MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

BIOLOGICKÉ ÚČINKY NĚKTERÝCH NANOMATERIÁLŮ Bakalářská práce

Zdeněk Pokorný

Vedoucí práce: doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.

1

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Zdeněk Pokorný Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Biologické účinky některých nanomateriálů

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Obecná biologie, zaměření Fyziologie živočichů

Vedoucí práce:

doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

41

Klíčová slova:

Nanomateriály, nanočástice titanu, nanočástice zlata, nanočástice stříbra, antibakteriální účinky, charakteristika nanočástic, příprava nanočástic, Escherichia coli

2

Bibliographic Entry Author

Zdeněk Pokorný Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Biological effects of some nanomaterials

Degree programme:

Biology

Field of Study:

General Biology, focus on Animal Physiology

Supervisor:

doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

41

Keywords:

Nanomaterials, titanium nanoparticles, gold nanoparticles, silver nanoparticles, antibacterial effects, characterization of nanoparticles, the preparation of nanoparticles, Escherichia coli

3

Abstrakt Tato bakalářská práce se zabývá srovnáním vybraných druhů nanomateriálů a jejich vliv na mikroorganismy. Jedná se o nanomateriály titanu, zlata a stříbra. Nejpoužívanějším mikroorganismem je grampozitivní Escherichia coli. Práce především shrnuje vlastnosti nanomateriálů, získané převážně pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM), přípravu, která je ve všech případech velice rozmanitá, antibakteriální vlastnosti a jejich využití v praxi. V závěru je uvedeno srovnání všech tří nanomateriálů a možnost jejich využití pro jejich antibakteriální účinky vzhledem k narůstající rezistenci mikroorganismů k antibiotikům.

Abstract This bachelor thesis deals with comparison of selected nanomaterials and their effects on microorganisms. It is a nano-titanium, gold and silver. The most commonly used microorganism is a Gram-positive Escherichia coli. The work mainly summarizes the properties of nanomaterials, obtained mainly by transmission electron microscopy (TEM), preparation, which in all cases are very diverse, antibacterial properties and their use in practice. In conclusion is presented a comparison of all three nanomaterials and the possibility to use them for their antibacterial effects due to the increasing resistance of microorganisms to antibiotics.

4

5

6

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat vedoucí mé práce paní doc. RNDr. Aleně Žákovské, Ph.D. za trpělivost, vstřícnost a cenné rady při psaní této práce, kamarádce, která mně pomohla se slohovou stránkou a samozřejmě mé rodině za jejich podporu při studiu a v celém životě.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 14. května 2013

……………………………… Jméno Příjmení

7

Obsah 1. ÚVOD ............................................................................................................................................. 9 2. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA NANOČÁSTIC .....................................................................................10 2.1 TITAN ......................................................................................................................................11 2.1.1 Charakteristika titanu .......................................................................................................11 2.1.2 Příprava nanočástic titanu ................................................................................................11 2.1.3 Antibakteriální účinek titanu .............................................................................................12 2.1.4 Využití titanu ....................................................................................................................14 2.2 ZLATO......................................................................................................................................15 2.2.1 Historie zlata ....................................................................................................................15 2.2.2 Charakteristika koloidního zlata ........................................................................................15 2.2.3 Příprava nanočástic zlata ..................................................................................................16 2.2.4 Antibakteriální účinek zlata ...............................................................................................16 2.2.5 Využití zlata ......................................................................................................................20 2.3 STŘÍBRO ..................................................................................................................................21 2.3.1. Historie stříbra.................................................................................................................21 2.3.2. Charakteristika koloidního stříbra ....................................................................................22 2.3.3. Příprava nanočástic stříbra ..............................................................................................23 2.3.4. Antibakteriální účinek stříbra ...........................................................................................24 2.3.5. Mechanismus působení nanočástic stříbra .......................................................................27 2.3.6. Škodlivé účinky stříbra .....................................................................................................30 2.3.7. Využití stříbra .................................................................................................................32 3. ZÁVĚR ...........................................................................................................................................33 4. Seznam zkratek .............................................................................................................................34 5. Seznam literatury ..........................................................................................................................35

8

1. ÚVOD Využívání nanomateriálů se v dnešní době rozšířilo prakticky do všech odvětví průmyslu. Nejvíce tohoto rozmachu využívají kmenové obory, které se o vzestup nanomateriálů zasloužily. Jde především o chemické a fyzikální obory a ty, které jsou k těmto v blízkém vztahu. Jako příklady, kde se nanomateriály nejvíce uplatňují, si můžeme uvést chemickou katalýzu, fotokatalýzu, elektrochemii, výrobu ochranných a samočisticích materiálů. Neméně významnou roli hrají tyto částice s nano-rozměry v lékařství. Zde se můžeme setkat s různými významy pojmu „nanomateriál“. Jako nanomateriály totiž můžeme označit všechny částice, sloučeniny nebo struktury odpovídající svou velikostí rozměrům nanočástic. Příkladem si můžeme uvézt liposomy, což jsou malé váčky tvořené fosfolipidovou membránou mající malou dutinku uprostřed a používají se jako vektory pro různá léčiva. Další význam nanomateriálu, kterou se tato bakalářská práce zabývá, jsou nanomateriály kovů. Pro lékařství jsou tyto nanomateriály důležité z hlediska jejich antibakteriálního účinku, a to především nanočástice stříbra, které vykazuje nejlepší antibakteriální vlastnosti. Tento způsob využívání nanostříbra je velice důležitý, vzhledem ke zvyšující se rezistenci bakterií k dosud vynalezeným antibiotikům.

9

2. OBECNÁ CHARAKTERISTIKA NANOČÁSTIC Nanotechnologie, tento pojem se skládá ze dvou řeckých slov, nanos neboli trpaslík a techné, což v překladu znamená dovednost, zručnost. V definici nanotechnologie je velice významná role velikosti zkoumaného zájmu. Tato vědní disciplína se zabývá objekty, které svou velikostí spadají do řádu nanometrů (tedy 10 -9 metru). Objekty, které mají takovou velikost, se běžně zabývají obory jako chemie, biologie a fyzika (Šrámek 2009). Z tohoto důvodu je potřeba zpřesnit definici nanotechnologie. Tu lze definovat podle Booker, Boyen (2005) a podle URL 1 jako technický obor, který se zabývá výzkumem a vývojem takových materiálů nebo systémů, jejichž alespoň některé charakteristické rozměry mají velikost řádově v jednotkách až desítkách nanometrů. Jako zakladatel nanotechnologie se obvykle uvádí fyzik Richard P. Feynman (1918 1988), který na kongresu v American Physical Society v roce 1959 nastínil v příspěvku There's Plenty of Room at the Bottom (Tam dole je spousta místa) principy nanotechnologie. Tvůrcem pojmu nanotechnologie a jejím velkým propagátorem je Eric Drexler, který je autorem konceptu nanorobotů, kteří jsou schopny sami se replikovat, opravovat poškozené struktury, a tím opravit i poškozený hostitelský organismus (Šrámek 2009). Nejběžnějšími nanomateriály jsou nanomateriály kovů, a to konkrétně přechodné d-prvky. Mezi charakteristické vlastnosti d-prvků patří vysoký index lomu světla, díky kterému mají kovový lesk. Jsou to velmi dobré vodiče tepla a elektrického proudu, tažnost a kujnost, malá ionizační energie a elektronegativita. Snadno vytvářejí kationty, vysoká teplota tání a varu, velká barevnost, jsou tvrdé a křehké (Vacík a kol. 1999). Nanočástice jsou charakteristické svou velikostí, která je od 1 do ~ 100 nanometrů alespoň v jednom rozměru a také svým prostorovým uspořádáním, které může nabývat rozličných podob. Jako příklady můžeme uvést nanodráty, nanokompozity, nanotrubice, tenké filmy či vrstvy. Další významnou vlastností je obrovský nárůst plochy části vůči jejich objemu (URL 2).

10

2.1 TITAN 2.1.1 Charakteristika titanu Titan se řadí mezi nejrozšířenější prvky zemské kůry, patří mu 10. místo. V čistém stavu připomíná vzhledem ocel, je ale pevnější a odolnější vůči korozi a má o 40% menší hustotu. Používá se na výrobu nadzvukových letadel jako součást titanových ocelí. Nejdůležitější sloučeninou je oxid titaničitý TiO 2 (titanová běloba), bílý pigment do nátěrových barev s největší krycí schopností (Vacík a kol. 1999).

2.1.2 Příprava nanočástic titanu Příprava nanočástic obsahující titan zahrnuje několik variant. Jednou z nich je příprava nanočástic pouze z titanu. I tato metoda má několik různých možností. Příkladem může být varianta použitá Jingem a kol. (2013). Základem je titanová sloučenina titanium n-butoxide (dále TBOT). Reakční směs ještě obsahuje vysoce čistou vodu, 2-propanol a koncentrovanou kyselinu dusičnou v poměru 1:155:1,5:0,1. Směs TBOT a 2-propanolu se po kapkách přidává do zředěné kyseliny dusičné. Následně se tato suspenze intenzivně míchá po dobu 24 hodin při teplotě 80°C. Poté je směs ochlazena na 25°C a vzniklé nanočástice shromážděny centrifugací. Další variantou výroby nanočástic je potažení jedné nanočástice titanovým obalem. Příkladem může být výroba takovýchto nanočástic pomocí manganato-zinečnatých feritů potažených titanovým obalem (Ma a kol. 2003). Manganato-zinečnatý ferit se připravil ze směsi uhličitanu manganatého, hexahydrátu dusičnanu zinečnatého a dodekahydrátu dusičnanu železnatého v molárním poměru Mn:Zn:Fe 3:2:10. K této práškové směsi se přidá roztavená kyseliny stearová. Směs se zahřívá na olejové lázni na teplotu 120°C po dobu tří až čtyř hodin. Vzniklý gel je broušen na prášek, který je promyt etanolem a sušen při teplotě 100° po dobu 24 hodin. Konečný ferit je získán následným zahřáním na teplotu 450°C po dobu jedné hodiny. Takto připravený ferit se obrousí na prášek a přidá do etanolu. Za intenzivního míchání se přidá chlorid titaničitý a po 25 minutách se roztok přidá do vodného roztoku kyseliny dusičné. Po 30 minutách míchání se ke směsi přidá amoniak a vzniklá sraženina se odfiltruje a promyje neionizovanou vodou. Směs se následně suší při teplotě 100°C po dobu 24 hodin a poté se opět brousí na prášek, který se následně zahřívá na teplotu 400°C po dobu tří hodin.

11

2.1.3 Antibakteriální účinek titanu Antibakteriálními účinky titanu, respektive jeho oxidu, se ve své práci zabýval Tsuang a kol. (2008). Velikost nanočástic oxidu titaničitého byla 20 nm. Antibakteriální účinky byly zkoumány se současným ozářením vzorků ultrafialovým (dále jen UV) zářením o vlnové délce 35,6 nm. V experimentu bylo použito pět mikroorganismů Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus hirae (ATCC 9790), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) a Bacteroides fragilis (kmen 638R). U všech výše uvedených mikroorganismů došlo k baktericidnímu účinku při působení obou faktorů po dobu jedné hodiny, což je vidět v grafech obrázku 1 (skupina D). Skupiny B a C obsahují jednu ze dvou složek experimentu. Ve skupině B je použito pouze UV záření a naopak skupina C obsahuje pouze nanočástice oxidu titaničitého. Oproti kontrole (skupina A) zde není vidět žádný statistický rozdíl. Neúčinnost nanočástic oxidu titaničitého bez přítomnosti UV záření dokazuje experiment od Vargas-Reus a kol. (2012), který byl proveden s více druhy nanomateriálů. Rozmezí velikosti částic je 10 až 50 nanometrů. Pokus probíhá za anaerobních podmínek. Použité mikroorganismy byly Porphyromonas gingivalis W83, Prevotella intermedia ATCC 25611, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 a Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 33384. Naměřené hodnoty minimální inhibiční koncentrace (minimální koncentrace látky, která viditelně inhibuje růst mikroorganismu) a minimální baktericidní koncentrace (minimální koncentrace látky potřebná k usmrcení mikroorganismu nejméně 99,9%) vidíme v Tabulce 1. Nejvyšší připravená koncentrace nanočástic titanu byla 2500 μg * ml-1, proto v Tabulce 1 vidíme, že minimální baktericidní koncentrace je vyšší než 2500 μg * ml -1, ale není známa její přesná hodnota. Tabulka 1: Minimální inhibiční a baktericidní koncentrace pro nanočástice oxidu titaničitého. Mikroorganismus

Minimální inhibiční koncentrace -1

Minimální baktericidní

(μg * ml )

koncentrace (μg * ml-1)

Porphyromonas gingivalis

2500

˃2500

Prevotella intermedia

1000

˃2500

Fusobacterium nucleatum

1000

˃2500

Aggregatibacter

250

˃2500

actinomycetemcomitans

12

Obrázek 1: Účinek UV záření a nanočástic oxidu titaničitého na Escherichii coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Enterococcus hirae a Staphylococcus aureus. Skupina A je negativní kontrola, skupina B ukazuje vliv UV záření na daný mikroorganismus, skupina C vliv nanočástic oxidu titaničitého a skupina D vliv obou dvou složek působících zároveň po 60 minutách (převzato z Tsuang a kol., 2008).

13

2.1.4 Využití titanu Nanočástice oxidu titaničitého se společně s UV zářením dají využívat v medicíně jako ochrana zevních fixačních aparátů na zlomeniny, a tím zamezit přenosu infekce z přístroje na pacienta (Tsuang a kol. 2008) nebo také v zubním lékařství k ošetření zubních protéz pro zamezení tvorby bakteriálních kolonií a zabránění tak tvorbě infekcí (Vargas-Reus a kol. 2012).

14

2.2 ZLATO 2.2.1 Historie zlata V Číně, asi před 7000 lety, byla vyvinuta technika akupunktury. Jako jehlice se používaly různé druhy dřeva a bambusu. Později byly tyto jehlice vyměněny za jehlice kovové, konkrétně za zlaté a stříbrné. Zlaté jehlice měly tělo stimulovat, zatímco stříbrné uklidňovat (URL 3). Před více než 5000 lety používali staří Egypťané zlato v zubním lékařství. Také věřili, že zlato má pozitivní účinek na tělesnou a duchovní očistu. Ve starověku věřili, že zlato obsažené v těle stimuluje chi, neboli životní sílu (URL 4). Ve starém Římě používali balzámy se stříbrem k hojení kožních lézí nebo vředů. Ve středověké Evropě byly populární pozlacené tablety a do nápojů se přimíchávalo práškové zlato (URL 4). V této době se „rozpuštěné zlato“ používalo na léčbu srdečních onemocnění, pohlavních nemocí, úplavice, epilepsie a také k diagnostikování syfilis (Daniel a Astruc 2004). To vše je popsáno v první knize o koloidním zlatě, kterou vydal v roce 1618 filozof a lékař Francisci Antonii (Antonii 1618). Jako první připravil koloidní roztok zlata alchymista Paracelsus. Na jeho práci navázal anglický vědec Michael Faraday, který v roce 1857 připravil koloidní zlato, a tím byly objeveny další možnosti využití koloidního zlata. To vyústilo až k objevení antibakteriálních účinků nanočástic zlata (URL 4).

2.2.2 Charakteristika koloidního zlata Zlato patří do skupiny d-prvků, a to konkrétně do skupiny mědi, do které se k těmto dvěma prvkům řadí i stříbro. Oxidační čísla zlata jsou 0, I a III. Je to žlutý, lesklý kov, odolný vůči kyselinám, zásadám i kyslíku. Rozpouští se pouze v lučavce královské, což je směs kyseliny dusičné a chlorovodíkové v poměru 1:3 (Dvořáčková 2003). Nanočástice zlata se připravují redukcí svých solí s pomocí redukčních činidel. Díky těmto činidlům se velikost nanočástic zlata pohybuje v rozmezí 3 – 120 nanometrů. Charakteristické nanočástice zlata můžeme vidět na Obrázku 2 (Prnka a Šperlink 2006). Zlaté

nanočástice

mají

antibakteriální 15

Obrázek 2: Nanočástice zlata (Prnka a Šperlink 2006)

účinek. Tato vlastnost úzce souvisí s jejich velikostí. Menší částice mají větší poměr mezi povrchem a objemem, než větší částice. Díky tomu mají silnější antibakteriální účinek (Zhang a kol. 2008). Charakteristická barva koloidního zlata je červená (Nangia a kol. 2009).

2.2.3 Příprava nanočástic zlata Syntéza nanočástic zlata se v průběhu času neustále zdokonaluje. Jedná se o různé druhy přípravy nanočástic až po snahu o co nejlepší stabilizaci ve vodném roztoku. Jednou z nejzajímavějších metod syntézy nanozlata je použití bakterií kmene Stenotrophomonas maltophilia (AuRed02), která se vyskytuje ve zlatých dolech v Indii. Touto prací se zabýval Nangia a kol. (2009). Jako substrát pro syntézu si vybral hydrogenchlorid zlatitý (HAuCl2). Po osmihodinové inkubaci při teplotě 25 °C se změnila barva roztoku hydrogenchloridu zlatitého v suspenzi se Stenotrophomonas maltophilia (AuRed02) ze žluté na červenou, což ukazuje na tvorbu nanočástic zlata. Charakterizací pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) byla zjištěna velikost nanočástic pohybující se okolo 40 nm. Při další charakterizaci nanočástic se zjistilo, že jsou spojeny s negativně nabitými fosfátovými skupinami z NADP, což je činí stabilními ve vodném prostředí. Možným mechanismem, díky kterému je schopen Stenotrophomonas maltophilia vytvářet nanočástice zlata z jeho hydrogenchloridu, je přítomnost NADPH dependentní reduktázy, která je schopná snížit oxidační číslo zlata z 3+ na 0 pomocí redukčního procesu kovu za pomoci enzymů (Nangia a kol. 2009). Další

možná

syntézá

nanočástic

stříbra

je

pomocí

velmi

větvené

látky

poly(amidoamin) s koncovými skupinami dimetylaminu [HPAMAM-N (CH3)2], která zde vystupuje jako stabilizační a redukční činidlo. Velikost nanočástic zlata se dá jednoduše ovlivnit úpravou molárního poměru N / Au. Je-li tento poměr roven dvěma, má vzniklé zlato nízkou antimikrobiální účinnost. Zvedne-li se však tento poměr na hodnotu okolo 30, snížila se průměrná velikost částic zlata až na 3,9 nm. Antibakteriální účinek se ještě zvyšuje díky přítomnosti

kationtům

HPAMAM-N

(CH3)2

přispívající

k

antimikrobiální

aktivitě

prostřednictvím silné interakce iontů s bakteriemi (Zhang a kol. 2008). Dalším způsobem syntézy zlatých nanočástic jsou mokré chemické metody, které jsou založeny na redukci zlatých solí pomocí činidel, jako je kyselina askorbová nebo tetrahydridoboritan sodný (Rayavarapu a kol. 2007).

2.2.4 Antibakteriální účinek zlata Antibakteriálními vlastnostmi zlata se ve své práci zabýval Zhou a kol. (2012). Použil při tom dva mikroorganismy. Jedním z nich je Escherichia coli DH5α a druhým Bacillus 16

Calmette-Guérin (BCG), který se používá jako náhrada při vývoji vakcíny proti tuberkulóze místo Mycobacterium tuberculosis, který tuto nemoc způsobuje. Nanočástice zlata byly v tomto případě stabilizovány dvěma různými sloučeninami, což mělo také vliv na účinnost jednotlivých vzorků nanočástic. První sloučeninou jsou ionty citrátu a druhou polyallylamin hydrochorid (PAH). Nanočástice stabilizované citrátem měli průměrnou velikost 20–30 nm a měly kulovitý tvar. Nanozlato stabilizované PAH mělo taktéž kulovití tvar a průměrnou velikost 22 nm. Na Obrázku 3 jsou vidět grafy inhibičního působení nanočástic zlata na bakterie E. Coli.

Obrázek

3A

znázorňuje

účinnost

nanozlata

stabilizovaného

ionty

citrátu

a Obrázek 3B ukazuje účinnost nanočástic zlata stabilizované PAH. Hyg je zkratka pro hygromycin, který je použit jako pozitivní kontrola a E. Coli jako negativní kontrola. Na Obrázku 3A je vidět, že nejvyšší koncentrace nanozlata má ze všech koncentrací nejnižší inhibiční účinek. To je dáno tvorbou shluků nanočástic zlata a tím zvětšení jejich velikosti a následné neproniknutí do buňky. Ostatní koncentrace netvoří tak velké množství shluků, což má za následek podobný účinek jako u hygromycinu. Na Obrázku 3B je vidět, že nejvyšší inhibiční účinek mají dvě nejvyšší koncentrace nanočástic zlata stabilizované PAH. Dokonce vyšší než je u hygromycinu. Naopak obě nejnižší koncentrace nevykazují žádný inhibiční účinek. Byl také ověřen účinek PAH na bakterie E. Coli zjištěním její minimální inhibiční koncentrace. Výsledek je vidět na Obrázku 4. Nejnižší inhibiční koncentrace je 2000 mg * l -1 a nižší koncentrace neměli žádný vliv. To dokazuje, že PAH nemělo žádný vliv na antibakteriálním účinku nanozlata stabilizovaného pomocí PAH.

Obrázek 3: Inhibiční účinek nanočástic zlata na E. Coli. A zobrazuje inhibiční účinek nanočástic zlata na E. Coli stabilizované ionty citrátu o koncentraci 0,1; 1; 5 a 10 µg/mL. B zobrazuje inhibiční účinek nanočástic zlata na E. Coli stabilizované PAH o koncentraci 0,1; 1; 5 a 10 µg/mL. Hygromycin (Hyg) je pozitivní kontrola a E. Coli negativní kontrola (převzato z Zhou a kol. 2012).

17

Obrázek 4: Minimální inhibiční koncentrace PAH pro E. Coli (převzato z Zhou a kol. 2012).

Účinnost nanočástic zlata proti BCG byla měřena pomocí intenzity fluorescence, protože bakterie vytváření tdTomato fluorescenční protein. Intenzita fluorescence se zvyšuje s narůstajícím počtem mikroorganismů, což dokazuje Obrázek 5. Obrázek 6 znázorňuje inhibiční účinky nanozlata proti BCG. Obrázek 6A ukazuje inhibiční účinky nanočástic zlata stabilizované pomocí iontů citrátu. Vyšší inhibiční účinek je vidět u koncentrací 0,1 a 1 µg * ml -1, což je v souladu s výsledky u E. Coli. Nízký fluorescenční signál byl pozorován u vysokých koncentrací nanočástic zlata stabilizované pomocí PAH (Obrázek 6B). Stejný účinek byl pozorován také u bakterie E. Coli a také u BCG.

18

Obrázek 5: Závislost intenzity fluorescence na počtu buněk BCG (převzato z Zhou a kol. 2012).

Obrázek 6: Intenzita fluorescence BCG. A zobrazuje inhibici BCG po aplikaci zlatých nanočástic stabilizovaných pomocí iontů citrátu. B zobrazuje inhibici BCG po aplikaci zlatých nanočástic stabilizovaných pomocí PAH. Hygromycin (Hyg) byl použit jako pozitivní kontrola a BCG jako negativní kontrola (převzato z Zhou a kol. 2012).

Naopak studie provedená Chatterjee a kol. (2011) dokazuje, že zlaté nanočástice nemají žádný vliv na růst bakterie E. Coli. Tohle tvrzení dokazuje Obrázek 7, na kterém je vidět, že všechny použité koncentrace nanozlata nemají na růst E. Coli žádný vliv. 19

Obrázek 7: Růst bakterie E. Coli po ovlivnění nanočásticemi zlata ve srovnání s běžnou růstovou křivkou E. Coli (převzato z Chatterjee a kol. 2011).

2.2.5 Využití zlata Největšího uplatnění dosahují nanočástice zlata v oborech chemie, biologie, techniky a medicíny. Dnes již existuje velké množství možností, jak připravit a modifikovat nanočástice zlata, což poukazuje na velké pokroky v tomto oboru. V posledních letech se pozornost obrátila spíše k lékařskému využití těchto látek, například jako prostředek pro přepravu léků v organismu (Giljohann a kol. 2010). Jedna z nejnovějších studií ukazuje využití zlata jako stabilizačního prostředku pro liposomy. Nanočástice zlata společně s chitosanem se navázaly na povrch liposomu, ve kterém byl vankomycin. Obal liposomu z nanočástic zlata s chitosanem se ukázal efektivním proti společné interakci mezi liposomy a neukázal žádný zásadní vliv na doručování vankomycinu k cílovému mikroorganismu, kterým byl Staphylococcus aureus (MRSA) (Pornpattananangkul a kol. 2011)

20

2.3 STŘÍBRO 2.3.1. Historie stříbra

Využívání stříbra kvůli jeho antibakteriálním vlastnostem se táhne dějinami jako stříbrná nit. V Číně, asi 7000 let před naším letopočtem, byla vyvinuta akupunktura. Postupem času se zde tato metoda zdokonalovala. Z počátku se používaly různé druhy dřeva a bambus, později stříbrné nebo zlaté jehlice. Používáním těchto jehlic se zjistilo, že zlaté jehlice dovedou stimulovat organismus a naopak stříbrné ho uvolňují. Stříbrné jehlice na akupunkturu se používají dodnes (URL 3). Ve staroindické medicíně bylo stříbro využíváno jako medikament pro různé druhy bakteriálních onemocnění. Slavný vojevůdce Alexandr Veliký používal k uskladnění vody při svých válečných výpravách stříbrné nádoby, aby tak zabránil rozšíření infekcí, které se přenáší vodou, mezi své vojsko. Stříbro jako antibakteriální materiál se dočkalo většího uplatnění v době římské, kdy se potraviny uskladňovaly ve stříbrných nádobách a do mléka a jiných tekutin se vkládala stříbrná mince. Díky tomu zůstaly tyto tekutiny déle čerstvé. Tato prevence se přenesla až do středověku, kde se k tomu ještě přidalo používání stříbrného nádobí a stříbrných příborů. Ukázku stříbrné sady nádobí můžeme vidět na Obrázku 8. V této době také arabský vědec a lékař Avicenna

použil

stříbro,

respektive

jeho

stříbrné

k čištění

krve

soli,

(Kleilová a Bencko 2010). Postupem času se upouštělo

od

používání

stříbrných solí a přešlo se na koloidní stříbro. To bylo již

používáno

světové orálním

v první

válce způsobem,

nejen

Obrázek 8: Stříbrná sada nádobí (převzato z URL 5)

ale

i nitrožilně (Kleilová a Bencko 2010). V průběhu druhé světové války se začalo upouštět od používání koloidního stříbra. Důvodem bylo objevení sulfonamidů a posléze i antibiotik. Oba tyto druhy léků měli oproti koloidnímu stříbru výhodu v jednoduchosti skladování, jako kapsle nebo později tablety. V šedesátých letech minulého stolení se začal prosazovat princip zakazující patentování jakékoli přírodní látky jako medikament, což vedlo k dalšímu

21

omezení používání koloidního stříbra. Tyto skutečnosti zapříčinily opuštění léčby pomocí koloidního stříbra a zvýšení zájmu o antibiotika (URL 3). V roce 1993 vyšlo najevo, že američtí i ruští kosmonauti si sebou do vesmíru vezou pro hygienické a lékařské účely koloidní stříbro. To způsobilo zvýšený zájem o tento výrobek. V roce 1997 pověřil lékař amerického ministerstva obrany vybraný tým specialistů, který měl za úkol zjistit nejúčinnější látku pro antiseptické, antibakteriální a antivirové vlastnosti a zároveň měla být rychle k dispozici. Vítězem této studie se stalo koloidní stříbro (URL 3).

2.3.2. Charakteristika koloidního stříbra

Stříbro, stejně jako zlato, patří mezi přechodné d-prvky skupiny

mědi.

Stříbro

má

oxidační čísla 0 a 1, jedná se o ušlechtilý

kov,

který

nejlepším

vodičem

je tepla

i elektrického proudu ze všech známých rozpouští

kovů.

Dobře

pouze

se

v kyselině

dusičné a s hydroxidy nereaguje vůbec. Má baktericidní účinky (Dvořáčková 2003). Vlastnosti

koloidního

stříbra a jeho účinek je pevně spjat s velikostí částic. Čím je velikost částic menší, tím se antibakteriální vlastnosti stříbra stávají více efektivní (Panáček

Obrázek 9: Různé tvary nanočástic stříbra a) čtverce

a kol. 2006) a také jsou více

b) trojúhelníky c) drátky d) srovnané tyčky (převzato

cytotoxické (Yen a kol. 2009).

z Sharma a kol. 2009)

Problémem

je

jeho

krátká

životnost v organismu a tedy nutnost k reaplikaci. Kovové stříbro je biologicky inertní a prochází tělem bez účinku, proto se spíše používá oxid stříbrný. Stříbro v organismu velmi pomalu oxiduje působením vlhkosti nebo tělních tekutin, což prodlužuje jeho účinek. Jinou možností aplikace je v podobě koloidního roztoku, kde je již stříbro oxidováno na jeho příslušný oxid a v organismu se rozpouští na stříbrné ionty, které pak mají antibakteriální účinek (Prnka a Šperlink, 2006). Nanomateriály stříbra se také vyznačují různými tvary částic, jako jsou trojúhelníky, koule, čtverce nebo nitky. Tyto tvary vidíme na Obrázku 9. Díky těmto změnám ve struktuře a velikosti částic se mění i barva. Ve své práci Darroudi a kol. 22

(2011) charakterizoval jeden band stříbrných nanočástic, které sám syntetizoval, pomocí UV/VIS spektrometrie. Použil vlnovou délku 400 nm a barva částic nanostříbra se lišila jak v posunu k červenému spektru barev, tak i k modrému. Tuto skutečnost přisoudil právě k různé velikosti částic a různému tvaru. Příklady různých barev nanočástic stříbra můžeme vidět na Obrázku 10.

Obrázek 10: Změna barvy u nanočástic stříbra a zlata v důsledku jejich změny tvaru a velikosti (převzato z URL 6)

2.3.3. Příprava nanočástic stříbra

Příprava nanočástic stříbra doznala v poslední době velkých změn. Od elektrolýzy stříbrných solí až po přípravu nanočástic stříbra pomocí redukčních činidel jako jsou monoa disacharidy (Panáček a kol. 2006) nebo vodný roztok želatiny (Darroudi a kol. 2011). Panáček a kol. (2006) se ve své práci zabýval přípravou nanočástic stříbra pomocí sacharidů. Použil k tomu dva monosacharidy (glukózu a galaktózu) a dva disacharidy (maltózu a laktózu). Nanostříbro syntetizoval z komplexu [Ag(NH3)2]+, dále použil různé koncentrace amoniaku a pH prostředí. Důvodem bylo získání široké škály nanočástic podle velikosti, ale s úzkou škálou velikostí při syntéze v různých podmínkách. Se zvyšující se koncentrací amoniaku se zvětšuje i průměrná velkost nanočástic až do koncentrace 0,035 mol * l-1 pro disacharidy a 0,20 mol * l-1 pro monosacharidy. Koncentrace 0,035 mol * l -1 je hraniční koncentrace, kdy se velikost částic mění z desítek na stovky. Při použití disacharidů jako redukčního činidla byly vytvořeny menší nanočástice stříbra, než při použití monosacharidů. Nejmenší částice byly získány pomocí maltózy, poté následovala laktóza, glukóza a největší byly získány při použití galaktózy. V tomto případě jsou jako redukční činidla použity sacharidy. To je výhodné z hlediska ekologie, jelikož sacharidy nejsou nebezpečné pro životní prostředí. Tímto směrem, takzvanou „zelenou“ syntézou, se ubírá většina vědců zabývající se touto tématikou. Darroudi a kol. (2011) použil ve svém výzkumu vodný roztok želatiny. Svou práci rozdělil na dvě části, v jedné k výše zmíněnému roztoku přimíchal glukózu a v druhé ponechal roztok nezměněn. Oba tyto roztoky ještě rozdělil na tři části a každou inkuboval 23

za různé teploty, 28, 40 a 60 °C. Při inkubaci již byla přítomna stříbrná sůl, dusičnan stříbrný. Menší částice byly tvořeny v roztoku bez glukózy a při nejvyšší teplotě, čili při 60 °C. Důležité je při syntéze zajistit i stabilizaci nanočástic ve vodném roztoku. Tím se ve své práci zabýval Stevenson a kol. (2012). K zvýšení stability nanostříbra ve vodném roztoku použil polyetylenglykol a poté dvě slitiny stříbra s jiným kovem. Jako první použil techniku jádro-plášť, kde jádrem je stříbro a obalem zlato. V druhém případě se jednalo o slitinu stříbra s chromem. Všechny vzorky charakterizoval po jejich vytvoření a následně po 100 dnech. Všechny metody se ukázaly být účinné. Další možný způsob syntézy je v podstatě totožný, jak již byl popisován u zlata a to za použití látky HPAMAM-N (CH3)2 jako redukční a stabilizační činidlo. I v případě nanočástic stříbra se jejich velikost dá ovlivnit úpravou molárního poměru N / Ag a snížit tak velikost získaných nanočástic (Zhang a kol. 2008).

2.3.4. Antibakteriální účinek stříbra Jak

již

bylo

napsáno

dříve,

antibakteriální

vlastnosti

jakéhokoli

kovového

nanomateriálu je závislý na velikosti samotných částic (Panáček a kol. 2006). V některých případech se ale účinnost koloidního roztoku může zvýšit. Závisí to na druhu stabilizační látky, která může mít přídatné antibakteriální vlastnosti (Zhang a kol. 2008). Studií týkajících se antibakteriálních vlastností nanočástic stříbra bylo již provedeno nespočet. V jedné z nich se Panáček a kol. (2006) zabýval syntézou, charakterizací a antibakteriálními vlastnosti nanočástic stříbra. Syntéza těchto nanočástic je popsána v kapitole 2.3.3 Příprava nanočástic stříbra. Tyto částice aplikoval na deset různých druhů mikroorganismů uvedených v Tabulce 2. Výsledkem minimální inhibiční koncentrace stříbrných nanočástic pro grampozitivní i pro gramnegativní bakterie je průměr z deseti různých měření. Kontrolní vzorek, který obsahoval všechny počáteční reakční látky kromě dusičnanu stříbrného, neukázal žádnou antibakteriální aktivitu. Z Tabulky 2 je vidět, že vyšší antibakteriální účinek mají stříbrné nanočástice syntetizované pomocí disacharidů. To je důsledek menší průměrné velikosti jejich nanočástic.

24

Tabulka 2: Minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální baktericidní koncentrace (MBC) stříbrných nanočástic připravených redukcí komplexního kationtu [Ag(NH3)2] sacharidů a koncentrace amoniaku 0,005 mol * l

+

pomocí různých

-1 -1

Minimální inhibice a baktericidní koncentrace (μg * ml )

Bakterie

Glukóza

Galaktóza Maltóza Laktóza Kontrola d

Kontrola e

Enterococcus faecalis CCM 4224

-c

-

13,5

54,0

6,75

-c

Staphylococcus aureus CCM 3953

6,75

54,0

6,75

6,75

6,75

-c

Escherichia coli CCM 3954

27,0

-

3,38

27,0

1,69

-c

Pseudomonas aeruginosa CCM 3955

27,0

-

6,75

13,5

0,84

-c

Pseudomonas aeruginosa

13,5

27,0

3,38

13,5

0,84

-c

Staphylococcus epidermis a

13,5

6,75

1,69

6,75

0,84

-c

Staphylococcus epidermidis b

6,75

54,0

1,69

6,75

1,69

-c

Staphylococcus aureus MRSA

27,0

54,0

6,75

27,0

6,75

-c

Enterococcus faecium (VRE)

-c

-c

13,5

54,0

3,38

-c

Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive)

27,0

-c

6,75

54,0

3,38

-c

a Citlivý na methicillin; b Odolný proti methicillinu; c Neopodstatněná inhibice růstu bakterií; d Kontrolní vzorek obsahující všechny počáteční reakční látky bez redukujících sacharidů; e Kontrolní vzorek obsahující všechny počáteční reakční látky bez dusičnanu stříbrného; f MIC a MBC stříbrných solí měly stejnou hodnotu (tabulka převzata z Panáček a kol. 2006).

V roce 2008 se zabýval Lee a kol. inaktivací bakterií Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917), Bacillus subtilis (KCCM 11316) a Escherichia coli (KCTC 1039) pomocí nanočástic stříbra unášející vzduchem. Je známo, že gram-negativní bakterie, jako je Escherichia coli, jsou náchylné k proudícímu vzduchu (Lee a Lew, 2006, Madigan a kol. 2000), a tak je tato studie spíše zaměřena na gram-pozitivní bakterie, v tomto případě Staphylococcus epidermidis a Bacillus subtilis. Provedení experimentu spočívalo v nanesení bioaerosolu s příslušnou bakterií na filtr, přes který proudil vzduch s nanočásticemi stříbra s průměrnou

velikostí částic 21

nm a

ve dvou

koncentracích

2,6

* 10 8 (A)

a 0,9 * 108 (B) částic * cm-3 nebo bez nich. Důvodem pro použití dvou různých koncentrací bylo zjištění jejího vlivu na úmrtnost mikroorganismů vystavených nanočásticím stříbra unášených proudem vzduchu. V intervalech jedné, třech, šesti a devíti minut bylo prováděno měření mrtvých buněk. Na obrázku 11A je vidět procentuální úmrtnost S. epidermidis po vystavení proudu vzduchu s nanočásticemi stříbra a bez nich. Z výsledků je vidět odolnost mikroorganismu proti proudění vzduchu bez přítomnosti stříbrných nanočástic. Po uplynutí devíti minut bylo procento usmrcených buněk přibližně 6%. Přesně opačný efekt vidíme u nanočástic stříbra A, kde již po uplynutí jedné minuty je procento usmrcených buněk 99% a s přibývajícím časem se blíží k 100%. V případě nanočástic B vidíme vliv nižší koncentrace 25

na jejich účinek. Po provedených měřeních

byla

úmrtnost

bakterií

po uběhnutí jedné, tří, šesti a devíti minut 27, 53, 87 a 99%. To ukazuje značný vliv koncentrace nanočástic na použitý mikroorganismus. Obrázek

11B

ukazuje

úmrtnost buněk B. subtilis po jeho vystavení

proudícímu

vzduchu

s nanočásticemi stříbra a bez nich. Bakterie vykazuje rezistenci vůči proudícímu vzduchu bez nanočástic stříbra.

Procentuální

úmrtnost

se pohybovala v rozmezí 6% až 22%.

Procento

úmrtí

bakterie

B. subtilis po vystavení stříbrným nanočásticím

A

bylo

měřeno

v intervalu jedné, třech, šesti a devíti minut a ukázalo úmrtnost 73%, 92%, 96% a 99%. Na obrázku 11C je vidět úmrtnost bakterie E. coli vystavené proudícímu vzduchu s přítomností stříbrných nanočástic A a bez nich. Jak

bylo

předpokládáno

gram-

negativní bakterie E. coli ukázala velmi vysokou citlivost k proudícímu vzduchu bez přítomnosti nanočástic Obrázek 11: Procentuální úmrtnost bakterií S. epidermidis, B. subtilis a E. coli po vystavení proudícímu vzduchu s nanočásticemi stříbra a bez nich (převzato z Lee a kol. 2008).

stříbra. Intervaly, ve kterých se měřila

ztráta

životaschopnosti

bakterie, byly jedna, tři, šest a devět minut.

Po

vystavení

bakterie

proudícímu vzduchu po dobu jedné minuty se průměrné procento buněk, které ztratily životaschopnost,

pohybovalo

okolo

8%.

Po

třech

minutách

se

výrazně

zvýšila

životaschopnost bakterií a po šesti minutách bylo procento vyšší než 90%. V intervalu tří minut se ukázaly velké odchylky od průměru. To Lee a kol. (2008) přisuzuje významné citlivosti bakterie E. coli v tomto časovém intervalu. Ve všech třech případech ukázaly

26

nanočástice stříbra velký potenciál jako antibakteriální látky proti bioaerosolu S. epidermidis, B. subtilis a E. coli uložené na filtrech. Další z mnoha studií zabývající se touto problematikou je studie od MpenyanaMonyatsi a kol. (2012), kde je pozornost zaměřena na filtry podzemních vod, která je kontaminovaná patogenními mikroorganismy. Bylo vybráno pět druhů filtrů: zeolitový, pískový, skelná vata a kationová a aniontová pryskyřicová směr, do kterých byly přidány nanočástice stříbra o koncentracích 0,01, 0,03, 0,05 a 0,1 mM * ml-1 dusičnanu stříbrného. Pro tento test byly vybrány bakterie Escherichia coli (ATCC 43895), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Vibrio cholera a Shigella dysenteriae. Výsledky experimentu ukázaly, že výše uvedené filtry s nanočásticemi stříbra jsou schopné snížit koncentraci bakterie E. coli o 21% - 100% u koncentrace 0,1 mM * ml-1 a u nejnižší koncentrace 0,01 mM * ml-1 o 7% - 50%. Jako nejlepší se v první fázi experimentu ukázal filtr z kationtové pryskyřičné směsi o koncentraci 0,1 mM * ml-1 dusičnanu stříbrného. Ve druhé fázi experimentu se testovala jen nejvyšší koncentrace dusičnanu amonného se všemi výše zmíněnými bakteriemi. Jako nejúčinnější se opět ukázal kationový filtr z pryskyřičné směsi, který odstranil veškeré bakterie z vody, a jako nejméně účinný se ukázal filtr zeolitový - odstranil 8 - 67% bakterií. Kim a kol. (2008) ve své práci prokázali i účinnost nanočástic stříbra proti houbovitým patogenům. Pro svůj experiment si vybrali 6 druhů houbovitých mikroorganismů. Jednalo se o Candida albicans (ATCC 90028), Candida tropicalis, Candida glabrata (ATCC 90030), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida krusei (ATCC 6258) a Trichophyton mentagrophytes. Pro porovnání antimykotického účinku byly vybrány dva druhy látek Amfotericin B a Flukonazol. Po vyhodnocení experimentu se ukázalo, že stříbrné nanočástice mají velice podobný účinek jako Amfotericin B a silnější než Flukonazol.

2.3.5. Mechanismus působení nanočástic stříbra I když význam používání nanočástic stříbra v posledních letech velice vzrostl, jeho mechanismus účinku na mikroorganismy není doposud plně prozkoumán. Mnoho vědců se ve svých studiích snaží vysvětlit tuto problematiku. Jednou z nich je schopnost nanostříbra změnit trojrozměrnou strukturu bílkovin. To je způsobeno blokováním vazby mezi atomy síry, a tudíž nevznikají disulfidické můstky, které jsou jedním ze slabých vazebných interakcí určující trojrozměrnou strukturu bílkovin (Chung a kol. 2008). Jiné studie uvádí jako nejdůležitější vlastnost antibakteriálních vlastností stříbra náboj Ag+. Díky tomuto náboji je stříbro schopno pomocí elektrostatické přitažlivosti reagovat se záporně nabitou buněčnou stěnou (Kim a kol. 2007). Naproti tomu Sondi a Salopek-Sondi (2004) ve své práci poukazují na spojitost mezi koncentrací stříbrných nanočástic a vznikem 27

jam v buněčné stěně. Zde se nanočástice akumulují v buněčné stěně a snižují její propustnost, což vede k buněčné smrti. Další mechanismus navrhl ve své práci Amro a kol. (2000). Podle něj může úbytek kovu vést ke vzniku nepravidelných jamek ve vnější membráně mikroorganismu a způsobit tak změnu propustnosti membrány, což je způsobeno postupným uvolňováním molekul lipopolysacharidů a membránových proteinů. Tuto teorii předpokládali také Sondi a SalopekSondi (2004) ve své práci, ve které se zabývali účinkem částic nanostříbra na bakteriální membránu Escherichie coli. Panáček a kol. (2006) ve své práci také vysvětluje mechanismus účinku nanočástic stříbra tím, že se částice naváží na buněčnou membránu mikroorganismů a změní její funkce jako je již výše zmiňovaná propustnost nebo i dýchání. Poukazuje se však také na pronikání těch nejmenších částic nanostříbra do buňky, kde jsou částice schopné interagovat s částmi buňky obsahující sloučeniny fosforu a síry, jako je tomu u DNA nebo proteinů (Morones a kol. 2005). Mirzajani a kol. (2011) se ve své práci zaměřil na tvorbu jamek v buněčné stěně gram-pozitivního

mikroorganismu.

Jako

reprezentativní

vzorek

si

vybral

bakterii

Staphylococcus aureus PTCC1431. Svůj experiment založil na kultivaci výše zmíněného mikroorganismu s (Obrázek 12b) a bez přítomnosti stříbrných nanočástic (Obrázek 12a). V případě interakce stříbrných nanočástic (Obrázek 13a) a následné tvorby jamek v membráně bakterie by se měly do média uvolňovat kousky buněčné stěny v podobě peptidoglykanů nebo muramové kyseliny (Obrázek 13b). Právě zvýšení koncentrace kyseliny muramové v médiu po skončení kultivace se stal hlavním důkazem působení stříbrných nanočástic na buněčnou stěnu S. aureus. Do práce byl vybrán pro příklad jeden z popisů působení stříbrných iontů na mikroorganismy: “ Pozitivně nabité ionty stříbra jsou pro mikroorganizmy vysoce toxické. Stříbro působí na mikroorganizmy několika způsoby. Např. má vysokou afinitu k negativně nabitým bočním skupinám biologických molekul, jako jsou sulfohydryl, karboxyl, fosfáty a jiné nabité skupiny nacházející se v mikrobiálních buňkách. Stříbro současně atakuje místa uvnitř buněk a deaktivuje kritické fyziologické funkce, jako např. syntézu stěn buněk, transport přes membrány, syntézu a translaci nukleových kyselin, skládaní proteinů a jejich funkci a rovněž transport elektronů v buňce. Ztrátou těchto funkci bakterie buď přestane růst, nebo většinou je mikroorganizmus zabit. Účinky stříbra nejsou selektivní, což má za následek, že stříbro projevuje antimikrobiální aktivitu proti širokému spektru lékařsky zajímavých mikroorganizmů včetně bakterii, hub a kvasinek.“ (Prnka a Šperlink 2006).

28

Obrázek

12:

TEM

snímky

buněk

Staphylococcus aureus. (a) jsou buňky před

a

(b)

po

použití

stříbrných

nanočástic. (převzato z Mirzajani a kol. 2011)

Obrázek 13: Předpokládaný mechanismus účinku stříbrných nanočástic na Staphylococcus aureus. (a) interakce buněčné stěny s nanočásticemi stříbra, (b) tvorba jamek a uvolňování peptidoglykanů (převzato z Mirzajani a kol. 2011)

29

2.3.6. Škodlivé účinky stříbra Nanostříbro se v lékařství již nějakou dobu využívá. V dnešní době má již většina lidí v povědomí antibakteriální účinek stříbra, ale už moc neví, jaké škodlivé účinky může mít jeho nadměrné užívání. Následky jsou pozorovatelné jak na lidském organismu, tak i na životním prostředí, ve kterém žijeme.

Negativní účinek stříbra na lidské zdraví

se projevuje různými symptomy. Jedním z nich je modrošedé zbarvení kůže, což nazýváme argyrií, Obrázek 14 a 15, a stejné zbarvení očí – argyróza (Panyala a kol., 2008). Jiné studie naopak dokazují, že by argyrie mohla být považována za detoxifikační mechanismus ukládající neškodné stříbro-proteinové komplexy do tkání (Venugopal a Luckey, 1978). Kromě těchto dvou nemocí, může dlouhodobé vystavení stříbru zapříčinit poškození buněk jater, ledvin a mozku, záněty očí, kůže, trávících a dýchacích cest (Panyala a kol., 2008). V okolní přírodě

je

stříbro

toxické

pro ryby

(Hogstrand a kol., 1996), řasy, houby, některé

rostliny

(Eisler

R.,

1996),

korýše, chemolitotrofní bakterie a také bakterie, které jsou schopny fixovat dusík (Albright a kol., 1974). Způsobů,

kterými se

mohou

částice stříbra nebo nanostříbra dostat do lidského těla, je mnoho. Nejčastěji to je přes trávící a dýchací systém, urogenitální (Chen

a

trakt, kol.,

vstřebáním 2007),

kůží Obrázek 14: Člověk trpící argyrií (převzato z URL 7)

kontaktem

se šperky nebo třeba aplikací krémů

na popáleniny obsahující stříbro (Panyala a kol., 2008). Téměř 20% stříbra, které bylo pozřeno ústy, se absorbuje hlavně ve dvanáctníku a v tenkém střevě (Boosalis a kol., 1987). Stříbro je v těle přenášeno krví a při dlouhodobém vystavení dochází k nevratnému ukládání do sliznic a podkoží. Další studie dokazují toxický účinek nanostříbra na buněčnou stěnu, konkrétně na změnu propustnosti membrány pro Na+ a K+ ionty (Kone a kol., 1988). Dalším místem, kde se nanočástice stříbra mohou ukládat, je mužský reprodukční systém. Do něj se stříbro dostane přes krevní bariéru varlat a zde může vyvolat nežádoucí účinky při vývoji spermií (McAuliffe a kol. 2007). 30

Dýchací systém je jedním z největších vstupních bran do organismu. Velké částice stříbra, nebo jiného materiálu, se až k plicním sklípkům nedostanou, jelikož se zachytí na systému mikrocilií, který je přítomen v dýchacím traktu (Lippmann a kol., 1980). Pouze tak malé částice jako jsou nanočástice jsou schopny se tomuto systému vyhnout a dostat se tak až do plicních sklípků. Konkrétně stříbrné nanočástice, které se dostaly až do plicních sklípků, mohou vytvářet radikály, reaktivní kyslíkové radikály, které jsou mnohem více toxické pro organismus (Chen a kol., 2007), než je samotné stříbro. Je prokázáno, že částice nanomateriálů mají delší životnost v nervové tkáni, než v jiných tkáních těla. Savci sice mají ve svém těle ochranné mechanizmy, aby se do nervového systému nedostala jakákoli cizí látka, ale nanomateriály jsou tak malé, že se uvažuje o přenosu do nervové soustavy přes krevně-mozkovou bariéru pasivní difůzí nebo zprostředkovaně pomocí endocytózy. Jejich přítomnost v mozku může vyvolat poškození neuronů nebo mikroglií. Může ovlivnit funkčnost iontových kanálů hrající důležitou roli v životaschopnosti buňky nebo také způsobí poruchy u sodno-draselných pump, které jsou důležité u synaptických vzruchů a dalších funkcí. Další možný problém, který může vzniknout přítomností nanomateriálů v nervovém systému, je vznik mutací vedoucí ke změně v takzvaných voltage-gated Na+ channels. Tyto změnu jsou spojeny s řadou neurologických poruch, jako je spontánní epilepsie a bolestivé stavy a byly zapojeny do různých psychiatrických

poruch

(Yang

a kol. 2010). Nadměrným

užíváním

koloidního stříbra nebo stříbrných solí, jako je dusičnan stříbrný, způsobuje

ukládání

stříbra

pod kůži nebo v očích. Dietl a kol. (1984) popsal ve své práci vznik maniodepresivní psychózy během nebo

krátce

argyrie.

po diagnostikování

To vedlo

k ruptuře

aneurysmatu a k následné smrti. V tomto případě pozoroval ukládání stříbra do kůže, sliznic, srdce,

Obrázek 15: Vzorek biopsie kůže s argyrií (převzato z URL 8)

ledvin, jater a do centrálního nervového systému. Stříbro má také vliv na prospěšné bakterie, které se podílejí na koloběhu dusíku. Tyto bakterie fixují vzdušný dusík do organických sloučenin. To je výhodné pro ně, ale také pro rostliny a všechny další organismy využívající této fixace dusíku, se kterými mají symbiotický vztah. Nadbytek dusíku v půdě má za následek snížení produktivity rostlin, a to může vést až k eutrofizaci řek, jezer, mořských ekosystémů a znečištění pitné vody (Senjen 2007). 31

Stříbro má také nežádoucí účinky dostane-li se do vodného prostředí. Například u sladkovodních ryb je jejich akutní toxicita stříbrem způsobena kontaktem s ionty stříbra Ag+ s jejich žábry. Nanočástice stříbra se také můžou vázat na bílkoviny a enzymy v savčích buňkách. Tyto struktury následně mohou interagovat s buněčnými membránami a vytvářet vysoce toxické a reaktivní radikály, jako jsou kyslíkové reaktivní radikály. Následně produkují apoptotické faktory, dochází k buněčné smrti a nekróze v okolí buňky. Částice nanostříbra mohou ovlivnit také mitochondriální funkci a životaschopnost buňky (Senjen 2007).

2.3.7. Využití stříbra

Využívání nanočástic stříbra je velice rozsáhlé. Jako příklady si můžeme uvést využívání v biologických a farmaceutických procesech: jako je například úprava povrchu operačních a pooperačních materiálů, výroba ortopedických a zubních transplantátů. Vayužití stříbra nechybí ani v textilním průmyslu (sportovní oděv) (Chen a kol., 2008; Navarro a kol. 2008). Nanočástice se také používají do fasád domů i do vnitřních omítek proti plísním, například v nemocnicích (Prnka a Šperlink, 2006). V lékařství nanočástice

se

stříbro,

popřípadě

stříbra,

používají

k povrchovému ošetření kovových nebo i plastových

nástrojů.

Jako

příklad

si

můžeme uvést ošetření povrchu katétrů (Roe a kol. 2008) a titanových protéz (Juan a kol. 2010) z důvodu ochrany před vznikem infekce. Další možností využití je přidáním stříbrných materiálů zabránění

nanočástic (Obrázek 16) vzniku

nebo

do obvazových opět rozvoji

z důvodu infekce

v ošetřované ráně. Stejnou funkci má stříbro v krémech na popáleniny, kde plní další funkci

v podobě

rychlejšího

Obrázek 16: Obvaz obsahující částice

hojení

stříbra (převzato z URL 9)

popáleného místa (Castellano a kol. 2007). Dalším možným využitím je ukládání nanočástic do různých filtrů, jako jsou filtry na znečištěnou vodu (Mpenyana-Monyatsi a kol. 2012) a také jako antimykotická látka (Kim a kol. 2008).

32

3. ZÁVĚR Cílem této bakalářské práce, která byla zpracována jako literární rešerše, bylo utřídit výsledky získané testováním účinku nanočástic titanu, zlata a stříbra na mikroorganismy, mechanismus působení nanostříbra, jeho možné škodlivé účinky a využití všech tří nanomateriálů v medicíně. Nejvyšší účinnost prokázaly nanočástice stříbra a naopak nejnižší účinnost má nanozlato. Z výsledků nanočástic stříbra je patrné, že jeho antibakteriální účinky jsou natolik silné, že je možné tyto nanočástice využívat v medicíně jako prevence proti bakteriálním onemocněním nebo při počátečních příznacích. Je ovšem nutné stanovit optimální koncentraci, kvůli možným škodlivým účinkům na organismus člověka. Dalším využitím, které je již prováděno v praxi, je aplikace v krémech na popáleniny nebo v obvazových materiálech kvůli zamezení vzniku bakteriální infekce přes ránu. Nanočástice titanu a zlata sice nemají tak vysokou antibakteriální účinnost jako stříbro, ale i tak mohou mít v medicíně uplatnění. Titan v zubním lékařství nebo zevní fixační aparáty na zlomeniny a zlato jako prostředek pro transport léků v organismu. Mechanismy, jakými nanočástice stříbra působí na mikroorganismy, není plně objasněn. Je mnoho studií, které se zabývají touto problematikou, a každá z nich odhaluje část tohoto mechanismu.

33

4. Seznam zkratek

[Ag(NH3)2]+

kation diaminstříbrný

a kol.

a kolektiv

ATCC

American Type Culture Collection

BCG

Bacillus Calmette-Guérin

B. subtilis

Bacillus subtilis

E. coli

Escherichia coli

HPAMAM-N (CH3)2

poly(amidoamin) s koncovými skupinami dimetylaminu

Hyg.

Hygromycin

KCCM

Korean Culture Center of Microorganisms

KCTC

Korean Collection for Type Cultures

MBC

Minimální Baktericidní Koncentrace

MIC

Minimální Inhibiční Koncentrace

MRSA

Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus

NADP

Nikotinamid Adenin Dinukleotid Fosfát

NADPH

redukovaná forma NADP

nm

nanometr

PAH

Polyalylamin hydrochorid

PTCC

Persian Type Culture Collection

S. epidermidis

Staphylococcus epidemidis

TBOT

titanium n-butoxide

TEM

Transmisní Elektronový Mikroskop

UV

Ultrafialové záření

UV/VIS

Ultraviolet-Visible spectroscopy

34

5. Seznam literatury

Primární zdroje: Boosalis M.G., McCall J.T., Ahrenholz D.H., Solem L.D., McClain C.J., 1987, Serum and urinary silver levels in thermal injury patiens; Surgery, 101, 40-43 str. Castellano J.J., Shafii S.M., Ko F., Donate G., Wright T.E., Mannari R.J., Payne W.G., Smith D.J., Robson M.C., 2007, Comparative evaluation of silver-containing antimicrobial dressings and drugs; International Wound Journal, 4, 114–122 str. Daniel M.Ch., Astruc D., 2004, Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology; Chemical Reviews, 104, 293-346 str.

Dietl H.W., Anzil A.P., Mehraein P., 1984, Brain involvement in generalized argyria; Clinical Neuropathology, 3, 32-38 str. Darroudi M., Ahmad M.B., Abdullah A.H., Ibrahim N.A., 2011, Green synthesis and characterization of gelatin-based and sugarreduced silver nanoparticles; International Journal of Nanomedicine, 6, 569–574 str. Dvořáčková J., 2003, Rychlokurz chemie: od základní školy k přijímacím zkouškám na vysokou školu, První vydání, Olomouc, Rubico, 238 str., ISBN: 80-85839-42-3 Giljohann D.A., Seferos D.S., Daniel W.L., Massich M.D., Patel P.C., Mirkin Ch.A., 2010, Gold Nanoparticles for Biology and Medicine, , Angewandte Chemie International Edition., 49, 3280 – 3294 str. Chatterjee S., Bandyopadhyay A., Sarkar K., 2011, Effect of iron oxide and gold nanoparticles on bacterial growth leading towards biological application; Journal of Nanobiotechnology, 9, 1-7 str.

Chen X., Schluesener H.J., 2007, Nanosilver: A nanoproduct in medical application; Toxicology Letters, 176, 1-12 str.

35

Chung Y-Ch., Chen I-H., Chen Ch-J., 2008, The surface modification of silver nanoparticles by phosphoryl disulfides for improved biocompatibility and intracellular uptake; Biomaterials, 29, 1807-1816 str. Jing J., Feng J., Li W., Yu W. W., 2013, Low-temperature synthesis of water-dispersible anatase titanium dioxide nanoparticles for photocatalysis; Journal of Colloid and Interface Science, 396, 90-94 str. Juan L., Zhimin Z., Anchun M., Lei L., Jingchao Z., 2010, Deposition of silver nanoparticles on titanium surface for antibacterial effect; International Journal of Nanomedicine, 5, 261– 267 str. Keilová V., Bencko V., 2010, Stříbro není jen krásný kov, z něhož se vyrábí šperky, ale také je o něm známo, že ničí nebezpečné choroboplodné zárodky, Moje zdraví, 6, 31-33 str. Kim J.S., Kuk E., Yu K.N., Kim J-H., Park S.J., Lee H.J., Kim S.H., Park Y.K., Park Y.H., Hwang C-Y., Kim Y-K., Lee Y-S., Jeong D.H., Cho M-H., 2007, Antimicrobial effects of silver nanoparticles; Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 95–101 str. Kim K-J., Sung W.S., Moon S-K., Choi J-S., Kim J.G., Lee D.G., 2008, Antifungal Effect of Silver Nanoparticles on Dermatophytes; Journal of Microbiology and Biotechnology, 18, 1482–1484 str. Kone B.C., Kaleta M., Gullans S.R., 1988, Silver ion (Ag+)-Induced increases in cell membrane K+ and Na+ permeability in the renal proximal tubule: Reversal by thiol reagens; Journal of Membrane Biology, 102, 11-19 str. Lee, Uk B., Yun S.H., Ji. J.H., Bae G.N., 2008, Inactivation of S. epidermidis, B. subtilis, and E. coli Bacteria Bioaerosols Deposited on a Filter Utilizing Airborne Silver Nanoparticles; Journal of Microbiology and Biotechnology, 18, 176–182 str. Lippmann M., Yeates D.B., Albert R.E., 1980, Deposition, retention, and clearance of inhaled particles; British Journal of Industrial Medmedicine, 37, 337-362 str. Ma M., Zhang Y., Li X., Fu D., Zhang H., Gu N., 2003, Synthesis and characterization of titania-coated Mn-Zn ferrite nanoparticles; Colloids and Surfaces A, 224, 207-212 str.

36

McAuliffe M.E., Perry M.J., 2007, Are nanoparticles potential male reproductive toxicants? A literature review; Nanotoxicology, 1, 204-210 str. Mirzajani F., Ghassempour A., Aliahmadi A., Esmaeili M.A., 2011, Antibacterial effect of silver nanoparticles on Staphylococcus aureus; Research in Microbiology, 162, 542-549 str.

Mpenyana-Monyatsi L., Mthombeni N.H., Onyango M.S., Momba M.N.B., 2012, CostEffective Filter Materials Coated with Silver Nanoparticles for the Removal of Pathogenic Bacteria in Groundwater, International Journal of Environmental Research and Public Health, 9, 244-271 str.

Nangia Y., Wangoo N., Goyal N., Shekhawat G., Suri C.R., 2009, A novel bacterial isolate Stenotrophomonas maltophilia as living factory for synthesis of gold nanoparticles; Microbial Cell Factories, 8, 1-7 str. Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M., Večeřová R., Pizúrová N., Sharma V.K., Nevěčná T., Zbořil R., 2006, Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity; The Journal of Physical Chemistry B, 110, 16248-16253 str. Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str.

Pornpattananangkul D., Zhang L., Olson S., Aryal S, Obonyo M., Vecchio K., Huang Ch-M., Zhang L., 2011, Bacterial Toxin-Triggered Drug Release from Gold Nanoparticle- Stabilized Liposomes for the Treatment of Bacterial Infection, Journal of the American Chemical Society, 133, 4132–4139 str. Prnka T., Šperlink K., 2006, Bionanotechnologie, Nanobiotechnologie, Nanomedicína, První vydání, Ostrava, Repronis, 177 str., ISBN: 80-7329-134-7 Rayavarapu R.G., Petersen W., Ungureanu C., Post J.N., van Leeuwen T.G., Manohar S., 2007, Synthesis and Bioconjugation of Gold Nanoparticles as Potential Molecular Probes for Light-Based Imaging Techniques; International Journal of Biomedical Imaging, 1-10 str. Roe D., Karandikar B., Bonn-Savage N., Gibbins B., Roullet J-B., 2008, Antimicrobial surface functionalization of plastic catheters by silver nanoparticles; Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61, 869–876 str. 37

Sondi I., Salopek-Sondi B., 2004, Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bakteria; Journal of Colloid and Interface Science; 275, 177–182 str.

Stevenson A.P.Z., Bea D.B., Civit S., Contera S.A., Cerveto A.I., Trigueros S. 2012, Three strategies to stabilise nearly monodispersed silver nanoparticles in aqueous solution; Nanoscale Research Letters, 7, 1-19 str. Šrámek J. 2009, Nanotechnologie v medicíně, Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta – Biofyzikální ústav, 15 str. Tsuang Y-H., Sun J-S., Huang Y-Ch., Lu Ch-H., Chang W. H-S., Wang Ch-Ch., 2008, Studies of Photokilling of Bacteria Using Titanium Dioxide Nanoparticles; Artif Organs, 32, 167-174 str. Vacík J., Barthová J., Pacák J., Strauch B., Svobodová M., Zemánek F., 1999, Přehled středoškolské chemie, Čtvrté vydání, Praha, SPN-pedagogické nakladatelství a. s., 368 str., ISBN: 80-7235-108-7 Vargas-Reus M. A., Memarzadeh K., Huang J., Ren G. G., Allaker R. P., 2012, Antimicrobial activity of nanoparticulate metal oxides against peri-implantitis pathogens; International Journal of Antimicrobial Agents, 40, 135-139 str.

Yang Z., Liu ZW., Allaker RP., Reip P., Oxford J., Ahmad Z., Ren G., 2010, A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system, Journal of The Royal Society, 7, 411 – 422 str. Zhang Y., Peng H., Huang W., Zhou Y., Yan D., 2008, Facile preparation and characterization of highly antimicrobial colloid Ag or Au nanoparticles; Journal of Colloid and Interface Science, 325, 371–376 str.

Zhou Y., Kong Y., Kundu S., Cirillo J. D., Liang H., 2012, Antibacterial activities of gold and silver nanoparticles against Escherichia coli and bacillus Calmette-Guérin; Journal of Nanobiotechnology, 10, 1-9 str.

38

Sekundární zdroje: Albright L.J.., Wilson E.M., 1974 cit. podle Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str.

Amro N.A., Kotra L.P., Wadu-Mesthrige K., Bulychev A., Mobashery S., Liu G., 2000 cit. podle Lara H.H., Garza-Treviño E.N., Ixtepan-Turrent L., Singh D.K., 2011, Silver nanoparticles are broad-spectrum bactericidal and virucidal compounds; Journal of Nanobiotechnology, 9, 1-8 str. Antonii F. 1618 cit. podle Daniel M.Ch., Astruc D., 2004, Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology; Chemical Reviews, 104, 293-346 str. Eisler R. 1996 cit. podle Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str. Hogstrand C., Wood C.M., 1996 cit. podle Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str.

Lee, Y.H., Lew B.U., 2006 cit. podle Lee, Uk B., Yun S.H., Ji. J.H., Bae G.N., 2008, Inactivation of S. epidermidis, B. subtilis, and E. coli Bacteria Bioaerosols Deposited on a Filter Utilizing Airborne Silver Nanoparticles; Journal of Microbiology and Biotechnology, 18(1), 176–182 str. Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J., 2000 cit. podle Lee, Uk B., Yun S.H., Ji. J.H., Bae G.N., 2008, Inactivation of S. epidermidis, B. subtilis, and E. coli Bacteria Bioaerosols Deposited on a Filter Utilizing Airborne Silver Nanoparticles; Journal of Microbiology and Biotechnology, 18(1), 176–182 str. Morones J. R., Elechiguerra J. L., Camacho A., Holt K., Kouri J. Ramirez J. T., Yacaman M. J., 2005 cit. podle Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M., Večeřová R., Pizúrová N., Sharma V.K., Nevěčná T., Zbořil R., 2006, Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity, The Journal of Physical Chemistry B, 110, 16248-16253 str. 39

Navarro E., Piccapietra F., Wagner B., Marconi F., Kaegir R., Odzak N., Sigg L., Behra R., 2008 cit. podle Mirzajani F., Ghassempour A., Aliahmadi A., Esmaeili M.A., 2011, Antibacterial

effect

of

silver

nanoparticles

on

Staphylococcus

aureus;

Research

in Microbiology, 162, 542-549 str.

Yen H-J., Hsu S-h., Tsai CH-L., 2009 cit. podle Lara H.H., Garza-Treviño E.N., IxtepanTurrent L., Singh D.K., 2011, Silver nanoparticles are broad-spectrum bactericidal and virucidal compounds, Journal of Nanobiotechnology, 9, 1-8 str. Senjen R. 2007 cit. podle Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str. Venugopal B., Luckey TD. 1978 cit. podle Panyala N., Pena-Mendez E., Havel J., 2008, Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health?; Journal of Applied Biomedicine, 6, 117-129 str.

40

Internetové zdroje: URL 1: http://www.nanoklastr.cz/inpage/nanotechnologie/ citováno 8. 5. 2012 URL 2: Nanotechnologie a nanomateriály. [online]. [cit. 2012-05-09]. Dostupné z: http://www.khsova.cz/01_aktuality/nanotechnologie.php?datum=2009-03-18 URL 3: Petr Gargulák, Koloidní stříbro [online]. 2010. 2012-04-19 [cit. 2012-04-15]. URL

4:

Alchemical

History

of

Gold

[online].

[cit.

2012-04-22]

URL 5: http://www.silverexcom.cz/o-stribru/historie-stribra/

URL 6: http://www.discovernano.northwestern.edu/whatis/index_html/sizematters_html

URL 7: http://moreaus-insel.blogspot.com/2010/07/blaue-wunder.html

URL 8: http://dermatology.cdlib.org/111/case_reports/argyria/wadhera.html

URL 9: http://www.woundsource.com/product/acticoat-7

41