MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
LISTERIÓZA V ČESKÉ REPUBLICE Bakalářská práce
Lucie Krištofová
Vedoucí práce: Mgr. Andrea Vávrová
Brno 2014
Bibliografický záznam Autor:
Lucie Krištofová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Listerióza v České republice
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie, směr Mikrobiologie a molekulární biotechnologie
Vedoucí práce:
Mgr. Andrea Vávrová
Akademický rok:
2013/2014
Počet stran:
65
Klíčová slova:
Listeria monocytogenes; listerióza; lysteriolysin O; protein ActA; listeriová meningitida; původce kontaminace potravin; listeriové epidemie; listerióza v České republice
Bibliographic Entry Author
Lucie Krištofová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental biology
Title of Thesis:
Listeriosis in the Czech Republic
Degree programme:
Experimental biology
Field of Study:
Special biology, specialization Microbiology and molecular biotechnology
Supervisor:
Mgr. Andrea Vávrová
Academic Year:
2013/2014
Number of Pages:
65
Keywords:
Listeria monocytogenes; listeriosis; lysteriolysin O; protein ActA; listerial menigitis; agent of food contaminations; listerial outbreaks; listeriosis in the Czech Republic
Abstrakt L. monocytogenes je odolná bakterie způsobující listeriózu. Toto onemocnění se liší ve své intenzitě poškození lidského organismu. Pro rizikové skupiny představuje smrtelné nebezpečí, pro zdravého jedince téměř žádné nebezpečí nepředstavuje a nemoc probíhá i bezpříznakově. Absence typických klinických projevů a dlouhá inkubační doba činí z této bakterie v klinické mikrobiologii velmi nebezpečného a významného patogena. V České republice se od roku 2006 diagnostikuje více případů listeriózy a zachycuje se více potravinových vzorků pozitivních na přítomnost L. monocytogenes. Práce se zaměřuje na popis klíčových mechanismů zapříčiňujících vysokou odolnost listerie, na symptomy infekce, rizikové skupiny obyvatelstva a na zmapování situace v České republice z pohledu epidemiologie a kontaminace potravin.
Abstract L. monocytogenes is a resistant bacteria causing listeriosis, which typically has different intensities of organism damage. This disease presents a mortal danger for highrisk groups of people. However, there is almost no risk for healthy peopleas the disease can occur with no symptoms. The absence of typical clinical manifestations and the long incubation period make this bacteriaa very dangerous and important pathogen in clinical microbiology. In the Czech Republic, since 2006, more cases of listeriosis have been observed and more positive food samples for L. monocytogenes have been detected. This thesis focuses on the description of the key mechanisms allowing listeria to be highly resistant, the expression of possible symptoms and clinical manifestations (including the definition of high-risk groups) and on the current situation in the Czech Republic, in terms of epidemiology and food contamination.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucí mé bakalářské práce, Mgr. Andree Vávrové, za poskytnutí praktických informací při hledání a používání literárních a webových zdrojů, za zodpovězení mých početných dotazů, za podporu při průběhu psaní mé bakalářské práce, za věnovaný čas při schůzkách a při dohledávání dalších informací, za neuhasínající motivaci a na závěr za důležité a cenné poznatky a návrhy pro doplnění a zdokonalení bakalářské práce v průběhu celého akademického roku.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně a v seznamu literatury jsem uvedla všechny informační zdroje, ze kterých jsem při práci čerpala.
Brno 14. květen 2014
……………………………… Lucie Krištofová
Obsah
Seznam zkratek……………………………………………………………………………..3 1. Úvod…………………………………………………………………………………....6 2. Cíl práce……………………………………………………………………...………..8 3. Charakteristika rodu…………………………………………………………………9 3.1 Taxonomické zařazení…………………………………………………………......9 3.2 Morfologie buněk a kolonií……………………………………………………......9 3.3 Růst a kultivace…………………………………………………………………...10 3.4 Buněčná stěna………………………………………………………………….....12 3.5 Bičík………………………………………………………………………………12 4. Listeria monocytogenes- původce listeriózy…………..…………………………….13 4.1 Charakteristika bakteriálního druhu Listeria monocytogenes................................13 4.2 Diferenciace od ostatních druhů rodu Listeria……………………………………13 4.3 Sérovary………………………………………………………………………......13 4.3.1
Genetická linie I obsahující sérovary 1/2b, 4b, 4a……………………......14
4.3.2
Genetická linie II obsahující sérovary 12/a a 1/2c……………………......15
4.4 Patogenita…………………………………………………………………………16 4.4.1
Zdroje a přenos infekce…………………………………………………...16
4.4.2
Průběh infekce………………………………………………………….....17
4.4.3
Rizikové skupiny obyvatelstva…………………………………………...17
4.4.4
Projevy infekce…………………………………………………………...17
4.4.5
Faktory virulence…………………………………………………………20
4.4.6
Popis infekce na buněčné úrovni………………………………………….24
4.5 Diagnóza……………………………………………………………………….....25 4.6 Léčba……………………………………………………………………………...26 4.6.1
Antibiotika………………………………………………………………...26
4.6.2
Délka léčby………………………………………………………………..27
4.7 Prevence…………………………………………………………………………..27 4.7.1
Nepřímá prevence………………………………………………………...27
4.7.2
Přímá prevence……………………………………………………………28
4.8 Metody záchytu a průkazu L. monocytogenes……………………………………29 1
4.8.1
Kultivační metody………………………………………………………...29
4.8.2
Metody založené na tvorbě protilátek…………………………………….30
4.8.3
Molekulární metody………………………………………………………30
4.8.4
Subtypizační metody……………………………………………………...30
4.8.5
Hmotnostní spektrometrie………………………………………………...31
5. Listerióza v ČR……………………………………………………………………....34 5.1 Normy pro výskyt listerie v potravinách…………………………………………34 5.2 Výskyt v potravinách……………………………………………………………..36 5.2.1
Obecný výskyt v potravinách……………………………………………..36
5.2.2
Konkrétní výrobky kontaminované L. monocytogenes od roku 2006……38
5.3 Epidemiologie…………………………………………………………………….41 5.3.1
Incidence………………………………………………………………….42
5.3.2
Mortalita…………………………………………………………………..43
5.3.3
Situace do roku 2006……………………………………………………...43
5.3.4
Situace v roce 2006, 2007………………………………………………...44
5.3.5
Situace po roce 2007……………………………………………………...46
6. Instituce a organizace s možností úpravy problematiky listeriózy……………….47 6.1 Evropská unie…………………………………………………………………….47 6.2 Česká republika…………………………………………………………………...47 6.2.1
Ministerstvo zdravotnictví………………………………………………..48
6.2.2
Ministerstvo zemědělství…………………………………………………49
6.2.3
Státní veterinární správa…………………………………………………..49
6.2.4
Státní veterinární ústavy…………………………………………………..50
6.2.5
Státní zemědělská a potravinářská inspekce……………………………...50
6.2.6
Krajské hygienické stanice………………………………………………..50
6.2.7
Státní zdravotní ústav……………………………………………………..51
7. Závěr………………………………………………………………............................52 8. Literatura…………………………………………………………………………….54 8.1 Seznam použité literatury………………………………………………………...54 8.2 Seznam internetových zdrojů……………………………………………………..62 8.3 Zdroje grafických příloh………………………………………………………….63 8.4 Zákony……………………………………………………………………………64 8.5 Knižní zdroje……………………………………………………………………...65
2
Seznam zkratek
16S rRNA- ribozomální RNA vyskytující se v malé podjednotce ribozomu ActA protein - Actin-assembly inducing protein (aktin-indukující protein) AFLP - Amplified fragment length polymorphism (amplifikovaný fragment polymorfismu) AFSSA - The Association for French Studies in Southern Africa (Asociace pro francouzské studie v Jižní Africe) AIDS - Acquired Immune Deficiency Syndrome (Syndrom získaného selhání imunity) ALOA agar - Agosti Ottaviani Listeria agar aw – aktivita vody BHI agar - Brain Heart Infusion agar CFU – colony forming unit (kolonie tvořící jednotka) CNS - Centrální nervový systém DNA - deoxyribonukleová kyselina ECDC - European Centre for Disease Prevention and Control (Evropské centrum pro prevenci a kontrolu onemocnění) EFSA - European Food Safety Authority (Evropský úřad pro bezpečnost potravin) ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (enzymová-imunoanalýza) ES - Evropské společenství GMP - Good manufacturing practices (Správná výrobní praxe) HACCP - Hazard Analysis and Critical Control Points (Systém analýzy rizika a stanovení kritických kontrolních bodů) HeLa - buněčná linie lidských epiteliálních buněk (Henrietty Lacksová) 3
IMS - Immunomagnetic separation (imunomagnetická separace) LLO - listeriolysin O LM - Listeria monocytogenes MALDI–TOF MS - Matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-flight Mass Spectrometry (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem) Mena protein – protein patřící do aktinových regulačních proteinů MHC – komplex - major histoncompatibility complex (hlavní histonkompatibilní komplex) MLEE - Multilocus enzyme electrophoresis (multilokusová enzymová elektroforéza) MLST - Multilocus sequence typing (multilokusová sekvenční typizace) MOX agar - Magnesium Oxalate agar (hořčíkovo - oxalátový agar) MVLST- Multi-virulence-locus sequence typing (multilokusová sekvenční typizace pro virulenční faktory) MZČR - Ministerstvo zdravotnictví České republiky MZE - Ministerstvo zemědělství NaCl – chlorid sodný OBL agar - Oxoid Novel Enrichment agar PCR - poly-chain reaction (polymerázová rekace) PFGE - Pulsed-field gel electrophoresis (gelová pulzní elektroforéza) PrfA - positive regulatory factor A (pozitivní regulační faktor A) RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed (Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva) RNA - riboxynukleová kyselina SVS - Státní veterinární správa SVÚ - Státní veterinární ústav SZPI - Státní zemědělská a potravinářská inspekce 4
SZÚ - Státní zdravotní ústav VASP protein - Vasodilator-stimulated phosphoprotein (vazodilastimulační fosfoprotein) WHO - World Health Organisation (Světová zdravotnická organizace)
5
1. Úvod Listeria monocytogenes je grampozitivní tyčinkovitá bakterie, nenáročná na kultivaci, schopná přežití při nízkých teplotách a růstu v prostředí s obsahem NaCl. Vyskytuje se téměř ve všech prostředích: zvířata (i jejich výkaly), odpadní voda, půda, kontaminované potraviny, v lidském organismu, a to jak u osob s onemocněním listeriózou, tak u přenašečů (cca 5% osob jsou bezpříznakovými přenašeči). Její příznaky jsou snadno zaměnitelné s příznaky chřipkovými, a proto často dochází k pozdnímu zahájení léčby, což může být život ohrožující. Větší pozornost by měla být věnována rizikovým skupinám obyvatelstva, u kterých infekce většinou postupuje do fáze meningitidy a často končí smrtí. Lékaři většinou výskyt listeriózy nepředpokládají, protože onemocnění není časté. Jeho mortalita již však zanedbatelná není, pohybuje se okolo 30%. Zahájení včasné léčby bývá většinou problematické, protože zatím neexistuje žádný specifický test na přítomnost L. monocytogenes, který by diagnostické laboratoře měly k dispozici. Diagnostika proto probíhá původními metodami a je zdlouhavá. V posledních letech se výskyt případů listeriózy zvýšil. I když Česká republika patří se svou incidencí tohoto onemocnění mezi státy s nižší četností záchytu, nejedná se o onemocnění, které by se mohlo opominout. Prevence spočívá pouze v dobře informované veřejnosti a dodržování správného skladování a úpravy potravin. Epidemiologická data jsou často špatně mapována, jelikož některé zdravotní instituce toto onemocnění nenahlásí, a mnohdy se ani nezjistí, že dotyčný pacient listeriózu prodělal. Výskyt v potravinách je hlídán dozorčími institucemi ČR. Kontrolují se jak místa provozoven, tak potraviny v průběhu výroby, při dovozu k prodejci a i na místě prodejce. I když výrobny a provozovny potravinové výroby jsou povinny kontrolovat své výrobky, i přesto se stává, že je L. monocytogenes schopna pomnožení v dané potravině a vyvolá infekci po požití. Proč se tak může stát, je přiblíženo dále v této práci. Listerióza je aktuální a nebezpečné onemocnění nejen pro rizikové skupiny obyvatelstva, ale i pro osoby jim blízké, které mohou včasným zajištěním lékařské pomoci přispět k úspěšnému vyléčení. Moje máma před Vánocemi v roce 2011 listeriózu prodělala, patřila mezi osoby oslabené stresem. K nakažení došlo po požití zrajícího sýru niva v česnekové polévce v hotelu Amos ve Fulneku. Lékaři na Interní ambulanci v Nemocnici Nový Jičín ji poslali domů s tím, že má chřipku a do rána se „uzdraví“. Toto 6
jejich opominutí mělo málem fatální následek a listerióza došla až do stádia meningitidy. Proto jsem se o toto onemocnění začala zajímat více. Vlastnosti a schopnosti L. monocytogenes ji dělají velmi úspěšným a špatně rozpoznatelným původcem onemocnění. Její narůstající perzistence a vysoká míra virulence nám tak znemožňují jak eliminaci z potravin, tak efektivní včasnou diagnostiku onemocnění.
7
2. Cíl práce Cílem bakalářské práce je přiblížit problematiku onemocnění listeriózou, uvést vlastnosti L. monocytogenes, které ji umožňují být úspěšným patogenem. Dále přiblížit epidemiologii tohoto onemocnění v České republice a zdůraznit některá relevatní porovnání se situací v ostatních státech. U epidemií budou uvedeny prokázané zdroje infekce a přiblíženy funkce státních orgánů a institucí České republiky, jež se zabývají kontaminací potravin a ochranou veřejného zdraví, a mohou tak účinně spravovat a minimalizovat výskyt tohoto onemocnění.
8
3. Charakteristika rodu 3.1 Taxonomické zařazení Rod Listeria byl poprvé popsán Pirie v roce 1940. Původně byl tento rod popsán jako monospecifický (zahrnující pouze Listeria monocytogenes), ale díky DNA - DNA hybridizaci
(Roccourt
et
al.,
1982)
došlo
k přerozdělení
zástupců
rodu
(Listeria monocytogenes sensu lato) do 6 druhů: Listeria monocytogenes (sensu stricto) (Murray et al., 1926), Listeria grayi (Errebo Larsen a Seeliger, 1966), Listeria innocua (Seeliger, 1981), Listeria seeligeri (Rocourt a Grimont, 1983), Listeria welshimeri (Rocourt a Grimont, 1983) a Listeria ivanovii (Seeliger et al., 1984). Na základě DNA složení a sekvenování genu pro 16S RNA (Collins et al., 1991) se ukázalo, že všechny druhy rodu tvoří homogenní skupinu. Nejvzdálenějším druhem (při porovnání fenotypových i genetických vlastností) je Listeria grayi. Nejbližší fylogenetickou skupinu rodu Listeria, na základě již zmiňovaného sekvenování genu pro 16S RNA (93% podobnost), tvoří rod Brochothrix. Kompletní sekvenace Listeria monocytogenes a Listeria innocua poukazuje na společný původ s Bacillus subtilis (Glaser et al., 2001). V posledních 4 letech byly popsány další 4 druhy: Listeria marthii (Graves et al., 2010), Listeria rocourtiae (Leclercq et al., 2010), Listeria weinhestephanensis (Lang Halter et al., 2013) a Listeria fleischmannii (Bertsch et al., 2013). Druh Listerie fleishmannii obsahuje ještě dva poddruhy: Listeria fleishmannii subs. fleishmannii (den Bakker et al., 2013) a Listeria fleishmannii subs. coloradonensis (den Bakker et al., 2013). Aktuální systém řadí rod Listeria do domény Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Bacillales, čeleď Listeriaceae.
3.2 Morfologie buněk a kolonií Buňky rodu Listeria jsou tvaru krátkých tyček o velikosti 0,4 - 0,5 x 1 - 2 μm. Tyčky mají tupý konec a vyskytují se samostatně nebo v krátkých řetízcích. Kokoidní buňky lze nalézt ve stěrech z tkání infikovaných Listeria monocytogenes, hovoří se poté o kokytyčkách, které jsou typickým obrazem pod mikroskopem po Gramově barvení. U tohoto druhu také můžeme zaznamenat tvorbu vláken (až 96 μm dlouhých) a to v případě velkého obsahu NaCl v kultivačním médiu, nebo při stáří kultury. Při kultivaci pod 30 °C 9
dochází k vytvoření peritrichálních bičíků, jejichž počet může kolísat od 2 až do 6. Rod Listeria patří mezi grampozitivní bakterie. Buňky tohoto rodu nejsou acidorezistentní a nevytváří kapsuly. Obrázek 1 ukazuje obraz buňky listerie v mikroskopu po Gramově barvení.
Obr. 1 Gramovo barvení, Listeria monocytogenes (zvětšeno 1500x); převzato z: Zpravodaj Centra MPI, 2007
Kolonie kultivované po dobu 24 – 48 hodin jsou kulaté s hladkým povrchem a neprodukují žádný pigment, jsou průsvitné. Kultury starší, obvykle kultivované 3 – 7 dní, jsou odlišné. Kolonie jsou na pohled větší, mají matný vzhled a mohou se vytvářet kolonie s drsným povrchem. Tvorba kyseliny máselné při kultivaci vytváří sladkou karamelovou až máslovou vůni.
3.3 Růst a kultivace Optimální teplota pro růst rodu Listeria se vyskytuje v rozmezí 30 – 37 °C, ačkoliv zpomalený růst může probíhat v rozsáhlejším rozpětí teplot (0 – 40 °C). L. monocytogenes je psychrofilní organismus. Roste ve velkém rozmezí pH od 5,5 do 9,6. Nejoptimálnější pH pro růst listerie je však neutrální až slabě zásadité. Všechny druhy dobře rostou na většině neselektivních médií. Slabý růst se projevuje na MacConkey agaru, zatímco intenzivní růst můžeme sledovat na žlučovém agaru (40% žluči). Listeria monocytogenes ve svém genomu obsahuje gen bsh, který kóduje enzym hydrolázu žlučových kyselin. Tento gen je regulován virulenčním faktorem PrfA a podle studie Dussurget et al. (2002) je jeho funkcí zachování životaschopnosti bakterií v průběhu listeriové infekce, kdy se bakterie vyskytují ve střevě a v játrech. 10
Nepatogenní druhy rodu Listeria gen bsh nemají. Vzhled kolonií na žlučovém agaru je znázorněn na Obrázku 2.
Obr. 2 Listeria monocytogenes na žlučovém agaru; převzato z: Zpravodaj centra MPI, 2007
Druhy Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii a Listeria seeligeri vykazují hemolytickou aktivitu na médiích obsahujících ovčí, koní, kraví, zaječí či lidskou krev. Prodloužené autoklávování média však tuto aktivitu snižuje (Sheikh-Zeinoddin et al., 2000). Obrázek 3 znázorňuje kolonie L. monocytogenes kultivované na krevním agaru.
Obr. 3 Listeria monocytogenes na krevním agaru (foto autorky)
11
Selektivní média pro rod Listeria jsou PALCAM agar a Oxford agar. Výsledkem hydrolýzy eskulinu na Oxford agaru kolonie tvoří kolem sebe černou zónu. Na PALCAM agaru mají všechny druhy tmavě červené pozadí. Firma HiMedia vyrábí chromogenní médium HiChrome Listeria Agar Base Modified, které se využívá na záchyt listerie v potravinách.
3.4 Buněčná stěna Buněčná stěna je grampozitivního typu. Meso-diaminopimelová kyselina, kyselina glutamová a D-alanin jsou součástí peptidoglykanu (Fiedler et al., 1984). Listerie neobsahují ve své buněčné stěně arabinózu ani mykolové kyseliny. Hlavní menachinon, vit. K2, je typu MK-7, což znamená, že obsahuje 7 izoprenových jednotek. V buněčné stěně všech druhů je většina mastných kyselin nasycených. Podle podmínek růstu se mění složení mastných kyselin, a to jednoduše z iso na anteiso formy. Tato změna složení je důležitá pro zachování růstu při nižších teplotách, kdy hlavním účelem je udržování fluidity buněčné membrány (Annous et al., 1997). Flexibilita buněčné membrány je důležitým faktorem při infekci. Dalším důležitým faktorem při infekci je skutečnost, že buněčná stěna obsahuje klíčové struktury virulence na svém povrchu, nebo jsou přes její povrch tyto prvky transportovány. Ribitolové a lipo-teichové kyseliny jsou součástí buněčné stěny Listeria monocytogenes. Na základě rozdílů těchto kyselin se potom rozlišují sérotypy tohoto druhu (Wendlinger et al., 1996; Fiedler et al., 1984).
3.5 Bičík Bičík listerie nejen činí pohyblivými, ale také jim umožňuje přichytit se k okolnímu povrchu. Tvorbu bičíku kóduje gen flaA, jehož transkripce je zastavována při teplotě růstu 37 °C (Dons et al., 1992). Toto potlačení je velmi důležité pro plnou virulenci patogenních druhů. Největší pohyblivost poté můžeme sledovat od 20 – 30 °C, nejlépe v polotuhém médiu ve zkumavce, kde je pohyb viditelný v „deštníkovém“ nárustu listerií.
12
4. Listeria monocytogenes - původce listeriózy 4.1 Charakteristika bakteriálního druhu Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes je bakteriální patogen ovcí, koz a člověka. Vysoká odolnost této bakterie zapříčinila její výskyt jak v prostředí (voda, půda, bláto, kal, rostliny) tak i v zažívacím traktu zvířat a člověka (5% bezpříznakových nosičů). Je to intracelulární parazit, který se díky svým faktorům virulence dokáže úspěšně šířit v těle hostitele, aniž by imunitní systém hostitele rozeznal přítomnost cizorodých bakteriálních částic. Listeria monocytogenes ve svém genomu obsahuje plazmidovou DNA. Rezistence ke kadmiu (Lebrun et al., 1994) chloramfenikolu, erytromycinu, streptomycinu a tetracyklinu (Charpentier a Courvalin, 1999; Threlfall et al., 1998; Hadorn et al., 1993; MacGowan, 1990; Poyart-Salmeron et al., 1990; Quentin et al., 1990) je součást plazmidové DNA. Plazmidovou DNA dokáže L. monocytogenes předat horizontálním přenosem jak jiným druhům tohoto rodu, tak i druhům odlišných bakteriálních rodů, jako je například Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae a Bacillus subtilis (Charpentier a Courvalin, 1999; Vicente et al., 1988; Flamm et al., 1984; Pérez-Díaz et al., 1982). Její virulenci podporují transpozony Tn1545, Tn916 a Tn917 (Vázquez-Boland et al., 2001).
4.2 Diferenciace od ostatních druhů rodu Listeria Morfologií buněk ani kolonií nejsou jednotlivé druhy rodu Listeria odlišitelné. L. monocytogenes však můžeme odlišit pomocí použití selektivních médií, kde je přídavek lipázy a β–D-glukosidázy (Vlaemynck et al., 2000). β–D-glukosidáza zvyšuje hemolytickou aktivitu, která se z normální úzké zóny bez znatelného okraje mění na širší zónu, kde je okraj patrnější. V rámci rodu Listeria pouze L. monocytogenes snáší 20% NaCl v kultivačním mediu.
4.3 Sérovary U L. monocytogenes rozlišujeme 4 rozdílné genetické linie, které byly prokázány mezi izoláty. Serotypizace byla první metoda, která se snažila dokázat subtypizační skupiny uvnitř tohoto druhu. Serotypizace byla provedena Patersonem v roce 1940. 13
Později byla provedena znovu a bylo potvrzeno, že L. monocytogenes obsahuje 13 sérovarů (Seeliger, 1958). Sérovary se dělí na základě tělových O-antigenů a bičíkových H-antigenů. Rozdělení do prvních 2 genetických linií přišlo později (Piffaretti et al., 1989) pomocí multilokusové enzymové elektroforézy (MLEE), kdy sérovary 1/2b, 4b a 4a byly fylogeneticky odlišeny od sérovarů 1/2a a 1/2c. Podle studie Wiedmann et al. (1997) byla uznána třetí genetická linie na základě použití ribotypizace a částečné sekvence genu pro virulenční faktor actA. Poznatky studie Ward et al. (2008) navrhly čtvrtou genetickou linii, ta však obsahuje kmeny, které se vyskytují jen výjimečně. Jelikož izoláty z III. a IV. genetické linie nejsou příliš časté, ve výzkumu a studiích se většinou pracuje pouze s I. a s II. genetickou linií. Genetická linie III. a IV. vykazuje nízkou patogenitu, byly však vyizolovány z veterinárního materiálu, proto se poukazuje na možnou schopnost těchto dvou linií infikovat savce, kteří nepatří mezi fylogenetickou větev primátů. 4.3.1
Genetická linie I obsahující sérovary 1/2b, 4b, 4a
Genetická linie I vykazuje větší patogenitu než genetická linie II. Sérovar 4b je příčinou většiny infekcí listeriózy. Sérovary listerií jsou však charakteristické pro určitou lokalitu - v USA bylo více infekcí zapříčiněných sérovary I. genetické linie (Jeffers et al., 2001) naopak infekce způsobené II. genetickou linií byly u pacientů z Finska (Lukinmaa et al., 2003) a ze Švédska (Parihar et al., 2008). Izoláty sérovaru 1/2b v Anglii pocházely od pacientů, kteří prodělali listeriózu vzhledem ke své oslabené imunitě, a žádná z pacientek nebyla gravidní. Pro těhotné pacientky byl příčinou listeriózy sérovar 4b (McLauchlin et al., 1997). Izolace z fekálního materiálu zvířat nepoukázala na větší přítomnost genetické linie I nad genetickou linií II, avšak sérovar 4b převládal v materiálu divokých zvířat (Zaytseva et al., 2007). Izolace z prostředí také korespondovala s výskytem různých sérovarů. Sérovary 1/2b a 4b byly hlavní součástí izolátů z neobdělávaných polí, obilných polí, luk, pastvin a lesů v Německu (Weis a Seeliger, 1975). Z potravin se izoluje nepatrné množství této genetické linie. I když skoro všechny infekce jsou způsobeny touto genetickou linii, většina izolátů z potravin patří do II. genetické linie. Lze proto předpokládat, že virulence I. genetické linie je o mnoho větší než virulence II. genetické linie. Buncic et al. (2001) zjistil, že sérovar 4b je více odolný proti stresovým podmínkám. Vyskytuje se v potravinách, které jsou uskladněny v ledničce a poté tepelně 14
upraveny. Lag fáze při růstu tohoto sérovaru je kratší než u sérovaru 1/2a při teplotě 37 °C. Tento poznatek dokazuje, že se sérovar 4b rychleji adaptuje na teplotu lidského těla při vstupu do organismu a je v něm schopen intenzivnějšího a rychlejšího růstu.
4.3.2
Genetická linie II obsahující sérovary 1/2a a 1/2c
Pouze málo infekcí bylo způsobených touto linií. Pokud byla tato linie identifikována jako původce, převládal sérovar 1/2a (Hong et al., 2007; Gianfranceschi et al., 2003; Aureli et al., 2000). Obecně většina kmenů izolovaných z potravin patří mezi sérovary II. genetické linie. Spekuluje se, že tato schopnost II. genetické linie je podmíněna jejímu lepšímu přizpůsobení se životu na rostlinách a v potravinách. Podle autorů Buncic et al. (2001) tato genetická linie vykazuje také větší rezistenci k bakteriocinům, což ji umožňuje lepší adaptaci k životu v prostředí, kde se tyto látky vyskytují. V prostředí tato linie zaujímá větší počet izolátů z vody v zimě, zvláště sérovar 1/2a. Na jaře a v létě je tomu naopak - sérovar 4b ve vodním prostředí převažuje, jak bylo dokázáno při výzkumu z jezera Geneva ve Švýcarsku. Tyto poznatky poukazují na to, že více virulentní sérovary preferují teploty bližší teplotnímu prostředí živého organismu, kdežto méně virulentní snášejí i teploty nižší (Schaffter et al., 2004). V Tabulce 1 je shrnuto porovnání vlastností sérovarů. Tabulka 1. Porovnání sérovarů L. monocytogenes Sérovar Patogenita Nejčastější výskyt infekce Charakter pacientů Izolace z potravin Izolace z prostředí Stresová odolnost
1/2b
Genetická linie I 4b vysoká
4a
Finsko, Švédsko
USA Anglieoslabená imunita
těhotné ženy
beze vztahu k typu pacienta
malé množství bakterií» velká virulence této linie Německo- pole, louky, pastviny, lesy -
nejvyšší
Genetická linie II 1/2a 1/2c nízká (většinou 1/2a)
velké množství bakterií - odolnost proti bakteriocinům
-
voda -
-
15
4.4 Patogenita 4.4.1
Zdroje a přenos infekce
Vystopovat zdroj infekce bývá těžké u sporadických případů listeriózy, úspěšnější situace nastává při epidemiích, ale ne vždy je zdroj nalezen. Nejčastějším zdrojem infekce, jsou potraviny kontaminované L. monocytogenes, kde dojde k jejímu pomnožení. K pomnožení může dojít primární cestou, kdy jsou potraviny špatně skladovány, např. dlouho vystaveny teplotnímu optimu této bakterie, kdy dochází k růstu a množení nad hodnotu infekční dávky. Dalším zdrojem infekce je poté kontaminace potravin vzniklá přímo
při
jejich
produkci
z výrobního
procesu
v potravinářských
závodech.
L. monocytogenes se vyskytuje v zelenině, mléku, rybách, drůbeži, hovězím mase, zrajících sýrech, vajíčkách, paštikách. Při požití kontaminované potraviny může nastat primární infekce. Sekundární infekce nastává, pokud dojde k nesprávnému tepelnému upravení chlazeného jídla. L. monocytogenes je schopna růstu při 4 °C, správná tepelná úprava a následné skladování tepelně upraveného jídla je proto jako prevence sekundární infekce velmi důležitá. Cesta vstupu do organismu je většinou přes sliznici trávicí soustavy, může se ale jednat i o vstup přes urogenitální trakt či spojivku. Dalším možným vstupem je poraněná kůže (nastává u specifických povolání - např. řezník). Další zdroj infekce (pro hospodářská zvířata) mohou být rostliny, na nichž L. monocytogenes roste. Jelikož listerióza nemá typické příznaky, nemoc bývá někdy nepostřehnuta a infekce často postupuje až do masa hospodářských zvířat. Fekálie infikovaných zvířat poté slouží jako přenos infekce a to prostřednictvím hnojení zeleniny těmito fekáliemi. Byly zaznamenány pouze dva typy mezilidského přenosu infekce. Prvním z nich je přenos infekce z matky na plod přes placentu. Druhým je možná nákaza přes nemocniční personál, pokud tento personál přichází do styku s infikovanými tekutinami (krev, plodová voda) či orgány. Často se jedná o přenos infekce po porodu, kdy porodní sestry manipulují s novorozencem (zdroj infekce ale může být i samotná porodní místnost, která není poté adekvátně sterilizována) (Farber et al., 1991b). V nemocnici je také možný vznik nozokomiálních nákaz touto bakterií.
16
4.4.2
Průběh infekce
Při nákaze potravinami bakterie v tenkém střevě proniká přes Peyerovy plaky a hromadí se v lymfatických uzlinách ve formě volných buněk nebo v makrofázích (Pron et al., 1998; Rácz et al., 1972, 1970). Odtud poté vniká do krevního řečiště. Druhou možnou cestou poskytující vstup do krve je přímá infekce epiteliálních buněk tenkého střeva. Jakmile je listerie přítomná v krevním řečišti, může napadnout téměř jakýkoliv orgán a rozvinout tak lokální infekci. Nejčastěji však napadá játra a slezinu. Na těchto místech dochází k fagocytóze volných bakterií makrofágy. Infekce makrofágů vede k uvolnění látek, které mají za následek nahromadění neutrofilů v místech infekce a účinné zabití hostitelských infikovaných buněk. To je rozhodujícím momentem infekce, protože je-li imunita hostitele dostatečná, k dalšímu šíření infekce nedochází a nákaza je v těle spolehlivě odstraněna (Mielke et al., 1997). Pokud je však imunita oslabena, listerie má vysokou naději pro průnik do epitelu placenty nebo do nervových buněk CNS vzhledem k vysoké afinitě k těmto buňkám.
4.4.3
Rizikové skupiny obyvatelstva
Infekce L. monocytogenes u většiny zdravých osob probíhá bez příznaků, nebo s lehkou gastroenteritidou (neinvazivní forma). Tyto osoby většinou nepotřebují odbornou pomoc, infekce za pár dnů bez následků odezní. Problém však přichází, pokud se nejedná o zcela zdravého člověka. Výskyt listeriózy postihuje především rizikové skupiny. Patří mezi ně osoby se sníženou imunitou (ať již kvůli stresu nebo vzhledem k jinému onemocnění), novorozenci, těhotné ženy, osoby ve vysokém věku (nad 60 let) a onkologičtí pacienti. Infekce se méně často vyskytují také u příjemců transplantačních orgánů nebo u pacientů, jež přijímají kortikosteroidní terapii. 4.4.4
Projevy infekce
Projevy infekce způsobené L. monocytogenes jsou dosti variabilní. Můžeme se setkat s bezpříznakovými případy až po vážné infekce, které ohrožují život pacienta. Infekční dávka byla testována na zdravých jedincích třídy Mammalia. Za množství přijatých bakterií orální cestou, které následně způsobí infekci, je považováno více než 109 buněk (Farber et al., 1991a). Přesná infekční dávka pro člověka ještě nebyla zjištěna a 17
vzhledem k diverzitě imunitní odpovědi to ani není možné. Inkubační doba se vyznačuje velkým rozpětím, a to od 11 až po 70 dní. Značně záleží na tom, jak hodně je tělo oslabeno. Infekce způsobené L. monocytogenes se dají dělit na: a) Infekce v těhotenství U těhotných žen infikovaných listerií je častý výskyt listeriové bakteriémie. Ta dále může vést k počátku hepatitidy, abscesů sleziny, pleuropulmonární infekci a cholecystitidy. Díky špatné detekci imunitním systémem na počátku infekce, se bakterie dostává až do placenty, kde dále může ohrozit plod. Mezi hlavní příznaky patří horečky, bolest kloubů a svalů, někdy také velké bolesti hlavy a zad v oblasti krční a hrudní páteře. Dosud nebylo zjištěno, proč je v době těhotenství v průběhu listeriové infekce pouze u výjimečných případů postižena CNS. Kvůli snížené imunitě v třetím trimestru těhotných žen je toto onemocnění v tomto období nejčastější. Včasná diagnóza a následná správná léčba však zabraňuje předčasným porodům nebo potratům. U těhotných žen 22% listeriové infekce končí narozením mrtvého dítěte nebo okamžitou smrtí po narození novorozeněte (Gellin a Broome, 1989). Smrt novorozeněte většinou nastává do několika hodin po porodu. Tento stav se nazývá septická granulomatóza a je pro něj typické velké množství mikroabscesů a granulomů v játrech a slezině novorozeněte (Larsson a Linell, 1979; Visintine et al., 1977). b) Neonatální infekce Septická granulomatóza je nejčastěji získána přes nakaženou amniotickou tekutinu. Důkazy tohoto faktu vyplývají z největší naměřené koncentrace bakterií u novorozeňat postižených touto chorobou v plících a ve střevě (Becroft et al., 1971). Dalšími příznaky jsou papulární vyrážka a zánět spojivek. S výjimkou septické granulomatózy je častým druhým typem infekce u novorozeňat pozdní meningitida. Tento typ meningitidy se objevuje většinou po 2 týdnech od narození. Zdrojem infekce je většinou mikroorganismus přítomný ve vagině v průběhu porodu, nebo mikroorganismus přítomný v průběhu císařského řezu.
18
c) Infekce CNS - meningitida, rhombencefalitida Listeriová meningitida má nejvyšší procento úmrtnosti (22%) ze všech nejčastějších meningitid způsobených dalšími bakteriemi - Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Haemophilus influenzae. Zároveň je L. monocytogenes pátým nejčastějším původcem tohoto onemocnění. Když se zaměříme na meningitidu u novorozenců, L. monocytogenes zaujímá třetí místo nejčastějšího původce, u osob starších 50 let dokonce druhé. U pacientů s lymfomy, u pacientů přijímajících kortikosteroidní terapii a u příjemců orgánových transplantací je L. monocytogenes nejčastějším původcem bakteriální meningitidy (Hooper et al., 1982). Meningitida je nejlépe rozpoznatelnou listeriovou infekcí. Ironií je, že je často diagnostikována v pozdním stádiu a do té doby je většinou považována za chřipkové onemocnění. Oproti jiným původcům meningitidy uvedených výše, L. monocytogenes nenapadá jen mozkové blány, ale také samotný mozek (jedná se poté o encefalitidu, může dokonce dojít ke kombinaci obou nemocí - meningoencefalitida). Příznaky jsou ze začátku velmi podobné chřipkovému onemocnění, tzn. vysoké horečky, bolesti hlavy, zad a kloubů, zvracení. Hlavní příznak, že se nejedná o chřipku, je však neschopnost pacientů předklonit hlavu na svou hruď tak, aby se dotkli klíční kosti. Tato neschopnost pramení z postupně přibývající svalové ztuhlosti, která se šíří z krční páteře. Nemoc má velmi rychlý průběh. Zvracení se stává častějším, bolesti hlavy a neschopnost ovládat své tělo silnější. Mohou se také objevit náhlé záchvaty. Včasná diagnóza a nasazení správných antibiotik jsou nevyhnutelné pro vítězství nad touto infekcí, neboť nemoc často díky pozdnímu zahájení léčby končí ztrátou funkčnosti určité části mozku nebo smrtí. Málo častým a výjimečným případem listeriové encefalitidy je rhombencefalitida. Její výjimečnost tkví hlavně v jejím výskytu, který byl zatím pozorován jen u dospělých zdravých jedinců. Příznaky jsou stejné jako u meningitidy. Pacienti navíc trpí náhlým počátkem ztráty funkčnosti kraniálního nervu, hemiparézou či ztrátou funkčnosti smyslů. Úmrtí je ještě častější než u meningitidy a trvalé následky při překonání nemoci nejsou vzácností. K selhání plic dochází u 40% pacientů.
19
d) Endokarditida Endokarditida postihuje hlavně dospělé jedince. Pacienti s endokarditidou často trpí septickými komplikacemi. Slouží i jako indikátor onemocnění gastrointestinálního traktu, nevyjímaje rakovinu (Lorber, 1990). e) Lokalizované infekce Tento jediný typ infekce se vyskytuje s nejvíce podobnou četností jak u rizikových tak nerizikových skupin obyvatelstva. L. monocytogenes byla vyizolována jako součást vzorku z pacientů se záněty spojivek, infekcí kůže a se záněty lymfatických uzlin.
f) Gastroenteritida Gastroenteritida často předchází CNS infekci. Studie Riedo et al. (1994) prokázala, že po požití jídla kontaminovaného L. monocytogenes u zdravých osob dochází s největší pravděpodobností k vypuknutí febrilní gastroenteritidy, kdy se infekce nešíří dál do dalších orgánů těla a postupně sama odezní, aniž by bylo potřeba zahájit jakoukoliv léčbu. Jedná se o tzv. neinvazivní formu listeriózy. Mezi producenty biogenních aminů v rybách patří i listerie. Biogenní aminy přijaté tělem v nadměrném množství jsou toxické. Nejčastěji může nastat otrava histaminem nebo tyraminem. Biogenní aminy jsou také prekurzory karcinogenních N-nitroso sloučenin.
4.4.5
Faktory virulence
V následujících řádcích budou přiblíženy a popsány důležité vlastnosti listerie, které náleži faktorům virulence. Faktory virulence obecně pomáhají bakteriálním patogenům při zahájení a i při průběhu infekce. Faktory virulence L. monocytogenes jsou obzvláště důmyslní a úspěšní pomocníci při vstupu do hostitelské buňky, při pohybu v ní a při následném rozšíření do okolních buněk. Velmi důležité je, že jeden z nich skrývá listerii před imunitou hostitele a poskytuje jí čas pro rozšíření infekce.
20
a) PrfA PrfA je pozitivní regulační faktor. Jeho funkcí je regulace exprese genů pro virulenci. Je kódován genem prfA. Tento protein souvisí s 10 virulenčními geny (viz Tabulka 2) a se 145-ti dalšími geny. Je to nejdůležitější řídící mechanismus, jenž zodpovídá za celý proces infekce buňky. Ztráta funkce nebo mutace v tomto genu zapříčiňuje neschopnost bakterie uniknout z fagozomu, replikaci v cytosolu nebo adheze k cytoplazmatické membráně. Dále se ve své práci budu zabývat pouze klíčovými faktory virulence. Tabulka 2. Faktory virulence L. monocytogenes a jejich funkce, geny za ně zodpovídající (převzato z: Vera et al., 2013) Gen
Protein
Funkce
hly plcA plcB
Listeriolysin O Fosfatidyinositol fosfolipáza C Fosfatidylcholin fosfolipáza C
Lýze a únik z fagozomu
mpl
Prekurzor metaloproteázy
actA
ActA protein
hpt inlA inlB inlC inlJ
Protein pro transport fosfátové hexózy Internalin A Internalin B Internalin C Internalin J
Proces zpracování PL - PLC na její zralou formu Pohyb bakterie pomocí cytoskeletu hostitelské buňky Intracelulární růst
Účast při invazi do buňky
a) Internalin A a B Ze všech internalinů pomáhajících k proniknutí do buňky a zakomponování do fagozomu pocházejícího z cytoplazmatické membrány hostitele, jsou nejdůležitější internaliny A a B. L. monocytogenes napadá jak fagocytující tak nefagocytující buňky. Receptor pro povrchový protein internalin A je E-cadherin. Tento povrchový protein se účastní invaze do všech typů buněk, zatímco internalin B se účastní vstupu do hepatocytů. K buňce se připojuje pomocí tyrozinkinázového receptoru a přes PI3-kinázu zprostředkovává internalizaci (Cossart, 2001). 21
b) Listeriolysin O LLO je nejdůležitějším faktorem virulence, mnoho jeho funkcí však ještě zůstává neobjasněno. Tento protein patří do skupiny cholesterol-dependentních cytolyzinů. Jeho hlavní funkcí je umožnění listerii proniknout do hostitelské buňky a poté uniknout z fagozomu, aniž by došlo k jejímu usmrcení. Proč má LLO tuto schopnost, není ještě přesně vysvětleno, ale podle poznatků Villanueva et al. (1995) může být důvodem krátká životnost LLO v cytosolu hostitelské buňky. Studie dále poukazuje na to, že množství LLO v cytosolu je částečně kontrolováno samotnou hostitelskou buňkou. Při degradaci ho buňka ukládá do svého MHC komplexu. Další důvod je postaven na faktu optimálního rozsahu pH pro LLO. LLO je stabilní při kyselém pH (5 až 5,5), to znamená, že se může předpokládat jeho funkce (čili cytolytická aktivita) pouze při tomto pH, které je v tomto rozmezí pouze ve fagozomu. Jelikož cytosol má pH neutrální, pro cytosol již LLO není cytolytický. Tento jev je důsledkem adaptace na delší a úspěšné přežití L. monocytogenes v hostitelské buňce (Kayal a Charbit, 2006). LLO se k membráně eukaryotické buňky váže na cholesterol přes svou doménu D4, poté nastane konformační změna zapříčiňující začátek oligomerizace a tvorby póru. Tato tvorba je kontrolována množstvím nenávratné degradace LLO v neutrálním pH cytosolu (Schuerch et al., 2005). Jakým mechanismem tvorba póru probíhá, nebylo dosud objasněno. Zatím byly navrhnuty dva modely tvorby póru. První z nich je vytvořen tak, že se při oligomerizaci LLO vytvoří úplný kruh, a ten poté vytvoří pre-pór. Proniknutím přes celou tloušťku cytoplazmatické membrány poté vzniká pór (Tweten et al., 2001). Při tomto modelu jsou vždy póry stejné velikosti. U druhého modelu však může docházet k pórům různé velikosti, a to díky nedokončení kruhu při oligomerizaci (Palmer et al., 1998). Přítomnost kombinace obou typů pórů by potom vedla k odlišné odpovědi při infekci (Hamon et al., 2012). Na úniku z fagozomu s LLO spolupracují ještě dvě fosfolipázy. Studie VázquezBoland et al. (2001) pojednává o tom, jaké látky z výše uvedených podmiňují únik z fagozomu a jsou pro tento krok bezpodmínečně nutné. Bylo zjištěno, že mutanti postrádající fosfolipázy dokážou uniknout z fagozomu, ale jen s 50% úspěšností. Naopak mutanti postrádající LLO jsou schopni uniknout z fagozomu jen díky přítomnosti fosfolipáz, avšak jen u některých typů buněk, např. epiteliálních buněk typu HeLa.
22
LLO je důležitým faktorem při rozpoznávání infekce imunitním systémem. Inflamasom je součást vrozené imunity a je zodpovědný za dozrávání cytokininů a jeho aktivace zvyšuje jejich sekreci. Inflamasom byl aktivován při tvorbě póru na cytoplazmatické membráně při vstupu listerie do buňky (Hamon a Cossart, 2011). Zároveň však LLO pomáhá listerii být neviditelnou pro buňky imunitního systému tím, že samotnou buňku nějak nepoškozuje a nevyvolává její smrt. LLO také snižuje schopnost CD4+ T lymfocytů odpovědět na struktury patogenní pro buňky při průběhu infekce (Gekara et al., 2010). Podle studie Arnett et al. (2014) LLO zvyšuje činnost neutrofilů v úspěšném zabíjení infikovaných buněk. Pokud se neutrofily potkají s buňkou ještě před dokončením tvorby fagozomu, granula neutrofilu fúzuje s cytoplazmatickou membránou buňky a znemožňuje tak uzavření listerie ve fagozomu. Produkty granule také degradují LLO a snižují tím jeho funkci.
c) ActA ActA je protein, díky němuž je listerie schopna pohybu k jednomu z pólů buňky do druhého a následnému rozšíření do ostatních buněk. Mutanti, kterým chybí ActA protein, jsou schopni úniku z fagozomu, ale nejsou schopni se uvnitř cytosolu buňky pohybovat. Exprese ActA je podmíněna proteinem PrfA a teplotou (Chakraborty et al., 1992; Mengaud et al., 1991). ActA se skládá se z 639 aminokyselin a je přichycený k cytoplazmatické membráně bakterie svým C-koncem. N-konec je primární podmínkou pro iniciaci pohybu listerie. Tento konec stimuluje Arp2/3 komplex a ten zapříčiňuje shluk aktinových filament kolem bakterie. Infikované buňky makrofágů a fibroblastů, které mají Arp2/3 komplex dislokalizovaný, neposkytují bakterii schopnost pohybu uvnitř jejich cytosolu (May et al., 1999). Dvě domény jsou v N-konci nejdůležitější, protože umožňují připevnění k proteinům VASP a Mena (Pistor et al., 1995). Krátká, delokalizovaná filamenta v blízkosti bakteriální buňky jsou výsledkem činnosti Arp2/3 proteinu. Jejich frakce jsou poté prodlužovány proteiny VASP a Mena po připojení profilinu. Toto prodlužování dává vzniku dlouhých lineárních aktinových filament (Sechi et al., 1997). Mechanizmus pohybu bakterie uvnitř cytosolu není ještě zcela objasněn. Po připojení kometového ocasu k listerii se bakterie začíná pohybovat po maximálně dvou hodinách po proběhnutí infekce. Rychlost se pohybuje v průměru 0,1 - 0,3 mikrometrů za 23
sekundu (Theriot et al., 1992). Krátká filamenta zodpovídají za změnu směru pohybu, dlouhá za samotný pohyb dopředu. Obrázek 4 zobrazuje mechanizmus ActA proteinu produkovaného listerií:
Obr. 4 Funkce ActA proteinu; převzato z: ENA/VASP proteins: multifunctional regulators of actin cytoskeletondynamics, Frontiers on Bioscience 9, 2004
Na závěr je vhodné zmínit železo, které je pro přežití listerie esenciální. Získává jej z transferinu a podporuje její růst in vitro. Podle studie Ampel et al. (1992) nadměrné množství železa má za účinek zvýšenou citlivost organismu k infekci. Minimální množství prodlužuje organismu život, kdežto podávání suplementů bohatých na železo je pro organismus letální. Autoři Nieman a Lorber (1980) našli spojitost mezi sporadickým výskytem listeriové infekce u pacientů trpících hemochromatózou. Ampel et al. (1992) objevil fakt, že železo hraje roli u pacientů podstupujících dialýzu, kteří jeho nadměrné množství přijímají transfuzí. U těchto pacientů dochází často k vypuknutí listeriové infekce.
4.4.6
Popis infekce na buněčné úrovni
L. monocytogenes napadá různé typy buněk s jinou intenzitou. U makrofágového typu buňky můžeme najít až 20 buněk listerií, naopak u fibroblastového typu buňky pouze jednu buňku listerie. Pomocí Internalinu A a B se listerie váže na povrchový receptor cytoplazmatické membrány E-cadherin a vstupuje do hostitelské buňky, obalena cytoplazmatickou membránu hostitele, která se nazývá fagozom. Pomocí LLO a fosfolipáz je bakterie schopna rozrušit membránu fagozomu (pomocí tvoření pórů) a dostane se tak do cytosolu buňky. V cytosolu poté nastává replikace a dělení buněk. Pro pohyb v hostiteli listerie využívá hostitelská aktinová 24
filamenta. Jejich polymerizací za účasti proteinu ActA se pohybuje k cytoplazmatické membráně a je „vtlačována“ do cytoplazmatické membrány vedlejší buňky - díky tomuto mechanismu dochází k šíření listeriové infekce z buňky do buňky. V druhé hostitelské buňce je uzavřena v dvoumembránovém fagozomu. Bakterie se vůbec nedostává do mezibuněčného prostoru, což ji zajišťuje bezpečné přežití při vcestování do další hostitelské buňky a je takhle neviditelná pro imunitu hostitele. Cyklus se poté opakuje. Průběh cyklu je znázorněný na Obrázku 5.
Obr. 5 Průběh šíření listeriových buněk v hostiteli; převzato z: Cell biology of the infection by Listeria monocytogenes, Institut Pasteur (i) Vstup listerie do buňky, (ii) Lyze fagozomu, (iii) Pohyb uvnitř buňky, (iv) Šíření do dalších buněk – listerie se nachází v dvoumembránovém fagozomu
4.5 Diagnóza Přítomnost listerie by měla být hlídána zejména při vážném onemocnění novorozenců, meningitidě, parenchymatické mozkové infekci u pacientů s AIDS a při mozkové infekci pacientů nad 50 let. Dále také u spontánní infekce mozkových blan a u mozkových abscesů, u těhotných žen prožívající vysoké horečky (zvláště v 3. trimestru) a u náhlých vypuknutí gastroenteritidy postihující větší skupinu osob ve stejném časovém 25
úseku. Jelikož u nás lékaři ve většině případů nepředpokládají její výskyt, většinou se diagnostika na listerii neprovádí. Zvýšenou pozornost vykazují u těhotných žen. Pro diagnostiku je požadována kultivace, která většinou úspěšně potvrdí výskyt L. monocytogenes. Vzorky na kultivaci mohou pocházet jak z krve, tak z mozkomíšního moku či kloubní tekutiny, moči, placenty, likvoru, stolice, hnisu a mekonia. Pod mikroskopem po kultivaci pozorujeme drobné grampozitivní až gramlabilní kokotyčky. Starší kultury jsou tyčkovitého tvaru, avšak diagnostika by měla být rychlá a tyčky či vlákna by se v preparátu neměly vyskytovat. Dosud není žádný specifický test, který by během krátké doby prokázal výskyt této nebezpečné bakterie, avšak s rozvojem metody PCR se průkaz L. monocytogenes na klinických pracovištích a v laboratořích s PCR sondami zlepšil, a zapříčinil tak účinnější a v závěru úspěšnější léčbu pacienta. Pro PCR diagnostiku jsou vhodné vzorky z krve, mozkomíšního moku a z likvoru. Identifikace protilátek LLO není při akutní formě dostačující, stejně tak jako sérologická diagnostika, která je dostačující jen při neinvazivní formě listeriózy.
4.6 Léčba
4.6.1 Antibiotika Jelikož L. monocytogenes snadno proniká do mozku a způsobuje meningitidu, je doporučeno podávat stejné léky, jak pacientům, u nichž prokázána meningitida byla, tak i pacientům, u nichž je pouze prokázána jakákoliv forma listeriové infekce. β- laktamová antibiotika jsou pro listerie jen bakteriostatická. Nejčastější látkou v boji proti listerióze je ampicilin. Na základě studií Cherubin et al., (1991), Gellin a Broome (1989) a Nieman a Lorber (1980) se zjistilo, že je velmi úspěšné přidávat k ampicilinu gentamycin a to při bakteriemii, meningitidě a endokarditidě. Pro pacienty alergické na výše uvedené látky je dobrou náhradou trimetoprim-sulfa-metoxazol. Tato látka
s kombinací
ampicilinu
také
byla
ověřena
jako
účinné
agens
proti
meningoencefalitidě. Výše uvedená kombinace látek vykazovala větší úspěšnost při léčbě než kombinace ampicilinu a aminoglykosidu. Cephalosporiny nejsou vhodné k léčbě, protože vykazují proti listeriové infekci sníženou účinost a v několika případech při podání cephalosporinů došlo k dalšímu šíření infekce až do stádia meningitidy (Cherubin et al., 1991; Lorber et al., 1975). Stejná situace 26
nastala u některých pacientů přijímajících vankomycin (Baldassarre et al., 1991). Nicméně použití vankomycinu u pacientů alergických na penicilin zastavilo další šíření infekce (Bonacorsi et al., 1993; Blatt a Zajac, 1991). Chloramfenikol, erytromycin a tetracyklin na listeriovou infekci zabírají jen málo, proto se nedoporučuje jejich použití. V průběhu léčby by se pacient měl vyhnout požívání kortikosteroidů. Ty zapříčiňují většinou nástup meningitidy. Dosud nebylo objasněno, proč kortikosteroidy brání léčbě, avšak přítomnost rizikové skupiny, kam patří právě pacienti přijímací kortikosteroidní léčbu, může být vodítkem k objasnění tohoto mechanismu (Lorber, 1997). 4.6.2 Délka léčby V následující Tabulce 3 je možné vidět požadovanou délku léčby u různého typu listeriové infekce. Významná rezistence L. monocytogenes na antimikrobiální látky dosud nebyla objevena. Počítá se ale s možným rozvinutím, jelikož již byl popsán přenos plazmidu ukrývající geny pro rezistenci z enterokoků do L. monocytogenes (Charpentier et al., 1995). Tabulka 3. Délka léčby konkrétní listeriové infekce Typ infekce
Meningitida
Rhombencefalitida, mozkové abscesy
Baktériemie
Endokarditida
Délka léčby
Více než 3 týdny
Více než 6 týdnů
2 týdny
4 - 6 týdnů
4.7 Prevence
4.7.1
Nepřímá prevence
Mezi možnosti nepřímé prevence patří informovanost společnosti o závažnosti listeriové infekce a nastínění, jak postupovat v přípravě a uchování potravin. Také je nutné je poučit o možných projevech a následcích, pokud dojde k vypuknutí nemoci. O salmonele laická veřejnost ví, že způsobuje průjem, ale o listerii většina nemá ani potuchy. V České republice existuje Národní referenční laboratoř pro listerie v potravinových řetězcích. Kromě mnoha činností, které má tato laboratoř ve své náplni, pořádá také 27
vzdělávací akce. Podle výroční zprávy Národní referenční laboratoře z roku 2011, to bylo za rok 6 vzdělávacích akcí a 1 vzdělávací akce se spoluprácí CEM 1 s názvem „Konzultační dny střevní infekce“. Ministerstvo zdravotnictví ČR vydalo jako součást své tiskové zprávy v roce 2006 Informace pro občany - rady a doporučení ohledně listeriózy a také
Rady
a
doporučení
pro
spotřebitele
a
prodejce
(dostupné
na:
http://www.mzcr.cz/dokumenty/dulezite-informace-k-listerioze_871_872_1.html). 4.7.2 Přímá prevence Přímá prevence zahrnuje hlavně dodržování nepřímé prevence. Důležité je dodržovat hygienické zásady při přípravě a skladování jídla. Dále je také možnost vyhýbat se potravinám, kde je možný očekávaný výskyt listerie větší. Společnost EBI Food Safety v roce 2006 uvedla na trh výrobek Listex P100. Podle popisu výrobku na webových stránkách výrobce tento přípravek využívá koncentrát širokospektrých bakteriofágů, které mají usmrcující účinek na buňky L. monocytogenes (Graf 1). Nedochází tak k nebezpečnému pomnožení bakterie. Jeho aplikace musí nastat v průběhu výroby potraviny. Dá se použít na jakékoliv potraviny, při testování byl aplikován na povrch sýra. Výrobek je v oběhu v USA, v České republice bohužel ne. Společnost O.K. Servis BioPro ve spolupráci se Státním veterinárním ústavem Olomouc a se Státní veterinární správou pracují na schválení tohoto výrobku v České republice, cena jedné krabičky se odhaduje cca na 200 €, je tedy pro výrobce potravin poměrně drahý. Graf 1. Srovnání množství listerie s/bez použití Listexu P100 (inokulace 7 CFU/ml)
množství listerie (CFU/cm2)
(převzato z: Micreos Food Safety)
1OE+8 1OE+7 1OE+6 1OE+5 1OE+4 1OE+3 1OE+2 1OE+1 1
6
10
13
16
21
dny modrá: s použitím Listexu P100, červená: bez použití Listexu P100
28
Podle nedávno publikované studie v Journal of Applied Microbiology je účinná prevence proti L. monocytogenes použití kmenů Enterococcus faecium (Banwo et al., 2013). Tato bakterie je komenzál lidského intestinálního traktu a bývá používána jako probiotikum pro podporu rovnováhy složení mikrobiálního společenstva (Kayser, 2003). Bakteriociny, které tahle bakterie produkuje, vykazují antilisteriovou aktivitu a poukazuje se na jejich velkou důležitost v potravinovém zpracovatelském odvětví (Cocolin et al., 2007). Nicméně další studie musí být provedeny, aby se tato metoda přímé prevence stala spolehlivou a mohla být zaváděna do praxe.
4.8 Metody záchytu a průkazu L. monocytogenes Díky rozvoji molekulární biologie je mnohem více metod pro detekci a průkazu listerií ve vzorku. Tyto metody jsou dostupné, ale nákladné. Svými výhodami pomalu nahrazují původní, časem náročné laboratorní metody (srovnání viz Tabulka 4).
4.8.1
Kultivační metody
Pro vyizolování L. monocytogenes z potravin se v minulosti využívalo jejího vztahu k teplotě. Vzorek se nechával množit v chladících teplotách, což mělo za následek usmrcení bakteriálních buněk jiných taxonů a přežití buněk listeriových. Dnes jsou však potravinové vzorky inkubovány v základním médiu poskytujícím tak obnovu poškozených, ale stále životaschopných buněk (Alessandria et al., 2010). Buňky se poté naočkují na selektivní agar pro listerii. Většinou se jedná o již zmiňovaný OXFORD, PALCAM či MOX agar. Chromogenní agary používané pro detekci listerie jsou ALOA a RAPID’L. mono agar. Klíčovým prvkem v těchto selektivních médiích je lecitin, který je hydrolyzovaný pouze L. monocytogenes a L. ivanovii a zabraňuje tak růstu dalším příbuzným druhům (Jeyaletchumi et al., 2010). Po kultivaci následují biochemické testy.
29
4.8.2
Metody založené na tvorbě protilátek - ELISA, IMS
ELISA (enzyme-linked immonosorbent assays) využívá záchytu antigenů listerie pomocí listeriových protilátek spolu s druhými protilátkami, které zodpovídají za určitý enzym. Tato metoda je citlivější než kultivační metoda, avšak méně citlivá než molekulární metody. Komerční test VIDAS LMO2 detekoval výskyt listerie jak v zelenině, masu tak i ve více kyselých vzorcích (džus). Citlivost se pohybovala mezi 105 - 106 CFU/ml a výsledek byl známý za 70 minut (Ueda a Kuwabara, 2010). IMS (Immunomagnetic separation) je založena na párování paramagnetických polystyrenových kuliček se specifickými protilátkami kovalentní vazbou. Antigeny patogena se poté vážou na protilátku v přítomnosti magnetického pole (Wadud et al., 2010). Vzorky můžou pocházet jak z bakteriálního nárustu na kultivačním agaru, tak přímo z nakažené potraviny.
4.8.3
Molekulární metody
Cílem PCR (poly-chain reaction) jsou geny pro faktory virulence. Nejčastěji to jsou geny hly, inlA, inlB, actA a geny pro fosfolipázy (Aznar a Alarcón, 2002). U této metody nedochází k rozeznání mrtvých buněk, které můžou být detekovány i po určitém časovém úseku po jejich odumření (Lei et al., 2010). Multiplex PCR je rychlejší než konveční PCR a navíc využívá fluorescenční detekci.
4.8.4
Subtypizační metody
Subtypizační metody rozlišují různé kmeny a sérovary listerie. Tyto metody jsou potřebné při velkých infekcích způsobených listerií. Pomáhají tyto rozsáhlé infekce kontrolovat, předpovídat a také efektivně minimalizovat. Sleduje se jak doba infekce, tak místo a původ nákazy a také cílová skupina osob, u kterých infekce vypukla. Subtypizační metody pomáhají korelovat přítomnost infikovaných potravin na trhu a také předcházet jejich opakovanému uvedení na trh. Standardizace těchto metod je nevyhnutelná, pokud jsou součástí epidemiologických studií (Nadon et al., 2001). V textu práce je dále uveden seznam různých subtypizačních metod a jejich hlavní principy. Mimo tyto metody lze použít metody na základě PCR, které většinou detekují 30
rozdílnost v genomu různých kmenů, např. mutace, delece a inzerce vzniklé v průběhu rozdílné evoluce těchto kmenů (Tyler et al., 1997). Serotypizace slouží k určení sérovarů na základě tělových a bičíkových antigenů. 95% procent izolátů z kontaminovaných potravin náleží do sérovarů 1/2a, 1/2b, 4b a 1/2c (Doumith et al., 2004). Fágová typizace má určité omezení, protože ne všechny kmeny lze touto metodou detekovat. Podle přítomností fága uvnitř listeriové buňky jsou listerie rozděleny do fagovarů a fágových skupin (Graves et al., 2007). MLEE (moltilocus enzyme electrophoresis) je metodou, která využívá rozdílné chování enzymů během elektroforézy. Enzymy bakterie se liší ve své aminokyselinové sekvenci (Shuckken et al., 2003). Podle přítomnosti enzymů se pak listerie dále dělí do skupin. Ribotypizace je příkladem metody využívající restrikční enzymy. DNA listerie je rozdělena enzymy na malé fragmenty, které jsou poté podrobeny detekci na základě hybridizování toho množství DNA, které kóduje ribozomální RNA.
Další metody
fungující na základě restrikčních enzymů jsou PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) (Wiedmann, 2002) a AFLP (amplified fragment length polymorphism) (Parisi et al., 2010). MLST (multilocus sequence typing) detekuje rozdíly v nukleotidech u 7 zvolených genů (Parisi et al., 2010). Typ této metody využívající rozdílné sekvence v nukleotidech u genů pro virulenci nebo u genů asociovaných s faktory virulence, se nazývá MVLST (multi-virulence locus sequence typing) (Whittam a Bergholz, 2007).
4.8.5
Hmotnostní spektrometrie
MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) je technika, která poskytuje hmotnostní spektrum biomolekul a velkých organických molekul ve vzorku. V mikrobiologii se jedná většinou o peptidy, proteiny a biomarkery. Tyto látky jsou během detekce ionizovány při procházení magnetickým 31
polem a dále detekovány podle své molekulové hmotnosti. MALDI-TOF MS hmotnostní spektrum je unikátní pro většinu kultivovatelných bakteriálních druhů. Podmínkou správné identifikace je výskyt referenční kultury analyzovaného vzorku v databázi spekter, identifikační software poté hledá spektrum nejvíce podobné neznámému vzorku. Metoda je rychlá a levná, dá se použít na čisté kultury, ale byly publikovány i studie analyzující vzorky hemokultur a moče (Ferreira et al., 2011; Seng et al., 2010). V případě listeriové infekce je velmi žádanou metodou díky své rychlosti a samotnému levnému procesu detekce. Jadhav et al. (2014) použil tuto metodu na detekci L. monocytogenes v mléce. Po vyizolování L. monocytogenes z mléka ji nechal růst v bujónu po 24 hodin, poté ještě dalších 6 hodin. Použil dvě média - OBL agar a BHI agar. Následující
Obrázek
6
ukazuje
výsledek
MALDI-TOF
MS
analýzy Listeria
monocytogenes:
A
B
Obr. 6 Hmotnostní spektra L. monocytogenes, MALDI detekce; převzato z: Journal of proteomics 2014, Detection of Listeria monocytogenes from selective enrichment broths using MALDI-TOF mass spectrometry; A: po vykultivování na OBL agaru, B: po vykultivování na BHI agaru
Vzorky z kolonií z obou typů agarů byly úspěšně identifikovány jako L. monocytogenes s využitím software SARAMIS (Jadhav et al., 2014).
32
Tabulka 4. Srovnání metod pro detekci L. monocytogenes (převzato z: Jadhav et al., 2012) Výhody
Metoda
Kultivační metoda
-
detekce živých buněk chromogenní médium, usnadňuje detekci
-
Imunologické metody
-
1-2 dny pro prokázání výsledků možnost zjištění prezence konkrétního proteinu/genu již ve vzorku jídla
-
PCR
-
vysoká citlivost, rychlost -
Subtypizační metody
-
MALDI
-
dohledání zdroje nákazy prevence výskytu dalších infekcí pomoc při epidemiologických studiích zjištění míry patogenity konkrétních kmenů/sérovarů levná, rychlá možná mezidruhová identifikace
-
-
-
Nevýhody 5-10 dní pro prokázání výsledků výsledky mohou být závislé na podmínkách prostředí buňky pod stresem či buňky se sníženou viabilitou nemusí být zachyceny příbuzné taxony mohou zastínit růst cílové bakterie méně spolehlivé než genetické metody- exprese antigenů se mění se změnou prostředí křížová reakce se může objevit mezi vysoce příbuznými druhy (vznik falešně pozitivních výsledků) neodliší mrtvé buňky od živých, možnost falešných pozitivních výsledků finančně nákladné některé velmi nákladné některé časově náročné poskytuje detekci kmenů a sérovarů listerie (nikoli pouze detekce přítomnosti bakterie) potřeba přípravy kvalitního antiséra obsahujícího sbírkové kmeny vysoká pořizovací cena samotného přístroje pro detekci nelze detekovat ze směsných vzorků
33
5. Listerióza v ČR
5.1 Normy pro výskyt listerie v potravinách Podle nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 ze dne 5. 12. 2007 se změnilo nařízení Komise (ES) č.2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Kromě kritérií pro bezpečnost potravin toto nařízení obsahuje hygienická kritéria pro výrobu potravin, možné kontaminanty různých typů potravin, povolené množství typických patogenních druhů bakterií kontaminujících potraviny, pravidla pro odběr vzorků a pravidla pro přípravu zkušebních vzorků. Tabulka 5 shrnuje kritéria bezpečnosti potravin pro výskyt L. monocytogenes: Tabulka 5. Kritéria bezpečnosti potravin pro L. monocytogenes (převzato z: nařízení Komise (ES) č. 1441/2007) Kategorie potravin
Počet jednotek pro vzorek
Limity
Analytická referenční metoda
Fáze, na nichž se kritérium spravuje
K přímé spotřebě pro kojence, pro zvláštní léčebné účely (1)
10
Nepřítomnost ve 25 g
EN ISO 11290-1
Produkty uvedené na trh během doby údržnosti
5 K přímé spotřebě podporující růst LM
K přímé spotřebě nepodporující růst LM (1) (2)
100 CFU/ml (3)
EN ISO 11290-2
5
Nepřítomnost ve 25 g (4)
EN ISO 11290-1
5
100 CFU/ml
EN ISO 11290-2
Produkty uvedené na trh během doby údržnosti Před tím, než potravina opustí kontrolu provozovatele, který ji vyrobil Produkty uvedené na trh během doby údržnosti
LM: Listeria monocytogenes (1) Pravidelné provádění vyšetření podle příslušného kritéria se za běžných podmínek nevyžaduje u těchto potravin určených k přímé spotřebě: -
u
takových,
které
byly
tepelně
ošetřeny
nebo
jinak
zpracovány
za
účelem
účinného
odstranění L. monocytogenes, pokud po tomto ošetření není možná opětovná kontaminace (např. výrobky, které jsou tepelně ošetřeny v konečném obalu),
34
-
u čerstvé, nekrájené a nezpracované zeleniny a ovoce, vyjma naklíčených semen,
-
u chleba, sušenek a podobných výrobků,
-
u vod, nealkoholických nápojů, piva, jablečného vína, vína, lihovin a podobných výrobků v lahvích nebo baleních,
-
u cukru, medu a cukrovinek, včetně výrobků z kakaa a čokolády,
-
u živých mlžů.
(2) Výrobky s pH ≤ 4,4 nebo aw ≤ 0,92, výrobky s pH ≤ 5,0 a aw ≤ 0,94, výrobky s dobou údržnosti pod 5 dní jsou automaticky považovány za výrobky spadající do této kategorie. Je-li to vědecky opodstatněné, mohou do této kategorie spadat také jiné kategorie výrobků. (3) Toto kritérium platí, pokud je výrobce schopen ke spokojenosti příslušného orgánu prokázat, že výrobek nepřekročí limit 100 CFU/ml po celou dobu údržnosti. Provozovatel může pro průběh procesu stanovit průběžné limity, které musejí být dostatečně nízké, aby zaručily, že limit 100 CFU/ml nebude na konci doby údržnosti překročen. (4) Toto kritérium se vztahuje na výrobky před tím, než opustí bezprostřední kontrolu provozovatele potravinářského podniku, který je vyrábí, pokud není schopen ke spokojenosti příslušného orgánu prokázat, že výrobek nepřekročí limit 100 CFU/ml po celou dobu údržnosti.
Je důležité si uvědomit, že se výrobky určené k přímé spotřebě nepodporující růst L. monocytogenes nesmí opomínat. V případě, kdy je detekováno podlimitní množství listerie ještě neznamená, že konkrétní potravina je bezpečná a po jejím požití nedojde k vypuknutí infekce. Tyto potraviny nemusí sloužit hned k přímé spotřebě, ale spotřebitel je může zakomponovat do svého výrobku, jehož součástí mohou být potraviny podporující růst L. monocytogenes - v takovém případě prostředí potraviny prvně nepodporující růst listerií se promění v mikroprostředí podporující jejich růst a mohou se tak úspěšně množit. Po požití může dojít k infekci. V nařízení je také oddíl „Interpretace výsledků vyšetření pro L. monocytogenes“, kde platí: a) L. monocytogenes v potravinách určených k přímé spotřebě pro kojence a pro zvláštní léčebné účely: - vyhovující, pokud všechny zjištěné hodnoty poukazují na nepřítomnost této bakterie, - nevyhovující, pokud je přítomnost této bakterie zjištěna v kterékoli jednotce vzorku.
35
b) L. monocytogenes v potravinách určených k přímé spotřebě, které podporují růst L. monocytogenes, před tím, než potraviny opustí bezprostřední kontrolu provozovatele potravinářského podniku, který je vyrábí, pokud není schopen prokázat, že výrobek nepřekročí limit 100 CFU/ml po celou dobu údržnosti: - vyhovující, pokud všechny zjištěné hodnoty poukazují na nepřítomnost této bakterie, - nevyhovující, pokud je přítomnost této bakterie určena vjednotce vzorku. c) L. monocytogenes v ostatních potravinách určených k přímé spotřebě: - vyhovující, pokud jsou všechny zjištěné hodnoty ≤ limit, - nevyhovující, pokud je kterákoli hodnota > limit. V Nařízení (ES) 178/2002 ze dne 25. 1. 2002 v oddílu „Obecné požadavky potravinového práva“, je součást čl. 19 „Odpovědnost za potraviny pro provozovatelé potravinářských podniků“. Ve vyhlášce 289/07 Sb. jsou definovány kontroly hygieny pracovního prostředí provozovatelů.
5.2 Výskyt v potravinách 5.1.1 Obecný výskyt v potravinách Větší pozornost se výskytu L. monocytogenes v potravinách začala věnovat až od roku 2007, kdy se zvýšil počet případů listeriózy. Tuto situaci nedostačuje pouze náhodně mapovat a pro mapování použít náhodné vzorky potravin - je potřeba provádět opakovatelné vyšetření mnoha vzorků potravin ze všech jejich druhů, které jsou pro výskyt listerie nejčastější. Jen díky kompletnímu mapování této situace můžeme mít přesná a kvalitní data, na kterých lze provádět další analýzy a testy a efektivně predikovat stav v průběhu času, více porozumět tomuto patogenu, eliminovat jeho výskyt a zabránit tak vypuknutí jak velkých infekcí, tak sporadických případů. Provozovatelé potravinářských podniků před distribucí výrobků většinou dodržují nařízení a vyhlášky ohledně testování svých produktů. Pokud se totiž L. monocytogenes v potravině vyskytuje pod limitní hodnotu, výrobek je možno nabízet k prodeji. V tomto případě může dojít k velmi nepříjemné situaci, kdy se L. monocytogenes stihne pomnožit nad svou infekční dávku a při požití způsobí onemocnění. Obvykle se tak stává u zrajících
36
sýrů, nebo obecně u potravin, které jsou při převozu špatně skladovány a L. monocytogenes má tak čas se rozmnožovat. Provozovatel si také může vybrat, jaká instituce bude testovat jeho výrobek, kdy při výběru hraje roli také určitě cena. S nárustem soukromých laboratoří je proto mnoho dat nepublikováno. U soukromých laboratoří se cena pohybuje cca kolem 100 Kč za jeden vzorek, u SVÚ cca 300 Kč. V Tabulce 6 jsou uvedeny časové intervaly potřebné pro namnožení určitého množství listerie v potravinách: Tabulka 6. Doba počtu zdvojení L. monocytogenes v konkrétních potravinách (převzato z: Eurepean comission, 1999) Potravina Polotučné mléko Odtučněné mléko Dlouhotrvající mléko Smetana Camembert Vakuované hovězí maso Namleté hovězí maso Naložené syrové vepřové maso Vakuovaná šunka Kuřecí maso Frankfurtské párky
Doba zdvojení počtu buněk (h) 12,5 12
Teplota (ºC)
pH
NaCl (g.l-1)
8 7
6,40 6,40
0,5 0,5
18,5
5
6,60
0,5
6 18
13 6
6,40 6,10
0,5 2,4
30
5,3
5,6
0,5
18,1
5
6,27
0,5
3,6
15
6,30
2
16,4 19,3 9
10 6 15
6,63 6,52 5,80
2,77 0,5 3,2
Dle tabulky je patrné, že obecně zvyšující se teplota má za následek snižující se dobu pro zdvojnásobení počtu listerií. V letních měsících je potom otázka chvilky, kdy se listerie ve špatně uskladněných potravinách může nadměrně množit. Podle průzkumu Brychty (2011), prezentujícího testování potravin na přítomnost L. monocytogenes prováděné na konkrétních SVÚ ČR v letech 2008 a 2009, bylo zjištěno 2,2% nevyhovujících vzorků potravin v roce 2008 a 1,4% nevyhovujících vzorků potravin v roce 2009. Tabulka 7 na další stránce shrnuje podrobnější údaje:
37
Tabulka 7. Výskyt L. monocytogenes v potravinách, rok 2008 a 2009 (převzato z: Brychta, 2011) Rok
2008
2009
Potravina
Počet vzorků
Počet nevyhovujících vzorků
Masné výrobky Mléčné výrobky Lahůdky Ryby Jiné Celkem Masné výrobky Mléčné výrobky Lahůdky Ryby Jiné Celkem
14 697 3142 533 277 625 19 294 15 945 8 142 604 210 2 026 26 927
288 43 46 18 33 428 311 43 16 6 4 387
Procento nevyhovujících vzorků 2 1,4 8,3 6,5 5,3 2,2 2 0,5 2,6 0,9 0,2 1,4
Následující výsledky se shodují se studií Gelbíčová a Karpíšková (2009), kdy bylo v období 2004 - 2008 testováno 2180 vzorků z běžných potravin, kdy 2,5% vzorků bylo pozitivních na výskyt L. monocytogenes. Nejvíce pozitivních vzorků spadalo do lahůdek (5,2%), masných produktů (3,4%) a mléčných výrobků (1,8%). Menší množství L. monocytogenes bylo nalezeno ve vzorcích z ryb (1,7%), cukrářských výrobků (0,9%) a ze zeleniny (0,5%). Žádný vzorek ovoce nebyl pozitivní na přítomnost L. monocytogenes. Nejčastější sérotyp vyskytující se v těchto vzorcích byl 1/2a (44,4%), méně pak 1/2c (19,4%) a sérotyp 1/2b byl prokázán u 16,7% případů.
5.1.2
Konkrétní výrobky s prokázaným výskytem L. monocytogenes od roku 2006
Listerióza byla až do roku 2006 vzácným onemocněním, proto lze rok 2006 považovat za jakýsi mezník pro problematiku listeriózy v ČR. Zvýšený výskyt listerie započal v prosinci, nejhorší situace nastala v Plzeňském kraji: Královéhradecký kraj 29. 12. - 2 výrobny lahůdek - Gurmán plus, Černilov u Hradce Králové a Zvičinské uzeniny a lahůdky, Bílá Třemešná.
38
Moravskoslezský kraj 14. 12. - pochoutkový salát od ostravské společnosti Nové lahůdky Sixta, 23. 12. - malé ostravské řeznictví (jméno neudáno) - staženo více než 30 kilogramů sekané, sanitace výrobních prostor. Olomoucký kraj 19. 12. - litovelský a vlašský salát, výrobna lahůdek Hejný v Litovli, 27. 12. - šunkové rolky a aspik - zastavena výroba v jesenické výrobně lahůdek OLE – Lahůdky, 29. 12. - tlačenka z výrobny Smičková ze Seničky, kabanos z výrobny Brachtl v Šumvaldu, sekaná z výrobny Masonava Olomouc - Pavlovičky, tlačenka z Brodku u Přerova, aspik z firmy Váhala v Hustopečích nad Bečvou, klobása z výrobny U Bínů z Hrabenova, tlačenka z firmy Pitel z Olšan na Šumpersku, salám Junior Středního odborného učiliště Jeseník, L. monocytogenes byla detekována také v sýrovém a hermelínovém salátu od firmy BIKOS CZ ze Zábřehu na Šumpersku. Plzeňský kraj 15. 12. - dezertní sýr Baladur, Prom-Prodej, s.r.o. z Nepomuku (až 820krát větší množství než povoluje norma!!!), 19. 12. - opět sýr Baladur od firmy Prom-Prodej (až 1340krát větší množství než povoluje norma!!!). Praha 14. 12. - hermelínový salát, Lahůdky Palma, výroba obnovena 22. 12. po sanitaci výrobny. Pardubický kraj 29. 12. - zákaz výroby lahůdek v provozovně Na červenici 1904, Jednota, Svitava. 39
Jihomoravský kraj 29. 12. - tlačenka firmy Rezpo Břeclav, játrový salám firmy Dobrá masna Kyjov, bruselská paštika firmy R&R Food Tetčice, výrobna firmy Strejček Brno. V polovině prosince 2006 kvůli velkému výskytu listeriózy nařídil hlavní hygienik povinné kontrolování potravin na výskyt L. monocytogenes. Kontrolovaly se jak potraviny, tak jejich výrobny. V Moravskoslezském kraji byla k dispozici informační linka pro občany týkající se problematiky listeriózy. Ke dni 16. 12. 2006 ji využilo 100 osob. Jak se situace vyvíjela v dalších letech, je nastíněno níže. Státní zemědělská a potravinářská inspekce zakázala výrobu těchto potravin po nalezení nadlimitního množství L. monocytogenes Krajskými hygienickými stanicemi: Rok 2007: 1. Ocean Queen Irský losos krájeny uzený (Makro Cash and Carry ČR). 2. Vlašský salát od firmy Limer s.r.o. (zakázána výroba v úseku lahůdek). 3. Losos uzený salátový, Almar Kartouzy Polsko (Kaufland, Spar). 4. Ďábelská a topinková pomazánka, Jednota Hladké Životice. 5. Bulharská pomazánka, Gastro Menu Express. 6. Vejce, bramborový salát, Maso West (zákaz lahůdkářské výroby). 7. Pochoutkový salát, Jiří Lapuník, Ledce na Mladoboleslavsku. 8. Vlašský salát, Jan Hajný (zákaz lahůdkářské výroby). 9. V dalších případech se jednalo zejména o lahůdkářské potraviny, výjimkou byl vzorek ze slaniny a z vepřového masa. Fakt, že téměř polovina potravin byla stažena a kontrolována v lednu/únoru, vyplývá z nařízení hlavního hygienika ČR, který učinil toto opatření po vypuknutí listeriózy v roce 2006. Rok 2008: 1. Zákaz prodeje 4 firmám vyrábějící lahůdky (neudáno kterým). Rok 2010: 1. Tvarůžky, Lidl.
40
Rok 2011: 1. Výrobek z uzených ryb HALIBUT, Almar, Kartuzy, Polsko (nabízený marketem Kaufland v ČR). Rok 2013: 1. Šunkový závitek v aspiku a Pařížský salát, Verner Kotula. Množství různých typů potravin, které byly odstraněny z marketů a obchodů a byla u nich zastavena výroba, koreluje s výsledky ze studií týkajících se výskytu L. monocytogenes v potravinách zmíněných výše. Je důležité si uvědomit, že nakažené potraviny nemusí vždy pocházet z českých výroben. Obchody a výrobny potravin mohou mít jako dovozce surovin zahraniční firmy. Tyto firmy nemusí mít špatné hygienické podmínky pro to, aby se v jejich surovinách L. monocytogenes pomnožila, ale čas potřebný pro dovoz a distribuci potraviny je pro listerii velmi příhodný a bakterie se tak může pomnožit ještě předtím, než se dostane ke spotřebiteli. Pro rok 2013 bylo SVÚ odebráno 6948 vzorků potravin na kontrolu přítomnosti L. monocytogenes a z toho 30 vzorků nevyhovovalo (0,43%). Nadměrný výskyt listerie oproti předešlým rokům nastal v mražené zelenině, kde L. monocytogenes úspěšně bojuje proti účinkům dezinfekce. Zajímavý poznatek také nastal při kontrolních stěrech po dezinfekci z pracovních ploch výroben - pokles z 3,6% pozitivních vzorků v roce 2010 na 0,43% pozitivních vzorků v roce 2012. Proč se tak stalo, lze jen spekulovat. Mohlo dojít ke zlepšení hygienických podmínek provozu, účinnější desinfekci a údržbě pracovních ploch, anebo naopak k ne zcela kvalitnímu provedení stěru. Stěry mohly být prováděny na stejných místech, nemuselo docházet ke stěrům na náhodných rozdílných místech (SVÚ, nezveřejněná data).
5.1 Epidemiologie Následující epidemiologická data vždy vycházejí ze všech hlášených údajů o výskytu onemocnění z Ministerstva zdravotnictví ČR a ze Státního zdravotnického ústavu ČR. Mnohá epidemiologická data proto nejsou uvedena, jelikož dochází k jejich ztrátě. I když je listerióza povinně hlášené onemocnění, při epidemii v roce 2006 byly izoláty z potravin a z pacientů dále typizovány v Národní referenční laboratoři pro listerie - podle 41
těchto izolátů byla poté možnost dohledat pár případů, které zdravotní střediska neohlásily příslušným orgánům. 5.1.1
Incidence
Onemocnění L. monocytogenes má nízký výskyt v porovnání s ostatními onemocněními. Incidence v ČR se pohybuje od 0,1 - 0,2 na 10 000 obyvatel. Epidemie v roce 2006/2007 však incidenci zvýšila až na 0,8. Ze všech případů listerióz, 30%- 45% připadá na novorozence a těhotné ženy. Procento onemocnění listeriózou také koreluje s věkem obyvatel. Již u osob s věkem 55-ti let je to 50% všech případů a s přibývajícím věkem toto procento roste. Nejčastěji listeriózu sledujeme v podzimních a zimních měsících. Udává se, že 5% osob je za svůj život alespoň jedenkrát bezpříznakovým nosičem. Světová incidence se udává od 0,1 - 1 na 100 000 obyvatel. Vysoký výskyt listeriózy bývá v severních a severozápadních zemích, naopak nízký v Rumunsku, Bulharsku a Řecku. V Evropě v roce 2005 stoupl počet onemocnění na 1430 oproti roku 2001, kdy byl počet onemocnění pouze 900. Jednalo se tedy o celkový nárust listeriózy, nejen nárust listeriózy na území ČR. Následující Graf 2 srovnává incidenci listeriózy v různých evropských zemích: Graf 2. Listerióza v zemích EU, rok 2005, podle EFSA (převzato z: MZČR, 2007) 0 Denmark Belgium Finland Germany The Netherlands France Sweden Ireland Latvia United Kingdom Norway Estonia Spain Austria Czech Republic
0,2
0,4
0,6
0,8
1 0,9
0,8 0,7 0,6 0,6 0,4 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1
42
5.1.2
Mortalita
Mortalita je vysoká, dosahuje 30%. Pokud srovnáme mortalitu s nejčastějšími onemocněními způsobenými konzumací infikovaných potravin, zjistíme, proč se právě listerióza po vypuknutí epidemie v roce 2006 dostala do popředí. Mortalita pro salmonelózu je 0,38%, pro kampylobakteriózu 0,02- 0,1%, pro vibriózu 0,005- 0,01% (Liu, 2006). Výskyt těchto onemocnění je mnohonásobně častější, ale kvůli nízkým hodnotám jejich mortalit, jsou tyto nemoci zanedbatelné. Největší mortalita je ve Francii (40%). Při CNS infekcích, vyskytujících se v průměru u 47% případů všech listerióz, je mortalita 36% (Siegman-Igra et al., 2002). 5.1.3
Situace do roku 2006
V minulosti listerióza nebyla častým onemocněním, a proto byla často opomíjena a dostala se do pozadí pozornosti v klinické diagnostice. Mnozí lékaři bez specializace zahrnující infekční či neurologickou tématiku často nepředpokládají tohoto patogena jako původce onemocnění. První popsaná listerióza na našem území pochází z roku 1944 a to na základě podobnosti nemoci popsané Nyefeldtem v roce 1929. K výskytu infekcí listerií, jak sporadických případů, tak epidemií, začalo u nás docházet od roku 1953. Počet případů od roku 1965 je znázorněno v Grafu 3. Graf 3. Počet hlášených onemocnění listeriózou v období 1965 – 2006 (převzato z:
2005
2000
1995
1990
1985
1980
1975
1970
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1965
počet případů
MZČR, 2007)
43
5.1.4
Situace v roce 2006, 2007
V prosinci roku 2006 došlo k epidemii způsobené L. monocytogenes. V roce 2006 bylo zjištěno 5x více onemocnění (78) než v roce 2005. Dalších 7 onemocnění poté vypuklo v lednu 2007. K nárustu postupně začalo docházet od dubna, nejvíce onemocnění nastalo v listopadu a v prosinci. 14 pacientů zemřelo, k novorozenecké listerióze došlo ve 14 případech, k úmrtí ve 3 případech. V 16 případech se jednalo o pacienty s nádorovým onemocněním. 44 pacientů bylo ve věku 55 - 74 let. Nejvyšší mortalita postihla věkovou skupinu nad 75 let (75%), skupina 55 - 74 let vykazovala mortalitu 15,9%. Novorozenecká skupina pacientů se vyznačovala 21,4% mortalitou. Listerióza převažovala ve Slezsku a na Moravě. Obrázek 7 a Tabulka 8 mapují situaci v ČR podle krajů:
Obr. 7 Výskyt listeriózy 2006, leden 2007; převzato z: Tisková konference MZČR 2007
Tabulka 8. Počet onemocnění způsobených L. monocytogenes v krajích, 2006 a leden 2007 (upraveno podle: MZČR, 2007) Kraj Jihomoravský Moravskoslezský Plzeňský Olomoucký Pardubický Zlínský Jihočeský
Počet nakažených 15 10 10 9 6 5 5 44
Kraj Ústecký Hl.m. Praha Středočeský Královehradecký Karlovarský Vysočina Liberecký
Počet nakažených 5 4 4 4 3 3 3
U nakažených byla zjištěna konzumace některých druhů sýrů, paštik, lahůdkových salátů, tepelně neupravených masných výrobků, tlačenky, rolky, šunky a aspiku. Tato epidemie vznikla po pozření kontaminovaného zrajícího sýru Baladur. Pár případů bylo ale také sporadických, jednalo se především o rizikové skupiny obyvatelstva, kdy došlo k nakažení přes jinou potravinu. Epidemie také měla dopad na ekonomiku potravinových firem. Mlékárny a výrobny lahůdek hlásily propad poptávky o jednu třetinu, pokud by se stav nevrátil na původní hodnotu, hrozil by krach firem a propouštění jejich zaměstnanců. V roce 2006 hlavní hygienik učinil tato opatření, uveřejněné na webových stránkách MZČR: 1. Vyhlásil tři nebezpečné výrobky - hermelínový a pochoutkový salát od Lahůdky Palma Praha, s.r.o., Nové Lahůdky Sixta, s.r.o. a Baladur měkký zrající dezertní sýr od Prom prodej, s.r.o. 2. Nařídil podrobná šetření v těchto výrobnách spolu se Státní veterinární správou a Státní zemědělskou a potravinářskou inspekcí. 3. Ve spolupráci s ministryní Vincenovou a s výše uvedenými institucemi, nařídil kontrolu výroben lahůdek a jejich následnou distribuci a prodej v tržní síti celé republiky od 18. 12. 2006. 4. Připravil informace o onemocnění a doporučení jak předcházet onemocnění pro občany ČR (dostupné na webových stránkách MZČR uvedených v kapitole 4.7.1 Nepřímá prevence). V předběžné zprávě z roku 2007 MZČR bylo napsáno, že MZČR, Státní veterinární zpráva a Státní zemědělská a potravinářská inspekce zahájili kontrolní kampaň obsahující více než 2 000 kontrol prováděné hygieniky a dalšími příslušnými pracovníky. Odebralo se přes 2200 vzorků potravin, pozitivních bylo až 2% vzorků. Pro odstranění
45
nedostatků v průběhu kontrol bylo vydáno více než 100 opatření. Závěr této zprávy informoval o dalším průběhu řešení oné situace: 1. Dozorové orgány budou nadále pokračovat v kontrolách dodržování systémů HACCP a GMP u výrobců a prodejců. 2. Dozorové orgány budou nadále při kontrolních akcích sledovat dodržování nařízení komise ES č.2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 3. Vzhledem k měnícím se demografickým ukazatelům (stárnoucí populace, vyšší výskyt pacientů s oslabenou imunitou v populaci) budou se obě ministerstva tj. zdravotnictví i zemědělství podílet na vzdělávacích aktivitách pro širokou veřejnost včetně citlivých skupin, vzdělávací aktivity budou zaměřeny i na základní požadavky na uchovávání a nakládání s potravinami se zaměřením na potraviny určené k přímé spotřebě. 5.2.5
Situace po roce 2007
Po epidemii listeriózy končící v lednu 2007 se výskyt listeriózy snížil, přesto se ale nedostal na původní hodnoty před vypuknutím epidemie v roce 2006. Následující data poskytl Státní zdravotní ústav ČR. V Tabulce 9 si můžeme povšimnout snížení počtu onemocnění po roce 2007 (diskutováno výše), ale tento počet je stále vyšší (dvojnásobný) než počet onemocnění před rokem 2006. Ke změně došlo také u mortality – od roku 2009 se rapidně zvýšila, kolísá mezi 20% a více. Tabulka 9. Počet listerióz a úmrtí od 2004-2013 (převzato ze: SZÚ, 2013) Rok 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Počet případů listeriózy 16 15 78 51 37 32 26 35 32 35
Počet úmrtí 2 1 12 8 8 8 5 10 5 7
Ke dni 14. 4. 2014 bylo hlášeno 5 případů listeriózy, z toho 2 případy končily úmrtím (SZÚ, nezveřejněná data). 46
6. Instituce a organizace s možností úpravy problematiky listeriózy 6.1 Evropská unie V závěrečné práci již byly uvedeny vyhlášky upravující limitní množství listerie v potravinách nařízené EU, pro doplnění je však dále vhodné zmínit organizaci European Food Safety Authority (EFSA). Tato organizace hodnotí bezpečnost potravin z hlediska výskytu L. monocytogenes v potravinách a dává rady pověřeným osobám, jak na základě jejího vědeckého pozorování mohou kontrolovat a zlepšovat dopad L. monocytogenes na zdraví člověka. Tuto funkci může zastávat díky třem svým činnostem: každoročně monitoruje přítomnost L. monocytogenes v potravinách ve všech členských státech EU, posuzuje výskyt této bakterie v produktech určených pro přímou spotřebu a analyzuje rizikové faktory zodpovědné za růst a přítomnost L. monocytogenes v potravinách. Další organizací EU je tzv. systém včasného varování pro potraviny a krmiva RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed), který upozorňuje na kontaminované výrobky pomocí dvou tipů notifikací: první se týká výrobků zadržených na hranicích vstupu do EU (border rejection), druhý obsahuje notifikace týkající se výrobků na trhu EU. Poslední zmíněný druh má dva typy upozornění: varování (alert notifications) a informativní
hlášení
(informations).
Systém
se
aktualizuje
ihned
po
detekci
kontaminované potraviny, u nás je ke zhlédnutí např. na www.bezpecnostpotravin.cz.
6.2 Česká republika V náledujícím textu je podán stručný přehled korelace bezpečnosti potravin v naší zemi. Tento systém byl schválen v roce 2001 (usnesení vlády č. 1320 - Strategie zajištění bezpečnosti potravin v ČR). Systém pracuje s principem analýzy rizika, do nějž patří 3 činnosti: hodnocení rizika, řízení rizika a komunikace o riziku. Potravinové právo je součástí nařízení ES č.178/2002. Nařízení ES č.882/2004 funguje jako předpis pro ověřování a kontroly, je-li potravinové právo dodržováno. Obrázek 8 na následující stránce zobrazuje schéma kontroly a zabezpečení nezávadnosti potravin u nás, o vyznačených orgánech je pojednáno dále: 47
Obr. 8 Schéma systému bezpečnosti potravin v ČR; převzato z: MVDr. Jaroslav Palásek, CSc. Bezpečnost potravin, 2001
V textu bakalářské práce se dále budu zabývat pouze vybranými orgány, u kterých uvádím informace a zastávající funkce týkající se problematiky nezávadnosti potravin.
6.2.1
Ministerstvo zdravotnictví
Ministerstvo zdravotnictví spolu s Ministerstvem zemědělství patří mezi orgány zodpovědné za hodnocení rizika a monitoring nebezpečných potravin. Je to orgán, který zodpovídá za funkci orgánů ochrany veřejného zdraví. Krajské hygienické stanice jsou orgány veřejného zdraví, k těmto stanicím plní následující funkce: -
kontroluje jejich činnost,
-
dává povolení k mimořádnému očkování,
-
sestavuje programy pro podporu ochrany veřejného zdraví,
-
navrhuje vládě hlavního hygienika České republiky,
-
nařizuje postupy k podpoře ochrany veřejného zdraví,
-
má právo nařídit četnost a postup při kontrolách nezávadnosti potravin.
48
Dále jeho funkce spočívá v zodpovědnosti dodržování platných předpisů mezinárodních smluv o ochraně veřejného zdraví, spolupracuje s ostatními státními i nestátními organizacemi a nařizuje opatření při: -
výskytu epidemií,
-
záchytu kontaminovaných potravin či výrobků,
-
výskytu infekčních onemocnění ze zahraničí. Ministerstvo zdravotnictví je zodpovědné za nezávadnost potravin nově uváděných
na trh a za stanovení požadavků na nezávadnost potravin v oblasti mikrobiologie, přídatných a pomocných látek k aromatizaci potravin a za nepřítomnost reziduí pesticidů či veterinárních léčiv v potravinách. 6.2.2
Ministerstvo zemědělství
Tento orgán zodpovídá za funkci veterinárních a fytosanitárních institucí, za oblast výživy a pohody zvířat při průběhu výroby potravin, za bezpečnost uvádění geneticky modifikovaných potravin a krmiv na trh. Ministerstvo zemědělství řídí Státní zemědělskou a potravinářskou inspekci, Státní veterinární správu, Ústřední kontrolní a zkušební úřad zemědělský a Ústav pro státní kontrolu veterinárních biopreparátů a léčiv. 6.2.3
Státní veterinární správa
Státní veterinární správa dohlíží na zdraví zvířat, na zdravotní nezávadnost potravin živočišného původu, na ochranu státu před zavlečením nositelů nebezpečných nákaz. Mezi její pravomoci patří: -
podává návrhy Ministerstvu zdravotnictví na stanovení dalších povinných a preventivních úkonů k předcházení vzniku onemocnění a šíření nákaz přenosných ze zvířat na člověka,
-
vykonává státní veterinární dozor a vydává opatření k odstranění zjištěných nedostatků,
-
navrhuje ministerstvu zemědělství referenční laboratoře, schvaluje je a usměrňuje jejich činnost,
-
dohlíží a kontroluje Státní veterinární ústavy.
49
6.2.4
Státní veterinární ústavy
Tyto ústavy provádějí komplexní laboratorní diagnostiku zaměřenou na zdravotní nezávadnost a jakost potravin, krmiv, vody, biologického materiálu, léčiv a kosmetických přípravků a na infekční a neinfekční choroby zvířat všech kategorií. Dále monitorují cizorodé látky v potravinovém řetězci člověka, zvířat a prostředí. Nezávadnost potravin kontrolují u výroben potravin, nikoli u marketů a obchodů, které již potraviny nabízejí k prodeji. 6.2.5
Státní zemědělská a potravinářská inspekce
Tato inspekce vykonává dozor nad potravinami, které nepřísluší orgánům veterinární správy, tzn. potraviny rostlinného původu, alkoholické nápoje, aditiva, doplňky stravy apod. Tímto dozorem se rozumí kontrola výroby, skladování, přeprava a prodej (i dovoz) výše zmíněných výrobků. SZPI může vydávat opatření k odstranění zjištěných nedostatků, k pozastavení nebo zákazu výroby potraviny, k stáhnutí potraviny z trhu, ke zničení potraviny a k zákazu používání prostor vyúživaných k výrobě kontaminované potraviny. 6.2.6
Krajské hygienické stanice
Krajské hygienické stanice jsou orgány ochrany veřejného zdraví. Tyto orgány vykonávají dozor při poskytování stravovacích služeb a vyšetřují příčiny poškození zdraví z potravin. Mezi jejich pravomoce patří: -
vydávat povolení, osvědčení a plnit úkoly pro ochranu veřejného zdraví,
-
vykonávat dozor nad plněním povinností vyplývajících ze zákonů spravujících problematiku veřejného zdraví,
-
spolu s Ministerstvem zdravotnictví projednávat přestupky vykonané proti ochraně veřejného zdraví,
-
nařizovat, organizovat, řídit i provádět opatření k předcházení vzniku a zamezení šíření infekčních onemocnění, v tomto rozsahu též usměrňuje činnost zdravotnických zařízení a kontroluje ji, určuje zdravotnická zařízení, která opatření provedou,
-
provádět státní zdravotní dozor nad osobní a provozní hygienou v prodejnách a výrobnách potravin, supermarketech, prodejnách drogerie a výrobnách kosmetiky, 50
-
provádět státní zdravotní dozor nad potravinami při výskytu alimentárních onemocnění,
-
provádět zkoušky ověřování znalostí osob činných při výrobě a uvádění potravin a pokrmů do oběhu a při výrobě kosmetických prostředků,
-
vyhlašovat nařízení při epidemii a nebezpečí jejího vzniku, při výskutu nebezpečných výrobků, při živelných pohromách a jiných mimořádných událostech,
-
vydávat povolení k přepravě lidských ostatků osob nakažených nebezpečnou nemocí,
-
jmenovat a odvolávat ředitele Státního zdravotního ústavu (pravomoce hlavního hygienika). Jejich činnost jako činnost orgánů tzv. státního zdravotního dozoru je stanovena
dle zákona č. 552/1991 Sb. 6.2.7
Státní zdravotní ústav
SZÚ je příspěvková organizace Ministerstva zdravotnictví. Jeho pravomoce a povinnosti jsou dány zákonem č. 258/2000 Sb. Tento ústav chrání a podporuje veřejné zdraví, monitoruje vztahy životních podmínek a zdraví a kontroluje kvality služeb k ochraně veřejného zdraví. Dále sleduje a zpracovává dlouhodobé trendy výskytu infekčních a jiných hromadně se vyskytujících onemocnění. Náplní jeho práce je taktéž předcházení vzniku a šíření infekčních onemocnění. Pod jeho záštitou fungují Národní referenční laboratoře a Národní referenční centra, vedoucí těchto institucí jmenuje hlavní hygienik. Tyto instituce se skládají ze specialistů, využívající unikátní postupy k řešení problémů jak v rámci ČR, tak i ve světě. NRL se řadí do různých center. Centrum laboratorních činností v ochraně a podpoře veřejného zdraví, Oddělení analýzy bezpečnosti potravin, obsahuje Národní referenční laboratoř pro listerie v potravinových řetězcích. Tato laboratoř je zaměřena na detailní charakterizaci izolátu L. monocytogenes z člověka, zvířat, z potravin a z prostředí. Vede se zde evidence anamnestických dat k humánním případům listeriové infekce a zpracovávají se zde epidemiologická data pro MZČR. Referenční laboratoř řeší výzkumné projekty, publikuje nové poznatky, přednáší své poznatky v kruhu specialistů, seznamuje s problematikou listeriózy i laickou veřejnost a spolupracuje s mezinárodními institucemi (ECDC, EFSA, WHO, AFSSA). 51
7. Závěr Listeria monocytogenes je všudypřítomný patogen člověka. V průběhu evoluce si osvojila ne málo prostředků, jak přežít nepříznivé podmínky a jak se úspěšně rozmnožovat v lidském těle. Vlastnosti faktorů virulence a její odolnosti jsou stále cílem mnoha studií, stále se přichází na nové poznatky, hlavně v rozmanité funkci jejího klíčového a nejdůležitějšího faktoru virulence listeriolysinu O. Přes tato všechna fakta záleží především na imunitě hostitele, zda a v jaké míře infekce vypukne. Téměř 5% obyvatelstva jsou alespoň jedenkrát za svůj život přenašečem této bakterie, aniž vykazují jakékoliv příznaky. Na druhé straně máme skupiny obyvatelstva, které jsou proti listeriové infekci bezbranné, musí vyhledat lékařskou pomoc. Někdy však případy mohou končit fatálně i po vyhledání lékařské pomoci. Čím je tedy lidské tělo oslabenější, tím více listerie prospívá. V budoucnu je kromě informovanosti a prevence potřeba rychlé, efektivní a zároveň finančně málo náročné metody detekce listerie v klinických vzorcích, která posune úspěšnost léčby kupředu, protože umožní snadnější přístup ke správné diagnostice a k rychlému zahájení léčby. Nezbytným krokem k této metodice je však v prvé řadě nezbytné informovat i samotné lékaře bez specializovaného vzdělání obsahující klinickou mikrobiologii o zvyšující se četnosti záchytu tohoto onemocnění a o zvyšující se perzistenci tohoto bakteriálního druhu, aby toto onemocnění neopomíjeli a brali jej v úvahu i při situacích, kdy listeriózu nepokládají za možný důvod onemocnění pacienta. Nezbytné je také vzdělávat laickou veřejnost o závažnosti tohoto onemocnění. Podle mého názoru počet případů listerióz v České republice vzrostl, protože v minulosti onemocnění listeriózou nebylo tak časté a řešily se onemocnění vyskytující se mnohem častěji způsobené jinými bakteriálními patogeny. Na listerii se tak pozapomnělo. To však byl důležitý okamžik pro její vývoj v tak nebezpečného a perzistentního patogena - byla dlouho dobu bez lidského zásahu a mohla se tak vyvíjet a přizpůsobovat se okolí. I když dozorčí orgány České republiky po vypuknutí epidemie v roce 2006 a 2007 držely situaci pod kontrolou, počet případů listerióz se již nedostal na původní počet alespoň blízký počtu infekcí před rokem 2006. Vysvětlení je více. Je možné, že se výskyt původce listeriózy po výše zmíněné epidemii začal více kontrolovat a případy tohoto onemocnění se poté také zodpovědněji hlásily konkrétním orgánům. Další možné vysvětlení pramení v získané odolnosti diskutované výše.
52
V následujících letech je pravděpodobné zvýšení počtu případů listeriózy. V dnešní uspěchané společnosti čím dál tím více osob trpí stresem a čím dál tím více osob se uchyluje k použití potravin k přímé spotřebě. Proto se tyto potraviny vyrábí ve větším množství a v pestrém složení. V polotovarech a lahůdkách se listerii daří obzvláště dobře a má dostatek času potřebného k pomnožení nad svou infekční dávku. Tyto potraviny jsou sice určeny k přímé spotřebě, ale poskytují dobu dostatečně dlouhou pro pomnožení této nebezpečné bakterie. Dalším důvodem je zvyšující se věková hranice populace, tedy vyšší počet starších osob v naší společnosti, a právě oni patří mezi rizikové skupiny onemocnění listeriózou. Vzhledem ke skutečnostem uvedeným výše, listerióza tedy není vážným problémem pouze posledních několika let, ale také alarmujícím ohrožením lidského zdraví pro roky příští. Faktory virulence a adaptace tohoto mikroorganismu jsou jednou stranou problému, druhou, ovlivnitelnější, je informovanost společnosti, která by měla být intenzivněji podporována příslušnými pracovišti, dále v textu práce zmíněná korelace bezpečnosti potravin v naší zemi, tedy prevence výskytu původce onemocnění. Možné je také ovlivnit ostražitost diagnostikujících lékařů vůči případné listerióze a vývoj rychlejších a spolehlivějších metod záchytu tohoto patogena a jeho identifikace.
53
8. Literatura 8.1 Seznam použité literatury Alessandria, V., Rantsiou, K., Dolci, P., Cocolin, L., 2010. Molecular methods to assess Listeria monocytogenes route of contamination in a dairy processing plant. Int. J. Food Microbiol. 141 Suppl 1, S156–162. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.02.001 Ampel, N.M., Bejarano, G.C., Saavedra, M., Jr, 1992. Deferoxamine increases the susceptibility of beta-thalassemic, iron-overloaded mice to infection with Listeria monocytogenes. Life Sci. 50, 1327–1332. Annous, B.A., Becker, L.A., Bayles, D.O., Labeda, D.P., Wilkinson, B.J., 1997. Critical role of anteiso-C15:0 fatty acid in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3887–3894. Arnett, E., Vadia, S., Nackerman, C.C., Oghumu, S., Satoskar, A.R., McLeish, K.R., Uriarte, S.M., Seveau, S., 2014. The pore-forming toxin listeriolysin O is degraded by neutrophil metalloproteinase-8 and fails to mediate Listeria monocytogenes intracellular survival in neutrophils. J. Immunol. Baltim. Md 1950 192, 234–244. doi:10.4049/jimmunol.1301302 Aureli, P., Di Cunto, M., Maffei, A., De Chiara, G., Franciosa, G., Accorinti, L., Gambardella, A.M., Greco, D., 2000. An outbreak in Italy of botulism associated with a dessert made with mascarpone cream cheese. Eur. J. Epidemiol. 16, 913–918. Aznar, R., Alarcón, B., 2002. On the specificity of PCR detection of Listeria monocytogenes in food: a comparison of published primers. Syst. Appl. Microbiol. 25, 109–119. doi:10.1078/0723-2020-00079 Baldassarre, J.S., Ingerman, M.J., Nansteel, J., Santoro, J., 1991. Development of Listeria meningitis during vancomycin therapy: a case report. J. Infect. Dis. 164, 221–222. Banwo, K., Sanni, A., Tan, H., 2013. Technological properties and probiotic potential of Enterococcus faecium strains isolated from cow milk. J. Appl. Microbiol. 114, 229–241. doi:10.1111/jam.12031 Becroft, D.M., Farmer, K., Seddon, R.J., Sowden, R., Stewart, J.H., Vines, A., Wattie, D.A., 1971. Epidemic listeriosis in the newborn. Br. Med. J. 3, 747–751. Bertsch, D., Rau, J., Eugster, M.R., Haug, M.C., Lawson, P.A., Lacroix, C., Meile, L., 2013. Listeria fleischmannii sp. nov., isolated from cheese. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 526–532. doi:10.1099/ijs.0.036947-0 Blatt, S.P., Zajac, R.A., 1991. Treatment of Listeria bacteremia with vancomycin. Rev. Infect. Dis. 13, 181–182.
54
Bonacorsi, S., Doit, C., Aujard, Y., Blot, P., Bingen, E., 1993. Successful antepartum treatment of listeriosis with vancomycin plus netilmicin. Clin. Infect. Dis. Off. Publ. Infect. Dis. Soc. Am. 17, 139–140. Brychta, J., Bulawová, H., Klímová, E., 2011. Frekvence výskytu Listeria monocytogenes v potravinách. Veterinářství 8/2011, 458-461. Buncic, S., Avery, S.M., Rocourt, J., Dimitrijevic, M., 2001. Can food-related environmental factors induce different behaviour in two key serovars, 4b and 1/2a, of Listeria monocytogenes? Int. J. Food Microbiol. 65, 201–212. Chakraborty, T., Leimeister-Wächter, M., Domann, E., Hartl, M., Goebel, W., Nichterlein, T., Notermans, S., 1992. Coordinate regulation of virulence genes in Listeria monocytogenes requires the product of the prfA gene. J. Bacteriol. 174, 568–574. Charpentier, E., Courvalin, P., 1999. Antibiotic resistance in Listeria spp. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 2103–2108. Charpentier, E., Gerbaud, G., Jacquet, C., Rocourt, J., Courvalin, P., 1995. Incidence of antibiotic resistance in Listeria species. J. Infect. Dis. 172, 277–281. Cherubin, C.E., Appleman, M.D., Heseltine, P.N., Khayr, W., Stratton, C.W., 1991. Epidemiological spectrum and current treatment of listeriosis. Rev. Infect. Dis. 13, 1108– 1114. Cocolin, L., Foschino, R., Comi, G., Grazia Fortina, M., 2007. Description of the bacteriocins produced by two strains of Enterococcus faecium isolated from Italian goat milk. Food Microbiol. 24, 752–758. doi:10.1016/j.fm.2007.03.001 Collins, M.D., Wallbanks, S., Lane, D.J., Shah, J., Nietupski, R., Smida, J., Dorsch, M., Stackebrandt, E., 1991. Phylogenetic analysis of the genus Listeria based on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 240–246. Cossart, P., 2001. Met, the HGF-SF receptor: another receptor for Listeria monocytogenes. Trends Microbiol. 9, 105–107. Den Bakker, H.C., Manuel, C.S., Fortes, E.D., Wiedmann, M., Nightingale, K.K., 2013. Genome sequencing identifies Listeria fleischmannii subsp. coloradonensis subsp. nov., isolated from a ranch. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 3257–3268. doi:10.1099/ijs.0.048587-0 Dons, L., Rasmussen, O.F., Olsen, J.E., 1992. Cloning and characterization of a gene encoding flagellin of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 6, 2919–2929. Doumith, M., Buchrieser, C., Glaser, P., Jacquet, C., Martin, P., 2004. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 42, 3819–3822. doi:10.1128/JCM.42.8.3819-3822.2004 Dussurget, O., Cabanes, D., Dehoux, P., Lecuit, M., Buchrieser, C., Glaser, P., Cossart, P., European Listeria Genome Consortium, 2002. Listeria monocytogenes bile salt hydrolase is a PrfA-regulated virulence factor involved in the intestinal and hepatic phases of listeriosis. Mol. Microbiol. 45, 1095–1106. 55
Errebo Larsen H., Seeliger H. P. R., 1966. Presented at the Proceedings of the 3rd International Symposium on Listeriosis, Biltoven, The Netherlands. Farber, J.M., Daley, E., Coates, F., Beausoleil, N., Fournier, J., 1991a. Feeding trials of Listeria monocytogenes with a nonhuman primate model. J. Clin. Microbiol. 29, 2606– 2608. Farber, J.M., Peterkin, P.I., Carter, A.O., Varughese, P.V., Ashton, F.E., Ewan, E.P., 1991b. Neonatal listeriosis due to cross-infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting. J. Infect. Dis. 163, 927–928. Ferreira, L., Sánchez-Juanes, F., Muñoz-Bellido, J.L., González-Buitrago, J.M., 2011. Rapid method for direct identification of bacteria in urine and blood culture samples by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: intact cell vs. extraction method. Clin. Microbiol. Infect. Off. Publ. Eur. Soc. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 17, 1007–1012. doi:10.1111/j.1469-0691.2010.03339.x Fiedler, F., Seger, J., Schrettenbrunner, A., Seeliger, H.P.R., 1984. The biochemistry of murein and cell wall teichoic acids in the genus Listeria. Syst. Appl. Microbiol. 5, 360– 376. doi:10.1016/S0723-2020(84)80038-7 Flamm, R.K., Hinrichs, D.J., Thomashow, M.F., 1984. Introduction of pAM beta 1 into Listeria monocytogenes by conjugation and homology between native L. monocytogenes plasmids. Infect. Immun. 44, 157–161. Gekara, N.O., Zietara, N., Geffers, R., Weiss, S., 2010. Listeria monocytogenes induces T cell receptor unresponsiveness through pore-forming toxin listeriolysin O. J. Infect. Dis. 202, 1698–1707. doi:10.1086/657145 Gelbíčová, T., Karpíšková, R., 2009. Occurrence and characteristics of Listeria monocytogenes in ready-to-eat food from retail market in the Czech Republic. Czech J. Food Sci. Gellin, B.G., Broome, C.V., 1989. Listeriosis. JAMA J. Am. Med. Assoc. 261, 1313– 1320. Gianfranceschi, M., Gattuso, A., Tartaro, S., Aureli, P., 2003. Incidence of Listeria monocytogenes in food and environmental samples in Italy between 1990 and 1999: serotype distribution in food, environmental and clinical samples. Eur. J. Epidemiol. 18, 1001–1006. Glaser, P., Frangeul, L., Buchrieser, C., Rusniok, C., Amend, A., Baquero, F., Berche, P., Bloecker, H., Brandt, P., Chakraborty, T., Charbit, A., Chetouani, F., Couvé, E., de Daruvar, A., Dehoux, P., Domann, E., Domínguez-Bernal, G., Duchaud, E., Durant, L., Dussurget, O., Entian, K.D., Fsihi, H., García-del Portillo, F., Garrido, P., Gautier, L., Goebel, W., Gómez-López, N., Hain, T., Hauf, J., Jackson, D., Jones, L.M., Kaerst, U., Kreft, J., Kuhn, M., Kunst, F., Kurapkat, G., Madueno, E., Maitournam, A., Vicente, J.M., Ng, E., Nedjari, H., Nordsiek, G., Novella, S., de Pablos, B., Pérez-Diaz, J.C., Purcell, R., Remmel, B., Rose, M., Schlueter, T., Simoes, N., Tierrez, A., Vázquez-Boland, J.A., Voss, H., Wehland, J., Cossart, P., 2001. Comparative genomics of Listeria species. Science 294, 849–852. doi:10.1126/science.1063447 56
Graves, L.M., Helsel, L.O., Steigerwalt, A.G., Morey, R.E., Daneshvar, M.I., Roof, S.E., Orsi, R.H., Fortes, E.D., Milillo, S.R., Bakker, H.C. den, Wiedmann, M., Swaminathan, B., Sauders, B.D., 2010. Listeria marthii sp. nov., isolated from the natural environment, Finger Lakes National Forest. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 1280–1288. doi:10.1099/ijs.0.014118-0 Graves, L.M., Swaminathan, B., Hunter, S.B., Ryser, E.T., Marth, E.H., 2007. Subtyping Listeria monocytogenes. FOOD Sci. Technol.-N. Y.-MARCEL DEKKER- 161, 283. Hadorn, K., Hächler, H., Schaffner, A., Kayser, F.H., 1993. Genetic characterization of plasmid-encoded multiple antibiotic resistance in a strain of Listeria monocytogenes causing endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Off. Publ. Eur. Soc. Clin. Microbiol. 12, 928–937. Hamon, M.A., Cossart, P., 2011. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infect. Immun. 79, 2839–2846. doi:10.1128/IAI.01243-10 Hamon, M.A., Ribet, D., Stavru, F., Cossart, P., 2012. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends Microbiol. 20, 360–368. doi:10.1016/j.tim.2012.04.006 Hong, E., Doumith, M., Duperrier, S., Giovannacci, I., Morvan, A., Glaser, P., Buchrieser, C., Jacquet, C., Martin, P., 2007. Genetic diversity of Listeria monocytogenes recovered from infected persons and pork, seafood and dairy products on retail sale in France during 2000 and 2001. Int. J. Food Microbiol. 114, 187–194. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2006.09.011 Hooper, D.C., Pruitt, A.A., Rubin, R.H., 1982. Central nervous system infection in the chronically immunosuppressed. Medicine (Baltimore) 61, 166–188. Iun-Fan Lei; Roffey, Paul; Blanchard, Chris; Gu, Ken, 2010. 6. Development of a Multiplex PCR Method for the Detection of Six Common Foodborne Pathogens [WWW Document]. URL http://www.fda.gov.tw/EN/publishJFDAListContent.aspx?id=421&chk=7c36d7c3-bd994fb9-afb8-b47dd5abebba¶m=pn%3D50%26cid%3D%26subcid%3D (accessed 4.27.14). Jadhav, S., Sevior, D., Bhave, M., Palombo, E.A., 2014. Detection of Listeria monocytogenes from selective enrichment broth using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Proteomics 97, 100–106. doi:10.1016/j.jprot.2013.09.014 Jeffers, G.T., Bruce, J.L., McDonough, P.L., Scarlett, J., Boor, K.J., Wiedmann, M., 2001. Comparative genetic characterization of Listeria monocytogenes isolates from human and animal listeriosis cases. Microbiol. Read. Engl. 147, 1095–1104. Jeyaletchumi,P., Tunung,R., Margaret, S.P., Son,R., Farinazleen,M.G., Cheah, Y.K.,2010.Detection of Listeria monocytogenes in foods. Int. Food Res. J. 17, 1-11. Kayal, S., Charbit, A., 2006. Listeriolysin O: a key protein of Listeria monocytogenes with multiple functions. FEMS Microbiol. Rev. 30, 514–529. doi:10.1111/j.15746976.2006.00021.x 57
Kayser, F.H., 2003. Safety aspects of enterococci from the medical point of view. Int. J. Food Microbiol. 88, 255–262. Lang Halter, E., Neuhaus, K., Scherer, S., 2013. Listeria weihenstephanensis sp. nov., isolated from the water plant Lemna trisulca taken from a freshwater pond. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 641–647. doi:10.1099/ijs.0.036830-0 Larsson, S., Linell, F., 1979. Correlations between clinical and postmortem findings in listeriosis. Scand. J. Infect. Dis. 11, 55–58. Lebrun, M., Audurier, A., Cossart, P., 1994. Plasmid-borne cadmium resistance genes in Listeria monocytogenes are present on Tn5422, a novel transposon closely related to Tn917. J. Bacteriol. 176, 3049–3061. Leclercq, A., Clermont, D., Bizet, C., Grimont, P.A.D., Flèche-Matéos, A.L., Roche, S.M., Buchrieser, C., Cadet-Daniel, V., Monnier, A.L., Lecuit, M., Allerberger, F., 2010. Listeria rocourtiae sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 2210–2214. doi:10.1099/ijs.0.017376-0 Liu, D., 2006. Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. J. Med. Microbiol. 55, 645–659. doi:10.1099/jmm.0.46495-0 Lorber, B., 1990. Clinical listriosis-implications for pathogenesis.New York: Elsevier, eds. Foodborne Listeriosis. 41-9. Lorber, B., 1997. Listeriosis. Clin. Infect. Dis. Off. Publ. Infect. Dis. Soc. Am. 24, 1–9; quiz 10–11. Lorber, B., Santoro, J., Swenson, R.M., 1975. Letter: Listeria meningitis during cefazolin therapy. Ann. Intern. Med. 82, 226. Lukinmaa, S., Miettinen, M., Nakari, U.-M., Korkeala, H., Siitonen, A., 2003. Listeria monocytogenes isolates from invasive infections: variation of sero- and genotypes during an 11-year period in Finland. J. Clin. Microbiol. 41, 1694–1700. MacGowan, A.P., 1990. Listeriosis--the therapeutic options. J. Antimicrob. Chemother. 26, 721–722. May, R.C., Hall, M.E., Higgs, H.N., Pollard, T.D., Chakraborty, T., Wehland, J., Machesky, L.M., Sechi, A.S., 1999. The Arp2/3 complex is essential for the actin-based motility of Listeria monocytogenes. Curr. Biol. 9, 759–762. doi:10.1016/S09609822(99)80337-6 McLauchlin, J., Hampton, M.D., Shah, S., Threlfall, E.J., Wieneke, A.A., Curtis, G.D., 1997. Subtyping of Listeria monocytogenes on the basis of plasmid profiles and arsenic and cadmium susceptibility. J. Appl. Microbiol. 83, 381–388. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J.A., Milon, G., Cossart, P., 1991. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Mol. Microbiol. 5, 2273–2283. 58
Mielke, M.E., Peters, C., Hahn, H., 1997. Cytokines in the induction and expression of Tcell-mediated granuloma formation and protection in the murine model of listeriosis. Immunol. Rev. 158, 79–93. Murray, E.G.D., Webb, R.A., Swann, M.B.R., 1926. A disease of rabbits characterised by a large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n.sp.). J. Pathol. Bacteriol. 29, 407–439. doi:10.1002/path.1700290409 Nadon, C.A., Woodward, D.L., Young, C., Rodgers, F.G., Wiedmann, M., 2001. Correlations between molecular subtyping and serotyping of Listeria monocytogenes. J. Clin. Microbiol. 39, 2704–2707. doi:10.1128/JCM.39.7.2704-2707.2001 Nieman, R.E., Lorber, B., 1980. Listeriosis in adults: a changing pattern. Report of eight cases and review of the literature, 1968-1978. Rev. Infect. Dis. 2, 207–227. Palmer, M., Harris, R., Freytag, C., Kehoe, M., Tranum-Jensen, J., Bhakdi, S., 1998. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. EMBO J. 17, 1598–1605. doi:10.1093/emboj/17.6.1598 Parihar, V.S., Lopez-Valladares, G., Danielsson-Tham, M.-L., Peiris, I., Helmersson, S., Unemo, M., Andersson, B., Arneborn, M., Bannerman, E., Barbuddhe, S., Bille, J., Hajdu, L., Jacquet, C., Johansson, C., Löfdahl, M., Möllerberg, G., Ringberg, H., Rocourt, J., Tjernberg, I., Ursing, J., Henriques-Normark, B., Tham, W., 2008. Characterization of human invasive isolates of Listeria monocytogenes in Sweden 1986-2007. Foodborne Pathog. Dis. 5, 755–761. doi:10.1089/fpd.2008.0123 Parisi, A., Latorre, L., Normanno, G., Miccolupo, A., Fraccalvieri, R., Lorusso, V., Santagada, G., 2010. Amplified Fragment Length Polymorphism and Multi-Locus Sequence Typing for high-resolution genotyping of Listeria monocytogenes from foods and the environment. Food Microbiol. 27, 101–108. doi:10.1016/j.fm.2009.09.001 Pérez-Díaz, J.C., Vicente, M.F., Baquero, F., 1982. Plasmids in Listeria. Plasmid 8, 112– 118. Piffaretti, J.C., Kressebuch, H., Aeschbacher, M., Bille, J., Bannerman, E., Musser, J.M., Selander, R.K., Rocourt, J., 1989. Genetic characterization of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causing epidemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 3818–3822. Pistor, S., Chakraborty, T., Walter, U., Wehland, J., 1995. The bacterial actin nucleator protein ActA of Listeria monocytogenes contains multiple binding sites for host microfilament proteins. Curr. Biol. CB 5, 517–525. Poyart-Salmeron, C., Carlier, C., Trieu-Cuot, P., Courtieu, A.L., Courvalin, P., 1990. Transferable plasmid-mediated antibiotic resistance in Listeria monocytogenes. Lancet 335, 1422–1426. Pron, B., Boumaila, C., Jaubert, F., Sarnacki, S., Monnet, J.P., Berche, P., Gaillard, J.L., 1998. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747–755. 59
Quentin, C., Thibaut, M.C., Horovitz, J., Bebear, C., 1990. Multiresistant strain of Listeria monocytogenes in septic abortion. Lancet 336, 375. Rácz, P., Tenner, K., Mérö, E., 1972. Experimental Listeria enteritis. I. An electron microscopic study of the epithelial phase in experimental listeria infection. Lab. Investig. J. Tech. Methods Pathol. 26, 694–700. Rácz, P., Tenner, K., Szivessy, K., 1970. Electron microscopic studies in experimental keratoconjunctivitis listeriosa. I. Penetration of Listeria monocytogenes into corneal epithelial cells. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17, 221–236. Riedo, F.X., Pinner, R.W., Tosca, M.L., Cartter, M.L., Graves, L.M., Reeves, M.W., Weaver, R.E., Plikaytis, B.D., Broome, C.V., 1994. A point-source foodborne listeriosis outbreak: documented incubation period and possible mild illness. J. Infect. Dis. 170, 693–696. Roccourt, J., Grimont, F., Grimont, P.A.D., Seeliger, H.P.R., 1982. DNA relatedness among serovars ofListeria monocytogenes sensu lato. Curr. Microbiol. 7, 383–388. doi:10.1007/BF01572609 Rocourt, J., Grimont, P. a. D., 1983. Notes: Listeria welshimeri sp. nov. and Listeria seeligeri sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 33, 866–869. doi:10.1099/00207713-33-4-866 Schaffter, N., Zumstein, J., Parriaux, A., 2004. Factors Influencing the Bacteriological Water Quality in Mountainous Surface and Groundwaters. Acta Hydrochim. Hydrobiol. 32, 225–234. doi:10.1002/aheh.200300532 Schuckken, Y.H., Grohn, Y.T., Wiedmann, M., 2003. Listeria monocytogenes, epidemiology of listeriosis. In: Torrence, M.E., Isaacson, R.E. (Eds), Mic.Food Saf.in Anim. Agricul.:Current topics. Schuerch, D.W., Wilson-Kubalek, E.M., Tweten, R.K., 2005. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 12537–12542. doi:10.1073/pnas.0500558102 Sechi, A.S., Wehland, J., Small, J.V., 1997. The isolated comet tail pseudopodium of Listeria monocytogenes: a tail of two actin filament populations, long and axial and short and random. J. Cell Biol. 137, 155–167. Seeliger, H. P. R. 1958. Listeriosen. Springer-Verlag KG, Berlin. Seeliger, H.P., 1981. [Nonpathogenic listeriae: L. innocua sp. n. (Seeliger et Schoofs, 1977) (author’s transl)]. Zentralblatt Für Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. Med. Mikrobiol. Infekt. Parasitol. Int. J. Microbiol. Hyg. Med. Microbiol. Infect. Parasitol. 249, 487–493. Seeliger, H.P., Rocourt, J., Schrettenburnner, A., Grimont, P.A., Jones, D., 1984. Notes: Listeria ivanovii sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 34, 336–337. Seng, P., Rolain, J.-M., Fournier, P.E., La Scola, B., Drancourt, M., Raoult, D., 2010. MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical microbiology. Future Microbiol. 5, 1733–1754. doi:10.2217/fmb.10.127 60
Sheikh-Zeinoddin, M., Perehinec, T.M., Hill, S.E., Rees, C.E., 2000. Maillard reaction causes suppression of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 61, 41–49. Siegman-Igra, Y., Levin, R., Weinberger, M., Golan, Y., Schwartz, D., Samra, Z., Konigsberger, H., Yinnon, A., Rahav, G., Keller, N., Bisharat, N., Karpuch, J., Finkelstein, R., Alkan, M., Landau, Z., Novikov, J., Hassin, D., Rudnicki, C., Kitzes, R., Ovadia, S., Shimoni, Z., Lang, R., Shohat, T., 2002. Listeria monocytogenes infection in Israel and review of cases worldwide. Emerg. Infect. Dis. 8, 305–310. doi:10.3201/eid0803.010195 Theriot, J.A., Mitchison, T.J., Tilney, L.G., Portnoy, D.A., 1992. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature 357, 257–260. doi:10.1038/357257a0 Threlfall, E.J., Skinner, J.A., McLauchlin, J., 1998. Antimicrobial resistance in Listeria monocytogenes from humans and food in the UK, 1967--96. Clin. Microbiol. Infect. Off. Publ. Eur. Soc. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 4, 410–412. Tweten, R.K., Parker, M.W., Johnson, A.E., 2001. The cholesterol-dependent cytolysins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 257, 15–33. Tyler, K.D., Wang, G., Tyler, S.D., Johnson, W.M., 1997. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. J. Clin. Microbiol. 35, 339–346. Ueda, S., Kuwabara, Y., 2010. Evaluation of an enzyme-linked fluorescent assay for the detection of Listeria monocytogenes from food. Biocontrol Sci. 15, 91–95. Vázquez-Boland, J.A., Kuhn, M., Berche, P., Chakraborty, T., Domínguez-Bernal, G., Goebel, W., González-Zorn, B., Wehland, J., Kreft, J., 2001. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 14, 584–640. doi:10.1128/CMR.14.3.584-640.2001 Vicente, M.F., Baquero, F., Pérez-Diaz, J.C., 1988. Conjugative acquisition and expression of antibiotic resistance determinants in Listeria spp. J. Antimicrob. Chemother. 21, 309–318. doi:10.1093/jac/21.3.309 Villanueva, M.S., Sijts, A.J., Pamer, E.G., 1995. Listeriolysin is processed efficiently into an MHC class I-associated epitope in Listeria monocytogenes-infected cells. J. Immunol. Baltim. Md 1950 155, 5227–5233. Visintine, A.M., Oleske, J.M., Nahmias, A.J., 1977. Infection in infants and children. Am. J. Dis. Child. 1960 131, 393–397. Vlaemynck, G., Lafarge, V., Scotter, S., 2000. Improvement of the detection of Listeria monocytogenes by the application of ALOA, a diagnostic, chromogenic isolation medium. J. Appl. Microbiol. 88, 430–441. Wadud, S., Leon-Velarde, C.G., Larson, N., Odumeru, J.A., 2010. Evaluation of immunomagnetic separation in combination with ALOA Listeria chromogenic agar for the 61
isolation and identification of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. J. Microbiol. Methods 81, 153–159. doi:10.1016/j.mimet.2010.02.014 Ward, T.J., Ducey, T.F., Usgaard, T., Dunn, K.A., Bielawski, J.P., 2008. Multilocus genotyping assays for single nucleotide polymorphism-based subtyping of Listeria monocytogenes isolates. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7629–7642. doi:10.1128/AEM.01127-08 Weis, J., Seeliger, H.P., 1975. Incidence of Listeria monocytogenes in nature. Appl. Microbiol. 30, 29–32. Wendlinger, G., Loessner, M.J., Scherer, S., 1996. Bacteriophage receptors on Listeria monocytogenes cells are the N-acetylglucosamine and rhamnose substituents of teichoic acids or the peptidoglycan itself. Microbiol. Read. Engl. 142 ( Pt 4), 985–992. Whittam, T.S., Bergholz, T.M., 2007. Molecular subtyping, source tracking, and food safety. In: Santo Domingo, J.W., Sadowsky, M.J. (Eds), Microbial Source Tracking. ASM Press, Washington. Wiedmann, M., 2002. Molecular subtyping methods for Listeria monocytogenes. J. AOAC Int. 85, 524–531. Wiedmann, M., Bruce, J.L., Keating, C., Johnson, A.E., McDonough, P.L., Batt, C.A., 1997. Ribotypes and virulence gene polymorphisms suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences in pathogenic potential. Infect. Immun. 65, 2707–2716. Zaytseva, E., Ermolaeva, S., Somov, G.P., 2007. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from wild animals in the far east of Russia. Infect. Genet. Evol. J. Mol. Epidemiol. Evol. Genet. Infect. Dis. 7, 736– 742. doi:10.1016/j.meegid.2007.07.006
8.2 Seznam internetových zdrojů (všechny internetové zdroje dostupné online ke dni 26. 4. 2014)
1. List of prokaryotic names with standing in nomeclature [http://www.bacterio.net/listeria.html] 2. Zpravodaj Centra MPI [http://www.zuova.cz/Content/files/zpravodaj_ckl/zpravodajmpi200703.pdf] 3. SZÚ [http://www.szu.cz/uploads/LB/Vyrocni_zprava_NRL/Vyrocni_zprava_NRP_2011.pd f] [http://www.szu.cz/publikace/data/vybrane-infekcni-nemoci-v-cr-v-letech-2003-2012absolutne?highlightWords=listeri%C3%B3za] [http://www.szu.cz/poslani-ustavu] [http://www.szu.cz/narodni-referencni-laborator-pro-listerie-v-potravinovych] 4. Micreos Food Safety [http://micreosfoodsafety.com/en/listex-productdata.aspx] 62
5. Foodnet [http://foodnet.cz/polozka/?jmeno=Listerie+u%C5%BE+byla+nalezena+v+sal%C3% A1tech+i+masn%C3%BDch+v%C3%BDrobc%C3%ADch&id=11596] [http://www.foodnet.cz/polozka/?jmeno=MZ%3A+Epidemii+listeri%C3%B3zy+zp% C5%AFsobil+z%C5%99ejm%C4%9B+jeden+zdroj&id=11916] 6. SZPI [http://www.szpi.gov.cz/fullTextSearch.aspx?snew=true&nid=&searchNow=1&as_q= listerie&as_epq=&as_oq=&as_eq=&searchFolder=11294&vyhledat=Vyhledat] 7. MZČR [http://www.mzcr.cz/dokumenty/tiskova-konference-onemocneni-listeriozoukomplexni-informace-o-vyskytu-a-opatrenich-na-zabraneni-dalsihosireni_852_871_1.html] [http://www.mzcr.cz/dokumenty/dulezite-informace-k-listerioze_871_872_1.html] 8. EFSA [http://www.efsa.europa.eu/en/corporate/doc/factsheetlisteria2014_en.pdf] 9. Bezpečnost potravin [http://bezpecnostpotravin.cz/stranka/system-rychleho-varovani-pro-potraviny-akrmiva-(rasff).aspx] 10. MVDr. Jaroslav Palásek, CSc. Bezpečnost potravin, 2001 [http://www.eposcr.eu/wp-content/uploads/2011/04/Bezpe%C4%8Dnostpotravin.pdf] 11. MZE [http://eagri.cz/public/web/mze/ministerstvo-zemedelstvi/o-ministerstvu/] 12. SVS [http://eagri.cz/public/web/svs/portal/zakladni-informace/]
8.3 Zdroje grafických příloh (všechny grafické přílohy dostupné online ke dni 26. 4. 2014) 1. Grafy Graf 1. Micreos Food Safety, [http://micreosfoodsafety.com/en/listex-productdata.aspx] Graf 2. a Graf 3. MZČR, Tisková konference, 2007, soubor listerióza_TK [http://www.mzcr.cz/dokumenty/tiskova-konference-onemocneni-listeriozou-komplexniinformace-o-vyskytu-a-opatrenich-na-zabraneni-dalsiho-sireni_852_871_1.html] 2. Obrázky Obr. 1 a Obr. 2 Listerie monocytogenes- původce listeriózy, Zpravodaj Centra MPI, 2007 [http://www.zuova.cz/Content/files/zpravodaj_ckl/zpravodajmpi200703.pdf] Obr. 4 ENA/VASP proteins: multifunctional regulators of actin cytoskeletondynamics, Frontiers on Bioscience 9, 2004 [http://www.bioscience.org/2004/v9/af/1324/fulltext.php?bframe=figures.htm] Obr. 5 Cell biology of the infection by Listeria monocytogenes, Institut Pasteur [http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/en/research/scientific-departments/cell-biologyand-infection/units-and-groups/bacteria-cell-interactions/images] 63
Obr. 6 Detection of Listeria monocytogenes from selective enrichment brothsusing MALDI-TOF mass spektrometr, Journal of proteomics 2014 [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391913004806] Obr. 7 MZČR, Tisková konference, 2007, soubor listerioza_TK [http://www.mzcr.cz/dokumenty/tiskova-konference-onemocneni-listeriozou-komplexniinformace-o-vyskytu-a-opatrenich-na-zabraneni-dalsiho-sireni_852_871_1.html] Obr. 8 MVDr. Jaroslav Palásek, CSc. Bezpečnost potravin, 2001 [http://www.eposcr.eu/wp-content/uploads/2011/04/Bezpe%C4%8Dnost-potravin.pdf] 3. Tabulky Tabulka 2. Vera, A., González, G., Domínguez, M., Bello, H., 2013. [Main virulence factors of Listeria monocytogenes and its regulation]. Rev. Chil. Infectol. Órgano Of. Soc. Chil. Infectol. 30, 407–416. doi:10.4067/S0716-10182013000400010 Tabulka 4. Jadhav, S., Bhave, M., Palombo, E.A., 2012. Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes. J. Microbiol. Methods 88, 327–341. doi:10.1016/j.mimet.2012.01.002 Tabulka 5. Nařízení Komise ES č. 1441/2007 [www.fulsoft.cz] Tabulka 6. Scientific committee on veterinary measures relating to public health, European comission, 1999 [http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scv/out25_en.pdf] Tabulka 7. Brychta, J., Bulawová, H., Klímová, E., 2011. Frekvence výskytu Listeria monocytogenes v potravinách. Veterinářství 8/2011, 458-461. Tabulka 8. MZČR, Tisková konference, 2007, soubor listerioza_TK [http://www.mzcr.cz/dokumenty/tiskova-konference-onemocneni-listeriozou-komplexniinformace-o-vyskytu-a-opatrenich-na-zabraneni-dalsiho-sireni_852_871_1.html] Tabulka 9. Vybrané infekční nemoci v ČR v letech 2004-2013, SZÚ [http://www.szu.cz/publikace/data/vybrane-infekcni-nemoci-v-cr-v-letech-2003-2012absolutne?highlightWords=listeri%C3%B3za]
8.4 Zákony (dostupné online na www.fulsoft.cz ke dni 26. 4. 2014) 1. nařízení Komise ES č. 1441/2007 2. nařízení Komise ES 178/2002 64
3. 166-1999 Sb., Zákon o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon) 4. 146-2002 Sb., Zákon o Státní zemědělské a potravinářské inspekci a o změně některých souvisejících zákonů 5. 258/2000 Sb., Zákon o ochraně veřejného zdraví
8.5 Knižní zdroje Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology - Volume 3, 2009. Vos De P., Garrity M.G., Jones D., Krieg R.N., Ludwig W., Rainey A.F., Whitman B.W., Schleifer K. Lékařská mikrobiologie obecná, 2. vydání, 2005. Votava M.
65
