MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav chemie
Využití laseru 405 nm pro fluorescenční detekci v kapilární elektroforéze
Bakalářská práce
Brno, květen 2008
ŠKRHÁK Tomáš
Děkuji doc. Mgr Janu Preislerovi, PhD. za odborné vedení mé bakalářské práce, jeho účast a cenné rady při experimentech. Dále děkuji Mgr. Markétě Ryvolové a Mgr. Janu Přikrylovi za pomoc během měření na přístroji CE-LIF a také všem dalším studentům a pracovníkům z Oddělení Analytické chemie Ústavu chemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity.
2
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně a že jsem použil pouze uvedenou literaturu a experimentální výsledky dosažené v laboratořích Ústavu chemie.
…………………
………………………
datum
Škrhák Tomáš
3
Obsah Úvod ....................................................................................................................................... 5 I. Teoretická část ...................................................................................................................... 6 1. Kapilární elektroforéza ..................................................................................................... 7 1.1 Elektroosmotický tok ................................................................................................. 8 1.2 Zdánlivá pohyblivost .................................................................................................. 9 1.3 Jouleovo teplo .......................................................................................................... 10 1.4 Kapilára .................................................................................................................... 11 1.5 Dávkování vzorku .................................................................................................... 11 1.6 Laserem indukovaná fluorescenční (LIF) detekce ................................................... 13 1.7 Budící zdroje pro LIF detekci .................................................................................. 13 2. Fluorescence ................................................................................................................... 15 2.1 Charakteristiky fluorescence .................................................................................... 17 2.2 Fluorofory................................................................................................................. 18 2.3 Fluorescence riboflavinu .......................................................................................... 19 2.4 Fluorescence GFP .................................................................................................... 19 II. Experimentální část ........................................................................................................... 21 3. Popis kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí ............................... 22 3.1 Použité přístroje a chemikálie .................................................................................. 22 3.2 Instrumentace CE-LIF .............................................................................................. 23 4. Experimenty CE-LIF ...................................................................................................... 27 4.1 CE-LIF riboflavinu ................................................................................................... 27 4.2 CE LIF zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP) ........................................................ 31 4.3 CE LIF AHP5-GFP .................................................................................................. 32 III. Shrnutí výsledků ............................................................................................................... 34 IV. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................................. 35
4
Úvod Analytická chemie je obor, ve kterém díky pokročilé instrumentaci, dochází v dnešní době ke značným pokrokům. K řešení úkolů může využívat širokého spektra vlastností sloučenin. Nejde ale jen o jednu vlastnost, ideální je využít kombinaci různých vlastností, třeba u látek s velice podobnými migračními vlastnostmi v elektrickém poli můžeme využít jejich schopnost absorbovat či emitovat záření s přesně definovanými vlastnostmi. Získáme tak informace i o látce, která má s jinými sloučeninami některé vlastnosti podobné. Bakalářská práce je ve značné míře případů první vědecká práce se kterou se student potýká. Cíle bakalářské práce jsou: o literární rešerše na téma o seznámit se s kapilární elektroforézou s laserem indukovanou fluorescencí (CE-LIF) o CE LIF riboflavinu o CE LIF zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP) a proteinu AHP5 značeného markerem GFP V teoretické části bakalářské práce jsou zpracovány obecné informace o kapilární elektroforéze, fluorescenci a látkách, které emitují při 405 nm laserovém záření. Experimentální část se zabývá stanovením riboflavinu, zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP) a jeho a jím derivatizovaných proteinů.
5
I. Teoretická část
6
1. Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza patří mezi elektromigrační metody. V kapilární elektroforéze (CE) se látky od sebe separují na základě jejich rozdílných pohyblivostí v elektrickém poli. Na obr. 1 je znázorněno schematické zapojení CE.
Obr. 1 Schéma zapojení kapilární elektroforézy
Definice elektroforézy je migrace látek vlivem elektrického pole. Síla působící na ion v elektrickém poli je přímo úměrná efektivnímu náboji q a intenzitě elektrického pole E: FE = q ⋅ E
Proti elektrické síle působí třecí síla F f :
F f = f ⋅ vep kde vep je rychlost iontu a f je frikční koeficient, který lze vyjádřit vztahem:
f = 6πηr V případě, že FE = F f , dostaneme:
q ⋅ E = f ⋅ vep Úpravou rovnice získáme: 7
vep =
q ⋅ E = µ ep ⋅ E f
kde µ ep je elektroforetická pohyblivost. Použitelnost elektroforézy se zvyšuje, díky zlepšujícím se separačním schopnostem kapilární elektroforézy. Elektroforéza již není limitována pouze na separaci kationtů, aniontů nebo neutrálních částic, ale umožňuje i separaci makromolekul během jedné analýzy. Jako výhoda oproti polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) se jeví, že v kapilární elektroforéze lze separovat proteiny v nativním stavu a dávkovat je hydrodynamicky. 1, 2
1.1 Elektroosmotický tok Jedním z hlavních faktorů ovlivňující průběh elektroforézy je elektroosmotický tok, neboli elektroosmóza. Tavený křemen, jakožto materiál tvořící vnitřní povrch kapiláry je pokryt Si-OH skupinami. Při dosažení pH nad hodnotu 3 začíná docházet k disociaci hydroxylové skupiny, čímž dojde k distribuci záporného náboje po celém vnitřním povrchu kapiláry tvořeném SiO- skupinami. pH >3 Si − OH → Si − O − + H +
Vznik filmu záporně nabitých skupin umožňuje elektrostatickou interakci opačně nabitým iontům v pufru, čímž dochází ke vzniku elektrické dvojvrstvy. Elektrická dvojvrstva se skládá ze dvou částí a to z monomolekulárního filmu kationtů tzv. Helmholtzovy vrstvy, která je dále následována Gouy-Chapmanovou vrstvou. Spojení Helmholtzovy vrstvy a GouyChapmanova modelu popisuje tzv. Sternův model. Zapnutím napětí se díky vnitřní soudružnosti media a působení elektrického pole na kationty difúzní vrstvy začne celý objem kapiláry pohybovat směrem ke katodě, což je
elektroosmotický tok (EOF). Díky velikosti toku mohou putovat ke katodě i anionty. Neutrální částice se pohybují rychlostí elektroosmotického toku, nabité částice (kationty) rychleji nebo pomaleji
(anionty)
v
závislosti
na
pohyblivosti
elektroosmotického
toku.
Vztah
pro pohyblivost elektroosmotického toku je definován:
veof = µ eof ⋅ E kde µ eof je pohyblivost eloktroosmotického toku, což je konstanta úměrnosti mezi rychlostí elektroosmotického
toku
veof
a
intenzitou
8
elektrického
pole
E.
Pohyblivost
elektroosmotického toku je přímo úměrná dielektrické konstantě prostředí ε a zéta potenciálu
ς , který vzniká mezi Helmholtzovou a Gouy-Chapmanovou částí elektrické dvojvrstvy a naopak nepřímo úměrná viskozitě kapaliny:
µ eof =
ες 4πη
Zéta potenciál, a tedy i celá pohyblivost, jsou ovlivněny elektrostatickými vlastnostmi materiálu kapiláry. Právě díky tzv. Sternovu modelu EOF způsobuje pístový profil toku kapaliny v celém průřezu kapilárou (Obr. 2), který je předpokladem vysoký separační účinnosti CE.
Obr. 2 Toky kapaliny v kapiláře bez EOF a s EOF
Celkově elektroosmotický tok můžeme ovlivnit třeba vhodnou volbou iontové síly, jejíž zvýšení způsobuje kolaps elektrické dvojvrstvy nebo může být potlačován modifikací vnitřního
povrchu
kapiláry,
který
omezuje
ionizaci
silanolových
skupin,
např. polyakrylamidem nebo methlylcelulosou. 2, 16
1.2 Zdánlivá pohyblivost V přítomnosti elektroosmotického toku se měřená pohyblivost nazývá zdánlivá pohyblivost. Zdánlivá pohyblivost iontu µ app je součtem pohyblivosti elektroosmotického toku µ eof a elektroforetické pohyblivosti µ ep :
µ app = µ eof + µ ep Ve stejném poměru jako u rychlosti elektroosmotického toku platí i vztah zdánlivé rychlosti iontu s intenzitou elektrického pole.
v app = µ app ⋅ E Přesnou pohyblivost µ a
můžeme získat z nezávislého měření elektroosmózy
s použitím neutrálních markerů, které se pohybují stejnou jak elektroosmotický tok.
9
µ a = µ e + µ eof Částice jsou separovány v závislosti na rozdílných zdánlivých pohyblivostech. Při zapojení dle Obr. 1 se kationty pohybují před elektroosmotickým tokem a platí:
µ app > µ ep Naopak při elektroforéze aniontů, které se pohybují až za elektroosmotickým tokem, platí přesný opak, protože µ eof má na rozdíl od kationtů záporné znaménko. Při hodnotách pH > 3 je elektroosmóza mnohem vyšší než elektroforetická pohyblivost iontů a díky tomu se i aniony pohybují k bodu detekce, který je zpravidla poblíž stejně nabité katody. Při elektroforéze za použití nižšího pH je elektroosmotický tok slabší a v případě, že chceme separovat aninonty, je vhodné změnit polaritu vysokého napětí. 2
1.3 Jouleovo teplo Hlavní výhodou kapilár v elektroforéze je, že jejich úzký průřez redukuje teplo, které vzniká v důsledku odporu kladeného roztokem při průchodu elektrického proudu. Takové teplo se nazývá Jouleovo teplo. H = U ⋅ I ⋅t
Jouleovo teplo H je přímo úměrné vloženému napětí elektrod U , elektrickému proudu I a času průchodu t . V systému se musí zajistit, aby bylo teplo dostatečně odváděno, jinak dojde ke vzniku gradientů hustoty a teploty. Ve středu kapiláry je totiž větší teplo než v okrajový částích, takže soluty uprostřed kapiláry mohou rychleji migrovat a to způsobuje rozšíření jednotlivých zón analytu, čili snížení účinnosti separace. 1, 2
10
1.4 Kapilára Podstatnou částí kapilární elektroforézy je kapilára. Kapilára s ideálními parametry má být chemicky a fyzikálně inertní, propustná pro světlo UV-VIS spektra, pružná a zároveň pevná a v neposlední řadě také cenově dostupná. V dnešní době je nejčastěji využívána kapilára z taveného křemene, ačkoli se lze setkat i s kapilárami z teflonu nebo borosilikátového skla. Právě díky dobré optické propustnosti v širokém rozmezí vlnových délek a jednoduché produkce kapilár i s několika mikrometrovým průměrem je tavený křemen velmi často používaný. Běžně se provádí separace v kapilárách o délce 25-100 cm, vnitřním průměru 25-75 µm a vnějším průměru 350-400 µm. Pružnost a zároveň mechanickou ochranu kapiláry většinou zajišťuje film polymeru, kterým je potažena vnější stěna, obvykle se používá polyamid.1, 2
1.5 Dávkování vzorku V kapilární elektroforéze je zapotřebí jen nepatrné množství vzorku. Objem vzorku v kapiláře má být zhruba do 1%, což odpovídá několika milimetrům injekční délky, zpravidla 1-50 nl, samozřejmě v závislosti na délce a vnitřním průměru kapiláry. Mezi nejběžněji využívané způsoby dávkování se řadí hydrodynamické
a
elektrokinetické: U hydrodynamického dávkování dochází k nanesení vzorku do kapiláry v důsledku rozdílů tlaků na jednotlivých stranách kapiláry. V praxi se provádí nejčastěji pomocí čerpadla nebo nastavením rozdílných výšek jednotlivých částí kapiláry. Množství naneseného vzorku se počítá dle Poiseuillovy rovnice:
∆Pπd 4 t Q= ⋅c 128ηLt Nadávkované množství analytu Q je přímo úměrné rozdílu tlaků ∆P na konci kapiláry, 4. mocnině vnitřního průměru kapiláry d , času dávkování t a molární koncentraci analytu c , naopak nepřímo úměrné viskozitě vzorku η a celkové délce kapiláry Lt .
11
Elektrokinetické dávkování využívá zdánlivých pohyblivostí jednotlivých analytů ve vzorku. Provádí se jednoduše, zařazením vialky se vzorkem do elektrického obvodu na určitou dobu.
Množství analytu se stanoví rovnicí: Q = v app ⋅
kb ⋅ tπr 2 C ks
kde látkové množství Q je přímo úměrné zdánlivé pohyblivosti analytu vapp , poměru vodivostí pufru a vzorku k b k s , času injektace vzorku t , vnitřnímu poloměru kapiláry r a látkové koncentraci vzorku C . Při elektrokinetickém dávkování je potřeba vzít v úvahu závislost nadávkovaného analytu
na
jeho
pohyblivosti,
protože
tento
faktor
diskriminuje
ionty
s malou
elektroforetickou pohyblivostí. Problém nastává při kvantitativní analýze, protože se do kolony nedostane reprezentativní část vzorku. Nicméně i přesto nachází elektrokinetické dávkování uplatnění a to zejména u metod, ve kterých je použit medium jako gel, jehož vysoká viskozita brání hydrodynamickému dávkování. 3
12
1.6 Laserem indukovaná fluorescenční (LIF) detekce Typů detekcí v kapilární elektroforéze je celá řada. Mezi nejpoužívanější patří UV-VIS detekce, která využívá absorpci záření daného analytu. Pro CE jsou také typické amperometrická, vodivostní, MS detekce a LIF detekce. Pro fluorescenční detekci potřebujeme budící zdroj (laser, lampa) o definovaných parametrech elektromagnetického záření (vlnová délka, intenzita). Fluorescenční detekcí lze přímo detekovat pouze analyty, které fluoreskují nebo které jsou příslušnými činidly derivatizovány (např. GFP, žlutý fluorescenční protein (YFP)). Díky LIF detekci můžeme posunout limit detekce v některých případech až na jednu molekulu. U fluorescence lze nižšího limitu detekce (LOD) dosáhnout především díky tomu, že u fluorescence je měřen signál v rozdílu nulové emise, na rozdíl od relativně nepatrných změn intenzity světla po průchodu prostředím. Z hlediska proveditelnosti detekce je efektivnější nativní než derivatizační fluorescence. Při detekci s derivatizací dochází k reakci dané látky s činidlem, při které se mohou tvořit vedlejší produkty s velice podobnými vlastnostmi, což může mít za následek zkreslení kvalitativních a kvantitativních výsledků. 8, 11
1.7 Budící zdroje pro LIF detekci Ke fluorescenční detekci je zapotřebí budícího zdroje, který dodá analytu energii potřebnou pro jeho excitaci. Mezi využívané zdroje energie patří výbojky, lampy a lasery. Obrovská výhoda u laserů jsou jejich směrové vlastnosti a schopnost vydávat záření o jedné vlnové délce. Velice oblíbené jsou laserové diody, jsou cenově dostupné a vyznačují se přijatelnou životností. Mezi často využívané se řadí Ar+ 488 nm, Ar+ 514 nm, He-Ne 543 nm a He-Ne 632 nm. 18,19
Využití LD 405 nm ve fluorescenční detekci Laserová dioda emitující při 405 nm (LD 405 nm) není často používaný a proto byl vybrán jako zdroj, u kterého bude studována fluorescence GFP a fúzního proteinu AHP5-GFP. Není nám známo použití LD 405 nm pro LIF detekci GFP.
13
Mezi prvními aplikacemi LD 405 nm byla analýza aminokyselin značených naftalen-2,3,-dikarboxaldehydem. V minulosti byl zdroj záření LD pro excitaci látek při vlnové délce záření 405 nm použit při detekci DNA sekvencí značených akridinovýmy barvivy
nebo
při
fluorimtetrickém
stanovení
europiem(III)-tetracyklinem. 9, 10
14
aktivity
katalasy
značené
2. Fluorescence Fluorescence patří mezi druhy luminiscence, přesněji fotoluminiscence. První zmínka o luminiscenci pochází z 16. století od španělského botanika Monardese, který se zabýval použitím rostlin v medicíně. Zmínka byla v namodralé opalescenci vody, ve které bylo vyvařeno dřevo, pravděpodobně ze stromu Eynsemhardtia polystachia, fluorescenci pravděpodobně způsobovala směs derivátů glucosylhydroxichalconu.20 Fotoluminiscence vzniká v případě, že daná látka nejprve absorbuje energii v podobě elektromagnetického záření a její atomy nebo molekuly přejdou na vyšší kvantové elektronové hladiny. Získanou energii pak daná látka vyloučí a dochází k luminiscenci. Luminiscence lze též definovat jako přebytek záření nad tepelným vyzařováním tělesa v tom případě, má-li toto přebytečné záření konečnou dobu trvání, jež podstatně převyšuje periodu světelných kmitů. Fotoluminiscenci můžeme rozdělit na fluorescenci a fosforescenci. Nastane-li emise záření z excitovaného elektronového stavu jedním či více spontánními energetickými přechody jedná se o fluorescenci. Fluorescence je sekundární záření, které vydává látka po absorpci záření od fosforescence se liší dobou, po kterou trvá sekundární záření, když přestalo působit záření primární, tato doba bývá u fluorescence 10-8 s až 10-5 s, u fosforescence 10-2 s až několik dní.8, 11
15
Obr. 3 Jablunkovského diagram 4
Schéma na obr.3 ukazuje zářivé přechody a nezářivé přechody mezi elektronově vibračními stavy molekuly. Absorpcí elektromagnetického záření se excitují molekuly ze základního singletového stavu do vibračních hladin singletových stavů S1, S2 … či triplexových stavů T1,… Získanou energii excitovaná molekula emituje jako fluorescenci nebo fosforescenci. Nabytou energii lze vyzářit i jinými způsoby, jako je třeba přeměna na vibrační energii. V analýze se nejvíce využívá fluorescence, popř. fosforescence. U anorganických sloučenin se s fluorescencí setkáváme poměrně zřídka (např. u solí vzácných zemin, uranylu, thalia). Organické látky vykazují fluorescenci daleko častěji, přičemž nejintenzivnější a analyticky nejvíce využitelná je fluorescence sloučenin, které obsahují aromatické cykly. Podle zbarvení můžeme v molekulové fluorescenční analýze usuzovat na přítomnost dokazované látky (kvalitativní analýza), podle intenzity záření na její množství (kvantitativní analýza).8 16
2.1 Charakteristiky fluorescence Mezi hlavní charakteristiky fluorescence patří:
Kvantový výtěžek fluorescence - přímo úměrný počtu světelných kvant vyzářených
N emitted a nepřímo úměrný počtu kvant absorbovaných N absorbed . Φ=
N emitted N absorbed
Nepřímo můžeme kvantový výtěžek definovat jako poměr pozorované střední doby dohasínání fluorescence
a vnitřní
doby života excitovaného stavu bez zhášecích
mechanismů.
Intenzita fluorescence - počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou v závislosti na čase .
Spektrální složení – spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí
Polarizace - určuje směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny.
Doba dohasínání – je dána vnitřní dobou života excitovaného stavu, z něhož dochází k emisi. Doba intenzity fluorescence je definována podle rovnice:
I = I0 ⋅ e
−
t
τ
kde I je intenzita fluorescence v čase t, I 0 je intenzita fluorescence v čase t = 0 s, τ je doba života excitovaného stavu t a je čas; rychlostní konstanta fluorescence k F je převrácená hodnota doby života τ .
kF =
17
1
τ
Základní spektrální charakteristiky:
Excitační spektrum vyjadřuje závislost intenzity fluorescence (měřené při konstantní vlnové délce) na vlnové délce excitujícího záření. Pásy excitačního spektra by měly být shodné s pásy absorpčního spektra (závislost absorbance na vlnové délce), ve skutečnosti se však částečně liší: excitační spektrum obsahuje jen ty pásy absorpčního spektra, kde dochází k zářivé deexcitaci. Emisní spektrum je pak závislostí intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitujícího záření. Jestliže molekula vyzáří veškerou absorbovanou energii, má fluorescence stejnou vlnovou délku jako záření (tzv. rezonanční fluorescence). Většinou se však část absorbované energie spotřebuje při vibrační relaxaci ( ztráty vibrační energie, kdy molekula přechází nejprve do základního vibračního stavu, tzv. nezářivý přechod). Následně emitované záření má pak většinou vlnovou délku vyšší než je vlnová délka absorbovaného světla. Emisní spektrum molekuly bývá většinou zrcadlovým obrazem spektra absorpčního a lze je excitovat zářením kterékoliv vlnové délky ležící uvnitř absorpčního pásu. 8, 11, 17
2.2 Fluorofory Fluorofor je látka, která je schopna absorbovat elektromagnetické vlnění o určité vlnové délce a následně emitovat záření o vlnové délce, která je zpravidla delší než absorbovaná. V přírodě se vyskytuje nemalé množství fluoreskujících sloučenin. Intenzivní fluorescenci vykazují některé aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly) nazývané fluorofory. Typické fluorofory jsou např.akridinová oranž, fluorescein, chinin, rhodamin B, umbeliferon, antracén, terylén, kofaktory enzymů FMN, FAD, NAD a aromatické aminokyseliny tryptofan, fenylalanin a tyroxin. 8, 17
18
2.3 Fluorescence riboflavinu
9 8 7
I [a.u.]
6 5 4 3 2 1 0 300
350
400
λ [nm]
450
500
Obr. 6 Excitační spektrum riboflavinu
První maximum excitačního spektra je při 360 nm, druhé při 470 nm. Využitelnost riboflavinu ve fluorescenční detekci je díky jeho snadné dostupnosti v přijatelné čistotě. Riboflavin (pKa = 8) je využíván při pH ≤ 8 jako neutrální marker v CE, snadno indikuje EOF.
2.4 Fluorescence GFP Fluorescenční centrum v GFP je tvořeno cyklizovanou trojicí aminokyselin serin tyrosin-glycin (obr.4), které tvoří dohromady 4-(p-hydroxybenzylidene)-imidazolidin5-on. Sekvenci serin-tyrosin-glycin má i řada jiných proteinů, nicméně samotná sekvence ještě nezpůsobuje fluorescenci, tu způsobuje teprve až její cyklizace. Sekvence aminokyselin vykazuje dvě rezonanční struktury umístění záporného náboje a to buď na kyslíku hydroxyl skupiny v tyrosinu nebo na kyslíku v imidazolidinovém kruhu. 14
19
Obr. 4 Struktura aktivního fluorescenčního centra GFP 14
Obr. 5 Excitační a a emisní b spektrum GFP 14
Absorpční spektrum GFP (obr. 5) má dvě maxima. První maximum je při vlnové délce 395 nm, druhé, méně intenzivní při 475 nm. Důležitým faktorem, které ovlivňuje intenzitu fluorescence je pH prostředí. S narůstajícím pH se snižuje intenzita prvního maxima a zvyšuje se intenzita druhého maxima. Výhodou GFP je tvorba proteinů přímo ve sledovaném organismu, aniž bychom modifikovali jejich terciární nebo kvarterní strukturu. Díky tomu se v dnešní době GFP využívá ke značení proteinů. 14
20
II. Experimentální část
21
3. Popis kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí
3.1 Použité přístroje a chemikálie Přístrojové vybavení
pH-metr Pro přesné nastavení pH pufrů byl využit pH-metr ORION, model 720A se skleněnou elektrodou firmy Monokrystaly Turnov, Česká republika.
Sonikátor Pro efektivnější rozpouštění a pro rozmražení fuzního proteinu byl použit sonikátor od firmy NOTUS-POWERSONIC s.r.o., Vráble, Slovenská republika
Aparatura pro přípravu vody Destilovaná voda byla deionizována aparaturou od firmy Premier MFG’D Systems INC, Phoenix a následně dvakrát redestilována destilační aparaturou z taveného křemene od firmy Heraeus, Hanau, Německo 5
Chemikálie
Pufry a chemikálie pro přípravu pufrů: o chlorid sodný ( NaCl; Lachema Brno, Česká republika) o 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (C4H11NO3; Merci, s.r.o., Brno, Česká
republika), dále jen „Tris“ o boritan sodný ( Na2B4O7.10 H2O; Lachema Brno, Česká republika) o dihydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4.2 H2O; Lachema Brno, Česká republika) o kyselina chlorovodíková (HCl; Merci, s.r.o., Brno, Česká republika)
Standardy: o riboflavin (C17H20N4O6; Sigma Aldrich, Steinherin, Německo)
22
Vzorky: o B-komplex ( Zentiva, Praha, Česká republika) o GFP
Zeleně fluoreskující protein byl připraven ve School of biotechnology, Dublin City University, Dublin, Ireland o AHP5- GFP
Vzorek
AHP5
(Arabidopsis
histidinphophotransfer
protein)
proteinu
fúzovaného s GFP (green fluorescent protein) byl připraven v Laboratoři molekulární fyziologie rostlin na Ústavu experimentální biologie Masarykovy Univerzity v Brně. Nejdříve musel být připraven destinační vektor pro klonovaní AHP5 proteinu. K tomuto účelu posloužil komerčně dostupný vektor pET 161 DEST od firmy Invitrogen,USA, kde byla zaměněna pomocí restrikčních endonukleáz BstB I a Age I sekvence pro Lumio tag za sekvenci genu
pro GFP. Do takto připraveného vektoru
byl pomocí gateway technologie vnesen gen pro AHP5 protein. Přípravu konstruktu provedla RNDr. Eliška Nejedlá, CSc . Připravený konstrukt byl následně transformován do expresního kmene E. coli (BL21 Star (DE3) One Shot, Invitrogen, USA), který umožňuje regulovatelnou expresi genu AHP5-GFP.
Buňky s nadexprimovaným fúzním proteinem byly následně
lyzovány v nativním lyzačních pufrech a takto získaná solubilní frakce bakteriálních proteinů byla skladována při teplotě -80°C. Tato práce byla provedena Mgr. Radkou Fohlerovou. 19
3.2 Instrumentace CE-LIF
Na obr. 8 a 9 je uvedeno celkové uspořádání CE-LIF. K sestavení separační části CELIF byla použita nemodifikovaná kapilára z taveného křemene potažena polyamidovým filmem. Rozměry kapiláry byly: vnější průměr (o.d.) 375 µm, vnitřní průměr (i.d.) 50 µm, efektivní délku 30 cm (vzdálenost dávkovacího konce kapiláry až po bod detekce) a celková délku 38 cm. Oba konce kapiláry ústily do zásobních vialek s pufrem a platinovými elektrodami. Vialky byly stacionárně umístěny v plastovém a dřevěném držáku. Na injekční straně kapiláry byla umístěna anoda. Držák na vzorky byl umístěn 3 cm nad rovinou kapiláry.
23
Umístění zásobní vialky s pufem
kapilára
zdroj napětí
Obr. 8 Fotografie vzhledu přístroje CE-LIF
fotonásobič
štěrbina objektiv
kapilára
čočka
24
Obr. 9 Fotografie instrumentálního provedení CE-LIF
Zdroj vysokého napětí (obr. 8), sestavený ing. Pavlem Krásenským, poskytoval vstupní napětí v rozmezí 0-15 kV. Zdroj je vybaven digitálním ukazatelem napětí a proudu, maximální hodnota proudu je omezena na ~ 100 µA. Napětí ze zdroje bylo vedeno VN kabelem do dávkovacího rezervoáru (vialky) s pufrem. Druhý konec kapiláry byl uzemněn.
K excitaci molekul byla použita laserová dioda, model NDHV310APC od firmy NICHIA Corp., Tokushima, Japonsko. Nominální délka emitovaného záření je 405 nm, výkon byl nastaven na cca 20 mW, přičemž maximální výkon dosahuje 60 mW. Čočka S1-UV s fokální vzdáleností od firmy ESCO PRODUCTS, New Jersey, USA byla pod rovinnou detekčního bodu kapiláry. Objektiv (100x) byl zakoupen od firmy Edmund Optics, Karlsruhe, Německo K záchytu fluorescenčního záření vybuzeného LD sloužil fotonásobič, model R647-01 od firmy Hamamatsu, Iwata City, Japonsko. Fotonásobič byl vzdálen ~ 22 cm od místa vybuzení fluorescenčního záření. Signál z fotonásobiče byl převeden do osobního počítače, kde byl zaznamenáván v programu CELIF405 vytvořeném Dr. Preislerem v prostředí Labwiew na Ústavu chemie Masarykovy univerzity. Získaná data byla zpracována pomocí programu Excel, Microsoft, Remont, USA.
Při uvažování o konstrukci optické soustavy byla věnována velká pozornost výběru vhodného materiálu. V úvahu přicházejí materiály, které při buzení světla o vlnové délce 405 nm nefluoreskují. Většina součástek byla proto zhotovena z eloxovaného hliníku. Byl použit i černý papír, který je postačující na pohlcení viditelného záření.
25
Obr.7 Excitační (A) a emisní (B) spektra GFP;emisní spektrum LD (C); transmitační spektra jednotlivých filtrů(D,E) 14
K separaci fluorescenčního záření od rozptýleného záření diody byla použita také štěrbina o vnitřním průměru 1,5 mm umístěná ve vzdálenosti 1 cm před fotonásobičem. Štěrbina byla zhotovena z černého papíru. Na obr. 7 je znázorněno emisní spektrum LD a emisní a excitační spektrum LD a transmitní spektr filtrů, které byly vybrány s cílem pohltit rozptýlené záření LD a propustit co nejvíce fluorescence.
26
4. Experimenty CE-LIF
4.1 CE-LIF riboflavinu Pro správnou funkci kapilární elektroforéza s laserem indukovanou fluorescencí je třeba nastavit řadu parametrů (zaostření laseru, přesné umístění mřížky), které mohou ovlivnit citlivost analýzy. Z toho důvodu byly provedeny modelové experimenty s riboflavinem. Cíl experimentu byl nejprve vhodně naladit systém a dosáhnout limitu detekce v řádu 10-8 mol.l-1. Dalším cílem bylo kontrolní měření obsahu riboflavinu v tabletách B-komplexu od firmy Zentiva, a.s., Praha s účelem ověření reprodukovatelnosti měření. Na excitačním spektru (obr. 6) si můžeme všimnout, že přestože 405 nm riboflavin nemá excitační maximum, může být efektivně excitován
CE-LIF standardu
Standard riboflavinu byl ředěn před separací příslušným pufrem. Volba pufru je klíčová pro dosažení uspokojivé separace. Standard riboflavinu byl separován ve dvou pufrech. Jako první separační pufr byla zvolena směs 50 mmol. l-1 NaCl a 50 mmol.l-1 Tris při pH = 8, z důvodu pozdější využitelnosti u identifikaci proteinů. Napětí na kapiláře bylo 7,05 kV, elektrický proud se pohyboval v rozmezí 24-25 µA. Z elektroforegramů měřených v čase vyplývá, že v pufru NaCl-Tris je riboflavin nestabilní (obr.10).
fluorescence [a.u.]
7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0
100
200
300
400
500
t [s]
Obr. 10 Měření riboflavinu v pufru směsi 50 mmol. l-1 NaCl a 50 mmol.l-1 Tris při pH = 8; ∆tměření = 50 min 27
Pro zjištění LOD byl tento experiment dostačující, nicméně po zjištění reálného obsahu riboflavinu v tabletách bylo potřeba, aby byl riboflavin stabilní během analýzy, tj. alespoň v řádu hodin. Jako další prostředí byl zvolen fosfátový pufr 20 mmol.l-1 Na2HPO4. o pH = 7,0. V tomto prostředí už byl riboflavin v řádech hodin stabilní. Na obr. 11 je uveden elektroforegram vzorku riboflavinu.
600 fluorescence [a.u.]
550 500 450 400 350 300 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
t [s]
Obr. 11 Elektroforegram standardu riboflavinu; c= 8.10-7 mol.l-1
Stanovení limitu detekce riboflavinu
Úkolem experimentu bylo zjistit co nejmenší detekovatelnou koncentraci standardu riboflavinu. Měření bylo prováděno v prostředí fosfátového pufru. Nastavením vzdálenosti čočka-kapilára 12,5 mm, dále vzdálenosti 22,50 cm mezi kapilárou a fotonásobičem a 1,5 mm průřezu štěrbiny, byl zaznamenán signál standardu s koncentrací 8,09.10-8 mol.l-1 na obr. 12.
28
Obr. 12 Elektroforegram standardu riboflavinu; c = 8,09.10-8 mol.l-1.
Limit detekce je definován jako: c LOD =
3 ⋅σ k
kde σ je směrodatná odchylka šumu, k je hodnota směrnice, vypočtena jako poměr výšky píku ku koncentraci riboflavinu. c LOD =
3 ⋅ 7,14 = 5.83 ⋅ 10 −9 mol ⋅ l −1 9 3,69 ⋅ 10
Limit detekce riboflavinu ve fosfátovém prostředí byl stanoven na 5,8.10-9 mol.l-1.
CE-LIF B-komplexu
Do 250 ml odměrné baňky bylo kvantitativně převedeno 5 tablet B-komplexu. Po rozpuštění tablet byla směs vzorku sonikována po dobu 20 minut. Po sonikaci byly z odměrné baňky odebrány dva alikvotní podíly o objemu 1 ml, které byly centrifugovány rychlostí 3000 otáček.min-1 po dobu 5 minut. Po ukončení centrifugace bylo odebráno 0,5 ml supernatanu, který byl zředěn na koncentraci 10-7 mol.l-1 s patřičným pufrem. Dávkování vzorku B-komplexu bylo hydrodynamické, rozdíl výšek konců kapilár byl 3 cm, doba dávkování 30 s. Vzorek byl měřen třikrát, jednotlivé retenční časy tr1 = 300 s, tr2 =306 s a tr3 = 299 s, byly stejné nebo velmi blízko retenčnímu času standardu trs = 300 s, c =8.10-7 mol.l-1, na obr. 13. Integrováním ploch pod signálem bylo stanoveno 9,30 ± 0,12 mg pro pět tablet.
29
650 fluorescence [a.u.]
600 550 500 450 400 350 300 250 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
t [s]
Obr.13 Elektroforegram vzorku riboflavinu
Vyhodnocení signálů bylo provedeno metodou kalibrační křivky v intervalu koncentrací standardu riboflavin 10-6 mol.l-1 – 10-7 mol.l-1. Zentiva deklaruje na každou tabletu 2 mg riboflavinu. Metodou CE-LIF byl stanoven obsah riboflavinu v 1 tabletě 1,86 ± 0,12 mg.
30
4.2 CE LIF zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP) Výhodou kapilární elektroforézy v oblasti proteomiky je schopnost analyzovat proteiny v nativním stavu. Vzhledem k tomu, že nedochází k destrukci bílkoviny lze metodu použít také k separování směsí proteinů. Uvedené experimenty, jsou první experimenty za daných podmínek. Jedním z budoucích cílů je optimalizovat metodu CE LIF ke kontrolním analýzám modifikovaných proteinů. Proteiny jsou molekuly o velkých molekulových hmotnostech a dosažení jejich uspokojivé separace vyžaduje důkladnou optimalizaci řady faktorů (vhodná volba pH, pufru, vysycení pórů kapiláry proteinem apod.).
Stokrát naředěný vzorek byl dávkován z výšky 3 cm po dobu 30 s, zvolené napětí pro separaci bylo 7,05 kV a kapilárou protékal proud 27 µA. Vzorek byl analyzován v prostředí 50 mmol.l-1 NaCl s 50 mmol.l-1 TRIS o pH = 8. Ze signálů z obr. 14, které byli naměřeny ve dvou po sobě jdoucích dnech je vidět soustava tří signálů z dvojitými vrcholy. Reprodukovatelnost měření GFP ze dvou následujících dnů byla uspokojivá.
fluorescence [a.u.]
2500 2000 1500 1000 500 0 0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 t [s]
Obr. 14 Elektroforegramy GFP ze dvou následujících dnů
31
4.3 CE LIF AHP5-GFP
Hydrodynamické dávkování vzorku AHP5-GFP bylo po dobu 30 s z výšky 3 cm nad rovinou kapiláry. Analýza proteinu probíhala ve směsi 50 mmol.l-1 NaCl s 50 mmol.l-1 Tris o pH = 8. Elektrické napětí bylo nastaveno na 7,05 kV. Hodnota elektrického proudu nebyla konstantní, ale zvyšovala se s každým dalším měřením. Změnu proudu ukazuje tabulka na obr. 15.
pořadí měření
A [µA]
1.
35
2.
37
3.
39
4.
40
5.
41
6.
42
7.
43
Obr. 15 Tabulka hodnot elektrického proudu při jednotlivých měřeních
Bylo provedeno sedm experimentů. Z elektroforegramů na obr. 16 vyplývá nízká reprodukovatelnost
elektroforézy. Pravděpodobně
může
docházet
k sorbci
proteinu
na kapiláru, o čemž svědčí i nárůst proudu o 20%. Dodaný vzorek nebyl čistý, nejspíše obsahoval ještě vedlejší produkty. Úkolem experimentu genu AHP5-GFP, bude do budoucna zjistit efektivitu fosforylace fúzního proteinu.
32
Obr. 16 Elektroforegramy CE-LIF AHP5-GFP
33
III. Shrnutí výsledků Náplní této bakalářské práce bylo seznámení s metodou a instrumentací CE-LIF. V teoretické části práce byly shromážděny informace o použité metodě. Byly získány informace o faktorech ovlivňujících účinnost a průběh elektroforézy, o požadavcích vlastností látek pro využitelnost metody, o technických požadavcích realizace analýzy apod. formou literární rešerše. Experimentální část byla zaměřena na stanovení citlivosti metody, pomocí modelového analytu riboflavinu. Z experimentu byl zjištěn limit detekce riboflavinu c= 5,8.10-9 mol.l-1 ve fosfátovém prostředí pro identifikaci riboflavinu. Projevila se také degradace riboflavinu v prostředí 50 mmol. l-1 NaCl a 50 mmol.l-1 Tris při pH = 8 během hodin. Použití je proto nevhodné pro separaci riboflavinu. Z deklarovaného množství 2 mg v 1 tabletě B-komplexu od firmy Zentiva, Praha bylo stanoveno 1,86 ± 0,12 mg riboflavinu. U analýzy GFP bylo zjištěno 6 píků.
Měření bylo reprodukovatelné ve dvou
následujících dnech. Z elektroforegramů AHP5-GFP vyplývá nízká reprodukovatelnost. Cílem dalšího výzkumu do budoucna je optimalizovat a zajistit reprodukovatelnost metody CE LIF tak, aby byla vhodná pro stanovení míry fosforylace u proteinů.
34
IV. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. Yan Xu, The Chemical Educator 1, Sringer- Verlag New York,Inc. 1996 2. Heger D., High performance capillary electrophoresi, Agilent Technologies 5968-9963E, Waldbronn, Německo, 2003 3. Klouda P., Moderní analytické metody, SPN, Praha , 2003 4.Přikryl Jan, Bakalářská práce, Katedra analytické chemie přírodovědecké fakulty, Masarykova Univerzita v Brně, 2005 5. Ryvolová Markéta, Diplomová práce, Katedra analytické chemie přírodovědecké fakulty, Masarykova Univerzita v Brně, 2005 6. Havliš J., Sborník přednášek Separační metody B, Masarykova Univerzita v Brně, 2008 7. Glatz Z., Sborník přednášek Metody separace proteinů, Masarykova Univerzita v Brně, 2008 8. Černý J., Sborník přednášek Fluorescenční mikroskopie, Univerzita Karlova, Praha, 2006 9 Nevin A., Conelli D., Valentini G.,Analytical and bioanalytical chemistry 388, 1897-1905, 2007 10. Wu M., Lin Z., Wolfbeis O., Analytical biochemistry 320,129-135, 2003 11. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic Publishers, 1999 12. Seunghee Y., Kyoung-Youn H., Hui-Sun N., Le Viet N., Young S., Journal of Chromatography A, 1056, 237–242, 2004 13. Lei Z., Weiping W., Shumin W., Yang H., Zhi L., Zhide H., Analytica chimica acta 611, 212–219,2008 14. Tsien R, Analytical Revue Biochemistry 67, 509-540, 1998 15. Weber G., Analytical Biochemistry 338, 124-130, 2005 16. http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-001/hesla/modely_elektricke_dvojvrstvy.html 17. http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm 18. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html 19. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pet161gwcat_map.pdf 20. http://bart.chemi.muni.cz/courses/1a2.pdf
35
