MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
Alena REKOVÁ
VYUŽITÍ MUTANTŮ A ANALÝZY GENOVÉ EXPRESE PRO STUDIUM INTERAKCÍ CYTOKININŮ A SVĚTLA V REGULACI DLOUŽIVÉHO RŮSTU HYPOKOTYLŮ SEMENÁČKŮ ARABIDOPSIS THALIANA
Disertační práce
Školitel: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
Brno, 2010
Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Alena Reková Název disertační práce:
Využití mutantů a analýzy genové exprese pro studium interakcí cytokininů a světla v regulaci dlouživého růstu hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana
Název disertační práce anglicky:
Utilization of mutants and gene expression analyses to investigate cytokinin-light interactions in the regulation of hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana seedlings
Studijní program: Biologie Studijní obor (směr), kombinace oborů: Obecná a molekulární genetika Školitel:
prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
Rok obhajoby:
2010
Klíčová slova v češtině:
Arabidopsis thaliana, cytokininy, dlouživý růst hypokotylu, fotomorfogeneze, skotomorfogeneze, cytokininová signalizace
Klíčová slova v angličtině:
Arabidopsis thaliana, cytokinins, hypocotyl elongation, photomorphogenesis, scotomorphogenesis, cytokinin signaling
© Alena Reková, Masarykova univerzita, 2010
Poděkování: Moje upřímné poděkování patří v prvé řadě mému školiteli prof. RNDr. Břetislavu Brzobohatému, CSc., za jeho odborné vedení a především čas, který věnoval diskuzím nezbytným ke směrování experimentů prezentovaných v této práci a k jejich co nejefektivnějšímu přínosu. Můj dík patří i všem mým kolegům z naší laboratoře, především za vytvoření přátelského pracovního prostředí a jejich psychickou podporu, a zejména pak Přemkovi Součkovi, za poskytnutí zkušeností s technikou RT-qPCT a nezanedbatelný experimentální
příspěvek
k problematice
kvantifikace
transkriptů
cytokininových
molekulárních markerů. V neposlední řadě jsem vděčná za podporu, motivaci a energii při vypracování této práce od svých nejbližších přátel a rodiny.
ABSTRAKT Doposud bylo popsáno, že cytokininy (CK) nemají žádný vliv na dlouživý růst hypokotylů u semenáčků Arabidopsis thaliana rostoucích na bílém světle a údajně CK stimulují dlouživý růst hypokotylů na bílém světle, když je zabráněno působení etylénu nebo je blokován transport auxinů. Detailněji byl v práci přezkoumán vliv CK na prodlužování hypokotylů u A. thaliana. Zatímco byl pozorován pouze nepatrný vliv CK na prodlužování hypokotylů při standardní intenzitě světla (80 μmol fotonů m-2 s-1), při nízké světelné intenzitě (20 μmol fotonů m-2 s-1) se projevila výrazná stimulace v prodlužování hypokotylů po aplikaci CK. Vliv CK na délku hypokotylů byl způsoben prodlužováním buněk. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů byla pozorována pro všechny čtyři základní typy CK (t-Z, iP, BA, TDZ) a byla koncentračně závislá v nano-molárním rozsahu. Stimulační efekt CK byl potlačen při současné aplikaci antagonisty CK PI-55. Analýza mutantů a transgenních rostlin ukázala, že kanonická dvou-komponentní dráha odpovědi je nezbytná pro tento proces s převažující účastí cytokininových receptorů AHK2 a AHK3. Tento vliv CK byl nezávislý na etylénové signalizaci a částečně inhibován IAA. Naproti tomu, byla pozorovaná inhibice prodlužování hypokotylů způsobená CK při nízké intenzitě červeného světla (20 μmol fotonů m-2 s-1). Analýza mutantů ukázala, že tento efekt je zprostředkován cytokininovým receptorem AHK3.
Dissertation Abstract Cytokinins (CKs) were reported not to affect hypocotyl elongation in Arabidopsis seedlings grown in the white light, and CK reportedly promoted hypocotyl elongation in the white light when ethylene action or auxin transport was blocked. Here we re-investigated the effects of CKs on hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana. While only a marginal effect of CKs on hypocotyl length was observed at a standard white light intensity (80 μmol photons m-2 s1
), a pronounced stimulation of hypocotyl elongation by CKs was found when the seedlings
were cultivated at a decreased white light intensity (20 μmol photons m-2 s-1). The CK effect on hypocotyl length was due to cell elongation. The stimulation of hypocotyl elongation was observed for all four principal CKs (t-Z, iP, BA, TDZ) and was dose-dependent in the nanomolar range. The stimulatory effect of the CKs was antagonized by PI-55. Mutant and transgenic plant analysis indicated that the canonical two-component response pathway is necessary for this process with prevailing contribution of cytokinin receptors AHK2 and AHK3. This CK action was independent of ethylene signaling and partially inhibited by IAA. In contrary, inhibition of hypocotyl elongation by CKs was observed at a decreased red light intensity (20 μmol m-2 s-1). Mutant analysis revealed that this effect is mediated by AHK3.
Obsah 1
Úvod ...................................................................................................................................9 1.1
Cytokininy ............................................................................................................... 10
1.1.1
Biosyntéza cytokininů .................................................................................... 11
1.1.2
Metabolismus cytokininů ............................................................................... 11
1.1.3
Přenos cytokininového signálu ...................................................................... 13
1.2
Světlo........................................................................................................................ 15
1.2.1
Fytohormony................................................................................................... 17
1.2.2
Kryptochromy................................................................................................. 18
1.2.3
Přenos světelného signálu .............................................................................. 18
1.3
Dlouživý růst hypokotylu....................................................................................... 19
1.3.1
Vliv fytohormonů na růst hypokotylu ve tmě.............................................. 19
1.3.2
Vliv fytohormonů na růst hypokotylu na světle .......................................... 20
1.3.3
Fytohormony a snížená intenzita světla ....................................................... 22
1.3.3.1 1.4
Úloha cytokininů při prodlužování hypokotylu na světle.......................22
Regulace hladiny endogenních cytokininů........................................................... 23
1.4.1
Zvýšená hladina endogenních cytokininů .................................................... 23
1.4.2
Degradace endogenních cytokininů .............................................................. 25
2
Cíle disertační práce....................................................................................................... 26
3
Materiál a metody........................................................................................................... 27 3.1
Rostlinný materiál .................................................................................................. 27
3.1.1
Chemikálie přidávané do kultivačního média .............................................28
3.2
Kultivace rostlin...................................................................................................... 29
3.3
Měření délek hypokotylů ....................................................................................... 31
3.4
Stanovení délek epidermálních buněk..................................................................32
3.5
Kvantitativní RT-PCR (RT-qPCR) ...................................................................... 32
3.5.1
Izolace celkové RNA....................................................................................... 32
3.5.2
Reverzní transkripce ...................................................................................... 33
3.5.3
Kvantitativní PCR .......................................................................................... 33
3.5.4
Extrakce a purifikace CK a stanovení jejich hladin ................................... 37
3.5.4.1
Obsah CK u semenáčků se systémem pOp/LhG4 ................................... 37
3.5.4.2
Obsah CK u semenáčků se systémem pOp/LhGR ..................................37
4
Výsledky .......................................................................................................................... 38 4.1
Vliv cytokininů na dlouživý růst hypokotylů u Arabidopsis thaliana při snížené
intenzitě bílého světla ......................................................................................................... 38 4.2
Role fyziologických hladin endogenních CK a percepce CK signálu v
dlouživém růstu hypokotylů při nízkých intenzitách bílého světla................................ 45 4.3
Úloha klíčových článků signální dráhy cytokininů ve stimulaci dlouživého
růstu hypokotylů.................................................................................................................47 4.4
Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením cytokininů je nezávislá na
signální dráze etylénu a je částečně inhibována auxinem...............................................49 4.5
Účinnost netypických forem CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů .... 50
4.6
Vliv intenzity bílého světla na citlivost TCS vůči CK ......................................... 53
4.7
Vliv dostupnosti živin na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů cytokininy .. 55
4.8
Nejen kvantita, ale i kvalita světla ovlivňuje cytokininy stimulovaný dlouživý
růst hypokotylů................................................................................................................... 57 5
Diskuse.............................................................................................................................60 5.1
Úloha cytokininů v dlouživém růstu hypokotylů na světle................................60
6
Závěr ................................................................................................................................ 69
7
Literatura ........................................................................................................................ 71
8
Seznam zkratek...............................................................................................................78
1
Úvod Rostliny jsou během svého života vystaveny silným vlivům mnoha environmentálních
faktorů. Vzhledem ke svému přisedlému způsobu života se rostliny vyznačují vysokou plasticitou a flexibilitou v odpovědi na tyto podněty. Komplexní propojení interakcí environmenálních a endogenních signálů má dopad na růst a vývoj rostlin. Ke studiu vzájemné souhry těchto signálů v regulaci růstových a vývojových odpovědí u modelové rostliny Arabidopsis thaliana (A. thaliana) je používán jako velmi vhodný orgán embryonální a post-embryonální stonek, nazývaný hypokotyl. Hypokotyl slouží především ke studiu vlivu interakcí světla a rostlinných hormonů (fytohormonů) na prodlužování buněk (Vandenbussche et al., 2005; Collett et al., 2000; Gendreau et al., 1997). Mezi molekuly, které plní funkci přenašečů signálů u rostlin patří fytohormon cytokinin (CK). Vnímání a přenos CK signálů probíhá přes kanonickou dvou-komponentní dráhu odpovědi (TCS), který se podobá bakteriálnímu dvou-komponentnímu systému, kterým bakterie vnímají a odpovídají na environmentální podněty (Hutchison a Kieber, 2002; Heyl a Schmülling, 2003; Rashotte et al., 2005; To a Kieber, 2008; Kieber a Schaller, 2010). Světlo, které hraje velmi důležitou roli v růstu a vývoji rostlin je vnímáno světelnými senzory (fotoreceptory). Jsou to fytochromy (PHY) pro červené (R) a vzdálené červené (FR) světlo, kryptochromy (CRY) pro modré (B) a ultrafialové A (UVA) světlo, fototropiny (PHOT) a dosud neidentifikované ultrafialové B (UVB) fotoreceptory. Rostliny rostoucí ve tmě (skotomorfogeneze) a na světle (fotomofogeneze) se morfologicky výrazně liší (Chory et al., 1995; Chory et al., 1996; Jiao et al., 2007). Ve tmě mají rostliny prodloužené hypokotyly, malé nerozvinuté kotyledony a nevyvinuté chloroplasty. Rostliny se označují jako etiolované. Vystavení rostlin rostoucích ve tmě světlu, vede k jejich de-etiolaci, růst hypokotylů je inhibován, dochází k růstu listů, diferenciaci a vývoji chloroplastů. Růst hypokotylů ve tmě i na světle je řízen kromě světla také fytohormony. Účinek některých z nich je již dobře popsán jak ve tmě, tak na světle. CK ve tmě částečně napodobují roli světla tím, že způsobují zkracování hypokotylů, aktivují vrcholový apikální meristém (shoot apical meristem; SAM) a stimulují tvorbu listů (Chory et al., 1994; Lochmanová et al., 2008). Na světle není jejich působení na růst hypokotylů doposud zcela objasněno. Otevřenou otázkou také zůstává, na jaké úrovni jsou propojeny signální dráhy světla a fytohormonů.
9
1.1 Cytokininy CK patří do skupiny rostlinných růstových regulátorů, fytohormonů. Byly objeveny v padesátých letech minulého století Millerem a Skoogem jako látky, které stimulují proliferaci rostlinných buněčných kultur. Účastní se mnoha růstových a vývojových procesů, ať už stimulačně nebo inhibičně, např. dělení buněk, vytváření prýtových meristémů a definování jejich funkcí, tvorby vaskulárního systému, potlačení senescence listů, inhibice růstu a větvení kořene, diferenciace chloroplastů a mimo jiné hrají roli i v klíčení semen a odpovědi na stres (Mok a Mok, 2001). Protichůdně působí CK na růst prýtu a kořene. Formují, udržují a stimulují růst prýtového apikálního meristému, ale inhibují růst kořene (Kieber a Schaller, 2010). Kořenová špička je hlavním místem biosyntézy CK, které se zde nachází ve vysoké koncentraci, a které jsou dále přenášeny xylémem do nadzemních částí rostlin. Dříve byla považovaná za jediné místo syntézy CK právě kořenová špička, CK jsou však syntetizovány i v jiných částech rostlin např. v kambiu, v prýtovém apexu a nezralých semenech (Letham, 1974) a mají funkci lokálních signálních molekul i přenašečů signálů na větší vzdálenosti (Sakakibara, 2006). Přirozeně se vyskytující CK jsou deriváty adeninu s postranním řetězcem v poloze N6. Podle struktury postranního řetězce jsou rozlišovány dva typy CK, isoprenoidní a aromatické. K aromatickým se řadí např. benzyladenin (BA) a ortho-topolin (oT). Jsou vzácnější a přestože byly nalezeny ve vyšších rostlinách (Strnad, 1997), jejich biosyntetická dráha nebyla doposud objasněna. Isoprenoidní CK se rozlišují na dva typy. Isopentenyladeninový, který nese v poloze N6 adeninu isopentenylový postranní řetězec, a zeatinový, který má v poloze N6 hydroxylovaný isopentenylový postranní řetězec. Stereoisomerická poloha hydroxylové skupiny ovlivňuje aktivitu trans- (tZ) a cis- (cZ) zeatinu (Hwang a Sakakibara, 2006; Sakakibara, 2006; Kakimoto 2003). CK se v rostlinách nachází ve formě volných bází, ribosidů nebo ribotidů. Za biologicky aktivní jsou považovány především volné báze, na základě jejich přímé vazby na cytokininový receptor CRE1 (Yamada et al., 2001), na který se CK ribosidy a ribotidy váží méně než odpovídající báze (Romanov et al., 2006; Spíchal et al., 2004). Syntetické CK se v rostlinách přirozeně nevyskytují, jejich zástupcem je difenylmočovinový typ, tidiazuron (TDZ), komerčně používaný jako herbicid (Sakakibara, 2006).
10
1.1.1
Biosyntéza cytokininů Klíčová role v biosyntéze isoprenoidních CK připadá enzymu adenosinfosfát-
isopentenyltransferase (IPT; EC 2.5.1.27), katalyzujícímu přenos isopentenylu z dimetylallyldifosfátu (DMAPP) nebo 1-hydroxy-2-metyl-2-(E)-butenyl 4-difosfátu (HMBDP) na adenosin-5´-fosfát (AMP, ADP nebo ATP) do polohy N6. IPT identifikovaná u některých fytopatogenních mikroorganismů, např. Agrobacteria tumefaciens (kódovaná genem ipt; Barry et al., 1984) využívá jako akceptor isopentenylu AMP (Sakakibara, 2006). IPT identifikovaná u vyšších rostlin, např. A.thaliana, upřednostňuje ADP a ATP před AMP (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2003). U A.thaliana je IPT kódována multi-genovou rodinou reprezentovanou 7 geny (AtIPT1, AtIPT3-8); (Kakimoto, 2001). Další cestou biosyntézy isoprenoidních CK u rostlin, ale i živočichů, je tRNA prenylace adeninu na 3´ konci antikodonu, katalyzovaná enzymem tRNA-isopentenyltransferasou (tRNA-IPT; EC 2.5.1.8) (Golovko et al., 2002). Degradací prenylované tRNA dochází k uvolnění cZ. U A.thaliana je tRNA-IPT kódována dvěma geny, AtIPT2 a AtIPT9 (Miyawaki et al., 2006). Není však považováno za pravděpodobné, že by touto cestou u rostlin vznikalo významně velké množství CK (obr. 1).
1.1.2
Metabolismus cytokininů Metabolismus CK lze rozdělit do dvou kategorií, jedna se týká adeninového kruhu,
druhá postranního řetězce. Za nejaktivnější formy CK jsou považovány jejich volné báze, jejichž uvolnění z nukleosidových či nukleotidových forem a naopak jejich vytváření je u A.thaliana katalyzováno několika enzymy, fosfatasou, adenosinkinasou a dvěma isoenzymy, adenin fosforybosyl-transferasami (APT2 a APT3; Allen et al,. 2002). Hladina aktivních CK může být dále regulována tvorbou konjugátů a to N- nebo O-glukosidů. N-glukosilace v polohách (N3, N7 a N9) adeninového kruhu je katalyzována enzymem N-glukosyltrasferasou. N-glukosidy představují ireverzibilně neaktivní formu CK a jsou biologicky neaktivní s výjimkou částečně aktivních N3-glukosidů. Konjugace může probíhat také na hydroxylové skupině postranního řetězce tZ, cZ a dihydrozeatinu (DHZ). Konjugaci zbytků glukosy nebo xylosy za vzniku O-glukosidů respektive O-xylosidů katalyzuje zeatin-O-glukosyltransferasa (Martin et al., 1999), respektive zeatin-O-xylosyltransferasa (Martin et al., 1999). O-
11
glukosidy, na rozdíl od N-glukosidů, představují reverzibilní zásobní formy CK a uvolnění aktivních forem CK je katalyzováno ß-glukosidasou (Brzobohatý et al., 1993). Ustálená hladina aktivních CK je dána poměrem uvolněných CK bází z jejich konjugátů a degradací respektive
konjugací
CK.
Velmi
důležitou
roli
v
homeostáze
CK
hraje
cytokininoxidasa/dehydrogenasa (CKX; Galuszka et al., 2004; Werner et al., 2003), která katalyzuje oxidaci a odštěpení postranního řetězce CK, čímž je ireverzibilně degraduje. Substrátová specifita CKX spočívá v rozlišování dvojné vazby, proto jsou DHZ, O-glukosidy a aromatické CK vůči CKX rezistentní. CK isopentenylového typu mohou být hydroxylovány na konci postranního řetězce, což je katalyzováno enzymem cytochrom P450 monooxigenasou (CYP735A1 a CYP735A2) za vzniku tZ nukleotidů, nukleosidů a volných bází (Takei et al., 2004b). Další metabolické enzymy se účastní změny přítomnosti nebo stereoisomerické polohy hydroxylové skupiny postranního řetězce. Zeatinreduktasa katalyzuje přeměnu tZ na DHZ a zeatin cis-trans isomerasa katalyzuje vzájemnou přeměnu tZ a cZ. (obr. 1).
Obr. 1 Současný model biosyntetické dráhy isoprenoidních CK u Arabidopsis thaliana (Sakakibara, 2006). Isoprenoidní postranní řetězec iP a tZ pochází přednostně z metyleritritol fosfátové dráhy (MEP), zatímco postranní řetězec cZ je odvozen převážně z mevalonové dráhy (MEV) (zelené šipky). Rostlinné IPT využívají preferenčně ATP nebo ADP jako akceptor isoprenoidu k tvorbě iPRTP nebo iPRDP (modré šipky).
12
1.1.3
Přenos cytokininového signálu Přenos CK signálu je u rostlin zprostředkován kanonickou dvou-komponentní dráhou
odpovědi – dvoukomponentním systémem (TCS) (obr. 2). Model TCS vznikl na základě podobnosti s dvou-komponentním systémem bakterií, jehož prostřednictvím bakterie vnímají a odpovídají na environmentální podněty. U bakterií se přenosu signálu účastní dvě komponenty, senzorová histidin (His) kinasa, která přijímá podněty a autofosforyluje konzervovaný histidyl kinasové domény, následuje fosforylace konzervovaného asparagylu regulátoru odpovědi, druhého člena dvou-komponentního systému. U některých bakterií a eukaryot včetně A.thaliana probíhá fosforylace ze senzorové His kinasy na regulátor odpovědi multi-krokově HisAspHisAsp a zahrnuje navíc dalšího člena TCS, His fosfotransferový protein (Hwang a Sheen, 2001; To a Kieber, 2008; Kieber a Schaller, 2010). U A.thaliana jsou jednotlivé členy TCS kódovány multi-genovými rodinami. Tři receptory CK, transmembránové hybridní His kinasy, AHK4/WOL/CRE1 (CRE1/AHK4), AHK2 a AHK3 obecně nazývané Arabidopsis His kinasy (Arabidopsis histidin kinases; AHK) jsou tvořeny dvěma typy domén, extracelulární CK vazebnou doménou (CHASE) a cytoplazmatickou His- přijímačovou a vysílací doménou. Ostatní His kinasy identifikované u A. thaliana (AtHK1, CKI1 a CKI2/AHK5) nejsou považovány za CK receptory, jelikož postrádají CK vazebnou CHASE doménu (Kakimoto, 2003). Odlišná ligandová specifita receptorů CK, v rámci derivátů CK, umožňuje rostlinám ladit procesy řízené CK a tím rozhodovat o celkovém dopadu jejich působení na rostlinu (Hwang a Sakakibara, 2006). Receptory CK AHK2 a AHK3 jsou ve velké míře exprimovány především v nadzemních částech rostliny, jejich funkce pozitivních regulátorů přenosu CK signálu (CK signalizace) se zde překrývají. V menší míře je v prýtu exprimován i CRE1, avšak jeho exprese je lokalizována především v kořeni (Higuchi et al., 2004). Dalšími články přenosu CK signálu je pět Arabidopsis His fosfotransferových proteinů (Arabidopsis histidin phosphotransfer proteins; AHP; AHP1-AHP5). Nesou konzervované aminokyselinové zbytky, nezbytné k fosforylaci prostřednictvím konzervovaného His. AHP jsou prostředníkem zajišťujícím fosforylaci mezi senzorovými His kinasami (receptory CK), a regulátory odpovědi, posledními členy TCS, přičemž fosforylace přijímačové domény regulátoru odpovědi mění jeho aktivitu. Pro uskutečnění tohoto kroku přenosu CK signálu dochází k transportu AHP z cytoplazmy do jádra, ve kterém jsou lokalizovány regulátory odpovědi (Hwang a Sheen, 2001).
13
Regulátory odpovědi u A. thaliana (Arabidopsis response regulators; ARR) spadají do dvou hlavních tříd, označovaných jako typ-A (ARR3-ARR9, ARR15-ARR17) a typ-B (ARR1, ARR2, ARR10-ARR14, ARR18-ARR21). Geny kódující ARR typu A nesou přijímačovou doménu a pouze krátkou C-terminální doménu a jejich transkripce je zvýšena do 10 minut po aplikaci CK (D'Agostino et al., 2000). ARR typu B mohou jako transkripční faktory řídit expresi mnoha genů, což vede ke změnám funkce buněk. ARR typu A jsou označovány jako negativní regulátory primární odpovědi na CK a v reakci na CK inhibují přenos CK signálu (To a Kieber, 2008). Geny kódující ARR typu B nesou kromě přijímačové domény na svém C-terminálním konci také DNA-vazebnou a transaktivační doménu, která řídí transkripci mnoha genů regulovaných CK, mezi které spadají i geny ARR typu A. ARR typu B působí jako transkripční faktory řídící expresi mnoha CK regulovaných genů. Před nedávnem byly objeveny faktory odpovědi na CK (cytokinin response factors; CRF), které byly zařazeny jako nové komponenty účastnící se odpovědi na CK. Experimentálně u nich byla prokázána CK regulovaná transkripce. Transkripce tří z těchto genů je indukovaná pomocí ARR typu B. U A. thaliana jsou CRF kódovány malou šestičlennou genovou rodinou (CRF1-CRF6). CRF spadají do větší třídy transkripčních faktorů podobných genu Apetala2 (AP2) V odpovědi na CK se akumulují v jádře a to v závislosti na aktivitě AHK a AHP, ale zcela nezávisle na ARR typu A i B (Rasshote et al., 2003; To a Kieber, 2008). Doposud však není objasněno, jak CK řídí jejich transport mezi jádrem a cytoplazmou, a jak probíhá přenos signálu z AHP na CRF. Účast CRF na řízení exprese regulovaných genů CK byla prokázána analýzou mutantů v CRF genech (Rashotte et al., 2006).
14
Obr. 2 Model přenosu CK signálu u A. thaliana (To a Kieber, 2008). CK jsou vnímány transmembránovými receptory AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4. Poté je zahájena multi-kroková fosforylace (modré šipky). CK signalizace se dále účastní His fosfotransferové proteiny (AHP) a regulátory odpovědi na CK (ARR) ARR typu A jsou negativní regulátory CK signalizace a ARR typu B jsou transkripční faktory, které řídí expresi genů regulovaných CK.
1.2 Světlo Světlo, zdroj energie pro fotosyntézu, současně působí jako jeden z nejvýznamnějších environmentálních faktorů ovlivňujících růst a vývoj rostlin. Ke vnímání světelných signálů mají rostliny vyvinuty fotoreceptory čtyř skupin, jak bylo uvedeno v kapitole 1. Jsou to fytochromy (PHY) pro červené (R) a vzdálené červené (FR) světlo, kryptochromy (CRY) pro modré (B) a ultrafialové A (UVA) světlo, fototropiny (PHOT) a neidentifikované receptory ultrafialového B záření (UVB). Jejich funkce se částečně překrývají, tudíž je morfogeneze semenáčků komplexním výsledkem spoluúčasti jednotlivých fotoreceptorů. Rostliny citlivě vnímají jak množství (intenzitu) světla, tak jeho kvalitu (vlnové délky). Neméně významný je také směr dopadajícího světla a doba po kterou na rostlinu působí. Odpověď rostlin na světlo
15
se promítá do mnoha vývojových procesů, např. klíčení semen, fotomorfogeneze semenáčků, vývoje a diferenciace chloroplastů, úniku před zastíněním, cirkadiánních rytmů a indukce kvetení. Klíčovou úlohu ve zprostředkování přenosu světelného signálu plní hierarchicky uspořádaný komplex transkripčních faktorů, které aktivují nebo potlačují expresi cílových, světlem regulovaných genů. Je známo, že přinejmenším 20 % genů A. thaliana vykazuje odlišnou expresi u semenáčků rostoucích na světle (fotomorfogeneze; de-etiolace) v porovnání s těmi co rostou ve tmě (skotomorfogeneze; etiolace). V přirozeném prostředí je každá vývojová fotomorfogenetická změna reakcí na různé světelné signály z více fotoreceptorů. V uspořádání transkripčních faktorů existují tzv. místa integrace signálů. Jedním z takových míst je světlem indukovaný transkripční faktor (Long Hypocotyl 5) (HY5), klíčový pozitivní regulátor během fotomorfogeneze semenáčků A. thaliana, který se účastní přenosu signálu R, FR i B světla. Ve světelné signální dráze působí za všemi fotoreceptory, je součástí kaskády transkripčních faktorů účastnících se fotomorfogeneze a váže se k promotorům některých světlem regulovaných genů (Jiao et al., 2007) (obr. 3). Fotoreceptory – PHY, CRY i PHOT, jsou tvořeny proteinovou složkou, která váže apoprotein, pigment absorbující světlo (chromofor). Schopnost každého chromoforu absorbovat různé vlnové délky určuje spektrální specifitu jednotlivých fotoreceptorů.
Obr. 3 Síť transkripčních faktorů světelné signální dráhy účastnících se fotomorfogeneze semenáčků (Jiao et al., 2007). Jednotlivé skupiny transkripčních faktorů vytváří separované sítě, které přímo interagují s určitým fotoreceptorem. Silná černá linka uprostřed označuje dráhu sbíhání signálních sítí separovaných skupin transkripčních faktorů.
16
1.2.1
Fytohormony Fytochromy (PHY) absorbují R a FR světlo a následně regulují odpovědi rostlin k světlu
této části spektra, jako jsou např. klíčení, fotomorfogeneze a únik ze zastínění. U A. thaliana jsou kódovány malou genovou rodinou pěti genů (PHYA-PHYE). Na základě jejich stability na světle jsou rozděleny do dvou skupin. Fotolabilní, typ I, konkrétně PHYA, hromadí se v etiolovaných semenáčcích a velmi rychle degraduje po vystavení světlu. Fotostabilní, typ II, reprezentují čtyři zbylé fytochromy, PHYB-E. Vyznačující se relativní stabilitou na světle, na kterém jejich množství v buňkách významně převládá nad obsahem PHYA (Chen et al., 2004). PHY je rozpustný protein vyskytující se ve formě homodimeru. Každý monomer váže pigment, lineární tetrapyrolový chromofor (fytochromobilin). PHY se vyskytuje ve dvou spektrálně odlišných formách, mezi kterými dochází k fotokonverzi po absorpci světla dané vlnové délky. Forma PHY red (Pr) s absorpčním maximem max = 660 nm po absorpci R světla přechází do formy PHY far-red (Pfr) s max = 730 nm a ta je absorpcí FR světla konvertována zpět na formu Pr. PHY jsou syntetizovány ve formě Pr a v této podobě se vyskytují v cytosolu. Jejich fotokonverze vede nejen ke změně formy z Pr na Pfr, ale také ke změně lokalizace. Z cytosolu se přemisťují do jádra, kde se váží na nukleární proteiny např. CRY, aux/IAA proteiny a transkripční faktory, např. (phytochrome interacting factor; PIF3; pozitivní regulátor přenosu signálu ve PHY signální dráze), které spouští transkripci specifických, světlem regulovaných genů (Kim et al., 2003; Chen et al., 2004). Za biologicky aktivní se považuje forma Pfr a to na základě pozorování, kdy fotokonverze Pr do Pfr zahajuje celou škálu biologických odpovědí, zatímco forma Pr tyto odpovědi zastavuje a je tudíž považována za neaktivní formu PHY (Chory et al., 1996). Molekulární mechanismus, kterým Pfr vyvolává biologické odpovědi, není zatím objasněn. Ale za obecně přijímané vysvětlení biologické aktivity Pfr se považuje konformační změna chromoforu během fotokonverze, jejímž důsledkem odlišně interaguje s funkčními komponentami světelné signální dráhy. Z molekulárních a genetických analýz mutantů necitlivých ke světlu, identifikovaných na základě jejich neschopnosti inhibovat růst hypokotylu při různých vlnových délkách bylo prokázáno, že PHYA i B řídí podobné odpovědi na světlo s tím rozdílem, že PHYA vnímá FR a PHYB R. Ovšem analýzy dvojnásobného mutanta phyAphyB dále ukázaly, že funkce PHYA i B není zcela oddělená, ale společně zajišťují odpověď na R světlo, kterou je de-etiolace semenáčků. U dvojnásobného mutanta phyAphyB byla detekována silnější deficience deetiolace na R světle než u jednoduchého mutanta phyB (Chory et al., 1995, 1996). 17
1.2.2
Kryptochromy U mutanta s deficiencí v lokusu HY4 byl identifikován fotoreceptor kryptochrom (CRY)
detekující B a UVA světlo. U A. thaliana se vyskytují dva příbuzné kryptochromy, CRY1 a CRY2, kódované geny CRY1 a CRY2. Mají odlišnou, i když částečně se překrývající, funkci. Jsou to rozpustné jaderné proteiny přítomné ve všech rostlinných orgánech. Každý z nich nese dva chromofory, flavin a pterin. CRY2 je, podobně jako PHYA, na světle nestabilní. Rychlý pokles jeho hladiny, u semenáčků vystavených světlu bezprostředně po jejich růstu ve tmě, je důsledkem degradace proteinu CRY2, nežli snížení transkripce genu CRY2. Naproti tomu, CRY1 je na světle stabilní (Taiz a Zeiger, 2002).
1.2.3
Přenos světelného signálu Funkce všech tří fotoreceptorů ve vývoji rostlin jsou nejen specifické, ale také
překrývající se, z čehož vyplývá, že fotoreceptory mohou jednak aktivovat společnou signální dráhu s jejími obecnými členy, ale na druhou stranu se tu vyskytují i členy specifické jednotlivým fotoreceptorům R, FR a B světla (Chory et al., 1996). Například k zahájení fotomorfogeneze po přijetí a přenosu světelného signálu světelnou signální dráhou dochází dvěma možnými způsoby. Transkripce fotosyntetických genů může být spuštěna pozitivní regulací, nebo přenos světelného signálu zastavují negativní regulárory fotomorfogeneze, jejichž úkolem je potlačit fotomorfogenezi u semenáčků rostoucích ve tmě. Analýzou mutantů byli u A. thaliana identifikovány geny DET, COP a FUS, které kódují egativní regulátory fotomorfogeneze. U semenáčků mutantů de-etiolated (det), constitutively photomorphogenic (cop) a fusca (fus) docházelo i ve tmě k fotomorfogenezi (Chory et al., 1995, 1996). Dále byly analýzou mutantů ve světelné signální dráze identifikovány tři pozitivně fungující přenašeče světelného signálu. Jedná se o HY5, který se účastní přenosu signálu R, FR i B světla.Far-red elongated hypocotyl (FHY1 a FHY3), fungující v přenosu signálu FR světla a CAB underexpressed (CUE), řídící expresi některých světlem regulovaných genů v buňkách mezofylu (Li et al., 1995; Chen et al., 2004).
18
1.3 Dlouživý růst hypokotylu Vhodným objektem ke studiu interakcí mezi environmentálními a endogenními podněty a jejich dopadu na růst a vývoj rostlin, je embryonální stonek dvouděložných rostlin, hypokotyl. Vhodný je především pro svou plasticitu, rychlou vývojovou odpověď na podněty a jednoduchou morfologii. Jedním ze studovaných jevů u hypokotylu je jeho prodlužování, které je regulováno komplexem spolupůsobících faktorů, mezi které patří mimo jiné i světlo a fytohormony (Vandenbussche et al., 2005). Hypokotyl je embryonální a postembryonální stonek, který spojuje embryonální lity (kotyledony) s kořenem semenáčku. Po své délce, od báze až k vrcholu je tvořen přibližně dvaceti epidermálními buňkami, z nichž většina je založena již v embryonálním stádiu. Na jeho příčném řezu, ve směru od středu k vnějšímu okraji, lze pozorovat cévní svazek, jednu endodermální, dvě kortikální a jednu epidermální vrstvu buněk. Růst hypokotylu je zprostředkován prodlužováním buněk, během růstu dochází k dělení jen nepatrného počtu buněk (Gendreau et al., 1997). Na prodlužování hypokotylu mají velký vliv světlo a fytohormony. Z fytohormonů jsou to především auxiny, CK, etylén, gibereliny (GA) a brasinosteroidy (BR). Fototropická odpověď, tedy směr růstu nadzemní části rostliny (prýtu) za světlem, zdrojem energie pro fotosyntézu, dopadajícím na rostlinu z určitého směru, je řízena fotoreceptory ze skupiny PHOT a distribucí fytohormonu auxinu.
1.3.1
Vliv fytohormonů na růst hypokotylu ve tmě Ve tmě jsou semenáčky etiolované, kotyledony zůstávají uzavřené, vytváří se tzv.
apikální háček, který chrání apex před poškozením při prorůstání semenáčku substrátem na jeho povrch. Růst kořene je redukován, zatímco hypokotyl se silně prodlužuje. Účelem tohoto vývojového programu (skotomorfogeneze) je rychlé dosažení světla, které umožní následné zahájení de-etiolace (fotomorfogeneze). Hned několik fytohormonů přispívá k ovlivnění růstu hypokotylu ve tmě. Etylén, v rámci tzv. trojné odpovědi, inhibuje prodlužování buněk. Podobný účinek na růst hypokotylu mají i CK. Ty působí prostřednictvím etylénu tak, že zvyšují jeho biosyntézu stabilizací klíčového enzymu v biosyntetické dráze etylénu, syntasy kyseliny 1-aminocyklopropan-1- karboxylové (ACS). Důsledkem zvýšené biosyntézy etylénu
19
podmíněné CK je inhibice prodlužování hypokotylu (Chae et al., 2003; Vandenbusche et al., 2005). GA patří mezi přední růstové regulátory, ovšem ve tmě exogenně dodané GA již nepodporují další prodlužování hypokotylů etiolovaných semenáčků (Cowling a Harberd, 1999). Z toho vyplývá, že ve tmě je dosaženo maximální odpovědi již při fyziologické hladině endogenních GA. Transport auxinů ve tmě sice nezprostředkovává prodlužování hypokotylu, přesto bylo pozorováno, že mutace některých genů nezbytných pro auxinovou odpověď (suppressor of hy2 mutation; SHY1 a SHY2) (Kim et al., 1996), zapříčiňuje krátký hypokotyl u etiolovaných semenáčků. Dalšími nezbytnými fytohormony, které zajiťují normální růst hypokotylů ve tmě jsou BR. Jejich úloha byla prokázána na základě fenotypu mutantů v biosyntetické a signální dráze BR, např. photomorphogenic dwarf (cpd), det2 (Kauschmann et al., 1996), vykazujících krátký hypokotyl i při růstu ve tmě.
1.3.2
Vliv fytohormonů na růst hypokotylu na světle Jak je již řadu let známo, auxiny (Smets et al., 1995), GB (Cowling a Harberd, 1999),
BR (Clouse, 1996) a etylén (Smalle et al., 1997; Smets et al., 1995) patří mezi fytohormony podporující růst hypokotylu na světle. Ke studiu vlivu fytohormonů na růst hypokotylu jsou používáni mutanti v metabolických a signálních drahách a rovněž transgenní linie nesoucí transgen, důsledkem jehož exprese je modulována přirozená hladina příslušného fytohormonu. Dále je možné využít chemických inhibitorů biosyntézy a antagonistů působení příslušného fytohormonu. První popsaná látka s antagonistickým účinkem k CK je 6-(2hydroxy-3-methylbenzylamino) purin (PI-55), který potlačuje aktivitu CK na úrovni receptorů CK (Spíchal et al., 2008). Z environmentálních faktorů je světlo jedním z nesilnějších, které růst hypokotylu inhibují (Gendreau et al., 1997). Folta et al. (2003) pozorovali inhibici prodlužování hypokotylu způsobenou světlem, která je založena na potlačení signálních drah auxinů a GA, modrým světlem. Tuto hypotézu vytvořili na základě analýzy mutanta cryptochrome1 (cry1), která odhalila jeho zvýšenou odpověď na přítomnost auxinů a GA v podobě prodloužených hypokotylů ve srovnání s divokým typem (kontrolou). Podobně byla pozorována i inhibice prodlužování hypokotylu potlačením signální dráhy BR modrým světlem. Vysoká hladina BR
20
je nezbytná pro skotomorfogenezi ve tmě, zatímco jejich biosyntéza je inhibována světlem a snížená hladina BR přispívá k celkové fotomorfogenezi na světle (Ma et al., 2001). Na rozdíl od tmy, na světle přidané exogenní GA stimulují prodlužování hypokotylu. Toto pozorování bylo potvrzeno analýzou mutantů v biosyntetické a signální dráze GA. Semenáčky mutanta s deficiencí v genu pro biosyntézu GA (GA requiring 1; GA1) vykazovaly krátké hypokotyly, naopak u mutanta s konstitutivní GA signalizací spindly (spy) byly pozorovány dlouhé hypokotyly (Cowling a Harberd, 1999; Vandenbussche et al., 2007). Na základě pozorování fenotypového projevu mutanta v auxinové signální dráze auxin resistant (axr1), kdy semenáčky mutanta měly krátké hypokotyly ve srovnání s kontrolními semenáčky, byla potvrzena role auxinů v prodlužování hypokotylu na světle. Na druhou stranu bylo prokázáno, že již přirozená hladina auxinů u semenáčků A. thaliana je optimální pro dlouživý růst a přídavek auxinu způsobuje inhibici růstu hypokotylu (Collet et al., 2000). Ovšem, za určitých růstových podmínek byl pozorován i pozitivní vliv exogenních auxinů na růst hypokotylu, a to tehdy pokud byly semenáčky pěstovány na růstovém médiu s velmi nízkým obsahem minerálních solí (LNM). Prodlužování hypokotylu je v tomto případě zapříčiněno růstovými podmínkami, které nejsou za těchto kultivačních podmínek dostačující pro syntézu endogenních auxinů u semenáčků (Smalle et al., 1997). Smalle et al. (1997) pozorovali pozitivní vliv etylénu a jeho prekurzoru, 1aminocyklopropan-1-karboxylové kyseliny (ACC), na prodlužování hypokotylu na světle. Bylo pozorováno dvojnásobné prodloužení hypokotylu ve srovnání s kontrolou pokud byly semenáčky kultivovány na LNM. Prodlužování hypokotylů podmíněné etylénem je důsledkem prodlužování buněk nikoliv jejich dělení. Nezbytnou podmínkou etylénem podmíněného prodlužování hypokotylů na světle je přítomnost modrého světla, respektive funkční CRY signalizace. Dvojnásobný mutant v signální dráze modrého světla cry1cry2 kultivovaný na modrém světle odpovídal fenotypově kontrole kultivované ve tmě. Po aplikaci ACC cry1 i cry2 vykazovaly redukovaný růst hypokotylu. Prodlužování hypokotylu na světle, jako odpověď na přítomnost etylénu, je závislé na minimální přípustné hladině GA, tedy funkční signální dráze GA, ale paradoxně není touto dráhou zprostředkováno (Vandenbussche et al., 2007).
21
1.3.3
Fytohormony a snížená intenzita světla Etiolace, která byla zmíněná již v kapitole 1.2, není morfologickou odpovědí pouze u
rostlin rostoucích ve tmě, ale je vyvolána i při zastíněním, při kterém dochází ke snížení poměru R/FR. V souvislosti s morfologickými reakcemi rostlin na zastínění byla dlouhou dobu studována především kvalita (spektrální složení) světla. Nicméně důležitou roli zde hraje i kvantita (intenzita) světla, které se rostliny musí přizpůsobit. Nedávno bylo prokázáno, že prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světla je podmíněno auxiny a etylénem. Obecně je přijatý poznatek, že světlo inhibuje biosyntézu etylénu snížením aktivity enzymu ACC oxidasy (ACO), která katalyzuje biosyntézu ACC. Naopak, při snížené intenzitě světla je produkce etylénu zvýšená (Vandenbussche et al., 2003). Význam auxinů a etylénu v prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světla byl prokázán analýzou mutantů s deficiencí v jejich signálních drahách (axr a etr), kteří vykazovali v porovnání s kontrolami sníženou odpověď na sníženou intenzitu světla (Vandenbussche et al., 2003).
1.3.3.1 Úloha cytokininů při prodlužování hypokotylu na světle Su a Howell (1995) pozorovali nezávislý a aditivní inhibiční vliv světla a CK na prodlužování hypokotylu. Inhibice růstu hypokotylu, byla blokována u mutanta long hypocotyl 5 (hy5), ale nebyla u něj změněná odpověď na přítomnost CK. Podobně, blokovaná CK-etylénová odpověď u mutanta cytokinin resistant/ethylene insetsitive (ckr1/ein2) neovlivnila odpověď na světlo. Inhibice prodlužování hypokotylu u A. thaliana byla odpovědí na světlo i CK. Jelikož světlo a CK způsobují inhibici prodlužování hypokotylu nezávisle a aditivně, při saturující hladině světla (7 µmol fotonů m-2 s-1), světlo překrývalo účinek CK, a naopak při saturující koncentraci CK (50 µM BA), CK maskovaly účinek světla. V pozdější práci Smets et al. (2005) popsali, že CK podporují prodlužování hypokotylu při snížené intenzitě světela (40 µmol fotonů m-2 s-1) pokud byla blokována buď funkce etylénu, nebo transport IAA. Kontrolní rostliny na médiu s BA obohaceném navíc o inhibitory
působení
nebo
biosyntézy
etylénu
(dusičnan
stříbrný
nebo
aminoetoxyvinylglycin; AVG), stejně jako na médiu s inhibitorem transportu IAA kyselinou 1-naftylftalamovou (NPA), vykazovaly významně delší hypokotyly ve srovnání se semenáčky na médiu s přídavkem samotného BA. Podobně se chovali i mutanti v etylénové signální
22
dráze ethylene resistant (etr1) a ein2. V této studii byl rovněž pozorován stimulační vliv CK na biosyntézu etylénu v souladu s prací Cary et al., (1995). Vandenbussche et al. (2007) studovali vliv CK na dlouživý růst hypokotylu při nízkých intenzitách B světla (0,8; 2,5 a 12 µmol fotonů m-2 s-1). Pozorovali, že samotné B světlo inhibuje dlouživý růst hypokotylu divokého typu (Ler-0), ale ne dvojnásobného mutanta cry1cry2. Avšak exogenní CK (BA) na B světle inhibuje dlouživý růst hypokotylu u každé z použitých linií, Ler a cry1cry2. Při nejvyší použité intenzitě světla pozorovali, že inhibice dlouživého růstu hypokotylu je saturována a není dále stimulována CK. Avšak mutant cry1cry2 reagoval na rostoucí koncentraci BA i při nejvyšší použité intenzitě světla. Vzhledem k tomu že při nejnižších použitých intenzitách světla a ve tmě způsobil BA stejnou míru inhibice dlouživého růstu hypokotylu u Ler-0 i mutanta cry1cry2, znamená to, že CK způsobují inhibici dlouživého růstu hypokotylu nezávisle a aditivně s CRY. Mira-Rodado et al. (2007) ve své práci pozorovali inhibici dlouživého růstu hypokotylů způsobenou přítomností CK (0,5µM kinetinu) při kultivaci semenáčků divokého typu Col-0 na R světle.
1.4 Regulace hladiny endogenních cytokininů 1.4.1
Zvýšená hladina endogenních cytokininů Systém CaMV35S-LhG4/pOp-ipt (pOp/LhG4; Moore et al., 1998) umožňuje zahájit
syntézu proteinu ipt po zkřížení reportérové linie nesoucí konstrukt pOp-ipt a aktivátorové linie s konstruktem CaMV35S-LhG4. Ke konstitutivní expresi genu zájmu ipt dochází již v generaci F1, díky dominantnímu charakteru každého z uvedených transgenů (obr.4A,B). Modifikací
systému
pOp/LhG4
byl
vytvořen
systém
CaMV35S-LhGR-N/pOp-ipt
(pOp/LhGR; Craft et al., 2005; Šámalová et al., 2005) s indukovatelnou expresí genu zájmu ipt. V tomto případě se v genomu jedné transgenní rostliny vyskytují dva konstrukty - pOpipt, který je shodný s konstruktem uvedeným v systému pOp/LhG4 a konstrukt – CaMV35SLhGR-N, který má na N konci LhG4 domény připojenou doménu GR (obr. 4C). Je to vazebná doména krysího receptoru glukokortikoidů. Nepřítomnost steroidního ligandu, např. dexametazonu (Dex), vede k vazbě hsp90 (heat shock protein 90) na transkripční aktivátor LhGR, důsledkem čehož dochází k jeho inaktivaci. Naopak transkripce genu zájmu umístěného pod pOp promotorem (pOp-ipt) je spuštěna aplikací steroidního hormonu Dex,
23
který vyvázáním hsp90 umožní uvolnění trans-aktivační domény LhGR a může dojít k vazbě na pOp promotor, čímž dochází ke spuštění transkripce.
C
Obr. 4 (A), Princip binárního transaktivačního systému (Moore et al., 1998). Exprese reportérového genu je spuštěna v generaci F1, získané zkřížením rodičovské reportérové- a aktivátorové linie. Aktivátorová linie exprimuje heterologní transkripční faktor, který specificky rozpoznává promotor reportérového genu. (B), Schématické znázornění reportérového a aktivátorového konstruktu. V reportérovém konstruktu je spojen gen zájmu s minimálním promotorem TATA postrádajícím transkripční aktivitu. Před TATA boxem jsou umístěna vazebná místa pro transkripční faktor s DNA vazebnou specifitou, která se nenachází u rostlin. (C), Schématické znázornění reportérového (pOp-ipt) a aktivátorového (LhG4 respektive LhGR-N) konstruktu (Šámalová et al., 2005). Exprese reportérového genu ipt v pOp reportérovém konstruktu je řízena chimerickým promotorem, který je tvořen ze dvou operátorů umístěných před minimálním CaMV35S promotorem. Exprese aktivátorových konstruktů LhG4 respektive LhGR je řízena promotorem CaMV35S. Transkripční aktivátor LhG4 je tvořen DNA vazebnou doménou lacI z lac represorového mutanta a GAL4 transkripční-aktivační doménou-II z kvasinky. Steroidní vazebná doména GR je připojena k N-terminálnímu konci LhG4.
24
1.4.2
Degradace endogenních cytokininů Galuszka et al. (2004) vytvořili transgenní rostliny A. thaliana nesoucí konstrukt
CaMV35S>GR>HvCKX2 s Dex indukovatelnou expresí genu HvCKX2 z ječmene (Hordeum vulgare). Cytokinin oxidasa/dehydrogenasa (CKX2) katalyzuje degradaci endogenních CK s nesaturovaným postranním řetězcem. Rostliny CaMV35S>GR>HvCKX2 po ošetření Dex vykazovaly CK deficientní fenotyp.
25
2
Cíle disertační práce Regulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK byla uspokojivě objasněna u
semenáčků kultivovaných ve tmě. Naproti tomu při studiu účinků CK na dlouživý růst hypokotylů u semenáčků kultivovaných na bílém světle byly nezávislými autory publikovány nekonzistentní výsledky. Cílem disertační práce bylo podrobně prozkoumat vliv CK na dlouživý růst hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana kultivovaných na bílém světle. K dosažení tohoto cíle byly vytyčeny tyto dílčí cíle. 1.
Stanovit vliv exogenních CK na dlouživý růst hypokotylů semenáčků Arabidopsis thaliana kultivovaných při různých intenzitách bílého světla za různých nutričních podmínek kultivačního média. Srovnat vliv ošetření exogenními CK a účinku zvýšení hladin endogenních CK s využitím transgenních linií umožňujících regulovatelnou expresi genu ipt.
2.
Poznat roli fyzilogických hladin CK a signální dráhy CK v regulaci dlouživého růstu hypokotylů při snížených intenzitách bílého světla s využitím regulavané exprese genu kódujícího cytokininoxidasu/dehydrogenasu HvCKX2 a antagonisty cytokininů PI-55.
3.
Identifikovat receptory CK a jednotlivé návazné články signální dráhy CK podílející se na regulaci dlouživého růstu hypokotylů s využitím odpovídajících mutantů a transgenních rostlin.
4.
Srovnat míru responsivity signální dráhy CK při standardní a snižené intenzitě světla jako možného faktoru podílejícího se na regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK.
5.
Zjistit podíl jednotlivých fotoreceptorů na regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK s využitím odpovídajících mutantů.
6.
Potvrdit dříve zjištěné vlivy CK na dlouživý růst hypokotylů kultivovaných při nízkých intenzitách modrého a červeného světla.
26
3
Materiál a metody
3.1 Rostlinný materiál Interakce zvýšených nebo snížených hladin endogenních CK a světla v regulaci růstu hypokotylu byly studovány s využitím transgenních rostlin Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotypu Columbia 0 (Col-0), nesoucích konstrukty se dvěma různými transgeny (ipt nebo HvCKX2), jejichž exprese vede k modulaci endogenních hladin CK. Vliv interakcí zvýšených hladin endogenních CK a světla na dlouživý růst hypokotylu byl studován na transgenních rostlinách se systémem pOp/LhG4 nesoucích konstrukt CaMV35S-LhG4/pOp-ipt (Moore et al., 1998) s konstitutivní expresí genu pro isopentenyltransferasu (ipt) izolovaného z Agrobacterium tumefaciens. Zvýšenou endogenní hladinu CK měla F1 generace rostlin získaná křížením homozygotní rodičovské aktivátorové linie (CaMV35S-LhG4) 14C se čtyřmi nezávislými rodičovskými reportérovými liniemi (pop-ipt) 2H2, 44G4, 7G1, 4G3. Následně byly použity transgenní rostliny s pOp/LhGR systémem s Dex regulovatelnou expresí genu ipt (CaMV35S-LhGR-N/pOp-ipt dále CaMV35S>GR>ipt; linie 11 a 13; Craft et al., 2005). Ke studiu vlivu interakcí snížených hladin endogenních CK a snížené intenzity světla na dlouživý růst hypokotylu byly použity rostliny A. thaliana nesoucí transgen CaMV35S-LhGR-N/pOp-HvCKX2 (dále CaMV35S>GR>HvCKX2; linie 4) na pozadí Col-0 s nadprodukcí enzymu cytokinin oxidasy/dehydrogenasy CKX2 z ječmene (HvCKX2), které je dosaženo Dex indukovatelnou expresí genu HvCKX2 (Galuszka et al., 2004). Rostliny byly laskavě poskytnuty doc. Galuszkou. V případě studia morfologických změn na semenáčcích v přítomnosti exogenních CK v médiu byly použity rostliny ekotypu Col-0 a dvojnásobné mutantní linie s deficiencí v receptorech CK - Arabidopsis histidine kinase (ahk2ahk3, ahk2cre1 a ahk3cre1) ahk2-5, Sail collection - SAIL_575_E05, Sesion et al., 2002; ahk3-7, GABI-KAT - 105E02, Rosso et al., 2003; cre1-2, Kakimoto, Inoue et al., 2001) a transgenní rostliny CaMV35S-ARR1SRDX (dominantní represorová verze Arabidopsis response regulator ARR1; linie 8; Heyl et al., 2008) na pozadí ekotypu Col-0. Mutanti v receptorech CK, stejně jako transgenní rostliny CaMV35S-ARR1-SRDX, byli laskavě poskytnuti prof. Schmüllingem. Jednoduchý a trojnásobný mutant cytokinin response factor (crf) crf5 a crf1crf2crf5 (Rashotte et al., 2006) byli laskavě poskytnuti prof. Rashottem. Linie mutantní v biosyntetických nebo signálních drahách fytohormonů ethyleneresistant (etr1-3), ethylene-insensitive (ein2-1) a de-etiolated (det2-1) na pozadí ekotypu Col-
27
0 byly získány z The European Arabidopsis Stock Centre. Linie mutantní ve fotoreceptorových signálních drahách cryptochrome2 (cry2-1) na pozadí Col-0 a long hypocotyl (hy1-1, hy2-1, hy4-1, hy5-1), phytochrome A (phyA-201), phytochrome B (phyB-1), phytochrome A phytochrome B (phyA-201 phyB-5) na pozadí ekotypu Ler-0, byly získány z The European Arabidopsis Stock Centre (seznam mutantů je uveden v tabulce P1). Col-0 a všechny tři výše uvedené linie dvojných mutantů v cytokininových receptorech byly dále použity ke stanovení hladiny transkriptů cytokininových molekulárních markerů, Arabidopsis response regulator (ARR3-6 a ARR16).
3.1.1
Chemikálie přidávané do kultivačního média Zásobní roztoky hydrofobních látek byly připraveny jejich rozpuštěním v dimetyl
sulfoxidu (DMSO; Sigma), tak, aby finální koncentrace DMSO v médiu byla vždy 0,002%, a tedy kontrolní médium bylo identické s kultivačním médiem obsahujícím studovanou látku (vyjma studované látky samotné) (tab. 1). Název aminoetoxyvinylglycin
Zkratka Koncentrace AVG 10
cis-zeatin
cZ
dexametazon
Jednotky Výrobce M Fluka M
Olchemim Ltd
Dex
0.1, 1, 10, 50, 100 10, 80, 100, 130, 200 1, 10
nM M
Sigma
dihydrozeatin
DHZ
0.1, 1, 10, 50, 100
M
Olchemim Ltd
dimetyl sulfoxid
DMSO
0.200
%
Sigma
kyselina indolyl-3-octová
IAA
6
M
Duchefa
orto-topolin
oT
0.1, 1, 10, 50, 100
M
Olchemim Ltd
tidiazuron
TDZ
1, 10, 50,100, 500 1, 5, 10
nM M
Olchemim Ltd
trans-zeatin
tZ
1, 10, 50,100, 500 1, 5, 10, 50, 100
nM M
Olchemim Ltd
1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina
ACC
50
M
Sigma
6-benzyladenin
BA
1, 10, 50,100, 500 1, 5, 10
nM M
Olchemim Ltd
6-isopentenyladenin
iP
1, 10, 50,100, 500 1, 5, 10
nM M
Olchemim Ltd
6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino) purin
PI-55
5
M
Dr. Spíchal
Tab. 1 Seznam látek přidávaných do kultivačního MS nebo LNM média.
28
3.2 Kultivace rostlin Semena A. thaliana byla povrchově sterilizována 75% etanolem po dobu 5-7 minut. Poté byla osušena na filtračním papíře a vyseta (po 15 kusech na jednu misku) na čtvercové Petriho misky (12,512,5 cm) do jedné linie, aby byly všechny rostliny během svého růstu ve stejné vzdálenosti od světelného zdroje. Po výsevu byly misky zalepeny polopropustnou páskou z netkaného textilu (Medipor 2210; Mediplast) Semena byla vyseta na pevné Murashige-Skoogovo (MS) kultivační médium (Duchefa) s 1,2% rostlinným agarem (Duchefa) s přídavkem 0,05% MES (Merck) a pH upraveným před autoklávováním na hodnotu 5,7-5,8 pomocí 1M KOH. Semena na miskách byla vystavena chladu (4-7 °C) ve tmě, po dobu 78 hod. za účelem vernalizace a dosažení synchronizace klíčení. Poté byly misky vertikálně umístěny do kultivačních boxů CU36L5 (Percival Scientific) a semenáčky rostly v podmínkách odpovídajících dlouhému dni s ostrými přechody mezi dnem a nocí (16 hod./ 21°C světlo – 8 hod./ 19°C tma), pod fluorescenčními trubicemi vyzařujícími bílé studené světlo (Philips). Spektrální složení bílého studeného světla je uvedeno v (obr. 5)
Obr. 5 Spektrální složení bílého studeného světla vyzařovaného fluorescenčními trubicemi TL-D 18W/33640 (Philips).
U vybraných experimentů semenáčky rostly při specifických světelných podmínkách na R (=660 nm), FR (=740 nm) nebo B (=470 nm) světle. Zdrojem světla o přesných vlnových délkách byl panel osazený diodami vyzařujícími světlo (light emitting diode, LED). Panel byl konstruován v rámci spolupráce s Fakultou elektrotechniky a komunikačních
29
technologií VUT v Brně. Je osazen LED o spektrálních charakteristikách uvedených v (tab. 2). Uspořádání LED na panelu je ukázáno na (obr. 6).
Výrobce ( Philips)
Vlnová délka Tok fotonů -1
Počet diod
Název
mol s )
na 1 modul
GreenPower LED module HF blue
470
10
5
GreenPower LED module HF far red
740
6
5
GreenPower LED module HF deep red
660
10
5
Tab. 2 Spektrální charakteristika LED modulů. LED moduly jsou vytvořeny tak, že světlo je homogenní ve vzdálenosti 50 cm od zdroje vyzařování.
Obr. 6 Uspořádání jednotlivých LED modulů na panelu.
V experimentech s barevnými LED moduly byly semenáčky kultivovány při kontinuálním osvětlení při teplotě 21 °C v kultivačním boxu AR36L (Percival Scientific). V jedné sérii experimentů bylo kromě MS média použito i médium s nízkým obsahem minerálních solí (LNM) pro vyhodnocení vlivu úrovně minerální výživy v regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při snížených intenzitách bílého světla. Složení média bylo převzato z práce (Smets et al., 1995).
30
Ke studiu vlivu nutriční hodnoty média v regulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK bylo v jedné sérii experimentů MS médium obohaceno o 1% sacharózu. Pro analýzu hladin transkriptů cytokininových molekulárních markerů (ARR3-6 a ARR16) metodou kvantitativní RT-PCR (RT-qPCR) byly 10-denní semenáčky kultivovány na vertikálních MS miskách s 0,002% DMSO (kontrolní médium) při snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) nebo standardní (80 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě světla, a poté přeneseny do tekutého média obohaceného o 1µM cZ, 1µM tZ, nebo 0,002% DMSO. Po přenosu byly jednotlivé vzorky kultivovány při snížené nebo standardní intenzitě světla po dobu 180 min. za stálého míchání (160 rpm, orbitální třepačka Infors AG)
3.3 Měření délek hypokotylů Semenáčky A. thaliana byly kultivovány na vertikálních MS nebo LNM miskách. Kromě kontrolního média (obsahujícího pouze rozpouštědlo hydrofobních látek, 0,002% DMSO) byla ostatní média obohacena o širokou škálu koncentrací (0,001-100 µM) exogenních CK (BA, DHZ, iP, cZ, tZ, oT, TDZ) nebo (0,01-10 µM) Dex. DMSO byl použit jako rozpouštědlo CK i Dex. V některých experimentech byl do média přidáván inhibitor biosyntézy etylénu AVG, prekurzor biosyntézy etylénu ACC, auxin - IAA a látka s antagonistickým účinkem k CK, PI-55, kterou nám laskavě poskytl Dr. Spíchal. Délky hypokotylů byly stanoveny u 10-denních semenáčků v případě, že byly kultivovány při snížené světelné intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1), nebo u 8-denních semenáčků, pokud byly kultivovány při standardní intenzitě světla (80 µmol fotonů m-2 s-1). Doba kultivace semenáčků, po jejímž uplynutí byly měřeny hypokotyly při každé z uvedených světelných intenzit, byla stanovena na základě synchronizace vývojové fáze semenáčků. Hypokotyly byly měřeny u 10-, respektive 8-denních semenáčků kultivovaných při 20, respektive 80 µmol fotonů m-2 s-1, které měly plně otevřené kotyledony a založený první pár pravých listů. Obrazy semenáčků byly snímány digitálním fotoaparátem (Olympus SP-350) a délky hypokotylů byly stanoveny s pomocí softwaru AnalySIS (www.softimaging.net; Olympus). Hranice hypokotylu byly vymezeny přechodem mezi kořenem a hypokotylem a polohou řapíků kotyledonů. Každý experiment tvořily 3 biologické repliky a pokud není uvedeno jinak, pro každou repliku bylo vyhodnoceno 15 nebo více semenáčků. Statisticky významné rozdíly byly stanoveny t-testem (P=0,05).
31
3.4 Stanovení délek epidermálních buněk Semenáčky Col-0 byly kultivovány na MS miskách s nebo bez 1µM BA umístěných vertikálně v kultivačním boxu s nastavenou sníženou intenzitou bílého světla (20 µmol fotonů m-2 s-1) po dobu 10 dnů. Hypokotyly byly rozděleny do tří částí: bazální, střední a horní. Pro každou z částí byla stanovena délka nejméně 28 epidermálních buněk a pro každé z médií a intenzitu světla bylo vyhodnoceno 10 semenáčků. Délky buněk jsou prezentovány jako průměrná délka všech tří hodnocených částí hypokotylu. Statisticky významné rozdíly byly stanoveny t-testem (P=0,05). Měření bylo provedeno na snímcích semenáčků pořízených s pomocí mikroskopu Olympus BX61 osazeného digitální kamerou Olympus DP50 (Olympus) a využitím softwaru AnalySIS (www.soft-imaging.net; Olympus).
3.5 Kvantitativní RT-PCR (RT-qPCR) 3.5.1
Izolace celkové RNA Bezprostředně po sběru bylo zamraženo v tekutém dusíku přibližně 50 mg semenáčků.
Během sběru byla stanovena a zaznamenána přesná hmotnost každého vzorku. Rostlinná pletiva byla důkladně homogenizována v tekutém dusíku a bezprostředně poté lyzována přidáním 0,5 ml TRIzol reagent (Invitrogen) (v případě odlišné navážky bylo přidáno množství úměrné této navážce) po dobu 5 minut při laboratorní teplotě. K lyzátu bylo připipetováno 100 µl chloroformu a po důkladném protřepání byla směs inkubována 2-3 min. při laboratorní teplotě. Centrifugací při 12000 g po dobu 15 min. došlo k oddělení vodní fáze, ta byla přepipetována do nové mikrozkumavky, ve které byla ve vodě rozpuštěná RNA vysrážena přidáním 250 µl isopropanolu a opětovně centrifugována (12000 g/ 15 min.). RNA pelet byl opláchnut 500 µl 75% etanolu, dobře vysušen a znovu rozpuštěn ve vodě ošetřené 0,05% dietylpyrokarbonátem (DEPC). Případná zbytková DNA přítomná ve vzorku byla odstraněna působením 1-4 U TurboDNase (Ambion) po dobu 20 min. při 37 °C. Následně byla DNáza tepelně inaktivována (65 °C, 15 min.) a nepřítomnost DNA byla ověřena pomocí PCR na referenční gen UBQ10 za použití RNA jako templátu. V případě přetrvávající DNA kontaminace byly vzorky znovu podrobeny působení TurboDNase a následné kontrole přítomnosti geonomové DNA, jak uvedeno výše.
32
3.5.2
Reverzní transkripce Ke stanovení množství transkriptu byla použita metoda dvoukrokové RT-PCR.
Množství RNA v reakční směsi se pohybovalo mezi 2,5-5 µg RNA. Pro syntézu cDNA byl použit 1 first strand buffer, 10mM dithiotreitol (DTT), 500 µM dNTP, oligo (dT) primer (RTP, sekvence uvedena v tab. 3) o výsledné koncentraci 0,4 µM a 100 U reverzní transkriptasy SuperscriptII (Invitrogen). Reakční směs tvořená RNA, dNTP, RTP a vodou byla zahřáta na 70 °C po dobu 10 min. a následně rychle zchlazena na 4°C. V tomto okamžiku byla přidána směs obsahující zbylé komponenty. Vlastní reverzní transkripce probíhala při 42 °C po dobu 50 min. Poté byla reverzní transkriptasa inaktivována při 70 °C po dobu 15 min. V každém vzorku po reverzní transkripci bylo předběžně stanoveno množství transkriptu UBQ10 a následně byly vzorky naředěny v takovém poměru, aby výsledná koncentrace mRNA pro UBQ10 byla shodná pro všechny analyzované vzorky. S ohledem na inhibiční efekt RT mixu na následnou PCR byla příslušná ředění prováděna pomocí RT mixu bez RNA a reverzní transkriptasy.
3.5.3
Kvantitativní PCR Pro všechny analyzované geny byla použita PCR směs složená z 1× Blue Buffer (Top-
Bio), 0,4mM dNTP, 0,7 U Taq polymerázy 1.1 (Top-Bio), 0,4× SybrGreen I (Molecular Probes), 0,4μM pravého primeru (forward) a 0,4μM levého primeru (reverse) (seznam použitých primerů spolu s reakčními podmínkami pro jednotlivé PCR reakce je uveden v tab. 3 a 4). Kvantitativní PCR (qPCR) byla následně provedena na cykleru RotorGene 6000 (Corbett Research). Množství DNA v reakční směsi bylo detekováno pomocí fluorescenčního barviva SYBR Green I a každý vzorek byl analyzován nezávisle dvakrát. Hladiny transkriptů byly kvantifikovány metodou standardní křivky a následně normalizovány na geny UBQ10, UBC9, UBC10 a EF1αlpha v programu GeNorm 3.5 (Vandesompele et al., 2002; Souček a Brzobohatý, nepublikováno). Ve všech případech byly výsledky expresí jednotlivých genů prezentovány jako hladiny transkriptů normalizované na své hladiny v příslušných kontrolních semenáčcích (%) s odpovídajícími směrodatnými odchylkami. Při hodnocení
33
biologické variability se vycházelo z měření expresí ze tří nezávislých sběrů, z nichž byl spočítán průměr a směrodatná odchylka.
34
Gen
Název primeru Sekvence primeru
Reakční podmínky
Arabidopsis response regulator 3 ARR3
fARR3rt
5´-ATC GCC TCT GTC TAT GGT T-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→60°C/20´´→72°C/20´´→
rARR3rt
5´-AAG TTC CTT CGT GAG CAA A-3´
80/15´´)→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Arabidopsis response regulator 4 ARR4
fARR4rt
5´- ATT CGT CTC CGC CGT TAT-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→60°C/20´´→72°C/20´´→
rARR4rt
5´- CGT CAT CAT CTT CAT CGT CT-3´
77/15´´)→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Arabidopsis response regulator 5 ARR5
fARR5rt
5´-GCT GAT AGA ACC AAG ACT GA-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→56°C/20´´→72°C/20´´)
rARR5rt
5´-CTT CCA AAA TAA CAC ACC AC-3´
→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Arabidopsis response regulator 6 ARR6
fARR6rt
5´- ATG GCT GAA GTT ATG CTA CCG AG-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→57°C/20´´→72°C/20´´→
rARR6rt
5´- TCA GAT CTT TGC GCG TTT GAG-3´
81/15´´)→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Arabidopsis response regulator 16 ARR16
fARR16rt
5´- TTA AGC AAC AAA GGA GAT-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→54°C/20´´→74°C/20´´)
rARR16rt
5´- TTA AAG ACG AAC AAG AAC-3´
→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Tab. 3. Seznam použitých primerů a reakčních podmínek pro RT-qPCR.
35
Gen
Název primeru Sekvence primeru
Reakční podmínky
Polyubiquitin 10 UBQ10
fUBQ10rt
5´- AAC GGG AAA GAC GAT TAC-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→60°C/20´´→72°C/20´´→
rUBQ10rt
5´- ACA AGA TGA AGG GTG GAC-3´
82/15´´)→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
Ubiquitin konjugující enzym 9/10 UBC9/10
fUBC9rt
5´- CAA GGT GCT GCT ATC G-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→56°C/20´´→72°C/20´´)
rUBC9rt
5´- ATC TCA GGG ACC AAA GG-3´
→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
rUBC10rt
5´- ATC TCG GGC ACC AAA GG-3´
Elongační faktor 1 alfa EF1alpha
fEF1alphart
5´- AGA TCA ACG AGC CCA AGA-3´
94°C/1´→40×(94°C/15´´→56°C/20´´→72°C/20´´→
rEF1alphart
5´- CCG TTC CAA TAC CAC CAA T-3´
79/15´´)→72°C/1´→ analýza Tm (50°C-95°C)
RTP
5´- CGT TCG ACG GTA CCT ACG TTT TTT TTT TTT TTT TT-3´
Tab. 4. Seznam použitých primerů referenčních genů a reakčních podmínek pro RT-qPCR.
36
3.5.4 Extrakce a purifikace CK a stanovení jejich hladin 3.5.4.1 Obsah CK u semenáčků se systémem pOp/LhG4 CK byly extrahovány z 36-, 30- nebo 28-denních semenáčků transgenních rostlin CaMV35S-LhG4/pOp-ipt s konstitutivní expresí genu ipt kultivovaných při světelných intenzitách 5, 20 nebo 50 µmol fotonů m-2 s-1 v podmínkách dlouhého dne na bílém světle. Extrakce, purifikace a stanovení hladin CK byly provedeny Dr. Malbeckem na Ústavu experimentální botaniky AV ČR, v.v.i. podle metodik uvedených v (Dobrev a Kamínek, 2002; Dobrev et al., 2005). Pro stanovení obsahu CK byla použita jedna biologická replika a byla provedena dvě nezávislá přístrojová stanovení (LC-MS/MS). Stanovené hodnoty jednotlivých derivátů CK jsou vyjádřeny v pikomolech vztažených na gram svěží hmotnosti semenáčků (pmol.g-1FW). 3.5.4.2 Obsah CK u semenáčků se systémem pOp/LhGR CK byly extrahovány ze 7-denních semenáčků Dex indukovatelných rostlin CaMV35S>GR>ipt linií 11 a 13, kultivovaných při snížené světelné intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1) v podmínkách dlouhého dne na bílém světle. Semenáčky byly kultivovány na MS médiu s nebo bez 80 nM Dex. Extrakce, purifikace a stanovení hladin CK byly provedeny Dr. Dobrevem na Ústavu experimentální botaniky AV ČR, v.v.i. podle metodik uvedených v (Dobrev a Kamínek, 2002; Dobrev et al., 2005). Pro stanovení obsahu CK byly použity 2 biologické repliky a pro každou z nich byla provedena dvě nezávislá přístrojová stanovení (LC-MS/MS). Stanovené hodnoty jednotlivých derivátů CK jsou průměrem dvou biologických replik a jsou vyjádřeny v pikomolech vztažených na gram svěží hmotnosti semenáčků (pmol.g-1FW). Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.
37
4
Výsledky
4.1 Vliv cytokininů na dlouživý růst hypokotylů u Arabidopsis thaliana při snížené intenzitě bílého světla Pozitivní vliv interakce zvýšené hladiny endogenních CK a snížené intenzity bílého světla na dlouživý růst hypokotylu jsme poprvé pozorovali u linií s konstitutivní- (linie 2H214C; 44G414C; 7G114C; 4G314C aktivované linie nesoucí konstrukt CaMV35S-LhG4/pOpipt). U těchto linií s konstitutivní expresí ipt byla sledována kinetika dlouživého růstu hypokotylů po dobu 13 dnů kultivace rostlin. Kontrolní (Col-0, 2H2, 44G4, 7G1, 4G3 a 14C) i aktivované (2H214C; 44G414C; 7G114C; 4G314C) rostliny byly kultivovány na MS médiu v podmínkách dlouhého dne při intenzitách (5, 20, 50, 70 a 80 µmol fotonů m-2 s-1) bílého světla (obr. 7, 8; tabulka P2). Zvýšení endogenních hladin CK (tabulka P3) vedlo k výrazné stimulaci dlouživého růstu hypokotylů při snížených intenzitách světla (5 a 20 µmol fotonů m-2 s-1). Mezi celkovým obsahem CK a stimulací dlouživého růstu nebyla pozorována přímá úměra. Nebyla zjištěna ani přímá závislost množství akumulovaných celkových CK na intenzitě světla. Vzhledem k tomu, že tyto charakteristiky mohou být ovlivněny rozdílnou časoprostorovou dynamikou změn hladin endogenních CK i jednotlivých aktivovaných linií, která může souviset s rozdílnými místy integrace T-DNA nesoucí pOp-ipt, ukázalo se jako vhodné pracovat s Dex indukovatelným systémem aktivace exprese genu ipt, u kterého může být dosaženo různého stupně zvýšení endogenních hladin CK v závislosti na koncentraci Dex v kultivačním médiu u jediné transgenní linie. Pro stanovení stimulačního účinku CK na dlouživý růst hypokotylu se jeví jako optimální 10. den kultivace, kdy je již téměř dosažena maximální délka hypokotylu a současně se stimulační účinek CK blíží maximu. Při delších kultivacích od 14. (při 5 nebo 20 µmol fotonů m-2 s-1) nebo od 10. dne kultivace (při 50, 70 a 80 µmol fotonů m-2 s-1) nebylo možné dostatečně spolehlivě měřit délku hypokotylů z důvodu odchlipování nadzemních částí rostlin od média. Při vyšších světelných intenzitách (od 50 µmol fotonů m-2 s-1) navíc docházelo k překrývání hypokotylů rostoucím prvním párem pravých listů. Do 10. dne došlo k nejvýraznějšímu prodloužení hypokotylů způsobenému CK a v tento okamžik byl tento jev již téměř saturován. Důležité pro stanovení délek hypokotylů je i to, že ještě nebyly překryty rostoucímy pravými listy. (Délky hypokotylů jednotlivých linií stanovené při všech použitých světelných intenzitách jsou uvedeny v mm a % v tab. P2). Pro následující experimenty byl zvolen jako nejvhodnější pro měření a srovnávání délek hypokotylů 10. den kultivace.Na 38
základě vyhodnocení prodlužování hypokotylů byla pro všechny další experimenty vybrána snížená (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzita světla, při které docházelo k výraznějšímu prodlužování hypokotylů semenáčků všech 4 aktivovaných linií ve srovnání s nejnižší použitou světelnou intenzitou (5 µmol fotonů m-2 s-1).
Obr. 7 Kinetika dlouživého růstu hypokotylů. Semenáčky kontrolních a aktivovaných linií byly kultivovány při intenzitách 5, 20, 50, 70 a 80 µmol fotonů m-2 s-1 bílého světla v režimu dlouhého dne. Délky hypokotylů byly stanoveny u 3, 5, 7, 9, 11 a 13-denních semenáčků při intenzitách světla 5 a 20 µmol fotonů m-2 s-1, respektive u 3, 5, 7 a 9-denních semenáčků při intenzitách světla 50, 70 a 80 µmol fotonů m-2 s-1. Na ose x jsou jednotlivé linie, na ose y délky hypokotylů (mm) a na ose z dny měření hypokotylů.
39
Obr. 8 Fenotyp semenáčků transgenních rostlin s konstitutivní expresí ipt. Linie označené 2H2, 44G4, 7G1 a 4G3 představují aktivované linie. Kontrolu reprezentuje Col-0. Semenáčky byly kultivovány 11 dní při uvedených intenzitách bílého světla a režimu dlouhého dne.
40
Stimulace dlouživého růstu hypokotylů A.thaliana byla potvrzena morfometrickou analýzou linií 11 a 13 transgenních rostlin CaMV35S>GR>ipt při snížené intenzitě světla v přítomnosti Dex. Srovnáním výsledků stanovení délek hypokotylů u koncentrační řady Dex bylo zjištěno, že k stimulaci dlouživého růstu hypokotylů dochází již v přítomnosti 80 nM Dex (obr. 9). Analýza obsahu CK v tomto biologickém materiálu ukázala, že k stimulaci dlouživého růstu dostačuje zvýšení hladin aktivních CK, které ještě není prokazatelné v homogenátech semenáčků ani metodou založenou na kapalinové chromatografii spojené s hmotnostní spektrometrií (obr. P3). Zvýšení toku metabolickou dráhou CK při takto nízké koncentraci Dex je zachytitelné pouze prostřednictvím zvýšených hladin CK-N7-glukosidů (obr. 10). Ty představují biologicky neaktivní metabolity, které nejsou v rostlinném těle odbouratelné a zýšení jejich hladin tedy může sloužit jako orientační měřítko zvýšení biosyntézy CK.
Obr. 9 Stimulace dlouživého růstu hypokotylů u semenáčků Dex indukovatelných linií. Semenáčky linií Col-0, 11 a 13 byly kultivovány při snížené intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1) bílého světla a podmínkách dlouhého dne po dobu 10 dní na MS médiu s přídavkem DMSO (kontrola) nebo koncentrační řady Dex.
41
A
B kontrola tZ-7-G (pmol.g-1 FW) 0.27
Dex
tZ-7-G (pmol.g-1 FW)
Col-0
8.52± 0.25
Col-0
8.15±
11
10.06± 1.37
11
73.17± 1.22
13
8.83± 0.0.71
13
26.67± 2.60
Obr. 10 Obsah tZ-7-G stanovený u 7-denních semenáčků A. thaliana. (A), U liní 11 a 13 byla zvýšená hladina tZ-7-G 7 respektive 3 po ošetření rostlin Dex. Semenáčky byly kultivovány 7 dní při režimu dlouhého dne a snížené intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1) bílého světla. (B), Obsah jednotlivých CK byl stanoven ve 2 biologických replikách a pro každou z nich byly provedeny dvě nezávislá přístrojová stanovení (LC-MS/MS). Stanovené hodnoty CK jsou průměrem dvou biologických replik a jsou vyjádřeny v pmol.g-1FW. Chybové úsečky vyjadřují směrodatnou odchylku.
Exprese genu ipt v transgenních rostlinách vede k téměř výlučnému zvýšení CK tZ typu. Pro posouzení účinnosti dalších typů CK bylo tedy nutné aplikovat exogenní CK. Délky hypokotylů byly stanoveny u 10-denních semenáčků Col-0 kultivovaných na samotném MS médiu a na MS médiu obohaceném o koncentrační řady čtyř základních typů CK (BA, iP, tZ, TDZ) při snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů byla pozorována u semenáčků kultivovaných v přítomnosti všech použitých CK a vykazovala závislost na jejich koncentraci. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů byla patrná již při nejnižší použité koncentraci CK (1nM), kdy bylo zjištěno prodloužení
42
hypokotylů o 10 (BA), 10 (iP), 9 (tZ) a 15 (TDZ) % ve srovnání s délkou hypokotylů na MS médiu bez přídavku CK (2,160,02 mm) (obr. 11A). Z obrázku je patrné, že tZ a TDZ jsou silnějšími stimulátory dlouživého růstu hypokotylů než BA a iP. Saturace prodlužování hypokotylů byla zaznamenána při koncentraci10 nM tZ a 100 nM TDZ. Hypokotyly byly o 47 % (tZ), respektive 70 % (TDZ) delší než hypokotyly Col-0 na MS médiu bez CK. Daleko vyšší koncentrace (5 µM) byla potřebná pro dosažení saturace pozorovaného jevu působením BA a iP. Při této koncentraci byl detekován nárůst hypokotylů o 52 % (BA), respektive 57 % (iP). Naproti tomu, při standardní (80 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla byl pozorován pouze nepatrný, statisticky nevýznamný, vliv CK na dlouživý růst hypokotylu (obr. 11B). Obr. 12 ukazuje porovnání fenotypů semenáčků rostoucích při snížené i standardní intenzitě bílého světla na MS médiu bez nebo s 1µM tZ. Zatímco tZ stimuluje dlouživý růst hypokotylů specificky při snížené intenzitě světla, k jeho inhibičnímu působení na dlouživý růst kořene dochází při snížené i standardní intenzitě světla. Vedle specifity pokud jde o intenzitu světla je patrné, že stimulace dlouživého růstu hypokotylů představuje podstatně citlivější biologickou odpověď semenáčků vyvolanou přítomností tZ, protože je saturována již působením 10nM tZ, kdy inhibiční působení tZ na dlouživý růst kořene ještě není průkazné (obr. P5).
Obr. 11 Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK u semenáčků A. thaliana při snížené intenzitě světla. (A), Odpověď semenáčků Col-0 na koncentrační řadu 4 základních typů CK (BA, iP, tZ, TDZ) při snížené intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1) bílého světla. (B), Při standardní intenzitě (80 µmol fotonů m-2 s-1) bílého světla nebyla pozorována významná stimulace dlouživého růstu hypokotylů v přítomnosti koncentrační řady tZ v porovnání se semenáčky rostoucími na MS médiu bez tZ. Semenáčky byly kultivovány v režimu dlouhého dne (16 hod./ 21°C světlo – 8 hod./ 19°C tma) a bílého studeného světla. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních v případě snížené intenzity, nebo 8-denních semenáčcích při standardní intenzitě světla. Experiment byl proveden ve 3 opakováních a vždy bylo vyhodnoceno minimálně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr všech opakování. a chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
43
Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK při nízké intenzitě světla byla dále studována na mikroskopické úrovni. Bylo zjištěno, že epidermální buňky semenáčků pěstovaných po dobu 10 dní na MS médiu s přídavkem 1 µM BA byly průměrně 1,64 delší než v případě semenáčků pěstovaných na samotném MS. Tento poměr je v dobré shodě s poměrem celkových délek hypokotylů, kdy hypokotyly semenáčků pěstovaných v přítomnosti 1 µM BA byly 1,58 delší než odpovídající kontroly (obr. 13).
Obr. 12 Fenotypové rozdíly mezi semenáčky kultivovanými při snížené a standardní intenzitě světla. Při snížené světelné intenzitě (20 µmol fotonů m-2 s-1) byla detekována silná stimulace dlouživého růstu hypokotylů semenáčků Col-0 na MS médiu s tZ. Při standardní světelné intenzitě (80 µmol fotonů m-2 s-1) nebyla pozorována významná stimulace dlouživého růstu hypokotylů na MS médiu s tZ.
Obr. 13 CK stimulovaný dlouživý růst epidermálních buněk hypokotylu. Hypokotyly semenáčků Col-0 ošetřených 1 µM BA byly 1,58 delší v porovnání s Col-0 na samotném MS. Epidermální buňky hypokotylů stejných semenáčků ošetřených 1 µM BA ukazovaly velmi podobné prodloužení 1,64 oproti Col-0 na samotném MS. Semenáčky byly kultivovány při snížené intenzitě bílého světla (20 µmol fotonů m-2 s-1) v podmínkách dlouhého dne.
44
4.2 Role fyziologických hladin endogenních CK a percepce CK signálu v dlouživém růstu hypokotylů při nízkých intenzitách bílého světla Poté co byl prokázán stimulační efekt CK na elongaci hypokotylu byly realizovány experimenty, jejichž cílem bylo posouzení role fyziologických hladin endogenních CK a percepce CK signálu v přirozeném dlouživém růstu hypokotylů při nízkých intenzitách bílého světla. Jako nástroj pro snížení percepce CK byl zvolen antagonista PI-55 [6-(2-hydroxy-3methylbenzylamino) purin; Spíchal et al., 2008]. Pro snížení hladin endogenních CK byly využity transgenní rostliny CaMV35S>GR>HvCKX2 (linie 4), u nichž dochází v přítomnosti Dex k aktivaci exprese cytokininoxidasy/dehydrogenasy HvCKX2 degradující CK. Semenáčky Col-0 byly kultivovány při podmínkách dlouhého dne a snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla na MS médiu s nebo bez přídavku PI-55. Na MS médiu s přídavkem 5 µM PI-55 byly hypokotyly Col-0 kratší o 24 % než na médiu bez PI-55 (průměrná délka hypokotylů na MS bez PI-55 byla 2,360,15 mm). Na MS médiu obohaceném o kombinaci 1 µM tZ a 5µM PI-55 byly hypokotyly kratší o 42 % než na MS s přídavkem pouze 1µM tZ (průměrná délka hypokotylů na MS s 1µM tZ byla 4,080,26 mm). Délka hypokotylů na MS s 1 µM tZ a 5µM PI-55 (2,380,03 mm)
byla velmi
blízká délce hypokotylů na MS bez obou látek PI-55 a tZ (2,360,15) (obr. 14). Transgenní semenáčky CaMV35S>GR>HvCKX2 (linie 4) byly kultivovány na MS médiu s koncentrační řadou Dex zahrnující čtyři řády (0,01; 0,1; 1 a 10 µM). Jako kontrola standardní reakce linie 4 vůči CK byla rovněž do experimentu zahrnuta kultivace na MS médiích s nebo bez 1µM tZ. Na uvedené řadě Dex byla pozorována inhibice dlouživého růstu hypokotylů o 10, 29, 31 nebo 32 % při rostoucí koncentraci Dex. Saturace této odpovědi byla tedy dosažena u 0,1 µM Dex (obr. 14). Kromě inhibice dlouživého růstu hypokotylů v přítomnosti Dex bylo detekováno i zakládání a růst laterálních kořenů, čímž byla potvrzena aktivace exprese genu HvCKX2 pomocí Dex (obr. 15). V přítomnosti tZ bylo pozorováno prodloužení hypokotylů o 56 % v porovnání s délkami hypokotylů semenáčků téže linie na MS bez tZ (2,690,06 mm; obr. 14). Tím byla potvrzena standardní odpověď linie 4 vůči CK za situace, kdy nebyla aktivována exprese genu HvCKX2.
45
Obr. 14 Vliv PI-55 a HvCKX2 na dlouživý růst hypokotylů. Semenáčky Col-0 měly kratší hypokotyly o 24 % v přítomnosti 5µM PI-55 než na MS bez PI-55. V přítomnosti obou látek PI-55 a 1 µM tZ byly hypokotyly delší o 33 % než na samotném PI-55, ale nedosahovaly délky hypokotylů Col-0 na MS s 1µM tZ. Hypokotyly semenáčků CaMV35S>GR>HvCKX2, linie 4, na koncentrační řadě Dex byly kratší než na médiu bez Dex. Inhibice růstu hypokotylů byla závislá na rostoucí koncentraci Dex. Hodnoceny byly 10-denní semenáčky kultivované při snížené intenzitě bílého světla a režimu dlouhého dne. Experiment byl proveden ve 3 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno minimálně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik. Chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
Fenotyp semenáčků Obr. 15 CaMV35S>GR>HvCKX2, linie 4. Semenáčky byly kultivovány na MS médiu s nebo bez 10µM Dex po dobu 10 dnů. V přítomnosti Dex byla pozorována inhibice dlouživého růstu hypokotylů a zakládání a růst laterálních kořenů.
46
4.3 Úloha klíčových článků signální dráhy cytokininů ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů K posouzení úlohy klíčových článků signální dráhy CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů jak za podmínek fyziologických, tak při ošetření exogenními CK byly využity mutanti v genech kódujících receptory CK (ahk2ahk3, ahk2cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3cre1) a v genech CRF (crf2 a crf1crf2crf5). Dále byly do experimentu zahrnuty transgenní rostliny CaMV35S-ARR1-SRDX (linie 8). U nich je pod kontrolou promotoru CaMV35S exprimována dominantně negativní rekombinantní verze proteinu ARR1 (ARR1-SRDX), který patří mezi transkripční faktory ARR typu B. Semenáčky těchto mutantů a transgenní linie byly kultivovány na MS médiu bez nebo s přídavkem 1 µM tZ při podmínkách dlouhého dne a snížené intenzitě bílého světla (20 µmol fotonů m-2 s-1). Vyjma mutantů akk2cre1, crf5 a crf1crf2crf5 byly hypokotyly těchto semenáčků na MS médiu bez tZ kratší než hypokotyly kontroly (Col-0; obr. 16; tab. 5) Vyjma mutantů s vyřazenou funkcí všech tří receptorů CK (ahk2ahk3cre1) si všechny ostatní linie (genotypy) zachovaly, byť v rozdílné míře, schopnost odpovídat k exogennímu CK stimulací dlouživého růstu hypokotylů. Předpokládám, že stupeň zachování odezvy k působení exogenních CK koreluje s významností odpovídajícího genu v této biologické odpovědi. Rozsah stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením tZ byl nejvyšší u dvojného mutanta ahk2cre1, což nasvědčuje klíčové roli receptoru AHK3 v regulaci této růstové odpovědi.
47
Obr. 16 Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK je zprostředkována TCS a CRF. CK stimulovaný dlouživý růst hypokotylů semenáčků CaMV35S-ARR1-SRDX, linie 8, a použitých mutantů je menší ve srovnání s Col-0. Výrazně je inhibována především stimulace dlouživého růstu hypokotylů u dvojného mutanta ahk2ahk3. Trojný mutant ahk2ahk3cre1 měl dokonce kratší hypokotyly na 1µM tZ než na MS bez tZ. Délky hypokotylů byly měřeny u 10-denních semenáčků a jsou vyjádřeny v relativních hodnotách, jako poměr délek na MS médiu s nebo bez 1µM tZ. Experiment byl proveden ve 3 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno (n20) semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik. Chybové úsečky vyjadřují směrodatnou odchylku.
Délka hypokotylů (mm) linie Col-0 ahk2cre1 ahk3cre1 ahk2ahk3 ahk2ahk3cre1 35S-ARR1-SRDX crf2 crf1crf2crf5
prodloužení (%)
kontrola
1 M tZ
2.30 2.49±0.04
3.91±0.08 4.05±0.09
70 63
2.260.03 1.950.03 2.040.03 1.520.05 2.720.06 2.770.08
3.350.08 2.250.05 1.760.04 2.110.08 3.960.12 4.200.17
48 15 -14 39 45 52
Tab. 5 V tabulce jsou uvedeny délky hypokotylů (mm) a prodloužení hypokotylů (%) stimulované 1µM tZ. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních semenáčcích všech použitých linií.
48
4.4 Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením cytokininů je nezávislá na signální dráze etylénu a je částečně inhibována auxinem Semenáčky Col-0 a etr1-3 byly kultivovány v podmínkách dlouhého dne a snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla na MS médiu bez nebo s přídavkem tZ a/nebo látek ovlivňující biosyntézu etylénu. 10-denní semenáčky Col-0 kultivované na MS médiu s 1µM tZ měly prodloužené hypokotyly o 43 % oproti hypokotylům Col-0 na MS bez tZ (průměrná délka hypokotylů Col-0 na MS bez tZ byla 2,760,04). Velmi podobné prodloužení o 47 % bylo pozorováno u etr1-3 po ošetření tZ (průměrná délka hypokotylů etr1-3 na MS bez tZ byla 2,720,09) (obr. 17). Semenáčky Col-0 na MS médiu s přídavkem inhibitoru biosyntézy etylénu, 10µM AVG, měly kratší hypokotyly o 23 % než Col-0 na MS bez AVG, ale na médiu obsahujícím současně AVG a tZ bylo pozorováno významné prodloužení hypokotylů o 67 % v porovnání s Col-0 na MS obohaceném pouze o AVG (2,120,18 mm) (obr. 17). Výsledky ukazují nezávislost stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK na etylénové signální dráze. AVG částečně inhibuje růst hypokotylů, ale nepotlačuje vliv CK na prodlužování hypokotylů. Růst hypokotylů semenáčků Col-0 ošetřených prekurzorem biosyntézy etylénu (ACC; 50µM) nebyl ovlivněn, jejich délka (2,750,05 mm) byla srovnatelná s délkou hypokotylů Col-0 na samotném MS bez přídavků ostatních látek (2,760,04 mm). Na MS s 50µM ACC a 1µM tZ byly hypokotyly Col-0 prodloužené jen o 24 % (obr. 17). ACC tedy negativně ovlivňuje stimulaci dlouživého růstu hypokotylů vyvolanou působením CK. Hypokotyly Col-0 rostoucí na MS s přídavkem 6µM IAA byly o 16 % kratší než na MS bez přídavku IAA a ostatních látek (2,330,05 mm). Na MS obsahujícím IAA a tZ byly hypokotyly prodloužené o 33 % než na MS s přídavkem samotného IAA (obr. 17). Z výsledků vyplývá, že IAA přidané do MS média částečně inhibuje jak samotný dlouživý růst hypokotylu, tak jeho stimulaci způsobenou ošetřením exogenním CK.
49
Obr. 17 Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK je nezávislá na etylénové signální dráze. Semenáčky Col-0 a etr1-3 kultivované na MS médiu pouze s přídavkem 1µM tZ, ale i v kombinaci tZ s 50µM ACC, 10µM AVG nebo 6µM IAA měly prodloužené hypokotyly ve srovnání s vlastními kontrolami. Hodnoceny byly 10-denní semenáčky kultivované při snížené intenzitě bílého světla a režimu dlouhého dne. Experiment byl proveden ve 3 opakováních, v každém opakování bylo vyhodnoceno nejméně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých opakování a chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
4.5 Účinnost netypických forem CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů V minulosti byly zjištěny rozdíly v biologických účincích různých chemických forem CK. Tyto rozdíly mohou souviset s diferenciací specifity jednotlivých receptorů CK vůči konkrétním chemickým formám CK. V další části práce byla pozornost věnována těm chemickým formám CK, které jsou schopny aktivovat pouze některé CK receptory a vyvolávat celkově výrazně nižší biologickou odpověď ve srovnání s tZ. Cílem této části práce bylo ověřit, zda jejich specifita zjištěná dříve v heterologním bakteriálním systému exprimujícím individuálně AHK3 a AHK4 a dále u celistvých transgenních semenáčků nesoucích reporterový konstrukt PARR5::GUS (Spíchal et al. 2004) bude korelovat s jejich schopností stimulovat dlouživý růst hypokotylů při snížené intenzitě bílého světla. .
50
Semenáčky Col-0, ahk2cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3 byly kultivovány v podmínkách dlouhého dne a snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla na MS médiu s nebo bez koncentrační řady (0,1, 1, 10, 50 a 100µM) DHZ, cZ, oT nebo tZ. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních semenáčcích. V přítomnosti DHZ a cZ byla pozorována významná stimulace dlouživého růstu hypokotylů všech čtyř použitých linií (genotypů) s výjimkou dvojnásobného mutanta ahk2ahk3. V souladu s jejich nižší aktivitou v porovnání s tZ v jiných systémech byl však významný efekt pozorován teprve u vyšších koncentrací (10 – 100 µM) těchto CK. Saturace bylo dosaženo při nejvyšší použité (100µM) koncentraci DHZ nebo cZ (obr. 18A,B). Při 1µM koncentraci DHZ byly hypokotyly Col-0 a ahk2cre1 pouze o 9 a 13 % delší než hypokotyly odpovídajících linií na MS bez DHZ (průměrná délka hypokotylů Col-0 a ahk2cre1 na MS bez CK: 2,550,06 a 2,640,16 mm). U linií ahk3cre1 a ahk2ahk3 byly hypokotyly dokonce kratší, a to v obou případech o 11 % (obr. 18A). Odlišná reakce v prodlužování hypokotylů na přítomnost CK byla pozorována na koncentrační řadě oT. Hypokotyly semenáčků každého ze čtyř použitých genotypů se neprodlužovaly, ani když byly semenáčky kultivovány na MS s přídavkem vyšších koncentrací oT. Naopak s rostoucí koncentrací oT docházelo k inhibici růstu hypokotylů (obr.18C). Naproti tomu u semenáčků ošetřených oT byla pozorována nejsilnější inhibice růstu kořene (obr. 18E). Na MS médiích s koncentrační řadou tZ bylo podle očekávání pozorováno statisticky významné prodlužování hypokotylů již při nejnižší použité koncentraci 0,1µM. Na MS s 1µM tZ byly hypokotyly Col-0, ahk2cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3 delší o 59, 61, 51 a 20 % než hypokotyly odpovídajících genotypů na MS bez tZ (průměrná délka hypokotylů na MS bez tZ: 2,420,09; 2,540,18; 2,330,11 a 1,820,03 mm) (obr.18D).
51
Obr. 18 Míra stimulace dlouživého růstu hypokotylu se liší v závislosti na použité formě CK. (A, B, D) Semenáčky Col-0 a dvojných mutantů ahk2cre1 a ahk3cre1 odpovídají na přítomnost DHZ a cZ stimulací dlouživého růstu hypokotylů teprve při aplikaci vyšších koncentrací 10, 50 a 100µM v porovnání s tZ. Mutant ahk2ahk3 odpovídá na CK podstatně slaběji. (C), Při ošetření semenáčků oT se neprodlužují hypokotyly semenáčků žádné z použitých linií, naopak dochází k inhibici růstu hypokotylů. Semenáčky byly kultivovány při snížené intenzitě bílého světla a režimu dlouhého dne. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních semenáčcích. Experiment byl proveden ve 3 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno minimálně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik. a chybové úsečky vyjadřují standardní chybu. (E), Na MS s oT nedochází k významnému prodlužování hypokotylů, ale naopak je patrná nejsilnější inhibici růstu kořene v porovnání s ostatními CK.
52
4.6 Vliv intenzity bílého světla na citlivost TCS vůči CK Semenáčky Col-0 a dvojných mutantů ahk2cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3 byly kultivovány při podmínkách dlouhého dne a snížené (20 µmol fotonů m-2 s-1) nebo standardní (80 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitě bílého světla po dobu 10 nebo 8 dnů na MS miskách bez přídavku CK. 10- respektive 8-denní semenáčky byly přeneseny do tekutého MS média s nebo bez přídavku 1µM cZ nebo tZ a dále kultivovány za stálého míchání po dobu 180 min při snížené nebo standardní světelné intenzitě. U všech vzorků byla metodou RT-qPCR stanovena míra exprese pěti ARR genů (ARR3, ARR4, ARR5, ARR6 a ARR16), které sloužily jako molekulární markery citlivosti TCS vůči CK. Výsledky stanovení ustálených hladin transkriptů jednotlivých genů byly prezentovány jako hladiny transkriptů normalizované na své hladiny v příslušných kontrolních (ošetřených MS bez CK) semenáčcích a vyjádřeny v %. Všechny analyzované ARR geny měly vyšší hladiny transkriptů po ošetření cZ nebo tZ a to při snížené i standardní intenzitě světla. Pro každý z genů ARR4, ARR5, ARR6 a ARR16 byly naměřeny velmi podobné hladiny transkriptů pro každou světelnou intenzitu u každé jednotlivé linie. V přítomnosti tZ bylo zvýšení hladin transkriptů dvou a vícenásobné v porovnání s cZ. Stejně jak bylo pozorováno na fenotypové, tak i na molekulární úrovni je vidět klesající síla odpovědi na CK u semenáčků jednotlivých linií v pořadí Col-0, ahk cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3 (obr. 9). Odlišné výsledky byly získány při analýze genu ARR3. Hladiny transkriptů po ošetření semenáčků každým z CK byly vícenásobně zvýšené v porovnání s ostatními analyzovanými ARR geny a nebyly detekovány příliš velké rozdíly mezi hladinami ARR3 po ošetření cZ nebo tZ. K největšímu zvýšení hladin transkriptů genu ARR3 došlo u linie ahk2 ahk3 (obr. 19). Výsledky naznačují nezávislost míry aktivace TCS působením CK na intenzitě bílého světla.
53
Obr. 19 Intenzita světla nemá vliv na aktivaci TCS působením CK. Zvýšená exprese molekulárních markerů citlivosti TCS vůči CK (ARR4, ARR5, ARR6, ARR16 a ARR3) byla detekována metodou RT-qPCR při snížené (šedé sloupce) a standardní (žluté sloupce) intenzitě bílého světla po ošetření tZ, cZ nebo MS bez CK. Ustálené vyšší hladiny transkriptů analyzovaných genů byly naměřeny po aplikaci tZ. Míra odpovědi na CK klesá u mutantních linií v pořadí ahk2cre1, ahk3cre1 a ahk2ahk3. Nejsilnější odpověď je naopak detekována u genu ARR3, u mutanta ahk2ahk3. Výsledky expresí jednotlivých genů jsou prezentovány jako hladiny transkriptů normalizované na své hladiny v příslušných kontrolních rostlinách (%) s odpovídajícími směrodatnými odchylkami. Při hodnocení biologické variability se vycházelo z měření expresí ze tří nezávislých sběrů, z nichž byl spočítán průměr a směrodatná odchylka.
54
4.7 Vliv dostupnosti živin na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů cytokininy Stimulace dlouživého růstu hypokotylů v přítomnosti CK při nízké intenzitě světla byla pozorována nejen na MS médiu, ale také u semenáčků Col-0 kultivovaných na LNM. Každé z uvedených médií bylo obohaceno o 1 nebo 10 µM BA. CK stimulovaný dlouživý růst hypokotylů byl výraznější u semenáčků rostoucích na LNM než na MS médiu (obr. 20A). Hypokotyly 10-denních semenáčků Col-0 na MS s 1 µM BA byly o 36 % delší než hypokotyly Col-0 na MS bez BA (2,160,02 mm). Avšak hypokotyly Col-0 kultivované na LNM s přídavkem 1 µM BA byly delší o 119 % ve srovnání s hypokotyly Col-0 na LNM bez BA (1,230,02 mm). Oproti optimální minerální výživě v případě MS média, za podmínek limitované minerální výživy (LNM médium) vykazují CK podstatně vyšší stimulační vliv na dlouživý růst hypokotylů, přesto bylo z níže uvedených důvodů pro další experimenty zvoleno MS médium. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů v přítomnosti CK na MS médiu byla dostatečně významná a semenáčky kultivované za těchto podmínek se jevily vitálnější v porovnání se semenáčky kultivovanými na LNM (obr. 20B). Na obrázku lze vidět, že 10denní Col-0 na LNM měly menší a chlorotické kotyledony a zakládající první pár pravých listů v porovnání se semenáčky na MS médiu. Tyto fenotypové rozdíly mezi semenáčky na MS a LNM médiu byly pozorovány u semenáčků Col-0 bez rozdílu, zda byly pěstovány na každém z uvedených médií s nebo bez BA. Výrazný rozdíl na nadzemních částech, zvláště pak na kotyledonech, byl pozorován mezi Col-0 na MS a LNM médiu bez BA. Naopak, inhibice růstu kořene v přítomnosti BA byla srovnatelná mezi semenáčky kultivovanými na LNM nebo MS médiích obohacených o stejné koncentrace BA (obr. 20B). Vliv CK na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů při nízké intenzitě bílého studeného světla byl dále studován na MS médiu s 1% sacharózou nebo na MS médiu bez sacharózy při režimu kontinuálního osvětlení. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních semenáčcích. Na MS médiu bez sacharózy byly hypokotyly semenáčků Col-0 v přítomnosti 1µM tZ o 75 % delší než hypokotyly Col-0 na samotném MS médiu bez sacharózy (1,870,01 mm). Naproti tomu, na MS médiu s 1% sacharózou a 1µM tZ ani BA nebyl zaznamenán významný stimulační vliv CK na dlouživý růst hypokotylu. Na MS médiu s 1% sacharózou a 1µM tZ byly hypokotyly o 13 % delší a v přítomnosti 1µM BA dokonce kratší a to o 0,1% ve srovnání s Col-0 na samotném MS médiu s 1% sacharózou (1,520,05 mm) (obr.20C,D).
55
Obr. 20 Dostupnost živin ovlivňuje míru stimulace dlouživého růstu hypokotylů semenáčků A. thaliana. (A), Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením BA byla detekována na každém z použitých médií, LNM (šedé sloupce) i MS (zelené sloupce). Tento jev byl výraznější na LNM. (B), Významné fenotypové rozdíly na nadzemních částech semenáčků jsou vidět mezi LNM a MS médii. Col-0 na LNM mají drobné a chlorotické kotyledony, na MS jsou kotyledony achlorotické a větší. Naproti tomu, není pozorován významný rozdíl ve vlivu BA na inhibici růstu kořene na každém z použitých médií. Semenáčky byly pěstovány při podmínkách dlouhého dne a snížené intenzitě bílého světla (20 µmol fotonů m-2 s-1) po dobu 10 dnů. (C,D), Semenáčky Col-0 byly kultivovány na MS médiu bez (světle modré sloupce) nebo s 1% sacharózou (tmavě modré sloupce) při podmínkách snížené intenzity bílého světla (20 µmol fotonů m-2 s-1) a kontinuálního osvětlení. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů byla pozorována u Col-0 kultivovaných na MS médiu bez sacharózy obohaceném o 1µM tZ. Na MS s 1% sacharózou nebyla detekována významná stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK. Experimenty byly provedeny ve 3 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno 20 a více semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik. Chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
56
4.8 Nejen kvantita, ale i kvalita světla ovlivňuje cytokininy stimulovaný dlouživý růst hypokotylů Na základě výsledků v pracích Vandenbussche et al. (2007) a Mira-Rodado et al. (2007), kteří pozorovali při použití B nebo R světla zkracování hypokotylů v přítomnosti CK, byly semenáčky Col-0 a etr1-3 kultivovány při režimu konstantního osvětlení sníženou (20 µmol fotonů m-2 s-1) intenzitou bílého, B (=470 nm) nebo R (=660 nm) světla na MS médiu bez nebo s 1µM tZ. Při kultivaci na bílém světle bylo pozorováno prodlužování hypokotylů způsobené tZ o 74 nebo 54 % pro každou z použitých linií (průměrná délka hypokotylů Col-0 a etr1-3 na MS bez tZ: 1,870,01 a 1,860,05 mm). Při použití B světla nebyl dlouživý růst hypokotylů téměř ovlivněn, po ošetření tZ, u žádné z použitých linií. Při kultivaci na R světle bylo pozorováno zkracování hypokotylů v přítomnosti tZ o 29 nebo 25 % u Col-0 nebo etr1-3 (průměrná délka hypokotylů Col-0 a etr1-3 na MS bez tZ: 11,590,19 a 10,500,62 mm) (obr.21). Hypokotyly byly měřeny na snímcích 10-denních semenáčků.Výsledky ukazují, že pouze samotné B nebo R světlo nejsou dostačující k dosažení stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK. Výsledky získané z experimentů provedených na B a R světle nás motivovaly ke snaze nalézt receptory zapojené ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů při snížených intenzitách bílého světla, s použitím mutantů s deficiencí ve fotoreceptorech. Semenáčky ekotypů Col-0 a Ler-0, stejně jako mutanti deficientní ve fotoreceptorech etr1-3, ein2-1, cry2-1, hy1-1, hy2-1, hy4-1(cry1), hy5-1, phyA-201, phyB-1, phyA-201phyB-5 a mutant deficientní v dráze biosyntézy BR det2-1 byly kultivovány na MS médiu bez nebo s 1µM tZ, při podmínkách dlouhého dne a škále snížených světelných intenzit 2, 5, 10, 20 a 25 µmol fotonů m-2 s-1. Délky hypokotylů byly stanoveny u 11- (2 a 5 µmol fotonů m-2 s-1) nebo 10-denních (10, 20 a 25 µmol fotonů m-2 s-1) semenáčků. V tyto dny kultivace byly semenáčky vzpřímené, měly plně otevřené kotyledony a založený první pár pravých listů. U semenáčků obou divokých typů Col-0 a Ler-0 byly pozorovány prodloužené hypokotyly na MS s tZ, se saturací tohoto jevu při světelné intenzitě 10 µmol fotonů m-2 s-1 (obr. 22A,D). Při této intenzitě světla bylo zahájeno prodlužování u Ler-0, při nižších intenzitách (5 µmol fotonů m-2 s-1) nebyl dlouživý růst hypokotylů působením CK ovlivněn, nebo docházelo k jeho inhibici (2 µmol fotonů m-2 s-1) (obr. 22D). U Col-0 bylo prodlužování zahájeno v přítomnosti tZ již při intenzitě světla 5 µmol fotonů m-2 s-1, a při 2 µmol fotonů m-2 s-1 nebyl dlouživý růst hypokotylu ovlivněn (obr. 22A). U mutantních linií hy1-1, hy2-1 s deficiencí v biosyntéze chromoforu PHY a mutanta hy5-1 s deficiencí v transkripčním faktoru HY5 bylo pozorováno CK způsobené zkracování 57
hypokotylů při všech použitých snížených světelných intenzitách (obr. 22E,F,G). Ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů nedocházelo v přítomnosti tZ ani u mutantních linií phyB-1 a dvojnásobného mutanta phyA-201phyB-5 s deficiencí ve PHY (obr. 22I,J). U mutanta phyA201 byla pozorována velmi podobná odpověď na přítomnost tZ, jako u kontrolní linie Ler-0. Hypokotyly byly prodloužené při světelných intenzitách 10, 20 a 25 µmol fotonů m-2 s-1 (obr. 22H). U mutantních linií hy4-1 (cry1) a cry2-1 s deficiencí v CRY1 nebo CRY2 nebyl pozorován CK stimulovaný dlouživý růst hypokotylů (obr. 22K,B). Naopak mutant det2-1, s deficiencí v negativním regulátoru fotomorfogeneze ve tmě, měl prodloužené hypokotyly po ošetření tZ podle očekávání při všech použitých intenzitách bílého světla (obr. 22C). Výsledky získané v tomto experimentu naznačují, že funkce PHYA není nutná ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK.
Obr. 21 Vliv jednotlivých vlnových délek na dlouživý růst hypokotylu. Semenáčky Col-0 a etr1-3 byly kultivovány na MS s nebo bez 1µM tZ v režimu snížené intenzity konstantního bílého, B nebo R světla. Po ošetření 1µM tZ na bílém světle byly hypokotyly prodlužovány. Na B nebyly délky hypokotylů významně ovlivněny. Na R docházelo ke zkracování hypokotylů. Délky hypokotylů byly stanoveny u 10-denních semenáčků. Experiment byl proveden ve 3 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno minimálně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik achybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
58
Obr. 22 Význam jednotlivých fotoreceptorů v dlouživém růstu hypokotylů při snížených intenzitách bílého světla. Hypokotyly semenáčků ošetřených tZ se prodlužovaly pouze u linií Col-0, Ler-0 a mutantů phyA201 a det2-1. Semenáčky byly kultivovány při podmínkách dlouhého dne a škále snížených intenzit bílého světla. Hypokotyly byly měřeny na 10-denních semenáčcích. Experiment byl proveden ve 2 biologických replikách, pro každou z nich bylo vyhodnoceno minimálně 20 semenáčků. Výsledky jsou prezentovány jako průměr jednotlivých biologických replik a chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
59
5 Diskuse 5.1 Úloha cytokininů v dlouživém růstu hypokotylů na světle CK jsou velmi často spojovány s působením světla, protože jsou schopny vyvolávat některé z de-etiolačních jevů vyvolaných světlem. Například u semenáčků A. thaliana pěstovaných ve tmě vede ošetření exogenními CK k otevření kotyledonů, iniciaci vývoje listů a chloroplastů, expresi genů regulovaných světlem a inhibici prodlužování hypokotylů (Chory et al.,1994; Lochmanová et al., 2008).Ve výsledcích dřívějších studií zabývajících se vlivem CK na dlouživý růst hypokotylů na bílém světle byly značné rozpory. Su a Howell, (1995) předpokládají, že CK a světlo mají nezávislý a aditivní vliv na dlouživý růst hypokotylů. Ve svých experimentech pozorovali, že buď CK nebo světlo, při určitých koncentracích, respektive intenzitách, způsobují saturaci sledované morfogenetické odpovědi, inhibice dlouživého růstu hypokotylů. Již při nízké intenzitě světla (7 µmol fotonů m-2 s-1) nezjistili vliv CK na dlouživý růst hypokotylů při běžných kultivačních podmínkách, protože již samotná hladina světla způsobí saturaci inhibice dlouživého růstu hypokotylů. Stejně tak, vysoká koncentrace CK (50 µM) způsobuje, že světlo již nemá další vliv na dlouživý růst hypokotylu, při této koncentraci je již inhibice dlouživého růstu hypokotylu saturována. Naopak CK a světlo při nesaturujících koncentracích / intenzitách přispívají aditivně k inhibici dlouživého růstu hypokotylů. Nezávislost vlivu CK na světelné signální dráze v dlouživém růstu hypokotylů předpokládají z výsledků, získaných z analýzy mutantů ve světelné signální dráze (hy1-hy6), u kterých pozorovali zkracování hypokotylů po aplikaci koncentrační řady BA (0,01-10µM). V další práci Smets et al., (2005) pozorovali stimulaci dlouživého růstu hypokotylů způsobenou CK na světle, pokud bylo zabráněno působení etylénu, buď inhibitorem biosyntézy etylénu, AVG, nebo inhibitorem jeho percepce, dusičnanem stříbrným. K stimulaci dlouživého růstu hypokotylů docházelo také tehdy pokud byl blokován transport auxinů aplikací NPA. Doposud byla tedy pozorována inhibice dlouživého růstu hypokotylů působením CK na světle (Su a Howell, 1995), nebo byla detekována stimulace dlouživého růstu hypokotylů způsobená CK na světle, ovšem jen za podmínek zabránění účinku etylénu nebo auxinů (Smets et al., (2005). Rozpory v těchto pracích nás vedly k novému přezkoumání vlivu CK na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů na světle. V této práci bylo prokázáno, že CK stimulují dlouživý růst hypokotylů na světle, a to jak v případě zvýšených endogenních hladin CK, jde tedy o jev způsobený zeatinovým typem CK, tak při aplikaci exogenních CK, v tomto případě byla
60
stimulace dlouživého růstu hypokotylů detekována již při nanomolárních koncentracích, konkrétně od 1nM koncentrace, v případě aplikace čtyř základních typů CK - BA, iP, tZ a TDZ. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK byla prokázána v rozsahu snížených intenzit bílého světla 2 – 40 µmol fotonů m-2 s-1 (výsledky z intenzity 40 µmol fotonů m-2 s-1 nejsou v práci ukázány). Při kultivaci semenáčků při vyšších světelných intenzitách, od 50 µmol fotonů m-2 s-1, ke statisticky významnému prodlužování nedocházelo, ale ostatní odpovědi na zvýšenou hladinu endogenních / přítomnost exogenních CK v médiu byly pozorovány, tj. inhibice růstu primárního kořene, akumulace antokyanů v kotyledonech a řapících. Výsledky v této práci ukazují, že stimulace dlouživého růstu hypokotylů způsobená CK je závislá na snížené intenzitě bílého světla. Téměř identické délky hypokotylů jsme stanovili u semenáčků divokého typu Col-0 a mutanta v etylénové signální dráze etr1-3 na médiu bez CK. Podobně po aplikaci 1µM tZ byla detekována stejná míra stimulace dlouživého růstu hypokotylů u každé z použitých linií. Po ošetření semenáčků AVG spolu s tZ jsme pozorovali významné prodloužení hypokotylů v porovnání s hypokotyly semenáčků ošetřených samotným AVG i přesto, že byla pozorovaná částečná inhibice stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK po aplikaci AVG. Tyto výsledky ukázaly, že stimulace dlouživého růstu hypokotylů způsobená CK při snížené intenzitě bílého světla je nezávislá na etylénové signální dráze a fyziologické úrovni jeho biosyntézy. Během růstové periody za standardních podmínek ve tmě i na světle, k dělení epidermálních a kortikálních buněk v hypokotylu buď vůbec nedochází, nebo je jejich dělení nevýznamné. Počet buněk zůstává víceméně konstantní od báze k vrcholu, cca 20 (Gendreau et al., 1997). Vzhledem k tomu, že stimulace buněčného dělení patří mezi jedny z biologických funkcí CK, byl zkoumán potenciální podíl stimulace buněčného dělení ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů u semenáčků ošetřených CK. Získané výsledky ukazují, že v tomto procesu CK stimulují prakticky výlučně dlouživý růst epidermálních buněk. Lze tedy očekávat, že CK stimulovaný dlouživý růst hypokotylů je realizován pouze stimulací dlouživého růstu buněk. Smalle et al., (1997) ve své práci také ukázali, že stimulace dlouživého růstu hypokotylů indukovaná etylénem nebo ACC, u semenáčků kultivovaných na světle na LNM, je spíše důsledek prodlužování nežli dělení buněk. O auxinech je známo, že patří mezi fytohormony podporující růst hypokotylu na světle. Za běžných kultivačních podmínek je jejich přirozená hladina optimální pro dlouživý růst hypokotylů a po přidání exogenního auxinu dochází k inhibici růstu hypokotylu (Collet et al., 2000). Pozitivní vliv mají exogenní auxiny na růst hypokotylu pouze tehdy, když jsou 61
semenáčky A. thaliana kultivovány na médiu s nízkým obsahem minerálních solí (LNM), protože tyto kultivační podmínky nejsou dostačující pro biosyntézu auxinů u semenáčků (Smalle et al., 1997). Výsledky získané v této práci tomu odpovídají, ukazují inhibici růstu hypokotylů po aplikaci IAA (semenáčky byly kultivovány na MS médiu), navíc ukazují částečně inhibiční vliv IAA na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK. V mnoha pracích (Smalle et al., 1997; Smets et al., 2005; Vandenbussche et al., 2003) je používáno ke kultivaci semenáčků LNM za účelem objasnění úlohy fytohormonů etylénu a IAA v dlouživém růstu hypokotylu a dosažení nebo zvýraznění efektu vyvolaného vlivem těchto látek přidávaných do média. Smalle et al., (1997) ukázali až dvojnásobné prodloužení hypokotylů na LNM po aplikaci 50 µM ACC. Výsledky naší práce ukazují, že takto navozená limitace minerální výživy semenáčků vede rovněž k vyššímu rozsahu stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením CK. Nevýhodou kultivace semenáčků na LNM je silná retardace jejich růstu a chloróza kotyledonů, tyto negativní dopady na růst a vývoj semenáčků byly podnětem pro rozhodnutí upřednostnit používání MS média ve všech dalších experimentech. Význam zdroje živin ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při snížené intenzitě bílého světla jsme detekovali také po aplikaci 1% sacharózy. Na MS médiu s 1% sacharózou a 1µM tZ nebo BA jsme nepozorovali významnou stimulaci dlouživého růstu hypokotylů v porovnání s kontrolou. Ovšem při kultivaci semenáčků na MS médiu bez sacharózy s 1µM tZ byla detekována výrazná stimulace tohoto jevu. V obou případech byly semenáčky kultivovány při kontinuálním osvětlení sníženou intenzitou bílého světla. Výsledky v této práci – absence stimulace dlouživého růstu hypokotylů působením BA na MS médiu s 1% sacharózou při režimu snížené intenzity bílého světla a kontinuálního osvětlení jsou blízké s výsledky v práci (Argyros et al., 2008), kde také nepozorovali stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením BA. V citované práci byla pozorována inhibice dlouživého růstu hypokotylů závislá na koncentrační řadě BA. Inhibice dlouživého růstu hypokotylů působením BA by mohla být způsobena obohacením bílého světla o 18 000 K fluorescenční zářivky použité při kultivaci v práci (Argyros et al., 2008). Přenos CK signálu je zprostředkovaný poměrně dobře prostudovaným TCS, jehož model vznikl na základě podobnosti s dvou-komponentním systémem u bakterií, prostřednictvím kterého přijímají a odpovídají na environmentální podněty. Úloha jednotlivých klíčových článků TCS v přenosu CK signálu u rostlin byla objasněna s pomocí in-vitro studií na heterologních kvasinkách a bakteriích a protoplastech A. thaliana (Kakimoto, 2003; Ferreira a Kieber, 2005; Heyl a Schmülling 2003) a z analýz mutantů (A. thaliana) s deficiencí nebo naopak zvýšenou expresí v genech, které kódují jednotlivé články 62
TCS. Překrývající se funkce CRE1/AHK4, AHK2 a AHK3 koreluje s modelem exprese příslušných genů, které kódují receptory CK. CRE1/AHK4 je v nadbytku exprimován v kořeni (Mähönen et al., 2000; Ueguchi et al., 2001; Riefler et al., 2006) zatímco AHK2 a AHK3 jsou ve vysoké míře exprimovány v prýtu (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Ueguchi et al., 2001). AHK2 a AHK3 mají částečně nadbytečnou a současně přední roli v kontrole růstu orgánů u rostlin, s opoziční regulační funkcí v prýtu a kořeni (Higuchi et al., 2004; Riefler et al., 2006). CRE1/AHK4 má hlavní úlohu ve vnímání exogenních CK v primárním kořeni s příspěvkem účasti receptorů AHK2 a AHK3 (Inoue et al., 2001; Higuchi et al., 2004). Stimulace dlouživého růstu hypokotylů zjištěné v prvních fázích této disertační práce vedlo ke dvěma otázkám. Hrají fyziologické hladiny endogenní CK a úroveň aktivace jejich signální dráhy roli v dlouživém růstu hypokotylů při snížených intenzitách světla? Které články signální dráhy CK jsou klíčové v regulaci této biologické odpovědi? Ve snaze odpovědět na tyto otázky byla nejdříve využita možnost snížit aktivitu CK signální dráhy působením antagonisty CK – PI-55 (Spíchal et al., 2008) a dále možnost snížit endogenní hladiny CK řízenou expresí genu kódujícího cytokininoxidasu/dehydrogenasu HvCKX2. Ošetření semenáčků PI-55 i aktivace exprese genu HvCKX2 vedlo k částečné inhibici dlouživého růstu hypokotylů při snížené intenzitě bílého světla. Navíc bylo možné ukázat, že PI-55 interferuje rovněž s účinky ošetření semenáčků exogenními CK. Následná analýza mutantů v receptorech CK a transgenních rostlin exprimujících dominantně negativní kurantní verzi transkripčního faktoru ARR1, participujícího v regulaci genové exprese v odpovědi na CK, ukázala inhibici dlouživého růstu hypokotylů u semenáčků, které postrádají funkční CK receptory AHK2 a AHK3 a dále u těch, u kterých došlo pouze k narušení funkce transkripčního faktoru ARR1. Uvedené výsledky jsou v souladu s dříve popsanou klíčovou funkcí AHK2, AHK3 a ARR1 ve vývoji nadzemní části rostlinného těla (Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004; Ueguchi et al., 2001 Riefler et al., 2006; Higuchi et al., 2004; Heyl et al., 2008; Kieber a Schaller, 2010). Studium odpovědi vůči ošetření semenáčků exogenními CK u mutant v receptorech a v signální dráze CK prokázalo klíčovou roli receptoru AHK3 ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylů indukovaného exogenními CK při snížené intenzitě bílého světla. V této funkci může být zastoupen, i když s menší účinností, receptorem AHK2. Ve velmi omezeném rozsahu pak může zastoupit tyto dva receptory i receptor AHK4/CRE1. V případě současné absence všech tří CK receptorů se stimulační efekt exogenních CK mění v slabě inhibiční. Tyto výsledky jsou konzistentní s dříve popsanou klíčovou funkcí AHK2 a AHK3 ve vývoji nadzemní části rostlinného těla i s omezenou schopností AHK4/CRE1 tuto jejich funkci 63
částečně nahradit (Higuchi et al., 2004). Úplná absence odpovědi v případě vyřazení všech těchto tří známých CK receptorů naznačuje, že v Arabidopsis neexistuje žádný další CK receptor, který by tuto funkci mohl převzít. To je v souladu se současnou představou, že u rostlin pravděpodobně neexistují jiné funkční receptory CK (Kieber a Schaller, 2010). Tato série experimentů rovněž naznačuje, že na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením exogenních CK participuje aktivace transkripce zprostředkovaná ARR1. V neposlední řadě bylo možné prokázat, že kromě této klasické komponenty TCS jsou v odpovědi účastny i geny kódující CRF. Tato zjištění jsou v souladu s částečně se překrývajícími funkcemi ARR typu B a CRF (Rashotte et al., 2006). Impulsem k přechodu od práce s transgenními rostlinami CaMV35S-LhG4/pOp-ipt a CaMV35S>GR>ipt
se zvýšenou expresí ipt, tj. zvýšenou hladinou endogenních CK,
k aplikaci exogenních CK byl především zájem sledovat vliv i ostatních typů CK (nejen zeatinového typu) na dlouživý růst hypokotylů při snížené intenzitě bílého světla. Nespornou výhodou práce s exogenními CK je také rychlost práce. Studium vlivu interakce CK a světla na fenotyp semenáčků jsme zahájili se dvěma systémy – pOp/LhG4 a posléze s jeho modifikovanou verzí pOp/LhGR. V prvním případě, pro získání transgenních rostlin CaMV35S-LhG4/pOp-ipt s aktivovanou expresí genu ipt (Moore et al., 1998), je nutné nejdříve vyselektovat z heterozygotní generace homozygotní reportérové- (pOp-ipt) a aktivátorové- (35S-LhG4) linie a následně je křížit. Ze získané generace F1 je nezbytné selektovat více linií, jednak pro ověření, zda fenotypový projev u těchto rostlin není způsobený inzercí transgenu do části genomu, která by negativně ovlivnila expresi transgenu, a jednak pro vyselektování linií s různě silnou expresí. Získání dostatečného počtu semínek rostlin generace F1 znamenala práci se třemi generacemi rostlin. Rostliny CaMV35S>GR>ipt s indukovatelnou expresí ipt Dex (Craft et al., 2005; Šámalová et al., 2005) mají nespornou výhodu v možnosti krátkodobých indukcí transkripce genu zájmu a namnožení dostatečného množství semínek pro experimenty cestou samoopylení. Potřebnou míru zvýšení hladiny CK lze modifikovat použitou koncentrací Dex. Na základě síly odpovědi rostlin na CK, např. míra inhibice kořene, nebo prodlužování hypokotylů při snížené intenzitě bílého světla lze z koncentrační řady Dex vybrat optimální koncentraci pro studium žádaného morfologického znaku. Pro sledování prodlužování hypokotylů jsme vytestovali jako minimální koncentraci Dex, při které ještě dochází k významnému prodlužování hypokotylů, 80 nM. Při použití 4 základních typů exogenních CK - BA, iP, tZ a TDZ v této práci, byly získány výsledky, které rozlišují použité CK podle síly fenotypové odpovědi do dvou skupin. tZ a TDZ jako silné stimulátory prodlužování hypokotylů při snížené intenzitě bílého světla, 64
zatímco BA a iP se chovají jako slabší stimulátory tohoto jevu. Jednotlivé chemické formy CK se mezi sebou liší především ve svém postranním řetězci, ten může být isoprenoidní či aromatický, dále přítomností či absencí hydroxylové skupiny a její stereoizomerickou pozicí. Relativní aktivita různých chemických forem CK je známá z měření ligandové afinity jednotlivých receptorů CK k odlišným chemickým formám CK. Je známo, že nejvíce aktivními formami CK v rostlinách jsou jejich volné báze, zatímco ribosidy a ribotidy jsou obecně méně aktivní. Z in vitro a in vivo studií prováděných na receptorech CK u A. thaliana je známo, že tZ a iP vykazují daleko vyšší biologickou aktivitu ve srovnání s cZ nebo DHZ a vazebná afinita jednotlivých receptorů CK je odlišná pro různé chemické formy CK. CRE1/AHK4 receptor váže především volné báze iP a tZ, ale také aromatický BA nebo syntetický TDZ. AHK3 receptor rozpoznává i cZ a DHZ stejně dobře jako tZ, ale s nižší citlivostí a na rozdíl od CRE1/AHK4 rozpoznává i ribosidy a ribotidy (Romanov et al.2006; Yamada et al., 2001 Spíchal et al., 2004; Kamínek et al., 1979). Spíchal et al. (2004) ve své práci poukazují na možnost, že různé chemické formy CK mohou mít specifické funkce v mnoha procesech řízených CK v závislosti na různých receptorech CK. Tato hypotéza se opírá o výsledky srovnávání relativních aktivit mnoha chemických forem CK. Na základě výsledků z histochemického barvení (PARR5::GUS) u A. thaliana v práci Spíchal et al. (2004) jsme studovali zda se projeví jimi detekovaná snížená aktivita různých chemických forem CK, oproti tZ, na úrovni dlouživého růstu hypokotylu. Z celé řady testovaných chemických forem CK ve výše uvedené práci jsme si vybrali cZ, DHZ a oT. Výsledky v této práci (morfologické studie) odpovídají sníženým aktivitám vybraných chemických forem CK, v porovnání s aktivitou tZ, které byly stanoveny ve výše uvedené práci. Po aplikaci DHZ a cZ jsme pozorovali stimulaci dlouživého růstu hypokotylů, ovšem pouze při použití vysokých koncentrací těchto CK. Dvojnásobný mutant ahk2ahk3 opět vykazoval nejslabší odpověď na CK, ze skupiny použitých dvojnásobných mutantů v receptorech CK, podobně jako v předchozích experimentech. Z výsledků lze soudit, že míra stimulace dlouživého růstu hypokotylů, ke které dochází vlivem interakce snížené intenzity bílého světla a přítomnosti exogenních CK, závisí na dané chemické formě aplikovaného CK. Jedinečně se na fenotypu semenáčků projevil vliv oT. Při žádné z použitých koncentrací nebyla indukována stimulace dlouživého růstu hypokotylů. Ovšem naproti tomu jsme pozorovali silnou inhibici růstu primárního kořene ve srovnání s DHZ, cZ a tZ, tedy formami CK, které stimulují dlouživý růst hypokotylu již při velmi nízkých (tZ) nebo alespoň vysokých (DHZ a cZ) koncentracích. Tento výsledek by mohl znamenat, že TCS je nezbytným, ale ne dostačujícím zprostředkovatelem odpovědi k CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylu. 65
CK ovlivňují expresi mnoha různých genů u rozličných druhů rostlin. Ovšem řada z těchto genů je současně regulována jinými podněty a / nebo jsou indukovány až po poměrně dlouhém intervalu (>1 h) (Crowell a Amasino, 1994; Hare a Staden, 1997; Schmülling et al., 1997). Dva geny ARR4 a ARR5 dříve nazývané IBC7 a IBC6 (Brandstatter a Kieber, 1998), které byly identifikovány jako transkripty indukované CK, vykazují vlastnosti genů primární odpovědi na CK – zvýšení stálé hladiny transkriptů nastává do 10 min. po aplikaci CK. Tato rychlá indukce je specifická pro CK (Brandstatter a Kieber, 1998; D`Agostino et al., 2000). V naší práci došlo k nárůstu hladin transkriptů všech použitých CK molekulárních markerů po aplikaci každého z vybraných CK, tZ nebo cZ. Obecně pro všechny použité ARR geny lze říct, že hladina jejich transkriptů byla po ošetření tZ přibližně dvojnásobně zvýšená oproti cZ, což koreluje i s fenotypovým projevem, stimulací dlouživého růstu hypokotylů,u semenáčků na MS s cZ nebo tZ. Důležitým zjištěním je skutečnost, že intenzita světla neměla podstatný vliv na stupeň zvýšení hladin transkriptů sledovaných markerových ARR genů v odpovědi na ošetření tZ nebo cZ. Snížení intenzity světla tedy nemá zásadní vliv na aktivaci TCS působením CK. Změna citlivosti TCS vůči CK tedy nemůže být klíčovým důvodem rozdílného vlivu CK na dlouživý růst hypokotylů při snížené a standardní intenzitě světla. Vandenbussche et al. (2007) ve své práci ukázali, že B světlo inhibuje růst hypokotylů u divokého typu (Ler-0) ne však u dvojnásobného mutanta s deficiencí v CRY (cry1cry2). Ovšem exogenní CK (BA) inhibuje růst hypokotylů na B světle, u každé z použitých linií. Výsledky v této práci tomu odpovídají. U semenáčků Col-0 a etr1-3 kultivovaných při snížené intenzitě B světla nebyly hypokotyly po ošetření tZ statisticky významně delší ve srovnání s odpovídajícími kontrolami. Mira-Rodado et al., (2007) pozorovali inhibici růstu hypokotylů Col-0 po aplikaci exogenního CK (0,5µM kinetin) při kultivaci semenáčků na kontinuálním R světle. V naší práci byla při kultivaci na snížené intenzitě kontinuálního R světla také pozorována inhibice růstu hypokotylů u semenáčků Col-0 a etr1-3. Z výsledků získaných při kultivaci semenáčků na červeném a modrém světle je patrné, že samotné R nebo B světlo nejsou dostačující pro námi popsaný jev, stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při snížené intenzitě bílého světla. Z experimentů s použitím mutantů s deficiencí ve fotoreceptorech kultivovaných při snížených intenzitách bílého světla na MS médiu s nebo bez CK lze předpokládat, že funkce PHYA není nutná ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK. Jednou z klasických pozorovaných odpovědí semenáčků na zvýšenou hladinu endogenních / koncentraci exogenních CK je inhibice růstu primárního kořene. Aplikace CK způsobuje pokles úrovně dělení buněk v kořenové špičce a mutanti necitlivý k CK mají větší 66
kořenový meristém (Werner et al., 2001; Ioio et al., 2008). V naší práci jsme pozorovali vliv CK na inhibici růstu kořene při každé z použitých světelných intenzit po ošetření semenáčků exogenními CK nebo u linií se zvýšenou hladinou endogenních CK. Na rozdíl od stimulace dlouživého růstu hypokotylů způsobené CK, ke které dochází specificky jen při snížené intenzitě bílého světla, k inhibici růstu kořene způsobené CK dochází ve velmi podobném rozsahu při každé z použitých intenzit. Vedle specifity pokud jde o intenzitu světla je patrné, že stimulace dlouživého růstu hypokotylů představuje podstatně citlivější biologickou odpověď semenáčků vyvolanou přítomností tZ, protože je saturována již působením 10 nM tZ, kdy inhibiční působení tZ na dlouživý růst kořene ještě není průkazné Překvapivá byla síla odpovědi, inhibice růstu primárního kořene, na oT. Ve srovnání se všemi aplikovanými formami CK v této práci byla inhibice růstu kořene vyvolaná oT velmi silná. V naší práci jsme se velmi pečlivě soustředili na externí faktory, které provázely kultivace semenáčků. Vedly nás k tomu i výsledky experimentů Genkova a Nejedlíka (osobní konzultace, nepublikované výsledky), kteří pozorovali, že vysoká hustota semenáčků na miskách a zabránění výměny plynů mezi vnitřním prostorem misky a okolím, které se během kultivace semenáčků hromadí uvnitř misek omotaných neprodyšným parafilmem či potravinovou fólií, vedou k retardaci růstu semenáčků. Proto jsme na jednu misku vysévali maximálně 15 semínek, pro zajištění stejného počtu semenáčků a jejich nepříliš hustého výsevu. Semínka jsme při výsevu pokládali sterilním párátkem do jedné řady vzdálené 2 cm od horního okraje misky, čímž jsme zajistili stejnou vzdálenost semenáčků od zdroje světla ve všech experimentech. Misky jsme zalepili prodyšnou páskou z netkané textilie, která zabránila hromadění plynů, včetně etylénu, uvnitř misek. Je možné, že právě volba pásky k zalepení misek je důvodem, že Smets et al. (2005) pozorovali stimulaci dlouživého růstu hypokotylů na bílém světle teprve po aplikaci inhibitorů biosyntézy a percepce etylénu. V případě, že by použili prodyšnou pásku, ve své práci neuvádí jakou páskou byly misky omotány, nedocházelo by k hromadění etylénu uvnitř misek a stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK by mohli detekovat i bez aplikace inhibitorů biosyntézy a percepce etylénu. Dalším z klíčových externích faktorů je spektrální složení bílého světla použitého pro kultivaci. Většina kultivačních komor je vybavena kromě fluorescenčních trubic vyzařujících bílé světlo i žárovkami, které obohacují světelné spektrum především o vlnové délky červeného světla. V naší práci jsme striktně používali pouze fluorescenční trubice vyzařující bílé studené světlo, jehož přesné spektrálním složení je uvedeno v kapitole 3.2 Kultivace rostlin. Významnou roli mají také nutriční hodnoty kultivačního média. Rozdílnou míru odpovědi na CK ve stimulaci dlouživého růstu hypokotylu při snížené 67
intenzitě bílého světla jsme pozorovali mezi LNM a MS médiem. Pokud bylo MS médium obohaceno o sacharózu a semenáčky byly kultivovány při snížené intenzitě bílého světla a režimu dlouhého dne, byla pozorována stimulace dlouživého růstu hypokotylu působením CK. Ovšem na MS médiu se sacharózou při podmínkách snížené intenzity kontinuálního bílého světla stimulace dlouživého růstu hypokotylu působením CK prokázána nebyla.V práci Argyros et al.(2008) kultivovali semenáčky na MS médiu se sacharózou na kontinuálním bílém světle a stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK také nepozorovali, dokonce detekovali významnou inhibici tohoto jevu. Tento rozdíl mezi našimi a jejich výsledky by mohl být způsoben tím, že používali bílé světlo obohacené o 18 000 K fluorescenční zářivky. Je tedy možné, že důvodem rozporů ve výsledcích získaných v dřívějších studiích, zabývajících se zkoumáním vlivu CK na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů na bílém světle, byly právě rozdíly v externích faktorech mezi jednotlivými výzkumnými týmy. Naše výsledky, které ukazují stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při snížené intenzitě bílého světla jsou konzistentní a byly získány v podmínkách přesné kontroly všech externích faktorů, které mohou výsledky experimentů ovlivňovat. Sledovaný jev jsme prokázali u několika genotypů, použili jsme dva divoké typy a několik mutantů s deficiencí v biosyntetické nebo signální dráze CK. Dále jsme získali koherentní výsledky při škále snížených intenzit bílého světla, aplikací více chemických forem CK a při odlišných nutričních hodnotách médií.
68
6
Závěr
Disertační práce se věnuje roli CK v regulaci dlouživého růstu hypokotylů při snížených intenzitách světla u modelové rostliny A. thaliana. Vychází z pozorování stimulace dlouživého růstu hypokotylů transgenních semenáčků A. thaliana se zvýšenými hladinami endogenních CK kultivovaných při snížených intenzitách bílého světla. Bylo nalezeno rozmezí intenzit bílého světla, při kterých dochází ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů A. thaliana při ošetření exogenními CK nebo v důsledku zvýšení hladin endogenních cytokininů po aktivaci klíčového genu jejich biosyntézy – ipt. Byla popsána účinnost řady chemických forem CK v tomto procesu, která do značné míry koreluje s jejich afinitou k receptorům CK u A. thaliana. Zvláštní postavení zaujímá oT, který dlouživý růst hypokotylu nestimuluje a současně vykazuje silný inhibiční účinek na dlouživý růst kořene. Zvýšení endogenních hladin CK převážně zeatinového typu vede ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů s charakteristikami podobnými jako u ošetření samotným tZ. Přitom k této stimulaci dochází již při zvýšení toku biosyntetickou dráhou CK v tak malém rozsahu, že je v celkovém homogenátu detekovatelný pouze jako zvýšení hladiny neodbouratelné neaktivní formy CK – N7-glukozidů. Stimulační efekt CK na dlouživý růst hypokotylů závisí na dostupnosti živin a světelném režimu v průběhu kultivace semenáčků. Nedostatek minerálních živin tento efekt prohlubuje. Naproti tomu v případě optimální minerální
výživy,
přítomnosti
cukru
v kultivačním
médiu
a
kultivaci
v režimu
nepřerušovaného světla ke stimulaci nedochází. Bylo prokázáno, že interference s percepcí CK na úrovni jejich receptorů působením antagonisty PI-55 stejně jako aktivace exprese genu HvCKX2 odpovědného za degradaci endogenních CK vede k inhibici přirozeného dlouživého růstu hypokotylů A. thaliana při nízkých intenzitách světla. Z toho je možné usuzovat, že se CK podílejí na regulaci tohoto procesu i za normálních podmínek. Analýzou mutantů a transgenních rostlin byl zjištěn klíčový podíl receptorů cytokininů AHK3 a AHK2 a dále transkripčního regulátoru ARR1 v tomto procesu za běžných fyziologických podmínek. Klíčová role obou těchto receptorů i transkripčního regulátoru ARR1 byla zjištěna rovněž při stimulaci dlouživého růstu hypokotylů v případě semenáčků ošetřených exogenními CK. Navíc bylo prokázáno, že je ve stimulaci zapojena i nedávno objevená nová složka cytokininové signální dráhy – geny CRF.
69
Nebyly zjištěny výrazné rozdíly v responsivitě signální dráhy CK u semenáčků kultivovaných při standardní nebo snížené intenzitě bílého světla. Modulace responsivity signální dráhy CK intenzitou světla tedy pravděpodobně není příčinou rozdílného vlivu CK na dlouživý růst hypokotylů při standardní a snížené intenzitě bílého světla. Analýza mutantů ve fotoreceptorech vedla k závěru, že na stimulaci dlouživého růstu hypokotylů působením CK při nízké intenzitě bílého světla spolupracují receptory PHYB, CRY1 a CRY2. PHYA je zapojen okrajově nebo vůbec. Bylo potvrzeno, že ke stimulaci dlouživého růstu hypokotylů CK nedochází u semenáčků kultivovaných při modrém nebo červeném světle, což naznačuje složitější kooperaci jednotlivých fotoreceptorů jak rovněž ukázala analýza mutantů v genech fotoreceptorů.
70
7
Literatura
Allen M, Qin W, Moreau F, Moffatt B (2002) Adenine phosphoribosyltransferase isoforms of Arabidopsis and their potential contributions to adenine and cytokinin metabolism. Physiol. Plant. 115:56–68 Argyros RD, Mathews DE, Chiang YH, Palmer CM, Thibault DM, Etheridge N, Argyros DA, Mason MG, Kieber JJ, Schaller GE (2008) Type B response regulators of Arabidopsis play key roles in cytokinin signaling and plant development. Plant Cell 20: 2102–2116 Barry GF, Rogers SG, Fraley RT, Brand L (1984) Identification of a cloned cytokinin biosynthetic gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4776–80 Brandstatter I, Kieber JJ (1998) Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1009–1020 Brugiere N, Jiao S, Hantke S, Zinselmeier C, Roessler JA, Niu X, Jones R.J, Habben JE (2003) Cytokinin oxidase gene expression in maize is localized to the vasculature, and is induced by cytokinins, abscisic acid, and abiotic stress. Plant Physiol. 132: 1228-1240 Brzobohatý B, Moore I, Kristoffersen P, Bako L, Campos N, Schell J, Palme K (1993) Release of active cytokinin by a beta-glucosidase localized to the maize root meristem. Science 262:1051–54 Cary AJ, Liu W, Howell SH (1995) Cytokinin action is coupled to ethylene in its effects on the inhibition of root and hypocotyl elongation in Arabidopsis seedlings. Plant Physiol. 107: 1075-1082 Clouse SD (1996) Molecular genetic studies confirm the role of brassinosteroids in plant growth and development. Plant J 10: 1-8 Collett CE, Harberd NP, Leyser O (2000) Hormonal Interactions in the Control of Arabidopsis Hypocotyl Elongation. Plant Physiol. 124: 553-561 Cowling RJ and Harberd NP (1999) Gibberellins control Arabidopsis hypocotyl growth via regulation of cellular elongation. J Exp Bot 50: 1351–1357 Craft J, Šámalová M, Baroux C, Townley H, Martinez A, Jepson I, Tsiantis M, Moore I (2005) New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. Plant J 41: 899–918 Crowell DN, Amasino RM (1994) Cytokinins and plant gene regulation. In DWS Mok and MC Mok, eds, Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Boca Raton, FL, pp 233–242 D`Agostino I, Deruére J, Kieber JJ (2000) Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulator Gene Family to Cytokinin. Plant Physiol. 124: 1706-1717
71
Dobrev PI, Kamínek M (2002) Fast and efficient separation of cytokinins from auxin and abscisic acid and their purification using mixed-mode solid-phase extraction. J Chromatogr A 121:431–442 Dobrev PI, Havlíček L, Vágner M, Malbeck J, Kamínek M (2005) Purification and determination of plant hormones auxin and abscisic acid using solid phase extraction and twodimensional high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1075: 159–166 Ferreira FJ and Kieber JJ (2005) Cytokinin signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 518–525 Folta KM, Pontin MA, Karlin-Neumann G, Bottini R, Spalding EP (2003) Genomic and physiological studies of early cryptochrome 1 action demonstrate roles for auxin and gibberellin in the control of hypocotyl growth by blue light. Plant J 36:203–214 Galuszka P, Frébortová J, Werner T, Yamada M, Strnad M, Thomas Schmülling T, Frébort I (2004) Cytokinin oxidase/dehydrogenase genes in barley and wheat Cloning and heterologous expression. Eur. J. Biochem. 271: 3990-4002 Gendreau E, Traas J, Demos T, Grandjean O, Caboche M, and Hofte H (1997) Cellular Basis of Hypocotyl Growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114: 295-305 Golovko A, Sitbon F, Tillberg E, Nicander B (2002) Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 49:161–69 Hare PD and Staden J (1997) The molecular basis of cytokinin action. Plant Growth Regul. 23: 41–78 Heyl A and Schmülling T (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant. Biol. 6: 480–488 Heyl A, Ramireddy E, Brenner WG, Riefler M, Allemeersch J, Schmülling T (2008) The Transcriptional Repressor ARR1-SRDX Suppresses Pleiotropic Cytokinin Activities in Arabidopsis. Plant Physiol. 147: 1380-1395 Higuchi M, Pischke MS, Mahonen AP, Miyawaki K, Hashimoto Y, Seki M, Kobayashi M, Shinozaki K, Kato T, Tabata S, Helariutta Y, Sussman MR, Kakimoto T (2004) Planta functions of the arabidopsis cytokinin receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 269: 8821–8826 Hutchison CE and Kieber JJ (2002) Cytokinin Signaling in Arabidopsis. Plant Cell S47– S59 Hutchison CE, Li J, Argueso C, Gonzalez M, Lee E, Lewis MW, Maxwell BB, Perdue TD, Schaller GE, Alonso JM, Ecker JR, Kiebera JJ (2006) The Arabidopsis Histidine Phosphotransfer Proteins Are Redundant Positive Regulators of Cytokinin Signaling. Plant Cell 18: 3073-3083 Hwang I and Sheen J (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature 413: 383–389
72
Hwang I and Sakakibara H (2006) Cytokinin biosynthesis and perception. Physiol. Plant. 126: 528-538 Chae HS, Faure F, Kieber JJ (2003) The eto1, eto2, and eto3 mutations and cytokinin treatment increase ethylene biosynthesis in Arabidopsis by increasing the stability of ACS protein. Plant Cell 15:545–559 Chen M, Chory J, Fankhauser C (2004) Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38: 87–117 Chory J, Reinecke D, Sim S, Washburn T, Brenner M (1994) A role for cytokinins in deetiolation in Arabidopsis. Det mutants have an altered response to cytokinins. Plant Physiol. 104: 339-347 Chory J, Cook RK, Dixon R, Elich T, Li HM, Lopez E, Mochizuki N, Nagpal P, Pepper A, Poole D, Reed J (1995) Signal-Transduction Pathways Controlling Light-Regulated Development in Arabidopsis. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 350: 59-65 Chory J, Chatferjee M, Cook RK, Elich T, Fankhauser C, Li J, Nagpal P, Neff M, Pepper A, Poole D, Reed J, Vitart V (1996) From seed germination to flowering, light controls plant development via the pigment phytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12066-12071 Inoue T, Higuchi M, Hashimoto Y, Seki M, Kobayashi M, Kato T, Tabata S, Shinozaki K, Kakimoto T (2001) Identification of CRE 1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature 409:1060-1063 Ioio RD, Nakamura K,Moubayidin L, Perilli S, TaniguchiM, MoritaMT, Aoyama T, Costantino P, Sabatini S (2008) A genetic framework for the control of cell division and differentiation in the root meristem. Science 322: 1380–1384 Jiao Y, Lau OS, Deng XW (2007) Light-regulated transcriptional networks in higher plants. Nat. Rev. Genet. 8:217-230 Kakimoto T (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42:677–85 Kakimoto T (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. 54: 605–627 Kaminek M, Paces V, Corse J, Challice JS (1979) Effect of stereospecific hydroxylation of N6-(delta-2-isopentenyl)adenosine on cytokinin activity. Planta 145: 239–243. Kauschmann A, Jessop A, Koncz C, Szekeres M, Willmitzer L, Altmann T (1996) Genetic evidence for an essential role of brassinosteroids in plant development. Plant J 9:701– 713. Kieber JJ and Schaller GE (2010) The Perception of Cytokinin: A Story 50 Years in the Making. Plant Physiol. 154: 487-492
73
Kim BC, Soh MC, Kang BJ, Furuya M, Nam HG (1996) Two dominant photomorphogenic mutations of Arabidopsis thaliana identified as suppressor mutations of hy2. Plant J 9:441–456 Kim J, Yi H, Choi G, Shin B, Song PS (2003) Functional characterization of phytochrome interacting factor 3 in phytochrome- mediated light signal transduction. Plant Cell 15: 2399– 407 Li H, Culligan K, Dixon RA, Chory J (1995) CUE1: A Mesophyll Cell-Specific Positive Regulator of Light-Controlled Gene Expression in Arabidopsis. Plant Cell 7: 1599-1610 Letham DS (1974) Regulators of cell division in plant tissues. XX. The cytokinins of coconut milk. Physiol. Plant. 32: 66-70 Lochmanová G, Zdráhal Z, Konečná H, Koukalová Š, Malbeck J, Souček P, Válková M, Kiran NS, Brzobohatý B (2008) Cytokinin-induced photomorphogenesis in dark-grown Arabidopsis: a proteomic analysis. J ExpBot 59: 3705–3719 Ma L, Li J, Qu L, Hager J, Chen Z, Zhao H, Deng XW (2001) Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell 13: 2589–2607. Martin RC, Mok MC, Mok DW (1999) Isolation of a cytokinin gene, ZOG1, encoding zeatin O-glucosyltransferase from Phaseolus lunatus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:284–89 Martin RC, Mok MC, Mok DW (1999) A gene encoding the cytokinin enzyme zeatin Oxylosyltransferase of Phaseolus vulgaris. Plant Physiol. 120:553–58 Miller CO, Skoog F, von Saltza MH, Strong M (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77:1329–34 Mira-RodadoV, Sweere U,Grefen CH, Kunkel , Fejes E, Nagy F, Schäfer E, Harter (2007) Functional cross-talk between two-component and phytochrome B signal transduction in Arabidopsis. J Exp Bot 58: 2595–2607 Miyawaki K, Tarkowski P, Matsumoto-Kitano M, Kato T, Sato S, Tarkowska D, Tabata S, Sandberg G, Kakimoto T (2006) Roles of Arabidopsis ATP/ADP isopentenyltransferases and tRNA isopentenyltransferases in cytokinin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 16598–16603 Mok DWS and Mok MC (2001) Cytokinin metabolism and action Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52: 89–118 Moore, I., Gälweiler L, Grosskopf D, Schell J, Palme K (1998) A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 376–381 Mähönen A.P, Bonke M, Kaupinnen L, Riikonen M, Benfey P.N, and Helariutta Y (2000) A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 14: 2938-2943
74
Nishimura C, Ohashi Y, Sato S, Kato T, Tabata S, Ueguchi C (2004) Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis. Plant Cell 16: 1365–1377 Rashotte AM, Carson SDB, To JPC, Kieber JJ (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol. 132: 998–2011 Rashotte AM, Chae1 HS, Maxwell BB, Kieber JJ (2005) The interaction of cytokinin with other signals. Physiol. Plant. 123: 184–194 Rashotte AM, Mason MG, Hutchison CE, Ferreira FJ, Schaller GE, Kieber JJ (2006) A subset of Arabidopsis AP2 transcription factors mediates cytokinin responses in concert with a two-component pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 11081–11085 Riefler M, Novak O, Strnad M, and Schmülling T (2006) Arabidopsis Cytokinin Receptor Mutants Reveal Functions in Shoot Growth, Leaf Senescence, Seed Size, Germination, Root Development, and Cytokinin Metabolism. Plant Cell 18: 40-54 Romanov GA, Lomin SN, Schmulling T (2006) Biochemical characteristics and ligand binding properties of Arabidopsis cytokinin receptor AHK3 compared to CRE1/AHK4 as revealed by a direct binding assay. J. Exp. Bot. 57: 4051–4058 Sakakibara H (2006) Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 431–449 Schmülling T, Schäfer S, Romanov G (1997) Cytokinins as regulators of gene expression Physiol. Plant. 100: 505–519 Smalle J, Haegman M, Kurepa J,Van Montagu M, Van Der Straeten D (1997) Ethylene can stimulate Arabidopsis hypocotyl elongation in the light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2756–2761 Smets R, Le J, Prinsen E,Verbelen J-P, Van Onckelen HA (2005) Cytokinin-induced hypocotyl elongation in light-grown Arabidopsis plants with inhibited ethylene action or indole-3-acetic acid transport. Planta 221: 39-47 Spíchal L, Rakova NY, Riefler M, Mizuno T, Romanov GA, Strnad M & Schmülling T (2004) Two cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1⁄AHK4 and AHK3, differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol. 45: 1299-1305. Spíchal L, Werner T, Popa1 I, Riefler M, Schmülling T, Strnad M (2008) The purine derivative PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition. FEBS Journal 276: 244-253 Stmad M (1997) The aromatic cytokinins. Physiol. Plant. 101: 674-688 Su W, Howell SH (1995) The effects of cytokinin and light on hypocotyl elongation are independent and additive. Plant Physiol. 108:1423-1430
75
Šámalová M, Brzobohatý B, Moore I (2005) pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. Plant J 41: 919-935. Takei K, Yamaya T, Sakakibara H (2003) A method for separation and determination of cytokinin nucleotides from plant tissues. J Plant Res. 116:265–269 Takei K, Yamaya T, Sakakibara H (2004b) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. Journal of Biological Chemistry 279: 41866–41872 Takei K, Dekishima Y, Eguchi T, Yamaya T, Sakakibara H (2003) A new method for enzymatic preparation of isopentenyladenine-type and trans-zeatin-type cytokinins with radioisotope-labeling J Plant Res. 116:259-63 Takei K, Yamaya T, Sakakibara H (2004b) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J Biol Chem 279: 41866–41872 Taiz L, Zeiger E (2002) Plant Physiology Third Edition, Sinauer Associates, Sunderland USA ISBN 0-87893-823-0 To JPC and Kieber JJ (2008) Cytokinin signaling: two-components and more. Trends Plant Sci. 13: 85–92 Ueguchi C, Sato S, Kato T, and Tabata S (2001) The AHK4 gene involved in the cytokinin-signalling pathway as a direct receptor molecule in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42: 751-755 Vandenbussche F, Vriezen WH, Smalle J, Laarhoven LJJ, Harren FJM, Van Den Straeten D (2003) Ethylene and auxin control the Arabidopsis response to decreased light intensity. Plant Physiol. 133: 517-527 Vandenbussche F, Verbelen, JP, Van Den Straeten D (2005) Of light and length: regulation of hypocotyl growth in Arabidopsis. Bioessays 27: 275–284 Vandenbussche F, Habricot Y, Condiff AS, Maldiney R,Van Der Straeten D, Ahmad M (2007) HY5 is a point of convergence between cryptochrome and cytokinin signalling pathways in Arabidopsis thaliana. Plant J. 49: 428–441 Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology 3: RESEARCH0034 Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmülling T (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10487–10492 Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmülling T (2003) Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations
76
indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15: 2532-2550 Werner T, Schmulling T (2009) Cytokinin action in plant development. Curr. Opin. Plant. Biol. 12: 527–538 Yamada H, Suzuki T, Terada K, Takei K, Ishikawa K, Miwa K, Yamashino T, Mizuno T (2001) The Arabidopsis AHK4 histidine kinase is a cytokinin-binding receptor that transduces cytokinin signals across the membrane. Plant Cell Physiol. 42:1017–1023
77
8
Seznam zkratek
ABA
kyselina abscisová
ACC
1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina (prekurzor biosyntézy etylénu)
ACO
ACC oxidasa (enzym biosyntetické dráhy etylénu)
AHK
Arabidopsis histidin kinase (receptor cytokininů; člen TCS)
AHP
Arabidopsis histidin phosphotransfer protein (člen TCS)
ARR
Arabidopsis response regulator (člen TCS)
APT
adenin fosforybosyltransferasa
AVG
aminoetoxyvinylglycin (inhibitor biosyntézy etylénu)
B
modré světlo
BA
benzyladenin (cytokinin)
BR
brasinosteroidy
CK
cytokininy
CKX
cytokinin oxidasa/dehydrogenasa (enzym metabolické dráhy cytokininů)
CRF
cytokinin response factor
CRY
kryptochrom (fotoreceptor modrého světla)
cZ
cis-zeatin (cytokinin)
DEPC
diethylpyrokarbonát
Dex
dexametazon
DHZ
dihydrozeatin (cytokinin)
DMAPP
dimetyallyl difosfát (substrát biosyntézy cytokininů)
FR
vzdálené červené světlo
GA
gibereliny
HMDDP
1-hydroxy-2-metyl-2-(E)-butenyl 4-difosfát (substrát biosyntézy cytokininů)
hsp90
heat shoch protein 90
IAA
kyselina indolyl-3-octová (auxin)
iP
isopentenyl (cytokinin)
ipt
isopentenyltransferasa (kódovaná genem Tmr z Agrobacterium tumefaciens)
IPT
isopentenyltransferasa (kódovaná multi-genovou rodinou AtIPT z Arabidopsis thaliana)
LNM
médium s nízkým obsahem minerálních solí
MS
Murashige a Skoogovo médium
78
NPA
kyselina 1-naftylftalamová (inhibitor polárního transportu auxinů)
oT
ortho-topolin (cytokinin)
Pfr
fr forma fytochromu (biologicky aktivní)
PHOT
fototropin (fotoreceptor modrého a ultrafialového světla)
PHY
fytochrom (fotoreceptor červeného a vzdáleného červeného světla)
PI-55
6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino) purin (antagonista vzhledem k CK)
Pr
r forma fytochromu (biologicky neaktivní)
R
červené světlo
RT-qPCR
kvantitativní RT-PCR
SAM
vrcholový apikální meristém (shoot apical meristem)
TCS
kanonická dvou-komponentní dráha odpovědi
TDZ
tidiazuron (cytokinin)
tZ
trans-zeatin (cytokinin)
UVA
ultra fialové světlo A
UVB
ultra fialové světlo B
79
Přílohy
Název ethylene resistant de-etiolated cryptochrome long hypocotyl long hypocotyl long hypocotyl long hypocotyl phytochrome A phytochrome B phytochrome A, phytochrome B
Lokus etr1 det2 cry2 hy1 hy2 hy4 hy5 phyA phyB phyA phyB
Alela etr1-3 det2-1 cry2-1 hy1-1 hy2-1 hy4-1 hy5-1 phyA-201 phyB-1 phyA-201 phyB-5
AGI kód At1g66340 At2g38050 At1g04400 At2g26670 At3g09150 At4g08920 At5g11260 --At2g18790 --At2g18791
Zdroj NASC NASC NASC NASC NASC NASC NASC NASC NASC NASC
NASC ID N3070 N6159 N3732 NW67 N68 N70 N71 N6219 N6211 N6224
P. 1 V tabulce je uveden seznam použitých mutantů v etylénové, brasinosteroidové a světelné signální dráze. Mutanti byli získáni z The European Arabidopsis Stock Centre (NASC).
5
-2
µmol fotonů m s
-1
dny
intenzita světla
Délka hypokotylu mm ± SE, %
3 5 7 9 11
20
-2
µmol fotonů m s
-1
13 3 5 7 9 11
aktivované linie 2H214C
44G414C
7G114C
4G314C
2,19±0,09 100% 2,98±0,10 136% 3,17±0,11 145% 3,25±0,10 148% 3,41±0,10 156% 3,56±0,10 163%
2,70±0,04 123% 3,11±0,07 142% 3,48±0,07 159% 3,66±0,09 167% 4,01±0,12 183% 4,33±0,12 198%
2,60±0,07 119% 3,60±0,09 164% 4,27±0,10 195% 4,62±0,10 211% 4,89±0,12 223% 5,21±0,11 238%
2,79±0,08 127% 3,51±0,10 160% 4,19±0,11 191% 4,67±0,12 213% 5,08±0,13 232% 5,37±0,14 245%
2,30±0,08 105% 2,48±0,09 113% 3,68±0,11 168% 3,72±0,13 170% 4,11±0,11 188% 4,43±0,11 202%
1,27±0,04 100% 1,53±0,04 120% 1,82±0,04 143% 2,22±0,05 175% 2,51±0,05 198% 2,71±0,06 213%
1,44±0,04 113% 1,94±0,06 153% 2,39±0,07 188% 2,87±0,08 226% 3,21±0,08 253% 3,35±0,09 264%
1,38±0,03 109% 1,92±0,03 151% 2,41±0,04 190% 3,15±0,06 248% 3,76±0,07 296% 4,06±0,09 320%
1,73±0,08 136% 2,24±0,07 176% 2,69±0,07 212% 3,31±0,07 261% 3,65±0,05 287% 3,96±0,09 312%
1,61±0,06 127% 2,05±0,08 161% 2,52±0,07 198% 2,86±0,11 225% 3,35±0,11 264% 3,70±0,11 291%
0,94±0,02 100% 1,05±0,03 112% 1,25±0,03 133% 1,29±0,03 137%
0,90±0,02 96% 1,06±0,02 113% 1,19±0,03 127% 1,22±0,02 130%
1,01±0,03 107% 1,10±0,02 117% 1,21±0,02 129% 1,28±0,03 136%
0,93±0,04 99% 1,07±0,03 114% 1,14±0,05 121% 1,27±0,04 135%
0,89±0,04 95% 0,96±0,03 102% 1,16±0,03 123% 1,25±0,04 133%
0,85±0,02 100% 0,93±0,02 109% 0,99±0,03 116% 1,08±0,03 115%
0,87±0,02 102% 0,95±0,02 112% 1,01±0,03 119% 1,06±0,03 125%
0,90±0,02 106% 0,94±0,03 111% 0,95±0,03 112% 1,10±0,03 129%
0,93±0,03 109% 0,93±0,03 109% 1,01±0,02 119% 1,05±0,02 124%
0,82±0,05 96% 0,86±0,03 101% 0,95±0,04 112% 1,05±0,05 124%
0,81±0,02 100% 0,88±0,02 109% 0,92±0,02 114% 1,01±0,04 125%
0,88±0,02 109% 0,88±0,02 109% 0,99±0,02 122% 1,00±0,02 123%
0,84±0,02 109% 0,84±0,02 109% 0,89±0,02 110% 0,91±0,01 113%
0,81±0,02 100% 0,85±0,02 105% 0,85±0,02 105% 0,90±0,03 111%
0,90±0,05 111% 0,91±0,07 113% 0,94±0,05 118% 0,96±0,03 119%
3 5 7 9 3 5 7 9
80
-2
µmol fotonů m s
-1
70
-2
µmol fotonů m s
-1
50
-2
µmol fotonů m s
-1
13
kontrola
3 5 7 9
P. 2 Vliv hladiny endogenních CK a intenzity bílého světla na prodlužování hypokotylů. Semenáčky byly kultivovány při režimu dlouhého dne a uvedených světelných intenzitách. Byla sledována kinetika dlouživého růstu hypootylů v rozsahu 3 – 9 respektive 13 dne kultivace. Výsledky jsou prezentovány jako průměr (n20) semenáčků. Chybové úsečky vyjadřují standardní chybu.
Obsah CK (pmol g-1 FW) aktivované linie 5 mol m-2 s-1 báze ribosidy fosfáty O-glukosidy N-7-glukosidy N-9-glukosidy suma CK
kontrola 4.67 2.50 107.50 33.17 236.33 18.00 402.17
2H214C --45.86 85.00 32.86 268.86 28.29 460.86
44G414C --3.22 51.67 46.44 1065.89 134.44 1301.67
7G114C --13.57 164.86 148.14 1770.00 280.29 2376.86
4G314C 26.67 131.83 816.00 620.50 3696.67 668.17 5959.83
20 mol m-2 s-1 báze ribosidy fosfáty O-glukosidy N-7-glukosidy N-9-glukosidy suma CK
kontrola --8.20 44.00 21.00 409.20 15.80 498.20
2H214C --45.86 85.00 32.86 354.65 44.29 562.66
44G414C --2.73 64.36 37.91 668.27 66.09 839.36
7G114C --16.67 161.33 196.22 1861.11 328.33 2563.67
4G314C --6.67 62.75 90.58 1110.83 158.75 1429.58
50 mol m-2 s-1 báze ribosidy fosfáty O-glukosidy N-7-glukosidy N-9-glukosidy suma CK
kontrola 3.36 1.31 12.88 9.71 186.97 11.75 225.99
2H214C --1.39 53.73 45.89 607.13 103.11 811.24
44G414C --4.19 38.98 69.70 1433.90 193.40 1740.18
7G114C 1.15 6.46 74.81 70.87 951.92 119.66 1224.87
4G314C 3.02 5.16 69.60 37.14 542.14 94.52 751.59
P. 3 Obsah CK stanovený u transgenních rostlin s konstitutivní expresí ipt. V tabulce je uvedený celkový obsah CK pro jednotlivé linie a dále obsah jednotlivých tříd metabolitů CK. Obsah CK byl stanoven u 36denních (5 µmol fotonů m-2 s-1), 30-denních (20 µmol fotonů m-2 s-1) a 28-denních (50 µmol fotonů m-2 s-1) rostlin. --- = nedetekovatelné hodnoty. Pro stanovení obsahu CK byla použita jedna biologická replika a byly provedeny dvě nezávislá přístrojová stanovení (LC-MS/MS). Stanovené hodnoty jednotlivých fytohormonů jsou vyjádřeny v pikomolech vztažených na gram svěží hmotnosti semenáčků (pmol.g-1FW).
Obsah CK (pmol g-1 FW) Col- 0 kontrola
báze 0.030.02 ribosidy 1.62±0.50 fosfáty 11.64±0.54 O-glukosidy 8.86±0.03 N-7-glukosidy 71.16±2.49 N-9-glukosidy 7.07±0.12 suma CK 100.38±3.45
1 1
80 nM Dex
kontrola
1 3
80 nM Dex
kontrola
80 nM Dex
0.26±0.01
0.19±0.01
0.71±0.11
0.17±0.08
0.46±0.11
1.39±0.25
1.95±0.06
10.38±1.51
1.73±0.03
4.40±0.98
9.06±0.20
9.37±0.34
91.33±0.75
11.62±0.03
33.22±3.92
8.94±0.40
8.45±0.68
26.33±0.10
5.97±0.46
15.04±0.34
67.50±6.02 69.45±5.10 128.57±0.97
77.35±2.55
79.64±1.33
6.97±0.69
13.22±1.56
6.52±0.52
7.00±0.76
27.68±0.25
93.66±4.66 96.41±5.47 285.00±1.56 103.81±2.23 145.97±7.57
P. 4 Obsah CK stanovený u transgenních rostlin s expresí ipt indukovatelnou Dex. V tabulce je uvedený celkový obsah CK pro jednotlivé linie a dále obsah jednotlivých tříd metabolitů CK. stanovení obsahu CK byly použity 2 bilogické repliky a pro každou z nich byly provedeny dvě nezávislá přístrojová stanovení (LCMS/MS). Stanovené hodnoty jednotlivých fytohormonů jsou průměrem dvou biologických replik a jsou vyjádřeny v pikomolech vztažených na gram svěží hmotnosti semenáčků (pmol.g-1FW). Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku.
P 5. Stimulace dlouživého růstu hypokotylů a inhibice růstu kořene působením CK. Semenáčky Col-0 byly kultivovány 10 dnů při snížené intenzitě bílého světla a režimu dlouhého dne na MS médiu s koncentrační řadou tZ.
