MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Pavel MAZURA Molekulární determinace substrátové specifity u rostlinných betaglukozidáz

Disertační práce

Školitel: doc. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc Brno, 2008

Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Pavel Mazura Název disertační práce:

Molekulární determinace substrátové specifity u rostlinných betaglukozidáz

Název disertační práce anglicky:

Molecular determination of substrate specificity in plant beta-glucosidases

Studijní program: PřF D-B14 Biologie Studijní obor (směr), kombinace oborů: PřF MBBI Molekulární a buněčná biologie Školitel:

doc. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc

Rok obhajoby:

2008

Klíčová slova v češtině:

substrátová specifita, beta-glukozidáza, řízená evoluce, enzymová kinetika

Klíčová slova v angličtině:

substrate specificity, beta-glucosidase, directed evolution, enzyme kinetics

© Pavel Mazura, Masarykova univerzita, 2008

Poděkování

Rád bych poděkoval každému kdo jakýmkoliv způsobem přispěl nejen k této práci, ale i ke všemu dobrému co jsem za dobu kdy pracuji ve vědě poznal. Jmenovitě jsou to doc. Břetislav Brzobohatý, Dr. Lubomír Janda, Mgr. Radka Dopitová, Mgr. Tomáš Filipi, Dr. Kiran, Mgr. Radka Mazurová a mnozí další.

Abstrakt Substrátová specifita enzymů je klíčovou charakteristikou pro katalýzu biochemických reakcí v živých systémech. Předkládaná disertační práce je zaměřena na výzkum substrátové specifity rostlinných βglukozidáz. Tato skupina proteinů je velmi rozmanitá co se týče homologních enzymů, což umožňuje bioinformatickou analýzu současně s objasněním významu β-glukozidáz zahrnutých v mnoha důležitých procesech růstu a vývoje rostlin. Zejména je řešena otázka, jak je specifita těchto β-glukozidáz strukturně determinována na úrovni funkčních vztahů mezi klíčovými aminokyselinami, které tvoří vstup do aktivního místa enzymu. Modelovým enzymem používaným v této práci je β-glukozidáza Zm-p60.1 z kukuřice. Racionální design v proteinovém inženýrství β-glukozidázy Zm-p60.1 přinesl cenné výsledky o vlivu některých aminokyselin v aktivním místě na substrátovou specifitu. Tyto informace byly vyhodnoceny v kontextu strukturně funkčních dat z výzkumu příbuzných rostlinných β-glukozidáz za použití nových postupů pro popis substrátové specifity. Vzhledem k limitům racionálního designu byl navržen směr výzkumu zaměřený na hledání funkčních kombinací aminokyselin v aktivním centru Zm-p60.1 pomocí řízené evoluce proteinů. V rámci vývoje metody byl vyřešen postup syntézy speciálně degenerovaných primerů, včetně vývoje programu pro odhady vnášené aminokyselinové variability, a velikosti souboru generovaných klonů. Dále byl vyvíjen skríning mutantních klonů na základě glukozidázové aktivity. Přestože vývoj skríningu nebyl dokončen pro výskyt nespecifické aktivity náhodně aktivovaného Bgl operonu, bylo vyselektováno několik nových mutantních forem β-glukozidázy Zm-p60.1., které byly částečně charakterizovány. Pro popis substrátové specifity β-glukozidáz, případně jejich mutantů, je nutné určení jejich katalytických parametrů KM a kcat na umělých a přirozených substrátech. V rámci disertační práce byla vyvinuta metoda pro měření enzymové kinetiky průběžným fluorimetrickým stanovením glukózy jako produktu β-glukozidázové reakce. Pomocí této metody byly stanoveny katalytické parametry hydrolýzy přirozeného substrátu trans-zeatin-O-glukozidu, což přispívá k diskusi o roli β-glukozidázy Zm-p60.1 v hormonálních regulacích rostlin.

Abstract The substrate specificity is a key determinant for biochemical catalysis in living systems. The thesis is focused on substrate specificity research of plant β-glucosidases. This protein group includes a high number of homologous enzymes, which enables bioinformatic analysis as well as the basis for discussion about the involvement of these glucosidases in various developmental and growth processes in plants. The main discussed question in the thesis is how the specificity of plant β-glucosidases is structurally determined on the level of structure/function relationships between key amino acids involved in forming the entrance part to the active site. The model enzyme used in this research is a maize β-glucosidase Zm-p60.1 Rational design in protein engineering of β-glucosidase Zm.p60.1 revealed novel insights into determination of substrate specificity by individual amino acids of its active site. Using latest procedures of substrate specificity evaluation, these data were interpreted in the context of structure/function data from the research on related plant β-glucosidases. Taking into account limits of rational design, a new direction of research was introduced and focused on a search for functional combinations of amino acids in the active site of Zm-p60.1 using directed protein evolution method. For this method, procedure for producing specially degenerated primers was developed along with a software for amino acid variability and clone library extent estimation. Screening system based on β-glucosidase activity in mutated clones was being developed. In spite of the fact that development of the screening has not been finished yet due to occurrence of non-specific activity caused by randomly activated Bgl operon, several new Zmp60.1 mutants were produced and partially characterized. For the description of β-glucosidase substrate specificity, the catalytic parametres KM a kcat measured on artificial and natural substrates are necessary. Within the thesis a new method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides was developed. The method is based on continuous fluorimetric measurement of glucose released as a product in the course of reaction catalyzed by βglucosidase. Using this method, kinetic parameters of hydrolysis of trans-zetin-O-glucoside were obtained. These findings contribute to a continuous discussion about the role of Zm-p60.1 in plant hormonal regulation.

Obsah 1. Cíl práce

5

2. Úvod

6

3. Materiál a metody

18

4. Výsledky a diskuse

23

5. Závěry

59

6. Literatura

61

7. Seznam zkratek

65

8. Přílohy Příloha 1 manuscript: Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize β-glucosidase Zm-p60.1 Příloha 2 publikace : A new, senzitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides

Cíle disertační práce

Cílem práce bylo přinést nové poznatky o funkčním vztahu mezi molekulární strukturou rostlinných β-glukozidáz a jejich substrátovou specifitou. Měly být zhodnoceny výsledky získané řízenou mutagenezí aktivního centra modelové βglukozidázy Zm-p60.1 z kukuřice v kontextu strukturně funkčních dat z výzkumu příbuzných rostlinných β-glukozidáz. Pro nový směr výzkumu zaměřeného na funkční kombinace aminokyselin v aktivním centru Zmp60.1 bylo cílem vyvinout metodu řízené evoluce.V teoretické rovině měl být vyřešen postup syntézy speciálně degenerovaných primerů, včetně vývoje programu pro odhady vnášené aminokyselinové variability, a velikosti souboru generovaných klonů. V experimentální rovině měl být vyvinut postup skríningu na β-glukozidázovou aktivitu mutantů kompatibilní s postupem řízené evoluce. Pro charakterizaci specifity β-glukozidáz a jejich mutantů bylo záměrem vyvinout metodu umožňující měření kinetických parametrů β-glukozidáz na přirozených substrátech

Úvod Specifita je jednou z nejdůležitějších vlastností enzymové katalýzy. Na rozdíl od chemické katalýzy, která vykazuje pouze omezenou selektivitu, enzymová katalýza vykazuje tři úrovně specifity: specifitu pro reaktanty, pro příslušný typ chemické vazby podílející se na reakci a také pro vznikající produkty. Právě před padesáti lety v roce 1958 představil Daniel E. Koshland svůj model indukovaného přizpůsobení pro popis enzymové katalýzy (Koschland, 1958). Od té doby bylo získáno ohromné množství dat zejména v oborech rentgenostrukturní a NMR analýzy a rozsáhlého genomového sekvenování. Společným cílem těchto snah je mimo jiné porozumět velmi delikátnímu procesu rozpoznávání dvou molekulárních entit, které dynamicky a přece simultánně mění svou strukturu, což může vést až do stavu umožňujícího definovanou chemickou reakci. V "postgenomové éře" při dostupných znalostech může být dalším krokem návrat a aplikování těchto poznatků ku prospěchu hlubšího pochopení enzymové katalýzy z pohledu její specifity. Otázka, která by měla být zodpovězena, je role jednotlivých aminokyselinových residuí v rozpoznávání substrátu, vlastní katalýze a celkovém fungování enzymu. Předmětem našeho výzkumu jsou rostlinné β-glukozidázy. Tento model má dvě hlavní výhody. Za prvé rostliny na rozdíl od ostatních organismů mají díky rozsáhlému sekundárnímu metabolizmu a struktuře svých genomů mnohočetně zastoupené rodiny příbuzných proteinů. Tento fakt nám umožňuje využívání bioinformatiky k získávání informací ze srovnávání sekvencí případně struktur těchto příbuzných proteinů. Příkladem je genová rodina β-glukozidáz Arabidopsis thaliana zahrnující 46 členů (Xu et al., 2004). Otázkou zůstává do jaké míry jsou enzymy kódované touto skupinou genů specializované pro svou funkci. Za druhé převážná část β-glukozidáz má strukturu označovanou jako doména (β/α)8 barel. (β/α)8 barel je základní strukturní prvek mnoha proteinů. Přibližně 10% všech enzymů, u kterých byla určena struktura, obsahuje tento strukturní motiv, což je v porovnání s ostatními nejčastější výskyt a současně největší funkční diverzita (Rigden et al., 2003). Naše výsledky tedy mohou přispět k rozšíření poznání funkčních vztahů hlavní strukturní skupiny enzymů k substrátům. V širším pohledu patří glukozidázy do skupiny enzymů zapojených do metabolizmu sacharidů v anglofonní nomenklatuře označovaných carbohydrate-active enzymes zkráceně (CAZymes). Tyto enzymy jsou zodpovědné za syntézu a štěpení zejména oligo a polysacharidů, přičemž geny, kterými jsou kódovány, typicky zaujímají 1-5% genů organismu. Konjugáty sacharidů zejména oligo a polysacharidy hrají klíčovou roli v biologických procesech jako jsou uchovávání a distribuce energie, tvorba strukturních komponent, ale také jsou zapojeny v mnohých intra i intercelulárních signalizacích. Enzymy metabolizmu sacharidů jsou často zapojeny v interakcích imunitního systému, nebo v interakcích mezi hostitelem a patogenem, čímž se dostávají do souvislostí s chorobami jak živočichů tak rostlin. Enzymy metabolizmu sacharidů také hrají hlavní roli v biosyntéze a degradaci buněčné stěny rostlin představující největší objem fotosynteticky vázaného uhlíku na Zemi. Proto je na tyto enzymy často nahlíženo jako na klíčové v rámci různých průmyslových projektů například produkce biopaliv (Henrissat a Bairoch, 2007web). Zajímavým ukazatelem zájmu konkrétně o využití β-glukozidáz je 69 patentů, které se na ně vztahují, registrovaných u patentového úřadu USA (zdroj US Patent and Trademark Office ). Vymezení β-glukozidáz v rámci ostatních proteinů sacharidového metabolizmu Taxonomicky není snadné β-glukozidázy v rámci enzymů metabolizujících sacharidy správně zařadit. β-glukozidázy (EC 3.2.1.21) se funkčně vyčleňují ze skupiny glykozid hydroláz (EC 3.2.1.), které představují širokou skupinu enzymů hydrolyzujících glykozidickou vazbu mezi dvěma nebo více cukry, případně mezi cukrem a necukerným zbytkem molekuly (aglykonem). Podle 6

Mezinárodní unie pro biochemii a molekulární biologii (IUBMB) se glykozidázy dělí podle substrátové specifity případně podle molekulárního mechanizmu reakce. Tyto enzymy jsou však modulární a dělení na základě substrátové specifity neodráží sekvenční a strukturní příbuznost mezi proteiny. Ve snaze o vytvoření logického systému zařazení enzymů sacharidového metabolizmu vznikla databáze CAZy (CAZy; http://www.cazy.org). V rámci CAZy je zavedena klasifikace podle sekvenční podobnosti do proteinových rodin a podle trojrozměrné struktury bylo zavedeno další dělení rodin na tzv. klany. Toto rozdělení odráží fakt, že některé struktury proteinů jsou lépe konzervované než jejich sekvence (Henrissat a Davies, 1997; Henrissat a Davies, 2000). Po patnácti letech fungování je databáze široce přijímána vědeckou komunitou a tvoří jeden ze základních zdrojů informací o enzymech sacharidového metabolizmu. Současný stav (srpen 2008) zahrnuje klasifikaci do 280 proteinových rodin s více než 95 000 katalogizovanými enzymy. V rámci CAZy databáze patří β-D-glukozid-β-D-glukohydrolázy (EC 3.2.1.21) do skupiny glykozid hydroláz, která je v současnosti rozdělena do 112 rodin. β-glukozidázy patří do rodin GH1,3,9. Pouze v rodinách 1 a 3 jsou rostlinné β-glukozidázy, přičemž strukturu (β/α)8 barel mají jen glukozidázy v rodině GH1 a patří tedy s několika dalšími rodinami enzymů do strukturního klanu GH-A. GH1 rodina zahrnuje kromě β-glukozidáz také například β-galaktozidázy, β-manozidázy a několik dalších enzymů. Všichni zástupci této rodiny sdílejí kromě příbuznosti v sekvenci aminokyselin tyto základní charakteristiky: stejný mechanizmus reakce, s výjimkou myrozináz, stejný katalytický pár glutamových aminokyselin a terciární struktury (β/α)8 barel. V rodině GH3 nebyl určen fold zařazených proteinů. Katalytický pár aminokyselin je zde kyselina asparagová ve funkci nukleofilu a glutamová jako donor protonu. Mechanismus katalýzy β-glukozidáz Hydrolytické štěpení glukozidické vazby mezi aglykonem a cukrem katalyzované β-glukozidázami může probíhat dvěma mechanizmy, jejichž výsledkem je stejná nebo opačná anomerní konfigurace odstupujícího cukru. U všech zástupců rodiny GH1 probíhá reakce podle všeobecně přijímaného modelu katalýzy ve dvou krocích s dvojím přeskupením substrátu (Ly, 1999; McCarter a Withers, 1994). Klíčovou roli zde hraje katalytický pár glutamových aminokyselin vystupujících v reakci jako elektrofil a nukleofil. Při prvním kroku (glykozylaci) nejprve dochází k interakci substrátu s kyselým aminokyselinovým zbytkem a tím k jeho protonaci. Zatím co se destabilizuje glukozidická vazba, protilehlý nukleofilní karboxyl vytváří se substrátem tranzientní stav, který přechází na kovalentní intermediát za odstoupení aglykonu. V druhém kroku (deglykozylaci) karboxyl prvního zbytku deprotonuje vodu a vytváří přes její kyslík druhý transientní stav, po jehož rozpadu odstupuje glukóza v původní anomerní konfiguraci (Clarke et al., 1993). Glykozylační krok je limitující pro rychlost katalýzy a kcat je úměrná reaktivitě substrátu (Vallmitjana et al., 2001). Oba zbytky kyseliny glutamové vystupující v katalýze jako elektrofil a nukleofil jsou v β-glukozidázách konzervované v peptidových motivech TXNEP a ITENG. V sekvenci se katalytické aminokyseliny v rámci (β/α)8 barelu nacházejí na C koncích smyček 4 a 7 (obr. 2) a ve vzájemné vzdálenosti kolem 5 Å (Zouhar et al., 2001). Proteiny se strukturou (β/α)8 barel Doména (β/α)8 barel byla poprvé popsána u enzymu triózafosfátizomeráza, proto je nazývána také TIM barel. α šroubovice a β listy se vzájemně obtáčejí, takže tvoří strukturu podobnou cívce nebo prstenci. Paralelní β listy vyplňují vnitřní část prstence, zatímco α šroubovice tvoří vnější část včetně většiny povrchu molekuly (obr. 1). Doména (β/α)8 barel má obvykle kolem 250 aminokyselin, přičemž výjimky mohou být až kolem 1000 aminokyselin jako β-galaktozidáza s 1023 rezidui, kde TIM barel tvoří prostřední ze tří strukturních domén amino kyselinového řetězce (Wierenga, 2001). Existují dva základní topologické parametry barelových struktur a to n (označuje počet řetězců struktury β listu) a S (označuje číslo zkrutu). Číslo zkrutu souvisí s úhlem, který svírají β-listy s 7

Obr. 1 Terciární struktura podjednotky β-glukozidázy Zm-p60.1 jako demonstrace domény (β/α)8 (β -listy žlutá, α-šroubovice červená, smyčky zelená).

α4/1

C-C

α5/1 α5/2

α4

α3 β4

β5

α5 α6/1

β3

α2

β2

β6

β6/1 α6

α3/1

β1

β7

α1 α1/1

β8 α8

α7 α8/1

N C

Obr. 2 Schéma terciární struktury podjednotky bglukozidázy Zm-p60.1 (čtverce označují β-listy kruhy označují α-šroubovice, zlomky vybíhající smyčky).

Obr. 3 Schéma topologických parametrů domény (b/a)8 barelu n počet β-listů a S číslo zkrutu (plné kroužky značí rezidua směřující postranními řetězci dovnitř barelu, prázdné ven).

osou barelu, a vyjadřuje, jak jsou vůči sobě posunuty aminokyseliny v sousedních β-listech. Výsledný zkrut se sčítá přes všechny β-listy. Vzhledem k délce vodíkových vazeb, které spojují aminokyseliny v sousedících β-listech by měl být posun vždy o celý počet aminokyselin a tedy S by mělo být celé číslo (obr 3.). Všechny barely s konfigurací (n = 8, S = 8) jsou TIM barely. V rámci TIM barelů v případě, že n = 8 téměř vždy S = 8 (Nagano et al., 1999). V barelech s konfigurací (n = 8, S = 8) postranní řetězce aminokyselin v β-listech tvoří vrstvy kolmé na osu barelu. Každá vrstva je tvořena čtyřmi residui a tyto postranní řetězce jsou směrovány střídavě v každé vrstvě buď dovnitř barelu nebo ven proti okolním α šroubovicím. Tato vlastnost způsobuje, že barely mají čtyřčetnou symetrii namísto osmičetné z pohledu podél osy barelu (Nagano et al., 1999). Ze symetrie vyplývá, že nejmenší strukturní jednotka je βαβα motiv. Na motivy tohoto druhu se lze dívat jako na struktury dále složené z jednodušších fundamentálních smyček, které díky svým fyzikálním vlastnostem mohou sloužit jako základní stavební prvky všech proteinů (Berezovsky et al., 2003). Motiv βαβα řeší napojení dvou paralelních řetězců β-listů přes α-šroubovici a dvě spojovací smyčky. Smyčky spojující karboxy konec β-listů s amino koncem αšroubovic jsou variabilní co do délky i aminokyselinové sekvence. Tyto smyčky tvoří aktivní místo obvykle ve tvaru nálevky. Kromě podílu na tvorbě aktivního centra, tvoří rovněž styčné plochy mezi podjednotkami, a tím umožňují tvorbu kvarterních struktur molekuly. Naproti tomu smyčky spojující karboxy konec α-šroubovic s amino konecem β-listů jsou většinou krátké a netvoří další struktury. Vedle známých domén jako jsou P-smyčka, kterou obsahují trifosfát hydrolázy, Rossmanův fold vážící NAD(P), Feredoxinu a flavodoxinu podobné domény a H motiv ribonukleázy patří (β/α)8 barel pravděpodobně k nejstarším dosud známým proteinovým strukturám (Ma et al., 2008). Enzymy s (β/α)8 barel doménou se vyskytují v pěti ze šesti hlavních katalytických kategoriích podle klasifikace enzymů pouze s výjimkou ligáz. Aktivní místa enzymů jsou lokalizována na C-terminální straně centrálního β-barelu. Konzervované sekvence aminokyselin 8

stejně jako sekundární terciární a kvarterní struktura jsou silnými argumenty pro možný společný původ mnohých členů rodiny enzymů se strukturou (β/α)8 barel (Henn-Sax, 2001; Vega, 2003). Poslední výzkumy ukazují, že evolučním předchůdcem (β/α)8 barelu mohl být (β/α)4 barel, k jehož zdvojení došlo genovou duplikací (Hocker, 2004). Tomu by napovídala i skutečnost, že nejvíce hydrofobní oblast (β/α)8 barelu neleží, jak by se dalo očekávat, uvnitř β-barelu, ale ve vrchní vrsvě mezi β-listy α-šroubovicemi (Nagano, 1999). U enzymu enolázy dokonce v rámci β-barelu exisuje hydrofilní tunel ústící z obou stran na povrch proteinu (Wierenga, 2001). Nové poznatky o konstrukci a evoluci proteinů se strukturou (β/α)8 barel dávají nový rozměr možnostem jejich proteinového inženýrství jak pro další výzkum tak pro průmyslové aplikace. Funkce glykozidáz a jejich specifita. Vzhledem k obrovskému bohatství různých sacharidů v biosféře není divu, že tento fakt odráží i velké množství proteinů regulujících jejich metabolizmus. Co se týče glykozidáz například genom Arabidopsis thaliana obsahuje 379 genů pro glykozidázy patřících do 29 rodin podle Cazy (Henrissat a Davies, 2000). V rostlinách se tyto glykozidázy účastní obrovského počtu různých reakcí, které můžeme uměle rozdělit na tyto oblasti: metabolizmus buněčné stěny, biosyntéza a remodulace glykanů, metabolizmus energetických rezerv, obranné systémy proti patogenům, procesy zapojené v symbióze, sekundární metabolizmus, hormonální metabolizmus a metabolizmus glykolipidů (Minic, 2008). Glykozidázová rodina GH1 je dobrým výchozím bodem pro studium diverzity substrátové specifity glykozidáz. Přes sekvenční a strukturní podobnost rodina obsahuje široký soubor enzymů velmi rozdílných ve své specifitě vůči substrátům. Obecně se o těchto enzymech dá říct, že všechny katalyzují štěpení glykozidické vazby mezi pyranozovým glykonem a aglykonem, ale většinou mají malou specifitu pro aglykon nebo pro konfiguraci vazby. Dokonce ani specifita pro glykon není absolutní (Hill a Reilly, 2008). Vyčleníme-li podskupinu rostlinných β-glukozidáz, lze říct, že se účastní kromě metabolizmu glykolipidů a glykanů všech zmíněných oblastí rostlinného metabolizmu. Takto různorodé pole působnosti samozřejmě klade různé nároky na specifitu těchto enzymů. Zejména v případě procesů obrany proti patogenům a hormonálního metabolizmu jde o reakce vyžadující vysoký stupeň specifity (Verdoucq et al., 2004; Minic, 2008). β-glukozidáza Zm-p60.1 Naším modelovým proteinem pro studium substrátové specifity rostlinných β-glukozidáz je kukuřičná β-glukozidáza Zm-p60.1. β-glukozidáza byla původně izolována z extraktu kukuřičných koleoptilií při hledání komponent signální dráhy fytohormonu auxinu. Protein o podjednotkové hmotnosti 60 kD byl označen pomocí metody fotoafinitního značení derivátem auxinu (Campos et al., 1993). Izolovaný protein byl podroben digesci trypsinem pro určení aminokyselinové sekvence štěpů. Na základě zjištěné sekvence byla z rostliny vyizolována příslušná mRNA a reverzní transkripcí připravena cDNA Zm-p60.1. Pomocí PCR byla sekvence dále upravena (odstraněn signální peptid) a naklonována do expresního vektoru pRSET. Tím byla na konec proteinu napojena hexahistidinová doména pro umožnění purifikace pomocí metalochelatační chromatografie (Zouhar et al., 2001). Označení výsledného konstruktu je pRSET::(His)6Zm-p60.r. cDNA obsahující stejný čtecí rámec byla nezávisle klonována, sekvencována a uložena v databance jako Zm-Glu1 alozym Zm-p60.1 (Esen, 1995; uloženo GenBank). Sekvence Zm-Glu1 začíná o 5 aminokyselin blíže k Nkonci proteinu, z čehož plyne posunuté číslování aminokyselin. Substrátová specifita β-glukozidázy byla testována ještě předtím, než se enzym podařilo identifikovat a naklonovat do bakteriálního expresního systému a to použitím β-glukozidázy izolované přímo z kukuřice. Testováno bylo několik umělých i přirozených substrátů. Jako nejlepší substráty byly označeny 4-metylumberliferyl-β-D-glukozid (MUG), p-nitrofenyl-β-D-glukozid (PNPG), p-nitrofenyl-β-D-fucopyranozid. Jako substrát byl označen také 2,4-dihydroxy-7-metoxy1,4-benzoxazin-3-one glukozid (DIMBOAG). Zajímavým zjištěním rovněž bylo, že diglukozidy s 9

navázaným aglykonem jako PNP-celobiosid nebo PNP-laktozid byly štěpeny (Babcock a Esen, 1994). Jak se ukázalo při fotoafinitním značení, β-glukozidáza váže auxin (IAA), proto byly testovány konjugáty fytohormonů, ale IAA-glukóza ester štěpen nebyl. Hydrolyzovány byly transzeatin-O-glukozid (ZOG) a kinetin-N3-glukozid (K3G) na rozdíl od cytokinin-N7 a N9-glukozidů, které štěpeny nebyly (Brzobohatý et al., 1993). Pozdější práce na purifikovaných rekombinantních proteinech vedly ke stanovení kinetických parametrů některých přirozených substrátů in vitro: DIMBOAG KM = 0,098 mM, kcat = 29,16 s-1 (Cicek et al., 2000 ), ZOG KM = 0,697 mM, kcat = 4,58 s-1 (Mazura et al., 2006 Příloha disertace 2). Pro ZOG byla rovněž stanovena KM = 0,062 mM in vivo v chloroplastech tabáku (Kiran et al., 2006). Katalytické parametry umělých substrátů PNPG a MUG se stanovovaly vícekrát v rámci různých projektů, poslední měřené hodnoty jsou PNPG KM = 0,68 mM, kcat = 42,8 s-1, MUG KM = 0,148 mM, kcat = 53.6 s-1 (Dopitová nepubl., příloha disertace 1). Zjištěné katalytické parametry naměřené na přirozených i umělých substrátech podněcují diskusi o fyziologické roli této β-glukozidázy. Jde zejména o zapojení β-glukozidázy Zm-p60.1 do regulace hormonálního metabolizmu rostlin na jedné straně a funkci v systému obrany proti patogenům na straně druhé. Schopnost hydrolyzovat některé konjugáty cytokininů jako ZOG, K3G umožňuje cílené uvolňování aktivních cytokininů z jejich zásobních a transportních forem, a tím modulaci klíčových procesů řízení vývoje a růstu rostlin (Brzobohatý et al., 1993). Uvolňování aktivních forem cytokininů zároveň dělá ze Zm-p60.1 jedinečný nástroj pro studium závislostí fyziologických odpovědí rostliny na jemném nastavení hladin aktivních cytokininů (Kiran et al., 2006). Velmi dobrým substrátem je rovněž DIMBOA glukozid, kdy se odštěpením glukózy uvolňuje toxický aglykon DIMBOA (Babcock a Esen, 1994). Tato skutečnost podnítila spekulace o možném zapojení Zm-p60.1 do obranyschopnosti rostlin vůči patogenům v případě, že by se účast Zm-p60.1 na štěpení DIMBOAG podařilo prokázat i in vivo. Kvalitativně nový pohled na funkční vztahy β-glukozidázy a jejích substrátů přineslo vyřešení terciární a kvarterní struktury pomocí rentgenové difrakce (Czjzek et al., 2000; Vévodová et al., 2001; Zouhar et al., 2001). Informace přímo spojené se substrátovou specifitou přinesly struktury kokrystalů se sustrátem DIMBOAG a kompetitivními inhibitory aglykonem DIMBOA a dhurrinem (Czjzek et al., 2000), sirným analogem substrátu p-nitrofenyl-b-D-thioglukozidem (Czjzek et al., 2001) a analogem reakčního intermediátu gluko-tetrazolem (Verdoucq et al., 2004). Aktivní centrum β-glukozidázy Zm-p60.1 je stejně jako u ostatních proteinů se strukturou (β/α)8 barelu tvořeno variabilními smyčkami na C-terminální straně barelu a má tvar zploštělé nálevky zanořující se přibližně do jedné třetiny průměru proteinu. Spodní část aktivního centra tvoří aminokyseliny interagující s cukernou částí substrátu. Ve střední části je umístěn katalytický pár glutamových kyselin E186 a E401. Vstupní část aktivního centra má tvar štěrbiny o délce 23 Å a šířce od 7.1 Å do 7.6 Å. V této části se nacházejí aminokyseliny interagující s aglykonem substrátu. Jsou to zejména F193, F200, F461 a W373, kde z jedné strany štěrbiny interagují aromatické kruhy fenylalaninů s vmezeřeným aglykonem pomocí van-der-Waalsovské interakce a z druhé strany tryptofan prostřednictvím π-interakce aromatických kruhů. Specifická konformace těchto aminokyselin a celkový tvar aktivního centra jsou pokládány za určující faktory substrátové specifity Zm-p60.1 (Czjzek et al., 2000; Zouhar et al., 2001).

Řízená evoluce proteinů Pokud na jakémkoliv místě použijeme termín evoluce, máme vždy na mysli postupný vývoj nějakého většinou biologického systému do stavu, který se vyznačuje změnou určité charakteristiky nebo dokonce nabytím charakteristiky zcela nové. Co se týče proteinů popisovat jejich evoluci tímto způsobem není úplně přesné vzhledem k jejich molekulární stavbě. Proteiny jsou polymery tvořené řetězcem aminokyselin. Vzhledem k tomu, že máme dvacet standardních aminokyselin, které následují v řetězci za sebou, počet jejich kombinací je mocnina při základu 20 s exponentem rovnajícím se délce řetězce. Běžná délka proteinů se pohybuje kolem 300 aminokyselin, počet 10

kombinací tedy může představovat 20300. Na evoluci proteinů bychom tedy mohli pohlížet jako na výběr z velmi velkého, ale konečného souboru variant. Kombinatorická bohatost proteinů Výše zmíněná představa o množině možných kombinací aminokyselin v proteinech je atraktivní, protože navozuje pocit, že existuje jakási vyčerpatelná množina kombinací a tedy, že pole pro evoluci je dobře definované. Problémem tohoto přístupu je podcenění velikosti této množiny. 20300 je velké číslo, ale až při srovnání s čísly, které odhadují reálné veličiny, bude tato velikost zřejmá. 20300 odpovídá přibližně 2x10390 kombinací. Kapacita hard disků současných počítačů je 1x1012 bitů, počet buněk v lidském těle asi 1x1014, doba trvání vesmíru asi 4,3 x 1017 sekund, vesmír obsahuje asi 5 x 1022 hvězd. Pozorovatelný vesmír má objem asi 1 x 1080 m3, přičemž obsahuje asi 1x1080 částic. (zdroj Wiki) Je tedy zřejmé, že čísla řádově přesahující tento počet nemají fyzikální rozměr ve smyslu počtu nějakých skutečných entit, ale mohou být dosažena jen počítáním operací s konečným souborem prvků. Je tedy otázka, kolik sekvencí proteinů o této délce se mohlo reálně v průběhu evoluce objevit. Jako velmi hrubý odhad lze použít výpočet, kolik proteinů by se dalo vytvořit, pokud bychom všechnu energii ze Slunce dopadající na povrch Země za dobu její existence, použili k syntéze proteinů dnes známým způsobem. Takto hrubým výpočtem se dopočítáme k číslu asi 1x1050. Je vidět, že přestože zanedbáme všechny ostatní aspekty a připustíme absurdity, například že budeme měnit všechny proteiny ve všech organismech za spotřeby veškeré dostupné energie, množina sekvencí, které takto získáme, je asi o 240 řádů menší než množina všech kombinací, které jsou možné. Ve skutečnosti bude samozřejmě počet vyzkoušených kombinací ještě mnohem menší. Nutností je stabilita organizmů znemožňující rychlé a rozsáhlé změny v proteomu (Zeldovich et al., 2007). Množina funkčních proteinů bude jistě zlomkem množiny kombinací aminokyselin. Co všechno ale ve skutečnosti sekvence proteinu kóduje? Primární sekvence proteinu určuje jeho strukturu, a tím funkci, ale poslední výzkumy ukazují, že tento vztah není jednoduše uchopitelný. Bylo známo, že do značné míry rozdílné sekvence mohou kódovat dosti podobné struktury, na druhou stranu velmi podobné sekvence mohou kódovat značně rozdílné struktury (Alexander et al., 2007). Neboli jak daleko je v prostoru kombinací od jednoho funkčního proteinu k dalšímu, se dá těžko říct. Rovněž je nesnadné určit roli jednotlivých aminokyselin ve sbalování a současně funkci proteinu. Hranice počítačové simulace Pokud vycházíme z toho, že vzhledem k nesmírné kombinatorické bohatosti proteinů ve vesmíru nikdy nedojde k vyzkoušení většiny možných variant, následuje logická otázka. Můžeme fungování proteinů simulovat na počítači? Tuto otázku rozdělím na dvě podotázky. První se týká našich znalostí proteinů. Abychom mohli efektivně simulovat nějaký proces, musíme mu dostatečně porozumět. Základním procesem pro fungování jakéhokoliv proteinu je skládání řetězce aminokyselin do sekundární, terciární popřípadě kvarterní struktury. Výzkum sbalování proteinů neboli foldingu se snaží popsat základní procesy v termínech konformace, intramolekulární interakce a celkové potenciální energie dané struktury. Již od sedmdesátých let minulého století bylo jasné, že proteiny při hledání stabilní konformace neprohledávají celý prostor možných konformací, protože vzhledem k vysokému počtu stupňů volnosti představuje množinu o velikosti přibližne 1 x 10143 (Levinthal, 1968). Tak velký počet možností by protein nebyl schopen konformačně prohledat ani za dobu trvání vesmíru. Bylo tedy jasné, že jde o proces, který rychle navádí protein k finální konformaci. V současnosti je věnována studiu procesu foldingu velká pozornost. Folding je studován z pohledu celkové konformační energie daného proteinu neboli hledání lokálních minim na hyperploše potenciální energie. Tento proces je nesmírně počítačově náročný, protože hyperplocha má rozsah 3N dimenzí, přičemž N je počet všech atomů proteinu a hydratační obálky. Fakticky není v současnosti pro žádný protein známa celá hyperplocha potenciální energie (Frauenfelder, 2002). V poslední době se 11

projevuje snaha zjednodušit problém foldingu pomocí homologií za využití informací z vyřešených 3D struktur proteinů. Tímto postupem se dá odhadnout které podobné konformace budou stabilní (Berezovsky, 2003). Vzhledem k počítačové náročnosti se pro výpočty foldingu používá distribuovaných systémů využívajících počítačů dostupných na internetu (např. Rosetta@home). Zcela novým přístupem pro řešení foldingu je projekt Foldit testující využití schopnosti lidského mozku řešit prostorové rébusy a možnost skládat proteiny formou hry. Pokud by lidští řešitelé byli úspěšnější než současné programy, budou poznatky z projektu implementovány do nové generace software, který by mohl být v řešení foldingu mnohem rychlejší (program foldit University of Washington http:// fold.it/portal/adobe_main). Přes značné pokroky je skládání proteinů stále ne zcela pochopený jev a jeho simulace je velmi náročná zejména proto, že zahrnuje tisíce mezimolekulárních interakcí současně působících k uspořádání proteinu do správné funkční konformace. Druhá podotázka se týká výpočetních možností samotného počítače použitelného pro simulaci. Základními charakteristikami počítače je paměť a rychlost, s jakou je schopen s daty v paměti vykonávat zadané operace. Protein popsaný souřadnicemi atomů zabírá asi 1MB paměti. Pro každý z atomů je třeba počítat sílu interakce s ostatními atomy, přičemž složitost výpočtu se řídí výběrem interakční vzdálenosti a úrovní teorie popisu interakce. Mezní výpočet tedy činí zahrnutí všech atomů a popis interakce na úrovni kvantové mechaniky ab inicio. V kroku výpočtu se pak změní pozice atomů a celý výpočet se opakuje dokud nedojde k ustálenému stavu systému charakterizovanému minimem energie. Na takto vypočítané struktuře lze dále řšit interakce s dalšími molekulami například formou dockingu substrátu do aktivního místa enzymu. Tím se lze dopátrat k základním údajům o možné funkčnosti daného proteinu. Z uvedeného je vidět, že výpočetní nároky jsou velké a i v případě velmi razantního zjednodušení problému budou stále nedosažitelné vyjma velmi malých peptidů. Kdy tedy budou dostupné počítače pro skutečné funkční prohledávání kombinatorického prostoru proteinů? Počítače v roce 2008 dosahují běžně taktovací rychlosti procesoru kolem 3GHz s pamětí kolem 300 GB. Nejrychlejší superpočítač je v současnosti IBM Road runner (Los Alamos National Laboratory) jehož maximální rychlost je 1,7 peta FLOPS (1,7x1015 operací s pohyblivou čárkou za sekundu), paměť počítače je 103,6 TiB (tera binary byte). Nelze předpovědět, jaký další vývoj se bude odehrávat v konstrukci počítačů, ale stejně jako každý jiný fyzikální systém bude vývoj počítačů limitován základními zákony fyziky. Pokud bychom si představili počítač o hmotnosti jednoho kilogramu a objemu jeden litr, který by veškerou svou hmotu využíval jen pro výpočet a uchovávání informace, tak rychlost takového počítače by byla 2mc2/πh= 5,4258 x 1050 logických operací za sekundu při maximální paměti 1 x 1031 bitů. Přitom by se takový počítač musel nacházet ve stavu s nulovou entropií a vnějšímu pozorovateli by se jevil jako těleso o teplotě miliardy stupňů Kelvina (Lloyd, 2000). Ani kdyby se k výpočtu použila výpočetní kapacita celého vesmíru 1x10120 operací za sekundu na 1 x 1090 bitech informace (Lloyd, 2002), nebyla by to výpočetní kapacita zdaleka dostatečná alespoň na zobrazení všech proteinů neřkuli k nějakým výpočtům na nich. Kombinatorická složitost a možnosti výpočetní techniky tvoří rámec, ve kterém se pohybujeme při vývoji metod pro řízenou evoluci proteinů. Pochopení základních principů fungování proteinů je jediným způsobem jak obejít prakticky i teoreticky nepřekonatelnou propast mezi počtem námi testovaných proteinových variant a jejich celkovým množstvím. Výzkum β-glukozidáz metodami řízené evoluce tedy může přispět k poznatkům do jaké míry jsou sekvence enzymů této skupiny spjaty se strukturou a funkcí proteinů které kódují, neboli do jaké míry jsou tyto sekvence v rámci evoluce unikátní.

12

Metoda řízená evoluce Řízená evoluce je používaná v rámci proteinového inženýrství k vývoji proteinů nebo i RNA se změněnými vlastnostmi. Pro tento účel jsou cíleně využívány procesy diverzifikace genetické informace a následně selekce úspěšných variant. Metoda napodobuje přírodní děj evoluce, i když použitím moderních metod vytváření genetické variability a zejména selekcí na podmínky, které se v přírodě nevyskytují, dochází k vytváření molekul, které by přírodní evolucí vzniknout nemohly, jsou však mnohem lépe použitelné v průmyslových aplikacích. Typický experiment využívající řízené evoluce zahrnuje tři kroky: 1.) Vytvoření genové variability. Za pomoci plejády dnes známých postupů je gen kódující protein našeho zájmu náhodně mutován, případně rekombinován. Takto je vytvořena rozsáhlá knihovna genových variant. Základními technikami jsou zde error -prone PCR a DNA shuffling. 2.) Selekce úspěšných variant. Na základě různých charakteristik je knihovna genových variant podrobena skríningu nebo selekci. Na základě skríningu je možné rozlišit a izolovat úspěšné varianty, zatímco selekce přímo eliminuje neúspěšné varianty nebo alespoň omezuje jejich výskyt. 3.) Namnožení úspěšných variant identifikovaných v rámci skríningu nebo selekce, což umožňuje jejich charakterizaci sekvencováním DNA a identifikaci vzniklých mutací. Souhrnně bývají tyto tři kroky označovány jako kolo (zdroj přehledu Wiki). Většinou jsou experimenty vícekolové, přičemž úspěšné varianty z předchozích kol experimentu slouží jako základ pro novou genovou knihovnu. Nakonec jsou takto získané proteiny charakterizovány některou biochemickou metodou (obr. 4). F. Arnold definovala čtyři podmínky, které musí splňovat úspěšný projekt založený na řízené evoluci: 1. funkce proteinu, ke které projekt vede by měla být fyzikálně možná; 2. funkce by měla být možná biologicky nebo evolučně ve smyslu existence mutační cesty mezi původním proteinem a výsledným proteinem, přičemž by mělo jít o posloupnost stále se zlepšujících variant; 3. mělo by být možné vytvořit knihovnu dostatečně rozsáhlou k pokrytí vzácných pozitivních mutací; 4. musí existovat velmi rychlá metoda skríningu nebo selekce postavená na detekci hledané funkce (Arnold, 2003, s.v). Dnes by se daly podmínky úspěšného experimentu řízené evoluce přeformulovat do dvou klíčových otázek. Jak efektivně prozkoumávat prostor proteinových sekvencí a jak generovat vysoce kvalitní mutační knihovny, které by umožnily identifikovat zlepšené varianty genů pomocí dnes dostupných technologií skríningu. Vysoce kvalitní mutační knihovny mohou být generovány pomocí vylepšených metod náhodné mutageneze. Generovaná variabilita může být pomocí počítačových metod omezena na aminokyseliny s největší pravděpodobností pozitivního výsledku (Wong et al., 2007).

13

Obr. 4 Schéma základních kroků řízené evoluce proteinů

Vývoj metod pro měření kinetických parametrů β-glukozidáz na přirozených substrátech Základní informací pro popis jakéhokoliv enzymu je určení závislosti rychlosti jím katalyzované reakce na koncentraci daného substrátu. U vratných reakcí závisí pozorovaná reakční rychlost na momentální koncentraci všech zúčastněných reaktantů i produktů. V průběhu reakce se její rychlost snižuje, a to vlivem poklesu koncentrace substrátu, zejména u reakcí s vysokou rovnovážnou konstantou, a také zvyšováním rychlosti zpětné reakce v případech, kde je významná. V přirozeném prostředí enzymy nebývají v podmínkách, kde by koncentrace produktu byla nulová, navíc mohou být ve složitých vztazích k dalším látkám v rámci metabolizmu. Tyto složité souvislosti znemožňují přímé určování reakční rychlosti in vivo, a byl proto zaveden koncept počáteční reakční rychlosti v0 . v0 je definovaná jako rychlost reakce v čase 0, kdy je koncentrace produktů reakce nulová. v0 = lim v pro t → 0. Takto definovaná reakční rychlost je měřena při stanovených podmínkách in vitro. Reakční model vycházející z podmínek měření v0 je tedy následující: k1 k2 E + S ⇔ ES → P + E k-1 Uvažujeme situaci, kdy na počátku reakce není přítomen žádný produkt a zpětná reakce produktu tedy neprobíhá. Odvozením z tohoto modelu získáme vztah pro počáteční rychlost ve tvaru rovnice Michaelise a Mentenové:

v0 =

V lim[S ] K M + [S ]

Závislost v0 na koncentraci substrátu má tvar rovnoosé hyperboly s posunutým počátkem. Hyperbola se blíží při vysokých koncentracích substrátu k limitní rychlosti Vlim. Michaelisova konstanta KM má hodnotu a rozměr koncentrace substrátu, při které počáteční 14

rychlost odpovídá polovině limitní rychlosti. Hodnota KM je nezávislá na koncentraci enzymu na rozdíl od Vlim, jejíž hodnota je koncentraci enzymu přímo úměrná. Pokud vydělíme Vlim koncentrací enzymu, získáme katalytickou konstantu kcat nebo též číslo přeměny enzymu. kcat vyjadřuje, kolik molekul substrátu je přeměněno jedním reakčním centrem enzymu za časovou jednotku za podmínky nasycení enzymu substrátem. Experimentální určování hodnot KM a Vlim u β-glukozidázy Zm-p60.1

Pro každý pár enzym-substrát jsou Michaelisova konstanta a katalytická konstanta základní charakteristiky a umožňují kvantifikovat míru substrátové specifity. Při studiu katalytických vlastností β-glukozidáz vycházíme z následujícího reakčního schématu: β-glukozidáza aglykon-O-glukozid aglykon + glukóza Teoreticky můžeme tedy při reakci sledovat úbytek substrátu glukozidu nebo přírůstek produktů buď aglykonu nebo glukózy. Přirozené substráty Vývoj metod pro měření KM a Vlim na přirozených substrátech.

Základním problémem při snaze o měření přirozených substrátů je hledání analytické metody, kterou by bylo možné přesně měřit přírůstek některého z produktů za podmínek, ve kterých glukozidázová reakce probíhá. Teoreticky je možné měřit i úbytek substrátu, ale prakticky je měření produktů experimentálně přístupnější a přesnější. V našem případě bylo nutné zachovat podmínky měření při standardní teplotě 30 ˚C při pH 5,5 udržovaného pufrem ve složení citrát/fosfát. Vzhledem k faktu, že aglykon přirozeného substrátu ani glukóza nemění po odštěpení spektrální vlastnosti, není možné pro měření použít klasické spektrofotometrické nebo fluorometrické metody. Proto byly testovány jiné přístupy. Zde ve výčtu uvádím jak ty, na jejichž testování jsem pracoval, tak rovněž fakta z literatury. ITMC Izotitrační mikrokalorimetrie Metoda měří tepelné zabarvení reakce. Velice elegantní metoda na rozdíl od spektrálních metod, není třeba řešit změnu složení reakční směsi, ale pouze množství vydaného nebo spotřebovaného tepla. Prakticky se provádí přidáváním enzymu nebo substrátu do dokonale vytemperovaného roztoku a měřením teplotních změn reakční směsi proti kontrole. Metodu jsme testovali na kombinaci β-glukozidáza Zm-p60.1 a substrát PNPG na přístroji ITMC (Isothermal Titration Calorimeter CSC 4200, Calorimetry Sciences Corp., USA). Ve spolupráci s Loschmidt Laboratories. Z naměřených dat vyplynulo, že tepelné zabarvení reakce je natolik nízké, že při současných možnostech instrumentace ITMC je reakce neměřitelná. Pokud by vývoj instrumentace dospěl k řádově větší citlivosti, stala by se zřejmě ITMC metodou volby. ELISA Metoda je založena na kvantitativním stanovení produktu pomocí imunoanalýzy. V naší laboratoři tuto metodu vyvíjel Mgr. Miloš Šmeral. Experimentální uspořádání zahrnovalo připravené elisa desky s imobilizovanou králičí protilátkou specificky vážící trans-zeatin a trans-zeatinribozid. Koncentrace navázaného trans-zeatinu se zjišťovala z rozdílu mezi navázaným trans-zeatinem a konjugátem trans-zeatinribozidu s alkalickou fosfatázou. Po přidání substrátu 4-nitrofenylfosfátu byla detekce vzniklého p-nitrofenolu prováděna spektrofotometricky pomocí Elisa readru Rainbow Tekan. Z naměřených hodnot byla odvozena koncentrace trans-zeatinribozidu metodou kalibrační

15

křivky. Základními nedostatky této metody je velký rozptyl dat a malá opakovatelnost výsledků. Důvodem je variabilní podíl nespecifických vazeb mezi protilátkami a trans-zeatinem a také nepříliš velký rozsah koncentrací trans-zeatinu vhodných pro stanovení vzhledem k omezenému množství imobilizovaných protilátek. Přes tyto komplikace se podařilo získat představu o KM a Vlim pro ZOG. Výsledky jsou obsaženy v publikaci (Kiran et al., 2006). Kapalinová chromatografie

V roce 1995 užili chromatografie Falk a Rask k stanovení zeatinu po glukozidázové reakci. Purifikovaná β-glukozidáza z řepky Brasica napus byla inkubována se ZOG po dobu 24 hodin při 37 ˚C, reakce byla zastavena přidáním studeného acetonu. Chromatografie proběhla na systému SMART HPLC/FPLC (Pharmacia Biosystems) s kolonou Sephasil C8 a UV detekcí. Vzorky byly vysušeny a následně rozpuštěny v 0.2 M acetic acid-triethylamine, pH 4.8. Eluce byla provedena gradientem 0 až 50% metanol v 0,2 M acetic acid-triethylamin. Uvedeným postupem byla získána specifická aktivita β-glucozidázy z Brasica napus vůči ZOG v hodnotě 0.2 nmol/min/mg (Falk a Rask, 1995). Hlavní nevýhodou této metody je velmi malá citlivost vyžadující extrémně dlouhé doby inkubace a zastavování reakce se složitým následným zpracováním vzorku. HPLC-MS Kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Současné metody analýzy látek dovolují napojit kapalinovou chromatografii na hmotnostní spektrometr a tím extrémně zvýšit citlivost detekce. Metodu stanovení produktů glukozidázové reakce pomocí HPLC-MS jsem vyvíjel v rámci diplomové práce ve spolupráci s Dr. Zdráhalem a Mgr. Dopitovou. Pomocí hmotnostní spektrometrie lze spolehlivě určit, o jakou látku se jedná na základě jejího poměru hmotnosti a náboje, který je spektrometrem měřen. Zvyšování koncentrace produktu v reakční směsi se pak projevuje zvětšováním plochy píku odezvy příslušné látky v poměru k ploše píku standardu přidávaného ke směsi ve stále stejném množství. Koncentrace produktu v daném čase je pak určena podle kalibrační přímky. Pro stanovení produktů hydrolytické reakce katalyzované β-glukozidázou Zm-p60.1 byl použit hmotnostní spektrometr Esquire 2000 od firmy Bruker Daltonics. Ionizace vzorku je prováděna metodou elektrosprej (ESI). Pro detekci iontů je využívána kvadrupólová iontová past (ion trap, IT). Pro lepší identifikaci látek a zjednodušení směsi vstupující do iontové pasti, byl hmotnostní spektrometr používán v kombinaci s kapilární kapalinovou chromatografií. trans-Zeatin i pnitrofenol byly děleny kapilární kolonou Phenomenex na reverzní fázi Synergi™ Hydro-RP. Izokratická eluce byla prováděna směsí 19% Acetonitril a 0,002% kyselina mravenčí. Doba analýzy byla většinou 7 min. (podle nastavení metody) při průtoku 4μl/min. s nástřikem vzorku na kolonu 300nl. Důležitou podmínkou pro stanovení určité látky touto metodou je její ionizovatelnost, zvláště pokud se hledaná látka nachází v analytu v minimální koncentraci. Z tohoto důvodu nebylo možné jako produkt reakce stanovovat vzrůstající koncentraci glukózy, ale koncentraci aglykonů, které jsou podstatně lépe ionizovatelné. Problémem, který se projevil při měření substrátu ZOG, byl velký rozptyl naměřených specifických rychlostí. Proto byla metoda nejdříve optimalizována na substrátu PNPG, pro který je možné určit kinetické hodnoty spektrofotometricky. Vzhledem k tomu, že průběžný způsob měření rychlosti na MS je pomalejší než při standardním měření, byly zavedeny podmínky měření na spektrofotometru tak, aby obě metody byly maximálně shodné. Zejména bylo nutné testovat pufry použitelné jak pro MS tak pro spektrofotometrické stanovení při pH vhodném jak pro enzymovou reakci tak pro vzhledem k absorbčnímu maximu měřených látek. Nečekaným zjištěním bylo, že velká část variability v měřených rychlostech je způsobena ředěním enzymu před vlastním měřením. Aktivita enzymu klesala úměrně tomu, jak dlouho byl enzym uchováván v naředěném stavu před odstartováním reakce. Největší pokles aktivity enzymu byl pozorován krátce po naředění. Pokud byl tento krok vynechán (enzym byl v reakci ve stejné koncentraci jen ve větším objemu), pak se reprodukovatelnost měření specifické rychlosti zlepšila.

16

Rozptyl měření nelze vysvětlit pouze ředěním enzymu, vysvětlením by mohlo bít kolísání v míře ionizace analytu. Metodu je proto zatím možné použít jen pro kvalitativní zjištění štěpitelnosti substrátů, ale nikoliv pro přesné zjištění katalytických parametrů (Mazura, 2005 diplomová práce). Spojené enzymové reakce

β-glukozidázová reakce nám k analýze nabízí v zásadě dva produkty. Pokud se zaměříme na glukózu, problém analytické metody se dá přeformulovat na měření glukózy, navíc je takováto metoda teoreticky nezávislá na aglykonu, tudíž univerzální. Protože je glukóza velmi významná látka, existují tradiční postupy pro její stanovení, používané zejména v medicíně pro stanovení glukózy v tělních tekutinách (Wright et al., 1971). Jedná se zejména o dva systémy, první obsahuje enzymy hexokinázu a glukózo-6-fosfátdehydrogenázu. Při spojené reakci se redukuje NADP na NADPH, přičemž se redukovaná forma měří spektrofotometricky při 340nm. Druhý systém je složen z enzymů glukózooxidázy a peroxidázy, přičemž peroxidáza využívá peroxid vodíku vznikající v reakci k oxidaci detekčního činidla, poté je oxidovaná forma detekována spektrofotometricky nebo fluorometricky. Jako detekční činidla se používá několik látek. Nejznámější činidla jsou: 3,3′,5,5′- tetramethylbenzidine (TMB) a 2,2′-azino-bis 3ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), o-phenylendiamine dihydrochloride (OPD). Každý z těchto substrátů má omezení. TMB je špatně rozpustný ve vodě a snadno precipituje, ABTS se nespecificky oxiduje a změna zbarvení je pomalá, OPD na světle degraduje. Ve standardním uspořádání jsou pro oba systémy dodávány komerční analytické soupravy, kde se roztok vzorku přidává k detekční směsi a po inkubaci 15 - 30 min. se měří množství glukózy. Citlivost se v obou případech pohybuje kolem 3μM koncentrace glukózy v reakční směsi.

17

Materiál a metody

Bioinformatika V rámci disertační práce byly využívány zejména následující programy a bioinformatické nástroje. Pro srovnávání sekvencí aminokyselin i DNA BioEdit Sequence Alignment Editor verze 7.0.9.0.(www.mbio.edu/BioEdit/BioEdit.html) spolu s programy Blast a ClustalW2 poskytovanými v rámci webové aplikace European bioinformatics institute tools Zdroje sekvencí β-glukozidáz byly databáze UniProt (www.ebi.ac.uk/tools). (www.uniprot.org) případně GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Jako výchozí bod k sekvenčním a strukturním informacím sloužila nejvíce databáze enzymů zapojených do metabolizmu sacharidů CAZy (www.cazy.org) . Ke studiu strukturních vztahů β-glukozidáz byly používány programy Deep View verze 4 (http://spdbv.vital-it.ch/) a PyMol verze 0.99 (http://pymol.org) PyMol byl využit i k rendrům výsledných obrázků. Pro hledání tunelů ve struktuře β-glukozidáz sloužil program Caver verze 0.99.4 (http://loschmidt.chemi.muni.cz/caver/). Zdrojem strukturních dat byla databáze Protein databank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Pro vyhodnocování kinetických dat sloužil program Origin verze7 (www.originlab.com/) v kombinaci s Microsoft Excel 2000. Speciální 3D grafy pro vyhodnocení efektivity βglukozidáz současně vůči dvěma substrátům si vyžádaly použití software Statistica verze 8 (www.statsoft.com). Vývoj programu pro odhad četnosti aminokyselinových záměn pro řízenou evoluci byl realizován v prostředí Microsoft Visual Basic for applications na platformě Microsoft Excel 2000. In vitro místně řízená mutageneze Vzhledem k tomu, že naším cílem bylo směrovat vytváření genetické variability do úzké oblasti několika aminokyselin v sekvenční návaznosti hlavního hydrofobního klastru, použili jsme osvědčenou metodu řízené mutageneze. Mutageneze byla realizována pomocí komerčního produktu QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis (dále kit) od firmy Stratagene. Metoda se skládá ze tří kroků. 1. Polymerázová reakce, při které se v několika cyklech syntetizují mutantní DNA řetězce. Reakční směs tvoří: DNA templát, v našem případě byl použit expresní plazmid pRSET:: (His)6Zm-p60.r. Syntetické degenerované oligonukleotidy v polymerázové reakci vystupují jako primery, od kterých se začíná přepisovat templát. Enzymová směs (součást kitu) obsahující PfuTurbo® DNA polymerázu. Tato polymeráza by měla zajistit, aby byl templát přepisován z vysokou přesností a nebyly vnášeny mutace do míst, kde nejsou navrženy. Navíc polymeráza nemá exonukleázovou aktivitu, takže neopravuje vnášené mutace. Cirkularizace vzniklého DNA řetězce je zajištěna ligázou, která však není blíže specifikovaná. 2. V rámci PCR vznikají mutované řetězce, takže výsledkem je směs původních templátových molekul a mutantních produktů. Pro transformaci a následný skríning mutantů je žádoucí, aby templátové molekuly byly odstraněny. K tomuto účelu se s úspěchem využívá fakt, že templátové DNA pocházející z E. coli jsou metylovány.

18

Produkty vzniklé uměle za použití PCR metylovány nejsou. Použitím restrikční endonukleázy Dpn I, která je specifická pro metylované řetězce DNA lze templátové molekuly odstranit. 3. Po štěpení endonukleázou je reakční směs použita pro transformaci XL10-Gold® ultrakompetentních buněk. Kruhová jednořetězcová DNA je v bakteriích doplněna na dvouřetězcovou formu. Takto vytvořené plazmidy mohou být izolovány, a po ověření sekvence transformovány do expresního kmene BL21. Použité bakteriální kmeny mají tyto genotypy: XL10-Gold® : TetR Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 g gyrA96 relA1 lac Hte [F’ proAB laclqZΔM15 Tn10 (TetR) Amy CamR]a BL21(DE3) : pLysS: F-ompThsdSb(rb-mb-; klon B E.coli Mutační polymerázová reakce Při mutační reakci dochází k připojení mutagenního oligonukleotidu na templátovou ssDNA a k jeho prodloužení a cirkularizaci. Složení reakce bylo připraveno podle protokolu firmy Stratagene. 1. 10x QuikChange® Multi reakční pufr 2,5 μl 2. Templátová DNA pRSET:: (His)6Zm-p60.r. 60 ng Jako templáty byly použity mutantní formy vektoru P2 a W373K 3. mutagenní primery OLIGO_58,42 KONST a VAR v možstvích 180ng a 130ng byly použity v experimentálních kombinacích: templaát P2+ primery OLIGO_58_KONST + OLIGO_42_KONST templaát P2+ primery OLIGO_58_VAR + OLIGO_42_VAR templát W373K+primer OLIGO_42_KONST templát W373K+primer OLIGO_42_VAR Jako kontrola byly použity templáty P2 a W373K bez primerů 4. dNTP mix (součást kitu) 1μl 5. QuikChange® Multi směs enzymů 1μl 6. Směs byla doplněna dd H2O do celkového objemu 25 μl. Takto připravená směs byla promíchána a umístěna na termocykler (Perkin Elmer). Zde byla zahřáta na 95ºC 1 min. Pak následovalo 30 cyklů 95 ºC 1 min. 55 ºC 1 min. 65 ºC 9,5 min. Po skončení programu byla směs umístěna na led na 2 min. pro ochlazení na tepotu pod 37 ºC.

19

Odstranění templátové DNA pomocí Dpn I restrikční endonukleázy Reakční směs byla uložena při 4 ºC do druhého dne. 1. K reakční směsi ochlazené na ledu byl přidán 1μl endonukleázy Dpn I (10 U/μl). 2. Směs byla řádně promíchána, stočena na mikrocentrifuze 1 min a inkubována na 37 ºC 2hod. (interval byl prodloužen kvůli spolehlivějšímu odstranění templátové DNA) Transformace XL10-Gold® ultrakompetentntních buněk Transformace byla provedena podle firemního protokolu Stratagen (http://www. stratagene.com/tradeshows/feature.aspx?fpld=146) Rozdíl oproti protokolu byl v použití triptonu místo kaseinu v NZY bujonu a použití 1,5 ml zkumavek namísto doporučovaných falkonů. Skríning na miskách Čtvercové Petriho misky s objemem 20ml agaru. Složení média: LB bujon 1 litr LB media: 10g Trypton 5g kvasniční autolyzát 5g NaCl 1 litr selekční medium na misky 1 litr LB 15 g Agar Ampicilin 100 μg/ml X-glu 0,02mg/ml Inkubace 37 ºC 2 dny poté při pokojové teplotě až 2 týdny. Izolace plazmidové DNA z E.coli na koloně QIAGENTM Namnožení kultury v LB médiu LB bujón Ampicilin 100 μg/ml kultivace 37 ºC třepání 200/min 18hod Pro izolaci plazmidové DNA byla použita metoda QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Tato metoda využívá alkalické (NaOH/SDS) lyze bakteriálních buněk. Alkalické prostředí denaturuje proteiny, chromozomální a plazmidovou DNA. Při zvolení optimální doby lyze dochází k uvolnění nepoškozené plazmidové DNA. Postup byl podle firemního návodu (http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000248). Sekvencování bylo provedeno firmou MWG-biotech.

20

Příprava bakteriálních lyzátů Inokulace Postup pro objem kultivačního média 1000 ml: LB medium 885 ml Ampicilin (50 mg/ml) 2ml Chloramfenikol (34 mg/ml) 1 ml Glukosa (w/v 40 %) 2,5 ml Cellobiosa (w/v 10 %) 10 ml Fostátový pufr (0,5 M; pH 7) 100 ml Bakteriální konzerva 1-1,5 ml Vše promíchat a rozlít do tří ostatních 1000ml Erlenmayerových baněk po 250 ml. Budou tedy 4 baňky s 250 ml inokulovaného media což je ideální objem pro míchání. Před přidáním konzervy je třeba odebrat 1,5 ml media jako blank na změření absorbance. Kultivace: T = 37 °C Rotace = 200 rpm t = 2 hodiny (dle potřeby k dosažení minimální hranice absorbance – cca 0,4) Poté je nutno změřit absorbanci při λ = 600 nm, která by měla být A ≈ 0,5 – 0,7. Indukce: Do všech čtyř baněk přidat izopropyl-β-D-thiogalaktozid (IPTG) do výsledné koncentrace v médiu 0,1 mM. Kultivace: T = 22,5 °C t = 3 hodiny Sonikace: Kultury centrifugovat 10 min při 10000g a 4 °C. Pelet z baněk spojit v jeden a resuspendovat v 50 ml sonifikačního pufru. Skladovat při –20 °C (nechat volně zamrazit, nepoužívat N2). Sonikační pufr 1000 ml: Tris.HCl (20 mM; pH 7,9) NaCl (0,5 M) Triton X-100 (w/v 0,1 %), nebo také X-114 (nově používán) Sonikátor Bandelin HD 2270: Počet cyklů 50 Energie 50% 50 ml falkon Kontinuální puls 1 min a pak chladit 1 minutu na ledu opakovat 2x, podle potřeby 3x (výsledně tedy 3, nebo 4 sonikační cykly)

21

Homogenát centrifugovat při 30000g, 30 min, při 4 °C a přefiltrovat přes filtr Minisart (Sartorius) s hydrofilní polyethersulfonovou membránou s velikostí pórů 0,20 μm. Aktivitní barvení Při aktivitním barvení je nejdříve bakteriální lyzát po expresi nanesen na polyakrylamidovou elektroforézu (PAGE), separace proteinů porběhne za nativních podmínek a následně je gel s rozdělenými proteiny inkubován v roztoku substrátu. Substrát: 12,5mg bromnaftyl rozpustit v 100uL dimetylsulfoxidu 25 mg Fast blue + 10 ml pufru (Citrát fosfát pH 5,5) Obě složky smíchat a inkubovat s gelem až 30min ve tmě. Měření kinetiky na umělém substrátu Standardní metoda pro měření specifické aktivity vůči umělému substrátu p-nitrofenyl-β-Dglukozidu (PNPG) případně určování kinetických parametrů KM a Vlim je diskontinuální spektrofotometrické měření reakční rychlosti. β-glukozidázovou aktivitou enzymu je substrát PNPG hydrolyzován na žlutý produkt p-nitrofenol, jehož absorbance se stanovuje při vlnové délce 405 nm. Standardně je reakce zastavována přidáním Na2CO3. Tím se roztok zalkalizuje, reakce se zastaví a oddělí se absorpční maxima substrátu a produktu. Reakční směs: 100 μl PNPG 20mM 1-10 μl lyzát nebo purifikovaný enzym doplnit do 400 μl pufrem (50mM citrát fosfát pH 5,5) trvání reakce 1-5 minut podle aktivity testovaného enzymu. Pro měření je nutné udržení konstantní teploty reakce. Reakční směs se proto inkubovala v termobloku na na 30 oC zastavit přidáním 600μl Na2CO3 (0,2 M) Kalibrační přímka je měřena za stejných podmínek pro několik koncentrací p-nitrofenolu. Měření byla prováděna na UV/VIS spektrofotometru Helios (Thermo Spectronics) a UV/VIS elisa readru Rainbow Tecan..

22

Výsledky Z hlediska molekulární determinace substrátové specifity rostlinných β-glukozidáz jsou nejvíce informativní ty enzymy, u kterých je známa terciární struktura a kinetické parametry pro substráty. Rodina GH1 glykozidáz obsahuje pět rostlinných β-glukozidáz, u nichž je určena terciární struktura. Jsou to β-glukozidázy z druhů Oryza sativa (OsBGLU), Sorghum bicolor (SbDhr), Trifolium repens(TrGlu), Triticum aestivum (TaGlu1) a Zea mays (Zmp60.1). Zea mays: Nejdéle studovanou a současně první rostlinnou β-glukozidázou s určenou terciární strukturou je ZmGlu1(Czjzek et al., 2000) respektive její alozym Zm-p60.1 (Vévodová et al., 2001; Zouhar et al., 2001). Z tohoto důvodu jsou nově určené struktury srovnávány často s β-glukozidázou z kukuřice. Určení terciární struktury na kokrystalech s některými substráty a inhibitory umožnilo určit zastoupení reziduí na klíčových pozicích v ústí aktivního centa (Czjzek et al., 2000). U Zm-p60.1 jde o kombinaci aminokyselin F-F-WF známou jako hydrofobní klastr a dalších aminokyselin účastnících se kontaktů se substrátem (Zouhar et al., 2001). Zm-p60.1 má širokou substrátovou specifitu, kdy in vitro štěpí řadu umělých substrátů jako například PNPG a MUG vedle přirozených substrátů jako jsou ZOG, K3G nebo DIMBOAG. Vedle ZmGlu1 existuje isoenzym ZmGlu2 sdílející 90% sekvenční identitu. Izoenzymy se kvantitativně liší ve specifitě vůči umělým substrátům a Glu2 neštěpí na rozdíl od Glu1 6-bromo-2-naftyl-b-D-glukozid (Czjzek et al., 2000). Oryza sativa OsBGLU hydrolyzuje oligosacharidy pocházející z buněčné stěny. Strukturou je podobná ostatním příslušníkům GH1 rodiny, ale smyčky tvořící aktivní místo jsou na povrchu více rozvolněné a směrem do nitra enzymu tvoří úzkou štěrbinu. Toto uspořádání umožňuje hydrolýzu β-1,4 vázaných oligosacharidů (Chuenchor et al., 2008). Trifolium repens: β-glukozidáza byla podle sekvenční příbuznosti zařazena do kyanogenních glukozidáz, ale kinetická data nebyla dosud naměřena na purifikovaném enzymu. Údaje z částečně purifikovaných izolátů naznačují, že enzym má širokou substrátovou specifitu (Pócsi et al., 1989; Hill a Reilly, 2008). Strukturně je β-glukozidáza velmi podobná glukozidáze z kukuřice co do tvaru aktivního centra. Na místě hydrofobního klastru F-F-W-F Zm-p.60.1 je seskupení N-F-W-D (Barrett et al., 1995). Triticum aestivum: β-glukozidáza TaGlu1b krystalizuje ve formě hexameru a hydrolyzuje zejména DIMBOAG a DIBOA. TaGlu1b sdílí 70% podobnost v aminokyselinové sekvenci s ZMGlu1 a 70% identitu s SbDhr1. Na místě hydrofobního klastru F-F-W-F Zmp.60 je seskupení F-H-W-S (Sue et al., 2006). Sorghum bicolor: Podobně jako u Zea mays byly popsány dva isoenzymy Dhr1 a Dhr2 sdílející navzájem 70% sekvenční identitu. Dhurinázy, jak byly tyto β-glukozidázy nazvány, se liší specifitou, přičemž Dhr1 štěpí výlučně p-hydroxy-(S)-mandelonitril-b-D-glukozid (dhurin), zatímco Dhr2 štěpí i některé umělé substráty (Czjzek et al., 2000). Krystalografická data ukázala, že místo hydrofobního klastru je seskupení aminokyselin V-L-W-S a způsob, jakým se dhurin (zeména glykon) váže do aktivního místa, se značně liší od konfigurace známé z ostatních kokrystalů β−glukozidáz. To je zřejmě důvodem pro absolutní specifitu tohoto enzymu (Verdoucq et al., 2004). Základní představu o substrátové specifitě dává následující (obr. 5) s vynesenými kinetickými parametry vybraných rostlinných β-glukozidáz. Body vyznačující kombinace enzymů s jejich přirozenými i umělými substráty se vyskytují spíše v levé horní části grafu, což odpovídá předpokladu, že volně se vyskytující β-glukozidázy budou mít dobrou afinitu i rychlost katalýzy zejména vůči svým přirozeným substrátům. 23

Substrátová specifita vybraných rostlinných β-glukozidáz KM (mM) 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1000 Ta-DIMBOAG

Ta-PNPG Sc-DIMBOAG Ta-DI BOAG Sc-DI BOAG

100 Zm-MUG

Zm-PNPG Zm-DIMBOAG kcat (s-1)

Sc-PNPG

10

Zm-ONPG

Os-ONPG Sb-DHURRIN

Sb-ONPG

Os-PNPG Os-MUG

Zm-ZOG

Os-CELOTRIOSE

BG-CELOTRIOSE

1 BG-PNPG

0,1

Obr. 5 Vynesení hodnot KM proti kcat rostlinných β-glukozidáz vůči umělým i přirozeným substrátům. Vybrány byly glukozidázy se známou terciární strukturou: Zm = Zm-p60.1 (kukuřice), Os= OsGlu1 (rýže), Sb = Sb1 (čirok), Ta=TaGlu1 (pšenice). Do grafu byly přidány ještě blízce příbuzné glukozidázy Sc=ScGlu (žito) a BG=BGQ60 (ječmen), u kterých struktura známa není Gradient barvy plochy grafu naznačuje oblast zvyšujícího se poměru kcat /KM. Racionální design ve výzkumu β-glukozidázy Zm-p60.1 Racionální design proteinu je zde míněn jako cílená změna v jeho aminokyselinové sekvenci, vytvořená na základě informací získaných pomocí metod bioinformatiky za účelem výzkumu vybrané vlastnosti, kterou protein vykazuje. V případě Zm-p60.1 byl racionální design úspěšně použit při prokázání katalytického páru glutamových kyselin v reakčním centru. Aminokyseliny byly mutovány E186D,Q a E401D,Q, přičemž při zachování KM došlo k poklesu kcat 1000 až 10000krát. Další úspěšnou aplikací racionálního designu byl výzkum cystejnových zbytků včetně prokázání 24

disulfidického můstku mezi C205 a C211 (Rotrekl et al., 1999). Co se týče výzkumu substrátové specifity, byly provedeny aminokyselinové záměny směřující do hydrofobního klastru F193I,Y,W (Zouhar et al., 2001), F193V, F193V+F200L+P372A, F200L, F461S, F461S+A462S (Verdoucq et al., 2003) a také záměny aminokyselin, které s hydrofobním klastrem sousedí M258I,V,F (Zouhar et al., 2001), D156N, M258F, P372A,Y468F (Verdoucq et al., 2003). Záměny aminokyselin byly podníceny zejména srovnáním široké specifity Zmp60.1 a β-glukozidázy SbDhr1z Sorghum bicolor hydrolzující pouze dhurrin. Zm-p60.1 dhurrin nehydrolyzuje. Vytvářením chimerních proteinů z těchto dvou enzymů se podařilo vytvořit konstrukty s aktivitou na dhurrinu. Dokonce aminokyselinová záměna Y468F sama umožnila kukuřičné β-glukozidáze štěpit dhurrin (Cicek, 2000; Verdoucq et al., 2003). Všechny záměny cílené na hydrofobní klastr měly dramatický vliv na katalýzu testovaných substrátů viz (obr. 6). Funkční analýza aglykon-vazebného místa β-glukozidázy Zm-p60.1 (příloha disertace 1) V našem současném projektu jsme chtěli více porozumět determinaci substrátové specifity βglukozidázy Zm-p60.1 zejména vůči substrátu ZOG vzhledem k zapojení glukozidáz do rostlinných hormonálních signalizací. S využitím dostupných strukturních dat byly za pomoci programu CASTp popsány všechny aminokyseliny, které se podílí na stavbě aktivního centra s vymezením pravděpodobných kontaktů s cukrem i aglykonem. Sekvenční data 22 příbuzných rostlinných β-glukozidáz byla vybrána pro stanovení míry variability na pozicích v sekvenci Zm-p60.1 odpovídajících aminokyselinám tvořícím aktivní centrum. Z fylogenetické analýzy vyplynula existence skupiny příbuzných glukozidáz z rostlin čeledi brasicaceae, z nichž β-glukozidáza Bgl4:1z řepky Brassica napus je v literatuře popsaná jako jediná β-glukozidáza vedle Zm-p60.1 schopná štěpit ZOG. Přestože obě β-glukozidázy sdílí substrátovou specifitu a zřejmě i fyziologickou funkci v uvolňování aktivních forem cytokininů, zastoupení aminokyselin v aktivním místě se zásadně liší. V identifikované skupině sekvencí z čeledi brasicaceae je na místě hydrofobního klastru Zm-p60.1 (F-F-W-F) konzervativní seskupení aminokyselin A-K-K-L. Pro studium substrátové specifity tohoto uspořádání aminokyselin v aktivním centru byla připravena série mutantů v těchto pozicích na molekule Zm-p60.1 F193A, F200K, W373K, F461L a jeden čtyřnásobný mutant nesoucí všechny tyto mutace současně F193A+ F200K+ W373K+ F461L s názvem P2. Tam kde to bylo možné byli mutanti charakterizováni pomocí enzymové kinetiky, strukturní analýzy a molekulového modelování. Enzymová kinetika byla měřena na dvou substrátech a to PNPG a MUG. U mutanta F461L se projevilo zvýšení katalytické efektivity (definované jako (kcat / KM)mutant/( kcat /KM)WT ) ve srovnání s divokým typem o 20% pro oba substráty díky zvýšení kcat. U ostatních mutantů tomu bylo právě naopak. U mutanta F193A klesla katalytická efektivita pro PNPG 195 a pro MUG 42krát. Zajímavou skutečností byl vzrůst afinity (snížení Km) velmi rozdílný pro PNPG a MUG, přičemž pro PNPG vzrostla afinita 15krát, ale pro MUG vzrostla jen o 20%. Mutant F200K vykazoval snížení afinity 5 a 10krát pro PNPG a MUG, který doprovázel pokles kcat 18 a 29krát. Rovněž mutant W373K vykazoval podobné snížení afinity 3 a 12krát pro PNPG a MUG, ale pokles kcat byl v tomto případě velmi výrazný 68krát pro PNPG a dokonce 243krát pro MUG. Celkově se pokles katalytické efektivity projevil více na substrátu MUG a mutant W373K vykazoval nejnižší efektivity pro oba substráty. Graf na (obr. 6) ukazuje vliv aminokyselinových záměn jak na rychlost katalýzy tak na afinitu k enzymu. Ze srovnání s dříve naměřenými daty a údaji z literatury je vidět, že mutanti F193A, F200K a W373K ovlivňují katalytické parametry velmi výrazně a záměna jedné aminokyseliny může zásadně měnit KM nebo kcat, případně oba parametry současně, přičemž výsledek se může velmi lišit v závislosti na použitém substrátu. 25

Vliv jednobodových mutací aminokyselin hydrofobního klastru na specifitu Zm-p60.1 KM (mM) 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1000

100

F461S-PNPG F461S-MUG F461L-MUG F193Y-MUG WT-MUG F200L-PNPG F461L-PNPG WT-PNPG

F200L-MUG WT-DIMBOAG

kcat (s-1)

F461S-ONPG F200L-ONPG

F193W-MUG F193W-PNPG F193I-MUG WT-ONPG F193Y-ONPG

10 F193V-ONPG WT-ZOG F193V-MUG F200K-MUG

F200K-PNPG

F193A-MUG 1

F193I-PNPG W373K-PNPG

F193A-PNPG

W373K-MUG

0,1

Obr. 6 Vynesení hodnot KM proti kcat divokého typu β-glukozidázy Zm-p60.1 a jednobodových mutantů v aminokyselinách hydrofobního klastru. Stejný tvar symbolu označuje stejnou pozici mutace. Stejná barva symbolu označuje stejnou záměnu aminokyseliny. Podtrženi jsou mutanti z aktuálního projektu (příloha disertace 1). Barevnost plochy grafu naznačuje oblast zvyšujícího se poměru kcat /KM. Pro zjištění vlivu mutací na strukturu proteinu byla použita metoda cirkulárního dichroismu. Relativní zastoupení α-šroubovic a β-listů bylo pro mutanty F193A a W373K shodné s divokým typem. U mutantů F461L, F200K a nejvíce pak u čtyřnásobného mutanta P2 byl evidentní snižující se podíl α-šroubovic. Pro studium vlivu mutací na kvarterní strukturu byla použita nativní PAGE, Western blott s imunodetekcí monomerních a dimerních forem enzymu a molekulová vylučovací chromatografie (size exclusion chromatography). Mutanti F193A a F461L se vyskytovali

26

téměř výhradně v dimerní formě stejně jako divoký typ. Naproti tomu mutanti F200K a W373K byli převážně monomerní. Mutant F193A výrazně ovlivnil katalytické parametry enzymu, ale přitom neměl výrazněji změněnou strukturu, proto byl vybrán pro molekulové modelování metodou molekulární docking. Dokovány byly substráty PNPG a MUG do aktivního centra divokého typu a modelu aktivního centra mutanta F193A. Struktury získané z dockingu byly rozděleny na reaktivní a nereaktivní komplexy podle orientace glykonu v aktivním místě. Nebyl shledán rozdíl v geometrii reaktivních komplexů mezi divokým typem a mutantem F193A, ale ukázalo se, že nereaktivní orientace substrátu je u mutanta energeticky výhodnější. Tato preference nereaktivní orientace substrátu spolu se snížením hydrofobicity aktivního místa vysvětluje preferenci menšího polárního aglykonu a výrazný pokles kcat F193A ve srovnání s divokým typem. Výrazný pokles kcat u W373K ukazuje na novou funkci W373 a to zapojení nejen do rozpoznávání substrátu v kombinaci s F193, jak bylo popsáno (Zouhar et al., 2001), ale i ovlivnění samotné rychlosti katalýzy substrátu a to správným nastavením pozice glukozidické vazby proti katalytickému páru aminokyselin. Strukturní studie ukázaly, že i v případě mutací v jedné aminokyselině může být vliv na sekundární, terciární i kvarterní strukturu enzymu značný. Kumulací těchto změn v rámci čtyřnásobného mutanta P2 došlo k poklesu jeho aktivity natolik, že nebylo možné kinetické parametry získat. Ukázalo se, že podíl aminokyselin v různých částech aktivního centra na determinaci substrátové specifity β-glukozidázy Zm-p60.1 je komplexní jev a vliv mutací na katalytické parametry enzymu může být nesnadno interpretovatelný, zejména pokud do hry vstupují dříve neznámé jevy, jako je námi popsaný energeticky výhodný, ale nereaktivní typ komplexu enzymu se substrátem. Zhodnocení katalytických a strukturních determinant substrátové specifity rostlinných β-glukozidáz s implikacemi pro β-glukozidázu Zm-p60.1 V určování specifity β-glukozidáz ale i enzymů obecně je většinou třeba nejprve řešit otázku enzymové kinetiky, a to který enzym či mutant “lépe” katalyzuje reakci s daným substrátem a je tedy více specifický pro daný substrát či skupinu substrátů. Potom je třeba řešit otázku strukturní biochemie, a to jak je tato schopnost katalyzovat reakci se substrátem strukturně determinována. Co se týče enzymové kinetiky, můžeme u některých rostlinných β-glukozidáz porovnávat naměřené hodnoty KM a kcat pro některé přirozené a umělé substráty. Jak ale z těchto konstant určit míru specifity? Běžným postupem je používat poměr kcat/KM, někdy nazývaný konstanta specifity. Problém s tímto poměrem je jednak terminologický; původně šlo o porovnávání rychlostí katalýzy dvou substrátů jedním enzymem, ale dostupnost mutantních forem enzymů a zavádějící označení konstanta specifity způsobily, že poměr kcat/KM je používán pro srovnávání odlišných enzymů (Koshland, 2002). Kromě terminologie vzniká chyba zejména vlivem faktu, že ať už srovnáváme reakci více substrátů pro jeden enzym nebo více enzymů pro jeden substrát, vzájemné poměry konstant specifity nemusí korespondovat s poměrem rychlostí katalýzy daných reakcí pro celý rozsah koncentrací substrátu. V zásadě může docházet ke třem situacím: 1.) 2.) 3.)

KM (b) > (kcat (b)/kcat (a))KM (a) KM (b) < (kcat (b)/kcat (a))KM (a) KM (b) = KM (a)

27

Srovnáme-li hyperbolické závislosti v0 na [S] podle klasické kinetiky podle MichaelisMentenové, tak v prvním případě získáme hyperboly, které se protínají a v tomto bodě se při odpovídající koncentraci substrátu rychlosti katalýzy vyrovnávají a dále se jejich poměr obrací. Koncentrace, při které k tomu dochází, se vypočítá podle vztahu: (a) (b ) k cat K M(b ) − k cat K M( a ) (b ) (a) k cat − k cat V druhém případě se hyperboly neprotínají, ale poměr rychlostí se při vzrůstající koncentraci substrátu mění. Posledním případem je situace, kdy se KM rovnají. Jen v tomto případě je poměr rychlostí zachován v celém intervalu koncentrací substrátu a odpovídá vzájemnému poměru kcat / KM zúčastněných reakcí (Eisenthal et al., 2007). Příkladem z našich dat může být vyhodnocování specifity Zm-p60.1 vůči různým substrátům viz (obr. 7) Pořadí poměrů kcat / KM je následující: Zm-p60.1 vs MUG (362,16), DIMBOAG (297,55), PNPG (62,941), ONPG (15,254), ZOG (6,571). Vztah DIMBOAG a PNPG odráží případ, kdy se hyperboly protínají. Z poměru 297,55/62,941 by se zdálo, že Zm-p60.1 má pro DIMBOAG 4,73krát vyšší specifitu. Koncentrace, při které dochází k vyrovnání rychlostí katalýzy, je 1,146 mM. Do této koncentrace je rychlost vyšší pro substrát DIMBOAG, ale od této koncentrace dál je rychlost vyšší pro substrát PNPG.

[S c ] =

Závislost reakční rychlosti β -glukozidázy Zm-p60.1na koncentraci substrátů 60

50

v0/[E] (s-1)

40 PNPG MUG 30

ONPG DIMBOAG ZOG

20

10

0 0

2

4

6

8

10

[S] (mM)

Obr. 7 Graf. Vynesení hyperbolické závislosti mezi reakční rychlostí a koncentrací substrátů podle Michaelis–Mentenové. Vzhledem k těmto problémům ve srovnávání specifit enzymů vůči substrátům se hledá vhodný nástroj, jak katalytickou kompetenci či katalytický výkon ohodnotit. Zajímavou 28

možností, jak obejít slabiny využívání poměru kcat / KM, je nový koncept katalytické efektivity enzymu vztažené k ideálnímu enzymu a následné porovnání těchto relativních efektivit. Zavádí se funkce (Ef ) definovaná jako poměr rychlosti katalyzované reakce a maximální teoretické rychlosti limitované difúzí substrátu do aktivního centra kdif = (~109 M-1 s-1). Pro jeden substrát v nepřítomnosti inhibitorů a při podmínkách nevratné reakce má rovnice tvar: Ef = ___kcat________ kdif (KM +[S])

(Ceccarelli et al., 2008). Vyhodnocení specifity Zm-p60.1 vůči substrátům v tomto případě vypadá následovně (obr. 8). Je zde vidět, že pro nízké koncentrace substrátu má Zm-p60.1 podobnou efektivnost katalýzy pro MUG a DIMBOAG. Dále je zřejmá koncentrace, kde se efektivita mění pro pár DIMBOAG a PNPG a rozsah koncentrace s nejvyšší efektivitou u zbývajících substrátů ONPG a ZOG. Stejným způsobem můžeme vyhodnotit efektivitu enzymů Zm-p60.1, TaGlu1, ScGlu, OsBGLU a BG60 vůči substrátu PNPG (obr. 9). Efektivita katalýzy je zde nejvyšší pro glukozidázu TaGlu1 z pšenice, pak následuje Zmp60.1. Pro OsGLU a ScGlu platí, že až do koncentrace substrátu 0,631 (mM) má vyšší efektivitu OsGlu nad tuto koncentraci ScGlu. Nejnižší efektivitu vůči PNPG má BG60. Posledním substrátem, pro který máme kinetická data alespoň u tří enzymů je DIMBOAG. Enzymy schopné jeho hydrolýzy jsou Zm-p60.1, TaGlu1 a ScGlu. Vyhodnocení katalytické efektivity je v grafu (obr. 10). Výrazně nejvyšší katalytickou efektivitu má v celém rozsahu koncentrace substrátu β-glukozidáza TaGlu1, potom následuje Zm-p60.1 až do koncentrace 0,174 (mM), odkud má vyšší efektivitu β-glukozidáza ScGlu. Efektivita katalýzy β-glukozidázy Zm-p60.1 na přirozených i umělých substrátech

100

1000

[S] (uM)

10000 1,00E-03 Ef

10

PNPG 1,00E-04

MUG ONPG DIMBOAG ZOG

1,00E-05

1,00E-06

Obr. 8 Funkce katalytické efektivity Zm-p60.1 v závislosti na koncentraci substrátů.

29

Efektivita katalýzy β-glukozidáz vůči substrátu PNPG

10

100

1000

[S] (uM)

10000 1,00E-03

Ef

1

1,00E-04

1,00E-05

Zm Ta Sc Os BG

1,00E-06

1,00E-07

Obr. 9 Funkce katalytické efektivity β−glukozidáz Zm-p60.1, TaGlu1, ScGlu, OsBGLU a BG60 vůči substrátu PNPG v závislosti na koncentraci substrátu.

Efektivita katalýzy β-glukozidáz vůči přirozenému substrátu DIMBOA

10

100

1000

[S] (uM)

10000 1,00E-02

Ef

1

1,00E-03

1,00E-04

Zm Ta Sc

1,00E-05

1,00E-06

Obr. 10 Funkce katalytické efektivity β−glukozidáz Zm-p60.1, TaGlu1a ScGlu vůči substrátu DIMBOAG v závislosti na jeho koncentraci.

30

Jak ukazuje (obr. 6) pro objasnění vlivu aminokyselin tvořících hydrofobní klastr u βglukozidázy Zm-p60.1 na substrátovou specifitu, byla vytvořena skupina mutantů, z nichž někteří mají výrazně změněné hodnoty KM a kcat. Z této skupiny jsem vyhodnotil katalytickou efektivitu mutantů, u kterých jsou známy katalytické konstanty pro substráty MUG a PNPG. Katalytickou efektivitu enzymu pro dva substráty lze znázornit jako bod v trojrozměrném prostoru, kde osy x a y znázorňují vypočtené hodnoty efektivity pro substráty a osa z bude mít rozměr společné koncentrace obou substrátů. Ef je pak maximální v nulové koncentraci substrátů a klesá s rozdílnou strmostí k maximální koncentraci substrátů. Vzniklá křivka se v horizontální rovině zakřivuje podle toho, vůči kterému substrátu má při dané koncentraci enzym vyšší Ef. Toto zakřivení lze lépe sledovat na půdorysném průmětu grafu. V grafech je rovněž vynesena diagonální rovina označující body, v nichž má enzym k oběma substrátům stejnou Ef. Pokud tedy křivka závislosti Ef substrátů na jejich koncentraci protíná diagonální rovinu, tak z souřadnice tohoto průniku označuje koncentraci substrátů, při které dochází ke změně Ef vůči substrátům. Teoreticky si lze představit rozšíření tohoto konceptu na n substrátů jako souřadnice polohy enzymu v n dimenzionálním prostoru, přičemž změna veličiny ovlivňující specifitu enzymu vůči substrátům se projeví jako trajektorie enzymu v tomto prostoru. Vzhledem k tomu, že katalytické efektivity divokého typu a mutantů se vzájemně liší o několik řádů, bylo nutné výsledky rozdělit do několika grafů. První graf ukazuje Ef pro divoký typ a mutant F461L. V celém rozsahu koncentrací mají enzymy jasně vyšší Ef vůči MUG, mutace F461L dokonce Ef mírné navýšila (graf 1). Ve skupině mutantů F461S, F200L a F193Y (graf 2) se u F461S a zejména F200L výrazně změnila specifita vůči PNPG, kdy pro mutant F200L je PNPG lepším substrátem v celém rozsahu koncentrací. Mutant F461S preferuje substrát MUG až do koncentrace 0,33 mM, potom mírně preferuje PNPG. Mutant F193Y při zachování preference k MUG má přibližně 80x nižší Ef než divoký typ. F193Y je současně i na dalším (grafu 3) pro srovnání velikosti Ef. V této skupině mutantů ve stejné pozici F193 je vidět, že přestože preferovaným substrátem je vždy MUG, je velký rozdíl zejména mezi F193W s velkým podílem aktivity i na PNPG a F193I, který katalyzuje téměř výhradně MUG. Poslední dvojici mutantů W373K a F200K ukazuje (graf 4). Mutanti mají velmi sníženu Ef oproti divokému typu u W373K více než 1000krát. Zajímavý je fakt, že W373K jasně preferuje PNPG v celém rozsahu koncentrací, zatímco F200K preferuje MUG, ale ve vysokých koncentracích substrátu počínaje 5,14 mM se preference mění ve prospěch PNPG.

31

Graf 1

32

Graf 2

33

Graf 3

34

Graf 4

35

Z hlediska strukturní biochemie vyvstává otázka, jak pozorované změny v substrátové specifitě vysvětlovat na úrovni molekulárních interakcí mezi enzymem a substrátem. Zdrojem strukturních informací jsou rentgenostrukturní data z kokrystalů se substráty a inhibitory. Z přeložení struktur rostlinných β-glukozidáz (obr. 11) vyplývá, že na úrovni základní stavby molekuly enzymu zejména pozici peptidové kostry jsou rozdíly minimální.

Obr. 11 Překrytí peptidových koster proteinů. Zm-p60.1- zelená, TrGlu-červená, OsGlu1modrá, SbDhr1-fialová, TaGlu-žlutá. Pohled směřuje do aktivního místa ve středu podjednotky. Superpozice byla vytvořena v programu PyMol.

36

Důležitým parametrem pro srovnání enzymů je molekulární povrch zejména v oblasti aktivního centra, kde tvar vzniklé dutiny spoluurčuje vztah k substrátům. V bližším pohledu na povrchy aktivních center jsou rozdíly u některých glukozidáz jasně patrné, zejména βglukozidázy z Trifolium repens a hlavně Oriza sativa viz obr. 12.

Obr. 12 Vizualizace řezů podjednotkami rostlinných β-glukozidáz na úrovni aktivních center. Přeložení molekulárních povrchů Zm-p60.1- zelená (šipka naznačuje vstup do aktivního centra), TrGlu-červená, OsGlu1-modrá, SbDhr1-fialová. Zobrazeny jsou řezy proteinem v úrovni aktivního centra nejprve pro samotnou β-glukozidázu Zm-p60.1. Při překrytí s ostatními enzymy byla kukuřičné β-glukozidáze nejvíce podobná co do povrchu aktivního centra glukozidáza SbDhr1, ale Zm-p60.1 má vstup do aktivního centra výrazně užší, což platí i ve srovnání s ostatními glukozidázami. U glukozidázy TrGlu se (z

37

našeho pohledu) nad aktivním centrem vyskytuje zvětšená dutina. Zjistili jsme, že u glukozidázy OsGlu1 zřejmě ústí tato struktura až na povrch. Výpočty pomocí programu Caver potvrdily možnost existence tunelu, který spojuje aktivní centrum s povrchem proteinu. Evoluční souvislosti ani funkční význam této struktury zatím nejsou známy (obr. 13).

Obr. 13 Vizualizace struktury tunelu v molekule β-glukozidázy OsGlu1 vypočtené programem Caver. Klíčový pohled na interakci enzymu se substráty tvoří skupina strukturních dat pro βglukozidázu Zm-p60.1 a zejména isozym ZmGlu1 se substráty PNPG, thio analogem PNPtG, DIMBOAG a, SbGlu1 se substrátem dhurrin, OsGlu1 s kovalentním intermediátem 2-deoxy2-fluoroglukozidem. Na (obr. 14). je základní pohled na aktivní centrum Zm-p60.1 bez substrátu. Hydrofobní klastr aminokyselin F-F-W-F je zodpovědný za zúžený profil vstupu do aktivního centra a zejména interakci s aglykony.

38

F193

F200

F461

W373

Obr. 14 Terciární a kvartérní struktura β-glukozidázy Zm-p60.1 s vyznačenými aminokyselinami hydrofobního klastru a katalytickým párem glutamových kyselin (žlutě nahoře E186, dole E401). Kokrystal mutantu E186D+F193V s DIMBOAG (obr. 15) naproti tomu ukazuje, že záměna jedné aminokyseliny, konkrétně F193, může vést k nepredikovatelné konformační změně, která se šíří na další okolní aminokyseliny (zejména je vidět odlišný rotamer F461). Přestože došlo k takové změně konformace hydrofobního klastru, nedošlo k zablokování vazby DIMBOAG, ale k vazbě v odlišné pozici substrátu (Verdoucq et al., 2003). To naznačuje určitou plasticitu specifity a to tak, že když měníme aminokyseliny hydrofobního klastru jako F193A, F200K, W373K, pozorované katalytické parametry mohou skrývat právě takové komplexní konformační změny ve vztahu k substrátu.

39

Obr. 15 3D Aktivní centrum mutanta ZmGlu1 E186D+F193V se substrátem DIMBOAG (hydrofobní klastr červená, katalytický pár aminokyselin žlutá). Stabilizace substrátu v aktivním centru je zajištěna jak na straně aglykonu tak glykonu, ale pro vytvoření komplexu enzym-substrát jsou výhodné jen některé konformace glykonu, srovnání je na (obr. 16), kde jsou přeloženy přes sebe pozice substrátu u mutanta E186D+F193V s DIMBOAG (glukóza v konformaci 4C1 ) a β-glukozidáza SbDhr1 se substrátem dhurrin (glukóza v konformaci 1S3 ).

Obr. 16 3D Superpozice substrátů DIMBOAG (zelená) a dhurrin (fialová) vzniklá přeložením struktur kokrystalu mutanta E186D+F193V a SbDhr1 (aglykony jsou značeny tmavším odstínem barvy). Pro skupinu β-glukozidáz zachovávajících po reakci konfiguraci glukózy platí, že ve stabilním komplexu, který vstupuje do glykozilačního kroku reakce, je glykon v konformaci 1 S3 (lodička). Pak se konformace mění přes tranzientní stav 4H3 (poloviční židlička) do 4C1 (židlička) na kovalentní intermediát, kdy je glukóza navázána na enzym. Toto schéma podporuje jak studie kokrystalu s inhibitorem glukotetrazolem (konformace 4H3 ) (Verdoucq

40

et al., 2004), tak data z výzkumu β-glukozidázy OsGlu1 na kokrystalu s 2-deoxy-2-fluoroglykozid, který tvoří s enzymem kovalentní intermediát (konformace 4C1) (obr.17).

Obr. 17 3D Superpozice dhurrinu v aktivním místě SbDhr1 (oranžová), glukotetrazolu v aktivním místě ZmGlu1 (zelená) a 2-deoxy-2-fluoro-glykozidu v aktivním místě OsGlu1 (modrá). Konzervativní katalytický pár aminokyselin (žlutá). Dhurrin se tedy váže do aktivního místa SbDhr1 rovnou ve formě stabilního komplexu. Z analýzy kontaktů mezi substrátem a aktivním centrem vyplývá, že interakce, do kterých vstupuje aglykon, ovlivňují umístění glykonu. V případě Zm-p60.1 a SbDhr1 je velký rozdíl v jejich specifitě dán zřejmě tím, že u Zm-p60.1 je hlavním stabilizačním prvkem hydrofobní interakce při vstupu do aktivního centra. Tento typ stabilizace může být kompatibilní s vícero aromatickými substráty, zatímco v případě SbDhr1 a substrátu dhurrin jde o stabilizaci přes polární interakce na straně aglykonu, což spolu s konformací glykonu zajišťuje výhradní specifitu vůči tomuto substrátu (Verdoucq et al., 2004). Řízená evoluce β-glukozidázy Zm-p60.1 Racionální design ve výzkumu β-glukozidázy odkryl velmi komplexní vztahy mezi aminokyselinami tvořícími aktivní centrum. Otázky, které na základě těchto výsledků vyplynuly, jsou jaká uspořádání aminokyselin v aktivním centru jsou možná při zachování struktury a funkce enzymu, případně které aminokyselinové záměny mohou pozitivně ovlivnit stabilitu a funkci námi již vytvořených mutantů. Tento typ otázek se velmi dobře hodí k využití metod řízené evoluce. Strategie pro vnášení mutací do struktury β-glukozidázy Zm-p60.1 vycházela z poznatku, že aminokyselinové zbytky v aktivním centru se navzájem ovlivňují jak co do determinace správné geometrie substrátu vhodné pro katalýzu tak celkové stability proteinu. Proto byla

41

vyvíjena metoda pro vnášení mutací do přesně vymezených oblastí proteinu sousedících s aminokyselinami dříve popsanými jako hydrofobní klastr. Pro vnášení mutací bylo použito speciálně navržených oligonukleotidů. Jejich design si vyžádal vývoj nového programu. Při návrhu postupu řízené evoluce bylo třeba teoreticky vyřešit dva související problémy. Jak velkou oblast můžeme v rámci projektu měnit, neboli kolik aminokyselinových záměn můžeme v cílové oblasti provést tak, abychom v rámci rozsahu testování byli schopni postihnout případné pozitivní mutace. Jak připravit oligonukleotidy s takovou úrovní degenerace, aby jejich množina obsahovala kýžené mutace s rozumnou pravděpodobností a současně byly tyto oligonukleotidy stále dostatečně homologní s původní sekvencí pro zajištění kompatibility s metodikou řízené mutageneze. Teoretické pozadí simulace řízené mutageneze Při simulaci jsem vycházel z biologických faktů o procesu řízené mutageneze a současně z technických parametrů chemické syntézy degenerovaných oligonukleotidů. V klasickém uspořádání chemická syntéza degenerovaných oligonukleotidů probíhá stejně jako u standardních oligonukleotidů, jen v místě degenerace se odebere současně ze dvou tří nebo všech čtyř zásobníků bazí a tudíž se syntetizovaná množina oligonukleotidů rozdělí v poměrech 1:1, 1:1:1, 1:1:1:1 na podmnožiny s danými bazemi na degenerovaném místě. Tento postup ale neumožňuje volnou mutovatelnost několika bazí za sebou při stanovené frekvenci, a tedy vytvoření oligonukleotidů s širší oblastí nesoucí mutace použitelných pro zamýšlenou řízenou mutagenezi. Z hlediska řízené mutageneze, přestože cíleně měníme určité aminokyseliny, samozřejmě pracujeme s DNA. Genetický kód obsahuje 64 kombinací nukleotidů z toho 3 stop kodony. Ostatních 61 kodonů je využíváno v různém stupni degenerace ke kódování dvaceti standardních aminokyselin. Při náhodné mutagenezi je výsledná frekvence dané aminokyseliny závislá na počtu kodonů, které ji kódují a rovněž která z pozic v tripletu je mutována. Je to evidentní zejména v případě methioninu a tryptofanu, které jsou kódovány pouze jedním kodonem. Tyto vztahy bylo nutné zapracovat do programu pro výpočet frekvencí mutací v syntetizovaných oligonukleotidech a z nich odvozených záměn aminokyselin. Popis programu Program má tři vstupy dat: 1. tabulka, do které se zadává, které zásobníky bazí na syntezátoru budou mít čisté baze a které budou mít směsi a v jakých poměrech 2. vstupní sekvence DNA 3. řádek označující pozice degenerovaných a standardních bazí na sekvenci DNA Celý program je vytvořen ve Visual Basic for Aplication a vstupním i výstupním prostředím je list aplikace Microsoft Excel. Nejdříve jsou do programu načteny hodnoty směsných poměrů nukleotidů. Poté je načtena vlastní sekvence zadané DNA s pozicemi, ve kterých bude degenerace. Následuje vytvoření náhodného oligonukleotidu podle matrice DNA sekvence. V každém kroku cyklu program

42

postupuje po jednom nukleotidu a vždy řeší, jestli bude daná pozice degenerovaná nebo zachovaná. Pokud je na dané pozici degenerace, program vygeneruje náhodné číslo a porovná jeho hodnotu s intervaly vypočtenými podle směsných poměrů zásobníku příslušného pro danou bazi. Podle toho je pak zvoleno, jestli nastane změna, případně která baze bude na dané pozici. Až je takto vytvořený oligonukleotid hotový, proběhne jeho virtuální translace. V rámci virtuální translace jsem řešil, jaký algoritmus zvolit s ohledem na maximální rychlost procedury. Nejjednodušší je srovnávat celé kodony a přiřazovat jim příslušné aminokyseliny, ale tento postup vyžaduje srovnávat daný kodon vždy se všemi ostatními kodony, což v ideálním případě může znamenat jednokrokové přiřazení, ale v nejhorším případě šedesát tři zbytečných přiřazení. Rozhodl jsem se v určování kodonů využít jejich degenerace, takže program postupuje po nukleotidech a v případě degenerovaných kodonů je možné velmi rychle už po druhé bazi přiřadit aminokyselinu. Tímto způsobem vznikne virtuální peptid. Vzhledem ke kombinatorické bohatosti je zapotřebí generovat tak velké množství těchto peptidů, že jejich hromadné zpracování po doběhnutí rozsáhlejší simulace je mimo možnosti stolního počítače. Proto jsem zvolil postup, kdy je programem zpracován vždy jeden peptid a poté zapomenut a pracuje se s novým. Vyhodnocení peptidu spočívá v záznamu jeho sekvence ve formě načítání hodnot do dvourozměrného vyhodnocovacího pole. První rozměr je délka peptidu, druhý rozměr je dvacet pozic pro jednotlivé aminokyseliny. Vyhodnocovaný peptid je možné takto zaznamenat ve formě počtu aminokyselin příslušného druhu na dané pozici v peptidu. Po skončení výpočtu je pole přepočítáno do frekvenčního grafu. Výpočet je možné ukončit nastavením pevného počtu generovaných peptidů nebo dopočítáním dokud není generován první tryptofan na každé pozici. Z tohoto výpočtu lze zhruba odhadnout dobu, po které se celý výpočet zdvojnásobí, a tedy jak dlouho bude trvat ustálení hodnot například deset cyklů. Výstupem programu je tedy frekvenční graf zastoupení aminokyselin na mutovaných pozicích peptidu s uvedením, kolik simulovaných peptidů bylo vytvořeno a jak dlouho trval výpočet. Dále program může poskytnout grafy rozložení počtu mutovaných bazí. Dá se tedy vypočítat, při jakých směšovacích poměrech bazí se v množině připravených oligonukleotidů budou vyskytovat oligonukleotidy s různým počtem mutací a jejich relativní zastoupení (obr 18). Generátor nahodilosti Popsaná simulace je co do rychlosti a kvality do značné míry závislá na generování obrovského počtu náhodných čísel, přičemž problémem je kvalitní generátor nahodilosti. Počítačem generovaná posloupnost je vždy pseudonáhodná a výsledná kvalita pseudonáhodných čísel závisí na funkci, podle které se získávají. V excelu použitý generátor (Wichmann a Hill, 1982) je nedostatečný a odchylky od nahodilosti se projevují už pokud je požadováno více než milion pseudonáhodných čísel za sebou. Problém s generátorem jsem vyřešil implementováním aplikace Zrandom poskytující generátor pseudonáhodných čísel Mersenne-Twister (Matsumoto a Nishimura, 1998); algoritmus je velmi rychlý s periodou opakování číselné řady 2 x 1019937, což je pro naše simulace více než dostačující. Coupling Simulace náhodných oligonukleotidů vychází z idealizované představy, že při chemické syntéze oligonukleotidu jsou baze zcela rovnocenné z hlediska vazby na narůstající řetězec. Z technických konzultací s firmou Generi biotech vyplynulo, že v praxi tomu tak není. Empiricky byly zjištěny poměry, v jakých se při syntéze jednotlivé baze začleňují. Fenomén bývá označován jako coupling bazí. Směsné poměry bazí ze simulace je tedy třeba pro syntézu upravit podle couplingu, aby docházelo k syntéze požadovaných degenerovaných oligonukleotidů v odpovídajících pravděpodobnostech.

43

Tabulka pro zadávání směsných poměrů

Řádky pro zadávání sekvence oligonukleotidů a zásobníků syntezátoru

Frekvenční graf zobrazuje výsledek výpočtu Obr. 18 náhled na list aplikace Microsoft excel s programem Mutagen 2.1.

Výsledky programu Mutagen 2.1 oligo: 58bazí(47 se mění), 97:1:1:1, 100 000 simulací, průměr 1,23594 mutace/oligo Frekvence mutací pro dané oligo

40,00 35,00 procentuální zastoupení

30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 >20

počty m utací (bodových)

44

oligo: 58bazí(47 se mění), 94:2:2:2, 100 000 simulací, průměr 2,46059 mutace/oligo Frekvence mutací pro dané oligo

30,00

procentuální zastoupení

25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 >20

počty m utací (bodových)

oligo: 58bazí(47 se mění), 91:3:3:3, 100 000 simulací, průměr 3,67999 mutace/oligo Frekvence mutací pro dané oligo

25,00

procentuální zastoupení

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 >20

počty m utací (bodových)

Za pomoci programu Mutagen 2.1 byly navrhnuty a poté syntetizovány oligonukleotidy: Oligo_42_VAR: 5'-GCC CTG agg gta cat gta gat ttt tgg att tcc cat AGG AGG-3' Oligo_42_KONST: 5'-GCC CTG agg gta cat gta gat TTT tgg att tcc cat AGG AGG-3' Oligo_58_VAR: 5'-GCA CCG acc tgg ggc ttt gac ccc agt tcc gta gga cgc gga agt aaa tgt CTG GGG C-3' Oligo_58_KONST:5'-GCA CCG acc tgg ggc TTT gac ccc agt tcc gta gga CGC gga agt aaa tgt CTG GGG C-3'

45

Oligo_42_ vnáší mutace do okolí aminokyseliny W373, přičemž varianta VAR počítá i s mutací aminokyseliny W373 na rozdíl od varianty KONST, která tuto aminokyselinu zachovává nezměněnu. Stejným způsobem Oligo_58_VAR a KONST vnáší mutace do okolí aminokyselin F193 a F200. Vývoj metody skríningu Neoddělitelnou součástí metody řízené evoluce je skríning. Skríning by měl být co nejjednodušší co do počtu kroků a také výsledky by měly být snadno interpretovatelné vzhledem k velkému počtu generovaných mutací. Pro naše účely jsme zvolili testování kolonií na miskách. Záměrem bylo po transformaci kompetentních E.coli buněk v rámci řízené mutageneze rovnou připojit detekci kolonií na miskách na základě štěpení glukozidu s chromogenním aglykonem. Testoval jsem celkem tři substráty PNPG resorufin-glukozid (R-GLU) a 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-Dglukopyranozid (X-GLU). Testovaný kmen E.coli bl21 plys nesl konstrukty divokého typu a mutanty F461L a P2. Další mutanti P3 a P4 byli v experimentu navíc pro ověření jejich dříve pozorované ztráty aktivity, takže posloužili spolu s P2 jako kontroly pozadí metody (obr. 19). Prvním testovacím glukozidem byl PNPG substrát používaný v rámci měření enzymové kinetiky. Tento substrát se ale neosvědčil. Z našich výsledků jsme došli k závěru, že aglykon nitrofenol rychle difunduje do média, a tudíž není možné pozitivní mutanty rozlišit. R-GLU rovněž jako substát nefungoval, přestože vzhledem ke své velikosti jistě nebyl tak difůzní jako PNPG, ale nelze určit, jestli pronikl do buněk. Vzhledem k červené barvě také nebyl dostatečně kontrastní ve žlutém médiu. X-GLU v testech dopadl výborně. Aglykon tvoří modré barvivo, které málo difunduje a na žlutých miskách vytváří dobře odlišitelné zdánlivě zelené kolonie. Nejlépe byl efekt pozorovatelný podle předpokladu u divokého typu a také u F461L při použití izopropyl-β-D-thiogalaktozidu (IPTG) jako induktoru exprese βglukozidázy v buňkách E.coli bl21. Dále byly optimalizovány podmínky skríningu zejména použitelné koncentrace X-GLU a IPTG v médiu a (obr. 20). Vzhledem k tomu, že konstrukt Zm-p60.r se překlonovává, byly testovány jak cílové buňky po řízené mutagenezi E.coli XL gold tak skladovací kmen E.coli Dh5α a expresní kmen E.coli bl21 plys (obr. 21). Pokud byl zaklonován konstrukt Zm-p60.r, klony byly označeny jako divoký typ (WT) s poznámkou o jaký kmen jde. Výsledek testování ukázal, že dostatečná koncentrace X-GLU je 1mg/50ml media. Nejlepším kmenem se v testech ukázal E.coli XL gold kmeny E.coli Dh5α a E.coli bl21 měly velmi malou až žádnou odezvu v testu, což si vysvětlujeme nízkou expresí vektoru až potlačenou expresí vektoru v případě E.coli bl21. Zvýšená exprese Zm-p60.1 spuštěná IPTG vedla k rychlejšímu zbarvení kolonií, ale zároveň byl tímto zásahem růst kolonií výrazně redukován, takže jsme se rozhodli IPTG dále nepoužívat. Dostatečná exprese v případě E.coli XL gold umožnila zařadit skríning hned po řízené mutagenezi a vyhnout se tak překlonovávání.

46

X-GLU

PNPG

R-GLU

Obr. 19 Testovací série pro substráty X-GLU, PNPG, R-GLU. Na miskách naneseny kmeny E.coli s vektory nesoucími WT a mutanty P2, P3, P4 a F461L. Spodní řada misek obsahuje navíc IPTG. Zbarvení je patrné pouze u WT, a to jak na misce s IPTG tak i bez a u F461L na misce s IPTG.

47

Obr. 20 Optimalizace koncentrace X-GLU a IPTG pro kmen E. coli Bl21 nesoucí konstrukt Zm-p60.r (WT).

48

Kontrola bez X-GLU IPTG

X-GLU bez IPTG

Kontrola bez X-GLU bez IPTG

X-GLU IPTG

Obr. 21 Testování vlivu bakteriálních kmenů E. coli nesoucích stejný konstrukt na expresi glukozidázy. WT v kmenech Bl 21 (WT 21) a DH5a (WTa). F461L v kmenech BL21(FBL) a XLGold (FG). Rovněž je testován vliv IPTG. Skríning na miskách. Na základě předchozích testů byly připraveny misky s obsahem X-GLU jako detekčním činidlem pro identifikaci pozitivních mutací. Směsi byly nejdříve naneseny v objemu 1μl, 10μl a 100μl na Petriho misky pro určení správného objemu na rozsáhlý výsev. Druhý den po srovnání počtu kolonií byly směsi resuspendovány a vysety každá na 10 misek. Misky byly inkubovány při 37 ºC dva dny a dále při pokojové teplotě až dva týdny. Izolované pozitivní klony byly použity k sekvenačnímu ověření zavedené mutace. V případě potvrzení mutace byly transformovány do bakteriálních buněk expresního kmene E. coli BL21(DE3)pLyS umožňujícího produkci mutovaných proteinů, případně do kmene DH5α. Vzhledem k rozsahu experimentu a lepšímu využití prostoru inkubátorů byly vybrány čtvercové misky s objemem 20ml agaru. V návazném kroku řízené evoluce byl použit identický postup. Jako templát sloužil mutantní vektor vyselektovaný skríningem z původní kombinace templátu P2+ primery OLIGO_58_VAR + OLIGO_42_VAR. Byl navržen nový mutagenní primer, který zachovává mutaci vnesenou v předchozím kole mutageneze a v jejím okolí vnáší další variabilitu. Oligo_F1_KONST:5'-GCA CCG acc tgg ggc TTT gac ccc agt tcc gta gga CGC GGC agt aaa tgt CTG GGG C-3'.

49

Směry řízené evoluce

Pro strategii řízené evoluce jsme navrhli dva základní směry podle templátu, ze kterého se vycházelo. První směr vycházel z templátu P2 a hledaly se mutace, které by mohly přispět k obnovení funkce proteinu, který vlivem záměny čtyř aminokyselin v hlavním hydrofobním klastru nemá detekovatelnou aktivitu a také podle dat s CD spektroskopie má porušen poměr zastoupení sekundárních struktur. Zde mělo být použito "hrubé síly" a byly měněny aminokyseliny v rámci širší oblasti aktivního centra. Zamýšlená změna měla být kvalitativní oproti výchozímu stavu. V rámci skríningu bylo otestováno přibližně 50 000 klonů. Byly nalezeny dvě pozitivní kolonie (označení F1, F2). Kolonie byly přeočkovány na nové selektivní misky a po opětovném potvrzení pozitivity byly namnoženy v tekutém médiu. Po izolaci plazmidové DNA byly mutace potvrzeny sekvencováním. Sekvence F1 nese dvě bodové mutace t191g, c1348t. Výsledkem je změna aminokyseliny S192A, druhá mutace nemění smysl kodonu. Sekvence F2 nese tři bodové mutace a788c, c798t, g818t. Výsledkem jsou změny aminokyselin T191P, S194F, A201S. Vzhledem k tomu, že sekvence F1 nesla pouze jednu záměnu aminokyseliny, dále jsme testovali tento klon. Nejprve byl plazmidem transformován expresní kmen E.coli bl21 a dále se postupovalo podle expresního protokolu. Pro charakterizaci lyzátů F1, F2 jsme použili aktivitní barvení v gelu pomocí substrátu bromnaftylu. Výsledek na (obr. 22) je nejednoznačný. Ve srovnání s purifikovaným divokým typem i jeho lyzáty lze říct, že pokud mají mutanti F1 a F2 aktivitu, tak je na hranici rozlišitelnosti metody. WTP P2P WTL WTL /

F1L F1L /

F2L F2L

Obr. 22 Aktivitní barvení lyzátu. Na gelu jsou naneseny: WTP-purifikovaný divoký typ, P2P purifikovaný mutant P2, WTL divoký typ lyzát, F1L lyzat, F2L lyzát.

50

Dalším postupem byla purifikace proteinu F1. Purifikační postup sestával z dvoukrokové metody, kde byl protein nejprve separován za použití metalo afinitní chromatografie (IMAC) a dále molekulové vylučovací chromatografie (Filipi, nepublikováno).V rámci purifikace se ale ukázalo, že protein F1 v čisté formě nemá detekovatelnou aktivitu, ale některé jiné frakce po purifikaci stále mírnou aktivitu vykazovaly. V dalším kroku řízené evoluce byla použita kombinace templátu P2 a primeru Oligo_F1_KONST. Druhá generace F1 (F1.G2) vytvořila na skríningových miskách málo kolonií. Pravděpodobně nové konstrukty negativně ovlivnily životaschopnost E.coli. Některé z kolonií byly pozitivní a budou dále charakterizovány (obr. 23).

Obr. 23 Návazná generace F1G2 řízené evoluce F1. Selekční miska obsahující X-GLC Druhý směr řízené evoluce vycházel z templátu W373K. Tento směr je opakem předchozího. Základem je protein, který má zachovánu nízkou aktivitu. Cíleně se mění úzká oblast kolem aminokyseliny K373. Mělo dojít k jemným změnám v aktivitě proteinu nejlépe ve smyslu zvýšení aktivity. Zamýšlená změna měla být kvantitativní rozdíl oproti výchozímu stavu. Vzhledem k tomu, že všechny kolonie byly ve skutečnosti mírně pozitivní, snažil jsem se zachytit ty klony, které reagovaly zbarvením nejrychleji a s největší intenzitou. Takto byly vyselektovány klony W373K1-5. Klony byly přeočkovány a byly z nich připraveny bakteriální konzervy. Následně byly bakteriální lyzáty z W373K1-5 testovány na specifickou aktivitu na substrátu PNPG (obr. 24).

51

Srovnání specifické aktivity mutantů v lyzátech na substrátu PNPG

Specifická aktivita (% W373K)

700 600 500 400 300 200 100 0 W373K

W373K(mut1) W373K(mut2) W373K(mut3) W373K(mut4) W373K(mut5)

Obr. 24 Graf specifické aktivity lyzátů klonů W373K1-5. Ze všech pěti klonů byla izolována plazmidová DNA a určena sekvence. Ukázalo se, že ve skutečnosti nesou mutace pouze klony W373K2 a W373K4. Sekvence W373K2 nese jednu bodovou mutaci c1331t. Výsledkem je záměna aminokyseliny P372S. Sekvence W373K4 nese dvě bodové mutace c1331a, a1343c. Výsledkem je záměna aminokyselin P372T a M376L. W373K2 a W373K4 byly poté překlonovány do expresního kmene E.coli BL21 a dále exprimovány a purifikovány (Filipi, nepublikováno). Purifikované proteiny byly poté dále charakterizovány měřením specifické aktivity a jejím porovnáním s purifikovaným proteinem W373K.

52

Specifická aktivita (% W373K)

Srovnání specifické aktivity purifikovaných mutantů na substrátu PNPG

140 120 100 80 60 40 20 0 W373K

W373K(mut2)

W373K(mut4)

Obr. 25 Graf srovnání specifických aktivit purifikovaných proteinů mutantů odvozených z W373K. Zhodnocení vývoje metody řízené evoluce β-glukozidázy Zm-p60.1 V naší práci jsme metodu zlepšovali ve dvou oblastech. První oblast je vytvoření sofistikovaného postupu pro návrh mutagenních primerů. Pro tento účel se podařilo vytvořit program, který řeší směsné poměry bazí při syntéze oligonukleotidú. Výsledný nejlepší poměr je 94:2:2:2. V takto syntetizovaných primerech dochází k mutacím ve frekvenci průměrně 2,46059 mutace vnášené jedním primerem. Taková frekvence záměn umožňuje při délkách primerů 42 a 58 nukleotidů dostatečnou míru homologie pro polymerázovou reakci. Druhá oblast je vytvoření jednoduchého skríningu na funkční varianty β-glukozidázy po mutagenezi. Zde se ukázalo, že pro transformanty divokého typu je možné sledovat aktivitu β-glukozidázy přímo zbarvením kolonií na miskách obsahujících optimalizovanou koncentraci X-GLU. Využívá se zde zbytkové aktivity T7 promotoru vektoru pRSET:: (His)6Zm-p60.r. v buňkách Escherichia coli kmen Xl-gold nebo lze v rámci expresních buněk E. coli BL21 indukovat expresi pomocí IPTG. Pokud mutantní forma β-glukozidázy štěpí XGLU, projeví se to změnou zbarvení kolonií z bílého na modré. V rámci testování méně aktivního mutanta W373K a posléze neaktivního P2 se ukázalo, že je v rámci skríningu selektována i aktivita, která není způsobena transgenní β−glukozidázou. Pokusy s opětovnou kultivací pozitivních kolonií ukázaly, že se jedná o velmi vzácný jev, kdy potomci pozitivní kolonie většinou přetrvávají v novém fenotypu, ale malá frakce se vždy vrací k původnímu negativnímu fenotypu. V pokusech in vitro se ukázalo, že při testování aktivity v lyzátech, na rozdíl od β-glukozidázové aktivity, neznámou aktivitu brzdí přítomnost citrát-fosfátového pufru. Literární rešerše ukázala, že přestože u E. coli byly popsány sekvence glykozidáz, nebyla objevena glukozidázová aktivita vyjma 6-P-b-glukozidázové, což nás přivedlo na stopu bgl operonu. E.coli divokého typu nejsou schopny využít aromatické glukozidy jako arbutin nebo salicin, protože hlavní genetický systém kódující funkce potřebné k jejich katabolizmu bgl operon je umlčený a neindukovatelný. Operon obsahuje tři geny: bglG slouží jako antiterminátor operonu, bglF kóduje součást fosfotransferázy a bglB kóduje fosfo-beta-glukozidázu zodpovědnou za štěpení fosforilovaných substrátů (Madan et al., 2005). Většina divokých kmenů je fenotipově Bgl-, ale spontánně se v populaci objevují mutanti Bgl+ v detekovatelné 53

frekvenci (Schnetz a Rak, 1992; Ueguchi et al., 1998). Operon je v případě aktivace náhodnou mutací pleiotropně regulován a jeho exprese se v různých kmenech liší (Schnetz, 2002). Pro ověření funkce bgl operonu v našich podmínkách jsme navázali spolupráci s profesorem Mahadevanem a získali kmeny E.coli ZK819-97T (Bgl+) a ZK819-97dbgl(Bgl-) (Madan et al., 2005). Kmeny jsme otestovali na miskách s X-GLU (obr. 26).

Obr. 26 Testování kmenů E.coli ZK819-97T (Bgl+) a ZK819-97dbgl(Bgl-) na miskách s XGLU. Test jasně prokázal, že aktivní Bgl operon je schopen zpracovávat X-GLU. Rovněž se ukázalo, že pokud je operon delečně vyřazen, nedochází ke spontánnímu výskytu pozitivních kolonií. Vzhledem k uvedeným skutečnostem jsme došeli k závěru, že neznámá aktivita, která se projevuje vedle aktivity námi transformovaných mutantů β-glukozidázy, bude s největší pravděpodobností aktivita 6-fosfoglukozidázy z náhodně aktivovaného a námi selektovaného bgl operonu. Přestože se ukázalo, že skríning nebyl spolehlivý, podařilo se získat zajímavé mutanty W373K2 a W373K4. Dosavadní charakterizace ukazuje, že mutant W373K2 má sníženou aktivitu vůči substrátu PNPG v porovnání s výchozím W373K, zatímco W373K4 má aktivitu zvýšenou.

Nová metoda pro studium enzymové kinetiky vzácných glukozidů (příloha disertace 2) Z předchozích zkušeností z vývoje metod pro studium kinetiky glukozidů β-glukozidázy Zmp60.1 vyplynul soubor podmínek kladených na novou metodu. Bylo třeba, aby glukozidázová reakce probíhala při podmínkách pH 5,5 v citrát fosfátovém pufru při teplotě 30 ˚C. Ze zkušeností s HPLC-MS jsme věděli, že enzym není možné příliš ředit kvůli možné ztrátě 54

aktivity. Z toho rovněž vyplývá, že s koncentrovaným enzymem není možné měřit příliš dlouho, aby nedošlo k přeměně více než 5% substrátu a kinetika tím nebyla ovlivněna. Koncentrovaný enzym lze přidávat do většího reakčního objemu, a tím regulovat jeho výslednou koncentraci a s tím spojenou reakční rychlost. Náš zájem byl však spíše snížit reakční objem, protože vzhledem ke KM substrátů bylo třeba k měření používat jejich vysoké koncentrace, což je v případě ZOG finančně velmi nákladné. Metoda musela nakonec zohlednit všechny tyto podmínky. Pro vývoj metody pro stanovení přirozených substrátů β-glukozidázy bylo třeba jako základ zvolit systém, který bude nejlépe přizpůsobitelný našim požadavkům zejména na rychlost a citlivost analýzy. Proto jsme vybrali systém glukózooxidáza (GO)/peroxidáza (HPR) na fluorescenčním substrátu. Základním problémem při měření kinetiky je volba mezi kontinuálním a diskontinuálním měřením. Diskontinuální měření Pro umělé substráty jako je PNPG nebo MUG máme dobré zkušenosti s diskontinuálním měřením, při kterém jsou z probíhající reakce odebírány alikvoty, v nichž je reakce zastavena a obsah produktu změřen spektrofotometricky, případně fluorimetricky. Předpokladem je, že způsob zastavení reakce neznemožňuje následné stanovení produktu. Z našich zkušeností i z literatury známe několik možností, jak enzymovou reakci zastavit; jsou to buď přídavky agresivních chemikálií nebo extrémní zahřátí či chlazení reakční směsi způsobující denaturaci enzymu. Některé z těchto metod jsou použitelné pro spektrofotometrické stanovení aglykonů, ale žádná z nich není slučitelná s následným stanovením glukózy za použití enzymů pracujících při normálním pH a teplotě. Tento problém jsme se pokusili obejít následující úvahou. Pokud z běžící glukozidázové reakce odebereme alikvot a v něm určíme množství glukózy tak rychle, aby rychlost analýzy byla o dva řády větší než rychlost glukozidázové reakce při Vlim, potom přestože glukozidázová reakce nebude zastavena, bude chyba stanovení glukózy tím způsobená zanedbatelná. Proto jsme se rozhodli vyvíjet metodu detekce glukózy s důrazem na rychlost. Optimalizace komponent detekčního systému Základem pro vývoj nové metody bylo testování komerční soupravy (kitu) pro stanovení glukózy Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (Molecular probes). Substrátem pro peroxidázu je zde nový derivát resorufinu pod komerčním názvem Amplex Red (AR). Při použití vyšších koncentrací enzymů se začala projevovat nespecifická aktivita bez přítomnosti glukózy. Systém byl rozebrán a komponenty testovány jednotlivě. Nejvíce k nespecifické reakci přispívala GO, proto byly zakoupeny vzorky z několika různých zdrojů, rovněž byly testovány dvě různé HRP. Pro další práci byla vybrána kombinace enzymů GO (Fluka kat. č. 49180) a HRP (Fluka kat. č. 77333) se zanedbatelnou nespecifickou aktivitou. Rovněž byl testován substrát AR a vyměněn za amplex ultra red (AUR) vzhledem k jeho lepší stabilitě v nižším pH. Pro udržení aktivity roztoků enzymů a zabránění samovolné oxidaci AUR byly všechny komponenty uchovávány v ochranné atmosféře N2 při -80 ˚C. Kalibrační přímku tvořily roztoky glukózy v rozmezí 1 - 20 uM. Pro měření byl použit Fluorimetr Fluorostar galaxy (BMG) umožňující měření na 96 jamkových mikrotitračních deskách a použití automatického injektoru s nastavitelným 55

objemem a rychlostí přídavku. Celý prostor stroje včetně všech roztoků byl temperovaný na 30 ˚C. Experimentální uspořádání pro diskontinuální měření bylo následující. Glukozidázová reakce byla odstartována přidáním β-glukozidázy do roztoku substrátu PNPG nebo ZOG o koncentracích 200 až 10000 uM. Reakční směs měla objem 1 ml a hned po odstartování byla nasáta do automatického injektoru. Injektorem byly poté dávkovány alikvoty reakční směsi v definovaných časech do jamek mikrotitrační desky s přichystanou detekční směsí (GO + HRP + AUR). Fluorescence vzorku se ustálila a byla odečtena v čase do 1s po přidání alikvotu. Celé měření většinou trvalo 2,5 min., přičemž byla změřena koncentrace glukózy pro šest až osm časových bodů pro každou koncentraci substrátu PNPG nebo ZOG. Detekční limit byl 2 uM glukóza. Při testování metody jsme zjistili, že takto měřené reakční rychlosti jsou stabilně nadhodnocené. Toto zjištění nás vedlo k podrobnému studiu dějů, ke kterým v rámci detekčních reakcí dochází se závěrem, že k nadhodnocování reakčních rychlostí dochází vinou rozdílných úrovní mutarotace glukózy v kalibračních roztocích a v detekční reakci. Mutarotace Mutarotace je přirozený proces, při kterém dochází v řádu minut k přeměně mezi α a β anomery cukrů. Po ustavení rovnováhy roztok obsahuje přibližně 36% α a 64% β anomeru. GO reaguje specificky s β anomerem. Pokud se pro stanovení glukózy použije procedura s dlouhými časy inkubace, rovnováha se ustaví jak v roztocích kalibrační přímky tak v detekční reakci, ale při rychlé detekční reakci se rovnováha neustaví. Glukozidázová reakce produkuje pouze β anomerní glukózu, proto jsou výsledné rychlosti nadhodnocené ve srovnání s kalibrační přímkou měřenou na roztocích, kde už část glukózy prodělala mutarotaci na α anomerní formu. Tento problém jsme překonali použitím nové kalibrace a také zavedením kontinuálního měření kinetik, abychom vyloučili vliv mutarotace v detekční reakci. Nová kalibrační přímka je měřena přímo na resorufinu jako oxidačnímu produktu AUR a je tedy na mutarotaci glukózy nezávislá. Kontinuální měření Výsledné uspořádání pro kontinuální měření bylo optimalizováno s ohledem na možnosti společného dávkování složek reakce. V reakční směsi tedy probíhají současně následující reakce: b-glucosidase cytokinin-O-glucoside ------------>cytokinin + glucose glucose oxidase glucose + O2 ------------------> D-gluconolactone + H2O2 horseradish peroxidase H2O2 + Amplex UltraRed ----------------> resorufin

Návaznost reakcí je naznačena na schématu na (obr. 27). Směs β-glukozidáza + GO + HRP je v injektoru. Reakce se startuje automaticky dávkováním této směsi enzymů do jamek na mikrotitrační desce, kde je vždy příslušná koncentrace PNPG nebo ZOG a AUR. 0,5 s po spuštění reakce (po ustálení hladiny) se začne měřit fluorescence. Kontinuální měření trvá standardně 2,5 s a pro každou koncentraci substrátu bývá změřeno devět časových bodů. Celkový objem reakční směsi byl zredukován na 150 ul. Detekční limit byl 100nM glukóza v reakční směsi. 56

Obr. 27 Schéma součinnosti reakcí v metodě stanovení kinetických parametrů přirozených substrátů β-glukozidáz. Validace metody Pro ověření použitelnosti nové metody pro měření kinetických parametrů byl vybrán substrát PNPG. Standardní metodou byly měřeny reakční rychlosti stanovením produktu p-nitrofenolu spektrofotometricky. Pro srovnání s fluorimetrickým stanovením byly použity koncentrace PNPG 200, 400, 600, 800, 1000, 3000 a 10000 μM, aby bylo možné otestovat shodu v celém rozsahu měřených koncentrací. Novou metodou byly proměřeny stejné koncentrace PNPG na základě stanovení glukózy. V rychlostech nebyl signifikantní rozdíl, což potvrdilo použitelnost metody (Obr. 28).

57

Obr. 28 Srovnání nové metody se standardní spektrofotometrickou metodou. Při použití substrátu PNPG byla fluorimetricky určována rychlost uvolňování glukózy a srovnána s rychlostí uvolňování p-nitrofenolu v paralelním pokusu za stejných podmínek. Měření kinetických parametrů pro ZOG ZOG přirozený fytohormonový konjugát s glukózou a substrát β- glukozidázy Zm-p60.1 je štěpen na glukózu a trans-zeatin. Fluorimetrické stanovení glukózy bylo provedeno v rozsahu koncentrací 100 - 10000 uM ZOG. Hodnota KM byla 697,43 +- 41,3 uM a kcat byla 4,58+-0,09 s-1 (Fig. 2 příloha disertace 2). Hodnoty byly získány proložením nelineární regrese daty závislosti počáteční rychlosti na koncentraci substrátu pomocí programu Origin.

Obr. 29 Hyperbolická závislost rychlosti štěpení substrátu ZOG β-glukozidázou Zm-p60.1 na koncentraci substrátu použitá pro výpočet parametrů KM a kcat. 58

Závěry Závěry z vyhodnocení strukturních a funkčních faktorů určujících substrátovou specifitu rostlinných β-glukozidáz Substrátová specifita rostlinných glukozidáz je komplexním jevem, kdy do hry vstupuje interakce s aglykonem i glykonem substrátu a současně zahrnuje interakce s měnícími se konformery substrátu během reakce. Specifita je také závislá na koncentraci do reakce vstupujících substrátů, přičemž průběh této závislosti je charakteristický pro každý enzym. Data získaná studiem mutantů v aminokyselinách aktivního centra ukazují, že přirozená variabilita aminokyselin na těchto pozicích může způsobovat zásadní odlišnosti ve specifitě βglukozidáz a zřejmě souvisí s funkcemi β-glukozidáz a podmínkami, při kterých pracují. Specifita je realizována odlišnou strukturou a složením aktivních center β-glukozidáz. Terciární struktura (β/α)8barel umožňuje vytvářet aktivní centra s možností do značné míry kombinovat aminokyseliny v nich zastoupené. Není to však kombinovatelnost volná, protože u většiny uměle připravených mutantů dochází k výraznému snížení katalytické rychlosti, ztrátě specifity či poškození sekundární a vyšších uspořádání struktury. Z našich výsledků rovněž plyne, že kromě známých strukturních faktorů určujících specifitu enzymů jako jsou stabilizace komplexů se substrátem v průběhu reakce pomocí vodíkových vazeb či hydrofobních interakcí, se mohou objevovat nové faktory s možným vlivem na specifitu. Mohou jimi být například neproduktivní módy vazby substrátu do aktivního centra nebo skryté struktury proteinového interiéru s možným vlivem na konformační chování substrátu během reakce. Spíše než vlastnost enzymu je specifita dynamickým stavem závislým in vitro na jedinečné kombinaci enzymu a substrátů a v podmínkách reakce in vivo na dalších zúčastněných molekulách a vlastnostech prostředí. Závěry z vývoje metody řízené evoluce kukuřičné β-glukozidázy Zm-p60.1 Při použití metody řízené evoluce je základní krok charakterizován vnášením nové genetické variability, v našem případě metodou řízené mutageneze, a následuje selekce nejlepších variant, tedy funkčních β-glukozidáz. Metody pro postižení těchto hlavních součástí řízené evoluce jsme vyvíjeli se zřetelem jak na použitelnost pro náš experimentální objekt, tak se snahou přispět k vývoji metodologie řízené evoluce obecně. Podařilo se nám vylepšit definování a cílení genetické variability prostřednictvím programu pro návrh speciálních mutagenních primerů pro řízenou mutagenezi. Při zavádění jednoduchého skríningu využívajícího přímo katalytické funkce studovaného enzymu se projevila neznámá glukozidázová aktivita, která ovlivnila skutečné výsledky skríningu. Neznámá aktivita byla za pomoci nových testovacích kmenů E.coli označena za aktivitu 6-fosfoglukozidázy z náhodně aktivovaného Bgl operonu. Úspěšné testování kmene s vyřazeným Bgl operonem vybízí k jeho použití jako základu pro nový cílový kmen pro skríning. V rámci řízené evoluce bylo získáno několik nových mutantů konstruovaných za účelem zjištění vlivu záměn aminokyselin na strukturu a funkci β-glukozidázy s vneseným lyzinem na klíčové pozici 373 (mutant W373K). Dva z těchto mutantů W373K2 a W373K4 vykazují enzymovou aktivitu. Ve srovnání s výchozím mutantem W373K má W373K2 45% specifické aktivity a W373K2 122% specifické aktivity na substrátu PNPG. Mutanti budou dále testováni pro získání kinetických parametrů Km a Kcat. Tito mutanti jsou rovněž dobrými kandidáty pro výchozí templáty při dalších kolech řízené evoluce.

59

Takto postavená metoda řízené evoluce bude dále vyvíjena s důrazem na konstrukci a testování skríningového kmene E.coli v rámci hledání strukturně funkčních souvislostí u rodiny β-glukozidáz Závěry z vývoje metody pro měření kinetiky přirozených substrátů β-glukozidáz Podařilo se vyvinout a zoptimalizovat metodu pro měření kinetických parametrů hydrolýzy glukozidů. Systém je založen na svázaných enzymových reakcích, kdy současně probíhá měřená reakce β-glukozidázy i reakce detekčních enzymů glukózooxidázy a peroxidázy. Detekčním činidlem je komerční látka amplex ultra red, která se v poměru 1:1 vůči detekované glukóze mění na silně fluorescenční resorufin. Metoda byla zoptimalizovaná pro substrát PNPG, což umožnilo její validaci srovnáním se standardní spektrofotometrickou metodou. Výhodou metody je fluorescenční stanovení, což zajišťuje vysokou citlivost (kolem 100nM glukóza), rychlost (změření reakční rychlosti do 3s) a malá spotřeba reaktantů (96 jamkový formát pokusu). Nevýhody jsou: enzymový systém, kdy předpokladem je, že měřené glukozidy neinteragují s žádnou komponentou detekčního systému. Velmi vysoká rychlost detekce odstraňující problém mutarotace, vyžaduje mimořádně čisté reagencie ve vysokých koncentracích a špičkovou fluorimetrickou instrumentaci. Pomocí této metody se podařilo stanovit kinetické parametry β-glukozidázy Zm-p60.1 vůči jejímu přirozenému substrátu ZOG. Pokud porovnáme naměřené hodnoty s více než desetinásobně nižší zdánlivou KM změřenou in vivo v chloroplastech tabáku (Kiran et al., 2006), otevírají se velmi zajímavé otázky vlivu subcelulární kompartmentace na specifitu βglukozidáz. Vzhledem k rozdílným koncentracím substrátů v kompartmentech nabývá na významu rovněž námi výše diskutovaný vztah mezi kocentracemi substrátů a měnící se specifitou vůči nim. Společným výsledkem těchto procesů může být ustavení hladin aktivních hormonů umožňující fyziologický děj jako například iniciaci dělení tabákových protoplastů exprimujících β-glukozidázu Zm-p60.1 (Brzobohatý et al., 1993).

60

Literatura Alexander PA, He Y, Chen Y, Orban J, Bryan PN. (2007) The design and characterization of two proteins with 88% sequence identity but different structure and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(29): 11963-8. Arnold FH. (2003) Directed enzyme evolution. Humana Press, New Jersey. s.v. Babock GD, Esen A. (1994) Substrate specificity of maize ß-glucosidase. Plant Science. 101: 31-39. Barrett T, Suresh CG, Tolley SP, Dodson EJ, Hughes MA. (1995) The crystal structure of a cyanogenic b-glucosidase from white clover, a family 1 glycosyl hydrolase. Structure. 3(9): 951-60. Berezovsky IN, Kirzhner A, Kirzhner VM, Trifonov EN. (2003) An Eye-Opener to Protein Structures. ComPlexUs. 1: 29–37. Brzobohatý B, Moore I, Kristoffersen P, Bakó L, Campos N, Schell J, Palme K. (1993) Release of active cytokinin by a ß-glucosidase localized to the maize root meristem. Science. 262: 1051-1054. Campos N, Bakó L, Brzobohatý B, Zettl FJR, Boland W, Palme K. (1993) Identification and characterization of a novel phytohormone conjugate specific b-glucosidase activity from maize. Acs Symposium Series. 533: 205-213. Ceccarelli EA, Carrillo N, Roveri OA. (2008) Efficiency function for comparing catalytic competence. Trends Biotechnol. 26(3): 117-8. Cicek M, Blanchard D, Bevan DR, Esen A. (2000) The aglycone specificity-determining sites are different in 2, 4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIMBOA)-glucosidase (Maize b-glucosidase) and dhurrinase (Sorghum b-glucosidase). J Biol Chem. 275(26): 20002-11. Clarke TR, Bain PA, Sha L, Payne AH. (1993) Enzyme characteristics of two distinct forms of mouse 3 b-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase complementary deoxyribonucleic acids expressed in COS-1 cells. Endocrinology. 132(5): 1971-6. Czjzek M, Cicek M, Zamboni V, Bevan DR, Henrissat B, Esen A. (2000) The mechanism of substrate (aglycone) specificity in b-glucosidases is revealed by crystal structures of mutant maize beta -glucosidase-DIMBOA, -DIMBOAGlc, and -dhurrin complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(25): 13555-60. Czjzek M, Cicek M, Zamboni V, Burmeister WP, Bevan DR, Henrissat B, Esen A. (2001) Crystal structure of a monocot (maize ZMGlu1) ß-glucosidase and its complex with pnitrophenyl-ß-D-thioglucoside. Biochem. J. 354: 37-46. Eisenthal R, Danson MJ, Hough DW. (2007) Catalytic efficiency and kcat/KM: a useful comparator? Trends Biotechnol. 25(6): 247-9.

61

Falk A, Rask L. (1995) Expression of a zeatin-O-glucoside-degrading b-glucosidase in Brassica napus. Plant Physiol. 108(4): 1369-77. Frauenfelder H. (2002) Proteins: paradigms of complexity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 Suppl. 1: 2479-80. Henn-Sax M. (2001) Divergent evolution of (b/a)8-barrel enzymes. Biol. Chem. 382: 13151320. Henrissat B, Bairoch A. (1996) Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J. 1;316 (Pt 2): 695-6. Henrissat B., Davies G. (1997) Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 7: 637-644. Henrissat B, Davies G. (2000) Glycoside hydrolases and glycosiltransferases. Families, modules, and implications for genomics. Plant Physiology 124: 1515-1519. Hill AD, Reilly PJ. (2008) Computational analysis of glycoside hydrolase family 1 specificities. Biopolymers. 89(11): 1021-31. Höcker B, Claren J, Sterner R. (2004) Mimicking enzyme evolution by generating new (betaalpha)8-barrels from (betaalpha)4-half-barrels.Proc Natl Acad Sci 23;101(47):16448-53 Chuenchor W, Pengthaisong S, Robinson RC, Yuvaniyama J, Oonanant W, Bevan DR, Esen A, Chen CJ, Opassiri R, Svasti J, Cairns JR. (2008) Structural insights into rice BGlu1 bglucosidase oligosaccharide hydrolysis and transglycosylation. J Mol Biol. 377(4): 1200-15. Kiran NS, Polanská L, Fohlerová R, Mazura P, Válková M, Smeral M, Zouhar J, Malbeck J, Dobrev PI, Machácková I, Brzobohaty B. (2006) Ectopic over-expression of the maize bglucosidase Zm-p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. J Exp Bot. 57(4): 985-96. Koshland DE. (1958) Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 44(2): 98-104. Koshland DE. (2002) The application and usefulness of the ratio k(cat)/K(M). Bioorg Chem. 30(3): 211-3. Levinthal C. (1968) Are there pathways for protein folding? Extrait du Journal de Chimie Physique. 65 no 1, p. 44. Lloyd S. (2000) Ultimate physical limits to computation. Nature. 406(6799): 1047-54. Lloyd S. (2002) Computational capacity of the universe. Phys Rev Lett. 88(23): 237901. Ly HD, Withers SG. (1999) Mutagenesis of glycosidases. Annu Rev Biochem. 68: 487-522. Ma BG, Chen L, Ji HF, Chen ZH, Yang FR, Wang L, Qu G, Jiang YY, Ji C, Zhang HY. (2008) Characters of very ancient proteins. Biochem Biophys Res Commun. 366(3): 607-11.

62

Madan R, Kolter R, Mahadevan S. (2005) Mutations that activate the silent bgl operon of Escherichia coli confer a growth advantage in stationary phase. J Bacteriol. 187(23): 7912-7. Matsumoto M, Nishimura T. (1998) Mersenne Twister: A 623-equidistributed uniform pseudorandom number generator. ACM Transactions on modeling and computer simulations: Special issue on uniform random number generation. Mazura P, Fohlerová R, Brzobohatý B, Kiran NS, Janda L. (2006) A new, sensitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides. J Biochem Biophys Methods. 68(1): 55-63. McCarter JD, Withers SG. (1994) Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr Opin Struct Biol. 4(6): 885-92. Minic Z. (2008) Physiological roles of plant glycoside hydrolases. Planta. 227(4): 723-40. Nagano N, Hutchinson EG, Thornton JM. (1999) Barrel structures in proteins: automatic identification and classification including a sequence analysis of TIM barrels. Protein Sci. 8(10): 2072-84. Pócsi I, Kiss L, Hughes MA, Nánási P. (1989) Kinetic investigation of the substrate specificity of the cyanogenic b-D-glucosidase (linamarase) of white clover. Arch Biochem Biophys. 272(2): 496-506. Rigden DJ, Jedrzejas MJ, de Mello LV. (2003) Identification and analysis of catalytic TIM barrel domains in seven further glycoside hydrolase families. FEBS Lett. 5;544(1-3): 103-11. Rotrekl V, Nejedlá E, Kučera I, Abdallah F, Palme K, Brzobohatý B. (1999) The role of cysteine residues in structure and enzyme activity of a maize b-glucosidase. Eur J Biochem. 266(3): 1056-65. Schnetz K. (2002) Silencing of the Escherichia coli bgl operon by RpoS requires Crl. Microbiology. 148(Pt 8): 2573-8. Schnetz K, Rak B. (1992) IS5: a mobile enhancer of transcription in Escherichia coli Proc Natl Acad Sci U S A. 89(4): 1244. Sue M, Yamazaki K, Yajima S, Nomura T, Matsukawa T, Iwamura H, Miyamoto T. (2006) Molecular and structural characterization of hexameric b-D-glucosidases in wheat and rye. Plant Physiol. 141(4): 1237-47. Ueguchi C, Ohta T, Seto C, Suzuki T, Mizuno T. (1998) The leuO gene product has a latent ability to relieve bgl silencing in Escherichia coli. Journal of bacteriology.p. 190–193. Vallmitjana M, Ferrer-Navarro M, Planell R, Abel M, Ausín C, Querol E, Planas A, PérezPons JA. (2001) Mechanism of the family 1 b-glucosidase from Streptomyces sp: catalytic residues and kinetic studies. Biochemistry. 40(20): 5975-82.

63

Vega MC. (2003) Evolutionary markers in the (b/a)8-barrel fold. Current Opinion in Chemical Biology. 7: 694-701. Verdoucq L, Czjzek M, Moriniere J, Bevan DR, Esen A. (2003) Mutational and structural analysis of aglycone specificity in maize and sorghum ß-glucosidases. J. Biol. Chem. 278: 25055-25062. Verdoucq L, Morinière J, Bevan DR, Esen A, Vasella A, Henrissat B, Czjze M. (2004) Structural determinants of substrate specificity in family 1 b-glucosidases: novel insights from the crystal structure of sorghum dhurrinase-1, a plant b-glucosidase with strict specificity, in complex with its natural substrate. J Biol Chem. 279(30): 31796-803. Vévodová J, Marek J, Zouhar J, Brzobohatý B, Su XD. (2001) Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of a maize cytokinin glucoside specific ß-glucosidase. Acta Crystallographica. D57: 140-142. Wierenga RK. (2001) The TIM-barrel fold: a versatile framework for efficient enzymes. FEBS Lett. 492(3): 193-8. Wichmann BA, Hill ID. (1982) Algorithm AS 183: an efficient and portable pseudo-random number generator. Appl. Statist. 31, 188-190. Wong TS, Roccatano D, Schwaneberg U. (2007) Steering directed protein evolution: strategies to manage combinatorial complexity of mutant libraries. Environ Microbiol. 9(11): 2645-59. Wright WR, Rainwater JC, Tolle LD. (1971) Glucose assay systems: evaluation of a Colorimetric hexokinase procedure. Clinical Chemistry 17:10. Xu Z, Escamilla-Treviño L, Zeng L, Lalgondar M, Bevan D, Winkel B, Mohamed A, Cheng CL, Shih MC, Poulton J, Esen A. (2004) Functional genomic analysis of Arabidopsis thaliana glycoside hydrolase family. Plant Mol Biol. 55(3): 343-67. Zeldovich KB, Chen P, Shakhnovich EI. (2007) Protein stability imposes limits on organism complexity and speed of molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(41): 16152-7. Zouhar J, Vévodová J, Marek J, Damborský J, Su XD, Brzobohatý B. (2001) Insights into the functional architecture of the catalytic center of a maize b-glucosidase Zm-p60.1. Plant Physiol. 127(3): 973-85.

64

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AR amplex red AUR amplex ultra red cDNA DNA kódující protein (komplementární DNA) CP citrát fosfátový pufr Da Dalton-hmotnostní jednotka de novo použito v souvislosti se syntézou látek ze základních metabolitů DIBOA 4-hydroxy-1,4-benzoxazin-3-on DIMBOA 4-hydroxy-7-metoxy-1,4-benzoxazin-3-on DIMBOAG 2-O-β-D-glukopyranozyl-4-hydroxy-7-metoxy-1,4-benzoxazin-3-on dhurrin p-hydroxy-(S)-mandelonitrile-β-D-glukozid E.coli Escherichia coli GO glukózooxidáza HRP peroxidáza IAA kyselina indolyl-3-octová (auxin) in vitro mimo živý organismus in vivo v živém organismu IPTG izopropyl-b-D-thiogalaktozid MS hmotnostní spektrometrie MUG 4-methylumbelliferyl-β-D-glukozid Mutantní protein protein exprimovaný z cDNA, v níž je zavedena záměna aminokyseliny mRNA mediátorová ribonukleotidová kyselina NAD(P) nikotinamid adenin dinukleotid fosfát NMR nukleární magnetická rezonance ONPG o-nitrofenyl-β-D-glukopyranozid oligo oligonukleotid pRSET expresní bakteriální vektor pRSET::(His)6Zm-p60.r konstrukt rekombinantní cDNA Zm-p60.r v expresním vektoru použitý jako templát pro mutagenezi PNPG 4-nitrofenyl-β-D-glukopyranozid PNP p-nitrofenol R-GLU rezorufin glukozid X-GLU 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glukopyranozid WT divoký typ ( Zm-p60.1 bez mutací) Zm-p60 (p60) β-glukozidáza o hmotnosti 60 kDa izolovaná z kukuřičných klíčků Zm-p60.1 cDNA kódující kukuřičnou β-glukozidázu, číslo 1 znamená první člen genové rodiny Zm-p60.r rekombinantní cDNA vytvořená z Zm-p60.1 Zm-p60.1 protein, jehož sekvence byla odvozena od cDNA Zm-p60.1 ZOG trans-zeatin-O-glukozid

65

Příloha 1 připravovaný rukopis: Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize β-glucosidase Zm-p60.1

manuscript

Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize βglucosidase Zm-p60.1 Radka Dopitová1,2, Pavel Mazura1,2,3, Lubomír Janda2,3, Radka Chaloupková4, Petr Jeřábek4, Jiří Damborský4, Tomáš Filipi3, Nagavalli S. Kiran1,3 and Břetislav Brzobohatý1,3 1

Institute of Biophysics AS CR, v.v.i., CZ-61265, Brno, Czech Republic; 2 Department of Functional Genomics and Proteomics, Masaryk University, CZ-62500 Brno, Czech Republic; 3 Department of Molecular Biology and Radiobiology, Mendel University of Agriculture and Forestry, CZ-61300 Brno, Czech Republic; 4 Loschmidt Laboratories, Masaryk University, CZ62500 Brno, Czech Republic Keywords aglycone-binding site, substrate specificity, β-glucosidase, Zea mays, Brassica napus

Summary β-glucosidases such as Zm-p60.1 (Zea mays) and Bgl4:1 (Brassica napus) have implicated roles in regulating plant development by releasing biologically active cytokinins from O-glucosides. A key determinant of substrate specificity in Zm-p60.1 is the F193-F200-W373-F461 cluster. However, despite sharing the same substrates, amino acids in the active sites of Zm-p60.1 and Bgl4:1 differ dramatically. In members of the Brassicaceae we found a group of β-glucosidases sharing both high similarity to Bgl4:1 and a consensus motif A-K-K-L corresponding to the F193-F200-W373-F461 cluster. To study the mechanism of substrate specificity further, we generated and analyzed four single (F193A, F200K, W373K and F461L) and one quadruple (F193A-F200K-W373K-F461L) mutants of Zm-p60.1. The F193A mutant showed a specific increase in affinity for a small polar aglycone, and a deep drop in kcat compared with the wild-type. Formation of a cavity with decreased hydrophobicity, and significant consequent alterations in ratios of reactive and non-reactive complexes revealed by computer modeling may explain the observed changes in kinetic parameters of the F193 mutant. The large decrease in the kcat of the W373K mutant was unexpected, but the findings are consistent with the F193-aglycone-W373 interaction playing a dual role in the enzyme’s catalytic action; influencing both substrate specificity, and the catalytic rate by fixing the glucosidic bond in a favorable orientation for attack by the catalytic pair. Investigation of the combined effects of all of the mutations in the quadruple mutant of Zm-p60.1 was precluded by extensive alterations in its structure and almost complete abolition of its enzymatic activity.

Introduction Glycoside hydrolases (GH; EC 3.2.1) catalyze the selective hydrolysis of glycosidic bonds within oligosaccharides and polysaccharides or between carbohydrates and non-carbohydrate moieties. Based on amino acid sequence similarities, GHs are currently classified into 112 families, as described in the CAZy database (www.cazy.org) [1]. β-Glucosidases are found in families GH1, GH3 and GH9. In plants, GHs are involved in the metabolism of cell wall polysaccharides, biosynthesis and remodulation of glycans, mobilization of storage reserves, defense, symbiosis, secondary metabolism, glycolipid metabolism, and signaling [2]. Plant β-glucosidases belonging to family 1 retaining GHs [2] are a widespread group of enzymes that hydrolyze a broad variety of aryl- and alkyl-β-D-glucosides as well as glucosides with only carbohydrate moieties. There is considerable interest in plant β-glucosidases, since they are involved in diverse biological processes, ranging from developmental regulation, e.g. activation of the plant hormones cytokinins [3] and abscisic acid [4], through cell wall degradation in the endosperm during germination [5], to pathogen defense reactions [6]. Three-dimensional structures of GH1 β-glucosidases from 19 species have been reported, seven of which are plant β-glucosidases (www.cazy.org). While levels of sequence identity vary between 17% and 45% in the GH1 β-glucosidases, their structures have proved to be highly similar. The overall fold of the enzymes is a single domain (β/α)8 barrel which classifies them as members of clan GH-A of related GH families [7]. GH1 β-glucosidases are retaining in that the anomeric configuration of the glucose is the same in the product (β-D-glucose) as it is in the substrate (a β-Dglucoside). Substrate hydrolysis requires participation of two glutamic acid residues (designated the catalytic pair) within highly conserved TXNEX and ITENG motifs, which reside in the loop regions at the C-terminal ends of β-strands 4 and 7, respectively [8]. Given the tremendous diversity of aglycone moieties in natural glucosides (which reflects their numerous biological functions) the fine-tuning of diverse biological processes in plants must depend (inter alia) on a number of β-glucosidases having high degrees of specificity towards their respective substrate aglycones. However, despite the substantial progress that has been made towards elucidating the mechanism of glucosidic bond cleavage and the roles of the catalytic pair, our knowledge of the molecular determinants of aglycone specificity in β-glucosidases remains limited. Elucidation of the aglycone specificity of β-glucosidases is a key prerequisite for understanding their precise role in biological processes in which glucosylation and deglucosyslation steps are regulatory elements. In addition, the ability to modulate the specificity of βglucosidases that would follow its elucidation could have valuable biotechnological applications. A maize β-glucosidase, Zm-p60.1, a member of the GH1 family, has been shown to release active cytokinins from their O- and N3-glucosides, and thus has implicated roles in the regulation of maize seedling development [3]. The enzyme has been located in plastids [9], and its accumulation in chloroplasts and plastids of transgenic tobacco has been shown to perturb the cytokinin metabolic network [10]. In addition, an allozyme of Zm-p60.1, ZM-Glu1, has been shown to hydrolyze 4dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIMBOA)-β-D-glucopyranoside (DIMBOA- β-DGlc; [11]) in a similar manner to a β-glucosidase purified from maize seedlings [12], and implicated in defense against pathogens by releasing the toxic aglycone (DIMBOA) from its storage form, DIMBOA-β-D-Glc. However, no direct experimental evidence confirming that ZM-Glu1 is involved in defense responses in planta has been published. Three-dimensional structures have been obtained for Zm-p60.1 [13], Zm-Glu1 and its complex with the non-hydrolyzable inhibitor pnitrophenyl β-D-thioglucopyranoside [14], and co-crystals of an inactive mutant of ZM-Glu1 and

DIMBOA-β-D-Glc [15]. Analysis of these structures has provided indications that the enzymes’ specificity toward substrates with aryl aglycones is conferred by the aromatic aglycone system stacking with W373, and van der Waals interactions with edges of F193, F200, and F461 located opposite W373 in a slot-like aglycone-binding site [13, 15]. In addition, kinetic analysis and computer simulations of F193I/Y/W mutants have demonstrated that F193-aglycone-W373 interactions not only contribute to aglycone interactions but also codetermine the catalytic rate by fixing the glucosidic bond in an orientation favorable for attack by the catalytic pair [13]. A distinctly different member of the GH1 family – a β-glucosidase hydrolyzing a cytokininO-glucoside – has been found in Brassica napus and designated Bgl4:1 [16]. Bgl4:1 and Zm-p60.1 display 44% identity at the amino acid sequence level. However, surprisingly, when we inspected the Bgl4:1 sequence we found no hydrophobic cluster corresponding to the F193-F200-W373-F461 cluster of Zm-p60.1. Analysis of these two distinct β-glucosidases – which appear to have very similar tertiary structures and substrate specificity, but differ dramatically in the architecture of their aglycone binding sites – offers exciting prospects for identifying molecular determinants of substrate specificity in β-glucosidases. Structurally, the aglycone binding sites of Zm-p60.1 from Zea mays and Bgl4:1 from Brassica napus represent two extreme cases in their protein family. Here, we report a consensus motif found in Bgl4:1 and evolutionarily closely related βglucosidases of the GH1 family of the Brassicaceae that corresponds to the F193-F200-W373-F461 cluster of Zm-p60.1. We also report the construction of four single mutants and one quadruple mutant introducing features of the consensus motif into the Zm-p60.1 scaffold, an analysis of structural and catalytic properties of the mutants, and simulations of the substrate-enzyme interactions of the wild-type and one of the mutants. The results provide indications of the native enzymes’ catalytic action and determinants of specificity, and the reasons for the changes observed in the mutants’ enzymatic activity.

Results Design and construction of the mutant β-glucosidases Findings that cytokinin-O-glucosides are natural substrates for both of the two β-glucosidases, Zmp60.1 and Bgl4:1, but the architecture of their sites that recognize the aglycone moieties of these substances distinctly differs, prompted us to initiate a bioinformatic analysis of plant β-glucosidases to obtain insights into the evolution of the molecular sites involved in the two modes of aglycone binding. The amino acid sequence of Zm-p60.1 was compared with sequences of 22 other members of the GH1 family from 13 plant genera. The resulting alignment was manually adjusted (supplementary Fig. S1) and a phylogenetic tree was inferred (Fig.1). Interestingly, we found four β-glucosidases closely related to Bgl4:1, all of which belong to the Brassicaceae, forming a separate five-member group. Further, we identified 37 amino acid residues forming an active site cavity using CASTp software, including the residues that make contact with glucose, an aglycone or both during interactions with their substrates, based on data obtained from the Protein Ligand database (supplementary Table S1). Information obtained using the two approaches allowed us to determine the relative level of variability in amino acid composition at the selected positions corresponding to the amino acid residues forming the active site (Fig. 2). In accordance with previous studies, a higher degree of conservation was found among the amino acid residues that contact a sugar, including the fully conserved amino acid residues Q33, H137, N185, Y328, W452, E459, W460, and the catalytic pair E186 and E401. In contrast, a high degree of variability was found in amino acid residues that contact an aglycone; only five out of 17 such amino acid residues were fully conserved. In accordance with their proposed role in aglycone specificity, F193 and F461 are among the most variable amino acid residues of the active center, and both F200 and W373 are also quite variable (showing almost half as much variability as F193 and F461). In the Brassicaceae group related to Bgl4:1, a consensus motif A-K-K-L was identified, corresponding to the F193-F200-W373-F461 cluster involved in enzyme specificity towards aglycones in Zm-p60.1. Interestingly, both lysine residues and the leucine residue are conserved in all five enzymes of the group, and the alanine residue is found in all but one of the enzymes, namely Bgl4:1, where the same position is occupied by a serine residue (supplementary Fig. S1). The results define a novel architecture involved in molecular recognition of aromatic aglycones in the Brassicaceae group of β-glucosidases. To allow more instructive structural comparisons, amino acid residues of the A-K-K-L consensus motif were modeled into the corresponding positions of the F193-F200-W373-F461 cluster in the Zm-p60.1 aglycone binding site (Fig. 3). Rotamer positions were calculated using the scoring function in Swiss-PdbViewer v3.7, and the results were visualized with PyMol v0.97 [17, 18]. To initiate a functional comparison of the two distinct architectures of the aglycone binding site, site-directed mutagenesis was employed to generate four single (F193A, F200K, W373K and F461L) mutants and one quadruple (F193A-F200K-W373K-F461L) mutant introducing features of the A-K-K-L consensus into the Zm-p60.1 scaffold. Secondary structure and dimer assembly of the mutant enzymes The wild-type and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS and purified close to homogeneity as follows. The first step was metal chelate affinity chromatography (MCAC), following a previously described protocol [19]. This step purified the wild-type and single mutants to levels exceeding 85% according to densitometric analysis of Coomassie Brilliant

Blue R250-stained SDS-PAGE gels (not shown), but failed to yield the quadruple (F193A-F200KW373K-F461L) mutant, designated P2, in >30% purity, indicating that the accessibility of the His tag is significantly altered in P2. Subsequent ammonium sulfate precipitation followed by hydrophobic chromatography resulted in preparations of P2, as well as the wild-type and single mutants, with >94% purity (supplementary Fig. S2). Circular dichroism (CD) spectroscopy was used to assess the relative proportions of secondary structural elements in the wild-type and mutant enzymes (using Dicroprot v1.0, see Fig. 4) and the thermal stability of the mutant enzymes. The predictions obtained for the wild-type enzyme coincided well with estimates obtained from a crystal structure, indicating that they were highly reliable ([13]; Fig. 4). The relative proportions of α-helices and β-sheets in F193A and W373K appear to be identical to those in the wild-type, while the proportions of α-helices appear to be lower in F461L, F200K and P2. Further, the F193A and W373K mutations do not result in any change in the thermostability of the enzyme (supplementary Table S2), and thermal unfolding of the wild-type and both the F193A and W373K mutants was found to be irreversible (supplementary Fig. S3). The propensity of the wild-type and each of the single mutant enzymes to form dimers was analyzed by size exclusion chromatography. The enzymes were purified by MCAC and subjected to size exclusion chromatography using a HighLoad 16/60 Superdex 200 column. The enzymes eluted in two peaks, d and m, corresponding to apparent molecular weights of ~110 kDa and ~43 kDa, respectively, (Fig. 5A, B and supplementary Table S3). The apparent molecular weight of ~110 kDa is in good agreement with the 118 kDa calculated for the dimeric forms of the enzymes based on their amino acid composition. Further, wild-type Zm-p60.1 was found in dimeric form in its crystal structure [13]. The E401D mutant of Zm-p60.1, which is defective in dimer assembly, [13] was used to show that the peak m corresponds to the monomeric forms of the enzymes each of which has a calculated molecular weight of 59 kDa (based on amino acid composition) – consistent with the 60 kDa determined from the SDS-PAGE analysis (Fig. 5A, B and supplementary Table S3). Low molecular weight polypetides found in peak m in Coomassie-stained SDS-PAGE gels (Fig. 5B) were not detected by either anti-Zm-p60 or anti-His-tag antibodies in Western blots (not shown), suggesting that they represent contaminants of the monomer fraction by low molecular weight proteins. Based on the same criteria, a ~ 66 kDa polypetide found in peak d represents a minor contaminant of the dimeric form of the enzymes. While the wild-type, F193A and F461L mutant enzymes were found almost exclusively in the form of dimers, the F200K and W373 mutations apparently hindered dimer assembly. Dimeric and monomeric forms of the enzymes were resolved by native PAGE, and enzymatic activity was found to be associated exclusively with the dimeric forms by in-gel activity staining (Figure 5C, D), as previously found for the wild-type and a number of mutant enzymes [13, 20]. Kinetics of the mutant enzymes Two general β-glucosidase substrates differing in polarity and the size of their aromatic aglycones, p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNPGlc) and 4-methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (4MUGlc), were used to evaluate the effects of the mutations on the enzymes’ kinetics (Table 1). F461L increased the enzyme’s relative catalytic efficiency, defined as (kcat / Km)mutant/( kcat / Km)WT by 20% compared to the wild-type for both substrates, by increasing kcat. In contrast, the F193A, F200K and W373K single mutations had dramatic negative effects on catalytic efficiency. The F193A substitution reduced the enzyme’s efficiency via 195- and 42-fold reductions in kcat values for pNPGlc and 4MUGlc, respectively. Interestingly, this substitution also highly increased the enzyme’s affinity for pNPGlc; reducing the Km for this substrate more than 15-fold and the Km for 4MUGlc by only ca. 20%. The F200K mutation resulted in 5- and 10-fold increases in Km, with 18and 29-fold reductions in kcat for pNPGlc and 4MUGlc, respectively. The W373K mutation caused

similar reductions in affinity for the substrates; 3- and 12-fold increases in Km for pNPGlc and 4MUGlc, respectively. However, these changes were accompanied by 68- and 243-fold reductions in kcat for pNPGlc and 4MUGlc, respectively, indicating that substrate turnover was hampered to a much higher extent by the W373 mutation. In general, reductions in the relative efficiency of F193A, F200K and W373K mutants were more pronounced with 4MUGlc as the substrate, and the W373K mutant showed the lowest efficiency with both substrates. Molecular modeling of enzyme-substrate complexes for wild-type and F193A enzymes Wild-type and F193A mutant enzyme-substrate complexes were explored by molecular modeling to obtain insights into the molecular interactions underlying the observed changes in the mutants’ enzymatic kinetics. Modeling was only applicable to F193A since interpretation of acquired data requires preservation of the overall tertiary structure in the modeled proteins. W373K also has an indistinguishable structure from the wild-type, according to the CD spectral analysis. However, this mutant could adopt a high number of possible conformations at the W373 position, precluding robust interpretation of any results obtained by molecular modeling with current methods. Furthermore, assembly of W373K mutant homodimers is hindered, indicating that there are alterations in its conformation that are not amenable to CD spectroscopy. The structures of enzyme-substrate complexes were obtained for both the wild-type and F193A enzymes by docking the substrate molecules 4MUGlc and pNPGlc into their active sites. The structures obtained from the docking were divided into reactive and non-reactive complexes, depending on the orientation of the sugar moiety (Fig. 6A and 6B), and the results from 50 dockings for each complex are summarized in Supplementary Tables S4 and S5. In each case the most highly populated binding mode was a reactive complex. However, the number of non-reactive clusters and the proportion of lightly populated reactive clusters were higher for F193A than for the wild-type enzyme, and non-reactive binding generally appears to be energetically preferred in the F193A mutant. The most highly populated binding modes from the docking were selected for further optimization, but this did not result in significant repositioning of the substrate molecule inside the enzyme active site. Reactive enzyme-substrate complexes of the wild type enzyme and F193A mutant are geometrically similar (Fig. 6C, D and 6E, F), showing no significant differences in the distances of reacting atoms. The only noted difference was in the orientation of the aromatic ring of pNPGlc in the F193A mutant (Fig. 6D), due to lost van der Waals contact with the side-chain of the substituted phenylalanine residue. However, the overall orientation of the aglycone moiety remains the same for both proteins due to the strong stacking interaction with W373.

Discussion We identified a group of β-glucosidases in members of the Brassicaceae that are closely evolutionarily related to Bgl4:1, a β-glucosidase of B. napus that cleaves cytokinin-O-glucosides, thus sharing the same natural substrates with the maize β-glucosidase Zm-p60.1. Despite also having the same overall fold, an (β/α)8 barrel, and levels of amino acid sequence similarity ranging from 45% to 53%, the architecture of the aglycone binding site of Zm-p60.1 distinctly differs from that of Bgl4:1 and its homologs. These findings offer exciting prospects for comparative analysis of the molecular determinants of substrate specificity in the GH1 family of β-glucosidases. Sequence comparisons of the Brassicaceae group identified a consensus motif, A-K-K-L, corresponding to the F193-F200-W373-F461 cluster of Zm-p60.1 that is involved in its interactions with aglycones. Therefore, we constructed four single (F193A, F200K, F461L and W373K) mutants and one quadruple (F193A-F200K-W373K-F461L) mutant introducing features of the consensus motif into the Zm-p60.1 scaffold, then subjected the mutant and wild-type enzymes to structural, kinetic and molecular modeling analyses to seek insights into the catalytic action of the β-glucosidases. Kinetic analysis of the F193A mutant indicated that its Km for pNPGlc was greatly reduced (15-fold), while its Km for 4MUGlc was practically unaltered compared with the wild-type, and thus that the mutation caused a substantial selective increase in its affinity for pNPGlc (Table 1). Its kcat values decreased for both substrates, but the decrease was more pronounced for 4MUGlc (Table 1). The apparently unaltered structure of the F193A mutant compared to the wild-type, according to CD spectral analysis (Fig. 4), allowed us to interpret the kinetic parameters using molecular modeling of enzyme-substrate complexes. Molecular docking did not indicate any significant differences in the geometry of the most highly populated energetically favorable reactive enzymesubstrate complexes of the wild-type and F193A enzymes that could be responsible for the determined differences in their kinetic parameters. However, the proportions of non-reactive clusters and lightly populated reactive clusters were significantly higher for the F193A mutant than for the wild-type. Such changes are expected to lead to reductions in kcat due to miss-positioning of the glucosidic bond in higher fractions of lightly populated reactive enzyme-substrate complexes and increases in enzyme occupation in non-reactive enzyme-substrate conformations. The decrease in the F193 mutant’s Km for pNPGlc, compared to the wild-type, is likely to reflect the higher frequency of energetically preferred, non-reactive complexes it apparently forms. Further, the F193A substitution widens the slot between amino acid residues at positions 193 and 373, and reduces its hydrophobicity, which may allow substrates with small polar aromatic aglycones, e.g. pNPGlc, to enter the active site without removal of a water hydration shell, saving energy otherwise needed for its dehydration, and thus preferentially increasing the enzyme’s affinity for these substrates. The data are consistent with our previous results indicating that F193-aglycone-W373 interactions not only contribute to aglycone recognition but also codetermine catalytic rates by fixing the glucosidic bond in a favorable orientation for attack by the catalytic pair [13]. A dramatic reduction in enzyme activity was observed in the F193V mutant, but this was likely due to an unexpected rearrangement in another three amino acid residues that are also involved in the substrate binding site according to previous structural analysis [21]. The W373K mutant exhibited the most pronounced reductions in relative efficiency for both substrates analyzed. Unexpectedly, the dramatic drop in W373K’s specificity constant is caused mainly by a drop in its kcat. Based on enzyme structure analysis and molecular docking, W373 stacking interactions with the aglycone aromatic system and van der Waals interactions with the edges of the phenyl rings provided by F193, F200 and F466 appear to be the major determinants of aglycone recognition and specificity in Zm-p60.1 [13, 14, 15]. Thus, the dramatic reductions in kcat conferred by the W373K mutation indicate a previously unrecognized function of W373 in the determination of the catalytic rate of the enzyme, albeit one that is consistent with the involvement

of F193-aglycone-W373 interactions in both substrate affinity and determination of the catalytic rate inferred from previous analyses of the F193I mutant [13]. Recent crystal structure determination and subsequent homology modeling has revealed that hydrophobic interactions are the major contributors to the binding of aglycone moieties to a human cytosolic β-glucosidase (hCBG; [22]). Structural superimposition showed that W345 of hCBG has a similar conformation to W373 of Zm-p60.1, lining the aglycone binding site in a way that enables stacking interactions with an aromatic aglycone. Dramatic reductions in the specificity constants for a number of glycosides were found in kinetic analyses of W345 mutants. Similarly to our results, these reductions in specificity constants were due to reductions in kcat, while Km values increased much less, and even decreased for several β-glucosides, including three out of five natural substrates tested. Investigation of hCBG’s 3D structure showed that the amine group of the W345 indole ring is located close (ca. 3.9 Ǻ) to the O6 of the sugar. This finding led to a proposal that W345 may be a key residue ensuring that the glucosidic bond is positioned in a favorable orientation for attack by the catalytic pair by a combination of aromatic stacking with the aromatic aglycone and hydrogen binding to the sugar moiety of the substrate [22]. However, our inspection of the structures of ZM-Glu1 and its catalytically inactive mutant in co-crystals with the nonhydrolysable substrate p-nitrophenyl β-D-thioglucoside, the competitive inhibitor dhurrin and the substrate DIMBOA-β-D-glc indicated that the corresponding distances are about 5.3, 4.8 and 7.8 Ǻ, respectively [14, 15, 23]; clearly too long to allow formation of a hydrogen bond, for which a distance of ca. 3 Ǻ is required. Taken together, the results obtained regarding β-glucosidases from organisms as distantly related as maize and humans performing distinct functions clearly indicate that the role of the tryptophan residue in the position equivalent to W373 in the enzyme’s catalytic action is more complex than anticipated in previous studies [13, 14, 15] in that it appears to influence the catalytic rate more than substrate binding parameters. The F200K substitution resulted in the second most severe reductions in specificity constants of all the single-point mutations analyzed (Table 1). Interpretation of these reductions in kinetic parameters in molecular terms is precluded by a significant structural alteration deduced from the results of CD spectroscopy (Fig. 4). The high degree of structural alteration might indicate an involvement of F200 in folding of Zm-p60.1. Interestingly, an F200L mutation was shown to cause an increase in the specificity constant for pNPGlc, while it remained practically unaltered for oNPGlc (o-nitrophenyl β-D-glucoside) and 4MUGlc. However, the structure of this mutant was not investigated [21]. The specificity constants of the F461L mutant were increased by about 20% for both substrates compared to the wild-type (Table 1). As for the F200K mutant, the F461L mutation also resulted in altered proportions of secondary structural elements, precluding interpretation of the changes in molecular terms, although the core of its (β/α)8 barrel might have remained unaltered since the changes were due to a reduction in its content of α−helices, while its β-chain content remained unchanged (Fig. 4). A positive effect of a F461S mutation on specificity constants for all investigated artificial substrates has been previously reported [21], but the effect of this mutation on enzyme structure was not determined in the cited study. Interestingly, however, the increases were mainly due to increases in turnover numbers, while the affinity for pNPGlc and 4MUGlc decreased about two-fold. Furthermore, the F461S mutant gained low but detectable enzymatic activity towards dhurrin, a natural substrate of a related β-glucosidase (SbDhr1) and a competitive inhibitor of Zm-p60.1. These findings indicate that variations in the amino acid residue at position 461 may have stronger effects on kcat than on Km, and thus significant effects on the enzyme’s specificity towards natural substrates.

Interestingly, all the mutations except F461L had more severe effects on the enzyme’s interactions with 4MUGlc than with pNPGlc, thus apparently shifting its specificity slightly towards substrates with small, polar, aromatic aglycones. Accumulation of the four mutations in a single molecule of the quadruple P2 mutant resulted in the polypeptide chain folding into a distinct structure characterized by an inversed ratio of α−helices and β-strands compared to the wild-type (Fig. 4). In addition, the electrophoretic mobility of the P2 mutant in native PAGE is slower than the wild-type, and it forms dimers to a low, albeit detectable, extent (not shown). Furthermore, its enzymatic activity dropped dramatically, precluding determination of kinetic parameters. This indicates that, in future work, sequence analysis should be focused on other parts of the sequences (outside the four-residue signature) in order to explain the eventual effects of the mutations.

Conclusion In conclusion, this work corroborates and extends previous knowledge of the dual role of F193aglycone-W373 interactions in the catalytic action of the Zm-p60.1 β-glucosidase; contributing both to the enzyme’s affinity for substrates with aromatic aglycones and codetermination of the catalytic rate by fixing the glucosidic bond in a favorable orientation for attack by the catalytic pair. Furthermore, our computer modeling of the wild type and F193A enzymes’ interactions with two substrates provides indications of the mechanisms involved in these roles, inter alia that the F193A mutation leads to the formation of a cavity with decreased hydrophobicity, and significant consequent alterations in ratios of reactive and non-reactive complexes. Wider exploration by computer modeling was precluded by unexpected structural alterations. These are mirrored in the most extreme case of the quadruple mutant in almost complete abolishment of enzyme activity, which also excluded investigation of the effects of accumulation of the mutations in a single protein molecule.

Experimental procedures Structural analysis The structural analysis of Zm-p60.1 was based on X-ray data presented in previous studies [13, 24]. Its active site was determined using the CASTp server [25], and the amino acid residues within the frame shaping the active site making calculated contacts with the tested ligands were identified using data in the Ligand Protein Contacts database [26]. Sequence analysis and phylogenetics Protein sequences were selected for alignment that met several criteria, notably apparently robust characterization of the sequences, functions and structure (where available), from entries in the CAZy-Carbohydrate-Active Enzymes database, in which β−glucosidase sequences are classified in families according to sequence homology, reaction mechanism and standard (IUBMB) classification [27]. The selected sequences were retrieved from the SwissProt and GenBank databases then edited manually using BioEdit Sequence Alignment Editor Version 5.0.9. Clustal W running on the European Bioinformatics Institute server [28] was used for alignment, and a phylogenetic tree was inferred by the Neighbor-joining algorithm [29] then visualized using the TREEVIEW program [30]. Site-directed mutagenesis The QuickChange Multi Site-directed Mutagenesis system (Stratagene, La Jolla, CA) was used to introduce the desired mutations into (His)6Zm-p60.r, a recombinant derivative of native Zm-p60.1 lacking the plastid targeting sequence in pRSET::Zm-p60.r previously described [13, 19, 20]. The mutagenic oligonucleotides were as follows: mutation F193A, 5´ agt tcc gta gga CGC gga agt aaa tgt gtc 3´; mutation F200K, 5´ cac cga cct ggg gcT TTg acc cca gtt ccg tag 3´; mutations F461L and F461L in P2, 5´ cgt tcg gtg aag ccg gcC AGc cat tca aag ttg tc 3´; mutations W373K and W373K in P2, 5´ ggg tac atg tag atT TTt gga ttt ccc ata g 3´; mutations F200K and F193A in P2, 5´gca ccg acc tgg ggc TTT gac ccc agt tcc gta gga CGC gga agt aaa tgt ctg ggg 3´(substituted nucleotides are underlined). Mutations were confirmed by DNA-sequencing using an ABI 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). The site-directed mutagenesis resulted in pRSET::Zm-p60.rm. Expression, purification and size exclusion chromatography of the wild-type and mutant enzymes To express wild-type and mutant enzymes in E. coli strain BL21(DE3)pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany), a previously described procedure [19] was modified as follows. Cells were cultured in LB medium supplemented with ampicillin (100 μg/ml), chloramphenicol (50 μg/ml), 0.1% glucose and 5 mM Na2HPO4 pH 7 at 37°C to an A600 of 0.5-0.6. Recombinant protein expression was then induced by adding 0.1 mM isopropyl-1-thio-β-D galactopyranoside and 3 mM cellobiose. Three hours after induction at 22°C, cells were harvested by centrifugation at 3,500 g for 10 min at 4°C. The cell pellets obtained from 500 ml portions of culture were each resuspended in 6 ml of extraction buffer containing 20 mM phosphate buffer (pH 7.9), 0.5 M NaCl, 0.1% Triton X-100 and stored at -20°C. After thawing, the cells were broken by sonication using a Sonoplus GM7035 W (Bandelin, Berni, Germany) with 3 x 60 s pulses, on ice. The cell lysate was then centrifuged at 47,446 g for 30 min at 4°C to remove insoluble cell debris. The protein-containing supernatant was applied to an Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare, Chalfont, St Giles, UK) column equilibrated with buffer A (20 mM Na2HPO4 pH 7.9, 0.5 M NaCl). The ballast proteins were washed out from the column with 15 column volumes of buffer B (50 mM Na2HPO4 pH 7.9, 1 M NaCl, 20 mM imidazole) and 15 column volumes of buffer C (50 mM Na2HPO4 pH 7.9, 1 M NaCl,

50 mM imidazole). (His)6 Zm-p60.r was eluted in buffer D (20 mM Na2HPO4 pH 7.9, 1 M NaCl, 20 % glycerol, 100 mM EDTA). Ammonium sulfate (pH 7) was added to eluted fractions to a final concentration of 1.0 M and the resulting solutions were centrifuged at 16,500 g for 15 min. The supernatants were applied to a HiTrap Phenyl-HP column (GE Healthcare, Chalfont, St Giles, UK) and the proteins were purified using a linear gradient of 0.8 to 0.2 M (NH4)2SO4, pH 7.0. Flowthrough fractions were pooled, desalted and concentrated using an Amicon Ultra-4 ultrafiltration cell with 10 kDa cut-off (Millipore, Bedford, IN, USA). The purity of the wild-type and mutant enzymes was determined by SDS-PAGE followed by Coomassie Blue staining and densitometry using a GS800 densitometer and Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad Laboratoriem, Hercules, CA, USA). To determine the degree of dimer assembly in the wild-type and mutant enzymes, the enzyme preparations obtained from the metal chelate affinity chromatography were concentrated using the Amicon Ultra-15 ultrafiltration cell with 30kDa cut-off (Millipore, Bedford, IN, USA), and each retentate applied (1.5 mL) was applied to a HighLoad 16/60 Superdex 200 prep grade column (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden) then eluted with elution buffer (50mM Tris.HCl, 500 mM NaCl; pH 7.00) using ÄKTA FPLC system (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden). Ferritin (Mr 440 kDa), aldolase (Mr 158 kDa), bovine serum albumin (Mr 67 kDa) and ovalbumin (Mr 43 kDa) were used as molecular weight (Mr) standards, and the void volume was determined using Blue Dextran 2000 (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden). Apparent molecular weights of eluting proteins were determined from a log Mr versus Ve/V0 plot, where Ve represents an elution and V0 a void volume. The content and purity of the enzymes in individual fractions were determined from Coomassie Blue stained SDS-PAGE gels (see above). Migration of the enzymes to positions corresponding to an apparent molecular weight of 60 kDa was confirmed by Western blot and immunostaining. Proteins separated by SDS-PAGE were transferred to a polyvinylidine difluoride membrane (Immobilon P, Millipore, Bedford, IN, USA) by semidry Western blotting according to [32]. Positions of (His)6Zm-p60.rm were then visualized by an alkaline phosphatase-mediated immunostaining procedure [33], using (i) polyclonal anti-Zmp.60 antibodies raised in rabbits against recombinant (His)6Zm-p60.r produced in E. coli and antirabbit-IgG antibodies conjugated to alkaline phosphatase, supplied by Sigma (Deisenhofen, Germany), and (ii) monoclonal anti-polyhistidine antibodies raised in mouse (Sigma, Deisenhofen, Germany) against the polyhistidine [(His)6] domain and goat anti-mouse-IgG conjugated to alkaline phosphatase (Sigma, Deisenhofen, Germany). Electrophoresis and in-gel activity staining The wild type and mutant proteins were separated from other proteins in their respective preparations by native PAGE using 10% (w/v) gels [31]. They were then subjected to in-gel activity staining (zymography) by incubating the gels for 30 min at 37 °C with 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-glucopyranoside (Biosynth International, Inc., Itasca, IL, USA) dissolved in N,N´dimethylformamide and diluted to the final working concentration of 0.6 mM in McIlvaine citratephosphate buffer (pH 5.50, 50 mM), a procedure developed by Mazura and Filipi (unpublished results). Proteins were visualized by Coomassie Blue staining.

Circular Dichroism Spectra Circular dichroism spectra were recorded at room temperature using a Jasco J-810 spectrometer (Jasco, Tokyo, Japan), collecting data from 185 to 260 nm, at 100 nm/min with a 1 s response time and 2 nm bandwidth using a 0.1 cm quartz cuvette containing the wild-type and mutant enzymes. Each spectrum shown is the average of ten individual scans corrected for absorbance by the buffer.

Collected CD data were expressed in terms of mean residue ellipticity (ΘMRE) using the equation:

ΘMRE =

(Θ

obs

.M w .100)

n .c .l

where Θobs is the observed ellipticity in degrees, Mw is the protein’s molecular weight, n is the number of residues, l is the cell path length, c is the protein concentration and the factor 100 converts the resulting value to mg/dmol. The proteins’ contents of secondary structural elements were calculated from the spectra using Self Consistent [34], K2D [35] and CONTIN [36] methods implemented in the program DICROPROT (http://dicroprot-pbil.ibcp.fr). Enzyme and Protein assays The enzymatic activities of the wild-type and mutant proteins were assayed using 4MUGlc and pNPGlc as fluorogenic and chromogenic substrates, respectively [12, 20], and the kinetic constants were calculated using Origin Pro 7.5 software (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). The concentrations of the proteins in the preparations were determined using the DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) with BSA as a calibration standard. Molecular Modeling The structures of the substrate molecules pNPGlc and 4MUGlc were built in INSIGHTII v95 (Biosym/MSI, USA) and energy-minimized by the AM1 semi-empirical quantum mechanics method, using the keyword PRECISE for optimization. A model of the F193A mutant was constructed using the experimental structure of the β-glucosidase Zm-p60.1 obtained from the Protein Data Bank (PDB ID 1HXJ). The substitution was introduced to the structure using the program PyMol v0.97 (DeLano Scientific, USA). Substrate molecules were positioned in the active sites using the program AUTODOCK v3.05 [37]. The grid maps (81 x 81 x 81 points with 0.25Å grid spacing) were calculated using AUTOGRID v3.06. Fifty dockings were performed for each substrate using a Lamarckian Genetic Algorithm [37] with a population size of 50 individuals, a maximum of 1.5 x 106 energy evaluations and 27,000 generations, an elitism value of 1, and mutation and cross-over rates of 0.02 and 0.5, respectively. Local searches were based on a pseudo Solis and Wets algorithm [38] with a maximum of 300 iterations per search. Final orientations from every docking were clustered with a clustering tolerance for the root-mean-square positional deviation of 0.5 Å. The most highly populated complexes obtained in the molecular dockings were further optimized using the quantum mechanic (QM) program MOPAC2002 (Fujitsu, Japan). All protein residues were fixed during optimization except E186, F/A193, F200, W373, E401 and F461. Heavy atoms of the backbone were fixed in all residues to keep the overall geometry of the protein active site intact. MOPAC calculations were carried out using the AM1 Hamiltonian and the BFGS geometry optimization algorithm. Results from the calculations were analyzed using the program TRITON v3.0 (Masaryk University, Czech Republic).

References 1. Coutinho PM & Henrissat B (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12. 2. Minic Z (2008) Physiological roles of plant glycoside hydrolases. Planta 227, 723- 740. 3. Brzobohaty B, Moore I, Kristoffersen P, Bako L, Campos N, Schell J & Palme K (1993) Release of active cytokinin by a beta-glucosidase localized to the maize root meristem. Science 262, 1051-1054. 4. Lee KH, Piao HL, Kim HY, Choi SM, Jiang F, Hartung W, Hwang I, Kwak JM & Lee IJ (2006) Activation of glucosidase via stress-induced polymerization rapidly increases active pools of abscisic acid. Cell 126, 1109-1120. 5. Leah R, Kigel J, Svendsen I & Mundy J (1995) Biochemical and molecular characterization of a barley seed beta-glucosidase. J Biol Chem 270, 15789-15797. 6. Poulton JE (1990) Cyanogenesis in Plants. Plant Physiol 94, 401-405. 7. Henrissat B & Bairoch A (1996) Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J 316, 695-696 8. Jenkins J, Lo Leggio L, Harris G & Pickersgill R (1995) Beta-glucosidase, beta-galactosidase, family A cellulases, family F xylanases and two barley glycanases form a superfamily of enzymes with 8-fold beta/alpha architecture and with two conserved glutamates near the carboxy-terminal ends of beta-strands four and seven. FEBS Lett 362, 281-285. 9. Kristoffersen P, Brzobohaty B, Hohfeld I, Bako L, Melkonian M & Palme K (2000) Developmental regulation of the maize Zm-p60.1 gene encoding a beta-glucosidase located to plastids. Planta 210, 407-415. 10. Kiran NS, Polanska L, Fohlerova R, Mazura P, Valkova M, Smeral M, Zouhar J, Malbeck J, Dobrev PI, Machackova I & Brzobohaty B (2006) Ectopic over-expression of the maize betaglucosidase Zm-p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. J Exp Bot 57, 985996. 11. Cicek M & Esen A (1999) Expression of soluble and catalytically active plant (monocot) betaglucosidases in E. coli. Biotechnol Bioeng 63, 392-400. 12. Babcock GD & Esen A (1994) Substrate specificity of maize beta-glucosidase. Plant Science 101, 31-39. 13. Zouhar J, Vevodova J, Marek J, Damborsky J, Su XD & Brzobohaty B (2001) Insights into the functional architecture of the catalytic center of a maize beta-glucosidase Zm-p60.1. Plant Physiol 127, 973-985. 14. Czjzek M, Cicek M, Zamboni V, Burmeister WP, Bevan DR, Henrissat B & Esen A (2001) Crystal structure of a monocotyledon (maize ZMGlu1) beta-glucosidase and a model of its complex with p-nitrophenyl beta-D-thioglucoside. Biochem J 354, 37-46. 15. Czjzek M, Cicek M, Zamboni V, Bevan DR, Henrissat B & Esen A (2000) The mechanism of substrate (aglycone) specificity in beta -glucosidases is revealed by crystal structures of mutant maize beta -glucosidase-DIMBOA, -DIMBOAGlc, and -dhurrin complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13555-13560. 16. Falk A & Rask L (1995) Expression of a zeatin-O-glucoside-degrading beta-glucosidase in Brassica napus. Plant Physiol 108, 1369-1377. 17. Guex N & Peitsch MC (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18, 2714-2723. 18. DeLano WL (2002) The PyMol Molecular Graphics System. DeLano Scientific. 19. Zouhar J, Nanak E & Brzobohaty B (1999) Expression, single-step purification, and matrixassisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific beta-glucosidase. Protein Expr Purif 17, 153-162. 20. Rotrekl V, Nejedla E, Kucera I, Abdallah F, Palme K & Brzobohaty B (1999) The role of cysteine residues in structure and enzyme activity of a maize beta-glucosidase. Eur J Biochem

266, 1056-1065. 21. Verdoucq L, Czjzek M, Moriniere J, Bevan DR & Esen A (2003) Mutational and structural analysis of aglycone specificity in maize and sorghum beta-glucosidases. J Biol Chem 278, 25055-25062. 22. Tribolo S, Berrin JG, Kroon PA, Czjzek M & Juge N (2007) The crystal structure of human cytosolic beta-glucosidase unravels the substrate aglycone specificity of a family 1 glycoside hydrolase. J Mol Biol 370, 964-975. 23. Verdoucq L, Moriniere J, Bevan DR, Esen A, Vasella A, Henrissat B & Czjzek M (2004) Structural determinants of substrate specificity in family 1 beta-glucosidases: novel insights from the crystal structure of sorghum dhurrinase-1, a plant beta-glucosidase with strict specificity, in complex with its natural substrate. J Biol Chem 279, 31796-31803. 24. Vevodova J, Marek J, Zouhar J, Brzobohaty B & Su XD (2001) Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of a maize cytokinin glucoside specific beta-glucosidase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57, 140-142. 25. Liang, J, Edelsbrunner, H & Woodward C (1998) Anatomy of protein pockets and cavities: Measurement of binding site geometry and implications for ligand design. Prot Sci 7, 18841897. 26. Sobolev V, Sorokine A, Prilusky J, Abola EE & Edelman M (1999) Automated analysis of interatomic contacts in proteins. Bioinformatics 15, 327-332. 27. Henrissat B & Davies G (1997) Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol 7, 637-644. 28. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ & Higgins DG (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947-2948. 29. Saitou N & Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4, 406-425. 30. Page RD (1996) TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci 12, 357-358. 31. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685. 32. Towbin H, Staehelin T & Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4350-4354. 33. Blake MS, Johnston KH, Russell-Jones GJ & Gotschlich EC (1984) A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Anal Biochem 136, 175-179. 34. Sreerama N & Woody RW (1993) A self-consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism. Anal Biochem 209, 32-44. 35. Andrade MA, Chacon P, Merelo JJ & Moran F (1993) Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. Protein Eng 6, 383-390. 36. Provencher, SW & Glöckner, J (1981) Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry 20, 33-37. 37. Morris GM, Goodsell DS, Halliday RS, Huey R, Hart WE, Belew RK & Olson FJ (1998) Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. J Comput Chem 19, 1639-1662. 38. Solis FJ & Wets RJB (1981) Minimization by random search techniques. Math Oper Res 6, 1930.

Acknowledgements This project was supported by grants GACR203/02/0865 from the Grant Agency of the Czech Republic, LC06034, LC06010, MSM0021622415 and MSM0021622412 from the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, and AVOZ50040507 from the Academy of Sciences of the Czech Republic. Fig. 1. Phylogenetic tree. Neighbour-joining phylogram depicting the relationships between selected plant β−glucosidase amino acid sequences. The group of β-glucosidases highly similar to Bgl4:1, in which a consensus motif A-K-K-L corresponding to the F193-F200-W373-F461 cluster was identified, is highlighted. The scale bar represents 0.01 amino acid substitutions per site. Fig. 2. Variability in amino acids at the positions equivalent to the active site of Zm-p60.1 βglucosidase derived from the multiple sequence alignment of 23 family members. The number of substitutions per site is represented by the bar and the types of amino acids are indicated by the one letter code. Fig. 3. (A) The main hydrophobic amino acid cluster (from the left: F193, F200 and F461, with W373 below) superimposed on the active site cavity of Zm-p60.1 β-glucosidase. (B) Model of the putative arrangement of amino acid alterations (from the left F193A, F200K, F461L, with W373K below) in the active site cavity of Zm-p60.1 β-glucosidase. In each case the protein surface is represented by a wire. Rotamer positions were calculated using the scoring function in SwissPdbViewer v3.7 and results were visualized using PyMol v0.97. Fig. 4. Secondary structure of wild-type and mutant Zm-p60.1 β-glucosidases as indicated by far-UV circular dichroism spectra. Solid lines (from top): WT, F193A, W373K. Dashed lines (from top): F461L, F200K and P2. Contents of secondary structural elements calculated from the CD spectra are presented in the inset: white columns, α-helices; black columns, β-sheets. Error bars for the wildtype Zm-p60.1 β-glucosidase represent the secondary structure content estimated from X-ray structure (PDB-ID code, 1hxj). Fig. 5. Quaternary structure of wild-type and mutant Zm-p60.1 β-glucosidases. (A) Elution profiles of wild-type and mutant Zm-p60.1 β-glucosidases from the HighLoad 16/60 Superdex 200 column. A sample (1.5 mL) of each enzyme purified by MCAC was applied to the column and eluted with elution buffer (50mM Tris.HCl, 500 mM NaCl; pH 7.00). Fractions corresponding to peaks d and m were collected and analyzed by (B) Coomassie-stained SDS-PAGE, (C) Coomassie-stained nativePAGE and (D) in-gel activity staining of native-PAGE gels. Peaks 1, 2, 3, 4 and 5 correspond to Blue Dextran 2000, ferritin (Mr 440 kDa), aldolase (Mr 158 kDa), bovine serum albumin (Mr 67 kDa) and ovalbumin (Mr 43 kDa), respectively, used as standards. Arrow marks positions of the wild-type and mutant Zm-p60.1 polypeptides in SDS-PAGE. Fig. 6. Modelled enzyme-substrate complexes viewed from the aglycone-binding site. Models of 4methylumbeliferyl β-glucoside (A-D) and p-nitrophenyl β-glucoside (E-F) docked into the aglyconebinding site of wild-type type Zm-p60.1 β-glucosidase (C, E) and the F193A mutant (A, B, D, F). Reactive complexes – A, C, D, E, F; non-reactive complex – B.

Fig. 1.

Fig. 2.

Fig.3

Fig. 4.

Fig.5.

Fig. 6.

Functional analysis of the aglycone-binding site of the maize βglucosidase Zm-p60.1 Radka Dopitová1,2, Pavel Mazura1,2,3, Lubomír Janda2,3, Radka Chaloupková4, Petr Jeřábek4, Jiří Damborský4, Tomáš Filipi3, Nagavalli S. Kiran1,3 and Břetislav Brzobohatý1,3

Supplementary material

Q33

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ------------MAPLL--AAAMNHAAAHPGLRSHLVGPNNESFSRHHLPSSSPQSSK-RRCNLSFTTR-SARVGSQ-NGVQM-LSPSEIPQRDWFPSDFTFGAATSAYQIEG-AWNEDG ------------MAPLL--AAAMNH-AAHPVLRSHLG-PNNESFSRHHL-SSSPQSSK-RRFNLSFTPR-SARVGNQ-NGVQL-LSPSEIPRRDWFPSDFIFGAATSAYQIEG-AWNEDG ------------MALLL--ASAINHTAHPAGLRSHPN---NESFSRHHLCSSPQNISK-RRSNLSFRPR-AQTISSESAGIHR-LSPWEIPRRDWFPPSFLFGAATSAYQIEG-AWNEDG ------------MAPLLLHASAISH-SAHPGLRSHIG-PNNEHISRHLS--SSSQNTK-RRCNISLRSR-AQRISSQ-LGGQK-LEHWEIPKRDWFPPSFTFGAATSAFQIEG-GWNEDG ------------MALLCS-ALSNST---HPSFRSHIG-ANSENL--WHLSADPAQKSK-RRCNLTLSSR-AARISSALE-SAKQVKPWQVPKRDWFPPEFMFGAASAAYQIEG-AWNEGG ------------MALLCS-ALSNST---HPSFRSHIAGANSENL--WHLSAHPAQKSK-RRCNLTLSSRAAARISSALE-SGK-LKPWQIPKRDWFPPEFTFGAASAAYQIEG-AWNEGG ------------MALLVGGTLNPTT---HLSLRSRAG-RNSENV--WLRSAASSQTSKGRFCNLTVRAGTPSKPSEPIGPVFTKLKPWQIPKRDWFSKDFLFGASTSAYQIEG-AWNEDG ---------------------------------------------------------------LLLLGFALANTNAARTDPPVVCATLNRTNFDTLFPGFTFGTATASYQLEG-AANIDG ----------------------------------------------MASVMALQFRSLLLCVVLLLLGFALANTNAAGTYPPVVCATLNRTHFDTLFPGFTFGAATAAYQLEG-AANIDG -----------------------------------------------------------------LLSITTTHIHAFKPLPIS-FDDFSDLNRSCFAPGFVFGTASSAFQYEG-AAFEDG --------------------------------------------------------MDFIVAIFALFVISSFTITSTNAVEASTLLDIGNLSRSSFPRGFIFGAGSSAYQFEG-AVNEGG MAAQLGLPLVSCHRGASQAASSSAHLVPGASAIMQAGNRRQKMRAPALRDRVVFARVVPVDGSVGFAGSSTEQETAVESATPTAVPSKVVLGRSSFPRGFIFGAASAAYQVEG-AWNEGG ---------------------------------------------------------MAITSIAHLRVVNANMSIPLARLRVVNANISIPLKRTSFPKKFLFGAGSASYQYEG-AAHIDG -------------------------------------------------------------MEVSVLMWVLLFYSLLGFQVTTAR-----LDRNNFPSDFMFGTASSAYQYEG-AVREDG -----------------------------------------------------MAARRANCALVLVLALALLAARDAGAAAVPKPNWLGGLSRAAFPKRFVFGTATSAYQVEG-MAASGG ---------------------------------------------------------------MMIFLTILAVNIFRMTS---------------FLERLLLLTRSKVKQLQR-VDHL---------------------------------------------------------------MLVLFISLLALTRPAMGTDDDDDNIPDDFSRKYFPDDFIFGTATSAYQIEG-EATAKG ---------------------------------------------------MASKHSLHLFGLLIVFLVSLLLVLTNQATAFDGDFIPLNFSRSYFPDDFIFGTATSAYQIEG-AANKFG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------MVLQKLP----LIGLLLLLTIVASP-ANADGPVCPP--SNKLSRASFPEGFLFGTATAAYQVPRFDLMKLV -------------------------------------------------MALQKFP----LMGLLLLLTILVSVTTAVDDPVCPA--TSKLSRASFPNGFLFGTATAAFQVEG-AINETC ----------------------------------------------------MKFP----LLGLLLLVTLVGSPTRAEEGPVCPK--TETLSRASFPEGFMFGTATASYQVEG-AVNEGC ---------------------------------------------------MVRFEKVHLVLGLALVLTLVGAPTKAQ-GPVCGAGLPDKFSRLNFPEGFIWGTATAAFQVEG-AVNEGC

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

H137,W138 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| KGESNWDHFCHNHP---ERILDGSNSDIGANSYHMYKTDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTKEGGINPDGIKYYRNLINLLLENGIEPYVTIFHWDVPQALEEKYGGFLDKSHKSI 218 KGESNWDHFCHNFP---ERIMDGSNADIGANSYHMYKTDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTVEGGINQDGIDYYKRLINLLLENGIEPYVTIFHWDVPQALEEKYGGFLDKTQKRI 215 KGPSTWDHFCHNFP---EWIVDRSNGDVAADSYHMYAEDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTLAGGINEKGVEYYNKLIDLLLENGIEPYITIFHWDTPQALVDAYGGFLDEED--- 213 KGPSTWDHFCHTYP---DFIADKSNGDVAADSYHLYEEDVKLLKEMGMDAYRFSISWPRILPNGTLS-DINEKGIAYYNNLINLLIDNGIEPYVTIFHWDTPQALVDDYGGFLDKRI--- 212 KGPSSWDNFCHSHP---DRIMDKSNADVAANSYYMYKEDVRMLKEIGMDSYRFSISWPRILPKGTLDGGINHEGIQYYNDLLDCLIENGIKPYITLFHWDTPQALADEYKDFLDRRI--- 211 KGPSSWDNFCHNYP---ERIMDGSNWDVAANSYYMYKEDVRMLKEIGMDSYRFSISWPRILPEGTLEGGINHEGIQYYNDLLDCLIENGIKPYITLFHWDTPQALADKYNDFLDRRI--- 212 KGPSTWDHFCHTYP---ERISDGTNGDVAANSYHMYEEDVKALKDMGMKVYRFSISWSRILPNGT--GKPNQKGIDYYNNLINSLIRHGIVPYVTIWHWDTPQALEDKYGGFLDKQI--- 213 RGPSIWDAFTHNHP---EKITDGSNGDVAIDQYHRYKEDVAIMKDMGLDAYRFSISWSRLLPNGTLSGGINKKGIEYYNNLTNELIRNGIEPLVTLFHWDVPQALEEEYGGVLSPRI--- 170 RGPSVWDNFTHEHP---EKITDGSNGDVAIDQYHRYKEDVAIMKDMGLDAYRFSISWSRLLPNGTLSGGINKKGIEYYNNLTNELLRNGIEPLVTLFHWDVPQALVDEYDGLLSPRI--- 187 KGPSIWDTFTHKYP---EKIKDRTNGDVAIDEYHRYKEDIGIMKDMNLDAYRFSISWPRVLPKGKLSGGVNREGINYYNNLINEVLANGMQPYVTLFHWDVPQALEDEYRGFLGRNI--- 167 RGPSIWDTFTHKYP---EKIRDGSNADITVDQYHRYKEDVGIMKDQNMDSYRFSISWPRILPKGKLSGGINHEGIKYYNNLINELLANGIQPFVTLFHWDLPQVLEDEYGGFLNSGV--- 177 RGPSIWDTFTHDHP---EKIADHSNGDKATDSYKKYKEDVKLLKDLGLDSYRFSISWSRILPKGTLQGGINQEGIQYYNDLINELLKNGIRPMVTLFHWDVPQALEDSYKGFRSSEI--- 233 RGLSVWDVFTKEHP---EKIADQSNGDVAQDFYHRYKEDIKSMKEMGLESFRFSISWSRILPNGKISGGINKLGIKFYNNLIDELLANGIKPLVTIYHWDLPQALQDEYGGFLSPKI--- 176 KGPSTWDALTH-MP---GRIKDSSNGDVAVDQYHRYMEDIELMASLGLDAYRFSISWSRILPEG--RGEINMAGIEYYNNLIDALLQNGIQPFVTLFHFDLPKALEDSYGGWLSPQI--- 164 RGPSIWDAFAH-TP---GNVAGNQNGDVATDQYHRYKEDVNLMKSLNFDAYRFSISWSRIFPDG--EGRVNQEGVDYYNNLINYLLQKGITPYVNLYHYDLPLALEKKYGGWLNAKM--- 177 -------VFGTYFPR--NRIIDGRNGDVAVDFYNRYIEDIKNVKKMGFNAFRMSISWSRVIPSGRRHEGVNEEGIQFYDDVINEIISNGLEPFVTIFHWDTPQALQDKYEGFLSRDI--- 147 RAPSVWDIFSKETP---DRILDGSNGDVAVDFYNRYIQDIKNVKKMGFNAFRMSISWSRVIPSGRRREGVNEEGIQFYNDVINEIISNGLEPFVTIFHWDTPQALQDKYGGFLSRDI--- 171 RGASVWDTFTHQYP---ERILDHSTGDVADGFYYRFKGDIQNVKNMGFNAFRFLISWPRVIPSGTRREGINEQGIEFYNKVINEIINQGMEPFVTIFHWDTPQAIEDKYGGFLSANI--- 182 ----------------------------GVDFFHRYKEDIQLMKNLNTDAFRMSIAWPRIFPHGRKEKGVSQAGVQFYHDLIDELKRNGITPFVTVFHWDTPQDLEDEYGGFLSERI--- 89 RGPALWDIYCRRYP----ERCNNDNGDVAVDFFHRYKEDIQLMKNLNTDAFRMSIAWPRIFPHGRKEKGVSQAGVQFYHDLIDELIKNGITPFVTVFHWDTPQDLEDEYGGFLSERI--- 177 RGPALWDIYCRRNPGECTQRCSGDHADVAVDFFHRYKEDIQLMKNLNTDAFRLSIAWSRIFPHGRKEKGVSQAGVQFYHELIDELLKNGIVPFVTVFHWDTPQDLEDEYGGFLSQNI--- 181 RGPSLWDIYTKKFP----HRVKNHNADVAVDFYHRFREDIKLMKKLNTDALRLSIAWPRIFPHGRMEKGNSKEGVQFYHDLIDELLKNDLTPLVTIFHWDMPADLEDEYGGFLSERV--- 174 RGPSMWDTFTKKFP----HRCENHNADVAVDFYHRYKEDIQLMKDLNTDAFRLSIAWPRIFPHGRMSKGINKVGVQFYHDLIDELLKNNIIPLVTVFHWDTPQDLEDEYGGFLSGRI--- 180

101 98 99 99 97 98 101 56 73 53 63 119 62 53 66 39 57 68 1 64 64 61 67

N185,E186

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

Q188,T189

F193

F200

N326

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

D256

M258

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| VEDYTYFAKVCFDNFGDKVKNWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPG-RCSPG-LD--CAYPTGN-SLVEPYTAGHNILLAHAEAVDLYNKHY-KRDDTRIGLAFDVMGRVPYG-TSFLDK-- 329 VNDYKNFAKVCFDNFGDKVKNWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPG-RCSPG-LD--CAIPTGN-SLVEPYIAGHNILLAHAEAVDLYNKYY-KGENGRIGLAFDVMGRVPYG-TSFLDE-- 326 YKDYTDFAKVCFEKFGKTVKNWLTFNEPETFCSVSYGTGVLAPG-RCSPG-VS--CAVPTGN-SLSEPYIVAHNLLRAHAETVDIYNKYH-KGADGRIGLALNVFGRVPYT-NTFLDQ-- 324 IKDYTDFAGLCFERFGDRVNNWLTFNEPHTFTCLSYGTGILAPG-RCSPG-MK--CPDPTGD-SIREPYLVGHNFLLAHAETVDLYNKFH-RGEKGRIGLALNVMGTVPYG-STFLDE-- 323 VKDYTDYATVCFEHFGDKVKNWFTFNEPHSFCGLGYGTGLHAPGARCSAG-MT--CVIPEED-ALRNPYIVGHNLLLAHAETVDVYNKFY-KGDDGQIGMVLDVMAYEPYG-NNFLDQ-- 323 VKDYTDYATVCFEHFGDKVKNWITFNEPHSFCGLAYGTGLHAPG-LCSPG-MD--CAIPQGD-ALRQPYIVGHNLLLAHAETVDVYKKFY-KGDDGQIGMVMDVMAYEPYG-NNFVDQ-- 323 VNDYKYFAELCFQSFGDRVKNWFTFNEPHTYCCFSYGEGIHAPG-RCSPG-LD--CAVPEGD-SLREPYTAGHHILLAHAEAVELFKAHYNKHGDSKIGMAFDVMGYEPYQ-DSFLDD-- 325 VYDFKAYAELCYKEFGDRVKHWTTLNEPYTISNHGYTIGIHAPG-RCSS-WYD--PTCLGGD-SGTEPYLVTHNLLLAHAAAVKLYREKYQASQEGVIGITVVSHWFEPAS-ESQKDI-- 282 VDDFEAYANLCYKEFGDRVKHWTTLNEPYTVSNHGYTIGIHAPG-RCSC-WYD--PTCLGGD-SGTEPYLVTHHLLLAHAAAVKLYREKYQASQNGVIGITIVSHWFEPAS-ESQQDK-- 299 VDDFRDYAELCFKEFGDRVKHWITLNEPWGVSMNAYAYGTFAPG-RCSD-WLK--LNCTGGD-SGREPYLAAHYQLLAHAAAARLYKTKYQASQNGIIGITLVSHWFEPAS-KEKADV-- 279 INDFRDYTDLCFKEFGDRVRYWSTLNEPWVFSNSGYALGTNAPG-RCS---AS--NVAKPGD-SGTGPYIVTHNQILAHAEAVHVYKTKYQAYQKGKIGITLVSNWLMPLDDNSIPDI-- 288 VNDFKDYADICFKEFGDRVKHWITLNEPWSLSTMGYAFGRHAPG-RCS---TW--YGCPAGD-SANEPYEVTHNLLLAHANAVKIYRDNYKATQNGEIGITLNSLWYEPYS-KSHEDV-- 343 VDDFLEYANLVFKEFGDRVKHWATLNEPNIMTQQGYVFGAHAPG-RCS--HFE--WNCPAGN-SGTEPYIVGHHLLLCHAAAFQLYKQKYKDDQKGIIGITTATQMAIPLN-DNVANL-- 287 INDFEAYAEICFRAFGDRVKYWATVNEPNLFVPLGYTVGIFPPT-RCAAPHAN--PLCMTGNCSSAEPYLAAHHVLLAHASAVEKYREKYQKIQGGSIGLVISAPWYEPLE-NSPEER-- 278 ADLFTEYADFCFKTFGNRVKHWFTFNEPRIVALLGYDQGTNPPK-RCTK--------CAAGGNSATEPYIVAHNFLLSHAAAVARYRTKYQAAQQGKVGIVLDFNWYEALS-NSTEDQ-- 285 VYDYDQYADLLFERFGDRVKRWMTFNEPSAYVGFAHDDGVFAPR-RCSS-WVN--RQCLAGD-SATEPYIVAHNLLLSHAAAVHQYRKYYQGTQKGKIGITLFTFWYEPLS-DSKVDV-- 259 VYDYLQYADLLFERFGDRVKPWMTFNEPSAYVGFAHDDGVFAPG-RCSS-WVN--RQCLAGD-SATEPYIVAHNLLLSHAAAVHQYRKYYQGTQKGKIGITLFTFWYEPLS-DSKVDV-- 283 VKDYREYADLLFERFGDRVKFWMTFNEPWSLSGFAYDDGVFAPG-RCSS-WVN--RQCRAGD-SATEPYIVAHHLLLAHAAAVKIYRENYQETQNGKIGITLFTYWFEPLS-NSTDDM-- 294 VKDFREYADFVFQEYGGKVKHWITFNEPWVFSHAGYDVGKKAPG-RCSKYVK---EECHDGR-SGFEAYLVTHNLLNSHAEAVEAFRQCEKCKGG-KIGIAHSPAWFEPHDLA--DSQDG 201 VKDFREYADFVFQEYGGKVKHWITFNEPWVFSHAGYDVGKKAPG-RSSSYVN---AKCQDGR-SGYEAYLVTHNLLISHAEAVEAYRKCEKCKGG-KIGIAHSPAWFEAHDLA--DSQDG 289 VKDFREYADYVFTEYGGKVKNWITFNEPWVFAHAGYDLGKKAPG-RCSRYVPG--CEDREGQ-SGKEAYLVSHNLLNAHAEAVEVFR--QKVKGG-KIGIAHSPAWFEPHDLK--DSNDA 292 VPDFVEYANFTFHEYGDKVKNWITFNEPWVFSRSAYDVGKKAPG-RCSPYIKDFGHLCQDGR-SGFEAYVVSHNLLVSHAEAVDAFRKCEKCKGD-KIGIAHSPAWFEPEDVE--GGQ-- 287 VQDFTEYANFTFHEYGHKVKHWITFNEPWVFSRAGYDNGKKAPG-RCSPYIPGYGQHCQDGR-SGYEAYQVSHNLLLSHAYAVDAFRNCKQCAGG-KIGIAHSPAWFEPQDLE--HVG-- 293 Y328

R331

P372,W373

370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| QAEERSWDINLGWFLEPVVRGDYPFSMRSLARERLPFFKDEQKEKLAGSYNMLGLNYYTSRFSKNIDI-SPNYSPVLNTDDAYASQEVNGPDG-KPIGPPMGNPWIYMYPEG-----LKD 442 QAKERSMDINLGWFLEPVVRGDYPFSMRSLARERLPFFSDKQQEKLVGSYNMLGINYYTSIFSKHIDI-SPKYSPVLNTDDAYASQETYGPDG-KPIGPPMGNPWIYLYPEG-----LKD 439 QAQERSMDKCLGWFLEPVVRGDYPFSMRVSARDRVPYFKEKEQEKLVGSYDMIGINYYTSTFSKHIDL-SPNNSPVLNTDDAYASQETKGPDG-NAIGPPTGNAWINMYPKG-----LHD 437 QAHERCMDYNLGWYLEPVVRGDYPHSMRSSVRDRLPHFTEKEQQKLVGSYDMIGINYYSSRFAKHVDI-TENFSPELNTHDCCATEEITGPNG-NTIGPATGNAWVYMYPKG-----LKD 436 QAQERAIDFHIGWFLEPMVRGDYPFSMRSLVGDRLPFFTKSEQEKLVSSYDFVGINYYTSRFAKHIDI-SPEFIPKINTDDVYSNPEVNDSNG-IPIGPDVGMYFIYSYPKG-----LKN 436 QAQERSIDFHIGWFLEPMVRGDYPFSMRSLVGDRLPFFTKSEQEKLVSSYDFVGINYYTARFSEHIDI-SPEIIPKLNTDDAYSTPEFNDSNG-IPIGPDLGMYWILSYPKG-----LKD 436 QARERSIDYNMGWFLEPVVRGDYPFSMRSLIGDRLPMFTKEEQEKLGSLCDIMGLNYYTSRFSKHVDI-SSDYTPTLNTDDAYASSETTGSDG-NEIGPITGTYWIYMYPKG-----LTD 438 NASVRALDFMYGWFMDPLTRGDYPQSMRSLVKERLPNFTEEQSKSLIGSYDYIGVNYYSARYASAYPEDYSIPTPPSYLTDAYVNVTT-ELNG-VPIGPQAASDWLYVYPKG-----LYD 395 DAASRALDFMYGWFMEPLTRGDYPQTMRSIVGSRLPNFTEEQSKSLNGSYDYIGVNYYSARYASAYTNNYSVPTPPSYATDAYVNVTTTDLNG-VPIGPQAASDWLYVYPKG-----LYD 413 DAAKRGLDFMLGWFMHPLTKGRYPESMRYLVRKRLPKFSTEESKELTGSFDFLGLNYYSSYYAAKAPR-IPNARP-AIQTDSLINATF-EHNG-KPLGPMAASSWLCIYPQG-----IRK 390 KAAERSLDFQFGLFMEQLTTGDYSKSMRRIVKNRLPKFSKFESSLVNGSFDFIGINYYSSSYISNAPS-HGNAKP-SYSTNPMTNISF-EKHG-IPLGPRAASIWIYVYPYMFIQEDFEI 404 EAATRALDFMFGWYMDPLVNGDYPFIMRALVRDRLPFFTHAESELIKGSYDFIGINYYTSNYAQHAPV-TEDHTPDNSYFDSYVNQSG-EKNG-VPIGPLQG-SWIYFYPRG-----LKE 454 LAASRAIDFNIGWFLHPVVYGEYPQTMRERLGSRLPKFTEKESEMLKQSFDFIGLNYYSTDYAAASSF-SVDPVNVSYTTDSRATLSA-IKDG-VPIGDPTFMSWLHIYPEG-----ILT 399 SAVDRILSFNLRWFLDPIVFGDYPQEMRERLGSRLPSISSELSAKLRGSFDYMGINHYTTLYATSTPP-LSPDHTQYLYPDSRVYLTG-ERHG-VSIGERTGMDGLFVVPHG-----IQK 390 AAAQRARDFHIGWYLDPLINGHYSQIMQDLVKDRLPKFTPEQARLVKGSADYIGINQYTASYMKGQQL-MQQTPTSYS-ADWQVTYVF-AKNG-KPIGPQANSNWLYIVPWG-----MYG 396 QAAKTALDFMFGLWMDPMTYGRYPETMVDLAGDRLIGFTDEESQLLRGSYDFVGLQYYTAYYAKPNIT--VDPNFRTYKTDSGVNATPYDNNG-NLIGPRAYSSWFYIFPKS-----IRH 371 QAAKTALDFMFGLWMDPMTYGRYPRTMVDLAGDKLIGFTDEESQLLRGSYDFVGLQYYTAYYAEPIPP--VDPKFRRYKTDSGVNATPYDLNG-NLIGPQAYSSWFYIFPKG-----IRH 395 QASRTALDFMFGLWMDPITYGRYPRTVQYLVGNRLLNFTEEVSHLLRGSYDFIGLQYYTSYYAKPNAP--YDPNHIRYLTDNRVTETPYDYNG-NLIGPQAYSDWFYIFPES-----IRH 406 ASIDRALDFILGWHLDTTMYGDYPQIMKDIVGHRLPKFTEAQKAKLKNSADFVGLNYYTSMFSNHLEK--PDPAKPRWMQDSLINWETKNAYN-YSIGSKPITGALPVFARG-----FRS 313 ASIDRALDFILGWHLDTTTFGDYPQIMKDIVGHRLPKFTTEQKAKLKASTDFVGLNYYTSVFSNHLEK--PDPSKPRWMQDSLITWESKNAQN-YAIGSKPLTAALNVYSRG-----FRS 401 PTVSRVLDFMLGWHLEPTTSGDYPQIMKDLLGYRLPQFTAAQKAKLKDSTDFVGLNYYTSTFSNYNEK--PDPSKPSWKQDSLVSWEPKNVDH-SAIGSMPLTAALPVYAKG-----FRK 404 RTVDRVLDFIMGWHLDPTTYGDYPQSMKDAVGARLPKFTKAQKAKLKGSADFVGINYYSSFYAKASEK--PDYRQPSWATDSLVEFEPKTVDGSVKIGSQPSTAKMAVYAAG-----LRK 400 GSIERVLDFILGWHLAPTTYGDYPQSMKDRVGHRLPKFTEAEKKLLKGSTDYVGMNYYTSVFAKEIS---PDPKSPSWTTDSLVDWDSKSVDG-YKIGSKPFNGKLDVYSKG-----LRY 404

E401 490

W451 500

510

520

530

540

E459,W460 550

F461,A462 560

E466 570

Y468 580

590

600

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| LLMIMKNKYGNPPIYITENGIGDVDTKETPLPMEAALNDYKRLDYIQRHIATLKESIDLG-SNVQGYFAWSLLDNFEWFAGFTERYGIVYVDRNNNCTRYMKESAKWLKEFN-TAKKP-ILMIMKNKYGNPPIYITENGIGDVDTKEKPLPMEAALNDYKRLDYIQRHISTLKESIDLG-ANVHGYFAWSLLDNFEWYAGYTERYGIVYVDRKNNYTRYMKESAKWLKEFN-TAKKP-ILMTMKNKYGNPPMYITENGMGDIDKGD--LPKPVALEDHTRLDYIQRHLSVLKQSIDLG-ADVRGYFAWSLLDNFEWSSGYTERFGIVYVDRENGCERTMKRSARWLQEFNGAAKKVEILMIMKKRYGNPPVYITENGMGDIDNGD--LSMEAALDDHIRLDYLQRHISVLKDSIDSG-ANVRGHFTWSLLDNFEWSSGYTERFGIVYVDRENGCKRTLKRSARWLKEFNGAAKRPGN ILLRMKEKYGNPPIYITENGTADMDGWGN-PPMTDPLDDPLRIEYLQQHMTAIKEAIDLGRRTLRGHFTWSLIDNFEWSLGYLSRFGIVYIDRNDGCKRIMKKSAKWLKEFNGATKKLNILLLMKEKYGNPPIYITENGTADMDGWGN-PPMTDPLDDPLRIEYLQQHMTAIKEAIDLG-ADVRGHFTWSLIDNFEWSMGYLSRFGIVYIDRNDGFKRIMKKSAKWLKEFNGATKEVNLLLIMKEKYGNPPIFITENGIADVE--GD-PEMPDPLDDWKRLDYLQRHISAVKDAIDQG-ADVRGHFTWGLIDNFEWGSGYSSRFGLVYIDKEDGNKRKLKKSAKWFAKFNSVPKTLLLVLYTKNKYNDPIMYITENGMDEFNN-PKISLE-QALNDSNRIDYCYRHLCYLQEAIIEG-ANVQGYFAWSLLDNFEWSEGYTVRFGINYVDYDNGLKRHSKLSTHWFKNFLKRSSISKE LVLYTKEKYNDPVMYITENGMDEFNN-PKLSLE-EALDDANRIDYYYRHLCYLQAAIKEG-ANVQGYFAWSLLDNFEWSEGYTVRFGINYIDYDNGLERHSKLSTHWFKSFLKRSSISKK LLLYVKNHYNNPVIYITENGRNS--------------------------------------STIN-----------------TVTSRIPF-----------------------------FCYILKINITILQFSITENGMNEFND-ATLPVE-EALLNTYRIDYYYRHLYYIRSAIRAG-SNVKGFYAWSFLDCNEWFAGFTVRFGLNFVD---------------------------LLLYVKRRYCNPKIYITENGTAEVE----KEKG-VPLHDPERKEYLTYHLAQVLQAIREG-VRVKGHFTWALTDNFEWDKGYTERFGLIYIDYDKDFNRQPKDSTKWFSKFLRT-----LLRYVKERYNNPFVMITENGMADENK-GSLAEDPMALKDNVRIRYHREHLYYVLEAIKEG-VNVGGYYAWTWMDDFEWGSGYTPRFGLNFVDFDNDLKRTPKDSYFWFKDFLAN-----IVEYVKEFYDNPTIIIAENGYPESE--ESSSTLQENLNDVRRIRFHGDCLSYLSAAIKNG-SDVRGYFVWSLLDNFEWAFGYTIRFGLYHVDFISDQKRYPKLSAQWFRQFLQHDDQGSI CVNYIKQKYGNPTVVITENGMDQPA--NLS--RDQYLRDTTRVHFYRSYLTQLKKAIDEG-ANVAGYFAWSLLDNFEWLSGYTSKFGIVYVDFNT-LERHPKASAYWFRDMLKH-----FLNYTKDTYNDPVIYVTENGVDNYNN--ESQPNGEALQDDFRISYYKKHMWNALGSLKNYSVNLKGYFAWSYLDNFEWNIGYTSRFGLYYVDYKNNLTRYPKESALWFTKFLNISVNANN FLNYTKDTYNDPVIYVTENGVDNYNN--ESQPIEEALQDDFRISYYKKHMWNALGSLKNYGVKLKGYFAWSYLDNFEWNIGYTSRFGLYYVDYKNNLTRYPKKSAHWFTKFLNISVNANN LLNYTKDTYNDPVIYITENGVDNQNN--ETEPIQDAVKDGFRIEYHRKHMWNALGSLKFYHVNLKGYFAWSYLDNFEWNIGYTARFGLYYVDYNNNLTRIPKDSAYWFKAFLNP-ENITK LLKYIKDKYGNPEIMIMENGYGEELG-AADS-IEVGTADHNRKYYLQRHLLSMNEAICIDKVNVTGYFVWSLLDNFEWQDGYKNRFGLYYIDFKNNLTRYEKESGRYYKDFLSQGVRPSM LLKYIKDKYANPEIMIMENGYGEELG-ASDS-VAVGTADHNRKYYLQRHLLSMQEAVCIDKVNVTGYFVWSLLDNFEWQDGYKNRFGLYYVDFKNNLTRYEKESGKYYKDFLSQGVRPSA LLKYIKDKYANPEIMIMENGYGDKLG-TTDS-VDVGTADHNRKYYLQRHLLAMNEAICIDKVRVTGYFVWSLLDNFEWQDGYKNRFGLYYVDFKNNLTRYEKESAKYYKDFLAQGVRPSA LVKYIKDRYGNPEIIITENGYGEDLG-EKDTDHSVALNDHNRKYYHQRHLLSLHQAICEDKVNVTSYFVWSLMDNFEWLDGYTARFGLYYIDFQNNLTRMEKESATCS--------LNSS LLKYIKDNYGDPEVIIAENGYGEDLG-EKHNDVNFGTQDHNRKYYIQRHLLSMHDAICKDKVNVTGYFVWSLMDNFEWQDGYKARFGLYYIDFQNNLTRHQKVSGKWYSEFLKPQFPTSK

P49235 Q41761 Q41290 Q93XR2 Q38786 Q9ZP27 Q9FYS3 Q43014 Q43073 P26205 P26204 Q42707 Q9XJ67 Q9ZT64 Q42975 O24524 Q41172 Q40283 O24434 O24433 O23656 Q42618 Q9SE50

....|....|....|....|....|....|....|.. ----------SKKILTPA----------------------------SKKIITPA----------------------------NNKILTPAGQLN--------------LIKPNFSEINKIKVVTPA-----------------------------NKILGASSCCSG------VTHGGGTA -----------NKILGASSCCSGELMWFLVQNPYGK-----------KTTNNNATVTAS------VSV----KIRRCGNNNARARKFVYRI-----------------KIRRCGNNNAKATKFVYQM-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------RSS---------------------------------------------------------------------IFECPSKDSRKVGKFYVM------------------IYELTSKDSRKVGKFYVM------------------TTRTVSWDSRKAGKFYIM------------------INRDEL------------------------------LKKDEL------------------------------LKRDEL------------------------------NRA---------------------------------LREEL-------------------------------610

620

630

566 563 565 571 574 578 568 531 549 425 493 562 511 510 504 507 531 541 437 525 528 514 528

558 555 553 553 554 553 553 512 530 425 493 562 511 507 504 489 513 523 431 519 522 511 523

Fig. S1. Multiple sequence alignment of 23 β-glucosidases representing 13 plant species. Sequences of related plant β-glucosidases were selected from the Cazy database (www.cazy.org), aligned using created using ClustalW software and manually adjusted. Active site amino acids are marked in the square.

30 wt

Relative scale

1

F193A

0.8

W373K

0.6 0.4 0.2 0

3 2 -1 MRE [x10 deg.cm .dmol ]

1.2

wt F193A W373K wt F193A W373K

25 20 15 10 5 0 -5 -10

-0.2 20

30

40

50 T [°C]

60

70

-15 185

200

215

230

245

260

wavelength [nm]

Fig. S2. (A) Thermal denaturation curves showing the thermostability of F193A and W373K mutant and wild-type Zm-p60.1 β-glucosidases. (B) Far-UV circular dichroism specra of the enzymes: solid lines represent the CD spectra of proteins before heating and dotted lines after heating from 23°C to 73°C, cooling and incubation at 23°C for 10 min (B). ΘMRE – mean residue elipticity.

Table S1. Active site amino acids of Zm-p60.1 β-glucosidases forming contacts with the glycone (G), aglycone (A) or no part (-) of the substrate molecule according to the Ligand-Protein Contacts database (http://bioportal.weizmann.ac.il/oca-bin/lpccsu).

Amino acid residue Q33 L60 H137 W138 N185 E186 Q188 T189 F193 F200 D256 V257 M258

Contact with G G GA G GA A GA A GA GA A

Amino acid residue R260 S276 I279 N280 N326 Y328 T329 R331 T348 A351 A353 Q355 P372

Contact with G GA ? A

Amino acid residue W373 E401 V407 T409 W452 E459 E459 W460 F461 A462 T465 E466 Y468

Contact with GA G G GA GA GA GA GA GA GA

Table S2. Melting temperatures (Tm) of the mutant and wild-type Zm-p60.1 β-glucosidases derived from thermal denaturation curves. enzyme wt F193A W373K

c (mg/ml) 0.113 0.103 0.170

λΘ (nm) 223 222 221

Tm (°C) 48.0 47.2 49.2

Table S3. Populations of 4MUGlc docked to the active site of mutant and wild-type Zmp60.1 β-glucosidases. wild-type F193A Mean Mean Docked Docked Energy Energy Population b Cluster (kcal/mol) Population Reactivity Cluster (kcal/mol) (50 runs) Reactivityb 1 -11.37 3 yes 1 -11.77 3 no 2 -11.19 1 yes 2 -11.81 1 no 3a -11.00 44 yes 3 -10.83 3 no 4 -11.10 1 yes 4 -10.79 2 no 5 -10.67 1 no 5 -10.82 1 yes 6 -10.78 1 yes 7 -10.53 4 yes 8 -10.53 2 yes a 9 -10.28 32 yes 10 -10.38 1 yes a b

orientation used for optimization by QM reactive orientation refers to positioning of the sugar moiety inside the active site

Table S4. Populations of pNPGlc docked to the active site of mutant and wild-type Zm-p60.1 β-glucosidases.

wild-type F193A Mean Mean Docked Docked Energy Energy Population b Cluster (kcal/mol) Population Reactivity Cluster (kcal/mol) (50 runs) Reactivityb 1 -10.55 4 no 1 -10.23 7 no a 2 -9.93 44 yes 2 -9.89 2 no 3 -10.21 1 yes 3 -9.99 1 no 4 -9.57 1 no 4a -9.49 31 yes 5 -9.49 4 yes 6 -9.34 3 yes 7 -9.06 1 yes 8 -8.66 1 yes a b

orientation used for optimization by QM reactive orientation refers to positioning of the sugar moiety inside the active site

Příloha 2 publikace : A new, senzitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides

J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55 – 63 www.elsevier.com/locate/jbbm

A new, sensitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides Pavel Mazura a,b , Radka Fohlerová a,b , Břetislav Brzobohatý b , Nagavalli S. Kiran a,b , Lubomír Janda a,⁎ a

Department of Functional Genomics and Proteomics, Masaryk University, University Campus Bohunice, Kamenice 3, CZ-62500 Brno, Czech Republic b Institute of Biophysics AS CR, Královopolská 135, CZ-61265, Brno, Czech Republic Received 17 October 2005; received in revised form 28 March 2006; accepted 29 March 2006

Abstract The maize β-glucosidase Zm-p60.1 is important for the regulation of plant development through its role in the targeted release of free cytokinins from cytokinin-O-glucosides, their inactive storage forms. Enzyme kinetics studies using these scarce substrates close to physiological concentrations are difficult due to two reasons: (a) Available methods are mainly suited for end-point kinetics. (b) These methods are not sufficiently sensitive when using scarce glucoside substrates.We developed a glucose assay using a system comprising three enzymes β-glucosidase, glucose oxidase and horseradish peroxidase, with the new substrate N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine–Amplex Ultra Red reagent (Molecular Probes). A calibration curve was constructed for resorufin and validation was carried out by comparing our method with the standard spectrophotometric method using p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside. In comparison with the other methods, this method is more sensitive, precise and accurate. The assay is rapid and hence suited for continuous kinetics, it is readily adapted to suit automated procedures, and potential applications include its use in studying the physiological role(s) of enzymes that cleave scarce glucoside substrates. © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Amplex Ultra Red reagent; β-Glucosidase; Glucose assay; Glucose-oxidase/peroxidase-coupled reaction; Phytohormone conjugation; Zeatin-O-glucoside

1. Introduction β-Glucosidases (β-D-glucoside glucohydrolase; EC 3.2.1.21) are a widespread group of enzymes that hydrolyze a broad variety of glucosides including aryl- and alkyl-β-D-glucosides. ⁎ Corresponding author. Fax: +420 54949 2640. E-mail address: [email protected] (L. Janda). 0165-022X/$ - see front matter © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.jbbm.2006.03.018

56

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

The physiological function of β-glucosidases varies greatly depending upon the organism of origin (plants, fungi, animals or bacterial) and substrate specificity. In plants, β-glucosidases have been implicated in regulating several aspects of development, including phytohormone activation, degradation of endosperm cell wall during germination and pathogen defense. The widespread and often the exclusive use of artificial substrates such as benzyl, nitrophenyl and 4methylumbelliferyl glycosides during characterization of glycosidases also has contributed to a commonly held but inaccurate view, that β-glucosidases do not exhibit high specificity towards the aglycone moiety. Determination of kinetic parameters against native substrates is limited by many factors including sensitivity of method, precision and discontinuity of measurement. In the literature, various methods for determination of β-glucosidase activity have been described. These vary from the simple photometric estimation of the increase in colored product concentration to sophisticated assays in which immunogenic products are quantified by ELISA. We have developed a rapid, accurate and sensitive assay for glucose that enabled us to measure the kinetic parameters for a cytokinin-O-glucoside-specific β-glucosidase [1] towards its natural substrate. Both the β-glucosidase reaction and the detection reaction occur simultaneously in solution. Measurement is continuous and the reaction is measured nine times during 3 s.

ß-glucosidase cytokinin + glucose

cytokinin-O-glucoside

glucose oxidase D-gluconolactone + H2O2

glucose + O2

horseradish peroxidase H2O2 + Amplex UltraRed

resorufin

2. Materials and methods 2.1. Chemicals and instrumentation In the standard procedure for determining kinetic parameters by spectrophotometry we used pnitrophenyl β-D-glucopyranoside (PNPG), p-nitrophenol (Sigma) and the ELISA plate reader Rainbow (Tecan). Incubation was done at 30 °C and the measurement was performed according to [2]. In our new fluorimetry procedure, we used Amplex Ultra Red, resorufin, Amplex Red Glucose/ Glucose Oxidase Assay Kit (Molecular Probes). trans-Zeatin-O-glucoside (ZOG) was supplied by Olchemim. All fluorimetric measurements were done on a FluoStar Galaxy fluorimeter (BMG Co.),

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

57

a multifunctional microplate reader that can perform a wide variety of applications for fluorescence intensity, time-resolved fluorescence, absorbance and luminescence. It can measure in the fluorescence polarization mode. The instrument can also be configured for injection and incubation. 2.2. Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay The Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (Molecular Probes) provides a sensitive onestep fluorimetric method for detecting as little as 3 μM D-glucose or 0.05 mU/mL of glucose oxidase in a 100 μL assay volume. We used the key reaction involved in this kit to develop our method. The temperature in all cases was 30 °C. Enzymes and substrates were diluted in 50 mM citrate/ phosphate buffer pH 5.5. Amplex Red and Amplex Ultra Red (Molecular Probes) were diluted in DMSO (Sigma). All aliquots were frozen and stored under nitrogen to avoid oxidation of Amplex Red/ultrared reagents and for better reproducibility. Frozen aliquots were thawed just before use. 2.3. Enzymes For our method, we optimized the usage of three enzymes—β-glucosidase Zm-p60.1 from Zea mays (EC 3.2.1.21), glucose oxidase (GO) from Aspergillus niger (EC 1.1.3.4) and peroxidase (HRP) from horseradish (EC 1.11.1.7). Recombinant β-glucosidase Zm-p60.1 [3] was expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3)pLysS according to a procedure that will be published elsewhere. (Fohlerová et al., unpublished results). In brief, purification on Ni Sepharose High Performance matrix was facilitated by a His tag. Elution was triggered by EDTA. The elution fraction was then applied to a Phenyl Sepharose 6 Fast Flow matrix. The purified protein preparation was concentrated and used directly for kinetic and electrophoretic analysis. The minimum purity of the protein was approximately 94% as determined by SDS PAGE and densitometry. Optimization of our method required not only changing the amount of enzymes in the detection reaction but also testing glucose oxidases and horseradish peroxidases from different suppliers to minimize nonspecific reaction(s). The final combination used was glucose oxidase (Fluka cat. no. 49180) along with horseradish peroxidase (Fluka cat no. 77333). Raw data from all experiments were processed in the program Microsoft Excel. The data were formatted to represent accumulation of product over time. A line was fitted through the measured points by linear regression and reaction velocity for each concentration of substrate was calculated. The values of turnover number (kcat) and Michaelis constant (KM) were calculated by using the classic Michaelis–Menten rate equation. This equation was implemented in program Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, USA) and the hyperbolic profile was non-linearly fitted to the data points. 3. Results 3.1. Sensitivity of Glucose/Glucose Oxidase Assay in original kit and after optimization The development of our method started by testing standard methods for determining glucose levels. These products are mainly suited for determining the amount of glucose in foods and body fluids. The most recent is Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (Molecular Probes). This kit is very sensitive due to the intense fluorescence of resorufin, the product of the detection reaction. The detection limit for standard procedure is 3 μM glucose, but this sensitivity is reached after a 30 min incubation. Since in our case it is impossible to stop the glucosidase reaction, detections that require such long incubations are not suited for our purposes.

58

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

Fig. 1. Comparison of glucose assay with the standard chromogenic assay. In the standard assay reaction, colorless PNPG is hydrolyzed to glucose and the yellow aglycone, PNP. PNP was measured discontinuously by spectrophotometry at 405 nm. This standard procedure was done for different concentrations of PNPG and rates were determined (absorbance). Continual measurement of released glucose under the same conditions was carried out independently (fluorescence) using the new glucose oxidase/peroxidase coupled assay with Amplex UltraRed as the peroxidase substrate.

We therefore rebuilt this procedure for the immediate detection of glucose level after aliquots were taken from the reaction. Different concentrations from 1 μM up to 20 μM of glucose were used for calibration and the fluorescence was measured under the same conditions and times as the enzyme assay. As a result, we arrived at the following experimental protocol: 1. Start reaction by adding β-glucosidase to substrate solution. The reaction contained PNPG and ZOG at concentrations between 200 and 10,000 μM, 0.75–3.75 μg of purified β-glucosidase, 50 U of GO, 25 U of HRP and 5 μM AUR in a reaction volume of 1 ml. 2. Fill in the automatic injector with assay solution. 3. Inject aliquots at defined times into wells on microplate filled previously with detection enzymes and Amplex Red. Typical results were series of six to eight measurements, depending on sampling intervals, for each concentration of substrate within a time-frame of 2.5 min. The detection limit was 2 μM glucose. Reaction rates were consistently overrated. We determined that this overestimation was mainly due to mutarotation of glucose occurring at different rates in the reaction and in the calibration solutions. 3.2. Mutarotation and the calibration curve Mutarotation is the interconversion of α- and β-anomers of carbohydrates. This natural process establishes, over a period of minutes, an equilibrium solution comprising approximately

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

59

36% α- and 64% β-anomers. GO specifically acts on the β-anomer. For the standard procedure with long incubation times, a calibration curve based on defined glucose concentrations is used. Under those conditions, the anomer equilibrium is established both in the calibration as well as in the reaction solution. In rapid detection methods, the establishment of full equilibrium is not possible. The glucosidase reaction releases only β-glucose and therefore the assay results are overrated when compared to the calibration solution where equilibrium is already established. To overcome the mutarotation problem, we first changed the calibration procedure and also modified the detection reaction into a much faster one, which is suitable for continuous kinetics. The newly adopted calibration is carried out by directly measuring defined concentrations of resorufin under reaction conditions. The resulting calibration curve is independent of glucose mutarotation. The proposed experimental setup is as follows. The whole procedure is under software control. 1. The reaction was started by injecting β-glucosidase, GO and HRP mixture through an automatic injector into microplate wells filled previously with different substrate concentrations and Amplex Ultra Red. The amount of purified β-glucosidase was 0.675 μg and the reaction volume was reduced to 150 μl. All other components remained unchanged. 2. Measurement was started 0.5 s after injection and continued for 2.5 s. The result typically was nine time points for each substrate concentration. Detection limit was 100 nM glucose. 3.3. Kinetics of PNPG hydrolysis by β-glucosidase according to the standard assay and the new method In the standard assay reaction, colorless PNPG is hydrolyzed to glucose and the yellow aglycone PNP. Concentration of PNP is measured discontinuously by spectrophotometry at 405 nm [2]. This

Fig. 2. Michaelis–Menten kinetics of ZOG cleavage by Zm-p60.1: dependence of velocity on substrate concentration. Reaction velocity was measured in the range of substrate concentrations between 100 and 10,000 μM. The resulting hyperbolic kinetics enabled the calculation of the parameters KM and kcat (see box in chart).

60

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

standard procedure was done for concentrations between 200 and 10000 μM PNPG. We estimated the KM to be 718.22 ± 35.99 μM and the kcat to be 35.51 ± 0.59 s− 1 (Fig. 1). In our new method, continuous fluorimetric measurement of released glucose under the same conditions was done independently. The estimated KM was 707.34 ± 44.31 μM and kcat was 34.12 ± 0.72 s− 1 (Fig. 1). 3.4. Kinetic parameters of ZOG hydrolysis by β-glucosidase We used ZOG, a plant phytohormone conjugate, as a natural substrate for the β-glucosidase Zm-p60.1. Enzymatic hydrolysis of this conjugate releases glucose and trans-zeatin, the most abundant natural cytokinin. Fluorimetric measurement of the released glucose was carried out for concentrations between 100 and 10000 μM ZOG. The estimated KM was 697.43 ± 41.30 μM and the kcat was 4.58 ± 0.09 s− 1 (Fig. 2). 4. Discussion We developed a glucose assay system comprising three enzymes—β-glucosidase, glucose oxidase and horseradish peroxidase with the new substrate N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (Amplex Ultra Red reagent, Molecular Probes), which is converted into the brightly fluorescent and strongly absorbing reaction product (absorption/emission maxima 568/581 nm) resorufin. Until now, two main methods have been used for glucose estimation based on coupled enzymatic assays where glucose is determined either by the peroxidase/glucose-oxidase-coupled reaction utilizing 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) [4,5] or by hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase reaction (Boehringer) producing NADPH, which absorbs at 340 nm [6]. Non-chromogenic aglycones can also be quantified by HPLC [7]. All these methods are suited for end-point kinetics and require that the assay be stopped. βglucosidase can be inactivated by adding by 40 mM D-gluconic acid [8], by 0.2 M borate buffer, pH 10 [9], by cold acetone [10], by 1 N HCl [7], by 0.4 M Na2CO3 [11] or by heat inactivation [4]. These treatments directly or indirectly influence the assay reaction and decrease the sensitivity of the method. Boiling β-glucosidase at 100 °C for 3 min cannot completely inactivate the enzyme and further, the substrate is not stable in such high temperatures. Coupled enzymatic schemes comprise an enzyme-catalyzed chromogenic or fluorigenic second step that produces an optical signal. To select the appropriate substrate for horseradish peroxidase was a challenge, because all peroxidase detection reagents have weaknesses. TMB (3,3′,5,5′tetramethylbenzidine) precipitates easily due to low water solubility. OPD (o-phenylendiamine dihydrochloride) is light sensitive and the chromogenic reagent ABTS (2′-azino-bis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) is readily oxidized and has slow color development. These compounds were found to be unstable under certain conditions after reaction with peroxidase [12]. A survey of several buffers and pH values showed that the oxidized ABTS was destabilized by raising the pH or by using the so-called Good buffers [13]. We have used Amplex Ultra Red reagent, a fluorigenic substrate for horseradish peroxidase. This non-fluorescent reagent reacts with H2O2 in a 1:1 stoichiometric ratio to produce brightly fluorescent and strongly absorbing reaction product (excitation/emission maxima ∼ 544/574 nm). Amplex Ultra Red is more resistant to spontaneous oxidation [14] and provides rapid results. Also the sensitivity of the substrate is higher than for other substrates. However, this substrate has its own limits. When we use high concentrations of glucose it can be locally over-oxidized from a

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

61

pink/highly fluorescent state (resorufin) to the blue/non fluorescent resazurin which can lead to reduced fluorescence. 4.1. Development of the method As described above, we developed a method mainly focused on sensitivity and speed of measurement. The experimental setup required several optimizations. Discontinuous kinetics has the advantage of being simple and requiring minimal optimization. But in our case, we needed to develop a very rapid assay that measured kinetic parameters in a continuous manner in order to overcome problems associated with mutarotation conversion occurring in solution. This involved a complex reaction mixture and, consequently, we had to optimize several of the reaction components. In the final assay setup, the β-glucosidase reaction and glucose detection reaction occur simultaneously. It allowed us to perform fast continual measuring of released glucose within 3 s with a detection limit of 100 nM glucose. D-Gluconolactone, one of the products of the glucose oxidase reaction, is a known competitive inhibitor of β-glucosidases. However, in our assay setup, it should not influence the kinetic parameters as it does not accumulate to concentrations close to the Ki [8]. 4.2. Validation of the method For confirmation of the ability of measuring natural substrates, comparison with standard method was done. The substrate most widely used currently for kinetic studies on β-glucosidases is PNPG. Colorless PNPG is hydrolyzed to glucose and the yellow aglycone PNP. PNP is measured discontinuously by spectrophotometry at the absorbance maximum of 405 nm. This standard procedure was done for different concentrations of PNPG and rates were determined. Continual measurement of glucose under the same conditions was done by our new method independently. Rates of hydrolysis for the same concentrations were compared and no significant difference was observed (Fig. 1, Table 1). This leads us to propose that the new assay can be used to measure kinetic parameters in all cases where PNPG is currently used. Thus, the new assay is ideal for studying enzyme specificity towards the aglycone moiety which is not possible using PNPG. 4.3. Kinetics with rare glucoside substrates We developed a glucose detection assay to estimate kinetic parameters of a β-glucosidase against cytokinin-O-glucosides, which are substrates that occur in very small concentrations in nature. As a type substrate we used ZOG, the O-glucoside conjugate of trans-zeatin, the most abundant natural cytokinin.

Table 1 Comparison of kinetic parameters of Zm-p60.1 Substrate [measurement]

KM (μM)

kcat (s− 1)

PNPG [PNP, absorbance] PNPG [glucose, fluorescence] ZOG [glucose, fluorescence]

718.22 ± 35.99 707.34 ± 44.31 697.43 ± 41.30

35.51 ± 0.59 34.12 ± 0.72 4.58 ± 0.09

62

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

Our previous attempts at determining the KM against ZOG using an ELISA assay to detect released zeatin (Table 1 in [15]) and other similar approaches yielded relatively crude estimates of KM due mainly to the unsatisfactory detection methods that were available. The newly developed assay enabled us to approach such physiologically relevant concentrations in an in vitro setup (Fig. 2). It is apparent from the significantly different turnover number (Table 1) that measuring kinetic parameters against natural substrates is necessary to understand fully the biological role(s) of β-glucosidases. Thus, it represents a powerful addition to our repertoire of tools that will help us understand the biological role(s) of Zm-p60.1 and related enzymes. We wanted to develop a rapid sensitive assay to determine kinetic parameters against ZOG as we are interested in elucidating the determinants of the catalytic activity of Zm-p60.1, which is predicted to play a key role in plant development. We would like to employ this assay in extending our previous analyses [2,16] of the role(s) of the individual amino acids that comprise the catalytic center in determining the substrate choice(s) of the enzyme. 5. Simplified description of the method and its applications A new method was developed for determination of glucose in the micromolar range. The assay was optimized for kinetic determinations within 3 s. Reaction starts by injecting β-glucosidase GO and HRP mixture through automatic injector into thermostable wells (30 °C) of a 96-well MTP filled previously with 100 μl of different substrate concentrations and Amplex Ultra Red. The reaction is started by the injection of enzyme mixture and continues for 2.5 s. As a result, we obtain typically nine points of each measured substrate concentration. Control experiments were conducted by adding buffer in place of substrate to give a blank signal denoted as X0. All MTP experiments were done in triplicate. Due to the fast measurement, this method can be applied for determining kinetic parameters of β-glucosidase reactions against glucose conjugated phytohormones as in our case. There is a wide range of potential applications. These include, but are not limited to, the measurement of glucose levels and/or glucosidase activity in various biological samples, determining kinetic parameters of glucosidases against different glucoconjugates or any other process where glucose is liberated. The procedure is relatively simple and in combination with current sophisticated fluorimetry equipment is an ideal candidate for full automatization. Acknowledgements We would like to express our gratitude to Dr. Kozubík (IBP, AS CR, Brno) and Dr. Rychlík (VRI, Brno) for providing equipment for measuring fluorescence. This work was supported by grants from the Ministry of Education of the Czech Republic (Nos. MSM 0021622415), the GA CR (No. GACR 203/02/0865) and the AS CR (AVOZ50040507). References [1] Brzobohatý B, Moore I, Kristoffersen P, Bako L, Campos N, Schell J, et al. Release of active cytokinin by a βglucosidase localized to the maize root meristem. Science 1993;262:1051–4. [2] Rotrekl V, Nejedlá E, Kučera I, Abdallah F, Palme K, Brzobohatý B. The role of cysteine residues in structure and enzyme activity of a maize β-glucosidase. Eur J Biochem 1999;266:1056–65. [3] Zouhar J, Nanak E, Brzobohatý B. Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific β-glucosidase. Protein Expr Purif 1999;17:153–62.

P. Mazura et al. / J. Biochem. Biophys. Methods 68 (2006) 55–63

63

[4] Verdoucq L, Czjzek M, Moriniere J, Bevan DR, Esen A. Mutational and structural analysis of aglycone specificity in maize and sorghum β-glucosidases. J Biol Chem 2003;278:25055–62. [5] Raabo E, Terkilesen TC. On the enzymatic determination of blood glucose. Scand J Clin Lab Invest 1960;12:402–7. [6] Leah R, Kigel J, Svendsen I, Mundy J. Biochemical and molecular characterization of a barley seed β-glucosidase. J Biol Chem 1995;270:15789–97. [7] Sue M, Ishihara A, Iwamura H. Purification and characterization of a β-glucosidase from rye (Secale cereale L.) seedlings. Plant Sci 2000;155:67–74. [8] Babcock GD, Esen A. Substrate specificity of maize β-glucosidase. Plant Sci 1994;101:31–9. [9] Keresztessy Z, Kiss L, Hughes MA. Investigation of the active site of the cyanogenic β-D-glucosidase (linamarase) from Manihot esculenta Crantz. (cassava): I. Evidence for an essential carboxylate and a reactive histidine residue in a single catalytic center. Arch Biochem Biophys 1994;314:142–52. [10] Falk A, Rask L. Expression of zeatin-O-glucoside-degrading β-glucosidase in Brassica napus. Plant Physiol 1995;108:1369–77. [11] Cicek M, Esen A. Expression of soluble and catalytically active plant (monocot) β-glucosidases in E. coli. Biotechnol Bioeng 1999;63:392–400. [12] McCoy-Messer JM, Bateman Jr RC. Instability of the ABTS/peroxidase reaction product in biological buffers. Biotechniques 1993;15:270–3. [13] Good NE, Winget GD, Winter W, Connolly TN, Izawa S, Singh RM. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry 1966;5:467–77. [14] Towne V, Will M, Oswald B, Zhao Q. Complexities in horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of dihydrophenoxazine derivatives: appropriate ranges for pH values and hydrogen peroxide concentrations in quantitative analysis. Anal Biochem 2004;334:290–6. [15] Kiran NS, Polanská L, Fohlerová R, Mazura P, Válková M, Šmeral M, Zouhar J, et al. Ectopic over-expression of the maize β-glucosidase Zm-p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. J Exp Bot 2006;57:985–96. [16] Zouhar J, Vevodová J, Marek J, Damborský J, Su XD, Brzobohaty B. Insights into the functional architecture of the catalytic center of a maize β-glucosidase Zm-p60.1. Plant Physiol 2001;127:973–85.