,97
±
Aktivita
66,96
±
20,21
71,25
±
178,14
±
147,46
166,34
±
Koncentrace Morf. normální spermie (%) Změny na
bc 64,35 11,67B
± ±
hlavičce (%) Změny na akrozomu (%)
b 0,78
Zm. spoj. části bičíku (%) Změny na bičíku (%) Nezralé spermie
B 4,10 14,55 3,63
± ± ± ±
23,24 9,64 1,50 4,03 13,27 3,23
(%) Degenerované spermie (%)
C 1,18
Patologické spermie (%)
bc 35,65
± ±
1,72 23,24
126,8
±
X
SX
11,97
±
8,22
72
±
8,33
135,25
±
91,48
a 73,80
±
7,93
7
a 70,09
±
11,13
A
±
3,44
10,9
±
1,25
1,91a
±
3,04
0,25
±
0,63
A
±
2,28
2,35
±
1,66
13,39
±
10,57
10,3
±
8,20
C
±
4,31
B
±
1,21
±
0,82
AB
±
0,30
±
11,13
a 26,20
±
7,93
6,30
2,32
5,05 C 0,86 a 29,91
2,00 0,10
ABC – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abc – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
39
4.3 Hodnocení ejakulátu dle pořadí odběru Jak je uvedeno v tabulce 7, při prvním až třetím odběru byl objem ejakulátu 8,88 až 9,45 ml. Což je vyšší objem než uvádí Jelínek a kol. (2003) jako průměrný pro psí ejakulát. Objem ejakulátu při jednotlivých odběrech mírně narůstal, výsledky však nebyly statisticky průkazně rozdílné. Naopak aktivita spermií v ejakulátu od prvního k třetímu odběru klesala, a to z 70,23 % na 68,64 %, ani zde však nebyl zjištěn statisticky průkazný rozdíl. Pouze při prvním odběru bylo dosaženo aktivity spermií, kterou uvádí Věžník a kol. (2004) pro normální psí ejakulát, a to 70 %. Koncentrace spermií také velmi mírně klesala, a to z 172,4 na 152,2.103.mm-3, což je vyšší koncentrace než uvádí Jelínek a kol. (2003), jako průměrnou pro psí ejakulát, a to 120.103.mm-3 . Procento morfologicky normálních spermií bylo u všech odběrů pod 70 %, které uvádí Věžník a kol.(2004) pro normální psí ejakulát. Nejvíce patologických změn bylo zjištěno na bičících, a to 12,48 až 14,76 %. Filipčík a kol. (2011) zjistil 9,82 až 20,32 % poškození bičíků v psím ejakulátu. Poškozené hlavičky byli zjištěny u 8,06 až 10,74 % spermií, nejvíce při druhém odběru a nejméně při třetím odběru ejakulátu. Filipčík a kol. (2011) ve své práci podobné výsledky.
40
Tabulka 7: Vliv pořadí odběru Úroveň
ODBĚR
faktoru
n
1
2
3
A
B
C
43
39
33
X
±
SX
Objem
8,88
±
7,15
Aktivita
70,23
±
Koncentrace
172,4
Morf. norm.
±
SX
9,22
±
7,24
9,45
±
7,30
18,45
69,36
±
18,67
68,64
±
19,53
±
136,1
171,1
±
140,3
152,21
±
115,75
69,12
±
15,92
67,56
±
19,17
67,73
±
18,03
9,42
±
5,25
10,74
±
10,36
8,06
±
4,14
1,37
±
3,03
0,79
±
1,30
1,18
±
1,84
2,95
±
2,33
3,59
±
4,08
2,76
±
3,06
12,48
±
11,23
13,15
±
11,64
14,76
±
12,01
3,63
±
3,48
3,56
±
3,11
4,6
±
4,27
1,02
±
1,35
0,67
±
1,03
0,91
±
1,54
30,88
±
15,92
32,44
±
19,17
32,27
±
18,03
X
±
X
SX
spermie (%) Změny na hlavičce (%) Z. akrozomu (%) Z. spoj. části bičíku (%) Změny na bičíku (%) Nezralé spermie (%) Degenerované spermie (%) Patologické spermie (%) ABC – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abc – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
41
4.4 Hodnocení ejakulátu podle FCI skupin Výrazně nižší objem ejakulátu byl zjištěn u psů ze skupiny FCI 7, a to 4,32 ml, u kříženců byl zjištěn objem ejakulátu 13,62 ml a u psů ze skupiny FCI 1 9,77 ml ejakulátu. Kříženci a psi ze skupiny FCI 1 měli vyšší objem ejakulátu, než uvádí Jelínek a kol. (2003) jako průměrný. Naopak psi ze skupiny FCI 7 měli objem ejakulátu nižší. Aktivita spermií byla nejnižší u psů ze skupiny FCI 7, a to 43,64 %. Psi ze skupiny FCI 1 a kříženci měli aktivitu spermií takřka stejnou, a to 76,5 a 76,54 %. Psi ze skupiny FCI 1 a kříženci měli aktivitu spermií vyšší, než uvádí Věžník a kol. (2004) jako minimální pro normální psí ejakulát. Nízká aktivita spermií u psů ze skupiny FCI 7 může značit sníženou plodnost těchto psů. Koncentraci spermií měli nejnižší kříženci a naopak nejvyšší psi ze skupiny FCI 7. Jelínek a kol. (2003) uvádí jako průměrnou koncentraci spermií v ejakulátu psů 120 .103.mm-3 na psi ze skupiny FCI 1 a 7 měli koncentraci vyšší, naopak nižší koncentraci byla zjištěna u kříženců. Výsledky morfologického vyšetření jsou uvedeny v tabulce 8. Nejvíce patologicky změněných spermií měli psi ze skupiny FCI 7. Nejvíce změn u nich bylo zjištěno na bičících. Spermie s poškozeným bičíkem tvořily 30,68 % spermií v ejakulátu. Což je výrazně více než uvádí ve své práci Filipčík a kol. (2011). Průkazné rozdíly jsou uvedeny v tabulce 8.
42
Tabulka 8: Hodnocení ejakulátu podle FCI skupin. Úroveň
FCI 1
FCI 7
NO FCI
A
B
C
80
22
13
faktoru n
±
X Objem
Aktivita Koncentrace
b 9,77 B 76,5
Změny na hlavičce (%) Zm akrozomu (%)
B
AC
0,82
± 1,09
0
±
0,00
4,09
± 4,19
1,54
±
0,77
AC
± 14,23
B
±
7,99
B
±
1,40
B
±
0,00
B
±
8,15
3,07
B
±
5,01
±
3,30
±
0,73
±
9,69
B 26,91
80,77 ± 37,01
1,12
±
Celková
± 8,16
±
3,1
B
B 76,54
11,39
2,56
0,63
± 8,82
± 6,60
±
Degenerované
B 13,62
8,15
1,39
B
± 24,01
SX
±
9,95
3,48
± 2,23
±
X
B
7,89
9,35
SX
186,82 ± 172,67
±
Nezralé
patologie (%)
AC 43,64
9,04
Změny na
spermie (%)
Ca 4,32
9,69
bičíku (%)
spermie (%)
± 10,23
±
X
±
73,09
Z. spoj. části
bičíku (%)
± 7,12
174,36 ± 123,90
Morf. norm. spermie (%)
SX
45,46
30,68 AC 6,59 AC 2,27 AC 54,54
± 24,56
± 4,20 ± 2,14 ± 24,56
76,54
8,77
1,58
0,00
23,46
ABC – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky vysoce průkazné rozdíly (P≤0,01) abc – mezi hodnotami s různými písmeny v jednotlivých řádcích byly prokázány statisticky průkazné rozdíly (P≤0,05)
43
5
DOPORUČENÍ PRO CHOVATELE Z výsledků práce vyšla tato doporučení: 1. Nepoužívat do chovu psi mladší dvou let . 2. Před zařazením do chovu, nebo při delší reprodukční pauze, provést preventivní vyšetření ejakulátu před použitím plemeníka v chovu, přejde se tak zklamání z neúspěšného krytí, vinou neplodnosti psa. 3. Chovatelé zejména plemen ze skupiny FCI 7, by měli zvážit možnost zvedení povinného vyšetření ejakulátu, před zařazením jedinců do chovu. 4. Při výběru plemeníka na svoji fenu, upřednostnit jedince s výbornými parametry ejakulátu.
44
6
ZÁVĚR Diplomová práce byla zaměřena na vyšetření ejakulátu a dále na vyšetření
patomorfologických vad v ejakulátech různých plemen psů. Psi byli odebíráni způsobem manuální stimulace. Ihned
po
odběru
bylo
provedeno
vyšetření
ejakulátu
makroskopické,
mikroskopické. Z výsledků vyšetření jsem zjistili, že nejvyšší objem ejakulátu byl zjištěn u australských ovčáků 21 ml naopak nejnižší objem byl zjištěn u pikardských ovčáků 2,5 ml. Průměrných hodnot dosahovali border kolie 7 ml. Australští ovčáci měli vysoce průkazně vyšší objem ejakulátu oproti ostatním sledovaným plemenům. Aktivitu nad 70 %, kterou by měl mít normální ejakulát, jsem zaznamenala u všech plemen, kromě setrů a německých krátkosrstých ohařů, kteří měli vysoce průkazně nižší aktivitu než ostatní sledovaná plemena. U pikardských ovčáků se aktivita pohybovala okolo 90 %, australský ovčák 81,5 %. Koncentrace spermií by se měla v průměrně pohybovat 120.103.mm-3 dosahují všechna námi sledovaná plemena mimo belgických ovčáků groenendaelů a kříženců. U kříženců byla koncentrace od 80,76.103.mm-3 až 437,50.103.mm-3, pikardští ovčáci, měli statisticky vysoce průkazně vyšší koncentraci spermií než ostatní sledovaná plemena psů. Dále bylo zjištěno, že nejvyšší procento morfologicky normálních spermií bylo u pikardských ovčáků 77,75 %. Nejméně morfologicky normálních spermií bylo u německého krátkosrstého ohaře 36,58 %. Normální ejakulát by měl dosahovat minimálně 70 % morfologicky normálních spermií, tuto hodnotu jsem zaznamenala u všech sledovaných plemen, mimo německého krátkosrstého ohaře, setra a belgického ovčáka malinoise, který dosáhl 69,8 % morfologicky normálních spermií. Nejčastěji jsme zaznamenali vadu na bičících. Nejvíce poškození bičíků spermií bylo u německých krátkosrstých ohařů 32,25 % a u setrů 28,80 %. Nejméně poškozených bičíků spermií bylo zjištěno u pikardských ovčáků, 6,13 %. Vysoce průkazný rozdíl byl zjištěn mezi setry a německými krátkosrstými ohaři a ostatními sledovanými plemeny. U psů do dvou let byla zaznamenána horší kvalita ejakulátu, než u starších psů. Pořadí odběrů nemělo na kvalitu ejakulátu vliv.
45
Psi z FCI skupiny VII. (ohaři) měli vysoce průkazně horší výsledky vyšetření ejakulátů, oproti psům z FCI skupiny I. (ovčáci), nebo křížencům, kteří měli výsledky vyšetření ejakulátu uspokojivé. Závěrem lze říci, jak ukazují výsledky diplomové práce, že chovatelé do značné míry staví ostatní znaky (exteriér, povahu) před reprodukční schopnosti zejména psů samců. Chovatelé zejména psů ze skupiny FCI 7 by měli zvážit zavedení povinného vyšetření ejakulátu před zařazením jedinců do chovu a pro krytí svých fen využívat přednostně psy s výbornými výsledky vyšetření ejakulátů. I chovatelé ostatních plemen by měli věnovat pozornost kvalitě ejakulátu psů, které využívají v chovu, protože jen při využití psů s kvalitním ejakulátem mohou dosáhnout plných vrhů a tak využít plně potenciál svých fen.
46
7
LITERATURA
Andersen K. (1975) Insemination with frozen dog semen based on a new insemination Technique. Zuchthygiene , 10, 1-4
Anonym: Http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/dog.html Http://vetvill.cz/index.php/andrologie/68 Čtyroká H., 2002: Seminář pro chovatele psů na téma Krycí pes. Databáze online [cit. 2010-08-05] Dostupné na: http://www.veterina-info.cz/script/articledetail.asp?Rid=131 Doležel, R. - Vitásek, R. - Senior, FD.: Poruchy reprodukčního systému. In: Svoboda Senior FD, Doubek J, Klimeš J. A kol.: Nemoci psa a kočky II. Díl. Noviko a.s.: 2001, 1253-1359, ISBN 80-902595-3 Dostál, J. Genetika a šlechtění plemen psů. České Budějovice: Dona, 2007. 261 s. ISBN 978-80-7322-104-1. Dostál, J. 1995: Chov psů : Genetika v kynologické praxi. České Budějovice: DONA,. 206 s. ISBN 80-85463-58-X Filipčík R. , Vágenknechtová M., Hošek M., Jarinkovičová L., 2011: The effect of the age of dogs on their ejaculate, Acta Universitatis Agriculturae et silviculturae Mendelianae Brunensis, 2011, sv 59, č. 3, s. 46 – 50, ISSN 1211-8516. Gamčík P., Kozumplík J. A kol., 1992 - Andrológia a umelá inseminácia hospodářských zvierat, vydavatelství Príroda, Bratislava, 574 s. Jelínek P., Koudela F. a kol. 2003: Fyziologie hospodářských zvířat. MZLU v Brně, Brno. ISBN 80-7157-644-1, 414 s. Joshua, J.O., 1984: Reprodukční klinické problémy u psů, Bristol, John Wrigth, 1984, s.49-60.
47
Kvapil R., Kvapilová R., 2007: Průvodce psí reprodukci, 145 s. Marvan F., a kol. 2007: Morfologie hospodářských zvířat. IV. Vyd. Brno: Centa, 2007. 304 s. ISBN 978-80-213-1658-4 Melissa Rouge, 2004: dostupné na: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/conc.html Naxera, V. 1991: Pes a domácí lékař, 115 s. Přinosilová P., Vinkler A., Věžník Z., 2005: Morphological Image of Fresh and Cryopreserved Dog Semen Evaluated by the Strict Analysis of Sperm Morphology Method, Using Sperm Quality Analyzer (SQA IIc) Evaluation. Acta Vet Brno 75, 2005: 393-401. Seagerovou, S. W. J. 1986: Umělé oplodnění u psů: Burke, TJ malé zvířecí reprodukci a neplodnost, Philadelphia: Lea & Febiger, 1986, str. 207-17 Sova Z., 1987: Nemoci psů, Státní zemědělské nakladatelství Svoboda M., 2001: Nemoci psa a kočky II. Díl, 2037 s. Šebková
N.,
2010:
Databáze
online
[cit.
2010-10-11]
Dostupné
na:
http://www.ifauna.cz/clanek/psi/xii-kapitola-kynologie-reprodukce-psu/5564/
Takeishi, M.; Mikami, T.; Odama, Y.; Tsunekane, T., Iwaki, T. 1976: Studie na reprodukci u psů; VIII. Umělé oplodnění pomocí zmrazeného spermatu. Japonský věstník reprodukci zvířat, v.22, č.1, s.28, 1976.
Threlfall W. R. 2003: Semen Collection and Evaluation. In: Root Kustritz Small Animal Theriogenology. Butterworth Heinemann, Missouri, pp. 97-123. Vasant R.,2009: dostupné na: www.scribd.com
48
Věžník Z, Svecova D. a kol., 1986: Hygienic aspects of fungal and other contaminations of the bull semen. Annual report of the phase P 06-329-809-01-04 (in Czech).Veterinary Research Institute, Brno, 63 p. Věžník Z et al. 2000: Evaluation of semen for assisted reproduction and selection of breeding males – Strict analysis of sperm morphology SASMO (in Czech). Veterinary Research Institute, Brno, 105 p. Věžník Z., Matoušková O. a kol, 2001: The use of the computer technology for the Věžník Z. a kol 2004: Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatolýzy. Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně. ISBN 80-86895-01-7, 266 s.
Evaluation of the strict morphological sperm analysis. Vet Med-Czech 46: 35-40
49
