Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat DIPLOMOVÁ PRÁCE. Bc. Naděžda Pirošová

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Brno 2010

Bc. Naděžda Pirošová

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

Diplomová práce

Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou graviditu

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Ing. Martin Hošek, Ph.D.


Brno 2010

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou gravidity vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne ………………………………………. Podpis diplomanta ……………………….

PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi, Ph.D. za vedení diplomové práce, za připomínky a pomoc při jejím vypracování. Děkuji majiteli společnosti Reprofit International MUDr. Marku Koudelkovi, za poskytnutá data a vedoucímu lékaři MUDr. Štěpánu Machačovi, PhD. za pomoc a odborné rady. Velké poděkování patří také celé mé rodině (Ing. Martinu Janíčkovi za pomoc se zpracováním dat, úpravou textu a veškerou trpělivost) a blízkým přátelům za podporu během dlouhých 5-ti let studií.


Diplomová práce

ABSTRAKT Cílem diplomové práce nazvané: Vliv teratospermie na kvalitu embryí, jejich implantaci a následnou graviditu bylo vyhodnotit vliv patologické morfologie spermií (teratospermie mužů) na kvalitu embryí, na jejich uhnízdění v děloze po transferu a na následnou graviditu příjemkyň kontrolovanou 8-mý týden gravidity. Jednalo se o embrya vytvořená v laboratorních podmínkách metodou intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI). Diplomová práce se zabývá popisem vzniku lidských pohlavních buněk (spermiogeneze a oogeneze) a charakterizací laboratorních metod asistované reprodukce. Tyto metody byly použity k získání oocytů (OPU), k odstranění kumulárních buněk vajíčka (denudace) a k jeho oplození (ICSI). Součástí práce je vyšetření čerstvého ejakulátu (SPG) a jeho zpracování metodou Swim-up bezpodmínečně nutné pro oplodnění vajíček metodou ICSI. Dále se tato práce zabývá hodnocením embryí s cílem vybrat ta, která jsou za účelem dosažení gravidity žen nejvhodnější k přenosu do dělohy (ET), případně ke kryokonzervaci. Materiálem pro předkládanou práci byly: spermie mužů, oocyty získané ovariální punkcí dárkyň a krev příjemkyň. K získání našich výsledků byly použity spermiogramy a embrya 207-mi vybraných případů vyšetřených na klinice asistované reprodukce v Brně v průběhu roku 2008 a to od 1.4. do 31.11. Do předkládané studie byli zařazeni pouze muži, u nichž jsme měli k oplození vajíčka k dispozici tzv. “fresh sperm“ (ejakulát získaný v odběrové místnosti na klinice). Z důvodu co nejvyšší možné eliminace vlivu ženského faktoru a co největší průkaznosti pouze vlivu mužské teratospermie jsme zvolili vajíčka pocházející od dárkyň (zdravých žen jejichž průměrný věk činil: 24,16 let. Celá skupina 207-mi případů byla rozdělena dle hodnot zjištěné normospermie na skupinu kontrolní a sledovanou. Kontrolní skupina 48-mi členů je tvořena normospermiky. Sledovanou skupinu tvoří 159 teratospermiků. V obou skupinách byly použity darované oocyty. Vyšlo nám, že u parametru FR zjištěný rozdíl 1,73 % ve prospěch skupiny normospermiků, není při hladině významnosti p=0,350 statisticky významný. U parametru PR byl zjištěn rozdíl 10,7 % ve prospěch skupiny normospermiků, který při hladině významnosti =0,189 není statisticky významný. Stejně tak u parametru IR zjištěný rozdíl 4,23 % ve prospěch skupiny normospermiků není při hladině významnosti p=0,390 statisticky významný. U parametru UR zjištěný rozdíl 1,38 % ve prospěch skupiny normospermiků také není při hladině významnosti p=0,759 statisticky významný.

7


Diplomová práce

Vliv teratospermie na jednotlivé parametry hodnotící kvalitu embryí (FR a UR), implantaci (PR) a následnou graviditu (IR) tedy nebyl prokázán. Z toho vyplývá, že u teratospermiků, jsou při dodržení námi nastavených podmínek šance na otěhotnění a dosažení následné gravidity stejné jako u normospermiků. Klíčová slova: spermie, oocyt, teratospermie, kvalita embryí, implantace, gravidita.

8


Diplomová práce

ABSTRACT The objective of the presented work entitled „Effect of teratospermia on the quality of embryo, emryo implantation and subsequent gravidity“ was to evaluate the effect of a faulty sperm morphology (male teratospermia) on the embryo quality, embedding of ovum in uterus and the following gravidity that was assessed within 8th week of pregnancy. The embryos were obtained under laboratory conditions by using a procedure of intracytoplasmic sperm injection (ICSI). This diploma work deals with description of the formation of human gamete cells and characterization laboratory techniques used for assisted reproduction. These techniques were used to obtain oocytes (OPU), to eliminate cumular cells of the ovum (denudation) and to rise the embryos (ICSI). One part of this work was to perform examination of a fresh ejaculate (SPG) and its processing by using the “swim-up” method that is implicitly required for in vitro fertilisation. Further the aim of this work was to evaluate the quality of embryos with the view of selecting the most suitable once for the transfer to the uterus (ET), respectively for cryoconservation, thus the most advisable for reaching gravidity. The biological materials used for this work were: male sperm, oocytes obtained by ovary tapping of female donators, further subsequently developed embryos and blood of recipient women. For the overall evaluation collection of data with spermiograms and embryos originating from 207 cases examined during the period 1.4. to 31.11. 2008 at the Clinic Reprofit International in Brno were used. In the presented study men were included for whom we had the „fresh sperm“ (ejaculate acquired in the taking room at the clinic) available at the day of egg fertilization. In order to eliminate the influence of female factor and to demonstrate only the effect of male teratospermia, we have used only the ovules derived from the donating women (healthy women with the average age of 24,16 years). The group consisting of 207 cases was divided to a control and monitored group based on the values of evaluated normospermia. The monitored group consisted of 159 men with teratospermia. For both groups only the donated oocytes were used. Our results demonstrated that: Considering the parameter FR, the difference of 1.73% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.35). Considering the parameter PR, the difference of 10.7% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.189). Considering the parameter IR, the difference of 4.23% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.39). Considering the parameter UR, the difference of 1.38% in favor of the group of men with normospermia was not statistically significant (p=0.759).

9


Diplomová práce

Based on our results we conclude that the effect of teratospermia on the individual parameters assessing the quality of embryos, the implantation efficiency and the successive gravidity is not significant. This implies that men with teratospermia, when following the optimal set-up conditions, have the same probability to allow and to reach successful impregnation and subsequent gravidity as men with monospermia. Key words: sperm, oocyte, teratospermie, embryo quality, implantation, gravidity

10


Diplomová práce

OBSAH 1 Úvod 2 Cíl práce 3 Literární přehled 3.1 Vznik a vývoj pohlavních buněk – gametogeneze 3.2 Zrací dělení pohlavních buněk – meióza 3.2.1 Význam meiózy 3.2.2 Dělení meiózy 3.2.2.1 První zrací (heterotypické) dělení meiózy 3.2.2.2 Druhé zrací (homotypické) dělení meiózy 3.3.1 Průběh spermatogeneze 3.3.2 Faktory účastnící se spermatogeneze 3.4 Spermie 3.4.1 Stavba a hlavní komponenty spermie 3.5 Oogeneze 3.5.1 Průběh oogeneze 4 Materiál a metodika 4.1 Materiál 4.2 Metodika 4.2.1 Metody k získání oocytů 4.2.2 Metody k získání spermií 4.2.3 Metody k získání embryí 4.2.4 Kultivace a kontrola embryí 4.2.4.1 Kultivace 4.2.4.2 Kontrola a hodnocení embryí 4.2.5. Metody k získání informace o implantaci (nidaci) embrya 4.2.6 Metoda k získání informace o následné graviditě 4.2.7 Metody statistického zpracování dat 5 Výsledky 6 Diskuze 7 Závěr 8 Seznam literatury 8.1 Soupis zdrojů obrázků 8.2 Soupis zdrojů tabulek

12 14 15 15 15 15 16 16 17 18 19 20 21 25 25 27 27 27 27 29 34 35 35 36 40 41 42 43 52 55 56 59 60

9 Příloha

61

11


Diplomová práce

1 ÚVOD V roce 1978 – po mnoha letech úsilí lékařů na různých místech světa – se konečně ve Velké Británii narodila Luisa Brownová, první dítě po mimotělním oplodnění, tedy jak se říká „ze zkumavky“. Lékaři při tom čerpali ze zkušeností získaných na zvířatech. Bylo ale zapotřebí nashromáždit mnoho poznatků o dozrávání vajíčka, o složení tekutin, ve kterých se může embryo ve zkumavce dále vyvíjet, a o tom, jak připravit spermie, než se podařilo úspěšně završit proces mimotělního oplodnění také u člověka. Princip mimotělního oplodnění tedy IVF (in vitro fertilizace) není složitý: vyjmeme vajíčko z vaječníku, k němu přidáme spermie a následně vzniklé embryo vrátíme tam kam patří – tedy zpět do dělohy. Metody asistované reprodukce a embryo transferu (které jsou nedílnou součástí této práce) nahrazují tu část oplození, která probíhá ve vejcovodu. Jejich úspěch vyžaduje splnění podmínek, jako je získání zralých oocytů z ovárií ženy po jejich hormonální stimulaci, či oplození těchto oocytů spermiemi in vitro, kultivace embryí anebo transfer embrya do vnitřních rodidel ženy. Všeobecně jsou hlavními předpoklady početí dítěte správná tvorba kvalitních spermií a hormonů stejně jako tvorba vajíčka. Mnohé současné studie dokazují pomalou, ale setrvalou tendenci ke snižování kvality mužského ejakulátu během posledních čtyř desetiletí. Příčin je mnoho (multifaktoriální patogeneze), patří mezi ně např. vysoká zátěž cévního systému v současné vyspělé euroamerické oblasti, zvýšený výskyt a tedy i účinek umělých estrogenů (ženských pohlavních hormonů) v prostředí i v organizmu muže. Problémy s plodností mají proto hlavně lidé z tzv. průmyslově vyspělých zemí. Vědci pod vedením prof. Jiřího Rubeše z Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně provedli na skupině dobrovolníků v Praze studii, která se týkala vlivu znečištěného ovzduší na kvalitu spermií a dle které důsledkem prokázaných změn fragmentace DNA může být i snížená schopnost spermií k oplodnění. Mužský faktor samotný je za problémy s plodností, které postihují téměř každou pátou partnerskou dvojici odpovědný ve 33 % a na příčinách problémů s plodnosti páru se podílí nejméně v 53 %. Proto bývá při problémech s plodností prováděno základní andrologické vyšetření muže. Jedná se o vyšetření spermatu jehož součástí je hodnocení morfologie spermií. Dle striktních kritérií hodnocení morfologie spermií vytvořených Krugerem v roce (1986) pro účely asistované koncepce bylo zjištěno, že každá spermie vykazuje určitý stupeň morfologické odchylky, a měla by být hodnocena jako abnormální. Na základě biologicky relevantní spojitosti mezi takovýmito odchylkami a schopností fertilizace in vivo a in vitro však byla stanovena hranice normy 14 % morfologicky normálních spermií.

12


Diplomová práce

Dle Světové zdravotnické organizace (WHO) je teratospermie definována jako: MAI index = „multiple anomalies index“ (index mnohočetných anomálií), nebo TZI index = „teratozoospermia index“ (index teratozoospermie). Jedná se o průměrný počet defektů spermie, který je považován za index o vysoce prediktivní hodnotě na fertilitu muže.

13


Diplomová práce

2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vyhodnotit vliv mužské teratospermie (patologické morfologie spermií) na kvalitu lidských embryí, jejich implantaci, následnou graviditu a zjistit zda existují v jednotlivých hodnotách teratospermií na daná počáteční vývojová stádia embryí průkazné rozdíly či nikoli.

14


Diplomová práce

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vznik a vývoj pohlavních buněk – gametogeneze Vývoj člověka čili ontogenezi lze rozdělit na období prenatální a postnatální. Prenatální vývoj člověka začíná spojením ženské pohlavní buňky: vajíčka (oocytu) a mužské pohlavní buňky: spermie. Nový jedinec tedy vzniká splynutím samčí a samičí pohlavní buňky za vzniku jediné buňky zvané zygota. Pohlavní buňky se vyvýjejí z tzv. primordiálních gonocytů procesem gametogeneze (gonogeneze) v pohlavních žlazách (gonádách), které jsou zároveň místem pro jejich výživu a ochranu (Laštůvka, 2004). Gametogeneze je tedy proces formování a vývoje specializovaných zárodečných buněk, nazývaných gamety. Je to pochod, který se týká chromozomů i cytoplazmy zárodečných buněk a připravuje pohlavní buňky pro fertilizaci. V jejím průběhu se snižuje počet chromozomů na polovinu a mění se tvar buňky (Vacek, 1992). Primordiální zárodečné buňky (primordinální gonocyty, prapohlavní buňky) které jsou předchůdci budoucích buněk pohlavních, se od ostatních somatických buněk odlišují již v časných stádiích embryonálního vývoje a mohou z nich vznikat jen buňky pohlavní. Jsou-li zničeny, je jedinec sterilní (Rosypal a kol., 1998). Migrují z ektodermu (třetí týden zárodečného vývoje) přes extraembryonální endoderm (pátý týden) do primordia budoucích gonád neboli do zárodečné rýhy. Z této rýhy se pak vyvíjí kortex budoucí gonády. Pokud je přítomen chromozom Y, pak se v sedmém týdnu vývoje vyvine primordium pro varlata, pokud chybí v osmém týdnu se objeví primordium pro vaječníky. Primordiální gonocyty se v gonádách stávají zdrojem pohlavních buněk, které z nich vznikají množením, růstem a zracím, tj. redukčním dělením. Vzhledem k tomu, že existují rozdíly mezi vývojem vajíčka a spermií, hovoříme zvlášť o vývoji spermií: spermatogenezi a o vývoji vajíček: oogenezi (Sládeček, 1986). I když mezi vývojem samčích a samičích pohlavních buněk, tj. mezi spermatogenezí a oogenezí, existují rozdíly, související s podstatně rozdílným konečným utvářením a úlohou gamet různého pohlaví, jejich zrací dělení probíhá v zásadě shodně (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato02.html#aubau).

3.2 Zrací dělení pohlavních buněk – meióza 3.2.1 Význam meiózy Meióza (z řeckého slova pro zmenšení) byla objevena v roce 1883. Jedná se o speciální typ buněčného dělení, v jehož průběhu je naprosto přesně redukován počet chromozomů na polovinu, což je nezbytný krok při tvorbě gamet. Výchozí diploidní buňky se tak stávají buňkami haploidními, přičemž současně se charakteristickým způsobem mění cytoplazma pohlavních buněk. Redukce je nezbytná, neboť splynutím vajíčka a spermie 15


Diplomová práce

(s polovičním množstvím původního počtu chromozomů) dojde k obnovení diploidního počtu chromozomů v buňkách embya (Alberts et al., 1998). Meióza zajišťuje nejen přesný přenos genetické informace do zralých pohlavních buněk a jejich prostřednictvím do dalších pokolení, ale též genetickou variabilitu a proměnlivost těchto pokolení novými kombinacemi dědičného materiálu (Vacek, 2006). Na vytváření nových kombinací se podílejí kromě rekombinace jednotlivých úseků chromatid při překřížení (crossing-over) v pachytenním stadiu také rekombinace jednotlivých chromozomů v rámci chromozomových sad na konci prvního zracího dělení (Vacek, 1992). Meióza je modifikovanou mitózou; je mnohem komplikovanější (probíhá ve dvou po sobě následujících děleních označovaných jako meióza I. a meióza II. nebo také jako dělení heterotypické a dělení homotypické ) a trvá mnohem déle než mitóza (u lidských oocytů může trvat až 50 let) (Jelínek a Zicháček, 1998). 3.2.2 Dělení meiózy 3.2.2.1 První zrací (heterotypické) dělení meiózy (viz obr. 1) Tvoří plynulý sled událostí, který je tradičně rozdělován do: 1. Profáze, jež se dělí na pět stadií: a) leptotene b) zygotene c) pachytene d) diplotene e) diakineze a během níž jsou všechny chromozomy zreplikovány. Vznikají tak dvě sesterské chromatidy, které spolu zůstávají spojeny po celé dělení a rozcházejí se až ve druhém meiotickém dělení. Každý replikací vzniklý chromozom se páruje se svým homologem za vzniku struktury zvané bivalent, která obsahuje čtyři chromatidy (tetrády). Profáze je charakteristická reorganizací genetické informace každého chromozomu v gametě a napomáhá vzniku jedinců se zcela novým uspořádáním genů. Tento důležitý proces nazývaný crossing-over (překřížení) umožňuje rekombinaci genů maternálních a paternálních. 2. Metafáze I., která začíná vymizením jaderného obalu. Po vytvoření dělícího vřeténka zaujmou chromosomy metafázního postavení v ekvatoriální rovině s centromerami orientovanými k opačným pólům vřeténka a jsou připraveny k rozestupu. 3. Anafáze I., kdy chromosomy putují k protilehlým pólům buňky avšak nedochází k oddělení chromatid, nýbrž k oddělení homologních chromosomů dočasně spárovaných ve dvojice. Z tetrád se stávají diády. Každý z těchto chromosomů má obě chromatidy rekombinované na podkladě crossing-overu v předchozím stadiu. Jádra takto vzniklých buněk mají poloviční počet chromosomů. 4. Telofáze I., při níž se u spermatogeneze na rozdíl od oogeneze zformuje obal jádra. Po relativně krátkém období (interkinezi) nastupuje druhé zrací dělení. Interfáze v pravém slova smyslu neexistuje, neboť nedochází k reduplikaci chromatid a ke zdvojení obsahu

16


Diplomová práce

DNA (Vacek, 2006). 3.2.2.2 Druhé zrací (homotypické) dělení meiózy (viz obr. 2)

obr. 1: první dělení meiózy

se v podstatě neliší od mitózy. Chromosomů je v profázi druhého zracího dělení haploidní počet. Každý je složen ze dvou téměř oddělených chromatid jež jsou v místě kinetochory spojeny, takže tvarově připomínají písmeno X (Vacek, 2006). Po krátké profázi II. následuje metafáze II. v níž se chromozómy v podobě diád uspořádají do ekvatoriální roviny (Sládeček, 1986). V anafázi II. se sesterské chromatidy úplně oddělují a rozcházejí k opačným pólům buňky. Nakonec má každé telofázní jádro jedinou chromatidu ze čtyř, které tvořily původní tetrádu (Alberts et al., 1998). Výsledkem jsou buňky, jejichž jádra mají poloviční počet chromosomů a tedy poloviční obsah DNA.

obr. 2: druhé dělení meiózy

17


Diplomová práce

3.3 Spermatogeneze Zjednodušeně lze tento sled událostí popsat jako kaskádu procesů na jejímž začátku stojí primitivní zárodečná buňka (spermatogonie), která dá procesy dělení a zrání vzniknout velkému množství zralých spermií. Vývoj samčích pohlavních buněk je zahájen nástupem puberty a pokračuje celý život (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/ spermato02.html#aubau). Probíhá ve varleti. A to v zárodečném epitelu semenotvorných kanálků v nichž nejdůležitější roli hrají Sertoliho buňky. Ty mají půrnou, vyživovací a ochrannou funkci, obklopují vývojová stadia budoucích spermií a sekretují látky nezbytné pro jejich zdárný vývoj. Ten trvá přibližně 64 dní (Vacek, 1992). Mužská pohlavní žláza (testis) vzniká u embrya za přítomnosti chromozomu Y a její vývoj nastává, kromě jiných faktorů, hlavně pod vlivem testosteronu. Ten je produkován Leydigovými intersticiálními buňkami, které vycestovávají z mezenchymu zárodečné rýhy a svoji aktivitu zahajují v sedmém týdnu zárodečného vývoje. Druhá vlna aktivity těchto buněk přichází v období puberty. Vede k dozrání epitelia gonád, růstu a formování lumen v semenotvorných kanálcích, zrání a tvorbě spermatických buněk (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato 01.html#einleitung). 3.3.1 Průběh spermatogeneze Spermie se vyvíjí z diploidních primordiálních gonocytů, které vznikly v různých částech zárodku během embryonálního vývoje a přesunuly se do základů pohlavních žláz (gonád). Zrání zárodečných buněk začíná v pubertě (mezi 13. – 16. rokem) a pokračuje do pozdního stáří (Moore, Persaud, 2002). Procesem mitotického dělení vznikají spermatogonie a z nich následně spermatocyty I. řádu. Spermatogonie, které dřímaly v semenotvorných kanálcích varlat od fetální periody vývoje, zvyšují v pubertě svůj počet. Po několika mitotických děleních spermatogonie rostou a podléhají procesům, které je mění v primární spermatocyty, největší ze zárodečných buněk v semenotvorných kanálcích. Z primárního spermatocytu procesem spermatogeneze vznikají 4 spermie (viz obr. 3). Navazuje první fáze meiózy při níž každý primární spermatocyt postupuje redukční dělení za vzniku dvou spermatocytů II. řádu (Vacek, 1992). Následně probíhá u těchto sekundárních spermatocytů druhé meiotické dělení a výsledné dceřiné buňky jsou, opět o polovinu menší, čtyři haploidní spermatidy. Nepohyblivé spermatidy se postupně procesem spermiogeneze (spermiohistogeneze) promění ve čtyři zralé spermie (Laštůvka, 2004). V okamžiku dovršení spermiogeneze se spermie, jež ke svému vývinu potřebují teplotu o 2-3°C nižší než je teplota tělesná, uvolňují do lumen semenotvorných kanálků (ductus epididymidis) kde dozrávají, tj. nabývají schopnosti pohybu a fertilizace (schopnost oplození). V průběhu celého života se v semenotvorných kanálcích tvoří denně okolo 100 miliónů spermií.

18


Diplomová práce

Celý průběh spermatogeneze (zahrnující i spermiogenezi) tedy vývoj od prekurzorové buňky po zralou gametu je mnohem kratší (trvá přibližně dva měsíce) než u oogeneze (http://genetika.wz.cz/gametogeneze.htm).

obr. 3: průběh spermatogeneze

3.3.2 Faktory účastnící se spermatogeneze Mezi nejdůležitější faktory které jsou nezbytné pro zdárný průběh spermiogeneze patří testosteron. Androgen, který je u muže secernován z 95% ve varlatech Leydigovými buňkami a z 5% v kůře nadledvin. Jeho koncentrace je v plazmě u muže asi 15krát vyšší než u ženy a ve stáří pomalu klesá. V krvi se váže z 98% na bílkoviny (albumin a globulin) podobně jako ostatní steroidy (Silbernagl a Despopoulos, 2004). Testosteron iniciuje nástup puberty a zrání pohlavních buněk, má vliv na růst a funkci genitálií, prostaty a semenných kanálků a řídí rozvoj mužských sekundárních pohlavních znaků. Dostatečná sekrece testosteronu je u muže předpokladem pro normální potenci (schopnost oplodnění) a schopnost pohlavního styku (Vacek, 1992). Folikuly stimulující hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH), jsou hormony adenohypofýzy. Luteinizační hormon působí na sekreci testosteronu z Leydigových buněk. FSH stimuluje v Sertoliho buňkách sekreci 19


Diplomová práce

inhibinu a indukuje v nich expresi vazebného proteinu pro androgeny, jehož přítomnost je předpokladem pro účinek testosteronu na spermatogenezi. Kromě toho indukuje FSH expresi receptorů pro LH na Leydigových buňkách (www.ucalgary.ca/uofc/eduweb/ virtualembryo/dev_biol.html). Seminální růstový faktor (SGF) je nejdůležitější z růstových faktorů vylučovaných Sertoliho buňkami. Během fetálního a postnatálního vývoje stimuluje proliferaci somatických buněk a tvorbu krevních cév ve varlatech. V dospělosti Sertoliho buňky odpovídají na svou vlastní produkci SGF tvorbou sulfátového glykoproteinu –2 (SGP- 2). SGP-2 je hlavní produkt Sertoliho buněk v dospělosti, váže se na membránu spermatozoí a předpokládá se, že je chrání před buněčnou apoptickou smrtí (www.ucalgary.ca/uofc/ eduweb/virtualembryo/dev_biol.html).

3.4 Spermie Správná morfologie spermie a přítomnost všech jejích komponent jsou důležitým a nezbytným předpokladem pro úspěšné splynutí s vajíčkem a následný vývoj zárodku. (www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato05.html#spermiohistogenese). Spermie (viz obr. 4) je vysoce specializovaná pohlavní buňka skládající se z hlavičky, středního oddílu a vláknitého bičíku (Gardner et al., 2004). Hlavička obsahuje chromozomy, střední oddíl je energetickým centrem a bičík se skládá ze struktur zajišťujících pohyb spermie (Dylevský, 1990). Na celém povrchu je spermie pokryta buněčnou membránou (Vacek, 1992). V porovnání se somatickými buňkami obsahuje poloviční (haploidní) počet chromozomů (Moore, Persaud, 2002). Celkově měří spermie 64 – 70 µm (Řežábek, 1999), 40 – 50 µm z toho připadá na bičík (Vacek, 1992). Pohybuje se rychlostí 100 µm/s proti proudu a současně se šroubovitě otáčí kolem své podélné osy (Roztočil a kol., 2001).

obr. 4: spermie

20


Diplomová práce

3.4.1 Stavba a hlavní komponenty spermie (viz obr. 5)

obr. 5: hlavní komponenty spermie

1 Plazmatická membrána 2 Vnější akrozomální membrána 3 Akrozom 4 Vnitřní akrozomální membrána 5 Jádro 6 Proximální centriola 7 Zbytek distální centrioly 8 Vnější fibrózní vlákna 9 Mitochondrie 10 Axonema 11 Terminální disk (anulus) 12 Prstencovitá vlákna (ring fibers)

A Hlavička B Krček C Střední část D Hlavní část bičíku E Koncová část bičíku

1. Cytoplazmatická membrána Pokrývá celou spermii, je acidorezistentní s vysokou schopností permeability, jež zabezpečuje látkovou výměnu spermií. Je bohatá na cystin, histidin a arginin (Gamčík, Kozumplík, 1984). Na povrchu membrány jsou vázány proteiny a glykoproteiny, které mají významnou úlohu pro oplozující schopnost spermie. Stabilizují ji nad akrozomálním váčkem a zabraňují tak předčasnému uvolnění enzymů v něm obsažených. Chrání spermie před fagocytózou buňkami ženských pohlavních cest a zabraňují shlukování spermií (aglutinaci) v ejakulátu (Vacek, 1992). 21


Diplomová práce

2. Hlavička spermie (caput) Vprocesu oplodnění má významnou funkci. Jejím úkolem je přenést dědičný materiál lokalizovaný v nukleoplazmě (Gamčík, Kozumplík, 1984). Hlavička spermie je oploštělá, 5 – 10 µm dlouhá (Sova, 1990), oválného tvaru při pohledu shora, hruškovitého při pohledu ze strany (Klika, 1980). Formace a organizace hlavičky spermie je složitý proces postupných morfologických a molekulárních změn v jádře a akrozomu ve spolupráci s hlavním svazkem mikrotubulů (manchette). Spolu s manchette se těchto změn účastní další dvě struktury a to akroplaxom a perinukleární théka (Toshimori a Chizuru, 2003). Hlavička spermie kompletně obklopená plazmatickou membránou je od bičíku oddělena charakteristickou zónou tzv. zadním prstencem (posterior ring) a lze ji rozdělit na akrozomální a postakrozomální oblast (Toshimori a Chizuru, 2004). Hlavní struktury a uspořádání hlavičky spermie (viz obr. 6)

obr. 6: hlavní struktury hlavičky spermie

Hlavička spermie obsahuje: Haploidní jádro vyplněné chromatinem obsahujícím převážně DNA. Té je ve zralých spermiích proti ostatním tělním buňkám poloviční množství. Změna obsahu DNA, stejně jako její poškození, vede k poruchám až ztrátě oplozovací schopnosti spermií. Jádro obaluje dvojvrstvá při bázi hlavičky o něco hrubší nukleární membrána.

22


Diplomová práce

Akrozóm který zabírá téměř 50% plochy hlavičky. Dle Krugerovi striktní morfologie musí tvořit 40-70 % hlavičky spermie (Gardner et al., 2004). Je to cytoplazmatický útvar čepičkovitého tvaru, který se nachází mezi buněčnou a jadernou membránou. Je složen z mukopolysacharidů, obsahuje fruktózu, manózu, galaktózu, ale i lipidy, kalium, kyselou a alkalickou fosfázu aj. (Gamčík, Kozumplík, 1984). V akrozómech spermií byla zjištěna také proteináza a další proteolytické enzymy (akrozin a katepsin v zadní části, hyaluronidázu v přední části) nezbytné k průniku přes zonu pellucidu do vajíčka. Akrozóm spermie je citlivý na osmotické změny vnějšího prostředí a nemá tak pevnou konzistenci jako ostatní části hlavičky (Toshimori a Chizuru, 2004). Akroplaxom Jedná se o komplex filament aktinu a keratinu ležící na distálním konci akrozomu, který se podílí na tvarování hlavičky, elongaci a formování akrozomu. Manchette Jest svazkem mikrotubulů, jež hraje úlohu v prodlužování hlavičky i jádra a v transportu molekul nezbytný pro kondenzaci jádra a tvorbu bičíku. Načasování jeho rozvoje je velmi precizní (objevuje se v ranné fázi spermatid). Perinukleární théka Je esenciální cytoskeletální element obsahující značné množství různých molekul podílejících se na procesech formování jádra a akrozomu a nezbytných také pro oplození jako např. oocyty aktivující faktor. Centrozom (mikrotubuly organizující centrum) a centriol Centrozom je oblast v buňce, kde dochází k tvorbě mikrotubulů a uvnitř se nachází pár malých organel zvaných centriol (Satananthan a kol, 1991). Lidská spermie má dvě centrioly (proximální a distální). Distální se podílí na tvorbě axonemy (osového vlákna) bičíku spermie během spermiogeneze (www.cellsalive.com/cells/amincell_archive.htm). Tato centra vytvářejí paprsčitou strukturu známou jako aster, které vytváří mitotické vřeténko, zodpovědného za segregaci chromozómů a rozdělení buňky (http://micro.magnet.fsu.edu/cells/centrioles/centrioles.html). Aster, v tomto případě nazývaný spermaster, se vytváří po oplození ve vajíčku díky centriolám vnesených otcem. Spermaster je naprosto esenciální strukturou nutnou pro pohyb prvojader a následné splynutí samčího a samičího genomu (Nakamura a kol, 2001). Přítomnost a správná funkčnost centriol jsou nezbytné pro normální průběh oplození a následný vývoj zárodku. Jakékoli morfologické abnormality v těchto strukturách vedou k neplodnosti, které nelze dost dobře odstranit ani použitím ICSI, neboť jsou-li centrioly v nepořádku, nemůže dojít ani k úspěšnému vývoji embrya. Boveriho klasická teorie oplození (r. 1900) říká, že neoplozená vajíčka získávají svůj centrozom ze samčích gamet. A jak se později zjistilo, platí to pro většinu druhů. Mitotické vřeténko savčích oocytů má sice centrozom a je astrální, válcovitého tvaru, složené

23


Diplomová práce

z množství mikrotubulů. Nemá však centrioly. Ty jsou neseny spermií. Postakrozomální čepička Je útvar obalující část jádra, kterou nepokrývá akrozóm. Na neporušené spermii je spojena s buněčnou membránou. Je mnohem odolnější proti vnějším vlivům než akrozóm (Gamčík, Kozumplík, 1984). Negativní ovlivnění všech výše zmiňovaných procesů a struktur může vést k výrazné změně morfologie spermatické buňky a v konečném důsledku vést k různým typům neplodnosti jako je např. teratozoospermie, při níž je deformováno jádro i akrozóm (Toshimori a Chizuru, 2004). 3. Krček (collum) Je poměrně krátký, měří jen 2 – 3 µm a obsahuje dva za sebou uložené ventrikuly, mezi nimiž je devět chord (příčně segmentovaných provazců) (Sova, 1990). Nachází se v zadní části hlavičky tvořené prstencem (posterior ring), v němž se jaderná dvojmembrána těsně stýká s vnější plazmatickou membránou (Sládeček, 1986). Je motorickým centrem bičíku spermie, ve kterém se chemická energie přeměňuje v kinetickou (Klika, 1980). 4. Bičík spermie (cauda) Bičík zprostředkovává transport spermie na místo oplodnění. Je nástrojem pohybu. Důležitou úlohu přitom má mitochondriální aparát (vyrábí energii ve formě ATP) a komplex axiálních vláken. Jde o místo kde se tato energie mění na energii mechanickou, tedy na pohyb spermie (Gamčík, Kozumplík, 1992). Přibližná délka je 45 µm (Gardner et al., 2004). Ve střední části se okolo bičíku hromadí četné mitochondrie, které se nazvájem dotýkají a vytvářejí mitochondriální pochvu, sloužící jako zdroj energie (Sládeček, 1986).

24


Diplomová práce

3.5 Oogeneze Proces vzniku vajíčka (oocytu). Probíhá v prenatálním období a poté pouze od puberty do menopauzy. Vývoj od prekurzorové buňky po zralou gametu činí i přes 40 let. Procesem oogeneze vzniká z primárního oocytu jediný zralý oocyt, přičemž pólová tělíska zanikají (viz obr. 7). Oocyt je haploidní samičí pohlavní buňka.

obr. 7: průběh oogeneze

3.5.1 Průběh oogeneze Oogeneze probíhá částečně v období prenatálního vývoje. Vajíčka se vyvíjejí z buněk ovariální kůry (oogonií). Tyto drobné buňky s velkými jádry jsou základními buňkami při vývoji folikulu. Pocházejí z primordiálních zárodečných buněk (gonocytů) jež prodělaly sérii asi 30-ti mitóz (Nussbaum a kol., 2004). Zárodečných buněk je v každém ováriu ženy před jejím narozením přítomno přes půl milionu (Veeck, 1999). Oogonie vstupují kolem třetího měsíce prenatálního vývoje do rozmnožovací fáze a začínají se vyvíjet v primární oocyty. Ty se do období pohlavní zralosti morfologicky příliš nemění. Ani počet oocytů I. řádu (vzniklý mitotickým dělením) se už pak během života více nezvětšuje.

25


Diplomová práce

Dnes je názor o stálém počtu oocytů před porodem zpochybňován zejména pracovníky kolektivu Dr. Jonathana Tylliho (http://www.sci.muni.cz/ptacek/REPRODUKCE2.htm). V organismu ženy je v době porodu přítomno zhruba 2,5 miliónu oocytů dosahujících profáze prvního meiotického dělení (diplotene). Většina z těchto oocytů degeneruje. Ty, které nedegenerovaly, zůstávají v tomto diktyotenní stadiu po desetiletí. Nakonec dozrává pouze kolem 400 oocytů. Jakmile dosáhne žena pohlavní zralosti, v každém ovulačním cyklu se selektuje většinou jeden dominantní folikul a v něm přítomný oocyt I. řádu vstupuje do růstové fáze. Během ní dochází k mnohonásobnému zvětšování cytoplazmy (cytoplazmatický růst) a jádra. Ocyt I. řádu se zvětšuje až 10 000 krát a na konci růstové fáze vstupuje do prvního zracího dělení. Oocyt I. řádu se rozdělí tak, že jedna buňka se stane sekundárním oocytem (vajíčko), který obsahuje většinu cytoplasmy s organelami, a druhá buňka se stává prvním pólovým tělískem (pólocyt). Z každého oocytu I. řádu tak vzniká jeden velký oocyt II. řádu a jedna malá pólová buňka. Oocyt II. řádu prodělává druhé meiotické dělení. To se však dokončí pouze po fertilizaci (Nussbaum a kol., 2004). Z oocytu II. řádu vzniká ootida a buňka pólová. Současně se může dělit i první pólová buňka, takže ootida má na svém povrchu dvě až tři malé pólové buňky, které jsou postupně vstřebávány a vzniká tak zralé vajíčko ( viz obr. 8), neboli ovum s polovičním počtem chromozomů (Dylevský, 2007).

obr. 8: schéma oocytu

26


Diplomová práce

4 MATERIÁL A METODIKA Materiálem pro tuto práci byli spermie mužů, vajíčka (oocyty) dárkyň, embrya z nich vzniklá a krev příjemkyň. Morfologie spermií byla posuzována mikroskopickým vyšetřením v andrologické laboratoři. Součástí práce byly metody asistované reprodukce, pomocí nichž jsme zajistiliy oocyty a embrya. Kvalita embrií byla hodnocena každý den jejich vývoje v laboratoři embryologické. Nezbytnou podmínkou dosažení gravidity žen byl také přenos kvalitního a životashopného embrya do dělohy ženy . Proces kultivace in vitro byl ukončen 6-tý den vývoje zamražením kvalitních embryí. Zda žena otěhotněla či ne, bylo zjištěno vyšetřením hCG z krve. Na závěr (8-mý týden gravidity) bylo ultrazvukovým vyšetřením potvrzeno, či vyloučeno pokračující těhotenství.

4.1 Materiál V této práci bylo nutné zajistit oocyty a spermie, jež dali (za použití metod asistované reprodukce) vzniknout embryím na základě jejichž kvality, implantace a následné gravidity byl hodnocen vliv teratospermie. Dále bylo potřeba zajistit krev příjemkyň k zhodnocení hladiny hCG, která je ukazatelem implantace embryí. Oocyty byly získány punkcí zralých folikulů (aspirací folikulární tekutiny) po předchozí hormonální stimulaci vaječníků dárkyň. Spermie byly získány zpracováním ejakulátů mužů přicházejících v páru s příjemkyněmi oocytů (recipientkami) v den odběru vajíček. Embrya byla získána metodikou ICSI. Krev byla získána odběrem venózní krve příjemkyň 14. - 17. den po embryotransferu.

4.2 Metodika 4.2.1 Metody k získání oocytů A) Hormonální stimulace ovariální činnosti Díky provokované stimulaci vaječníků prováděné injekčním podáním gonadotropinů jsme v organismu dárkyně stimulovali současný vývoj většího počtu folikulů a tím vyzrání většího počtu oocytů – tzv. superovulaci. Použité preparáty obsahují folikuly stimulující hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH) nazývané gonadotropiny. Jedná se o hormony předního laloku hypofýzy, která řídí činnost vaječníků. Ve snaze zabránit předčasnému prasknutí folikulů (uvolnění vajíček) ještě před jejich odběrem, aplikovali se současně tzv. agonisté nebo antagonisté GnRH. Tyto hormony (analoga gonadoliberinu) tlumí funkci hypofýzy a tím brání vyplavení hormonu, odpovědného za uvolnění vajíček z folikulu. Závěrečné vlastní dozrání všech vajíček bylo zajištěno podáním lidského choriogonadotropního hormonu (hCG).

27


Diplomová práce

B) Odběr vajíček (ovum pick-up) OPU: Den před OPU proběhla v embryologické laboratoři příprava, která zahrnovala: 1) Nahřátí Petriho misek určených k vyhledávání oocytů vložením do Labotecu. 2) Ekvilibraci misek s nakapaným Fertilizačním médiem (pro OPU) a Cleavage médiem (pro použití po ICSI) umístěním do inkubátoru Minc. OPU probíhala v celkové narkóze. Pochvou byla do vaječníku zavedena tenká jehla, jejíž hrot je dobře patrný na obrazovce ultrazvuku. Pomocí ní byla do zkumavek odsáta folikulární tekutina obsahující vajíčka (viz obr. 9). Ta se rozlévala do předem připravených Petriho misek. V laminárním boxu na výhřevné plotýnce pod stereomikroskopem byly vyhledány oocyty, zjištěn jejich počet a zhodnocena kvalita. Pomocí pipety byly vyhledané oocyty přemístěny do misky ekvilibrovaného fertilizačního média (FM).

obr. 9: schéma punkce oocytů

C) Denudace Slouží k odstranění kumulárních buněk z oocytů. Prováděla se cca za 2 hod. po odběru oocytů (OPU) pomocí enzymu hyaluronidázy a skleněných pipet striktních průměrů.

obr. 10: oocyt před denudací

obr. 11: zralý oocyt po denudaci

28


Diplomová práce

Postup: Do fertilizačního roztoku s hyázou byl přenesen COC: cumulus-oocyt-complex tj. oocyt obklopený kumulárními buňkami (viz obr. 10) a pomocí pipety (200 µl) byly opakovaným promýváním uvolněny kumulární buňky. V čistém fertilizačním médiu byly oocyty dále denudovány pomocí skleněné pipety 200µm. Skleněnou pipetou150 µm z nich byly odstraněny zbytky buněk corona radiata. Na závěr se zhodnotila zralost a kvalita denudovaných oocytů: MII (zralý oocyt) (viz obr. 11): vhodný pro mikromanipulaci (ICSI) Degenerovaný oocyt: mikromanipulace se neprováděla GV (germinal vesicul): mikromanipulace se neprováděla MI (nezralý oocyt) mikromanipulace byla provedena, ale kultivovalo se odděleně od zralých oocytů. 4.2.2 Metody k získání spermií Spermie nutné k oplození lidského vajíčka (In Vitro Fertilizaci) metodou ICSI byly získány zpracováním ejakulátu metodou Swim-up. Zpracování bylo provedeno po zkapalnění ejakulátu a po předchozím vyhodnocení spermiogramu (viz tab. 1). Ten představuje základní laboratorní metodu vyšetření mužské fertility a umožňuje klasifikovat závažnost podílu mužského faktoru na neplodnosti páru (Dvořáček, 1999). V obou případech zpracování byly zkumavky s ejakulátem vždy řádně označeny příjmením a jménem partnera a příjmením a jménem partnerky, pro kterou byl ejakulát zpracován.

tab. 1: parametry vyhodnocení spermiogramu dle WHO

Normální hodnoty (normospermie)

Abnorm. hodnoty

Abnormality

< 2 ml > 6 ml

< Oligospermatismus > Hyperspermatismus

Objem

2 - 6 ml

pH

7,2 – 7,8

Zkapalnní

normální

Abnormální (+, ++, +++, ++++)

Koncentrace

20 mil / ml

< 20 mil/ml

Oligospermie

40 mil / celkový obj

< 40 mil

Oligospermie

Celková pohyb.

> 50 %

< 50 %

Asthenospermie

Progresivní pohyb.

> 25 %

< 25 %

Asthenospermie

Morfologie

> 15 %

< 15 %

Teratospermie

Leukocyty

< 1 mil / ml

> 1 mil / ml

Leukocytospermie

Celková konc.

< 7,2

> 7,8

29

Zkapalnní Bc. Naděžda Pirošová

Koncentrace Celková konc.

normální

Abnormální (+, ++, +++, ++++)

20 mil / ml

< 20 mil/ml

Oligospe

40 mil / celkový obj

< 40 mil

Oligospe

Diplomová práce

A) Vyhodnocení spermiogramu (SPG) JednáCelková se o základní ejekulátu. Kvalita a<standardizace jeho pohyb.andrologické vyšetření > 50 % 50 % provedení je zásadní a je řízeno WHO nomenklaturou. V této práci byli spermiogrami Progresivní pohyb. > 25 % Před odběrem (vyšetřením < 25 % spermatu) posuzovány dle 4-tého vydání WHO standardů. byla klientům doporučována 2-3 denní pohlavní abstinence. Sperma bylo zpracováno do Morfologie > 15 % < 15 % 45 minut po odběru (Manuál a metodiky andrologie, Reprofit International, 2009).

Leukocyty

< 1 mil / ml

> 1 mil / ml

Asthenosp

Asthenosp

Teratosp

Leukocytos

Použité pomůcky a spotřební materiál: 1) odběrová nádobka 2) injekční stříkačka + růžová jehla 3) pipeta o objemu 20-200 µl 4) špičky použité pomcky a spotební 5) počítací Maklerova komůrka s krycím materiál sklíčkem : odbrová nádobka 6) mikroskop Nikon Eclipse E200

injekní stíkaka + ržová jehla Postup: pipeta o objemu 20-200 µl špiky Odběry byly prováděny v k tomuto určených prostorách: tzv. odběrové místnosti. Maklerova komrka s krycím poítací Kelímek s ejakulátem byl umístěn do termoboxu B-15,sklíkem kde byl ponechán 15 - 45 minut Nikon Eclipse E200 při teplotěmikroskop 37 °C ke zkapalnění.

Následovalo: Postup: A) Makroskopické hodnocení vzhledu ejakulátu, objemu (injekční stříkačkou), viskozity Odbry byly provádny v k tomuto urených prostorách: tzv. odbrové místnosti. a pH. Kelímek s ejakulátem byl umístn do termoboxu B-15, kde byl ponechán 15 - 45 B) Mikroskopické vyšetření provedeno poNásledovalo: odebrání 20 – 50 µl dobře promíchaného 37 °C bylo ke zkapalnní. pi teplot ejakulátuA) v Maklerově počítací komůrce (viz vzhledu obr. 12) pod mikroskopem (objektiv 20- stíkakou), Makroskopické hodnocení ejakulátu, objemu (injekní 40x). Hodnoceny byly vybrané parametry spermiogramu (viz tab. 2). viskozity a pH.

B) Mikroskopické vyšetení bylo provedeno po odebrání 20 – 50 µl dobe promíchaného ejakulátu v Maklerov poítací komrce pod mikroskopem (objektiv 20-40x). tab. 2: vybrané parametryse SPGvybrané dle WHO Hodnotily parametry SPG dle WHO: Koncentrace spermií Celkový pohyb Progresivní pohyb Normální morfologie Leukocyty a vývojové buky spermiogenetické ady

mil/ml % % % ano / ne

30


Diplomová práce

Koncentrace spermií (množství spermií na jeden mililitr) Byla hodnocena v Maklerově počítací komůrce. Ta je tvořena čtvercem, rozděleným na menší čtverečky (viz obr. 13). Kapka spermatu se kápla na podložní sklíčko komůrky, na němž je nakreslen čtverec a přikryla se krycím sklíčkem. Dle počtu spermií se spočítal počet spermií např. buď v: V 1 čtverci = 10 spermií x 10 = 100 mil / ml V 10 čtvercích = 10 spermií = 10 mil /ml Ve 100 čtvercích = 10 spermií dělíme 10 = 1 mil /ml

obr. 12: Maklerova komůrka

obr. 13: schéma obrazu v mikroskopu

Motilita (pohyblivost) Byla hodnocena do 3 - 5 min, kdy spermie mají tendenci migrovat z periférie. Byl spočítán počet všech pohyblivých spermií a poté počet progresivních spermií. Vyděleno celkovým počtem spermií, násobeno 100 nám vyšla hodnota v %. Morfologie Ne všechny spermie, které jsou produkovány, jsou normálně vyvinuté. Morfologické posouzení ejakulátu je jedním ze základních kritérií spermatoanalýzy zaměřené na stanovení kvalitativních a kvantitativních rozdílů v normálně a patologicky utvářených spermiích (Věžník, 2004). Při hodnocení musí být brána v úvahu celá spermie (Věžník, 2000). Ve všech případech této práce bylo morfologickému vyšetření podrobeno sperma čerstvé. Všechny pomůcky, které přišly do styku se spermatem, byly sterilní, chemicky čisté a měly přibližně stejnou teplotu jako vyšetřované sperma. Morfologie byla hodnocena na 50-200 pohyblivých spermiích ve zředěném vzorku (podle spermiogramu tak, že byla 1-2 spermie na zorné pole). Zřeďovacím roztokem byl fyziologický roztok NaCl. Hodnotily se: normální a abnormální formy hlavičky, krčku a bičíku dle 4-tého vydání WHO standardu, které obsahuje tzv. Krugerova striktní kriteria (viz tab. 3) 31

spermiích (Vžník, 2004). Pi hodnocení musí být brána v úvahu celá spermie (Vžník, 2000). Morfologie spermií byla hodnocena na 50-200 pohyblivých spermiích ve zedném vzorku (podle spermiogramu tak, že byla 1-2 spermie na zorné pole). Zeovacím Bc. Naděžda Pirošová Diplomová práce roztokem byl fyziologický roztok NaCl. Hodnotili se: normální a abnormální formy hlaviky, krku a biíku dle 4-tého vydání WHO standardu, které obsahuje tzv. Krugerova striktní kriteria (viz tab.).

Názvy abnormalit patologických spermiogramů:

Nomenklatura parametr ejakulátu: Názvy abnormalit patologických spermiogram: tab. 3: názvy abnormalit patologických spermiogramů Normospermie Oligospermie Oligospermia gravis Asthenospermie Teratospermie (T) Oligoasthenoteratospermie (OAT) Oligoasthenospermie (OA) Azoospermie Aspermie

Normální ejakulát dle parametr WHO Koncentrace spermií nižší než 20mil/ml. Koncentrace spermií< 5 mil/m Celková motilita spermií je nižší než 50%. Progresivní motilita je nižší než 25% Mén než 15 % spermií s normální morfologií Kombinace všech 3 výše zmínných patologií Kombinace snížené koncentrace spermií a motility

V ejakulátu jsou pítomny pouze vývojové buky V ejakulátu nejsou pítomny žádné spermie ani vývojové buky V ejakulátu jsou pítomny pouze spermie mrtvé ( bez Nekrospermie pohybu) 0 % pohyblivých spermií Kryptozoospermie nález spermií až po centrifugaci Aspermatismus Není žádný ejakulát Oligospermatismus Objem ejakulátu mén než 2 ml Hyperspermatismus Objem ejakulátu více než 5 ml http://www.androcare.cz/sex.html

Odchylky v morfologii hlaviky Odchylky v morfologii hlavičky: 1) zahrocená hlavička 2) hruškovitá hlavička 3) kulatá hlavička bez akrozomu 4) kulatá hlavička s akrozomem

5) – 7) amorfní spermie 8) vakuolizovaná hlavička

9) malý akrozóm

obr. 14: patologie hlaviček

32


Diplomová práce

Odchylky v morfologii krčku a středního oddílu: 1) ztenčelý krček, 2) ztluštělý krček, 3) normální krček, 4) ohnutý krček, 5) asymetrická inserce, 6) velká cytoplazmatická kapka (patologie je to jen pokud je větší než 1/3 hlavičky)

obr. 15: patologie krčků

Odchylky v morfologii bičíku: 1) spermie s krátkým bičíkem 2) spermie se zlomeným bičíkem 3) spermie se stočeným bičíkem

obr. 16: patologie bičíků

33


Diplomová práce

B) Metoda Swim–up (vycestování spermií) představuje proces promývání a třídění spermií. Do sterilní konické zkumavky, předem řádně označené, jsme přenesli pomocí sterilní injekční stříkačky zkapalněný ejakulát. Přidali 1 - 3 ml ekvilibrovaného Sperm média. Pasteurovou pipetou dobře promíchali a vložili do centrifugy na 10 minut /1,8 rpm. Odstranili supernatant pomocí Pasteurovi pipety a sediment opět promíchali Sperm médiem. Vložili do centrifugy na 10 minut / 1,4 rpm. Opět odstranili supernatant. Pelet spermií byl zakapnut Sperm médiem 20 – 800 µl dle spermiogramu a vložen do inkubátoru (s CO2 / 37 °C) na 15 - 30 minut. Po vycestování spermií jsme supernatant stahli do sterilní zkumavky a v Maklerově komůrce provedli vyhodnocení vycestovaných spermií. Vzorek byl až do doby použití k ICSI uchováván v inkubátoru s CO2 při teplotě 37 °C. Použité pomůcky a spotřební materiál: 1) sterilní konická zkumavka 2) sterilní injekční stříkačka 3) ekvilibrované Sperm médium 4) Pasteurova pipeta 5) centrifuga 6) inkubátor 7) sterilní zkumavka 8) Maklerova komůrka 4.2.3 Metody k získání embryí ICSI Hlavní metodou získání embryí v této práci bylo ICSI (Intra Cytoplasmatic Sperm Injection). Metoda ICSI - díky které dochází k plození lidských vajíček a představuje nejnáročnější část celého procesu fertilizace in vitro - využívá mikromanipulační systém, který mění nedokonalý mechanický pohyb rukou na jemný a přesný pohyb mikromanipulačních nástrojů pomocí hydraulických, resp. elektrických převodů. Embryolog drží na konci tenoučké pipety jediné lidské vajíčko a jehlou (sedmkrát tenčí než průměr lidského vlasu) individuálně zavede do cytoplasmy zralého (MII) oocytu jedinou spermii. Pro fixaci oocytů a pro injekci spermií se používají jednorázové, sterilní netoxické skleněné kapiláry. ICSI dává šanci mužům, kteří nemají dostatečně kvalitní sperma a představuje tak řešení problému neschopnosti počít dítě, je - li příčinou andrologický faktor (oligospermie, astenospermie, teratospermie apod.).

34

mikromanipulaních nástroj pomocí hydraulických, resp. elektrických pevod. Embryolog drží na konci tenouké pipety jediné lidské vajíko a jehlou (sedmkrát tení než prmr lidského vlasu) individuáln zavede do cytoplasmy zralého (MII) oocytu jedinou spermii. Pro fixaci oocyt a pro injekci spermií se používají jednorázové, Diplomová práce Bc. Naděžda Pirošová sterilní netoxické sklenné kapiláry. ICSI dává šanci mužm, kteí nemají dostaten kvalitní sperma a pedstavuje tak ešení problému neschopnosti poít dít, je- li píinou andrologický faktor (Oligospermie, Astenospermie, Teratospermie apod.). tab. 4: použité pomůcky a spotřební materiál

Použité pomcky a spotební materiál: Petriho misky plastové Falcon 4 ks Hyaluronidase Cook 0,30 ml PVP 10 % Cook 0,01 ml Holding pipeta Microtech 1 ks ICSI pipeta Microtech 1 ks 1 ks Manipulaní pipeta 200, 300 um Microtech Manipulaní pipeta 150 um Microtech 1 ks Mineral oil FertiPro, Cook 10 ml Použité pístroje Mikromanipulátor Eppendorf s vyhívaným sklenným stolkem (TOKAI HIT), Stereomikroskop Použité přístroje Nikon Eclipse, CO2 inkubátor (Labotect) a Hera cell (Heraeus), Mikromanipulátor Eppendorf s vyhřívaným skleněným stolkem (TOKAI HIT), StereLaminární box Heraeus, Minc(CookNikon ) inkubátor zajišující stálé složení plynné fáze a neperušenou teplotu Laminární omikroskop Eclipse, CO2 inkubátor (Labotect) a Hera cell (Heraeus), kultivaního média, boxDigitální Heraeus, Minc(Cook ) inkubátor zajišťující stálé složení plynné fáze a nepřerušenou fotoaparát pro fotodokumentaci.

teplotu kultivačního média, digitální fotoaparát pro fotodokumentaci.

popis metody ICSI Pomocí mikromanipulaní jehly pro ICSI došlo k znehybnní spermie tak, že se Popis metody ICSI mikromanipulaní jehlou prudce seklo kolmo na biík spermie o dno misky. Následn Pomocí mikromanipulační jehlypipety pro ICSI k smrem znehybnění spermie tak, která že se mikbyla spermie nasáta do injekní (vždydošlo biíkem dovnit ICSI jehly), se pesunula do kapkyprudce s oocytem. byl fixován pomocí holdingové aby romanipulační jehlou sekloTen kolmo na bičík spermie o dno pipety misky.tak, Následně byla pólové tlísko bylo v pozici 6 nebo 12. Po nastavení ICSI pipety do vhodné polohy byla spermie nasáta do injekční pipetya velmi (vždyjemn bičíkem směrem ICSI jehly), která se spermie umístna ke konci pipety injikována do dovnitř oocytu tak, že se cytoplazma oocytusaspirovala do byl prasknutí oolemy. Následn byla spermie přesunula do kapky oocytem.ažTen fixován pomocí holdingové pipety tak, aby pólové injikována i s aspirovanou cytoplazmou zpt do oocytu. Fertilizovaný oocyt byl uvolnn tělísko bylo v pozici 6 nebo 12. Po nastavení ICSI pipety do vhodné polohy byla spermie z holdingové pipety. Takto bylo postupováno analogicky u ostatních oocyt. Po provedení ICSIpipety byly ádn oplozené peneseny do ekvilibrovaného umístěna ke konci a velmi jemněoocyty injikována do oocytu tak, že se cytoplazma oorýhovacího média (Cleavage medium) ve tykomrce. V této pak byly kultivovány do cytu aspirovala až do prasknutí oolemy. Následně byla spermie injikována i s aspirovanou dalšího dne.

cytoplazmou zpět do oocytu. Fertilizovaný oocyt byl uvolněn z holdingové pipety. Takto A KONTROLA byloKULTIVACE postupováno analogicky uEMBRYÍ ostatních oocytů. Po provedení ICSI byly řádně oplozené oocyty přeneseny do ekvilibrovaného rýhovacího média (Cleavage medium) ve čtyřkomůrce. V této pak byly kultivovány do dalšího dne. 4.2.4 Kultivace a kontrola embryí 4.2.4.1 Kultivace Kultivační prostředí bylo zajištěno tekutými kultivačními médii (fertilizační médium, cleavage medium, blastocyst medium) saturovanými plynnou fází (směsný plyn: CO2: 6 %, O2: 5 %, N2: 89 % ). Stálé složení a nepřerušenou teplotu kultivačního systému zajišťovaly speciální inkubátory, zvané Minc. Embrya byla kultivována do nejvyššího stádia, jakého lze v laboratoři dosahnout (do tzv. blastocysty). Tato tzv. prodloužená kultivace umožňuje delší sledování vývoje embryí a vybrat nejkvalitnější embrya pro transfer. Sníží se tak pravděpodobnost zavedení embryí s omezenou schopností buněčného dělení. Embrya tak mají vyšší šanci na uchycení v děložní sliznici. 35


Diplomová práce

Dle stanovených kritérií byla nejčastěji pátý den kultivace vybrána nejlepší embrya na ET (embryotransfer). V den transferu tak byla embrya rozdělena na skupinu embryí určených pro ET a na skupinu určenou pro další kultivaci. Posledním dnem kultivace byl den šestý. Déle kultivace nebyla prodlužována, neboť v tento den by embrya měla být ve stádiu blastocysty, což je hraniční vývojové stádium, které lze úspěšně kultivovat v podmínkách in vitro. Kultivace embryí byla tedy šestý den zakončena zamrazením kvalitních blastocyst. 4.2.4.2 Kontrola a hodnocení embryí Po dobu kultivace byla embrya kontrolována a hodnocena každý den v ranních hodinách. Jejich hodnocení bylo řádně zaznamenáváno do embryologických protokolů. Den druhý, tj. 48 hod po odběru a den třetí, tj. 72 hod po odběru, byla embrya hodnocena podle počtu blastomer a stupně fragmentace, granulace a vakuolizace cytoplazmy. Na základě těchto charakteristik byla jednotlivá embrya ohodnocena stupněm kvality, tzv. grade a rozdělena do skupin s nejvyšším A či nižším B a nejnižším C grade. Den čtvrtý byla embrya hodnocena dle stupně kompaktace a kavitace. Pátý a šestý den vývoje jsme u blastocyst hodnotili trofoektoderm (TE), ze kterého se vyvýjí chorin a placenta, blastocel a vnitřní buněčnou masu (ICM). Ta tvoří základ vlastního embrya. Na základě těchto charakteristik byla jednotlivá embrya také rozdělena do skupin s nejvyšším A či nižším B případně nejnižším C grade. Hodnocení embryí - Den 1 Hodnotili jsme prvojádra (PN). Za 16-18 hodin po oplození byla provedena kontrola fertilizace. Oplození bylo hodnoceno

obr. 17: řádně oplozený oocyt (2PN)

obr. 18: abnormálně oplozený oocyt (3PN)

na základě počtu vytvořených prvojader (PN) a počtu pólových tělísek (PB) v perivitelinním prostoru (PP). Výsledky oplození v den 1 byly:

36


Diplomová práce

a) 2PN (řádně oplozený oocyt), kdy byla v cytoplasmě patrna 2 PN a v PP vyděleny 2 PB (viz obr. 17). b) 0PN (neoplozený oocyt), kdy nebyla v cytoplasmě patra PN a pouze v PP bylo 1 PB c) 1PN (aktivovaný oocyt), kdy bylo v cytoplasmě patrno pouze 1PN a v PP pouze 1 PB, nebo kdy bylo v cytoplasmě patrno pouze 1PN a v PP vydělena 2PB (pravděpodobně oplozený oocyt, po syngamii jader, což bylo ověřeno další kultivací, neboť pokud se po dalších 24 hod embryo nedělilo, pak oocyt nebyl oplozen). d) Abnormálně oplozené oocyty a degenerované oocyty (viz obr. 18). Hodnocení embryí - Den 2 Hodnotili jsme počet blastomer. Jak se preembryo vyvíjí, podstupuje rýhovací proces, v němž se buňky dělí na menší buňky (blastomery). Po dvou dnech vývoje obsahuje embryo 4 blastomery (viz obr. 19).

obr. 19: 4-buněčné embryo druhý den kultivace

Hodnocení embryí - Den 3 Hodnotili jsme počet blastomer. Za normální počet blastomer jsme třetí den vývoje embrya považovali 8 blastomer (viz obr. 20). Tolerovat se dá 7 i 9 buněk. Tak tomu bylo i v této práci.

obr. 20: 8-mi buněčné embryo třetí den kultivace

37


Diplomová práce

Hodnocení embryí - Den 4 Hodnotili jsme kompaktaci a kavitaci (tvorbu dutiny). Po třech dnech, kdy embryo obsahuje 8-16 blastomer, se buňky začínají kompaktovat a vytvářet fúzované embryo, které přechází do moruly. U embrya lze pozorovat rozsáhlé změny jeho vzhledu. Buňky se začínají diferencovat na ty, které se stanou plodem, amniotickým váčkem a placentou. Tyto změny nastávají formováním dutiny (blastocelu) v morule a vytvářením blastocysty. Hodnocená stádia čtvrtého dne vývoje byly: morula: M, kompaktující morula: CM (viz obr. 21), kompaktující morula s kavitací: CM+, kavitující morula: cav. M, časná blastocysta: EB (viz obr. 22).

obr. 21: kompaktující morula

obr. 22: časná blastocysta

Hodnocení embryí - Den 5 Hodnotili jsme trofoektoderm (TE) a vnitřní buněčnou masu (ICM). Pátý den vývoje embryo dorůstá do stádia expandované blastocysty (215 µm). Toto stádium je charakteristické poměrným zůžením buněk trofoektodermu (TE) ve prospěch blastocelu (vnitřní dutiny naplněné intracelulární tekutinou), formováním vnitřní buněčné masy (ICM- inner cell mass) a výrazným ztečením zona pelucida. Stádia pátého dne vývoje byly: expandovaná blastocysta: XB (viz obr. 23), hatchující blastocysta HB (viz obr. 24).

obr. 23: expandovaná blastocysta

obr. 24: hatchující blastocysta

38


Diplomová práce

Hodnocení embryí - Den 6 Hodnotili jsme blastocysty stejným způsobem jako Den 5. Stádia šestého dne vývoje byly stejně jako den patý: expandovaná blastocysta: XB, hatchující blastocysta HB a navíc full hatched blastocyst: FHB- zcela vycestovaná blastocysta ze ZP (viz obr. 25).

obr. 25: full hatched blastocyst

Výběr embryí pro embryotransfer (ET) Nejvýznamnějším kritériem výběru embryí pro ET byl v daný den odpovídající grade embryí. K embryotransferu byla vybírána (z embryí, která jsme měli v jednotlivých případech k dispozici) embrya té nejlepší kvality, tj. gradu A. Pokud to nebylo možné byla zvolena embrya gradu B. Ve vyjímečných případech došlo k přenosu embryí gradu C. Embrya po provedení ET zbylá, byla kultivována dále a v případně odpovídajícího vývojového stupně a kvality byla šestý den kryokonzervována. Embryotransfer (ET) jedná se o nenáročný, nebolestivý, ambulantní výkon při němž byla embrya šetrně zaváděna (za použití ultrazvukové sondy) tenkým a ohebným katétrem přes děložní hrdlo do sliznice dutiny děložní (viz obr. 26). Z důvodu normálního napodobení růstu endometria byla před samotným přenosem embryí do dělohy příjemkyň, nutná příprava jejich sliznice děložní. Ta proběhla podáním léků ve formě tablet a intramuskulárních injekcí obsahujících estrogen a gestagen.

obr. 26: schéma embryotransferu

39


Diplomová práce

4.2.5 Metody k získání informace o implantaci (nidaci) embrya Ke zjištění, zda žena (v tomto případě příjemkyně embryí vzniklých intracytoplazmatickou injekcí spermie muže do darovaného vajíčka) po ET otěhotněla, či ne, tj. zda došlo k počátečnímu uhnízdění (implantaci) embrya ve sliznici děložní či ne, bylo potřeba zajistit venózní krev příjemkyně. Odběr krve byl uskutečněn 12-tý – 16-tý den po embryotransferu, neboť těhotenství lze prokázat nejdříve po uplynutí 12 dnů po transferu embrya. Jednalo se o odběr krve venózní, provedený zdravotní sestrou v gynekologické ambulanci. Řádně popsaná sterilní zkumavka se získanou krví byla předána do andrologické laboratoře ke zpracování. Vyšetření krve Získanou krev bylo nutné k průkazu těhotenství vyšetřit a stanovit v ní hodnoty těhotenského hormonu b- HCG (lidský choriový gonadotropin). Vyšetření bylo provedeno v andrologické laboratoři pomocí analyzátoru AIA-360. - zkumavky s krví byly centrifugovány při otáčkách 3600 rpm 6 minut - jednotkami prokázané hladiny HCG byly IUI Informace o výsledku vyšetření byla informací o úspěšnosti či neúspěšnosti celého procesu a kontrolou kvality. Implantace embrya (nidace) Po transferu embryí by mělo dojít k jejich uhnízdění do sliznice dutiny děložní. V přirozeném cyklu k němu dochází 5 až 6 dnů po ovulaci, kdy se děložní sliznice nachází v plné sekreční fázi. Implantace je proces vyžadující přísně koordinovanou souhru interakce buněk trofoblastu blastocysty a endometria ženy. Imunologickou tolerancí endometria (která je přičítána hCG v součinnosti se steroidy) vůči blastocystě je zabráněno senzibilizaci mateřské tkáně a tvorbě protilátek proti zárodku. Porucha tohoto mechanismu může být příčinou selhání implantace a odumření zárodku (Vacek, 1992). Proces interakce mezi buňkami trofoblastu a endometriem, probíhá pouze v omezeném časovém období, nazývaném „okno vnímavosti“, které je zpočátku závislé na přítomnosti estrogenu a progesteronu. Významnou roli při kontrole nidace má vliv chemokinů a cytokinů. Jedním z klíčových cytokinů embryo-maternálního molekulárního dialogu, který probíhá během implantace embrya je Leukemický inhibiční faktor (Králíčková, 2008).

40


Diplomová práce

4.2.6 Metoda k získání informace o následné graviditě Ultrazvuk Metodou potvrzení pokračující gravidity bylo ultrazvukové vyšetření plodu přes stěnu břišní. Šlo o ambulantní bezbolestné vyšetření. Bylo provedeno lékařem 8-mý týden těhotenství pomocí ultrazvukové sondy. Jeho cílem bylo zjistit počet dále se vyvýjejících plodů. Pokud bylo embryotransferem do dělohy ženy zavedeno 1 embryo, výsledkem vyšetření byly 2 situace a 2 závěry. 1) Potvrzení akce srdeční plodu: ASP +. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující. 2) Akce srdeční plodu nebyla potvrzena: Abort. Těhotenství bylo prohlášeno za zmlklé. V případě, že byly embryotransferem do dělohy ženy zavedeny 2 embrya, výsledkem vyšetření byly 3 situace a 2 závěry: 1) Potvrzení akce srdeční obou plodů: ASP++. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující. 2) Potvrzení akce srdeční pouze jednoho plodu: ASP+. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující. 3) Akce srdeční plodu nebyla potvrzena ani u jednoho z nich: Abort. Těhotenství bylo prohlášeno za zmlklé. V případě, že byly embryotransferem do dělohy ženy zavedeny 3 embrya, výsledkem vyšetření byly 4 situace a 2 závěry: 1) Potvrzení akce srdeční všech třech plodů: ASP+++. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující 2) Potvrzení akce srdeční dvou plodů: ASP++. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující. 3) Potvrzení akce srdeční pouze jednoho plodu: ASP+. Těhotenství bylo prohlášeno za pokračující. 4) Akce srdeční plodu nebyla potvrzena ani u jednoho z nich: Abort. Těhotenství bylo prohlášeno za zmlklé.

41


Diplomová práce

obr. 27: 8-mi týdenní plod

Obr. 27: 1- oblast oka, 2- ucho, 3- ústa, 4- obrys žeber , 5-pupečníková žíla, 6-pupečníková tepna, 7- pupečník, 8-kotník, 9- koleno 4.2.7 Metody statistického zpracování dat Pro hodnocení sledovaných parametrů (FR, PR, UR, IR) byl celý hodnocený soubor rozdělen do dvou nezávislých skupin (N a T). Jelikož u dat nebyla prokázána normalita ani stejnorozptylovost, byly všechny hodnocené parametry porovnávány pomocí neparametrického Wilcoxonova testu. Hladina významnosti byla stanovena na 0,05. Hladina významnosti jednotlivých intervalů byla počítána s využitím neparametrického Kruskal-Wallisova testu rovnosti mediánů. Hladina významnosti byla opět stanovena na 0,05.

42


Diplomová práce

5 VÝSLEDKY

Hodnocený soubor předkládané retrospektivní srovnávací studie zahrnuje vybranou skupinou 207 případů, do které byli zařazeni muži, u nichž jsme v den OPU měli k dispozici tzv.ĀȀ̀ЀԀ‫਀ऀࠀ܀؀‬ “fresh sperm“. ਀ Tedy ejakulát získaný v odběrové místnosti na klinice (případy, ଀ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀ਀ ᘀᜀကഀ᠀ᤀᨀഀᬀ฀ᰀ਀ᔀကᴀᔀఀሀᘀက᠀ᴀḀἀ฀ ਀ሀᔀఀἀ฀ᨀἀᬀༀ ਀ሀᴀጀഀḀကdo਀!ᬀ"ᔀ฀ጀ#က਀ἀ$᐀ᔀᬀ฀ఀጀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ఀጀ਀਀%& u nichž bylo použito sperma kryokonzervované, či sperma darované studie nebyly ĀȀ̀ЀԀ‫਀ऀࠀ܀؀‬ ਀ !ᬀᜀᬀ!က฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀#ሀ*က਀ἀ਀ഀက฀਀,-.਀*/ᤀḀ਀᠀਀ഀḀሀᘀఀ!ḀༀḀ਀ᴀ!ἀ0਀12ᔀကሀ"਀ሀᘀကᔀ*10਀ ᘀᜀ ᘀᬀഀ()਀ഀఀ਀᠀ᴀကᔀᰀ਀᐀$ᤀḀ਀ zahrnuty).3ကഀ$਀က#ᬀ᠀ጀᤀᨀᴀ਀! ଀ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀ਀ ᘀᜀကഀ᠀ᤀᨀഀᬀ฀ᰀ਀ᔀကᴀᔀఀሀᘀက᠀ᴀḀἀ฀ ਀ሀᔀఀἀ฀ᨀἀᬀༀ ਀ሀᴀጀഀḀက਀!ᬀ"ᔀ฀ጀ#က਀ἀ$᐀ᔀᬀ฀ఀጀ਀ሀ᠀ ሀ᠀ᬀ฀ᄀ਀ἀ਀ఀഀ᐀/ᔀఀἀᰀ਀* ሀᴀ฀ఀሀᴀḀ਀฀ᬀ਀᠀ᤀḀ฀Ḁༀက਀4ᘀᜀ ᘀᬀഀ$਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀᐀$ᤀఀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀఀ਀ሀᘀကᔀ*ᬀ਀ Další ᠀ᔀ$ఀ᠀ఀ฀!ကᔀἀఀἀᬀ฀ᰀ)਀5Ḁ਀ሀᘀကᔀ*ᬀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᰀ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀฀က᐀$ᤀ$਀!ᬀ"ᔀ฀ጀᴀ$60 úrovní selekce zařazení do studie byl původ vajíčka. Z důvodu co nejvyší možné ᘀᜀ ᘀᬀഀ()਀ഀఀ਀᠀ᴀကᔀᰀ਀᐀$ᤀḀ਀!ᬀᜀᬀ!က฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀#ሀ*က਀ἀ਀ഀက฀਀,-.਀*/ᤀḀ਀᠀਀ഀḀሀᘀఀ!ḀༀḀ਀ᴀ!ἀ0਀12ᔀကሀ" ĀȀ̀ЀԀ‫਀ऀࠀ܀؀‬ ਀ ਀8ᔀఀἀ฀ ਀ሀကᤀက᠀ༀက਀!ᬀᜀᬀ!က฀ 5᠀ᬀ0਀9਀ഀ(ἀఀഀጀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ$7 ਀*ఀ+฀ᰀ਀ကᤀḀ*Ḁ฀ᬀༀက਀ἀᤀḀἀ 3ကഀ$਀က#ᬀ᠀ጀᤀᨀᴀ਀! ሀ᠀ᬀ฀ᄀ਀ἀ਀ఀഀ᐀/ᔀఀἀᰀ਀* ሀᴀ฀ఀሀᴀḀ਀฀ᬀ਀᠀ᤀḀ฀Ḁༀက਀4ᘀᜀ ᘀᬀഀ$਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀᐀$ᤀఀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀఀ਀ሀᘀကᔀ* eliminace‫؀‬ᬀᤀ7 vlivu ženského faktoru a ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀᐀$ᤀ਀ᘀ(ἀఀഀ਀ἀᬀ# co největší průkaznosti pouze vlivu terato଀ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀ਀ ᘀᜀကഀ᠀ᤀᨀഀᬀ฀ᰀ਀ᔀကᴀᔀఀሀᘀက᠀ᴀḀἀ฀ ਀ሀᔀఀἀ฀ᨀἀᬀༀ ਀ሀᴀጀഀḀကmužské ਀!ᬀ"ᔀ฀ጀ#က਀ἀ$᐀ᔀᬀ฀ఀጀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ఀጀ਀਀% +က฀ሀ᠀ᰀ"ఀ਀2ᬀ᠀ᴀఀᔀጀ਀ᬀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ/ᴀ7 ਀ᘀᔀ(᠀ᬀ!฀ఀሀᴀḀ਀ᘀఀጀ!က਀ἀᤀḀἀጀ਀*ጀ+ሀ᠀ᰀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀#ሀ*က਀!ἀఀᤀḀᤀḀ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ$਀ጀ਀ ᠀ᔀ$ఀ᠀ఀ฀!ကᔀἀఀἀᬀ฀ᰀ)਀5Ḁ਀ሀᘀကᔀ*ᬀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᰀ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀฀က᐀$ᤀ$਀!ᬀ"ᔀ฀ጀᴀ$60 spermie jsme zvolili případy, kterých byla použita vajíčka pocházející od dárkyň. )਀ഀఀ਀᠀ᴀကᔀᰀ਀᐀$ᤀḀ਀ !ᬀᜀᬀ!က฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀#ሀ*က਀ἀ਀ഀက฀਀,-.਀*/ᤀḀ਀᠀਀ഀḀሀᘀఀ!ḀༀḀ਀ᴀ!ἀ0਀12ᔀကሀ"਀ሀᘀကᔀ*10਀ ᘀᜀ ᘀᬀഀ( ᠀ᴀကᔀᄀༀ"਀᐀$ᤀᬀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀᬀ਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ਀ᘀఀༀ"ᨀ!က# ༀ ਀ఀഀ਀ഀᨀᔀ᠀$:0਀ ‫؀‬ᬀᤀ7 ਀8ᔀఀἀ฀u ਀ሀကᤀက᠀ༀက਀!ᬀᜀᬀ!က฀ ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀᐀$ᤀ਀ᘀ(ἀఀഀ਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ0਀9਀ഀ(ἀఀഀጀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ$7 ਀*ఀ+฀ᰀ਀ကᤀḀ*

3ကഀ$਀က#ᬀ᠀ጀᤀᨀᴀ਀! ሀ᠀ᬀ฀ᄀ਀ἀ਀ఀഀ᐀/ᔀఀἀᰀ਀* ሀᴀ฀ఀሀᴀḀ਀฀ᬀ਀᠀ᤀḀ฀Ḁༀက਀4ᘀᜀ ᘀᬀഀ$਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀᐀$ᤀఀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀఀ਀ሀᘀကᔀ*ᬀ਀ +က฀ሀ᠀ᰀ"ఀ਀2ᬀ᠀ᴀఀᔀጀ਀ᬀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ/ᴀ7 ਀ᘀᔀ(᠀ᬀ!฀ఀሀᴀḀ਀ᘀఀጀ!က਀ἀᤀḀἀጀ਀*ጀ+ሀ᠀ᰀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀#ሀ*က਀!ἀఀᤀḀᤀḀ਀ ᠀ᔀ$ఀ᠀ఀ฀!ကᔀἀఀἀᬀ฀ᰀ)਀5Ḁ਀ሀᘀကᔀ*ᬀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᰀ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀฀က᐀$ᤀ$਀!ᬀ"ᔀ฀ጀᴀ$60 Āሀᴀጀᘀጀ# ༀ *Ḁ਀5ᤀက฀$਀%&';*Ḁ਀฀ᨀ*Ḁ਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀༀ"਀ᘀᜀ ᠀ᴀကᔀᄀༀ"਀᐀$ᤀᬀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀᬀ਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ਀ᘀఀༀ"ᨀ!က# ༀᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀఀ਀%&'਀+က฀਀ᬀ਀%&'਀*ጀ+(0਀ ਀ఀഀ਀ഀᨀᔀ᠀$:0਀ Vstupujícími členy਀ሀကᤀက᠀ༀက਀!ᬀᜀᬀ!က฀ 207-mi námi hodnocených případů bylo 207 žen a 207 mužů. ਀*ఀ+฀ᰀ਀ကᤀḀ*Ḁ฀ᬀༀက਀ἀᤀḀ ‫؀‬ᬀᤀ7 ਀8ᔀఀἀ฀ ਀ഀఀ਀ሀᴀጀഀḀက਀᐀$ᤀ਀ᘀ(ἀఀഀ਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ0਀9਀ഀ(ἀఀഀጀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ$7 +က฀ሀ᠀ᰀ"ఀ਀2ᬀ᠀ᴀఀᔀጀ਀ᬀ਀ༀఀ਀฀က#ἀ/ᴀ7 ਀ᘀᔀ(᠀ᬀ!฀ఀሀᴀḀ਀ᘀఀጀ!က਀ἀᤀḀἀጀ਀*ጀ+ሀ᠀ᰀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀#ሀ*က਀!ἀఀᤀḀᤀḀ਀ᘀᜀ Āሀᴀጀᘀጀ# ༀ *Ḁ਀5ᤀက฀$਀%&';*Ḁ਀฀ᨀ*Ḁ਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀༀ"਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀఀ਀%&'਀+က฀਀ᬀ਀%&'਀*ጀ+(0਀ ᘀᬀഀ$਀ጀ 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&=਀ ᠀ᴀကᔀᄀༀ"਀᐀$ᤀᬀ਀ᘀఀጀ+Ḁᴀᬀ਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ਀ᘀఀༀ"ᨀ!က# ༀ ਀ఀഀ਀ഀᨀᔀ᠀$:0਀ tab. 5: sledované hodnoty žen

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&=਀

ĀȀ̀Ѐ

Āሀᴀጀᘀጀ# ༀ *Ḁ਀5ᤀက฀$਀%&';*Ḁ਀฀ᨀ*Ḁ਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀༀ"਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀఀ਀%&'਀+က฀਀ᬀ਀%&'਀*ጀ+(0਀ ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬ ĀȀ̀ЀԀĀऀ਀଀ఀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ ĀȀ̀ЀԀഀĀऀ਀଀ఀഀऀĀᄀऀሀऀ‫؀‬฀ጀ᐀ᔀᘀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ ᜀ᠀ᤀᨀᬀ

ᰀᤀᴀḀ ĀȀ̀Ѐ ᬀᤀἀ ĀȀ̀ЀԀĀऀ਀଀ఀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ ĀȀ̀ЀԀഀĀऀ਀଀ఀഀऀĀᄀऀሀऀ‫؀‬฀ጀ᐀ᔀᘀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ ᜀ᠀ᤀᨀᬀ ᰀᤀᴀḀ ᬀᤀἀ -ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀ഀᨀᔀ᠀$:਀᐀$ᤀ਀%>)=?਀ᤀကᴀ0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ਀#Ḁ*Ḁ਀ഀᔀᬀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# 5က᠀਀᐀$ᤀ਀@)<0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ ĀȀ̀Ѐ !ᔀᬀᤀᄀༀ")਀ᴀကഀ$਀ఀᘀᤀఀ!ఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# 5က᠀਀᐀$ᤀ਀?)@0 Průměrný věk dárkyň bylĀȀ̀ЀԀĀऀ਀଀ఀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ 24,16 let. PrůměrnýĀȀ̀ЀԀഀĀऀ਀଀ఀഀऀĀᄀऀሀऀ‫؀‬฀ጀ᐀ᔀᘀഀ‫؀‬฀ༀက਀଀ࠀ počet jimi darovaných vajíček byl 8,5.5က᠀਀᐀$ᤀ਀@)<0਀-ᔀ(* ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬ -ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀ഀᨀᔀ᠀$:਀᐀$ᤀ਀%>)=?਀ᤀကᴀ0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ਀#Ḁ*Ḁ਀ഀᔀᬀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# ᰀᤀᴀḀ !ᔀᬀᤀᄀༀ")਀ᴀကഀ$਀ఀᘀᤀఀ!ఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# 5က᠀਀᐀$ᤀ਀?)@0 Průměrný3ᬀ᐀0ऀ਀<;&% početᜀ᠀ᤀᨀᬀ zralých, tedy oplozovaných vajíček byl 6,8. ᬀᤀἀ

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&=਀ ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬

-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀ഀᨀᔀ᠀$:਀᐀$ᤀ਀%>)=?਀ᤀကᴀ0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ਀#Ḁ*Ḁ਀ഀᔀᬀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# 5က᠀਀᐀$ᤀ਀@)<0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&% Ԁ‫؀‬Ā‫܀‬ 5က᠀਀᐀$ᤀ਀?)@0 ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬ ∅ഀ!ഀ"

!ᔀᬀᤀᄀༀ")਀ᴀကഀ$਀ఀᘀᤀఀ!ఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ἀᬀ# tab. 6: sledované hodnoty mužů ᠀ᜀᤀᜀᴀ

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&%

ᨀᨀᤀᴀᜀ Ԁ‫؀‬Ā‫܀‬ ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬

ABऀ਀ᘀᔀఀༀက฀ᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀᠀ᜀᤀᜀᴀ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက

∅ഀ!ഀ" ᨀᨀᤀᴀᜀ

Ԁ‫؀‬Ā‫܀‬ ĀȀ̀ЀԀ‫ࠀ܀؀‬ ∅ഀ!ഀ" -ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*ጀ+(਀ༀကᤀᰀ"ఀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀ਀>%)%<਀ᤀကᴀ0਀Ā਀ഀᬀ฀ᰀ*਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀᬀ਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᬀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᨀ਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀ ABऀ਀ᘀᔀఀༀက฀ᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက ᠀ᜀᤀᜀᴀ ᨀᨀᤀᴀᜀ %N: procenta normální morfologie ฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀==)<%਀A0਀3!฀0ऀ਀+က਀==)<%਀਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ఀഀᘀఀἀ ഀᨀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/਀ᬀ਀!᐀ᄀἀᬀ# ༀ ༀ"਀@@)>@

A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀#က਀ᴀကഀ$਀ᘀᬀᴀఀᤀఀCḀༀ᠀ᄀༀ"0 -ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*ጀ+(਀ༀကᤀᰀ"ఀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀ਀>%)%<਀ᤀကᴀ0਀Ā਀ഀᬀ฀ᰀ*਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀᬀ਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᬀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ ABऀ਀ᘀᔀఀༀက฀ᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက ฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀==)<%਀A0਀3!฀0ऀ਀+က਀==)<%਀਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ఀഀᘀఀἀ ഀᨀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/਀ᬀ਀!᐀ᄀἀᬀ# PrůměrnýDကᤀᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀%&';*Ḁ਀ᘀᜀ věk mužů celého souboru byl 42,25 let. V daném souboru ਀ᬀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ఀጀ0 byla zjištěna průᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀᬀ਀ᔀఀ!ഀ/ᤀက฀ᬀ਀฀ᬀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ጀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀#က਀ᴀကഀ$਀ᘀᬀᴀఀᤀఀCḀༀ᠀ᄀༀ"0 -ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*ጀ+(਀ༀကᤀᰀ"ఀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀ਀>%)%<਀ᤀကᴀ0਀Ā਀ഀᬀ฀ᰀ*਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀᐀$ᤀᬀ਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᬀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᨀ਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ měrná hodnota normospermie 11,52 %. Tzn.: že 11,52 % spermií odpovídá morfologické ฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀==)<%਀A0਀3!฀0ऀ਀+က਀==)<%਀਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ఀഀᘀఀἀ ഀᨀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/਀ᬀ਀!᐀ᄀἀᬀ# 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&E Dကᤀᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀%&';*Ḁ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀᬀ਀ᔀఀ!ഀ/ᤀက฀ᬀ਀฀ᬀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ጀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ᬀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ఀጀ0 ༀ ༀ"਀@@)> normě a zbývajících 88,48 % spermií je tedy patologických. A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀#က਀ᴀကഀ$਀ᘀᬀᴀఀᤀఀCḀༀ᠀ᄀༀ"0

ഀ ጀ !ഀሀ฀#ఀऀ$Ā଀ጀက 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&E Dကᤀᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀%&';*Ḁ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀᐀$ᤀᬀ਀ᔀఀ!ഀ/ᤀက฀ᬀ਀฀ᬀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ጀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ᬀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ఀጀ0 ࠀऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀԀഀጀऀȀЀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᠀ᰀ Celá skupina 207-mi případů byla rozdělena na skupinu kontrolníᜀḀᤀᨀ a sledovanou. #ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀԀഀഀఀ଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᨀᴀ ἀᬀᤀᰀᨀ !ഀሀ฀#ఀऀ$Ā଀ጀက ഀ ጀ 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&E ࠀऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀԀഀጀऀȀЀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᠀ᰀ ᜀḀᤀᨀ tab. 7: rozdělení mužů podle %N #ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀԀഀഀఀ଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᨀᴀ ἀᬀᤀᰀᨀ ĀȀ̀ЀԀȀ‫଀਀ऀࠀ܀̀؀‬ఀഀ̀଀਀ᴀἀఀᜀ ਀>@਀5ᤀက฀(਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀᠀ఀ*᐀Ḁ฀ᬀༀḀ਀ሀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᄀ*Ḁ਀ఀఀༀ$ᴀ$0਀ ഀ ጀ !ഀሀ฀#ఀऀ$Ā଀ጀက Bఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀$਀#ሀఀጀ਀ἀ਀ᴀఀᴀఀ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ/਀ἀ7Ḁༀ"฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀#က#Ḁༀ"+਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀̀-F਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀ਀ἀက਀ἀ7ကༀ"਀ ࠀऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀԀഀጀऀȀЀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᠀ᰀ ᜀḀᤀᨀ ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ᴀᬀ฀ᰀ"ఀ਀AB਀ ĀȀ̀ЀԀȀ‫଀਀ऀࠀ܀̀؀‬ఀഀ̀଀਀ᴀἀఀᜀༀ"਀"ఀഀ฀ఀᴀ0਀‫؀‬ᤀက਀*Ḁ᠀ᔀఀሀ᠀ఀᘀḀༀ᠀$਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᰀ"ఀ਀ᬀ਀ἀ$ᘀఀ5 ਀>@਀5ᤀက฀(਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀᠀ఀ*᐀Ḁ฀ᬀༀḀ਀ሀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᄀ*Ḁ਀ఀఀༀ$ᴀ$0਀ #ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀԀഀഀఀ଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ ᨀᴀ ἀᬀᤀᰀᨀ ᐀$ᤀఀ਀=>਀A਀ᬀ਀ ἀ਀ᬀ฀ഀᔀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ᤀᬀ᐀ఀᔀᬀᴀఀᜀḀ਀#ሀ*က਀!ᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁༀ᠀ᰀ਀ᘀఀἀᬀ+ఀἀᬀᤀḀ਀ሀᘀကᔀ*ḀఀCᔀᬀ*$)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀ Bఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀$਀#ሀఀጀ਀ἀ਀ᴀఀᴀఀ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ/਀ἀ7Ḁༀ"฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀#က#Ḁༀ"+਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀̀-F਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀ਀ἀက਀ἀ7ကༀ

ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"਀"ఀഀ฀ఀᴀ0਀‫؀‬ᤀက਀*Ḁ᠀ᔀఀሀ᠀ఀᘀḀༀ᠀$਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᰀ"ఀ਀ᬀ਀ἀ$ᘀఀ5 ᴀᬀ฀ᰀ" ἀ ༀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀$਀ἀᘀఀᜀᨀഀ᠀ጀ0਀Bఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*ḀༀḀ਀#ሀఀጀ਀ἀ਀ഀᬀ฀ᰀ*਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀!ᬀሀᴀఀጀᘀက฀Ḁ਀ἀ਀%E)=G਀A ĀȀ̀ЀԀȀ‫଀਀ऀࠀ܀̀؀‬ఀഀ̀଀਀ᴀἀఀᜀ ਀>@਀5ᤀက฀(਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀᠀ఀ*᐀Ḁ฀ᬀༀḀ਀ሀ਀ഀᬀᔀఀἀᬀ฀ᄀ*Ḁ਀ఀఀༀ$ᴀ$0਀ ἀ਀ᬀ฀ഀᔀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ᤀᬀ᐀ఀᔀᬀᴀఀᜀḀ਀#ሀ*က਀!ᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁༀ᠀ᰀ਀ᘀఀἀᬀ+ఀἀᬀᤀḀ਀ሀᘀကᔀ*ḀఀCᔀᬀ*$)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀᐀$ᤀ Bఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀$਀#ሀఀጀ਀ἀ਀ᴀఀᴀఀ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ/਀ἀ7Ḁༀ"฀Ḁ਀*ጀ+Ḁ)਀#က#Ḁༀ"+਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀̀-F਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀ਀ἀက਀ἀ7ကༀ"਀ ฀‫؀‬ༀကȀᄀሀ̀ጀࠀऀ਀଀ఀഀ̀ሀ਀#က਀ᴀἀఀᜀက฀ᬀ਀=
ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"਀"ఀഀ฀ఀᴀ0਀‫؀‬ᤀက਀*Ḁ᠀ᔀఀሀ᠀ఀᘀḀༀ᠀$਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᰀ"ఀ਀ᬀ਀ἀ$ᘀఀ5 3ကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀$਀#ሀఀጀ਀ἀ਀ᴀᰀᴀఀ਀ᘀᔀᨀༀḀ਀*ጀ+Ḁ਀#က#Ḁༀ"+਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀̀-F਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀ਀ἀက਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ*਀ᴀᬀ฀ᰀ"ఀ਀AB਀ ᐀$ᤀఀ਀=>਀A਀ᬀ ἀ਀ᬀ฀ഀᔀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ᤀᬀ᐀ఀᔀᬀᴀఀᜀḀ਀#ሀ*က਀!ᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁༀ᠀ᰀ਀ᘀఀἀᬀ+ఀἀᬀᤀḀ਀ሀᘀကᔀ*ḀఀCᔀᬀ*$)਀ጀ਀฀Ḁༀ"+਀ 43 ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀᬀ*ကᴀᔀጀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"਀"ఀഀ฀ఀᴀ0 ਀‫؀‬ᤀက਀*Ḁ᠀ᔀఀሀ᠀ఀᘀḀༀ᠀$਀!#Ḁ7ᴀ/฀ᰀ"ఀ਀ᬀ਀ ฀‫؀‬ༀကȀᄀሀ̀ጀࠀऀ਀଀ఀഀ̀ሀ਀#က਀ᴀἀఀᜀက฀ᬀ਀=਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀$਀ἀᘀఀᜀᨀഀ᠀ጀ0਀ 3ကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*ḀༀḀ਀#ሀఀጀ਀!ᬀሀᴀఀጀᘀက฀Ḁ਀


Diplomová práce

Kontrolní skupinu Je tvořa 48 členy normospermiků v kombinaci s darovanými oocyty. Normospermiky jsou v toto případě všichni muži, jejichž kontrolní SPG dosahoval ve všech sledovaných parametrech normálních hodnot. Dle mikroskopicky zjištěného a vypočítaného %N v andrologické laboratoři jsme za normospermické považovali spermiogramy, u nichž bylo 14 % a více spermií morfologicky v pořádku. Normospermici jsou v daném souboru zastoupeni v 23,19 %. Sledovaná skupina Je tvořena 159-ti případy teratospermie opět v kombinaci s darovanými oocyty. Teratospermiky jsou v této práci muži jejichž kontrolní SPG dosahoval ve sledovaném parametrametru morfologie spermií abnormálních hodnot. Dle mikroskopicky zjištěného a vypočítaného %N v andrologické laboratoři jsme za teratospermické považovali spermiogramy, u nichž bylo méně jak 14 % spermií morfologicky v pořádku. Teratospermici jsou zastoupeni v 76,81 %. 1) Na základě %N byla kontrolní i sledovaná skupina dále rozčleněna do intervalů ᨀ( ᐀ሀࠀᔀጀ਀‫؀‬ሀကᘀࠀᜀ᐀ࠀ᐀$ᤀᬀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀Ḁ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀ഀᨀᤀက਀ᔀఀ!5ᤀက฀/฀ᬀ਀ഀఀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀ(0

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&>

tab. 8: rozdělení mužů dle (%N) do intervalů

ጀ

)ऀЀ‫܀‬Ȁഀ ሀ฀#ఀऀ$Ā଀ጀက

,ऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ "ऀȀЀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀

᠀ᰀ

ᜀḀᤀᨀ ഀ!

/ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ 0଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀

ᨀᴀ

ἀᬀᤀᰀᨀഀ!

ഀ

*ጀఀ଀Ȁ‫؀‬฀ᄀഀ+!"(

ጀഀ

Ḁ-.ἀᨀᴀ.ᜀ ᨀ-.ᨀ᠀ .ᴀ -.᠀

ᨀᬀ Ḁᜀ ᠀᠀ Ḁᰀ ἀἀ

H฀ᴀကᔀἀᬀᤀ਀4AB6਀฀ᨀ*਀ᜀ ᠀ᨀ)਀᠀ఀᤀḀ᠀਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀਀#က਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀$਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"0 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&>਀฀ᨀ*਀ᜀ ᠀ᨀ)਀+က਀฀က#ἀ ༀက਀5ᤀက฀(ऀ਀''਀ሀက਀฀ᬀༀ"ᨀ! ਀ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀&;>਀A਀B0਀Bက#*ᰀ฀/਀

Interval (%N) nám říká, kolik % spermií je morfologicky normálních. 5ᤀက฀(ऀ਀=?਀ሀက਀฀ᬀༀ"ᨀ! ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀A਀B0਀3#0਀''਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀&;>਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀

ఀഀᘀఀἀ ഀᬀ# ༀ ༀ"਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/਀ᬀ਀ᘀఀጀ!က਀=?਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀E&;'&਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ἀᘀఀᜀᨀഀ᠀ጀ0਀E@਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀ <;G਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ఀഀᘀఀἀ ഀᬀ# ༀ ༀ"਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/0਀>>਀*ጀ+(਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀఀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀=&;=>਀A0਀ Tab. 9਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁༀ᠀ᄀༀ"਀>@;*Ḁ਀ᘀᜀ 8 nám říká, že nejvíce členů: 77 se nachází u teratospermiků v intervalu ᘀᬀഀ(਀*/ᤀఀ਀E%਀!਀฀Ḁༀ"਀=<;%G਀A਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ᬀ਀ጀ਀=?਀!਀฀Ḁༀ"਀ 0-4 ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀᬀ਀8ᔀఀἀက:਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀E&;'&਀A0 % N. Nejméně členů: 16 se nachází u normospermiků v intervalu 30-70 %

N. Tj. 77 mužů mělo 0-4 % spermií odpovídajících morfologické normě a pouze 16 mužů ᜀ( ᐀ሀࠀᔀጀ਀‫؀‬ሀကᘀ਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᬀ฀ᄀༀ"਀5Ḁ਀฀ကᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᬀ฀ᄀༀ"਀ሀ᠀̀ȀԀᤀሀ‫؀‬ഀЀࠀḀ਀ἀ਀ഀᬀᤀ7 ༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ ਀ mělo 30-70 %̀-F਀᠀ᔀఀ*/਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ spermií v pořádku. 38 mužů mělo 5-9 % spermií odpovídajících morfologické ਀᐀$ᤀᬀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀=
ሀࠀȀ฀ఀࠀ฀ " 0 80 980 980:

"ഀ ᠀ᰀ ᜀᴀ ᬀ ᜀᜀ ᨀᬀ

)฀Ȁ฀Ѐ଀ఀȀ ЀऀȀ2ऀᄀऀ1%଀ Āऀᘀ34 ࠀऀጀᔀ଀ጀఀȀ฀ᔀ଀

. 7 7 7 7

. . 7 7 7

. . . 7 7

ࠀऀጀᔀ଀ጀఀȀ฀ᔀ଀ഀ5ഀᴀԀЀ%ᄀ6Ѐᄀ

. . . . 7

44

H฀ᴀကᔀἀᬀᤀ਀4AB6਀฀ᨀ*਀ᜀ ᠀ᨀ)਀᠀ఀᤀḀ᠀਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀਀#က਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀$਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"0 3ᬀ᐀0ऀ਀<;&>਀฀ᨀ*਀ᜀ ᠀ᨀ)਀+က਀฀က#ἀ ༀက਀5ᤀက฀(ऀ਀''਀ሀက਀฀ᬀༀ"ᨀ! ਀ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀&;>਀A਀B0਀Bက#*ᰀ฀/਀

Bc. Naděžda Pirošová ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀A਀B0਀3#0਀''਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀&;>਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ Diplomová práce 5ᤀက฀(ऀ਀=?਀ሀက਀฀ᬀༀ"ᨀ! ਀ ఀഀᘀఀἀ ഀᬀ# ༀ ༀ"਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/਀ᬀ਀ᘀఀጀ!က਀=?਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀E&;'&਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ἀᘀఀᜀᨀഀ᠀ጀ0਀E@਀*ጀ+(਀*/ᤀఀ਀ <;G਀A਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ఀഀᘀఀἀ ഀᬀ# ༀ ༀ"਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀฀ఀᔀ*/0਀>>਀*ጀ+(਀ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀఀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀=&;=>਀A0਀ 9਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁༀ᠀ᄀༀ"਀>@;*Ḁ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀*/ᤀఀ਀E%਀!਀฀Ḁༀ"਀=<;%G਀A਀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ༀ"਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ᬀ਀ጀ਀=?਀!਀฀Ḁༀ"਀ ഀఀሀᬀ"ఀἀᬀᤀᬀ਀8ᔀఀἀက:਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀E&;'&਀A0 2) Na základě prokázaných či neprokázaných abnormalit

I v dalších parametrech hodnocení SPG kromě morfologie spermií byla sledovaná skupina ᜀ( ᐀ሀࠀᔀጀ਀‫؀‬ሀကᘀ਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᬀ฀ᄀༀ"਀5Ḁ਀฀ကᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᬀ฀ᄀༀ"਀ሀ᠀̀ȀԀᤀሀ‫؀‬ഀЀࠀḀ਀ἀ਀ഀᬀᤀ7 ༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ ਀ ̀-F਀᠀ᔀఀ*/਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀᐀$ᤀᬀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᨀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᬀ਀=
tab. 9: rozdělení mužů dle patologií na kategorie

ࠀ฀ఀ଀1ऀȀ%଀ "ऀȀЀऀ#Ā଀ȀЀ%଀ 0଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%଀ 8#ఀ଀ጀऀ0଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%଀ 9ᄀ%1ऀ8#ఀ଀ጀऀ0଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%଀ 9ᄀ%1ऀ8#ఀ଀ጀऀ0଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%଀:Ȁ฀‫؀‬%#

ሀࠀȀ฀ఀࠀ฀

"ഀ

" 0 80 980 980:

᠀ᰀ ᜀᴀ ᬀ ᜀᜀ ᨀᬀ

)฀Ȁ฀Ѐ଀ఀȀ ЀऀȀ2ऀᄀऀ1%଀ Āऀᘀ34 ࠀऀጀᔀ଀ጀఀȀ฀ᔀ଀

. 7 7 7 7

. . 7 7 7

ࠀऀጀᔀ଀ጀఀȀ฀ᔀ଀ഀ5ഀᴀԀЀ%ᄀ6Ѐᄀ

. . . 7 7

. . . . 7

Kऀ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᬀᤀḀᴀᬀ਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀጀ਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᰀ"ఀ਀ἀ਀ᬀ฀ഀᔀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ᤀᬀ᐀ఀᔀᬀᴀఀᜀḀ਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᨀ฀ᬀ0 ;ऀ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᬀᤀḀᴀᬀ਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀጀ਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᰀ"ఀ਀ἀ਀ᬀ฀ഀᔀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ᤀᬀ᐀ఀᔀᬀᴀఀᜀḀ਀฀ကᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᨀ฀ᬀ0

+: abnormalita parametru hodnoceného v andrologické laboratoři prokázána.

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&<਀฀ᨀ*਀ᜀ ᠀ᨀ)਀+က਀ሀᘀကᔀ*ḀఀCᔀᬀ*$਀>@਀*(+(਀ഀᤀက਀"ఀഀ฀ఀༀ฀ ਀L଀,਀ఀഀᘀఀἀ ഀᬀᤀḀ਀ἀက਀ἀ7ကༀ"਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀༀ"਀ -: abnormalita parametru hodnoceného v andrologické laboratoři neprokázána. ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ"਀฀ఀᔀ*/0਀.਀%<;ᴀḀ਀*ጀ+(਀᐀$ᤀᬀ਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᨀ฀ᬀ਀ᘀఀጀ!က਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက਀ሀᘀကᔀ* ਀4360਀Bက#ἀ ༀက਀ *ጀ+(ऀ਀G?਀ἀ$᠀ᬀ!ఀἀᬀᤀఀ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀḀ਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ἀ਀᠀ఀ*᐀Ḁ฀ᬀༀḀ਀ሀ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᨀᤀ฀ *਀ᘀఀ"$᐀က*਀4I360਀ ‫܀‬ᬀᴀကCఀᔀḀက਀,I3਀ሀ਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᬀ฀ఀጀ਀ᬀ᐀฀ఀᔀ*ᬀᤀḀᴀఀጀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက)਀ᘀఀ"$᐀ጀ਀Ḁ਀᠀ఀ฀ༀက฀ᴀᔀᬀༀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀!ᬀ"ᔀ฀ጀ#က਀%%਀ Tab. 9 nám říká, že spermiogramy 48 můžů dle hodnocní WHO odpovídali ve všech *ጀ+(0਀Bက#*ᰀ฀/਀#ကഀḀ฀ༀ(ऀ਀=?਀ሀᘀᬀഀᨀ਀ഀఀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀက਀,I3਀CᔀᬀἀḀሀ0਀̀ᘀကᔀ*ḀఀCᔀᬀ*$਀*ጀ+(਀ᴀ/ༀ"ᴀఀ਀=?;ᴀḀ਀*ጀ+(਀ ᐀$ᤀ$਀ᘀᬀᴀఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ἀက਀ἀ7ကༀ"਀"ఀഀ฀ఀༀက฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀကༀ")਀ᘀᜀḀ5က*+਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀᠀ఀ฀ༀက฀ᴀᔀᬀༀက਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀ጀ਀฀Ḁༀ"਀ hodnocených parametrech normě. U 25-ti mužů byla prokázána pouze abnormální ᐀$ᤀᬀ਀฀Ḁ+7 ਀฀က+਀<਀*ḀᤀM*ᤀ0

morfologie spermí (T). Nejvíce mužů: 96 vykazovalo abnormální morfologii spermií v kombinaci s abnormálním pohybem (AT). Kategorie OAT s prokázanou abnormalitou morfologie, pohybu i koncentrace spermií zahrnuje 22 mužů. Nejméně jedinců: 16 spadá do kategorie OAT gravis. Spermiogramy mužů těchto 16-ti mužů byly patologické ve všech hodnocených parametrech, přičemž hodnota koncentrace spermií u nich byla nižší než 5 mil/ml.

3ᬀ᐀0ऀ਀<;&?

tab.: 10: rozložení četnosti N ve sledovaných skupinách

ĀȀ̀ࠀ

ഀ ഀ ,ऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ" /ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ0 Ḁ-.ἀ-ഀ!" ᨀᴀ.ᜀ ഀ!" ᨀ-.ᨀ᠀ഀ!" ᴀ. ഀ!" -.᠀!" 0 80 980 980: ഀऀȀ਀଀ఀഀ฀ༀကᄀሀԀጀᄀ

ጀഀ਀ᄀ଀ጀ̀ഀ ᠀ᰀ ᨀᴀ ᨀᬀ Ḁᜀ ᠀᠀ Ḁᰀ ἀἀ ᜀᴀ ᬀ ᜀᜀ ᨀᬀ ഀ

‫ࠀ܀؀‬ ഀ ഀ ഀ ᜀ᠀ᤀ-ᜀᴀᤀᜀᴀ ᜀ᠀ᤀᨀ᠀ ᜀḀᤀ ᴀ ᜀḀᤀᰀᬀ ᜀḀᤀᴀᜀ ᜀ᠀ᤀ᠀ᴀ ᜀᜀᤀᴀᜀḀᤀᬀ ഀ᐀ᔀᘀᜀ᠀

ऀऀ ഀ ഀ ഀ ᰀᤀᴀᰀᤀᬀᬀ ᰀᤀᬀᨀ ᤀᜀᨀ ᰀᤀᰀᤀᴀᬀ ᰀᤀḀ᠀ ᰀᤀ᠀ᴀ ᤀ᠀᠀ ഀᤀᘀᨀᬀ

ጀഀ;ᜀ.*
3ᬀ᐀0ऀ਀<;&?਀਀#က਀!ᜀက#*ᰀ਀+က)਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀+က฀਀ἀ਀ᴀᰀᴀఀ਀ᘀᔀᨀༀḀ਀᐀$ᤀ਀ᨀᬀᰀᴀḀࠀᤀကᴀ)਀ᘀᜀḀ5က*+਀฀က#฀Ḁ+77 ਀ἀ/᠀਀᐀$ᤀ਀N 45 ฀က#ἀ$77 ਀ࠀࠀ0਀Oက!Ḁ਀ഀᨀᔀ᠀$฀/*Ḁ਀ᬀ਀ᘀఀ5ᴀက*਀ᘀᜀḀഀ/ᤀက฀ᄀༀ"਀ఀఀༀ$ᴀ(਀ἀ਀#ကഀ฀ఀᴀᤀḀἀᄀༀ"਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᨀༀ"਀฀က᐀$ᤀ਀ሀᴀᬀᴀḀሀ ἀᄀ!฀ᬀ*฀ᄀ਀ᔀఀ!ഀ ᤀ0਀਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ਀!ᔀᬀᤀᄀༀ"਀ἀᬀ# 5က᠀਀ἀ"ఀഀ฀ᄀༀ"਀᠀਀HD̀H਀᐀$ᤀऀ਀@)<E਀ἀᬀ# 5᠀ᬀ0਀Bက#฀Ḁ+7 ਀ ἀ/᠀ఀἀᄀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ਀ഀᨀᔀ᠀$฀/ऀ਀%%)<&਀ᤀကᴀ਀᐀$ᤀ਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᨀ*਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀30਀9਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀఀἀᄀༀ"਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀਀᐀$ᤀ਀฀က#


Diplomová práce

Z tab.: 10 je zřejmé že, průměrný věk žen v této práci byl 24, 16 let, přičemž nejnižšší věk byl XX a nejvyšší YY. Mezi dárkyněmi a počtem přidělených oocytů v jednotlivých skupinách nebyl statisticky významný rozdíl. Průměrný počet zralých vajíček vhodných k ICSI byl: 8,53 vajíčka. Nejnižší věkový průměr dárkyně: 22,50 let byl zaznamenám v kategorii T. Z intervalových skupin byl nejnižší věkový průměr dárkyně: 23,86 zaznamenamý intervalu 0-4 % N. Z toho vyplývá, že spermie mužů s nejhoršími hodnotami normospermie 0-4 % N byly kombinovány s vajíčky žen věkového průměru 23,86. V nejčetnějším intervalu 77-mi mužů bylo k dispozici v průměru nejméně darovaných vajíček: 8,09. V tomto intervalu byl také zaznamenán nejnižší průměrný počet zralých vajíček: 6,55. Stejný průměrný počet vajíček byl zaznamenán také v kategorii OAT. Nejvyšší věkový průměr žen: 25,25 let, byl zaznamenán u normospermiků v intervalu: 15-29 % N. V tomto intervalu 32-ou mužů bylo k dispozici v průměru nejvíce zralých vajíček: 7,25. V průměru nejvíce vajíček: 9,44 vajíčka bylo darováno mužům kategorie OATG. 0฀4Ԁ=ᴀ.-ἀഀ>ऀሀᄀऀ?଀ጀကഀ਀଀ఀጀऀ#ఀကഀЀ$?̀ഀ‫଀؀‬ഀ#ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ᐀ᔀᘀഀ#ࠀ$Ā%ጀ'ᔀᘀ tab. 11: rozložení četnosti mužů ve sledovaných skupinách Ԁ‫؀‬ĀༀḀἀȀ ̀ఀ! "

ഀ ,ऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ" /ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ0

᠀ᰀ ᨀᴀ

‫ࠀ܀؀‬ ᠀-ᤀ᠀᠀ ᠀Ḁᤀ-ᨀ

Ḁ-.ἀ-ഀ!" ᨀᴀ.ᜀ ഀ!" ᨀ-.ᨀ᠀ഀ!" ᴀ. ഀ!" -.᠀ഀ!"


᠀ᜀᤀᰀᰀ Ḁᰀᤀ-᠀᠀ᤀ᠀ᨀᤀ ᴀ ᠀ᜀᤀ ἀ

ᨀ--ᤀ-ഀ! ᨀ--ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ!

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᜀᜀᤀἀഀ! ᜀᰀᤀ ഀ! ᴀᤀᜀഀ!

0 80 980 980: ऀȀ਀଀ఀഀ฀ༀကᄀሀԀጀᄀ

ᜀᴀ ᬀ ᜀᜀ ᨀᬀ

᠀-ᤀ᠀ᰀ ᠀Ḁᤀ-ᰀ ᠀ᴀᤀἀἀ ᠀Ḁᤀ-ᔀ᐀ᘀ᐀ᨀ

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᐀ᬀᘀᜀᴀༀ#

ᨀ--ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᨀ--ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᜀ᐀ᘀ%ᤀༀ# ᔀ᠀ᘀᬀᤀༀ#

#ༀ$

" ഀ ഀ

0 ഀ ഀ

80 ഀ ഀ

980 ഀ ഀ

980: ഀ ഀ

ᜀᰀᤀᜀᴀ ᬀᤀ᠀ἀ

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᬀᴀᤀ ഀ! ᴀἀᤀ ഀ! ᴀᰀᤀ᠀ഀ!

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᬀᤀᰀഀ! ᨀḀᤀᜀഀ! ᨀᰀᤀᜀഀ!

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᠀ᤀᴀഀ! -ᤀ-ഀ! ᨀᰀᤀᜀഀ!

᠀ᜀᤀἀᴀ ᜀᨀᤀ-ᨀᜀᤀ-ἀᤀᰀἀ ᜀᤀᬀᨀ

-ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᰀᤀᰀ᠀ -ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᬀᤀἀ᠀ ᨀ--ᤀ-ഀ! -ᤀ-ഀ! ᴀᤀ--ᤀ-ഀ! ᨀ--ᤀ-ഀ! ḀᤀᨀḀ ᜀ%ᘀ᠀ᬀༀ# ᰀᘀᰀᬀༀ# ᜀᜀᘀᨀ᐀

Z tab.: 11 vyplývá, že průměrný věk mužů je 42,25 let. Celý souborऀ਀%E)=G਀A਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀()਀ tvoří: 23,19 % normo9਀3ᬀ᐀0ऀ<;&'਀ἀ$ᘀᤀᄀἀᨀ)਀਀+က਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*ጀ+(਀#က਀>%)%<਀ᤀကᴀ0਀Dကᤀᄀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀ਀ᴀἀఀᜀ =%)&@਀A਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀()਀>?)E@਀A਀ఀᤀḀCఀᬀሀᴀက฀ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ᬀ਀')'E਀A਀਀ఀᤀḀCఀᬀሀᴀက฀ఀᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ spermiků, 12,08 % teratospermiků, 46,38 % oligoastenospermiků a 7,73 % oligoastenoሀ਀᠀ఀ฀ༀက฀ᴀᔀᬀༀ ਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀฀Ḁ+7 ਀฀က+਀<*Ḁᤀ0਀ሀᘀကᔀ*Ḁ ਀฀ᬀ਀*ᤀ0਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᨀ਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀4AB6਀ᘀᔀఀ਀ༀကᤀᄀ਀ teratospermiků s koncentrací spermií nižší než 5mil. spermií na ml. Průměrná hodnota ሀఀጀ᐀ఀᔀ਀#က਀==)<0 normospermie (%N) pro celý soubor je 11,5.

ἀᘀ਀ ਀-ᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*(+(਀ἀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀/਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀#က਀᠀-ᤀ᠀᠀ഀᄀ଀ఀഀ฀ഀĀȀ̀Ѐ‫܀‬Ȁጀ᐀ഀ‫ࠀ܀؀‬ഀЀ̀?̀ഀ‫଀؀‬ഀ Věk: Průměrný věk můžů v kontrolní skupině normospermiků je 40,44 let a průměrný #ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ@ഀ#ࠀ$Ā%ጀ‫܀‬ഀఀ଀Ȁ฀ఀऀ#Ā଀ȀЀ%ࠀ̀ഀༀ଀ഀ᠀Ḁᤀ-ᨀഀᄀ଀ఀԀ" က#ἀ$77 ਀ἀ/᠀ఀἀᄀ਀ᘀᔀ(*/ᔀऀ਀><)''਀ᤀကᴀ਀#ሀ*က਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᬀᤀḀ਀ ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀,I30਀.਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀਀AB਀਀᐀$ᤀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᄀ਀ἀ/᠀਀*ጀ+(ऀ>%)@@਀ᤀကᴀ0਀ věk můžů ve sledované skupině teratospermiků je 43,01 let. Nejvyšší věkový průměr: Bက#*ᤀᬀഀ7 ਀*ጀ+Ḁऀἀ/᠀ఀἀᄀ਀ᘀᔀ(*/ᔀ਀E@਀ᤀကᴀ਀᐀$ᤀ਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᨀ฀਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀=<;%G਀਀AB0਀

45,77 let jsme zaznamenali v kategorii OAT. U normospermiků v intervalu 30-70 %N ᐀ ਀ᬀ਀ᤀఀCḀༀ᠀$਀=&&A਀!ᬀሀᴀఀጀᘀက฀ bylBက#ἀ$77 průměrný věk mužů: 42,88 let.਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀#က਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀကༀ"਀਀=<;%G਀਀A਀Ḁ਀E&;'&਀਀A0਀ Nejmladší muži:věkový průměr 38 let byl zaznamenán H฀ᴀကᔀἀᬀᤀ$਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက਀#ሀఀጀ਀ᴀကഀ$਀฀ᬀᘀᔀఀሀᴀఀ਀ᘀᜀကሀ฀/਀ᴀἀఀᜀက฀$਀ᘀఀጀ!က਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀$਀B0਀਀Ѐ!က਀ᴀကഀ$਀ v intervalu normospermiků 15-29 %N. ᠀ఀ฀ሀᴀᬀᴀఀἀᬀᴀ਀)਀+က਀!ᬀሀᴀఀጀᘀက฀ ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀B਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀကༀ"਀=<;%G਀਀AB਀ᬀ਀E&;'&਀਀AB਀#က਀=&&A0਀,ᘀᔀఀᴀḀ਀ ᴀఀ*ጀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀ ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀฀ጀᤀఀἀᰀ0 N: Nejvyšší aༀ"਀3)਀I3)਀,I3)਀,I3F਀#က਀!ᬀሀᴀఀᘀጀᘀက฀ logicky 100 % zastoupení normospermiků je v intervalech 15-29 % i Bက#5ကᴀ฀/#Ḁ਀ሀကࠀ!਀਀ἀ$ሀ᠀$ᴀఀἀᬀᤀᬀ਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀<;G਀AB਀ἀ਀%@)G਀A 30-70%. Bက#5ကᴀ฀/#Ḁ਀ሀက਀"!਀ἀ$ሀ᠀$ᴀఀἀᬀᤀᬀ਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀=&;=>਀਀AB਀ἀ਀?<)G਀A

Bက#5ကᴀ฀/#Ḁ਀ሀက਀#"!਀ἀ$ሀ᠀$ᴀఀἀᬀᤀᬀ਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀&;>਀AB਀ἀ਀=@)%਀A Bက#5ကᴀ฀/#Ḁ਀ሀက਀#"!$਀ἀ$ሀ᠀$ᴀఀἀᬀᤀᬀ਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀&;>਀AB਀ἀ਀=@)%਀A਀3ကഀ$਀ጀ਀*ጀ+(਀ሀ਀฀က#฀Ḁ+7 ਀"ఀഀ฀ఀᴀఀጀ਀ ฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁက0਀‫؀‬ᨀ਀ሀက਀ᴀကഀ$਀ᜀ ༀḀ)਀+က਀,I3F਀ሀက਀ἀ$ሀ᠀$ᴀఀἀᬀᤀᬀ਀฀က#ἀ ༀက਀ጀ਀*ጀ+(਀#က#Ḁༀ"+਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀༀ᠀ᰀ਀ ฀ఀᔀ*$਀฀ကᘀᜀကሀᨀ"ᤀᬀ਀>਀A0 ࠀᜀ᐀ ࠀBက#ἀ$77 ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᨀ਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀက*ᔀḀကऀ਀>%)'<਀A਀᐀$ᤀᬀ਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᨀ฀ᬀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀਀A0਀Bက#฀Ḁ+7 ਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀ᨀ਀"ఀഀ฀ఀᴀᬀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀက*ᔀḀကऀ਀%)?=਀A਀᐀$ᤀᬀ਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᨀ฀ᬀ਀ጀ਀

46


Diplomová práce

Intervaly normospermie jsou tedy naprosto přesně tvořeny pouze normospermiky N. Lze tedy konstatovat, že zastoupení normospermiků N v intervalech 15-29 %N a 30-70 %N je 100%. Oproti tomu v kategoriích T, AT, OAT, OATG je zastopupení normospermiků nulové. Nejčetněji se T vyskytovala v intervalu 5-9 %N v 28,9 % Nejčetněji se AT vyskytovala v intervalu 10-14 %N v 65,9 % Nejčetněji se OAT vyskytovala v intervalu 0-4 %N v 18,2 % Nejčetněji se OATG vyskytovala v intervalu 0-4 %N v 18,2 %, tedy u mužů s nejnižší hodnotou normospermie. Dá se tedy říci, že OATG se vyskytovala nejvíce u mužů jejichž hodnota morfologické normy nepřesáhla 4 %. %N: Nejvyšší průměrná hodnota normospermie: 42,75 % byla zaznamenána u normospermiků v intervalu 30-70 %. Nejnižší průměrná hodnota normospermie: 2,61 % byla zaznamenána u teratospermiků v intervalu 0-4 %N. 0฀4Ԁ=ᴀ.-ᰀ

tab. 12: průměrná kvalita embryí

ȀԀ&ᄀЀఀ ഀ ഀ ᠀ᰀ

ഀ ᴀᤀἀᴀ

8 ᨀᤀᬀḀ

C -ᤀḀḀ

< -ᤀ-ᰀ

∅ഀሀЀ฀?଀ጀ᐀ᔀᘀഀ ଀Ѐ4ԀഀAAA 8 C -ᤀᬀ-ᤀᬀ-

ᨀᴀ

ᴀᤀᜀᬀ

ᨀᤀᴀᜀ

-ᤀ᠀

-ᤀᨀᬀ

-ᤀ᠀ᰀ

-ᤀ᠀-

Ḁ-.ἀ-ഀഀ! ᨀᴀ.ᜀ ഀഀ! ᨀ-.ᨀ᠀ഀഀ! ᴀ. ഀഀ! -.᠀ഀ!


ᴀᤀᰀᰀ ᴀᤀᬀ ᴀᤀḀᴀᤀᬀᨀ ᴀᤀ-ᰀ

ᨀᤀᴀᬀ ᨀᤀᬀᬀ ᨀᤀᴀᜀ ᨀᤀḀᜀ ᨀᤀᬀᜀ

-ᤀᴀᬀ -ᤀᜀᜀ -ᤀ᠀ᰀ -ᤀᴀᴀ -ᤀ᠀ἀ

-ᤀ-ᬀ -ᤀ-ᤀᨀᨀ -ᤀᜀᨀ -ᤀᨀἀ

-ᤀᴀᬀ -ᤀᬀḀ -ᤀᴀᴀ -ᤀḀ -ᤀ᠀ᰀ

-ᤀḀᨀ -ᤀἀᴀ -ᤀḀᜀ -ᤀᴀᴀ -ᤀḀᬀ

0 80 980 980: <଀ᄀࠀऀ‫؀‬᐀ഀĀȀ̀Ѐ‫܀‬Ȁ ऀȀ਀଀ఀഀ฀ༀကఀἀȀ

ᜀᴀ ᬀ ᜀᜀ ᨀᬀ

ᴀᤀḀᬀ ᴀᤀᜀᴀ ᠀ᤀ ᴀ ᴀᤀᬀḀ ᴀᤀḀᰀ ᜀᜀᜀᬀ

ᨀᤀ᠀᠀ ᨀᤀ᠀ ᨀᤀᴀᴀ ᨀᤀᰀᨀ ᨀᤀᴀᴀ ᬀ᐀%

-ᤀ᠀ᰀ -ᤀ᠀ἀ -ᤀἀἀ -ᤀᜀᴀ -ᤀ᠀ᴀ ᴀᔀ

-ᤀᜀᰀ -ᤀᨀᰀ -ᤀ-ᤀ--ᤀᨀ᠀ ᬀ%

-ᤀᴀᬀ -ᤀ᠀-ᤀᬀᰀ -ᤀᴀᬀ -ᤀᴀᨀ ᜀ%ᨀ

-ᤀ᠀-ᤀ᠀ᨀ -ᤀᨀᰀ -ᤀᬀḀ -ᤀ᠀᠀ ᴀ᐀

∅ഀ)"ഀA ഀ ,ऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ" /ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ 0

᐀%ᰀ

∅ഀ଀Ѐ4Ԁഀጀ฀ഀB0ഀAA

P਀=0਀ഀက฀਀᠀ጀᤀᴀḀἀᬀༀက਀਀PP਀਀<0਀ഀက฀਀᠀ጀᤀᴀḀἀᬀༀက਀਀PPP਀?0਀ഀက฀਀᠀ጀᤀᴀḀἀᬀༀက * 1. den kultivace ** 5. den kultivace ਀᠀਀ఀ"ఀഀ฀ఀༀက฀ *** 6. den kultivace I)Q)Dऀ਀ሀ᠀Rᔀက਀᠀ἀᬀᤀḀᴀ$0਀ᴀ!ἀ0Cᔀᬀഀက)᠀ᴀကᔀᄀ਀ሀᤀఀጀ+ ਀*ఀᔀ2ఀᤀఀCḀက਀က*᐀ᔀ$ᬀ0 I;਀฀က#ᤀကᘀ7 0 tzv. grade, který slouží k ohodnocení morfologie embrya. A, B, C:)਀D;਀฀က#"ఀᔀ7 skóre kvality.

A- nejlepší, C- nejhorší. 3ᬀ᐀0ऀ<;&@਀ᘀఀᘀḀሀጀ#က)਀+က਀ᘀᔀ(*/ᔀ฀/਀#ሀ*က਀ἀ਀ༀကᤀᰀ*਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀%&';*Ḁ਀ᘀᜀ ᘀᬀഀ(਀! ሀ᠀ᬀᤀḀऀ਀<)E@਀-B0 .਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀਀>@;*Ḁ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀#ሀ*က਀! ሀ᠀ᬀᤀḀ਀ἀ਀ᘀᔀ(*/ᔀጀ਀ऀ਀<)'<਀-B0਀.਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀#ሀ*က਀! Tab. 12 popisuje, že průměrněሀ᠀ᬀᤀḀ਀ἀ jsme ਀vᘀᔀ(*/ᔀጀऀ਀<)%?਀-B0਀Bက#ἀ celém souboru 207-miༀကऀ਀<)@@਀-B਀#ሀ*က਀!ᬀ!฀ᬀ*က฀ᬀᤀḀ਀ případů získali: 5,38 PN. Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀਀AB0਀Bက#*ᰀ฀/ऀ਀>)G<਀-B਀#ሀ*က਀! ਀ ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ U kontrolní skupiny 48-mi normospermiků jsme získali v průměru:ሀ᠀ᬀᤀḀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀,I30਀ 5,75 PN. U sledované Jఀ!ഀ ᤀ$਀ἀ਀ᘀఀ5ᴀጀ਀-B਀ἀ਀#ကഀ฀ఀᴀᤀḀἀᄀༀ"਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ᨀༀ"਀฀က᐀$ᤀ$਀ሀᴀᬀᴀḀሀᴀḀༀ᠀$਀ἀᄀ!฀ᬀ*฀ᰀ0 skupiny teratospermiků jsme získali v průměru: 5,26 PN. Nejvíce: 5,88 PN਀Cᔀᬀഀጀ਀I0਀Āက਀ jsme zaznaĀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀/਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ሀက਀ᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀఀἀᬀᤀఀ਀ἀ਀ᘀᔀ(*/ᔀጀऀ਀=)?E਀က*᐀ᔀ$ ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀/਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ሀက਀ᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀఀἀᬀᤀఀ਀ἀ਀ᘀᔀ(*/ᔀጀऀ਀=)<%਀က*᐀ᔀ$ᬀ਀Cᔀᬀഀጀ਀I਀0਀Bက#ἀ ༀက਀ ᐀$ᤀఀ਀ἀ਀ᘀᔀ(*/ᔀጀ਀ᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀఀἀᨀ฀ఀ਀က*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀Iऀ=)<<਀ᬀ਀฀က#*ᰀ฀/਀က*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀D0਀Ԁ*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀ 47 I਀᐀$ᤀఀ਀ᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀఀἀᨀ฀ఀ਀E%&਀ᬀ਀!ᬀ*ᔀᬀ!က฀ఀ਀=&<0਀̀ఀጀ5ᴀက*਀! ሀ᠀ᨀ*က਀ༀကᤀ᠀ఀἀᄀ਀ᘀఀ5ကᴀ਀᠀ጀᤀᴀḀἀᬀༀ ਀ ! ሀ᠀ᬀ฀ᄀༀ"਀က*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀Iऀ਀>%<0਀Ԁ*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀Q਀᐀$ᤀఀ਀ఀഀᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀఀἀᨀ฀ఀ਀G>਀ᬀ਀!ᬀ*ᔀᬀ!က฀ఀ਀#Ḁༀ"਀ ᐀$ᤀఀ਀=&<0਀Dကᤀ᠀က*਀᐀$ᤀఀ਀ᴀကഀ$਀᠀ጀᤀᴀḀἀᬀༀ ਀! ሀ᠀ᨀ฀ఀ਀=GG਀က*᐀ᔀ$ ਀Cᔀᬀഀጀ਀Q0਀Bက#*ᰀ฀/਀ᘀఀ5ကᴀ฀ఀጀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀ఀጀ਀


Diplomová práce

menali u normospermiků v intervalu 30-70 %N. Nejméně: 4,95 PN jsme získali v kategorii OAT. Rozdíly v počtu PN v jednotlivých skupinách nebyly statisticky významné. V kontrolní skupině normospermiků se transferovalo v průměru: 1,63 embryí gradu A. Ve sledované skupině teratospermiků se transferovalo v průměru: 1,52 embrya gradu A . Nejvíce bylo v průměru transferováno embryí gradu A:1,55 a nejméně embryí gradu C. Embryí gradu A bylo transferováno 320 a zamrazeno 105. Součtem získáme celkový počet kultivací získaných embryí gradu A: 425. Embryí gradu B bylo odtransferováno 94 a zamrazeno jich bylo 92. Celkem bylo tedy kultivací získáno 199 embryí gradu B. Nejméně početnou skupinou k transferu využitých embryí byla embrya gradu C. Transferováno bylo celkem 30 embryí gradu C. Kvalitu embryí a možný vliv teratospermie na ni jsme hodnotili v jednotlivých intervalech a kategoriích pomocí FR a UR. 1) FR (fertilization rate)= n 2PN d1/n M2-ICSI počet prvojader v den 1 poděleno počtem zralých oocytů hodnotí procento fertilizace (kolik z oplozovaných vajíček je opravdu oplozených) 2) UR (utilization rate)= sum(embr.)/n PN D1 součet všech kvalitních embryí (grade A, B, C) podělený počtem prvojader v den 1. Jde o procento využití embryí (kolik kvalitních embryí jsme získali z jednodenních embryí) Implantaci a možný vliv teratospermie na ni jsme hodnotili v jednotlivých intervalech a kategoriích pomocí PR. 3) PR (pregnanci rate)= hCG+/ET - počet pozitivních výsledků hCG poděleno počtem embryotransferů - nám říká kolik žen otěhotnělo (mělo pozitivní těhotenský test) na embryotransfer Následnou graviditu a možný vlit teratospermie na ni jsme hodnotili v jednotlivých intervalech a kategoriích pomocí IR. 4) IR (implantation rate)= ASP++/ET - počet srdečních akcí na ultrazvuku poděleno počtem embryotransferu - hodnotí procento uhnízděných embryí (počet gestačních váčků) v 8-mém týdnu gravidity po transferu. Všechny potřebné hodnoty nutné pro výpočet FR, UR, PR a IR jsou součástí datového souboru viz Příloha.

48

>6਀HJ਀4Ḁ*ᘀᤀᬀ฀ᴀᬀᴀḀఀ฀਀ᔀᬀᴀက6T਀Ì-KKMԀ3 Bc. Naděžda Pirošová; ᘀఀ5ကᴀ਀ሀᔀഀက5฀ ༀ"਀ᬀ᠀ༀ ਀฀ᬀ਀ጀᤀᴀᔀᬀ!ἀጀ᠀ጀ਀ᘀఀഀ/ᤀက฀ఀ਀ᘀఀ5ᴀက*਀က*᐀ᔀ$ఀᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀጀ Diplomová práce ; "ఀഀ฀ఀᴀ ਀ࠀఀԀȀ(ༀ̀ЀȀࠀ଀1̀‫܀‬ᔀကᘀ̀3(1ࠀༀᤀ᠀Ԁ*‫਀܀‬4ᘀఀ5ကᴀ਀Cကሀᴀᬀ5฀ ༀ"਀ἀᨀ5᠀(6਀਀ἀ਀@;*ᰀ*਀ᴀᄀഀ฀ጀ਀ CᔀᬀἀḀഀḀᴀ$਀ᘀఀ਀ᴀᔀᬀ฀ሀ2ကᔀጀ0 Ā7ကༀ"฀$਀ᘀఀᴀᜀက᐀฀ᰀ਀"ఀഀ฀ఀᴀ$਀฀ጀᴀ฀ᰀ਀ᘀᔀఀ਀ἀᄀᘀఀ5ကᴀ਀SJ)਀.J)਀-J਀ᬀ਀HJ਀#ሀఀጀ਀ሀఀጀ5ᨀሀᴀ ਀ഀᬀᴀఀἀᰀ"ఀ਀ሀఀጀ᐀ఀᔀጀ਀ἀḀ!0਀ -ᜀ ᤀఀ"ᬀ0 0฀4Ԁ=ᴀ.-

tab. 13: sledované parametry u skupin

'( ഀ ,ऀጀఀȀऀᄀጀကഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ" /ᄀ଀&ऀ‫؀‬฀ጀ'ഀ#ࠀ$Ā%ጀ฀ഀ0 >ऀሀ&ကᄀ

ጀഀᜀ)"ഀ&ᨀ6ጀഀ;ᜀ. *
)(

*(

ᘀᔀ176B0 8/)776B0 ᬀᬀᤀᬀἀഀ! ᴀᴀᤀ ἀഀ! ᨀ-ᤀἀഀ!ഀ

ᜀ ᤀᰀᬀഀ! ᜀᴀᤀᬀḀഀ! ᠀ᤀᜀḀഀ!

+( #$Ѐ+଀Ѐ4ȀԀ(6ጀഀ)"ഀ Dᨀ ᬀ-ᤀἀᰀഀ! ᬀᜀᤀᨀᬀഀ! ᨀᤀḀᰀഀ!

SJ਀ጀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀>@;*Ḁ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀᐀$ᤀ਀@&)@@਀A0਀਀ SJ਀ጀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀=@;*Ḁ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀᐀$ᤀ਀??)?'਀A0਀ (Oehninger, 1996 uvádí FR 68% ) -J਀ጀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀=@;*Ḁ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀᐀$ᤀ਀%G)@?਀A0 HJ਀ጀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀=)%E਀A਀฀ᬀ਀"ᤀᬀഀḀ฀/਀ἀᄀ!฀ᬀ*฀ఀሀᴀḀ਀ᘀT&)EG&0਀Bက#ကഀ฀ᨀ਀ሀက਀ᴀကഀ$਀ఀ਀ሀᴀᬀᴀḀሀᴀḀༀ᠀$਀ἀᄀ!฀ᬀ*฀ᄀ਀ᔀఀ!ഀ u sledované skupiny 159-ti teratospermiků byl 55,97 %. Mezi kontrolní skupinou normospermiků a sledovanou skupinou T u PR byl zjištěn .J਀ጀ਀᠀ఀ฀ᴀᔀఀᤀ฀ ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀>@;*Ḁ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀᐀$ᤀ਀@&)@@਀A0਀਀ rozdíl 10,7 % na hladině významnosti p=0,189. Nejedná se tedy o statisticky vý.J਀ጀ਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᰀ਀ሀ᠀ጀᘀḀ฀$਀=
49


Diplomová práce

0฀4Ԁ=ᴀ.ᨀtab. 14: sledované parametry u skupin

'( ഀ Ḁ-.ἀ-ഀ! ᨀᴀ.ᜀ ഀ! ᨀ-.ᨀ᠀ഀ! ᴀ. ഀ! -.᠀!

)(

*(

ᘀᔀ176B0 8/)776B0 ᬀᰀᤀᰀ! ᬀᴀᤀᬀ! ᬀᰀᤀᜀ! ᠀ᜀᤀᨀᨀ! ᴀᴀᤀᰀ᠀!

Ḁ-ᤀᜀ! ᜀ ᤀἀ! ᜀᬀᤀ ! ᨀ ᤀἀ᠀! ᜀἀᤀᰀᨀ!

+( #$Ѐ+଀Ѐ4ȀԀ(6ጀഀ)"ഀ Dᨀ ᴀᬀᤀ-! ᬀḀᤀᜀ! ᬀᨀᤀ᠀! ᴀᰀᤀᰀᰀ! ᬀ᠀ᤀᨀᰀ!

.਀฀ᨀ*Ḁ਀!ἀఀᤀက฀ᄀༀ"਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀ(਀᐀$ᤀఀऀ ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀SJ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀ABऀ਀@?)?਀A ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀SJ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀=<;%G਀ABऀ਀'@)&A U námi zvolených intervalů bylo: ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀-J਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀ABऀ਀?@)@A nejlepšího výsledku FR dosaženo u normospermiků v intervalu 30-70 %N: 86,6 % ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀-J਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀<;G਀ABऀ਀>%)==A (Kruger, 1986 uvádí v intervalu 31 %-45 % FR: 82%) ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀HJ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀ABऀ਀E&)%A nejhoršího výsledku FR dosaženo u normospermiků v intervalu 15-29 %N: 78,0 % ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀HJ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀<;G਀ABऀ਀=G)'>A (Kruger, 1986 uvádí v intervalu 15 %-30 % FR: 81%)

฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀.J਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀=<;%G਀ABऀ਀?E)%A ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀.J਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀ἀ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀<;G਀ABऀ਀<@)@@A Nejlepšího výsledku PR dosaženo u normospermiků v intervalu 30-70 %N: 68,8 % (Kruger, 1986 uvádí v intervalu 31 %-45 % PR: 31%) 9਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀(਀ἀ$ᘀᤀᄀἀᨀ)਀+က਀ऀ nejhoršího výsledku PR dosaženo u teratospermiků v intervalu 5-9 %N: 42,11 % ጀ਀ᴀကᔀᬀᴀఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀&;>਀AB਀਀฀က᐀$ᤀ$਀ጀ਀SJ)਀-J)H਀J਀ᬀ฀Ḁ਀.J਀ᘀᔀఀ᠀ᨀ!ᨀ฀$਀฀က#"ఀᔀ7 ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀$0਀ ጀ਀฀ఀᔀ*ఀሀᘀကᔀ*Ḁ᠀(਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀጀ਀E&;'&਀A਀᐀$ᤀఀ਀ጀ਀SJ)਀-J)H਀J਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀฀က#ᤀကᘀ7 ༀ"਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀(0 nejlepšího výsledku IR dosaženo u normospermiků v intervalu 30-70 %N: 30,2 % Oက!Ḁ਀Ḁ฀ᴀကᔀἀᬀᤀ$਀E&;'&਀AV਀=<;%G਀AV਀=&;=>਀AV਀<;G਀A਀ᬀ਀&;>਀A਀฀က᐀$ᤀ਀!#Ḁ7ᴀ/฀਀ሀᴀᬀᴀḀሀᴀḀༀ᠀$਀ἀᄀ!฀ᬀ*฀ᄀ਀ nejhoršího výsledku IR dosaženo u teratospermiků v intervalu 5-9 %N: 19,74 % ᔀఀ!ഀ ᤀ਀ጀ਀+ᨀഀ฀ᰀ"ఀ਀!က਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀ(ऀ਀SJ਀4ᘀT&)?%G6)਀-J਀4ᘀT&)==%6)਀HJ਀4ᘀT&)60਀ nejlepšího výsledku UR dosaženo u normospermiků v intervalu 15-29 %N: 63,2 % nejhoršího výsledku UR dosaženo u teratospermiků v intervalu 5-9 %N: 58,88 % Z výsledků vyplývá, že : u teratospermiků intervalu 0-4 %N nebyly u FR, PR,I R ani UR prokázány nejhorší výsledky. u normospermiků intervalu 30-70 % bylo u FR, PR,I R dosaženo nejlepších výsledků. Mezi intervaly 30-70 %; 15-29 %; 10-14 %; 5-9 % a 0-4 % nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl u žádného ze sledovaných parametrů: FR (p=0,629), PR (p=0,112), IR (p=0,591), UR (p=0,614).

50


Diplomová práce

3ᬀ᐀0ऀ<;==

tab. 15: sledované parametry u kategorií

'( ഀ 0 80 980 980:

)(

*(

ᘀᔀ176B0 8/)776B0 ᠀᠀ᤀ--ഀ! ᬀᨀᤀ᠀ᬀഀ! ᠀ᴀᤀ᠀ᴀഀ! ᴀᬀᤀᜀᴀഀ!

ᨀᰀᤀ--ഀ! ᜀᬀᤀ-᠀ഀ! Ḁᨀᤀ᠀᠀ഀ! ᜀἀᤀ-ᰀഀ!

+( #$Ѐ+଀Ѐ4ȀԀ(6ጀഀ)"ഀ Dᨀ ᬀḀᤀᨀᴀഀ! ᴀ ᤀ ᨀഀ! ἀᜀᤀ-ἀഀ! ᬀ-ᤀ᠀ᬀഀ!

.਀฀ᨀ*Ḁ਀!ἀఀᤀက฀ᄀༀ"਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀ ਀᐀$ᤀఀऀ U námi zvolených kategorií bylo: ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀SJ਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀3ऀ਀'G)@@਀A ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀SJ਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀,I3ऀ਀ ἀ ᤀᬀᬀഀ! nejlepšího výsledku FR bylo dosaženo v kategorii T: 79,88 % nejhoršího výsledku FR bylo dosaženo v kategorii OAT: 79,66 % ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀-J਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀I3ऀ਀ᬀᨀᤀ᠀ᬀഀ! ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀-J਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀3ऀ਀᠀᠀ᤀ--ഀ! nejlepšího výsledku PR bylo dosaženo v kategorii AT: 61,46 % ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀HJ਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀,I3ऀ਀ nejhoršího výsledku PR bylo dosaženo v kategorii T: 44,00Ḁᨀᤀ᠀᠀ഀ! % ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀HJ਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀3ऀഀᨀᰀᤀ--ഀ! nejlepšího výsledku IR bylo dosaženo v kategorii OAT: 31,44 % ฀က#ᤀကᘀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀.J਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀,I3ऀ਀ ἀᜀᤀ-ἀഀ! ฀က#"ఀᔀ7 "ఀ਀ἀᄀሀᤀကഀ᠀ጀ਀.J਀᐀$ᤀఀ਀ഀఀሀᬀ+က฀ఀ਀ἀ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀḀ਀I3ऀ਀ nejhoršího výsledku IR bylo dosaženo v kategorii T: 18,00ᴀ%ᤀ ᨀഀ!

Oက!Ḁ਀᠀ᬀᴀကCఀᔀḀက*Ḁ਀3)਀I3)਀,I3਀ᬀ਀,I3F਀฀က᐀$ᤀ਀!#Ḁ7ᴀ/฀਀ሀᴀᬀᴀḀሀᴀḀༀ᠀$਀ἀᄀ!฀ᬀ*฀ᄀ਀ᔀఀ!ഀ ᤀ਀ጀ਀+ᨀഀ฀ᰀ"ఀ਀ nejlepšího výsledku UR bylo dosaženo v kategorii OAT: 72,07 % !က਀ሀᤀကഀఀἀᬀ฀ᄀༀ"਀ᘀᬀᔀᬀ*ကᴀᔀ(ऀ਀SJ਀4ᘀT&)@'>6)਀-J਀4ᘀT&)%<=6)਀HJ਀4ᘀT&)?>'6)਀.J਀4ᘀT&)
51


Diplomová práce

6 DISKUZE Problémy průmyslově vyspělých zemí jsou spjaty s civilizačními chorobami, mezi které můžeme počítat také problémy související s plodností. Zhruba u 33 % párů postižených problémem s plodností je na vině čistě mužský faktor. Studium problematiky mužské plodnosti je stále v popředí zájmu center asistované reprodukce a proto se také vlivu patologické morfologie spermií na úspěch IVF stále vedou diskuse. Jedním z důvodů vzniku předkládané práce, bylo pokusit se odpovědět na otázku významu morfologické abnormality spermií. Vzorky mužských ejakulátů kombinované s vajíčky pocházejícících od mladých zdravých žen byly získány na pracovišti soukromé kliniky asistované reprodukce, která má na evropské poměry silně rozvinutý program dárcovství oocytů, kterým jsme byli schopni zajistit dostatečné množství vzorků poměrně atipického souboru pro průkaz statistické významnosti. Díky stoprocentnímu zastoupení darovaných oocytů vstupujícících do procesu vzniku embrya jsme dokázali výrazně snížit variabilitu vlivu ženského faktoru, která by mohla hrát roli při vývoji embrya a co nejvíce poukázat na vliv námi vybraného mužského faktoru. Spermie jsme získali při rutinním odběru vždy čerstvé. Sperma zmrazené nebylo použito v žádném z případů, abychom vyloučili možný vliv kryokonzervace. Celkem jsme zhodnotili 207 výběrových vzorků, což je v rozměrech současné asistované reprodukce poměrně vysoké číslo. Do protokolu byly zařazeny jen vzorky ejakulátů s prokázanou normospermií nebo teratospermií (buď samotnou nebo v kombinaci s jinou patologií). Ostatní patologie spermií nebyly předmětem našeho zájmu a proto takové případy do studie vůbec zahrnuty nebyly. V práci jsme obsáhli skupinu celkem 207-mi mužů. Z nich 48 tvořilo skupinu normospermiků, jejichž spermiogram vykazoval normální hodnoty morfologie (WHO, 1999) a 159 tvořilo skupinu teratospermiků. To znamená, že u 76,8 % mužů byla prokázána teratospermie. Teratospermici byli rozděleni do 3 kategorií, podle toho jaká další patologie u nich byla prokázána. Průměrný věk mužů byl 42,25 let, z toho skupina normospermiků vykazovala průměrný věk 40,44 let a skupina teratospermiků 43 let. Významný věkový rozdíl prokázán nebyl. Co se týče hodnoty normospermie, tedy parametru vypovídajícím o procentuálním zastoupení morfologicky normálních spermií, tak celkový soubor vykazoval 11,52 % spermií normálních tvarů. (WHO, 1999 uvádí 15 % normálně utvářených spermií v 1 ml ejakulátu jako normu. Průměrně se tedy jedná o skupinu teratospermickou). Skupina normospermiků vykazovala průměrnou hodnotu normospermie 28,25 %, zatímco skupina teratospermiků vykazovala v průměru 6,47 % normospermií. Mezi těmito skupinami byl tedy výrazný rozdíl ve výskytu nor52


Diplomová práce

mální morfologie spermií. Porovnáme-li četnost výskytu různých stupňů poruch morfologie (intervaly 0-4 %, 5-9 % a 10-14 %), pak u teratospermie byla nejčastější hodnota morfologie mezi 5-9 %, u astenoteratospermie byla nejčastější hodnota morfologie 10-14 %, u OAT byla nejčastější hodnota morfologie 0-4 % a u OATG byla nejčastější hodnota morfologie 0-4 %. Lze tedy usuzovat, že čím více poruch parametrů spermií je u jednoho muže, tím větší je poškození morfologie spermií. Oocyty použité v této práci byly vždy získány ovariální punkcí dárkyně po řízené hormonální stimulaci. Po získání vajíček byla nutná jejich denudace. Cílem tohoto procesu bylo zbavit oocyt kumulárních buněk proto, aby bylo možné ke vzniku embryí použít metodu ICSI. Procesem denudace byl upřesněn počet získaných vajíček na počet vajíček použitelných, tedy těch, které se nacházejí ve 2 profázi meiotického dělení. Zmíněné metody, byly vždy standardní. Mezi dárkyněmi a jimi poskytnutými oocyty nebyly prokázány žádné rozdíly. Průměrný věk dárkyň 24,2 let je ve shodě s věkem 18-34 let (Guidelines for gamete, 2002). Průměrný počet získaných oocytů byl 8,52. V průměru bylo od jedné dárkyně získáno 6,79 vhodných oocytů pro metodu ICSI. Po metodě ICSI se oocyty kultivovaly a následující den se hodnotil počet oplozených vajíček. Průměrně bylo oplozeno 5,38 vajíček. V kontrolní skupině normospermiků bylo oplozeno v průměru 5,75 vajíček a ve sledované skupině teratospermiků bylo oplozeno v průměru 5,26 vajíček. Tento rozdíl nebyl statisticky průkazný. Naproti tomu ve své práci uvádí přímou souvislost mezi kvalitou spermí a počtem oplozených vajíček (Host et al, 1999) . Dále jsme v práci sledovali množství a kvalitu embryí, které vznikly spojením sledovaných spermií s darovynými oocyty. Ve všech případech byla k ET použita ta nejkvalitnější embrya. Zbylá kvalitní embrya se z důvodu jejich co možná nejvyšší využitelnosti zamrazila. Nejčastěji se použila embrya gradu A. V průměru se v celém souboru transferovalo 1,55 embryí gradu A. U skupiny normospermiků se pak tranferovalo v průměru 1,63 embryí gradu A a ve skupině teratospermiků se transferovalo 1,52 embryí gradu A. Vypočítaný rozdíl 0,15 je statisticky nevýznamný. Podíváme-li se na absolutní čísla, tak během naší práce jsme použili 320 embryí grade A a 94 embryí grade B. Podobná situace byla u embryí grade B vhodných pro transfer. V průměru bylo transferováno 0,45 embryí této kvality v celém souboru 0,33 embryí ve skupině normospermiků a 0,49 ve skupině teratospermiků. Pokud jsme měli kvalitních embryí více než se využilo na ET, byla tato embrya kryokonzervována. Porovnáme-li průměrné počty zmražených embryí kvality A u celkového souboru (0,51) s průměrnými počty ve skupině normospermiků (0,6) a teratospermiků (0,48) zjistíme, že u teratospermiků byl průměrný počet embryí grade A o něco nižší, avšak statisticky neprůkazný. Stejně neprůkazný výsledek byl zaznamenán u embryí kvality B.

53


Diplomová práce

Průměrný počet těchto embryí v celkovém souboru byl 0,44, u normospermiků 0,6 a u teratospermiků 0,4. Celkem jsme během naší práce získali 425 embryí gradu A (320 bylo použito k ET a 105 bylo kryokonzervováno) a 188 embryí grade B (94 bylo použito k ET a 92 bylo kryokonzervováno). Embryí gradu C využitých pouze pro ET bylo 30. Metoda ICSI byla použita, jako modulátor kvality spermií. Vychází se z toho, že tato metoda je vysoce selektivní, neboť při ní dochází k výběru nejkvalitnější spermie z celého množství spermií v ejakulátu. Při přípravě spermií dochází v prvním kroku k eliminaci nepohyblivých spermií a během vlastní ICSI metody dochází k prohlížení všech pohyblivých spermií, hodnocení jejich morfologie a výběru pohyblivé a morfologicky co možná nejvíce normální spermie. Vychází se z toho, že i v těžké patologické morfologii u OATG syndromu existuje několik normálních spermií. A cílem metody ICSI je jejich nalezení a použití jejich genetického materiálu k oplození vajíčka. Předpokládali jsme tedy, že při použití této metody pravděpodobně nebude prokázán vliv teratospermie na výsledek IVF. Tuto hypotézu se nám podařilo potvrdit a metodu ICSI lze jako vhodné řešení doporučit pacientům s diagnózou poruchy morfologie spermií. Mezi kontrolní skupinou normospermiků a sledovanou skupinou teratospermiiků byl u FR zjištěn rozdíl 1,73 % na hladině významnosti p=0,350, což není statisticky významný rozdíl. To znamená, že nebyl prokázán vliv teratospermie na to, kolik jsme první den kultivace měli oplozených vajíček. Fertilization rate normospermiků a teratospermiků se tedy nijak významně neliší a pravděpodobnost vzniku prvojader jsou u obou skupin vyrovnané. Szcygiel, 1999 naproti tomu uvádí signifikantní korelaci morfologie a fertilizace. Mezi kontrolní skupinou normospermiků a sledovanou skupinou teratospermiků byl u PR zjištěn rozdíl 10,7 % na hladině významnosti p=0,189. Nejedná se tedy o statisticky významný rozdíl. To znamená, že nebyl prokázán vliv teratospermie na implantaci embrya. Pregnanci rate normospermiků a teratospermiků se tedy nijak významně neliší a pravděpodobnost implantace embrya u obou skupin je vyrovnaná. Mezi kontrolní skupinou normospermiků a sledovanou skupinou teratospermiků byl u IR zjištěn rozdíl 4,23 % na hladině významnosti p=0,390. Nejedná se tedy o statisticky významný rozdíl. To znamená, že nebyl prokázán vliv teratospermie na následnou graviditu. Implantation rate normospermiků a teratospermiků se tedy nijak významně neliší a šance, že implantované embryo bude ve svém vývoji pokračovat jsou u obou skupin vyrovnané. Mezi kontrolní skupinou normospermiků a sledovanou skupinou teratospermiků byl u UR zjištěn rozdíl 1,38 % na hladině významnosti p=0,759. Nejedná se tedy o statisticky významný rozdíl. To znamená, že nebyl prokázán vliv teratospermie na Utilization rate, tedy na to jaké množství kvalitních embryí můžeme ze vzniklých prvojader vykultivovat a využít.

54


Diplomová práce

7 ZÁVĚR Vliv mužské teratospermie (patologické morfologie spermií) na kvalitu lidských embryí, jejich implantaci a následnou graviditu, které byly hodnoceny parametry FR, PR, IR a UR nebyl prokázán. Z výsledků diplomové práce tedy vyplývá, že při dodržení námi stanovených podmínek (využití metody ICSI a darovaných oocytů) mají teratospermici stejnou šanci na otěhotnění a dosažení následné gravidity jako muži s normospermií. Vysvětlením námi zjištěné neprůkaznosti vlivu teratospermie by mohlo být právě využití metody ICSI, v kombinaci s darovanými oocyty. Metoda ICSI totiž pracuje s individuálním výběrem každé jednotlivé spermie, čímž možná obchází problém špatné morfologie. ICSI tak zůstává nadále nejvhodnější a nejdoporučovanější metodou vzniku embrya a následně nového jedince v laboratorních podmínkách IVF, jako řešení problému neschopnosti počít dítě přirozenou cestou, kde na vině je mužský faktor a obvzlášť jedná li se o vyšší zastopupení abnormální morfologie.

55


Diplomová práce

8 SEZNAM LITERATURY ALBERTS, B., BRAY, D., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P.: Základy buněčné biologie - úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing 1998, 1 vyd. 740 s. DVOŘÁČEK, J.: Urologie, Obecná a speciální urologie. Karolinum: Praha,1999. 2 vyd. 235 s. DYLEVSKÝ, I.: Základy funkčí anatomie člověka. MANUS, Praha, 2007, 194 s. GARDNER, D., K., WEISSMEN, A., HOWLES, C., M., SHOHAM, Z.: Textbook of Assisted Reproductive Techniques, Laboratory and Clinical Perspectives. Taylor & Francis, 2004, 2.vyd. 984 s. GAMČÍK, P., KOZUMPLÍK, J. a kol.: Andrológia a umelá inseminácia hospodářských zvierat. Príroda Bratislava, 1984, 299 s. HOST, E., et al.: Sperm morphology and IVF, Embryo quality in relation to sperm morphology following the WHO and Krüger‘s strict kriteria, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 1999,78, 526 -529 s JELÍNEK, J., ZICHÁČEK, V.: Biologie pro gymnázia, Nakladatelství Olomouc, Olomouc 1998, 3 vyd. KLIKA, E.: Embryologie člověka – I., Obecná embryologie a teratologie, 1. Svazekčást textová. Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1980, 91 s. KRUGER, T.F., MENKVELD, R., STANDER F.S.: Sperm morfologic features as a prognostic factor in vitro fertilization. Fertil Steril. 1986. Dec,46(6):1118-23 KRÁLÍČKOVÁ, M., ŠÍMA, R., MARTÍNEK, P., VANĚČEK, T., ULČOVÁ-GALLOVÁ, Z., ŠÍMA, P., KŘIŽAN, J., KALIŠ, V., ŠTĚPÁN, J. JR., ŠTĚPÁN, J., ROKYTA, Z., UHER, P., HES, O.: Mutace v genu pro leukemický inhibiční faktor (LIF) v populaci neplodných žen: heterozygotní bodová záměna G za A na pozici 3400 neovlivňuje úspěšnost léčby. Česká gynekologie. 2007, roč. 72, č. 4, s. 293-298. LAŠTUVKA, Z.: Zoologie pro zemědělce a lesníky. Konvos: Brno, 2004. 3 vyd. 264s.

56


Diplomová práce

MANKVELD, R., RHEMREV, J.P., FRANKEN, D.R., VERMEIDEN J.P., KRUGER, T.F.: Morfology as a novel criterion for male fertility diagnosis. Fertil Steril. 1996. Mar, 65(3):637-44 MOORE, K. L., PERSAUD, T. V. N.: Zrození člověka. ISV nakladatelství Praha, 2002, 564 s. NAKAMURA, S. TERADA Y., HORIUCHI T., EMUTA C., MURAKAMI T, YAEGASHI N., OKAMURA K.: Human sperm aster formation and pronuclear decondensation in bovine eggs following intracytoplasmic sperm injection using a piezo-driven pipette: a novel assay for human sperm centrosomal function. 2001. Biol reprod: 65(5), 1359-1363. ROSYPAL, S. a kol.: Přehled biologie. Praha, Scientia, 1998. 2.vyd., 642 s. ROZTOČIL, A. a kol.: Porodnictví. Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 2001, 333 s. ŘEŽÁBEK, K.: Léčba neplodnosti aneb – co dělat, když chceme mít dítě. Grada Publishing, 1999, 102 s. SATHANANTHAN, A.H., KOLA, I., OSBORNE, J., TROUNSON, A., Ng, S.C., BONGSO, A., RATNAM, S.S.: Centrioles in the beginning of human development. 1991. Proc Natl Acad Sci USA: 88, pp.4806-4810. SILBERNAGL, S., DESPOPULOS, A.: Atlas fyziologie člověka. Grada, Praha, 2004, 6. vydání, publishing a.s. SLÁDEČEK, F.: Rozmnožování a vývoj živočichů – základy vývojové biologie. Academia, Praha, 1986. SOVA, Z. a kol.: Fyziologie hospodářských zvířat. Státní zemědělské nakladatelství Praha, 1990, 472 s. SZCZYGIEL, M., KURPISZ, M.: Teratozoospermie and its effect on male fertility potential. Andrologia, 1999. Mar,31(2):63-75 TOSHIMORI, K., ITO CH. : Formation and organization of the mammalian sperm head.

57


Diplomová práce

2003, Arch Histol Cytol,66(5), pp.383-396. VACEK, Z.: Embryologie pro pediatry: učebnice pro lékařské fakulty. Karolinum, Praha, 1992 . 313 s. VACEK, Z.: Embryologie: učebnice pro studenty lékařství a oborů všeobecná sestra a porodní asistentka. Grada, Praha, 2006. 1 vyd. 255s. VEECK, L. L., ZANINIVIĆ, N.: An Atlas of Human Blastocyst. The Parthenon Publishing Group, 2003, 286 s. VĚŽNÍK, Z. a kol.: Hodnocení semene pro asistovanou reprodukci a výběr plemeníků. VÚVEL Brno, 2000, 141 s. VĚŽNÍK, Z. a kol.: Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy, VÚVEL Brno, 2004, 258 s. World Health Organization: WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm – cervical mucus interaction. Cambridge University Press, 1999. 4th vydání www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato02.html#aubau www.ucalgary.ca/uofc/eduweb/virtualembryo/dev_biol.html www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato05.html#spermiohistogenese http://micro.magnet.fsu.edu/cells/centrioles/centrioles.html http://www.sci.muni.cz/ptacek/REPRODUKCE2.htm

58


Diplomová práce

8.1 Soupis zdrojů obrázků obr. 1: http://www.slideshare.net/catherinepatterson/cell-division-mitosis-and-meiosis -presentation 2.3.2010 17 obr. 2: http://www.slideshare.net/catherinepatterson/cell-division-mitosis-and-meiosis -presentation 2.3.2010 17 obr. 3: http://science.tjc.edu/images/reproduction/spermatogenesis.jpg 2.3.2010 19 obr. 4: http://www.bloud.cz/wp-content/uploads/image/spermie.jpg 4.4.2010 20 obr. 5: www.embryology.ch/anglais/cgametogen/spermato05.html#spermiohistogenese 2.3.2010 21 obr. 6: http://cs.wikipedia.org/wiki/Spermatogeneze 2.3.2010 22 obr. 7: http://science.tjc.edu/images/reproduction/oogenesis.jpg 2.3.2010 25 obr. 8: http://worms.zoology.wisc.edu/frogs/fert/subcortrot/oocyt.gif 29.4.2010 26 obr. 9: http://www.ivfq.com.au/ivf.asp 22.4.2010 28 obr. 10: Canon D400, objektiv 18-55 mm obr. 11: Canon D400, objektiv 18-55 mm 28 obr. 12: www.zdlinc.com/makler_chamber_ jpg 1.1.2010 obr. 13:www.sk.org.tw/blood/lecture/Images/Image006.png 31 obr. 14: http://www.fs.cvut.cz/stretech/2009/pdf/1023.pdft 29.4.2010 32 obr. 15: http://www.fs.cvut.cz/stretech/2009/pdf/1023.pdft 29.4.2010 33 obr. 16: http://www.fs.cvut.cz/stretech/2009/pdf/1023.pdft 29.4.2010 33 obr. 17: Canon D400, objektiv 18-55 mm obr. 18: Canon D400, objektiv 18-55 mm 36 obr. 19: Canon D400, objektiv 18-55 mm 37 obr. 20: Canon D400, objektiv 18-55 mm 37 obr. 21: Canon D400, objektiv 18-55 mm obr. 22: Canon D400, objektiv 18-55 mm 38 obr. 23: Canon D400, objektiv 18-55 mm obr. 24: Canon D400, objektiv 18-55 mm 38 obr. 26: http://www.ivfq.com.au/embryotransfer.asp 39 obr. 25: Canon D400, objektiv 18-55 mm 39 obr. 27: http://translate.google.cz/translate?hl=cs&langpair=en|cs&u=http:// www.visembryo.com/baby/ 42

59


Diplomová práce

8.2 Soupis zdrojů tabulek tab. 1: Manuál a metodiky andrologie, Reprofit International, 2009 tab. 2: Manuál a metodiky andrologie, Reprofit International, 2009 tab. 3: http://www.androcare.cz/sex.html tab. 4: vlastní tab. 5: vlastní tab. 6: vlastní tab. 7: vlastní tab. 8: vlastní tab. 9: vlastní tab. 10: vlastní tab. 11: vlastní tab. 12: vlastní tab. 13: vlastní

29 30 32 35 43 43 43 44 45 45 46 47 49

tab. 14: vlastní tab. 15: vlastní

50 51

60

9 PŘÍLOHA Ԁ‫؀‬Ā Ā Ā

ĀȀ̀Ѐ Ԁ฀ༀࠀကᄀ

ሀጀᄀ

᐀฀฀

ࠀ᐀ᔀᘀᜀఀ᠀ᤀఀ Ԁ฀ༀࠀကᄀ

ሀጀᄀ

ᨀ

ȀԀ‫਀ऀࠀ܀‬ ᬀĀ

ᰀᬀĀ

ᰀᬀĀᴀ

Ḁ᐀ᨀ

ࠀ᐀Ѐᨀ᐀ἀ

ࠀ᐀!"#$ἀ%&!Ā ᬀ

%2 '3 54 % 77 % '3 35 8 22 2' 25 74 73 '8 5 57 82 48 8 ᘀ8 2' 25 %ᘀ 'ᘀ '% '8 83 ᘀ44 ᘀ2 ᘀ3 7' 34 38 ᘀ4 5 ᘀ ᘀ7 ᘀ8 2% 23 28 72 77 % %% %8 ' 'ᘀ '2 52 5% 55 3 3ᘀ 3% 8ᘀ 87 88 4ᘀ 4 5 3 74 7 %2 ' '' 5ᘀ 57 38 82 87 8' 85 ᘀ4' 2 2% 2 7 % ' 7 % 5 ᘀ4 ᘀ% ᘀ' 2 27 7 75 %4 %ᘀ %7 '4 8' 44 42 ' ᘀ ᘀ2 ᘀ5 78 %4 %' '2 5' 53 3 33 ᘀ4ᘀ ᘀ42 ᘀ45 3 8 4 ᘀ 2 3 ᘀ5 24 2ᘀ 7ᘀ 7% 78 %5 %3 '7 '5 5ᘀ 5' 53 58 3' 35 8 8% 85 83 45 ᘀᘀ ᘀ7 27 72 %7 %5 5 55 58 34 3ᘀ 32 3' 8 ᘀ47 ᘀ4% ᘀᘀ 47 4% 2ᘀ 7ᘀ 52 84 ᘀ ' 33 4' ᘀ4 ᘀ% 28 7' %3 '5 5% 8ᘀ '% 43 22 '4 54 8% 7 ᘀ' 24 7% 88 '' 4 23 75 32 2 ᘀ3 73 37 ᘀ 37 84 '7 %8 %% %'

3% 35 3% 5' 35 32 5' 35 37 37 35 3' 53 3' 35 35 34 55 33 38 3% 33 53 3' 33 35 34 37 3% 35 34 53 3' 3ᘀ 3% 37 35 3% 34 3 3' 53 35 3% 3% 33 33 5' 32 32 33 34 35 35 35 37 5' 35 84 3% 37 3ᘀ 35 38 35 35 3' 3 35 38 3 3 3' 32 5' 3% 32 38 3' 37 3% 3% 33 3% 3% 53 35 3% 3% 3 3 35 32 3% 34 33 33 3ᘀ 3ᘀ 5% 32 38 3% 3ᘀ 34 38 33 3% 3ᘀ 58 3' 3 33 3' 55 3' 37 3' 3' 3' 33 34 37 3 35 5' 3% 33 3 35 32 53 3ᘀ 34 37 3' 35 37 3% 55 33 33 3' 3' 32 3' 3 58 34 33 3% 32 3' 3ᘀ 3% 33 3ᘀ 34 32 3' 3% 5% 5' 3' 53 38 35 3 33 33 52 3' 38 53 5' 5 34 5' 3ᘀ 3ᘀ 33 3 3' 3' 34 37 3% 32 35 84 3' 33 3ᘀ 53 33 32 33 3% 37 37 3ᘀ 38 3ᘀ 3' 5' 33 3

ᘀ2 ᘀ ᘀ2 2ᘀ ᘀ ᘀ% 2ᘀ ᘀ ᘀ7 ᘀ7 ᘀ ᘀᘀ 24 ᘀᘀ ᘀ ᘀ ᘀ3 2 ᘀ4 8 ᘀ2 ᘀ4 24 ᘀᘀ ᘀ4 ᘀ ᘀ3 ᘀ7 ᘀ2 ᘀ ᘀ3 24 ᘀᘀ ᘀ' ᘀ2 ᘀ7 ᘀ ᘀ2 ᘀ3 ᘀ5 ᘀᘀ 24 ᘀ ᘀ2 ᘀ2 ᘀ4 ᘀ4 2ᘀ ᘀ% ᘀ% ᘀ4 ᘀ3 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ7 2ᘀ ᘀ 3 ᘀ2 ᘀ7 ᘀ' ᘀ 8 ᘀ ᘀ ᘀᘀ ᘀ5 ᘀ 8 ᘀ5 ᘀ5 ᘀᘀ ᘀ% 2ᘀ ᘀ2 ᘀ% 8 ᘀᘀ ᘀ7 ᘀ2 ᘀ2 ᘀ4 ᘀ2 ᘀ2 24 ᘀ ᘀ2 ᘀ2 ᘀ5 ᘀ5 ᘀ ᘀ% ᘀ2 ᘀ3 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ' ᘀ' 22 ᘀ% 8 ᘀ2 ᘀ' ᘀ3 8 ᘀ4 ᘀ2 ᘀ' ᘀ8 ᘀᘀ ᘀ5 ᘀ4 ᘀᘀ 2 ᘀᘀ ᘀ7 ᘀᘀ ᘀᘀ ᘀᘀ ᘀ4 ᘀ3 ᘀ7 ᘀ5 ᘀ 2ᘀ ᘀ2 ᘀ4 ᘀ5 ᘀ ᘀ% 24 ᘀ' ᘀ3 ᘀ7 ᘀᘀ ᘀ ᘀ7 ᘀ2 2 ᘀ4 ᘀ4 ᘀᘀ ᘀᘀ ᘀ% ᘀᘀ ᘀ5 ᘀ8 ᘀ3 ᘀ4 ᘀ2 ᘀ% ᘀᘀ ᘀ' ᘀ2 ᘀ4 ᘀ' ᘀ3 ᘀ% ᘀᘀ ᘀ2 22 2ᘀ ᘀᘀ 24 8 ᘀ ᘀ5 ᘀ4 ᘀ4 2% ᘀᘀ 8 24 2ᘀ 25 ᘀ3 2ᘀ ᘀ' ᘀ' ᘀ4 ᘀ5 ᘀᘀ ᘀᘀ ᘀ3 ᘀ7 ᘀ2 ᘀ% ᘀ 3 ᘀᘀ ᘀ4 ᘀ' 24 ᘀ4 ᘀ% ᘀ4 ᘀ2 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ' 8 ᘀ' ᘀᘀ 2ᘀ ᘀ4 ᘀ5

2 5 5 8 3 ᘀ 5 ' 8 4 4 4 5 ' 3 5 8 3 % 5 5 ' 8 3 % 8 3 2 3 8 3 ' % 8 5

4 ' 5 8 ' 5 5 ' ' 3 3 ' ' % ' 7 ' % 7 ' 5 % ' 5 % 5 5 3 ' 3 ' ' ᘀ 3 ' 8 % 8 ' 4 % ' 5 5 3 % 8 5 % 7 3 5 5 % % ' % 3 5 5 7 5 8 5 5 ' ' 2 ' 3 5 5 ' ' ' ' 7 5 5 5 3 5 5 5 3 5 ' 3 3 3 4 3 % 8 3 % 3 % ' ᘀ 3 4 5 ' 5 7 % % ' 5 3 5 7 % 7 8 5 3 ' ' 3 ' 5 3 3 ' 5 5 5 7 7 % % ' 3 3 5 5 4 % 3 3 % 3 5 5 8 ' 3 ' ' 3 3 ' 7 3 5 2 % 3 4 3 ' ' 5 5 5 8 5 3 5 % ' ' ' 3 5 5 8 5 2 ' ' 3 5 3 5 % 3 5 ' % 8 5 %

' 4 3 4 4 3 8 3 5 ᘀ 4 % % 4 4 3 3 3 ' % 3 5 3 % 3 8 5 5 5 5 2 8 8 3 5 3 3 3 3 % ᘀ 3 8 4 8 7 3 8 3 3 4 8 4 8 3 4 4 3 ᘀ 3 7 ᘀ 3 8 ' 2 5 ' 3 5 4 8 3 8 3 % 4 3 5 5 ᘀ 3 ᘀ 4 8 3 3 ᘀ % % % % 8 % 8 8 ' 8 8 % 8 8 8 ᘀ ' 4 4 ' 4 8 7 3 8 ' % 4 8 5 ' 5 3 5 8 3 3 ᘀ4 % 5 5 ' 4 2 5 ᘀ 8 7 8 ' 8 3 3 5 ' 8 3 5 % 2 8 % ᘀ 4 3 3 5 3 4 3 7 4 ' 2

8 % 3 ' 5 5 5 7 ' ' 5

%5 '4 '7 '4 52 5 5 %8 '2 %8 %8 5ᘀ '7 '3 '' 5ᘀ %' '5 '8 '2 57 %3 5 '8 54 '7 '% 'ᘀ 52 5' 54 '8 '7 'ᘀ 5 52 '5 '5 5ᘀ 'ᘀ '7 '8 5ᘀ 57 '7 '' %2 '2 % '5 5 '2 '% '2 %' %4 '' %5 ' '5 7 '% %2 54 '3 5 '% ' '2 %7 57 '' 52 57 '3 '8 %3 58 '8 '3 '7 ' '2 '8 '' '8 54 '8 '' '' '2 '% '3 52 '% '3 '4 ' 5ᘀ '2 5ᘀ 'ᘀ 55 '8 '5 '% 5% '' %4 ' 'ᘀ %3 %ᘀ 3 %' '3 '8 '4 54 %3 '5 '4 %2 '5 %5 '3 'ᘀ 54 'ᘀ 78 53 %3 '2 55 5 34 '% '% %2 %ᘀ '5 '7 '8 '% 5ᘀ '2 54 '' ' '7 '3 '4 '' %3 %4 55 '7 %3 73 52 '3 '3 %2 5 '3 57 '5 ' 55 54 52 5ᘀ 53 5 58 57 '2 '5 54 '3 55 5' '% 3 '7 '5 5 52 'ᘀ 5' '2 '2 '5 %2 54 %8 '5 78 '% 3% %2 '2 '% 5 5ᘀ 54 54

% 73 77 73 2% 25 25 78 7% 78 78 2' 77 74 7ᘀ 2' %ᘀ 7 28 7% 27 %4 25 28 23 77 72 7' 2% 2ᘀ 23 28 77 7' 25 2% 7 7 2' 7' 77 28 2' 27 77 7ᘀ %% 7% %5 7 25 7% 72 7% %ᘀ %3 7ᘀ % 75 7 '5 72 %% 23 74 25 72 75 7% %7 27 7ᘀ 2% 27 74 28 %4 ᘀ8 28 74 77 75 7% 28 7ᘀ 28 23 28 7ᘀ 7ᘀ 7% 72 74 2% 72 74 73 75 2' 7% 2' 7' 2 28 7 72 22 7ᘀ %3 75 7' %4 %' ᘀ5 %ᘀ 74 28 73 23 %4 7 73 %% 7 % 74 7' 23 7' %8 24 %4 7% 2 25 ᘀ3 72 72 %% %' 7 77 28 72 2' 7% 23 7ᘀ 75 77 74 73 7ᘀ %4 %3 2 77 %4 '4 2% 74 74 %% 25 74 27 7 75 2 23 2% 2' 24 25 ᘀ8 27 7% 7 23 74 2 2ᘀ 72 ᘀ5 77 7 25 2% 7' 2ᘀ 7% 7% 7 %% 23 78 7 %8 72 ᘀ2 %% 7% 72 25 2' 23 23

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

ĀȀ̀Ѐ Ԁ฀ༀࠀကᄀ <฀ࠀ;Ԁ฀:ࠀက᐀-ᄀ.9଀ࠀऀ᐀ᨀ ᤀ:‫؀‬+฀ሀऀࠀ=᐀-ᄀ.9଀ࠀऀ᐀Ā 24ᜀ54᐀Ḁ %ᜀᘀ8᐀Ḁ 4ᜀ 7᐀Ḁ %ᜀ8᐀Ḁ 4ᜀ7Ḁ Ā ᬀĀ ᰀᬀĀ ᰀᬀĀᴀ ᴀȀഀḀ਀ᔀἀጀఀࠀ Ԁ!ࠀ

73 %8 ' 2ᘀ 77 23 55 ᘀ% 8' ᘀᘀ ' "#$"%

ሀጀᄀ

ᘀ7644 ᘀ%6ᘀ% ᘀ76 7 ᘀ268% ᘀ263' ᘀ26%ᘀ ᘀ767% ᘀᘀ6%4 ᘀ26'8 &%$'(

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4

4 4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4

4

4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

ༀ ฀฀

36%4 36'' 36' 86ᘀ 3648 36%' 3627 367% 8677 "$)#

ࠀ᐀ᔀᘀᜀఀ᠀ᤀఀ Ԁ฀ༀࠀကᄀ 5642 '657 '63 56ᘀ% '652 '68% '6%% '6'3 '6'' '6%% 56 2 ($*+

()$*)

ሀጀᄀ

7ᘀ633 23644 77648 7 68% 7ᘀ685 74673 72643 7%655 72644 %&$&)

ᨀ

Ā

4464Ḁ 464Ḁ 4464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ ᘀᘀ65Ḁ 464Ḁ ᘀ368Ḁ 464Ḁ %6ᘀḀ 464Ḁ 4464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ &#$'+ᘀ '&$,"ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4

4

ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 % ' 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ' ' ' ' ' ' ' ' ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ4 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ7 ᘀ3 ᘀ3 ᘀ3 ᘀ3 ᘀ3 2ᘀ 2ᘀ 2ᘀ 2ᘀ 2' 2' 2' 2' 74 74 77 %ᘀ %ᘀ %' '4 '3

3 7 5 8 % 5 ' 7 ᘀ ' ' 7 % % ᘀ % 2 2 7 ' 5 % % % % % ᘀ 5 7 % % 7 5 % ' 3 2 ' % 5 7 % 5 ' 5 7 7 % % 2 ' 7 ' 7 % ' 2 3 ' ' 2 2 5 ' % % 7 2 ' 5 ' 7 % 2 % % 2 7 ' 5 3 5 7 ' 5 ' 7 % 5 3 ' ' 2 3 ' 2 5 % ' 4 5 8 ᘀ 7 5 2 7 % 7 5 ' % 2 7 7 3 % 7 ' ' 7 7 ' % 5 ' ' 5 ᘀ 2 2 7 % 2 ' % ᘀ % 4 % 5 5 % 5 % 7 3 7 3 ' 7 3 5 ' 7 7 % ᘀ % 7 5 % 7 % % 5 ' 3 5 3 ' ᘀ ' 7 ' % ' 5 8 ᘀ 2 7 ' 2 ᘀ 3 7 % 3 5 2 7 ' ' 2 8 8 % 3 ' ' ' % 7 ' % '

ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ 2 ᘀ ᘀ

ᰀᬀĀ

464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ '%68Ḁ '63Ḁ %568Ḁ 26ᘀḀ %367Ḁ 36ᘀḀ 464Ḁ 464Ḁ 4464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 4464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ %($#"ᘀ ',$(#ᘀ

ᰀᬀĀᴀ

464Ḁ 464Ḁ 76%Ḁ 464Ḁ 36ᘀḀ 464Ḁ 464Ḁ 464Ḁ 4464Ḁ *$*#ᘀ

ᬀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4

2 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ 4

4 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 ᘀ 4 4 4 2 ᘀ ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ ᘀ 4 4

2 2 ᘀ ᘀ 4 ᘀ ᘀ 4 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4 4 4 4

ᘀ

4 ᘀ 4 4 4 ᘀ

ᘀ ᘀ ᘀ 4 ᘀ ᘀ ᘀ 4 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

4

2

4

ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 2 4

ᘀ ᘀ 4 ᘀ 2 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ 4 ᘀ 4 4 4 ᘀ 4 4 4 ᘀ ᘀ ᘀ

4 4

4 4 ᘀ ᘀ

ᘀ ᘀ 4 2

4 ᘀ 4 4 4 ᘀ 4

ᘀ ᘀ

4

ᘀ ᘀ 4 ᘀ 2 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

ᘀ 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ

4

ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ 4 ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4

ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

ᘀ ᘀ ᘀ 2

4 4 4

ᘀ 4 ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ ᘀ 4 4

ᘀ

ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ ᘀ

%65% %6ᘀ' %633 %6'8 %624 %6' %643 %62' %6ᘀ% 768% %6'2 )$#"

ᘀ

4622 4678 46%' 46ᘀᘀ 4673 46%% 4675 4673 4675 4655 46ᘀ% ,$%)

4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 4 4

4 4 4

4 4 ᘀ 4 4

4 4 4

4 4 ᘀ 4

4

4

4 4

ᘀ 4 2

2

4 4 ᘀ

4 4 4 4 4

4 4 4 4

4 ᘀ 4 ᘀ

4 4

4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 ᘀ

4

4 4 ᘀ

4 2 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 2 4 4 4 ᘀ 4 4

4 4 4 4

4

4

4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 ᘀ ᘀ 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4

4 ᘀ 4 ᘀ 4 4 4 ᘀ

2 ᘀ

4 4

ᘀ 4 4 4 4

ᘀ ᘀ

4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4

4 4 4

4

4 4 4

4

4

ᘀ 4 4

4

4 4

4 4 4 4 ᘀ ᘀ 4 5 4

4 4 4 ᘀ 4 2 ᘀ 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

ᘀ 4

ᘀ 4 4 ᘀ

4 2

4

4 4 4

4

4 4 4 ᘀ

4 ᘀ

4 4 4 ᘀ 4

4 4

ᘀ 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4

4 ᘀ

4 ᘀ 4 4 ᘀ 4 4 ᘀ

4 4 4 ᘀ

4 4 2 4

4 ᘀ 4 4 ᘀ

4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

଀"9:ऀࠀ;ऀ਀‫؀‬

ࠀ᐀!"#$ἀ%&!Ā 6'2 6%ᘀ 6%' 6'' 6%ᘀ 62ᘀ 6'ᘀ 677 678 6%% 63 '$))

4 4 4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 ᘀ 4 4

ᘀ ᘀ ᘀ 4

4

4

4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 2 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4

ᘀ ᘀ

ᘀ 4 4 4

4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

ᘀ ᘀ

4 4

4 4 4 4

4 ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 ᘀ 4 ᘀ 4

ᘀ 4 ᘀ

2

4

4 4 4 4 4 ᘀ 4

ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 4 4 % 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 ᘀ 4 4 4 4 4

4 ᘀ ᘀ 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 ᘀ ᘀ ᘀ 4

ᘀ ᘀ 4 ᘀ ᘀ ᘀ

4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4

4 4 4 2 ᘀ 4 4 4 4 4

ᘀ

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 2 4 4 4 4 4 ᘀ 4

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

ᘀ

4

4 2 4 4 4 4

4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 ᘀ 4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

ᘀ

ᘀ 4 4 ᘀ 4

ᘀ 7

4

ᘀ 2 ᘀ ᘀ 2 ᘀ 2 2

ࠀ᐀!"#$ἀ'&ᄀԀ(฀ 4643 46 ' 464' 4648 46 46ᘀ 46 5 46ᘀ3 46 3 4648 4644 ,$'%

46'4 4673 46%' 46'2 46%% 4628 4673 46%' 4674 46'3 46%' ,$)'

ఀ̀ ഀ̀ ᬀᤀЀ**,!Ā -."/‫"؀‬#Ԁ$0,ࠀ᐀Ѐᨀ᐀ἀ

1

ȀԀ‫਀ऀࠀ܀‬ ࠀ᐀Ѐᨀ᐀ἀ

ᘀ36ᘀ% '675 7ᘀ65% ᘀ 644 ᘀ644 5635 ᘀ6' 3637 '657 %644 26 2 ''$)&

᠀ 4 4 4 4 4 4

ᘀ 4

ᘀጀᜀ ᬀĀ

଀ԀఀഀЀ̀฀ЀༀȀ̀ကᄀഀȀሀ̀ကጀ᐀ࠀЀᔀ଀ሀ଀฀Ѐ Ȁ̀ ЀԀ‫଀਀ࠀऀࠀ܀؀‬ ࠀ᐀ᘀЀᨀ᐀+ ,ࠀ᐀ᔀᘀᜀఀ᠀ᤀఀ )਀‫*܀‬,!Ā )᠀ᴀ᐀* ᬀᤀЀ**

ࠀ᐀!"#$ἀ'&ᄀԀ(฀ 1

46'4 4674 462 465% 462ᘀ 46%% 462' 4674 467 46 3 46'2 ,$%%

)᠀ᴀ᐀* 46'3 46%' 46'8 46'3 4654 467ᘀ 46%' 4677 46'ᘀ 467% 46%' ,$)+

34644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 32622Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ ''6'5Ḁ 22622Ḁ 5%644Ḁ 5%644Ḁ ''6'5Ḁ 32622Ḁ 44644Ḁ 22622Ḁ ᘀ%644Ḁ %4644Ḁ '4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 32622Ḁ 5 672Ḁ 44644Ḁ 5 672Ḁ ᘀ36%5Ḁ 356%4Ḁ ''6'5Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 32622Ḁ ''6'5Ḁ %3622Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 44644Ḁ 33638Ḁ '4644Ḁ ''6'5Ḁ 32622Ḁ 54644Ḁ 34644Ḁ 32622Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ 356%4Ḁ 34644Ḁ 77677Ḁ 5 672Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 5%644Ḁ %56 7Ḁ 3%65 Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ 3%65 Ḁ 5%644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ 55653Ḁ 3%65 Ḁ 5 672Ḁ 32622Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 356%4Ḁ 3%65 Ḁ %56 7Ḁ 32622Ḁ %4644Ḁ 32622Ḁ 32622Ḁ 5%644Ḁ %56 7Ḁ 3%65 Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ %56 7Ḁ 3%65 Ḁ 356%4Ḁ 3%65 Ḁ ''6'5Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 356%4Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ 5%644Ḁ '4644Ḁ 33638Ḁ 5%644Ḁ '4644Ḁ 356%4Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 32622Ḁ 356%4Ḁ 84644Ḁ ᘀ36%5Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 5 672Ḁ 5%644Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ 33638Ḁ 5 672Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 3%65 Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 356%4Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ 44644Ḁ ᘀ36%5Ḁ 5%644Ḁ 5%644Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 5%644Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ ᘀ36%5Ḁ 5 672Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 356%4Ḁ 356%4Ḁ 44644Ḁ 356%4Ḁ 5 672Ḁ %56 7Ḁ 33638Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 356%4Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 5 672Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 54644Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ ''6'5Ḁ 32622Ḁ 5 672Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ 33638Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 876 ᘀḀ 74644Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 3%65 Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ ᘀ36%5Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 256%4Ḁ ᘀ36%5Ḁ 44644Ḁ %56 7Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 34644Ḁ ''6'5Ḁ 3%65 Ḁ '4644Ḁ 3 63ᘀḀ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ 3%65 Ḁ 5 672Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 32622Ḁ 3%65 Ḁ

4

4

4 4

4 4 4 4 4 4 4

4

4 4 4 4 4 4 4

4

4 4

4

4

4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4

4 4

4

4

4

4

4 4 4

4

4 4 4 4 4

4

4 4 4 4

4

4

4 4 4

ࠀ=-:‫؀‬+ࠀ=᐀ ᠀ᤀ ᨀᤀ ‫܀‬Ԁऀሀ଀+଀;ऀ )਀‫*܀‬,!Ā ᬀᤀЀ** ࠀ᐀ᘀЀᨀ᐀+ ,ࠀ᐀ᔀᘀᜀఀ᠀ᤀఀ 4685 4683 644 468% 463' 4633 648 468 4684 6'4 4638 ,$+"

34633Ḁ 586 %Ḁ 3'6'Ḁ 5364Ḁ 586ᘀḀ 346%'Ḁ 53677Ḁ 58633Ḁ 58627Ḁ 556 ᘀḀ 586''Ḁ

''6'5Ḁ %%685Ḁ '363Ḁ '%6'Ḁ '36ᘀḀ 7ᘀ6 Ḁ %%637Ḁ 77644Ḁ ' 67'Ḁ 7%67%Ḁ %'6ᘀ%Ḁ

%4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ 22622Ḁ 5%644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 22622Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 22622Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 22622Ḁ 4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ ''6'5Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ 22622Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ ''6'5Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 44644Ḁ 4644Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ ''6'5Ḁ %4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ 4644Ḁ

ᬀᤀ

'ᘀ6%4Ḁ 44644Ḁ 3%65 Ḁ %%6%'Ḁ '4644Ḁ 3%65 Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ '6'5Ḁ %4644Ḁ ᘀ%644Ḁ 74644Ḁ '4644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ %56 7Ḁ '4644Ḁ ᘀ4644Ḁ 74644Ḁ 74644Ḁ 74644Ḁ 44644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ %4644Ḁ '4644Ḁ 74644Ḁ 5%644Ḁ ᘀ36%5Ḁ '4644Ḁ 32622Ḁ 256%4Ḁ ''6'5Ḁ 22622Ḁ 34644Ḁ 5 672Ḁ %4644Ḁ 74644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ 22622Ḁ ᘀ36%5Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 34644Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ 22622Ḁ 5%644Ḁ ''6'5Ḁ 5%644Ḁ 34644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 22622Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ ᘀ36%5Ḁ %4644Ḁ '4644Ḁ '4644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ ''6'5Ḁ 5 672Ḁ 32622Ḁ %4644Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ ᘀ4644Ḁ 22622Ḁ 5%644Ḁ %4644Ḁ %56 7Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ %56 7Ḁ ᘀ%644Ḁ 32622Ḁ %56 7Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ 74644Ḁ ᘀ36%5Ḁ ᘀ%644Ḁ %4644Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ ᘀ%644Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ '4644Ḁ ''6'5Ḁ 74644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ ᘀ36%5Ḁ ''6'5Ḁ 5%644Ḁ 74644Ḁ %4644Ḁ %56 7Ḁ 22622Ḁ 74644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 256%4Ḁ '4644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 5%644Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 74644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ 22622Ḁ %4644Ḁ ᘀ36%5Ḁ %4644Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 32622Ḁ 34644Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ ᘀ4644Ḁ '4644Ḁ ᘀ36%5Ḁ ᘀ36%5Ḁ 34644Ḁ 3%65 Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ %4644Ḁ ᘀ%644Ḁ 22622Ḁ %4644Ḁ 256%4Ḁ ᘀ36%5Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ '4644Ḁ 44644Ḁ 34644Ḁ %4644Ḁ %56 7Ḁ 74644Ḁ 5%644Ḁ '4644Ḁ '4644Ḁ ᘀ36%5Ḁ %4644Ḁ 5%644Ḁ %56 7Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 'ᘀ6%4Ḁ 44644Ḁ %4644Ḁ ᘀ%644Ḁ 22622Ḁ 34644Ḁ 22622Ḁ 3%65 Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 22622Ḁ 44644Ḁ 44644Ḁ 5%644Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ %4644Ḁ 7ᘀ63'Ḁ ''6'5Ḁ ᘀ%644Ḁ %4644Ḁ %4644Ḁ 44644Ḁ 22622Ḁ 22622Ḁ 34644Ḁ 256%4Ḁ 22622Ḁ ''6'5Ḁ 44644Ḁ '4644Ḁ 44644Ḁ 22622Ḁ '4644Ḁ 22622Ḁ

ᰀᤀ

ᬀᤀЀ**,!Ā -."/‫"؀‬#Ԁ$0,ࠀ᐀Ѐᨀ᐀ἀ ᘀ863'Ḁ ᘀ%6'2Ḁ 246ᘀḀ ᘀ865Ḁ ᘀ'68Ḁ 8657Ḁ ᘀ563 Ḁ 3644Ḁ ᘀ'647Ḁ 2 677Ḁ ᘀ5643Ḁ

'4653Ḁ 'ᘀ6 'Ḁ %'64Ḁ '26ᘀḀ ' 67Ḁ %3633Ḁ '76 3Ḁ '26 %Ḁ %868 Ḁ 5ᘀ645Ḁ '467'Ḁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat DIPLOMOVÁ PRÁCE. Bc. Naděžda Pirošová

Recommend Documents