MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii
VYUŽITÍ METODY SUPERKRITICKÉ FLUIDNÍ EXTRAKCE K EXTRAKCI ORGANICKÝCH POLUTANTŮ
Brno 2008
Autor: Lucie Bielská Vedoucí: doc. RNDr. Zdeněk Šimek, CSc.
PODĚKOVÁNÍ Děkuji doc. RNDr. Zdeňku Šimkovi, CSc. za jeho podnětné vedení a odbornou pomoc a také Mgr. Romaně Kurkové za cenné rady a připomínky týkající se formální a obsahové stránky diplomové práce.
1 SEZNAM ZKRATEK A ACN ASE
Trojný bod Acetonitril Zrychlená extrakce rozpouštědlem (Accelerated solvent extraction) Index označující vodnou fázi aq CO2 Oxid uhličitý Cox Oxidovatelný uhlík CCHL/ CFK/ CHK Celkový obsah huminových látek/ fulvokyselin/ huminových kyselin CRM Certifikovaný referenční materiál DAD Detektor s diodovým polem (Diode array detector) DCM Dichlormethan DDE Dichlorbis(chlorfenyl)ethen DDD Dichlorbis(chlorfenyl)ethan DDT Trichlorbis(chlorfenyl)ethan ECD Detektor elektronového záchytu FID Plamenový ionizační detektor (Flame ionisation detector) FLD Fluorescenční detektor Podíl organického uhlíku v půdě foc Index označující plynnou fázi gas GC Plynová chromatografie (Gas chromatography) H Bezrozměrná Henryho konstanta HCB Hexachlorbenzen HPLC Vysoce účinná kapalinová chromatografie (High performance liquid chromatography) HRGC Vysoce rozlišovací plynová chromatografie (High resolution gas chromatography) ICP Indukčně vázané plazma (Inductively coupled plasma) K Kritický bod Koc Rovnovážný rozdělovací koeficient organický uhlík-voda Kow Rovnovážný rozdělovací koeficient oktanol-voda KVK Kationtová výměnná kapacita kp Křivka syté páry ks Křivka sublimační kt Křivka tání LC Kapalinová chromatografie (Liquid chromatography) mmolchemekv milimol chemických ekvivalentů M Celková hmotnost (kg) Mr Molekulová hmotnost (g/mol) MetOH Methanol MPa megapascal MS Hmotnostní spektrometrie (Mass spectrometry) NPD Detektor selektivní na dusík a fosfor (Nitrogen-phosphorus detector) Ntot Celkový obsah dusíku ** N Neakreditované zkoušky vycházející z metodiky Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského p Tlak
3
pKa PAH PANH PA(N)H PAOH PASH PCB pk pKa POP(s) Q 4/6 R RP-HPLC sc CO2 SF SFC SFE SOP SVOC t Te Tk TKS UV/VIS V ε ρb
Disociační konstanta Polykondenzované uhlovodíky, polycyklické aromatické uhlovodíky (Polycyclic aromatic compounds) Polycyklické aromatické dusíkaté heterocykly (Polycyclic aromatic nitrogen heterocycles) Souhrnné označení pro polycyklické aromatické uhlovodíky a polycyklické aromatické dusíkaté heterocykly používané v této práci Polycyklické aromatické kyslíkaté heterocykly (Polycyclic aromatic oxygen heterocycles) Polycyklické aromatické sirné heterocykly (Polycyclic aromatic sulfur heterocycles) Polychlorované bifenyly Kritický tlak Disociační konstanta kyselin Perzistentní organické polutanty Parametr vyjadřující kvalitu humusu Výtěžnost Kapalinová chromatografie na reverzní fázi Superkritický CO2 Superkritická tekutina (Supercritical fluid) Superkritická fluidní chromatografie Superkritická fluidní extrakce (Supercritical fluid extraction) Standardní operační postup Semivolatilní organické látky (Semivolatiles organic compounds) Délka extrakce Teplota extrakční cely Kritická teplota Teorém korespondujících stavů Ultrafialová/viditelná oblast spektra Objem Dielektrická konstanta Hustota půdy (kg m-3)
4
2 OBSAH 1 SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................................................................. 3 2 OBSAH ..................................................................................................................................................................... 5 3 ABSTRAKT ............................................................................................................................................................. 6 4 ABSTRACT ............................................................................................................................................................. 7 5 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE ................................................................................................................................. 8 6 TEORETICKÁ ČÁST............................................................................................................................................. 9 6.1 ÚVOD................................................................................................................................................................... 9 6.2 TEORIE NADKRITICKÝCH VELIČIN ...................................................................................................................... 10 6.3 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ CHROMATOGRAFIE ( SFC ) ......................................................................................... 13 6.4 SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE (SFE) ....................................................................................................... 14 6.4.1 Základní princip a vlastnosti SFE.............................................................................................................. 14 6.4.2 Instrumentace SFE..................................................................................................................................... 16 6.5 DISTRIBUCE LÁTEK V PŮDNÍM PROSTŘEDÍ ......................................................................................................... 18 6.6 VYUŽITÍ SFE K POPISU ENVIRONMENTÁLNÍCH PROCESŮ ................................................................................... 20 6.7 SELEKTIVNÍ EXTRAKČNÍ TECHNIKY ................................................................................................................... 24 6.8 POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ DUSÍKATÉ HETEROCYKLY (PANH) .................................................................... 26 6.8.1 Výskyt a zdroje polycyklických aromatických uhlovodíků a polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů – PA(N)H......................................................................................................................................... 30 6.8.2 Toxikologické vlastnosti polycyklických aromatických uhlovodíků a polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů – PA(N)H ....................................................................................................................... 32 6.8.3 Biologická degradace PAH a hetero-PAH ................................................................................................ 36 6.9 ANALYTICKÁ SEPARACE A DETEKCE.................................................................................................................. 38 7 MATERIÁL A METODY..................................................................................................................................... 40 7.1 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE ........................................................................................................................................ 40 7.2 POUŽITÉ LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A ZAŘÍZENÍ.................................................................................................. 41 7.2.1 Superkritický fluidní extraktor ................................................................................................................... 42 7.3 PŮDNÍ MATRICE ................................................................................................................................................. 43 7.3.1 Příprava modelových vzorků ..................................................................................................................... 44 7.4 VYSOCE ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE – HPLC .............................................................................. 45 8 VÝSLEDKY A DISKUSE ..................................................................................................................................... 47 8.1 VYSOCE ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) .............................................................................. 47 8.2 STUDIUM EXPERIMENTÁLNÍCH PODMÍNEK OVLIVŇUJÍCÍCH VÝTĚŽNOST SUPERKRITICKÉ FLUIDNÍ EXTRAKCE Z PŮD .......................................................................................................................................................................... 48 8.2.1 Optimalizace záchytu ................................................................................................................................. 49 8.2.1.1 Stabilita PA(N)H v čistém rozpouštědle (DCM) a v DCM- extraktu ................................................................... 51
8.2.2 Optimalizace délky extrakce ...................................................................................................................... 53 8.2.3 Optimalizace modifikace superkritické tekutiny ........................................................................................ 54 8.2.4 Optimalizace teploty a tlaku ...................................................................................................................... 57 8.3 SLEDOVÁNÍ ČASOVÝCH ZMĚN KONCENTRACE ANALYTU U OBOHACENÝCH VZORKŮ ......................................... 64 8.4 NÁVRHY PRO ZVÝŠENÍ VÝTĚŽNOSTI ANALYTŮ A ODSTRANĚNÍ PROBLÉMŮ S PRAKTICKÝM PROVEDENÍM SFE .. 67 9 ZÁVĚR ................................................................................................................................................................... 69 10 LITERATURA..................................................................................................................................................... 71 11 PŘÍLOHY............................................................................................................................................................. 85
5
3 ABSTRAKT Metoda superkritické fluidní extrakce (SFE) byla použita ke studiu chování polycyklických dusíkatých heterocyklů (PANH) a polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) při extrakci z půd za různých experimentálních podmínek. Vliv teploty a tlaku byl sledován v rozmezí 50 – 150 °C a 30 – 40 MPa. Nejvyšší extrakční výtěžnost byla dosažena při 150 °C a 40 MPa. Tlak a teplota ovlivňují rozpustnost analytu a podporují difusi látky z půdní matrice do superkritické tekutiny. Vzhledem k nízké polaritě oxidu uhličitého nelze PANH extrahovat čistým CO2. Polarita extrakčního média byla modifikována přídavkem rozpouštědla přímo do extrakční cely před zahájením extrakce. S použitím 600 µl směsi modifikátoru acetonitrilu a vody (1:1) bylo dosaženo kvantitativní extrakce většiny PA(N)H (výtěžnost 87-102 %). Slabší extrakční účinnost byla pozorována pro ftalazin, 1,7-fenanthrolin a akridin (37-42 %). Tyto látky pravděpodobně silně interagují s aktivními místy půdní matrice. Pro (de)sorpční experimenty byly připraveny vzorky o různém složení a poměru základních komponent artificiální půdy (písek, jíl, rašelina). Nejvyšší výtěžnost PA(N)H byla pozorována u písku (průměrná výtěžnost: PAH = 100 %; PANH = 99 %), naopak pokles extrakční účinnosti byl zaznamenán pro vzorky s vyšším obsahem rašeliny (průměrná výtěžnost: PAH = 93,5 %; PANH = 73,5 %). Na základě výsledků studie lze předpokládat, že sorpce organických polutantů se uskutečňuje přednostně na organickou složku půdní matrice. S využitím metody SFE byl sledován a vyhodnocen také proces stárnutí jako změna extrakční výtěžnosti v závislosti na době, která uplynula od laboratorní kontaminace vzorku. Během 150-dnů trvajícího experimentu byl pozorován až 50% pokles extrakční výtěžnosti. Tento jev může být důsledkem procesů stárnutí.
6
4 ABSTRACT The present paper describes factors that have been found to be important in developing quantitative SFE methods for extracting polycyclic aromatic hydrocarbons and their nitrogen heterocycles from soil matrices. The effect of temperature and pressure was examined in the range of 50 – 150 °C and 30 – 40 MPa. The highest extraction recoveries were obtained at 150 °C and 40 MPa. The temperature and pressure influence the solubility of analytes and enhance the mass transfer from soil matrix into the supercritical fluid. It is not possible to sufficiently extract PANHs with pure CO2 because of the low polarity of carbon dioxide. The polarity was modified by adding an appropriate volume of solvent directly into the extraction cell. Good results (recovery 87-102 %) were obtained for most of the PA(N)Hs with the mixture of 600 µl acetonitrile and water (1:1). Lower extraction efficiencies were observed for phtalazine, 1, 7-phenanthroline and acridine (37-42 %). These compounds are probably strongly bound to soil matrix. Soil samples with different composition and ratios of basic soil components (sand, loam, peat) were prepared and used for (de)sorption experiments. The best extraction recoveries of PA(N)H were obtained for sand samples (average recovery: PAH = 100 %; PANH = 99 %), the lowest with samples containing higher amount of peat (average recovery: PAH = 93,5 %; PANH = 73,5 %). It was revealed that the sorption may occur due organic matter. In order to describe the process of aging freshly spiked and aged samples were extracted under the same extraction conditions. During a 150-day long experiment it was observed < 50 % decrease of extracted pollutants from soil samples. This could be a result of strong sorption of organic pollutants to the soil matrix and the process called aging..
7
5 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cíle předložené diplomové práce lze shrnout do čtyř bodů: 1. Zpracování literární rešerše na téma:
teorie nadkritických veličin, možnosti využití systémů s nadkritickou tekutinou, použití
extrakce
nadkritickou
tekutinou
v přípravě
a
zpracování
vzorků
pro instrumentální analýzu, instrumentální analytické metody využívající vlastnosti superkritických tekutin;
použití extrakce nadkritickou tekutinou (SFE) v analýze vzorků životního prostředí, využití v analytice organických polutantů;
požadavky na zařízení vhodné k SFE vzorků životního prostředí;
využití SFE k popisu environmentálních procesů.
2. Zvládnutí metody separace vybraných organických polutantů metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). 3. Studium experimentálních podmínek ovlivňujících extrakční výtěžnost (SFE) vybraných organických polutantů z pevných environmentálních matric a srovnání s moderními metodami Soxhletovy extrakce. 4. Použití metody SFE ke studiu efektů ,,stárnutí“ sledovaných polutantů v pevných environmentálních matricích.
8
6 TEORETICKÁ ČÁST 6.1 Úvod Příprava analytického vzorku z reálných matric je jedním z klíčových problémů analytické chemie. Na jejím provedení závisí celkový úspěch kvantitativního i kvalitativního analytického stanovení. Volbou vhodné metody přípravy vzorku tedy rozhodujeme nejenom o přesnosti stanovení dané látky, ale vůbec o možnosti jejího určení. V případě tuhých environmentálních vzorků se obvykle využívají metody extrakce organickými rozpouštědly, např. Soxhletova extrakce. Tyto metody však vyžadují dlouhé extrakční časy (až 2/3 z celkové doby analýzy), používají ekologicky závadná rozpouštědla a výsledný extrakt často obsahuje řadu balastních a rušivých látek.
Požadavky na stanovení stále širšího počtu látek a využití procesů šetrných k životnímu prostředí vedly k rostoucímu uplatnění nekonvenčních alternativních rozpouštědel, např. superkritických tekutin (SF). Z hlediska fyzikálně-chemických vlastností tvoří SF přechod mezi plynem a kapalinou. Solvatační schopnost superkritických tekutin se přibližuje kapalinám, zatímco penetrace do pevné matrice je usnadněna vlastnostmi podobnými plynu. Důsledkem toho je, že rychlost extrakce je vyšší než u konvenčních extrakčních postupů. Extrakční podmínky mohou být řízeny tak, aby bylo dosaženo selektivní separace. Rozpustnost analytů v superkritické fázi je totiž závislá na hustotě tekutiny, která může být ovlivňována tlakem a teplotou. Nadkritické tekutiny se uplatňují při extrakci i jako mobilní fáze v chromatografii.
9
6.2 Teorie nadkritických veličin Kritické veličiny představují důležité fyzikálně-chemické parametry, které slouží k charakterizaci látek a jejichž znalost umožňuje prostřednictvím teorému korespondujících stavů (TKS) stanovení jiných látkových vlastností. Indikují průmyslové využití látky (superkritická extrakce, oxidace, speciální polymerace apod.). Většina současných aparatur pro stanovení kritického bodu vychází z vizuálního pozorování (Obrázek 2). Existují i postupy ke stanovení kritických veličin na základě měření fyzikálních parametrů (index lomu, permitivita, rychlost zvuku).
Fázový diagram (Obrázek 1) je diagram, do jehož souřadného systému je současně zanesena křivka syté páry (kp), křivka tání (kt) a křivka sublimační (ks). Na vodorovné ose je vynesena termodynamická teplota, na svislé ose tlak. Ve fázovém diagramu se všechny křivky protínají v jednom bodě, který se nazývá trojný bod (A). Znázorňuje rovnovážný stav soustavy tuhá fáze + kapalina + plynná fáze. Křivky kp, kt a ks rozdělují rovinu fázového diagramu na tři oblasti I, II, III. Oblast I znázorňuje stav látky v pevném skupenství, oblast II ve skupenství kapalném a oblast III znázorňuje stav plynné fáze. Přechod z jedné oblasti do druhé znázorňuje děj, při kterém dochází ke změně skupenství.
Superkritická tekutina je chemické individuum při teplotě a tlaku nad svým kritickým bodem. Kritický bod (K) látky je označení podmínek (tlak, teplota), při kterých se ztrácí rozdíl mezi kapalnou a plynnou fází látky a kapalná fáze přestává existovat. Při zahřívání kapaliny v uzavřené nádobě se její teplota zvyšuje, hustota, viskozita a povrchové napětí se snižují, zatímco hustota a tlak plynné fáze narůstá. Ve chvíli, kdy jsou obě hustoty stejné, vymizí fázové rozhraní mezi kapalinou a plynem (viz. Obrázek 2). Tekutina v superkritickém stavu si uchovává solvatační vlastnosti kapaliny, ale transportními vlastnostmi se blíží parametrům obvyklým pro plyny (Tabulka 1). Regulací tlaku a teploty lze měnit solvatační schopnost a hustotu nadkritické tekutiny a simulovat vlastnosti organických solventů v rozsahu od chloroformu přes dichlormethan až po hexan. Variabilní sílu nadkritického rozpouštědla můžeme využít pro čištění, extrakci, frakcionaci a rekrystalizaci široké řady materiálů.
10
Obrázek 1. Fázový diagram jednosložkové soustavy
Obrázek 2. Přechod oxidu uhličitého do superkritického stavu dosažením kritického tlaku a teploty
Superkritická fluidní technologie využívající superkritickou vodu a oxid uhličitý má značné průmyslové uplatnění zahrnující tyto oblasti [Zougagh et al. 2004]:
farmacie (extrakce přírodních produktů, odstraňování zbytku rozpouštědel);
potravinářství
(extrakce
chmele,
snižování
obsahu
kofeinu - čaj, káva);
petrochemie (regenerace lubrikantů a olejů);
syntetická chemie, polymerní a elektronický průmysl;
ekologie (čištění kontaminovaných půd).
11
tuku,
cholesterolu,
V analytické oblasti se v posledních letech staly předmětem výzkumné aktivity chemické a enzymatické reakce v nadkritických médiích, nadkritická mobilní fáze v chromatografii a extrakce látek stojících v popředí zájmu biologů a ochránců životního prostředí. Tabulka 1. Porovnání typických fyzikálních parametrů plynů a kapalin za normálních podmínek se superkritickými tekutinami [Székely, on line] Plyn SF Kapalina
Hustota [kg.m-3]
Viskozita [cP]
Difuzivita [mm2.s-1]
1 100-800 1 000
0,01 0,05-0,1 0,5-1,0
1-10 0,01-0,1 0,001
12
6.3 Superkritická fluidní chromatografie ( SFC ) Superkritická fluidní chromatografie (SFC) se s výhodou používá v případech, kde selhává plynová chromatografie (GC), tzn. pro analýzu málo těkavých nebo tepelně labilních látek. Tyto látky lze analyzovat metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC), avšak s nižší účinností [Obrázek 3] a s delší dobou analýzy než v SFC [Yanqun et al. 2008].
Nižší viskozita superkritické tekutiny a vyšší difuzivita analytu v SF umožňují dosáhnout požadovaného rozlišení při vyšších průtocích mobilní fáze a účinnou separaci v kratších analytických kolonách ve srovnání s HPLC [Brunelli et al. 2008].
Přístrojové vybavení pro SFC v kapilárních kolonách se podobá instrumentaci kapilární plynové chromatografie, zařízení pro SFC v náplňových kolonách připomíná instrumentaci HPLC [Combs et al. 1997]. Metoda SFC se uplatňuje při analýze polymerů, vosků, dehtů, fosilních paliv, léčiv [Villeneuve & Anderegg 1998; Brunelli et al. 2008; Cazenave-Gassiot et al. 2008] i potravinářských produktů [Peper et al. 2007].
Obrázek 3. Srovnání účinnosti (počet teoterických pater) a selektivity (separační faktor) metod GC, SFC, HPLC
13
6.4 Superkritická fluidní extrakce (SFE) 6.4.1 Základní princip a vlastnosti SFE Superkritická fluidní extrakce (SFE) je účinná izolační metoda, která eliminovala některé nedostatky kapalinové extrakce kapalin a pevných látek. Kombinuje jedinečné fyzikální a chemické vlastnosti superkritických tekutin usnadňujících difusi do matrice vzorku a umožňujících rychlou a kvantitativní separaci.
Nejčastěji používaným superkritickým rozpouštědlem je oxid uhličitý (Tabulka 2). V průmyslových aplikacích je preferován zejména kvůli snadno dosažitelným kritickým parametrům (Tk = 31,1 °C, pk = 7,38 MPa), snadné dostupnosti v požadované čistotě a množství a nízké ceně. Netoxický a chemicky inertní charakter vyhovuje environmentálním požadavkům. Z analytického hlediska je vítána kompatibilita oxidu uhličitého s plamenovým ionizačním (nehořlavost CO2), spektrofotometrickým (transparentnost CO2 v UV oblasti) nebo vodivostním detektorem. Limitujícím faktorem CO2-SFE je neschopnost extrakce polárních molekul (dielektrická konstanta CO2: ε = 1-2), které se frekventovaně vyskytují v reálných matricích. Rozpustnost sledované látky však můžeme ovlivnit přídavkem polárního (organického) rozpouštědla, tzv. modifikátoru (nejčastěji 5 – 10 % methanolu, ε
methanol
= 33) [Drake & Smith
1990]. Modifikátory mění polaritu a solvatační sílu superkritické tekutiny nebo nahrazují molekuly analytu vázané na aktivní centra matrice a uvolňují analyt do superkritické fluidní fáze [Young & Weber 1994].
Tabulka 2. Kritické hodnoty látek využitelných pro SFE (tlak: 7,43 MPa = 74,8 atm = 1070,4 psi; 1 psi= 6 894,76 Pa) [Reid et al. 1987, http://sunny.vemt.bme.hu/sfe/angol/supercritical.html] CO2 SF6 n-C6H12 CCl2F2 CClF3 N2O CHF3 CHClF2 NH3
Kritická teplota [°C] 31,3 45,5 196,6 111,7 28,8 36,5 25,9 96,0 132,3
14
Kritický tlak [MPa] 7,43 3,77 3,39 4,02 3,97 7,28 4,86 5,01 11,35
SFE se stala zajímavou alternativou získávání organických látek z biologických a environmentálních vzorků. Příklady některých analytických aplikací jsou uvedeny v Příloze Tabulka 1P. Spektrum použití SFE techniky se v posledních letech rozšířilo také do oblasti analytické chemie anorganických látek, tj. využití pro extrakci kovů z různých typů tuhých vzorků. Extrakční postupy jsou založeny na reakci komplexačního či chelatačního činidla s ionty kovů za vzniku neutrálních produktů rozpustných v superkritickém médiu [Lojková & Vejrosta 1998; Chou & Yang 2008].
Použití SFE sebou nese řadu výhod, ale také některá negativa [Dean & Xiong 2000; Holoubek et al. 2001; Zougagh et al. 2004].
Výhody SFE:
zkrácení doby extrakce v důsledku vyšší difuzivity a nižší viskozity => rychlý převod hmoty v důsledku příznivých charakteristik toku;
nízké povrchové napětí SF => snadný průnik do pórů matrice;
použití netoxických a levných rozpouštědel (oxid uhličitý, voda);
selektivita nastavitelná volbou teploty, tlaku a přídavkem modifikátoru;
čistší extrakty s nižším podílem balastních a rušivých látek;
záchyt
analytu
po
expanzi
superkritického
roztoku
=>
zisk
čistého
a zakoncentrovaného extraktu;
extrakce vysokovroucích složek a tepelně labilních látek při nižších teplotách;
vysoký stupeň automatizace;
možnost on-line spojení s vysokorozlišovací plynovou chromatografií (HRGC), superkritickou fluidní chromatografií (SFC) a dalšími analytickými metodami.
Nevýhody SFE:
potřeba tlakového zařízení;
vyšší pořizovací náklady;
zvýšený tlak => zvýšené materiálové nároky, nebezpečí koroze;
•
nutná pečlivá optimalizace extrakčních parametrů (teplota, tlak, výběr a množství modifikátoru, statický a dynamický čas extrakce, průtok SF, způsob a podmínky záchytu analytu) [Dachs et al. 1997; Zhou et al. 1997].
15
6.4.2 Instrumentace SFE Extrakční přístroje obsahují šest základních komponent: zdroje vysoce čistého CO2 a organického modifikátoru, pumpy, extrakční celu, restriktor a sběrnou nádobku. Instrumentace je znázorněna na Obrázku 4.
Obrázek 4. Schematické znázornění SFE systému
Modifikovaný CO2 je možné produkovat systémem se dvěma pumpami nebo pomocí tlakového válce obsahujícího organický modifikátor a CO2. Obvykle je preferována dražší varianta se dvěma pumpami. V případě směšovacího válce se obtížně udržuje stálý poměr CO2/modifikátor v průběhu celé operace. Ideální pumpa dopravuje směs konstantní průtokovou rychlostí (ml/min) za vhodného tlaku (25 – 70 MPa). K dosažení superkritického stavu a zavedení CO2 do extrakční cely slouží pístové nebo injekční pumpy (pístové běžnější z důvodu nižších nákladů). Termostatovaná extrakční kolona z nerezové oceli musí být schopna odolávat tlakům až 70 MPa. Mechanicky nebo elektronicky kontrolované restriktory slouží k udržení požadovaného tlaku a teploty.
Výhodou SFE je možnost provedení off-line nebo on-line způsobem. •
Při off-line způsobu dochází k zachycování extraktu do rozpouštědla [Langenfeld et al. 1992; Porter et al. 1992; Lopez-Avila et al. 1994; Lojková et al. 2005a], na inertní materiál nebo na sorbent [Ashraf-Khorassani et al. 1992; Hüsers & Kleiböhmer
16
1995]. Tento způsob je používán zejména při studiu výtěžnosti SFE a optimalizaci extrakčních podmínek. •
Při on-line provedení je SFE přímo spojena s analytickou jednotkou - např. superkritickou fluidní (SFC), kapalinovou (LC) nebo plynovou chromatografií (GC) [Turner et al. 2002]. Díky tomu odpadá manipulace se vzorkem-extraktem před provedením analýzy.
Sběrné
zařízení
pro
záchyt
analytu
musí
obsahovat
dostatečné
množství
solventu/sorbentu při vhodných podmínkách (teplota, rychlost toku, výška sloupce) pro zajištění adekvátního přenosu hmoty z expandující extrakční tekutiny do záchytné fáze (sorbent, rozpouštědlo) a k prevenci úniku těkavých analytů [Langenfeld et al. 1992; Porter et al. 1992; Lojková et al. 2005a].
Tabulka 3. Přehled komerčně dostupných SFE extraktorů HP 7680T SFE (Hewlett-Packard, Palo Aldo, CA)
[Szolar et al. 2004; Nilsson & Björklund 2005]
SE-1 (SEKO-K, s.r.o., Brno, Česká republika)
[Dachs et al. 1997; Montero-Vázques et al. 2003]
SFE 30 (Fisons-Carlo Erba, Milany, Italy)
[Zhou et al. 1997; Björklund et al. 1999; Nilsson et al. 2002, 2003]
ISCO SFX 3560, ISCO SFE 2300, ISCO SFX 2-10 (ISCO, Inc., Lincoln, NE)
[Hawthorne et al. 1993, 2001; Nilsson et al. 2000]
SFE 703 (Dionex, Sunnyvale, CA) SFE 50 (Suprex Corp., Pittsburg, PA) Spe-ed SFE 4, Spe-ed SFE-NP, Spe-ed SFE-1500 (Applied Separations, Inc., Allentown, PA)
17
6.5 Distribuce látek v půdním prostředí Hlavními procesy přispívajícími k výměně semivolatilních organických látek (SVOC) mezi vzduchem a půdou jsou suchá depozice (adsorpce plynů a částic), mokrá depozice (srážkové vyplavování plynů a částic) a těkání z půdního povrchu. K migraci sloučenin obsažených v půdě do půdního povrchu může docházet: 1. Přenosem hmoty v průběhu vodního vypařování. 2. Pomocí stoupající plynné/kapalné difuse vlivem existence koncentračního gradientu látek mezi povrchem a spodními vrstvami půdy. 3. V důsledku umělého narušení půdní rovnováhy – člověkem nebo půdními organismy.
Pro většinu SVOC je první proces hlavním transportním mechanismem, druhý způsob se uplatňuje především u více těkavých sloučenin a za suchých podmínek, poslední případ je významný zejména pro perzistentní nepohyblivé látky (polychlorované bifenyly, polychlorované dioxiny a dibenzofurany) [Cousins & Jones 1998]. Potenciál k pohybu půdním prostředím je závislý na distribuci sloučenin mezi pevnou, kapalnou a plynnou půdní fázi. Rozdělování látek lze popsat pomocí distribučních koeficientů, které vyjadřují sumu molekulárních interakcí (iontové interakce, van der Waalsovy síly, vodíkové můstky) mezi látkou a dvěma fázemi. Distribuce neiontového organického materiálu mezi pevnou a kapalnou fází koreluje s obsahem organické hmoty v půdě. Rozdělovací koeficient mezi oktanolem a vodou (Kow) je běžným a obecně akceptovaným indikátorem hydrofobicity a společně s obsahem organického materiálu v půdě slouží k odhadu sorpce na půdu, retenčních faktorů a zhodnocení možného nebezpečí kontaminace vodního prostředí. Parametr Kow je často začleněn do modelů popisujících environmentální distribuci a osud látek v prostředí [Cousins et al. 1999].
Koc = 0,411 Kow………… Karickhoffova rovnice, Kd = foc Koc = 0,411 foc Kow, kde
foc.....................podíl organického uhlíku v půdě, Kow...................rozdělovací koeficient oktanol-voda, Koc...................rozdělovací koeficient organický uhlík a voda.
18
Rovnovážné rozdělení hmoty mezi vodnou a plynnou fázi lze charakterizovat pomocí Henryho konstanty. Rozdělovací koeficienty mohou být za rovnovážných podmínek spolu se znalostí půdního objemu vzduchu, obsahu vody, půdní hustoty, tloušťky a porosity použity k odhadu množství organických polutantů spočívajících v pevné, vodné a plynné fázi půdy.
Mgas / M = Vgas / (Vgas + 1/H Vaq + ρb Kd 1/H) Maq / M = Vaq / (Vaq + H Vgas + ρb Kd), kde
M……. celková hmotnost přítomných sloučenin (kg), ν…….. objem (m3), ρb…….hustota půdy (kg.m-3), H…….. bezrozměrná Henryho konstanta, indexy ´aq´ a ´gas´ označují vodné a plynné fáze půdy.
Polutant je po vstupu do půdního prostředí podroben celé řadě fyzikálně-chemických procesů. Z pohledu predikce biodostupnosti a mobility polutantu v půdě jsou nejvýznamnější sorpce, rozdělování a difuse. Sorpce zahrnuje procesy adsorpce (sloučenina interaguje s dvoudimenzionálním povrchem) a absorpce (molekula penetruje do trojrozměrného prostoru) [Schwarzenbach et al. 2003]. Rozdělování je definováno jako rovnovážná distribuce analytu mezi dvě fáze (plynnou a pevnou, vodnou a pevnou, vodnou a plynnou) [Ehlers & Loibner 2006]. Difuse označuje transportní procesy uvnitř půdní matrice [Pignatello & Xing 1996; Nam & Alexander 1998].
Hydrofobní organické polutanty interagují s amorfní (půdní) organickou hmotou a geosorbenty s vysokým obsahem uhlíku [Cornelissen at al. 2005]. Sorpce na půdní organickou složku
je
považována
za
reverzibilní
proces.
Geosorbenty
jsou
kompaktní
produkty nedokonalého spalování (saze), jejichž nanoporózní struktura je příčinou silné ireverzibilní sorpce především planárních PAH. Desorpce polutantů z půd se proto uskutečňuje jako dvoufázový proces [Cousins & Jones 1998; Hawthorne et al. 2001] charakterizovaný rychlou počáteční fází, po které následuje pomalejší tok kontaminantů. Tento jev označujeme jako nerovnovážnou nebo pomalou reverzibilní desorpci a ve svém důsledku může vést k tvorbě trvalých podílů kontaminantů nevratně vázaných k matrici (rezidua) [Carroll et al. 1994; Kan et al. 1994; Alexander 1995]. 19
6.6 Využití SFE k popisu environmentálních procesů Možnost
využití
techniky
superkritické
fluidní
extrakce
k charakterizaci
environmentálních procesů se vztahuje na popis kinetiky sorpce a desorpce POP z pevných matric [Burford et al. 1993; Hawthorne et al. 2001; Al-Jabari 2002] a nově také na výzkumné studie v oblasti vyhodnocení biodostupnosti [Nilsson et al. 2002, 2006; Hallgren et al. 2006].
Účinnost extrakční metody se zejména v případě, kdy nemáme k dispozici standardní referenční materiál, stanovuje na základě výtěžnosti externího standardu. Jako externí standardy se využívají látky, které se v reálných matricích přirozeně nevyskytují (např. izotopicky značené analyty – deuterované PAH). Jejich definované množství se přidá ke kontaminovanému vzorku před zahájením extrakce. Ve srovnání s ostatními stanovovanými polutanty je externí standard exponován matrici velmi krátkou dobu. V důsledku kinetických a difusních omezení sorpčního procesu nebude externí standard (deuterovaný PAH na Obrázku 5) [Burford et al. 1993], přidáný před extrakcí do vzorku odpadního kalu znečištěného PAH, situován na stejných aktivních místech a ani adsorbován stejným způsobem jako PAH, u kterého delší doba kontaktu analytu s matricí (desítky až stovky dnů) umožnila vytvoření silnějších vazebných interakcí (tzv. stárnutí, angl. aging). Síla vzájemných interakcí se projevuje rozdílnou výtěžností a kinetikou desorpce PAH a deuterovaného PAH (Obrázek 5) [Burford et al. 1993]. Primární příčinou různé intenzity interakcí mezi konkrétní matricí a analyty, které vykazují téměř shodné fyzikálně-chemické vlastnosti (PAH a deuterovaný PAH), je tedy odlišná délka vzájemného kontaktu s matricí. Účinnost extrakčních metod proto nelze spolehlivě vyhodnotit použitím vnějšího standardu či laboratorně kontaminovaných vzorků [Hawthorne et al. 1993].
20
Obrázek 5. Srovnání kinetiky SFE extrakce nativních PAH a deuterovaných PAH (plné značky) z odpadního kalu (0-30 min: CO2, 400 atm, 60 °C, 30-60 min: CO2/MetOH 400 atm, 60 °C; Výtěžnost = 100 % označuje sumu výtěžků ze 3 extrakčních procesů – SFE-CO2, SFECO2/MetOH a ultrazvukové extrakce-DCM) [Burford et al. 1993]
naftalen
100
benzo[b+k]fluoranten
Výtěžnost [%]
80
chrysen fenantren
60
pyren
40
d12benzo[b+k]fluoranten d12-chrysen d10-pyren
20
d8-naftalen 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Čas extrakce [min]
Metoda sekvenční (vícekrokové) SFE (Obrázek 6) umožňuje vyhodnotit distribuci POP na energeticky odlišná vazebná místa matrice [Björklund et al. 1999]. První fáze extrakce je charakterizována rychlým uvolněním analytu z míst o nízkém sorpčním potenciálu, v následujících fázích probíhá extrakce za zvýšeného tlaku a teploty a dochází k desorpci silněji vázaných analytů. Postupnou změnou extrakčních podmínek lze docílit kontinuálního nárustu rozpustnosti analytu v superkritické fázi a jeho mobilizace z různých míst matrice. Procentuální zastoupení analytu v jednotlivých frakcích se pro různé vzorky odlišuje (viz. Přílohy - Tabulka 2P, 3P). Kinetika extrakce je tedy ovlivněna nejen vlastnostmi analytu, ale především fyzikální strukturou a chemickým složením matrice a také délkou kontaktu analytu s matricí.
21
Obrázek 6. Selektivní desorpční chování vybraných PCB kongenerů z CRM 536 sedimentu (SFE: 1. hodina – 120 bar, 40 °C; 2. h – 400 bar, 40 °C; 3. h – 400 bar, 100 °C; 4. h – 400 bar, 150 °C) [Björklund et al. 1999] rychlá a snadná desorpce → pomalá desorpce
Kinetické desorpční profily SFE mají za určitých podmínek stejný průběh jako u jiných metod pro stanovení kinetických parametrů, např. uvolňování do vodného média [Hawthorne et al. 2001] a lze je využít pro odlišení tzv. volného a vázaného podílu analytů [Young & Weber 1997; Hawthorne & Grabanski 2000]. Volná (labilní) frakce kontaminantů je extrahována za mírných podmínek (např. 40-50 °C, 12 MPa), zatímco vázaný podíl analytů zůstává imobilizován v matrici. Intenzita interakcí a mobilita analytu v matrici je různá a ovlivňuje dostupnost jednotlivých molekul analytu superkritickému médiu. Poznatky z provedených kinetických studií se staly podnětem k úvahám, zda je selektivní SFE probíhající za mírných podmínek schopna simulovat mechanismus desorpce analytu v přírodních systémech během biologického příjmu (Přílohy – Tabulka 3P) a jaké jsou případné možnosti jejího využití jako prostředku pro získání informací o chování, environmentálním osudu a mobilitě polutantu v zatížených lokalitách [Björklund et al. 1999]; predikci účinnosti bioremediačního procesu
22
[Hawthorne & Grabanski 2000; Hawthorne et al. 2001] a odvození akumulačního potenciálu nebo toxického vlivu na živé organismy [Tang et al. 2002]. V současné době jsou toxikologická a environmentální rizika spojená s kontaminovanými oblastmi odhadována na základě stanovení absolutní koncentrace polutantu ve vzorku pomocí kvantitativních extrakčních technik [Paton et al. 2005]. Věrohodnost tohoto postupu však byla v posledních letech zpochybněna [Alexander 1995; Tang et al. 2002; Scott & Dean 2003]. Bylo prokázáno, že vzorky se stejnou hladinou kontaminace mohou vykazovat odlišnou toxicitu a také, že vzorky s nejvyšším obsahem polutantu nemusí být nejtoxičtější. Jiná alternativa, biologické testy (viz. Přílohy - Tabulka 4P), jsou často časově náročné, nákladné a nedosahují požadované přesnosti [Paton et al. 2005]. Současný vědecký zájem je proto soustředěn na nalezení chemické techniky schopné předpovědět a kvantifikovat frakci analytů, která představuje bezprostřední riziko pro živé organismy (tzv. biodostupná frakce).
23
6.7 Selektivní extrakční techniky Kvantitativní způsoby extrakce jsou nahrazovány postupy umožňujícími selektivní odstranění biodostupné frakce analytu. Selektivní extrakce mohou být založeny na nepřímé extrakci pomocí pevných disků (pryskyřice TenaxTM nebo XADTM, C18) a semipermeabilních membrán nebo na přímé kapalinové extrakci slabými rozpouštědly (voda, butanol) [Northcott & Jones 2003; Scott & Dean 2003] či chemickými činidly (HPCDhydroxypropyl-β-cyklodextrin) (viz. Přílohy - Tabulka 4P). Biologické degradaci může podléhat pouze volně rozpuštěná frakce analytů. Působením bakterií dochází ke kontinuálnímu odstraňování analytu z vodné fáze a je podporováno jeho další uvolňování z půdy. HPCD (hydroxypropyl-β-cyklodextrin) je ve vodě rozpustný, kruhový heptasacharid s hydrofobními centry, který může tvořit komplexy s organickými molekulami. Při použití HPCD je proces odstraňování analytu biologickým rozkladem simulován vznikem komplexu mezi molekulou cyklodextrinu a analytu [Reid et al. 2004].
SFE nabízí na rozdíl od konvenčních kapalinových extrakčních technik možnost snadno upravovat efektivitu (účinnost, sílu) extrakce a za vhodných superkritických podmínek (tlak, teplota) docílit podobné rozpustnosti analytu jako ve vodě [Hawthorne et al. 2001]. Při SFE extrakci čistým CO2 navíc nedochází k tak výraznému narušení půdní matrice jako při použití organických solventů. Zachování integrity matrice je jedním ze základních požadavků pro studium kinetiky extrakce [Björklund et al. 1999].
Ověření korelace mezi chemicky extrahovanou a biologicky dostupnou frakcí lze provést následujícími způsoby:
srovnáním reziduálních koncentrací analytu ve vzorku extrahovaného selektivní SFE se vzorkem, který byl podroben bioremediaci nebo vodnému výluhu [Hawthorne & Grabanski 2000; Hawthorne et al. 2001];
porovnáním biota-substrát bioakumulačních faktorů vypočtených pro chemicky neošetřený substrát a substrát, který byl selektivně extrahován [Nilsson et al. 2003; Nilsson & Björklund 2005; Hallgren et al 2006];
24
porovnáním velikosti frakce analytu extrahovaného selektivní SFE s frakcí analytu, která byla přijata vybraným receptorem – bioakumulované množství se stanoví metodou kvantitativní extrakce [SFE – Nilsson & Björklund 2005; ASE – Nilsson et al. 2006];
srovnáním velikosti frakce analytu získaného selektivní SFE s množstvím biologicky degradovaného analytu - kvantifikace biologické atenuace se provádí pomocí: ▫ mineralizačních studií s 14C-izotopicky značenými analyty podle množství uvolněného 14CO2 [Chung & Alexander 1998; Johnson & Karlson 2007; Stroud et al. on line]; ▫
izotopové frakcionace, jejímž principem je výpočet rozsahu biologické degradace na základě změny izotopového složení, resp. poměru
13
C/12C strukturně
identických sloučenin [Elsner et al. 2005] – k nestejné izotopové frakcionaci dochází vlivem rozdílu v hmotnosti jednotlivých izotopů, která se projevuje různou rychlostí difuse a přechodu do biologických organismů, ▫ sledování změn v relativním zastoupení isomerů (např. methyl-PAH), které vykazují podobné fyzikálně-chemické vlastnosti, ale různý potenciál k biologické degradaci [Wang et al. 1998].
25
6.8 Polycyklické aromatické dusíkaté heterocykly (PANH) Polycyklické aromatické dusíkaté heterocykly (PANH) jsou odvozeny od polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH), v jejichž struktuře byl jeden nebo více atomů uhlíku nahrazen heteroatomem
dusíku.
Mezi
PANH
zahrnujeme
jedno-
až
devítijaderné
molekuly,
environmentálně významné jsou PANH se dvěma až pěti kondenzovanými cykly. Dusíkaté heterocykly obsahující v kruhovém řetězci jeden atom dusíku bývají často označovány termínem azaareny [Helweg 1997]. Polykondenzované dusíkaté heterocykly (PANH) obsažené ve vzorcích životního prostředí tvoří složitou směs sloučenin. Bylo identifikováno více než padesát PANH a jejich isomerů [Carlsson & Östman 1997; Osborne et al. 1997]. Vzhledem k toxikologické charakteristice (mutagenní a karcinogenní aktivita) a environmentálně chemickým vlastnostem (vyšší rozpustnost, biodostupnost vodním organismům) je proto žádoucí:
vyvinout a aplikovat takové analytické metody a postupy, které by umožnily snadnou kvantifikaci a kvalitativní stanovení PANH a přispěly k pochopení osudu těchto látek v prostředí a mechanismu jejich transportu;
navrhnout vhodné experimentální testy toxicity k vyhodnocení biologických účinků PANH na živé organismy.
Podle počtu atomů v cyklu, který obsahuje heteroatom dusíku, lze PANH rozdělit do dvou skupin:
akridiny – obsahují pyridinový, tzn. šestičlenný kruh;
karbazoly – obsahují pyrrolový, tzn. pětičlenný kruh.
PANH akridinového typu mají lehce bazické vlastnosti (akceptory vodíku), jež jsou dány přítomností volného elektronového páru na endocyklickém heteroatomu dusíku, který nevstupuje do konjugace s delokalizovanými π-elektrony aromatického systému (pKa akridin ~ 5,5). U látek typu karbazolu dochází k interakci volného elektronového páru dusíku s π-elektrony aromatického jádra, jejímž výsledkem jsou slabě kyselé vlastnosti (donory vodíku) těchto sloučenin (pKa karbazol ~ 16,5).
26
Obrázek 7. Elektronová struktura pyridinového a pyrrolového kruhu [Kočí 2001]
Bazické PANH lze dále rozdělit na:
PANH se stérickou překážkou;
PANH bez stérické překážky.
Za stérický efekt považujeme ochranu vůči volnému elektronovému páru heteroatomu dusíku pomocí benzenové nebo methylové skupiny přiléhající k tomuto heteroatomu. Stínění volného elektronového páru dusíku způsobuje zvýšení hodnoty Kow [Helweg et al. 1997; Kollist-Siigur et al. 2001]. Obrázek 8. Znázornění stérické překážky [Kočí 2001]
Tabulka 4. Přehled sledovaných PANH a PAH
27
Chinolin
6-methylchinolin
Ftalazin
Karbazol
Akridin
Fenanthridin
Benzo[h]chinolin
Fenazin
Naftalen
Fluoren
Anthracen
Fenanthren
Fluoranthen
Benz[a]anthracen
1,7-fenanthrolin
28
Tabulka 5. Fyzikálně-chemické vlastnosti PANH a PAH * Rozp. ve vodě (mg/L; 25 °C)
H (atmm3/ mol; 25 °C)
Tlak páry pKa (mm Hg; (20 °C) 25 °C)
2,30
6110
1,67E-06
0,06
-2.20E+01 258,6
2,57
631
7,60E-07
130,10
90,5
316
0,57
5,00E+04
2,80E-07
karbazol
167,20
246,2
354,7
3,72
1,8
8,65E-08
-3,00
akridin
179,22
108
345,5
3,40
38,4
3,97E-07
5,45 (15 °C)
fenanthridin
179,22
107,4
349
3,48
300 (20 °C)
1,64E-08
2,08E-05
4,61
benzo[h]chinolin
179,22
52
339
3,43
5,08
6,72E-08
2,18E-04
4,21
fenazin
180,21
176,5
>360
2,84
16
2,78E-08
3,26E-05
1,19
1,7-fenanthrolin
180,21
78
360
2,51
376 (22 °C)
2,78E-8
3,26E-05
naftalen
128,17
80,2
217,9
3,30
31
4,40E-04
0,085
fluoren
166,22
114,8
295
4,18
1,69
9,62E-05
6,00E-04
anthracen
178,23
215
339,9
4,45
0,0434 (24 °C)
5,56E-05
fenanthren
178,23
99,2
340
4,46
1,15
4,23E-05
1,21E-04
fluoranthen
202,26
107,8
384
5,16
0,26
8,86E-06
9,22E-06
84
437,6
5,76
0,0094
1,20E-05
2,10E-07
Analyt
Mr (g/mol)
Bod tání (°C)
chinolin
129,16
-1,48E+01 237,1
6-methylchinolin 143,20 ftalazin
benz[a]anthracen 228,29
Bod varu log Kow (°C)
4,9 5,34 (20°C)
Mr...molekulová hmotnost (g/mol); log Kow... logaritmus koeficientu oktanol-voda; H... Henryho konstanta; pKa...disociační konstanta
* Hodnoty získány z internetu http://esc.syrres.com/~ESC/kowexpdb.htm, model C log P, Environmental Science Centre of Syracuse Research Corporation.
29
6.8.1 Výskyt a zdroje polycyklických aromatických uhlovodíků a polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů – PA(N)H PANH se stejně jako PAH do prostředí dostávají z antropogenních [Johnson & Karlson 2007] i přírodních zdrojů. Hlavním zdrojem těchto látek je pyrosyntéza v průběhu nedokonalého spalování organické hmoty obsahující dusík [Helweg 1997].
Mezi nejvýznamnější producenty PA(N)H patří:
produkce a zpracování dehtu;
výroba koksu, zpracování uhlí;
ropný průmysl;
automobilová exhalace.
V přírodě jsou zástupci pěti-, šesti- a sedmičlenných, resp. kondenzovaných heterocyklů s dusíkem často strukturním základem nebo částí molekuly nukleových kyselin, přírodních barviv a látek s význačnými fyziologickými účinky, jako jsou alkaloidy, některé vitamíny apod. [Van Vlaardingen et al. 1996].
PA(N)H z neúplného spalování vystupují ve vysokoteplotních plynech, které rychle chladnou, a PA(N)H kondenzují na částicích. PA(N)H s vyšší molekulovou hmotností existují v atmosféře vázané na aerosoly, nízkomolekulární PA(N)H se vyskytují převážně v plynné fázi [Dachs & Eisenreich, 2000; Chen & Preston 1997, 2004]. Z ovzduší jsou PA(N)H deponovány na hladinu vody, povrch vegetace [Holoubek et al. 2000; 2003] a do půdy při vymývání deštěm a suchou depozicí plynů a částic [Chen & Preston 2004]. Model hmotnostní bilance PAH emitovaných do volného ovzduší ze zdrojů ve sledovaném regionu (severovýchodní oblast USA) ukazuje, že okolo 10 % PAH přechází z atmosféry přímo do půdy, 5 % se stává součástí sedimentů, 46 % je v atmosféře transformováno a odváděno pryč z daného regionu a 44 % PAH je přijato vegetací a inkorporováno do půdy po skončení růstového období [Simonich & Hites 1994] .
30
Proces rozpouštění organických látek v akvatickém systému je řízen celou řadou faktorů (rozpustnost analytu, pH roztoku, teplota a iontová síla) a je jedním z klíčových parametrů určujících jejich environmentální chování a dopad. Přítomnost heterocyklického atomu v molekule PANH zvyšuje polaritu (elektronegativita N 3,0; C 2,5; H 2,2) a tedy i rozpustnost ve vodě (Tabulka 5). Pro PANH dále platí, že s rostoucí molekulovou hmotností (počtem kondenzovaných jader) a zvyšujícím se pH rozpustnost klesá. Obsah PANH v ovzduší je proto do značné míry ovlivněn srážkovým pH, neboť PANH se rychle rozpouští v prostředí o pH typickém pro dešťovou vodu (obvykle < 6). Více než 90 % PANH se uvolní z aerosolu během mokré depozice za 10 minut. Při suché depozici částic městského aerosolu do říční nebo mořské vody (pH ~ 7-8) se přes 60 % PANH rozpustí do 10 minut, více než 90 % pak během jedné hodiny [Chen & Preston 2004]. Vzhledem k vyšším hodnotám rozdělovacích koeficientů n-oktanol-voda (Kow,PAH = 1,1 – 1,3Kow, PANH) [Helweg et al. 1997, Kollist-Siigur et al. 2001] lze předpokládat snazší a rychlejší vylučování PANH do vodného prostředí, vyšší mobilitu a také biodostupnost akvatickým organismům ve srovnání s analogickými PAH [Chen & Preston 2004].
PANH byly detekovány na částicích městského prachu, v aerosolu městského ovzduší [Nito & Ishizaki 1997; Chen & Preston 2004], v mořských a jezerních sedimentech [Blumer et al. 1977; Wakeham et al. 1979; Furlong et al. 1982; Bleeker et al. 1996; Osborne et al. 1997], půdě [Kočí et al. 2007; Švábenský et al. 2007], mořské, povrchové a podzemní vodě [Van Genderen et al. 1994], odpadní vodě a splaškových kalech. Vyskytují se také ve výfukových plynech, cigaretovém kouři nebo například v mase pečeném na dřevěném uhlí [Rivera et al. 1996]. Hodnoty koncentrací v různých složkách životního prostředí se pohybují o jeden až tři řády níže ve srovnání s analogickými PAH (viz. Přílohy - Tabulka 5P) [Yamauchi et al. 1987; Dijkman et al. 1997; Helweg 1997; Švábenský et al. 2007].
31
6.8.2 Toxikologické vlastnosti polycyklických aromatických uhlovodíků a polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů – PA(N)H Distribuci PA(N)H do prostředí je v posledních letech věnována zvýšená pozornost, neboť se jedná o látky s mutagenní a karcinogenní aktivitou, jež byla prokázána celou řadou toxikologických testů na bakteriích, řasách a vyšších organismech (Tabulka 6).
Tabulka 6. Přehled realizovaných toxikologických a metabolických studií PANH na různých typech organismů Receptor
Sledovaný parametr
rostliny
fytotoxicita toxicita (inhibice růstu, obsah chlorofylu)
Reference Gissel-Nielsen & Nielsen, 1996; Helweg et al. 1997 Van Vlaardingen et al. 1996
toxicita (Toxi-chromotest)
Škarek et al. online
zelené řasy
Scenedesmus acuminatus
bakterie
genotoxicita (Amesův test) Seixtas et al. 19 82 genotoxicita (SOS Chromotest) Škarek et al. online genotoxicita (Mutatox TM test) Bleeker et al. 1999 bezobratlí
obratlovci
komár (Chironomus riparius) komár (Chironomus riparius) komár (Chironomus riparius)
akutní toxicita
Bleeker et al. 1998
akutní toxicita
Bleeker et al. 1999
korýš (Daphnia magna)
metabolismus Bleeker et al. 2001 akutní a chronická toxicita; indukce oxidativního stresu Feldmannová et al. 2006
myš
karcinogenita
Motohashi et al. 1995
krysa
karcinogenita
krysa
hepatokarcinogenita
Deutsch-Wezel et al. 1986 Yutaka et al. 1983; Bleeker et al. 2002
kapr (Cyprinus carpio)
metabolismus
Bleeker et al. 2001
32
Cesty vstupu PA(N)H do lidského organismu zahrnují:
inhalaci znečištěného vzduchu a prachových částic;
příjem kontaminované potravy a vody [IARC 1983].
Aerosolové částice (o velikosti 1-10 µm) kontaminované PANH jsou absorbovány v plicích. Expozice plicním tekutinám o pH < 8 podporuje jejich rychlé uvolňování. Výsledkem tohoto procesu jsou vysoké koncentrace PANH v plicích, ale také značná pravděpodobnost jejich následného rozšíření do krevního řečiště [Chen & Preston 2004]. PA(N)H spadají do skupiny tzv. prokarcinogenů, jsou v těle metabolizovány cestou polyfunkčního systému oxidás [Bleeker et al. 2001]. Aktivace PA(N)H na karcinogenní sloučeninu představuje proces biotransformace na diolepoxidy [Bleeker et al. 2000].
Polykondenzované sloučeniny vykazující karcinogenní aktivitu obsahují ve skeletu molekuly tzv. zátokovou oblast (bay region) (Obrázek 9). V protilehlé části molekuly lze najít oblast s vyšší elektronovou hustotou (oblast K), která je velmi reaktivní a podílí se na tvorbě vazby s akceptorem. Při odhadu karcinogenity na základě hodnocení struktury je důležitá dvojice uhlíků v para poloze (oblast L). K vyvolání karcinogenního účinku je nutné, aby reaktivita, resp. elektronová hustota v oblasti L byla malá (uhlovodík nebude v organismu rychle detekován) a aby reaktivita v oblasti K byla dostatečně vysoká (předpoklad pevné vazby uhlovodíku s akceptorem). Substitucí aromatického jádra se reaktivita oblastí K a L mění v souladu s posuny elektronů vyvolanými působením substituentu. Tím lze vysvětlit vyšší karcinogenní aktivitu např. alkylovaných derivátů [Motohashi et al 1995; Škarek et al. online]. Obrázek 9. Znázornění reakčních center a zátokové oblasti molekuly [Ostrá 2000]
Oblast L
N Zátoková oblast
33
Oblast K
Mutagenita
a
karcinogenita
polyaromatických
uhlovodíků
s rostoucím
počtem
kondenzovaných jader stoupá, maxima dosahuje pro uhlovodíky s pěti aromatickými kruhy. PA(N)H se dvěma až třemi kruhy jsou častěji klasifikovány jako mutageny, zatímco molekuly se čtyřmi a více kondenzovanými jádry vykazují spíše karcinogenní charakter [Van Vlaardingen et al. 1996]. Obecně platí, že karbazoly projevují nižší mutagenní aktivitu než akridiny, jejichž mutagenní vlastnosti jsou srovnatelné s PAH [Dijkman et al. 1997].
Rozdílná biologická aktivita sloučenin, isomerů a derivátů je dána kombinací fyzikálněchemických a fotochemických vlastností [Newsted et al. 1987; Bleeker et al. 1997, 1998] a strukturních a molekulárních parametrů [Van Vlaardingen et al. 1996]. Výsledná toxicita je ovlivněna např. počtem aromatických kruhů [Bleeker et al. 1997, 1998], velikostí a tvarem molekuly, hodnotou log Kow, počtem a pozicí dusíkových heteroatomů v molekule a do značné míry také zvoleným cílovým receptorem (životním stadiem a typem testovaného organismu) a délkou expozice [Van Vlaardingen et al. 1996].
Tabulka 7. Srovnání toxicity a genotoxicity PAH a analogických PANH [Škarek et al. online] Srovnání toxických potenciálů (bakterie): 1,10-fenanthrolin > akridin > benzo[h]chinolin > fenanthridin > fenanthren > 2-methylindol > karbazol > 4,7-fenanthrolin > fluoren > fenazin > chinolin > 1-methylindol > 6-methylchinolin > 1,7-fenanthrolin > indol > benzothiazol > chinazolin > naftalen > anthracen > ftalazin, isochinolin Výsledky testu genotoxicity (SOS chromotest): Analyt
Genotoxická aktivita bez metabolické s metabolickou aktivace aktivací
Analyt
Genotoxická aktivita bez metabolické s metabolickou aktivace aktivací
naftalen
benzo[h]chinolin slabá
anthracen
fenanthridin
fenanthren
silná
1,10-fenanthrolin
fluoren
slabá
1,7-fenanthrolin
silná
4,7-fenanthrolin
silná
chinolin
slabá
6-methylchinolin isochinolin
silná
chinozalin
slabá
ftalazin
slabá
akridin
silná
fenazin
silná
silná
karbazol
slabá
indol
silná
1-methylindol
silná
2-methylindol
slabá
silná
benzothiazol
34
slabá
silná slabá slabá
Tabulka 8. Výsledky experimentálních testů toxicity [Bleeker et al. 1999]
chinolin benzo[f]chinolin fenanthridin benzo[h]chinolin akridin benz[a]akridin benz[c]akridin
Toxicita [µM] Chironomus riparius LC50 (96 hod)
Genotoxicita [µM] Mutatox LOEC
log Kow
37,91 4,6 3,42 3,38 0,4 0,07 0,03
88,03 > 0,12 1,23 2,54 1,88 0,01 > 0,19
2,03 3,43 3,48 3,43 3,40 4,49 4,49
35
6.8.3 Biologická degradace PAH a hetero-PAH Současná
přítomnost
PAH
a
heterocyklických
PAH
(sirných
-
PASH,
dusíkatých - PANH, kyslíkatých - PAOH) ovlivňuje rychlost a stupeň biologické degradace v půdách [Meyer & Steinhart 2000]. Degradace 2 – 5 jaderných PAH je inhibována přítomností hetero-PAH a opačně – PAH mohou mít značný inhibiční efekt na biodegradaci některých hetero-PAH. Stále však platí, že čím vyšší je počet kondenzovaných jader v molekule, tím jsou PAH obtížněji degradovatelné [Johnsen & Karlson 2007]. Mikrobiální degradace heterocyklů je ovlivňována počtem aromatických kruhů a druhem heteroatomu.
Sirné heterocykly podléhají biologickému rozkladu v menší míře ve srovnání s analogickými PANH a PAOH. Akridin vykazuje extrémní perzistenci a silnou sorpci k půdní matrici (zvýšení jeho výtěžnosti lze dosáhnout zmýdelněním matrice) (Obrázek 10). Tento jev můžeme vysvětlit bazicitou akridinu (pKa = 5,5). Lze předpokládat jeho sorpci k půdní matrici na základě kationtově-výměnných reakcí, které vedou ke snížení biodostupnosti a zamezují jeho degradaci. Přítomnost hetero-PAH se na průběhu a rychlosti degradace výrazněji projevuje u PAH se 3 a 4 kondenzovanými kruhy [Meyer & Steinhart 2000; Johnsen & Karlson 2007].
Pokud jsou látky v prostředí degradovány v pořadí podle klesající polarity (s výjimkou bazického chinolinu a akridinu), pak lze předpokládat, že pokles degradační kapacity PAH je dán přítomností hetero-PAH.
36
Dispozice PAH a hetero-PAH k biologické degradaci v půdách; v závorce je uveden počet kondenzovaných jader [Meyer & Steinhart 2000] PAH: naftalen (2) > acenaften (3) ~ fluoren (3) ~ fenanthren (3) > anthracen (3) > fluoranthen (4) ~ pyren (4) > benz[a]anthracen (4) > benzo[a]pyren (5) Hetero-PANH: indol (2) ~ benzofuran (2) ~ chinolin (2) > benzothiofen (2) > dibenzofuran (3) ~ karbazol (3) > dibenzothiofen (3) ~ 1-kyanonaftalen (2) > 9-kyanoanthracen (3) > akridin (3) PAH + hetero-PANH: indol (2) ~ benzofuran (2) > naftalen (2) ~ benzothiofen (2) > chinolin (2) > acenaften (3) > dibenzofuran (3) ~ karbazol (3) > fluoren (3) ~ kyanonaftalen (2) > fenanthren (3) ~ anthracen (3) ~
dibenzothiofen (3) ~
fluoranthen (4) ~ pyren (4) > 9-
kyanoanthracen (3) ~ akridin (3) ~ benz[a]anthracen (4) > benzo[a]pyren (5) Obrázek 10. Degradace vybraných PANH v půdním systému “NSO” obsahujícím pouze hetero-PAH a v půdním systému “PAH + NSO” se směsí PAH a hetero-PAH (rozdíly mezi plnými body jsou signifikantní; t-test, α = 0.05) [Meyer & Steinhart 2000]
37
6.9 Analytická separace a detekce PAH i PANH vykazují silnou absorpci v ultrafialové oblasti (λ = 220-300 nm) a mají také charakteristická fluorescenční spektra (pouze acenaftylen nefluoreskuje). Mezi nejvhodnější metody separace proto patří kapalinová chromatografie s fluorescenční [Bleeker et al. 1999, 2000; Miège et al. 2003] nebo UV-detekcí [Bleeker et al. 2000; Miège et al. 2003; Kočí et al. 2007]. Lze však využít také plynovou chromatografii s hmotnostním detektorem (MSD) [Nito & Ishizaki 1997; Osborne et al. 1997; Chen & Preston 2004], plamenovým-ionizačním detektorem (FID) [Hawthorne & Grabanski 2000], selektivním NP-detektorem (NPD) [Osborne et al. 1997; Tollbäck et al. 2000] nebo detektorem elektronového záchytu (EDC) [Kamata et al. 1992].
Separace PANH v kapalinové chromatografii je založena na využití různé polarity, rozdílných acidobazických vlastností skupiny akridinů a karbazolů, schopnosti vytvářet vazbu s vodíkem a uplatnění stérických efektů [Tollbäck et al. 2000; Kollist-Siigur et al. 2001]. Retenční chování je řízeno především acidobazickými vlastnostmi PANH, proto je účelné provádět separaci v systémech s obrácenými fázemi (RP-HPLC) [McGuffin et al. 2005]. Vhodnou úpravou pH a iontové síly elučního rozpouštědla a obsahem organického modifikátoru lze docílit účinné separace jednotlivých PANH i současného stanovení PANH vedle PAH bez nutnosti jejich předchozího oddělení [Kočí 2001; Kočí et al. 2007; Švábenský et al. 2007].
38
Tabulka 9: Přehled analytického stanovení PANH v environmentálních matricích Matrice
Přečištění
podzemní voda biota
sediment
kal
Frakcionace extraktu
SPE NaOH
SPE
Soxhlet (ethylacetát)
biota
půda
Extrakční technika
HCl, Na2SO4
Soxhlet (DCM)
adsorpční chromatografie adsorpční chromatografie (SiO2.H2O, Na2SO4; hexan/ethylacetát) 1. SPE (DCM/MetOH) 2. Kationtověvýměnná SPE (MetOH)
Metoda analytického stanovení HPLCUV/FLD/MS 1. RP-HPLC 2. GC-MS RP-HPLCUV/FLD GC-MS
Reference Mundt et al. 2005 Strozyk et al. 2002 Van Vlaardingen et al. 1996; Bleeker et al. 2000, 2001
Meyer & Steinhart 2000
Soxhlet (DCM)
LLE
GC-MS
Osborne et al. 1997
Soxhlet
1. semipreparativní NP-HPLC 2. dvoustupňová adsorpční chromatografie
RP-HPLC-UV
Strozyk et al. 2000
39
7 MATERIÁL A METODY
7.1 Použité chemikálie Acetonitril (Ultra gradient HPLC Grade, J. T. Baker, Holandsko) Dihydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4 . H2O, čistota 99 %, Lachema, Česká republika) Dichlormethan (čistota 99,8 %, Lab-scan, Irsko) Dusík (technický, čistota 4.7, Siad, Česká republika) Hydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4 . 12H2O, čistota 98 %, Lachema, Česká republika) Methanol (čistota 99,9 %, Lab-scan, Irsko) Oxid uhličitý (čistota 4.0, Siad, Česká republika) pH standardy (pH = 4,01; pH = 7,00 (Hamilton, Švýcarsko) standard akridin, 97% (Fluka, Švýcarsko) standard anthracen, 97% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard benz[a]anthracen, (Supelco, USA) standard benzo[h]chinolin, 97% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard fenanthren, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard fenanthridin 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard fenazin, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard fluoranthen, (Supelco, USA) standard fluoren, (Supelco, USA) standard ftalazin, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard chinazolin, 99% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard chinolin, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard karbazol, 95% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard naftalen, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard 1,7-fenanthrolin, 99% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard 4,7-fenanthrolin, 98% (SIGMA-ALDRICH, Německo) standard 6-methylchinolin (MERCK-Schuchardt, Německo) voda destilovaná a redestilovaná (Osmonics 2, Česká republika; Milipore, Molsheim, Francie)
40
7.2 Použité laboratorní přístroje a zařízení Automatické pipety (Nichiryo, Japonsko) Filtrační papír (Whatman qualitative filter paper, Fisher Scientific, Czech Republic) HPLC- modulární kapalinový chromatograf HP Agilent 1100 (Hewlett Packard, Německo) - analytická kolona: ACE-5 C18, 250 x 4,6 mm, velikost částic 5µm (Agilent, USA) - automatický dávkovač HP 1100, objem nástřiku: 1 µl - kvartérní čerpadlo HP 110 - mikrovakuový odplynovač - mobilní fáze: A) fosfátový pufr (pH = 6); B) 100% acetonitril - průtok mobilní fáze: 0,5 ml/min - předkolona: ACE-5 C18, 7,5 x 4,6 mm, velikost částic 5µm (Agilent, USA) - teplota kolony: 15 °C - vlnová délka detekce: 220 nm, 231 nm, 249 nm, 262 nm, 274 nm - vlnový detektor série HP 1100 MW Laboratorní třepačka, Vortex mixer (BiBBy-STERILIN, Anglie) Laboratorní váhy AE240 (Mettler-Toledo, Švýcarsko) Laboratorní váhy NAVIGATOR (Mettler-Toledo, Švýcarsko) pH-metr- CyberScan pH 5500/5000 (EUTECH-INSTRUMENTS, Singapur) - skleněná elektroda-SINGLE PORE (HAMILTON, USA) Superkritický fluidní extraktor (SEKO-K, Česká republika) Restriktor – křemenná kapilára (délka 13 cm, vnitřní průměr 30 µm, Supelco, USA) Ultrazvuková lázeň, Sonex super RK-106 (BANDELIN, Německo)
41
7.2.1 Superkritický fluidní extraktor Superkritická fluidní extrakce byla prováděna na přístroji SE-1 (SEKO-K, s. r. o., Brno, Česká republika). Technické parametry extraktoru jsou uvedeny v Tabulce 10. Tabulka 10. Tabulka limitních hodnot extrakčních parametrů * Parametr Tlak (pístová mikropumpa) Čas extrakčního kroku Celkový čas extrakce Počet extrakčních kroků Teplota extrakční cely Teplota restriktoru Teplota záchytu
Označení Press Time TTime 1 - 12 Te Tc Tt
Pracovní rozsah 7 - 40.9 MPa 5 - 999 min 5 - 999 min 30 - 150 °C no, 80, 100, 120, 150, 200, 250 °C -40 - +15 °C 30 - 100 °C 0,7; 2,7; 7 ml
Objem extrakční cely *
Výrobce dále uvádí možnost přímého propojení s plynovým chromatografem a volitelného způsobu záchytu analytů.
Obrázek 11. Superkritický fluidní extraktor SE-1 (SEKO-K, s. r. o., Brno, Česká republika)
42
7.3 Půdní matrice Studium vlivu extrakčních podmínek na analytické chování vybraných organických polutantů (PAH a PANH) bylo provedeno s využitím artificiální půdní matrice. Artificiální půda je tvořena třemi základními složkami: kaolinem, křemenným pískem a rašelinou. Půdní organická hmota rozhodujícím způsobem ovlivňuje fyzikální, chemické a zejména biologické vlastnosti půdy. Organický podíl půdy je podstatně menší než minerální, jeho obsah u zemědělských půd zřídka převyšuje 5 % (nejčastěji 2 – 3 %) [Pokorný et al. 2001]. Vhodným poměrem základních komponent lze snadno připravit půdní matrice lišicí se např. obsahem organického uhlíku (změnou procentuálního zastoupení rašeliny) či jílovité složky. Připravená půda obsahovala 70 % písku, 20 % kaolinu a 10 % rašeliny, matrice o stejném složení se používají k ekotoxikologickým studiím [OECD 1984].
Charakterizace složek půdy: Kaolin 18672, Sigma Aldrich - ztráta při zahřívání (600 °C) max. 1,4 %; rozpustnost v kyselině max.. 1 %; obsah - Fe max.. 0,1 %; Pb max.. 0,001 % Písek křemenný - 0,1-0,5 mm. Rašelina – 47,2 % obsah organického uhlíku (Laboratoř Morava, s. r. o.; metoda SOP 47).
Popis a identifikace artificiální půdy byl proveden v laboratoři Morava, s.r.o., divize Ekola Bruzovice. Výsledky rozboru jsou shrnuty v Tabulce 11.
Tabulka 11. Popis vzorků a jejich identifikace Cox %
Ntot %
5,79 0,09 SOP 47
Výluh dle Mehlicha II suma síra mg/kg mmolchekv/kg % Mg Ca K H+ KVK
pyrofosforečnanem sodným Q 4/6 % C CHL C HK C FK
pH
138
5,76
4,26 3,50 SOP 44
650 38 SOP 45
73
118
0,18
0,45 N**
0,33
Zrnitostní frakce dle Kopeckého v %
0,13
H 2O
KCl
Klasifikace:
Fyzikální jíl (%) ≤ 2 mm
I. jíl á10 mm
II. prach 10-50 mm
III. práškový písek 50-100 m
IV. písek 100-2000mm
Kopecký/Novák
4,2
12,0
8,0
4,0
76,0
písek jílnatohlinitý/ hlinitopísčitá
43
7.3.1 Příprava modelových vzorků Ke studiu vlivu experimentálních podmínek na výtěžnost superkritické fluidní extrakce byla použita artificiální půda. Půda byla před extrakcí laboratorně kontaminována. Ke 2 gramům půdy v tmavé skleněné vialce bylo přidáno 20 µl zásobního roztoku PA(N)H (c = 300 µg/ml ACN), což odpovídá úrovni kontaminace 3 µg/g půdy [Tučková 2007]. Obohacená půda byla důkladně protřepána za účelem dosažení homogenní kontaminace a po odpaření ACN neprodyšně uzavřena v tmavých skleněných vialkách. Vzorky byly uloženy na tmavé místo za účelem eliminace fotolytické degradace v místnosti termostatované na 20 °C.
44
7.4 Vysoce účinná kapalinová chromatografie – HPLC Kvalitativní a kvantitativní analýza extraktů byla provedena pomocí metody vysoce účinné kapalinové chromatografie v reverzním uspořádání (RP-HPLC) ve spojení
s UV-
fotometrickou detekcí. Stanovení koncentrací sledovaných analytů bylo uskutečněna přímo v surovém extraktu bez přečištění, k zachycení případných nečistot sloužila předkolonka plněná stacionární fází C18. PANH a PAH byly separovány bez předchozího oddělení na koloně ACE-5 C18 (250 x 4,6 mm o velikosti částic 5 µm) s využitím gradientové eluce směsí fosfátového pufru (pH = 6, c = 10 mM) a organického modifikátoru (acetonitrilu). Separace probíhala při konstantním průtoku 0,5 ml/min. Kolona byla termostatována na 15 °C.
Průběh gradientové eluce a změna složení mobilní fáze jsou znázorněny v Tabulce 12. Požadované účinnosti separace PANH bylo docíleno zejména použitím lineárního nárustu obsahu ACN v mobilní fázi mezi 5. a 20. minutou analýzy z 35 % na 85 % (v/v). K zajištění reprodukovatelnosti retenčních časů a dosažení optimálního rozlišení píků (1,7-fenanthrolinu a chinolinu; akridinu a karbazolu) byl místo redestilované vody používán fosfátový pufr (c = 10 mM) o hodnotě pH = 6 [Švábenský et al. 2007]. Pro spektrofotometrickou detekci bylo vybráno pět různých vlnových délek (220, 231, 249, 262, 274 nm), které nejlépe pokrývají absorpční maxima sledovaného souboru analytů. UV-detekce byla provedena při vlnových délkách: 220 nm pro ftalazin, chinazolin, chinolin, 6-methylchinolin; 231 nm pro karbazol, naftalen, benzo(h)chinolin, fluoranthen; 249 nm pro fenazin, akridin, fenanthridin, fenanthren, anthracen; 262 nm pro fluoren; 274 nm pro 4,7-fenanthrolin, 1,7-fenanthrolin, benz(a)anthracen.
PA(N)H byly z půdních vzorků extrahovanány superkritickým CO2 modifikovaným polárním rozpouštědlem. Extrahované analyty byly zachytávány v dichlormethanu. Získané extrakty byly pod proudem dusíku zahuštěny na 1,5 ml. K analýze byl použit 1 µl vzorku. V chromatogramu je proto vedle 17 píků PA(N)H patrný také pík dichlormethanu (tr = 17,9 min). Samotná doba analýzy PA(N)H trvala 50 minut. Půdní extrakty však obsahují řadu balastních látek, které jsou na koloně silně zadržovány, proto je nutné ke každé analýze přiřadit režim promývaní kolony 95% ACN za účelem eluce těchto znečišťujících složek. Výsledná délka jedné analýzy proto byla 90 minut.
45
Tabulka 12. Průběh gradientové eluce. Doba
Obsah ACN (%)
Průtok (ml/min)
5 min
35
0,5
20 min
85
0,5
50 min
85
0,5
70 min
90
0,5
90 min
95
0,5
91 min
35
0,5
Obrázek 12. HPLC separace PANH a PAH
4 0 .9 9 3 - b e n z o [a ]a n th ra c e n
3 4 .6 6 1 - flu o ra n th e n
3 1 .3 7 0 - fe n a n th re n
3 2 .4 4 7 - a th ra c e n
2 6 .7 8 9 - n a fta le n
2 2 .4 8 5 - fe n a n th rid in
1 9 .3 6 8 - 6 -m e th y lc h in o lin
2 4 .6 3 1 - k a rb a z o l 2 5 .4 1 8 - b e n z o [h ]c h in o lin
3 0 .0 3 7 - flu o re n
10
2 1 .6 7 7 - a k rid in
15
1 9 .9 2 4 - fe n a z in
7 .3 0 3 - fta la z in
20
8 .7 9 5 - c h in a z o lin
25
1 0 .2 7 2 - 4 ,7 -fe n a n th ro lin
Norm.
1 7 .8 5 6
1 5 .7 6 3 - c h in o lin 1 6 .3 3 6 - 1 ,7 -fe n a n th ro lin
DAD1 B, Sig=231,20 Ref=360,20 (F:\LUCIE 2301 2008\ST.D)
5
0 5
10
15
20
25
30
35
40
min
Stanovení koncentrace analytu a limity detekce HPLC metody
Koncentrace analytů ve vzorcích byly vyhodnoceny metodou kalibrační křivky. Bylo připraveno 9 kalibračních roztoků o koncentraci 1-20 µg PA(N)H/ml. Parametry kalibrační funkce byly stanoveny regresní analýzou. Hodnoty spolehlivosti (R2) se pro jednotlivé lineární závislosti pohybovaly v rozmezí 0.9983-0.9991. Limity detekce (LOD) pro jednotlivé PANH a PAH dosahovaly 2,06 - 10,14 ng/injektovaný objem.
46
8 VÝSLEDKY A DISKUSE 8.1 Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) Podmínky pro chromatografickou separaci v systému s obrácenými fázemi (stacionární fáze – C18) byly vybrány na základě výsledků studie retenčního chování PA(N)H, která popisuje vliv obsahu organického modifikátoru (acetonitrilu) v rozsahu 20-50 % (v/v) ve směsi s vodným roztokem 10 mM fosfátového tlumiče o pH 2.5-6.5 (oblast pKa PANH) na selektivitu separace [Švábenský et al. 2007].
Obecně platí, že s rostoucím množstvím organického modifikátoru se retence PA(N)H snižuje. V závislosti na pH mobilní fáze se změna obsahu ACN navíc projevuje změnami selektivity separace a elučního pořadí některých PANH. Hodnota pH mobilní fáze v rozmezí pH 2.5-6.5 pak výrazně ovlivňuje pouze retenci PANH v závislosti na jejich pKa. Změnou pH mobilní fáze tak lze účinně kontrolovat separaci PANH v reálných vzorcích obsahujících také PAH, jejichž retence se vlivem pH fosfátového pufru nemění. Efekt iontové síly není v obvykle používaném rozsahu koncentrací tlumiče (5-20 mM) významný.
Pro separaci vybrané směsi PAH a PANH byla zvolena gradientová eluce: složení mobilní fáze 35 → 85 % ACN, pH fosfátového pufru rovno 6, teplota kolony 15 °C, průtok 0,5 ml/min.
47
8.2 Studium experimentálních podmínek ovlivňujících výtěžnost superkritické fluidní extrakce z půd Dosažení kvantitativní extrakce metodou SFE je podmíněno třemi kroky: kvantitativním přechodem analytu ze vzorku do extrakčního média (termodynamický aspekt), úplným odstraněním analytu z extrakční cely (kinetický aspekt) a jeho účinným záchytem. Optimalizaci dvou posledních kroků lze provést v podmínkách laboratorní studie na obohacených vzorcích. Výtěžnost prvního kroku je však do značné míry ovlivněna heterogenními vlastnostmi půdní matrice a limitována rozpustností analytu v nadkritickém médiu, kinetikou a/nebo schopností extrakčního fluida narušit interakce mezi analytem a matricí. Uvolnění analytu z půdní matrice do nadkritického média je ovlivňováno teplotou, tlakem a polaritou superkritické tekutiny. Kvantitativní převod analytu z extrakční cely do absorpční kapaliny závisí na objemu prošlého extrakčního média (tzn. na rychlosti průtoku extrakční tekutiny a celkové délce extrakce), geometrii extrakční cely, velikosti vzorku a úrovni kontaminace. Absorpce extrahovaného analytu je ovlivněna výběrem záchytného rozpouštědla/sorbentu, jeho teplotou a objemem. Protože efektivita prvních dvou kroků extrakčního procesu nemůže být spolehlivě vyhodnocena, pokud není dosaženo kvantitativní absorpce/adsorpce extrahovaného analytu v záchytném rozpouštědle/sorbentu, byla v rámci optimalizace SFE metody pozornost soustředěna nejprve na výběr vhodných podmínek pro záchyt analytu.
Extrakce byly prováděny v celách o objemu 7 ml opatřenými na obou koncích fritou. K prevenci úniku drobných částic půdní matrice dále sloužil filtrační papír umístěný na obou stranách extrakční cely. Jako restriktor byla použita křemenná kapilára o délce 13 cm s vnitřním průměru 30 µm.
Výsledky jednotlivých experimentů jsou uvedeny jako průměry ze tří opakování společně s hodnotou směrodatné odchylky.
48
8.2.1 Optimalizace záchytu Při off-line módu SFE můžeme volit mezi dvěma základními způsoby záchytu extrahovaných analytů: sorpce na inertní materiál [Ashraf-Khorassani et al. 1992; Miller et al. 1993] nebo absorpce v rozpouštědle [Langenfeld et al. 1992; Porter et al. 1992; Vejrosta et al. 1994]. Kvantitativní retence analytu na pevný sorbent při použití modifikovaného CO2 je však poměrně obtížná, neboť přítomnost modifikátoru v eluentu vede k nežádoucímu vymývání adsorbovaných analytů [Hüsers & Kleinböhmer 1995]. Pro SFE extrakci PAH a PANH modifikovaným CO2 proto byla zvolena běžnější varianta záchytu extrahovaných analytů do kapalného rozpouštědla.
Při výběru absorpční kapaliny je nutné brát v úvahu rozpustnost a stabilitu cílového analytu ve zvoleném rozpouštědle, jeho kompatibilitu s analytickou a detekční metodou a riziko vysrážení koextrahovaných látek. V rámci optimalizace záchytu byla na základě informací z literatury nejprve provedena extrakce půdy čistým CO2 do 15 ml ACN [Kočí 2001]. Získané extrakty však byly zakalené a po zkoncentrování plné sraženin. V dalších experimentech byl ACN nahrazen DCM, který byl nejen schopen rozpustit sraženiny v ACN-extraktu, ale je zároveň doporučován řadou autorů pro SFE extrakci PAH [Lopez-Avila et al. 1994; Langenfeld et al. 1992; Hawthorne et al. 2001].
Při průtoku 1 ml superkritického CO2/min se do prostředí uvolňuje 500 ml plynného CO2/min. Silný proud expandujícího plynu s sebou může strhávat molekuly analytů a způsobovat ztráty především těkavých látek [Lojková et al. 2005a]. Bylo zjištěno, že z uvedené řady zkoumaných parametrů - polarita, teplota, objem a výška sloupce, míchání kapaliny, rychlost toku CO2 - má na účinnost záchytu vedle polarity zásadní vliv teplota a objem absorpčního rozpouštědla [Langenfeld et al. 1992; Porter et al. 1992]. V další fázi byl proto zkoumán vliv teploty záchytu (15 °C, 30 °C, bez regulace) na těkaní analytů ze sběrné vialky. K 15 ml DCM v záchytné vialce bylo přidáno 20 µl standardu (c = 300 µg PA(N)H/ml ACN). Roztokem po dobu 30 minut probublával čistý CO2 při maximálním tlaku 40 MPa. Výsledky experimentu jsou graficky znázorněny na Obrázku 13.
49
Obrázek 13. Vlivu teploty na účinnost záchytu Vliv teploty záchytu na těkání analytu ze sběrné vialky
Výtěžnost (%)
bez regulace
15 °C
30 °C
100
80
ka rb az ol ak ri d in fe na nt hr be id nz in o[ h] ch in ol in fe na 1, 7zi n fe na nt hr ol in na fta le n fl u or en an th ra ce n fe na nt hr en fl u or an be nz th en [a ]a nt hr ac en
fta la zi n
ch 6in ol m in et hy lc hi no lin
60
Získané výsledky ukazují, že těkání analytu bylo omezeno při nižších teplotách (průměrná výtěžnost: R
bez regulace
100,4 %; R
15 °C
93,4 %). Vlivem expanze CO2 se absorpční
tekutina dále ochlazuje a v závislosti na stupni vyhřívání se její teplota může dostat až do záporných hodnot. Při extrakci modifikovaným CO2 nebo u vzorků s vyšší vlhkostí [Hawthorne et al. 1993] je pak nutné záchytný solvent spíše zahřívat (30 °C), aby nedocházelo k blokaci restriktoru, omezování jeho průchodnosti a poklesu extrakční účinnosti. Následující extrakce proto probíhaly při teplotě záchytu 30 °C (R 30 °C 92,9 %). K prevenci ucpávání křemenné kapiláry sloužil také pohyblivý vyhřívací blok. Pro hladký průběh experimentů byla jeho teplota nastavena na 120 °C.
50
8.2.1.1 Stabilita PA(N)H v čistém rozpouštědle (DCM) a v DCM- extraktu
V rámci optimalizačních experimentů byl vyhodnocen také vliv podmínek uchování (teploty, množství světla, času) na stabilitu PA(N)H v čistém DCM a v SFE-extraktu.
Stabilita PA(N)H v čistém rozpouštědle
K 15 ml DCM ve vialce bylo přidáno 20 µl zásobního roztoku (c = 300 µg PA(N)H/ml ACN). Připravená směs byla po dobu 24 hodin uchována za uvedených podmínek: I. tma, lednice (5 °C); II. tma, termostatovaná místnost (20 °C); III. světlo, termostatovaná místnost (20 °C).
Výsledky experimentu jsou graficky znázorněny na Obrázku 14. Stabilita cílových analytů v čistém rozpouštědle se výrazně nemění v závislosti na teplotě uchování (podmínky I. a II.), ale je ovlivněna intenzitou světla (podmínky II. a III.). Nejvyšší procentuální úbytek (II. vs. III.) byl zaznamenán u ftalazinu, akridinu a 1,7-fenanthrolinu (8,2 %; 8 %; 8,4 %). DCM-extrakty z inertní matrice (skleněné kuličky, písek) byly skladovány za podmínek I. s časovou prodlevou mezi extrakcí a analýzou nepřesahující 24 hodin.
Stabilita PA(N)H v extraktu
Extrakt půdní matrice byl získán extrakcí 2 g půdy po přídavku 600 µl modifikátoru (ACN:voda, 1:1) při teplotě 150 °C, tlaku 35 MPa po dobu 60 minut. Ke zkoncentrovanému extraktu bylo před HPLC analýzou dodáno 20 µl zásobního roztoku (c = 300 µg PA(N)H/ml ACN). Vzorek byl analyzován v časových intervalech: 0; 1,75; 6,75; 24, 48 hodin (Obrázek 15). Během nejdelšího sledovaného časového rozmezí (0-48 h) byl zaznamenán úbytek max. 5 %.
51
Obrázek 14. Stabilita PA(N)H v čistém dichlormethanu za různých podmínek Stabilta analytů v DCM (24 hod) za různých teplotních a světelných podmínek tma, 5 °C
tma, 20 °C
světlo, 20 °C
Výtěžnost (%)
120
100
80
hr ol in fta len fl u or en an th ra ce fe n na nt hr en fl u o be ra nz nt he [a ]a n nt h ce ra ce lk o n vý pr ů pr ům měr ěr PA pr NH ům ěr PA H
1,
na
nt
na fe 7-
nz
o[
h]
na
fe
ino ch
nt be
6-
z in
lin
in
in
hr id
ri d
ak
m
et
fe
na
rb a
zo l
zi n ka
la
lin
f ta
ino
hy
lc h
ch
ino
l in
60
Obrázek 15. Stabilita PA(N)H v DCM-extraktu (Podmínky SFE: Te = 150 °C, p = 35 MPa, t = 60 minut, modifikátor (ACN:voda, 1:1): V = 600 µl) Stabilita PA(N)H v extraktu 0h
1,75 h
6,75 h
24 h
48 h
110
100 95 90 85
52
an thr ac en fen an thr en fl u ora nth be en nz [a] an th rac en
fl u ore n
na fta len
1,7 -fe na nt hro lin
fen az in
fen an thr i di be n nz o[h ]c h ino lin
din ak ri
ka rba zo l
fta l az in
6me thy lc
hin o li n
80 ch ino l in
Výtěžnost %
105
8.2.2 Optimalizace délky extrakce Optimální doba extrakce PAH a PANH z půd byla stanovena na základě jednoduchého experimentu. Během 90-ti minutové extrakce 6 g kontaminované půdy (30 MPa a 100 °C; 3 PA(N)H µg/g půdy) byly odebrány tři frakce a jejich obsah zanalyzován. V posledním extraktu (60. – 90. minuta) nebyly nalezeny žádné z cílových analytů. Následující extrakce PAH a PANH z půdy proto probíhaly po dobu 60 minut. Analogickým způsobem byl odvozen také čas potřebný pro kvantitativní extrakci ze skleněných kuliček. Anylyty byly obsaženy pouze v první frakci (0.-30.minut).
Delší doba extrakce (60 minut a více) je nutná zejména při použití modifikované extrakční směsi. Přídavek solventu zvyšuje rozpustnost polutantu v superkritické fázi, ale negativně ovlivňuje rychlost extrakce. Příčinou je zřejmě snížení difusního koeficientu analytu za přítomnosti modifikátoru, kdy jsou půdní póry vyplněny kapalinou namísto superkritické tekutiny [Montero-Vásquez et al. 2003].
53
8.2.3 Optimalizace modifikace superkritické tekutiny Nízká polarita CO2 neumožňuje účinnou extrakci PANH z půd ani při aplikaci vysoké teploty (150 °C) a tlaku (40 MPa) (R < 10 %) [Ostrá 2000]. Předpokladem pro výběr vhodného rozpouštědla pro modifikaci CO2 byla publikovaná data o účinnosti extrakce PANH technikou SFE a ASE [Ostrá 2000; Kočí 2001] Byly testovány dvě směsi rozpouštědel: ACN/voda a ACN/MetOH. Optimalizační experimenty probíhaly na 4 g skleněných kuliček při 150 °C, 40 MPa, po dobu 30 minut směsnými modifikátory s různým obsahem ACN (10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 95 %) o objemu 200, 400 nebo 600 µl.
Za uvedených podmínek bylo při aplikaci objemů 200, 400 i 600 µl směsi modifikátorů (ACN:voda, 1:1) dosaženo podobné návratnosti analytů (R200 R600
µl
µl
= 88 %; R400
µl
= 88,6 %;
= 89,4 %). Blízké hodnoty průměrné výtěžnosti jednotlivých extrakcí signalizují
skutečnost, že se skleněné kuličky chovají jako neaktivní matrice, analyty se na ně nesorbují a jejich rozpustnost za zvolených podmínek je limitujícím parametrem extrakce [Hawthorne et al. 1993]. Menším množství ACN a vody (< 200 µl) by pravděpodobně nebylo docíleno vhodné polarity a eluční síly extrakční směsi [Ostrá 2000], naopak vyšší obsah (> 600 µl) modifikátoru v extrakční cele by mohl negativně ovlivňovat dosažení superkritického stavu extrakčního média [Young & Weber 1994].
54
Obrázek 16. Vliv objemu modifikátoru na výtěžnost extrakce (Podmínky SFE: Te = 150 °C, p = 40 MPa, t = 30 minut, modifikátor: ACN:voda = 1:1) Vliv objemu modifikátoru na výtěžnost SFE 200 µl
400 µl
600 µl
Výtěžnost (%)
110 105 100 95 90 85 80 75 70
ch 6m in ol et in hy lc hi no lin fta la zi n ka rb az ol ak ri d fe in na nt be hr nz id o[ in h] ch in ol in fe 1, n 7az fe in na nt hr ol i na n fta le n fl u or an e n th ra ce fe n na nt hr en fl u be or an nz th [a en ]a nt h ce r ac lk ov en ý pr ů pr ům mě r ěr PA pr ům NH ěr PA H
65 60
Skleněné kuličky byly využity také pro optimalizaci složení extrakční směsi. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 13.
Tabulka 13. Vliv složení směsi modifikátorů na výtěžnost extrakce (Podmínky SFE: Te = 150 °C, p = 40 MPa, t = 30 min, objem modifikátoru: 600 µl) Výtěžnost (%) celkový průměr průměr PANH průměr PAH Výtěžnost (%) celkový průměr průměr PANH průměr PAH
5 91,40 90,49 92,75 5 91,35 90,88 92,05
Obsah vody v acetonitrilu (%) 25 50 75 90,82 90,60 90,84 91,62 91,03 93,46 89,62 89,97 86,92 Obsah methanolu v acetonitrilu (%) 25 50 75 91,05 90,68 89,99 90,92 90,37 89,50 91,25 91,15 90,74
90 75,16 74,26 76,51 90 90,85 91,27 90,22
Nejnižší extrakční výtěžnost (R = 75 %) byla pozorována pro směs 90 % vody a 10 % acetonitrilu. Ve všech ostatních případech návratnost překračovala 90 %.
Pro půdní experimenty byla preferována kombinace ACN s vodou před methanolem. Vlhkost matrice ovlivňuje polaritu a difuzivitu superkritické tekutiny; celkovou výtěžnost 55
a reprodukovatelnost SFE [Spack et al. 1998]. Přídavkem definovaného objemu vody tak můžeme kontrolovat nejen polaritu extrakčního média, ale také variabilitu obsahu vody ve vzorku před extrakcí. Otázkou také zůstává, do jaké míry a jakým způsobem je sorpce a desorpce PANH, které vykazují acidobazické vlastnosti, závislá na hodnotě pH půdy [Tučková 2007] a zda by změnou pH extrakční směsi (resp. její vodné fáze) bylo možné dosáhnout nárustu extrakční výtěžnosti PANH. Směs acetonitrilu, povrchově aktivní látky Triton X-100 a vody okyselené 0,1 M HCl byly použita pro modifikaci oxidu uhličitého při extrakci pesticidů (atrazin, diuron, methyl-bensulfuron) z půd [Zhou et al. 1997]. Další kroky v rámci optimalizace SFE probíhaly se 2 g půdy po přídavku ACN a vody (1:1) o celkovém objemu 600 µl.
56
8.2.4 Optimalizace teploty a tlaku Extrakční výtěžnost je závislá na použitém tlaku a teplotě [Hawthorne et al. 2001]. Vyšší teplota pozitivně ovlivňuje kinetiku rozdělovacího procesu a eliminuje interakce mezi analytem a matricí [Hawthorne et al. 1993; Jaffé et al. 2000]. Vliv teploty na účinnost extrakce byl popsán v řadě studií. Koncentrace PCB získané při 100 °C byly shodně vyšší (v průměru o 8 %) než při 80 °C [Sporring et al. 2005]. Při vyšších teplotách (100 °C a více) je snadněji dosaženo kvantitativní extrakce zejména pro vysokomolekulární analyty. Při 40 °C mohou být ze
sedimentů
čistým
CO2
účinně
extrahovány
PCB
s nízkým
stupněm
chlorace
(90 % trichlorobifenylů vs. Soxhlet), dosažení stejné výtěžnosti pro výšechlorované PCB je podmíněno teplotou 100 °C [Lee & Peart 1994]. Björklund et al.. extrahovali řadu půdních vzorků a sedimentů při 40, 100 a 150 °C a zjistili, že existuje malá, silně vázaná frakce analytů (5–10 %), která byla uvolněna až při 150 °C [Björklund et al. 1999].
Experimentální ověření výtěžnosti PAH a PANH za různých teplot bylo provedeno při 50, 75, 100, 125 a 150 °C; tlaku 30 MPa po přídavku 600 µl modifikátoru ke 2 g artificiální půdy. Relativní výtěžnost na Obrázku 17 vyjadřuje podíl analytu extrahovaného při 50-125 °C ku množství získanému při maximální provozní teplotě (150 °C.). Výtěžnost PAH (naftalen, fluoren, anthracen, fenanthren, fluoranthen) není výrazně ovlivněna teplotou, lze je snadno extrahovat i při nízkých teplotách (relativní RPAH > 70 % při 50 °C), zatímco vysokomolekulární benz[a]anthracen je účinněji extrahován až při 100 °C. Podobně také výtěžnost PANH výrazněji vzrostla při teplotě nad 100 °C (Obrázek 18). Přídavkem modifikátoru se kritická teplota směsi zvyšuje [Hawthorne et al. 1993], a proto je z hlediska kvantitativní extrakce vhodné, aby experimenty probíhaly za vysokých teplot.
57
Obrázek 17. Závislost výtěžnosti SFE extrakce na teplotě (Podmínky SFE: p = 30 MPa, t = 60 minut, objem modifikátoru (ACN:voda; 1:1): 600 µl)* Vliv teploty na výtěžnost extrakce
Relativní výtěžnost (%)
50 °C
75 °C
100 °C
125 °C
150 °C
100 80 60 40 20
*
an th ra ce n fe na nt hr en fl u or an be nz th en [a ]a nt hr ac en
fl u or en
6m et hy
ch in ol
in lc hi no lin fta la zi n ka rb az ol ak ri d in fe na nt hr be id nz in o[ h] ch in ol in fe na 1, zi 7n fe na nt hr ol in na fta le n
0
Procentuální hodnoty extrakční výtěžnosti byly získány srovnáním koncentrace analytu při určité teplotě ke koncentraci analytu při 150 °C.
Obrázek 18. Srovnání výtěžnosti vybraných PANH a analogických PAH při teplotách 50–150 °C (Podmínky SFE: p = 30 MPa, t = 60 minut, objem modifikátoru (ACN:voda; 1:1): 600 µl) Srovnání výtěžnosti karbazolu a fluorenu karbazol fluoren
Srovnání výtěžnosti fenazinu a anthracenu fenazin anthracen Výtěžnost (%)
100
80 60 40 20 0
80 60 40 20 0
50 °C
75 °C
100 °C 125 °C 150 °C Teplota (°C)
Výtěžnost (%)
Výtěžnost (%)
100
50 °C
75 °C
Srovnání výtěžnosti benzo[h]chinolinu a fenanthrenu benzo[h]chinolin fenanthren 100 80 60 40 20 0 50 °C
75 °C
100 °C 125 °C 150 °C Teplota (°C)
58
100 °C 125 °C 150 °C Teplota (°C)
Stoupající extrakční účinnost byla pozorována také s rostoucím tlakem. Zvýšením tlaku je podpořena difuse superkritického média do pórů matrice a zvyšuje se rozpustnost analytu v superkritickém CO2 [Montero-Vázquez et al. 2003]. Efekt tlaku na výtěžnost extrakce byl sledován při 30, 35, 40 MPa a 125 °C. Optimalizace při nižších tlacích nebyla prováděna, neboť vlivem teploty > 100 °C klesá hustota CO2 natolik, že nedochází k účinné solvataci vysokomolekulárních analytů [Hawthorne et al. 2001]. Změna tlaku z 30 na 40 MPa nevedla k výrazné změně extrakční účinnosti PAH, ale měla pozitivní vliv na výtěžnost akridinu a 1,7fenanthrolinu.
Obrázek 19. Vliv tlaku na výtěžnost extrakce (Podmínky SFE: Te = 125 °C, t = 60 minut, objem modifikátoru (ACN:voda; 1:1) = 600 µl)* Vliv tlaku na výtěžnost extrakce
*
35 MPa
40 MPa
an th ra ce n fe na nt hr en fl u or an be nz th en [a ]a nt hr ac en
fl u or en
ka rb az ol ak ri d in fe na nt hr be id nz in o[ h] ch in ol in fe na 1, 7zi n fe na nt hr ol in na fta le n
fta la zi n
ch 6in ol m in et hy lc hi no lin
Relativní výtěžnost (%)
30 MPa 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Procentuální hodnoty extrakční výtěžnosti byly získány srovnáním koncentrace analytu při určitém tlaku ke koncentraci analytu při 40 MPa.
Poznatky z optimalizačních studií byly využity pro dosažení kvantitativní extrakce zvoleného souboru látek z artificiální půdní matrice. Vybrané podmínky spolu s výtěžností PA(N)H jsou uvedeny v Tabulce 14.
59
Tabulka 14. Výtěžnost SFE extrakce za optimalizovaných podmínek Podmínky SFE Teplota (Te) Délka extrakce (t) Tlak (p) Modifikátor Objem modifikátoru Velikost vzorku Analyt chinolin 6-methylchinolin ftalazin karbazol akridin fenanthridin benzo[h]chinolin fenazin 1,7-fenanthrolin naftalen fluoren anthracen fenanthren fluoranthen benz[a]anthracen průměr průměr PANH průměr PAH
150 °C 60 minut 35 MPa ACN:voda; 1:1 600 µl 2g Průměrná výtěžnost ± směrodatná odchylka 91,30 ± 5,57 90,20 ± 7,01 35,31 ± 15,40 93,59 ± 2,21 46,70 ± 14,11 88,44 ± 9,05 98,82 ± 5,54 95,60 ± 2,31 42,02 ± 11,15 87,02 ± 2,75 95,42 ± 1,45 94,42 ± 6,65 102,24 ± 2,78 99,09 ± 0,24 97,75 ± 4,35 83,86 75,78 95,99
Průměrná výtěžnost PAH, resp. PANH za uvedených podmínek dosahovala 96 %; resp. 76 %, celková průměrná výtěžnost 84 %. Nejnižší účinnost extrakce byla pozorována u ftalazinu (35 %), akridinu (47 %) a 1,7-fenanthrolinu (42 %). Příčinou limitované extrakční výtěžnosti těchto PANH může být nedostatečná eluční síla zvolené extrakční směsi a matricové efekty.
Alternativní módy SFE extrakce modifikovaným CO2 navržené s cílem zlepšit výtěžnost obtížně extrahovatelných látek jsou diskutovány v samostatné kapitole ,,Návrhy pro zvýšení výtěžnosti analytů a odstranění problémů s praktickým provedením SFE”.
K vyhodnocení vlivu matrice na účinnost extrakce bylo připraveno pět typů pevných matric (označení I – V) se stejnou hladinou kontaminace (3 µg/g vzorku) lišících se obsahem a poměrem jednotlivých komponent (písek, jíl, rašelina) podle schématu v Tabulce 15. Extrakce metodou SFE byla provedena za podmínek uvedených v Tabulce 14.
60
Příprava směsných vzorků vycházela ze složení půdní matrice používané v předchozích optimalizačních experimentech (70 % písku, 20 % jílu a 10 % rašeliny). Matrice I byla extrahovaná za účelem ověření inertního charakteru písku vůči sledovaným polutantům a zároveň jako kontrola celého analytického postupu. Extrakce dvousložkových vzorků (II a III), v nichž jednu komponentu tvoří inertní písek, umožňuje oddělit vliv jílu (II) a rašeliny (III) na extrakční výtěžnost matrice V. Vzorky IV - VI jsou tvořeny všemi třemi složkami, liší se obsahem organické hmoty, zatímco množství jílu je konstantní - přinášejí tak informaci o vlivu obsahu organického uhlíku na účinnost extrakce.
Tabulka 15. Složení směsných vzorků určených k extrakci Zastoupení jednotlivých složek ve vzorku (%) Písek Jíl Rašelina (obsah Corg = 47,2 %)
I
II
III
IV
V
VI
100 0 0
80 20 0
90 0 10
75 20 5
70 20 10
65 20 15
Tabulka 16. Výtěžnost metody SFE z různých typů pevných matric* Výtěžnost analytů (%) chinolin 6-methylchinolin ftalazin karbazol akridin fenanthridin benzo[h]chinolin fenazin 1,7-fenanthrolin naftalen fluoren anthracen fenanthren fluoranthen benz[a]anthracen celkový průměr průměr PANH průměr PAH
I 94,94 91,25 98,66 103,94 103,29 105,49 97,54 100,28 96,21 92,90 104,30 96,60 100,50 104,20 101,31 99,43 99,07 99,97
II 91,04 85,30 70,33 84,00 69,14 91,74 95,31 101,92 70,66 93,40 98,12 78,26 102,20 103,80 101,03 89,08 84,38 96,14
III 84,85 87,45 36,33 88,31 40,26 80,39 92,54 89,62 60,4 73,29 89,65 85,29 99,08 97,95 97,56 80,64 74,08 90,47
IV 93,86 89,00 50,73 87,26 56,66 91,03 95,41 90,64 44,69 81,36 93,35 90,37 100,67 102,63 94,59 84,15 77,70 93,83
V 91,30 90,20 35,31 93,59 46,70 88,44 98,82 95,60 42,02 87,02 95,42 94,42 102,24 99,09 97,75 83,86 75,78 95,99
VI 92,41 89,21 37,19 91,80 34,21 85,99 98,60 89,59 42,50 87,07 93,59 91,82 100,39 97,42 90,82 81,51 73,50 93,52
* Hodnoty směrodatných odchylek jsou uvedeny v Příloze – Tabulka 7P.
Celková výtěžnost se pro jednotlivé směsné vzorky pohybovala mezi 81-99 %. Průměrná výtěžnost PAH vždy přesáhla hranici 90 %, u PANH bylo vyšší než 90% průměrné výtěžnosti dosaženo pouze u matrice I (písek). Návratnost ftalazinu, akridinu a 1,7-fenanthrolinu
61
dosahovala u matrice I (písek) 96-100 %, u vzorku II (písek a jíl) 69-71 %, u ostatních matric pouze 34-67 %.
Podobný trend v extrakční výtěžnosti PA(N)H z půd byl pozorován také při aplikaci Soxhlet Warm extrakce (viz. Přílohy - Tabulka 8P). Stejně jako v případě SFE v této studii byla u Soxhlet Warm extrakce [Tučková 2007] zaznamenána celkově nižší extrakční výtěžnost PANH ve srovnání s PAH (RPANH = 87 %; RPAH = 93 %). Technikou Soxhletovy extrakce bylo dosaženo lepších výsledků pro ftalazin a 1,7-fenanthrolin (R = 89 % a 82 %), návratnost akridinu zůstává shodná pro obě metody (RSoxhlet = 44 %; RSFE = 47 %). Ftalazin a 1,7-fenathrolin obsahují ve své molekule dva atomy dusíku, na rozdíl od ostatních azaarenů sledovaných v této studii, které mohou mít vliv na jejich chování při SFE extrakci. Ftalazin vykazuje nejvyšší polaritu ze zájmové skupiny analytů, pro zlepšení jeho výtěžnosti by pravděpodobně byl vhodnější mód kontinuální extrakce modifikovaným CO2 namísto in situ modifikace. Výtěžnost akridinu je zřejmě více ovlivněna charakterem půdní matrice než použitou extrakční technikou, neboť při aplikaci různých extrakčních postupů (Soxhlet Warm, ASE a SFE) na stejný půdní vzorek bylo získáno obdobné množství akridinu – 75 %, 78 % a 72 % [Ostrá 2000; Petrovská 2004].
Také předložená práce prokázala závislost extrakční účinnosti akridinu na složení půdní matrice (Tabulka 16). S rostoucím obsahem organické hmoty v půdě (0; 5; 10 a 15 % rašeliny u vzorků III-VI) bylo pozorováno snížení výtěžnosti SFE akridinu (RIII = 69,1; RIV = 56,7; RV = 46,7 %; RVI = 34,2 %). Stejný efekt měl nárust podílu organické hmoty nebo jílu (ze 2 na 28 %) také na návratnost pesticidů z půdy metodu SFE (pokles výtěžnosti až 28 %) [Zhou et al. 1997] Množství organického uhlíku v půdě však nebude jediným parametrem, který ovlivňuje účinnost extrakce (viz. Přílohy – Tabulka 8P), zvláště vezmeme-li v úvahu acidobazické vlastnosti PANH. Metodou Soxhlet Warm byla extrahována půdní matrice, jejíž pH bylo upraveno na hodnoty 4,5; 5,5 a 6,5. Vyšší extrahovatelnosti akridinu bylo docíleno při vyšším pH půdního prostředí (RpH 4,5 = 45,2 %; RpH 5,5 = 63,4 %; RpH 6,5 = 80 %) [Tučková 2007]. Také Meyer a Steinhart uvádí zlepšení výtěžnosti akridinu po zmýdelnění půdy [Meyer & Steinhart 2000]. Kyselý charakter experimentální matrice (pH = 4,3) tak může být důvodem vysoké afinity akridinu k půdě a slabé výtěžnosti SFE pozorované v této studii (RSFE = 46,7 %).
62
Vzhledem ke komplexnímu složení půdy lze očekávat různé interakční mechanismy a spolupůsobení řady faktorů určujících výsledné fyzikální, chemické a biologické vlastnosti půd. Pro detailní vyhodnocení vlivu půdních vlastností na sorpční a desorpční procesy je proto třeba další podrobné a celistvé série experimentů se širokým spektrem vzorků.
63
8.3 Sledování časových změn koncentrace analytu u obohacených vzorků S rostoucí molekulovou hmotností se rozpustnost v CO2 snižuje: naftalen 160 mg/ml CO2, fenanthren 13 mg/ml CO2, pyren 3 mg/ml CO2 (při 40 MPa a 50 °C) [Bartle et al. 1991]. Podle těchto údajů by tedy bylo možné dosáhnout kvantitativní extrakce 1 g půdního vzorku kontaminovaného 13 000 µg fenanthrenu (ca. 1% w/w) pouhým 1 ml superkritického CO2. Protože reálné environmentální koncentrace těchto polutantů se obvykle pohybují v řádech nižších (ng/g až µg/g) [Lojková et al. 2005a, 2005b; Švábenský et al. 2007], lze předpokládat jejich vysokou extrakční účinnost. Vysoká rozpustnost analytu v extrakčním médiu však není zárukou kvantitativních výsledků extrakce, pro reálné matrice musí být vzaty v úvahu další faktory limitující účinnost extrakce [Burford et al. 1993; Hawthorne et al. 1993; Björklund et al. 1993].
Vzájemné interakce mezi analytem a matricí ovlivňují termodynamiku a kinetiku SFE extrakce, distribuci analytu mezi superkritický CO2 a matrici v rovnováze a rychlost ustanovení rovnováhy [Hawthorne et al. 1993]. Povaha, síla a počet možných interakcí jsou zatím prostudovány jen částečně [Luthy et al. 1997]. Polutanty v půdách mohou být asociovány s anorganickými [Ehlers et al. 2006] a organickými aktivními místy matrice (huminovými a fulvo-kyselinami) [Kollist-Siigur et al. 2001]. Při sorpci/vazbě na kyseliny se dominantně uplatňuje rozdělování a v menší míře další mechanismy - tvorba vodíkových a iontových vazeb, dipól-dipólové interakce nebo stérické efekty. Sorpce je ovlivňována molekulovou hmotností huminových kyselin a analytu. Extrakce cílového analytu však může být inhibována také fyzikálními překážkami, difusí [Nam & Alexander 1998] a uzavřením do mikropórů a separací analytu od extrakčního média půdní pórovou vodou nebo organickým materiálem. Důsledky zmíněných procesů zahrnují snížení mobility, biologické dostupnosti [Chung & Alexander 1998; Tang et al. 2002] a pokles extrahovatelnosti analytu vlivem jeho zabudování do matrice (angl. sequestration). Čím déle se analyt v matrici zdržuje, tím výrazněji se tyto efekty mohou projevit (tzv. stárnutí, angl. aging). Celková výtěžnost je proto ovlivněna vlastnostmi analytu, chemickým složením (např. obsahem organického uhlíku a vody) [Carroll et al. 1994; Chung & Alexander 1998; Tang et al. 2002] a typem matrice (půda, sediment, prachové částice), fyzikálními parametry (velikost pórů
64
a částic) [Krauss & Wilcke 2002] a mechanickou úpravou vzorku před extrakcí (mletí, přesívání). Během laboratorních experimentů byl zkoumán vliv doby, která uplynula od umělé kontaminace vzorku na výtěžnost superkritické fluidní extrakce. Studium stárnutí bylo prováděno za podmínek uvedených v Tabulce 14 v časovém intervalu 0-150 dnů. Časové závislosti změny výtěžnosti extrakce jsou zobrazeny odděleně pro skupinu PANH (Obrázek 20) a PAH (Obrázek 21). Hodnoty relativní výtěžnosti jsou procentuálním vyjádřením koncentrace analytu získané metodou SFE, při níž byl standard dávkován přímo do extrakční cely se vzorkem před začátkem extrakce (t = 0 dnů).
Grafické znázornění výsledků (Obrázek 20) ukazuje, že k výraznějšímu poklesu extrakční výtěžnosti dochází u skupiny PANH zejména v první pětině sledovaného období. Nejvyšší koncentrační úbytek byl pozorován u akridinu, ftalazinu, 1,7-fenanthrolinu a 6-methylchinolinu, jejich relativní výtěžnost v žádném z měření neklesla pod 50 %. Naproti tomu výtěžnost PAH (Obrázek 21) se s časem měnila jen minimálně a zůstávala nad hranicí 80 % během celého 150 dnů trvajícího experimentu. Nejvýraznější úbytek ze skupiny PAH byl zaznamenán u anthracenu. V obdobné studií [Tučková 2007], jejímž cílem bylo vysledovat změny koncentrací PA(N)H v půdě s využitím metody Soxhletovy extrakce, byl po 84 dnech zjištěn 5,3-84,6% pokles původního obsahu. Největší koncentrační úbytek byl zaznamenán v případě ftalazinu a 1,7-fenanthrolinu, za skupiny PAH pak u anthracenu (viz.Přílohy - Obrázky 1P).
Studium stárnutí vzorku a jeho vliv na výtěžnost extrakce má význam zejména u reálně kontaminovaných vzorků, kde lze předpokládat dlouholetou difúzní kontaminaci (PAH z automobilové dopravy a spalování) [Johnsen & Karlson 2007] nebo jednorázové znečištění vysoce perzistentními polutanty z lokálních zdrojů (PCB z transformátorů). Další osud, mobilita a dostupnost biotické a abiotické degradaci jsou závislé hlavně na fyzikálně-chemických vlastnostech polutantu a příjmového prostředí (půda, sediment).
65
Obrázek 20. Vliv délky kontaktu analytu s matricí na výtěžnost PANH metodou SFE Vliv délky kontaktu analytu s matricí na výtěžnost extrakce PANH
Relativní výtěžnost (%)
100 chinolin 90
6-methylchinolin ftalazin
80
karbazol akridin
70
fenanthridin benzo[h]chinolin
60
fenazin 1,7-fenanthrolin
50 40 0
20
40
60
80
100
120
140
160
Délka kontaktu (den)
Obrázek 21. Vliv délky kontaktu analytu s matricí na výtěžnost PAH metodou SFE Vliv délky kontaktu analytu s matricí na výtěžnost extrakce PAH
Relativní výtěžnost (%)
100 90 naftalen 80
anthracen fenanthren
70
fluoren fluoranthen
60
benz[a]anthracen
50 40 0
20
40
60
80
100
Délka kontaktu (den)
66
120
140
160
8.4 Návrhy pro zvýšení výtěžnosti analytů a odstranění problémů s praktickým provedením SFE Jednu z možností, jak zlepšit výtěžnost cílových analytů, představuje dvoukroková extrakce [Lojková et al. 2005b]. V první, statické fázi, je vzorek exponován organickému rozpouštědlu (toluen, ACN) za podmínek blízkých jeho superkritickým hodnotám. Solvent proniká mezi částice matrice a substituuje silně vázané analyty. Po ochlazení na okolní teplotu kondenzují analyty na povrchu částic nebo na stěnách extrakční cely, aniž by docházelo k vytváření pevných vazeb nebo hlubšímu průniku do matrice. Na statickou fázi navazuje běžná extrakce superkritickým CO2 s následným zachycením analytu v absorpční kapalině. Účinnost kombinované procedury je srovnatelná se Soxhletovou extrakcí (RSFE PAH = 105 %). Extrakce PANH je možná pouze v případě použití modifikovaného CO2 [Ostrá 2000]. Jednorázový přídavek organického modifikátoru přímo na povrch půdy před započetím extrakce (in situ modifikace) nezaručuje optimální polaritu extrakčního média během celé doby extrakce, může nekontrolovatelným způsobem ovlivňovat dosažení a udržení superkritických vlastností CO2 a často vede k problémům s ucpáváním restriktoru zvláště v prvních minutách extrakce, kdy společně s CO2 odchází z extrakční cely i část organického modifikátoru [Lopez-Avila et al. 1994]. Doba, po kterou je modifikátor přítomen v extrakční cele, závisí především na rychlosti průtoku extrakčního média a na vzdálenosti vrcholu sloupce půdy k výstupu z extrakční cely. Průtok je ovlivněn aplikovaným tlakem a geometrií restriktoru, výška sloupce pak objemem vzorku půdy a parametry cely. Množství přidaného modifikátoru nelze zvyšovat přímo úměrně s velikostí půdního vzorku určenému k extrakci. S vyšším objemem modifikátoru v extrakční cele narůstá riziko ucpávání restriktoru (zejména při použití vody jako modifikátoru) a snižuje se selektivita extrakce [Hawthorne et al. 2000]. Chromatografické píky slabě zadržovaných analytů pak mohou být překryty koextrahovanými látkami a ztěžovat identifikaci a kvantifikaci pomocí HPLC. Popsané problémy můžeme eliminovat:
úpravou termodynamiky HPLC, tj. posunem retenčních časů tak, aby nekorespondovaly s elučními časy znečišťujících látek;
použitím selektivní metody detekce, např. hmotnostní spektrometrie (MS), u které je možnost interference omezena pouze na kontaminanty se stejnou molekulovou hmotností iontu;
67
aplikací jiné separační metody (GC/ MS, NPD) [Meyer & Steinhart 2000];
implementací čistícího kroku před vlastní analytické stanovení [Bodzek et al. 1997; Carlsson & Östman 1997]
Problémy s vyváženým množstvím matrice a modifikátoru, jeho pozdržením a postupným uvolněním z extrakční cely byly v této studii řešeny přidáním skleněných kuliček k půdě tak, aby byl vyplněn celý objem extrakční cely. Snížila se tak koncentrace modifikátoru v cele a snadněji udržela průchodnost restriktoru.
Další cestou ke zlepšení výtěžnosti polárních látek a eliminace výše uvedených komplikací je nahrazení in situ modifikace kontinuální modifikací CO2 před jeho vstupem do extrakční cely. Podobně jako v chromatografické analýze můžeme do extrakční cely čerpat již předpřipravenou směs CO2 a organického modifikátoru ze společné zásobní láhve nebo v systému se dvěma pumpami provést nejprve stlačení obou komponent a následné smíšení ve zvoleném poměru. Na pomezí in situ a kontinuální modifikace stojí použití dávkovacího ventilu a smyčky o definovaném objemu ve dvou možných experimentálních uspořádáních: a) tlaková láhev – dávkovací ventil – pístová pumpa – extrakční cela, b) tlaková láhev – pístová pumpa – dávkovací ventil – extrakční cela.
Z praktického hlediska je druhá varianta vhodnější, neboť v prvním případě může docházet k postupnému hromadění organického modifikátoru v pumpě, snižování jejího pracovního objemu a nereprodukovatelným extrakčním podmínkám. S rostoucím tlakem se navíc zvyšuje riziko koroze nebo jiného poškození pumpy, zejména při použití vody a agresivních rozpouštědel. Dávkování organického modifikátoru lze provést opakovaně při každém plnění pumpy.
68
9 ZÁVĚR První část předložené práce je věnována nalezení a ověření vhodných podmínek pro kvalitativní a kvantitativní analýzu sledovaného souboru polycyklických aromatických heterocyklů (PANH) a polykondenzovaných uhlovodíků (PAH) metodou vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). Princip dělení směsi PA(N)H je založen na různé polaritě skupin PANH a PAH a rozdílných acidobazických vlastnostech PANH. Účinné separace jednotlivých látek bylo dosaženo v reverzním uspořádání (RP-HPLC) se stacionární fází C18 za použití gradientové eluce směsí 10 mM fosfátového pufru (pH = 6) a acetonitrilu při průtoku 0,5 ml/min a teplotě kolony 15 °C.
Dalším cílem této studie bylo vyhodnotit vliv experimentálních podmínek na výtěžnost superkritické fluidní extrakce PANH a PAH. V rámci optimalizačních experimentů byl testován vliv teploty (50-150 °C), tlaku (30-40 MPa), objemu (200-600 µl) a složení modifikátoru (10-95% obsah acetonitrilu ve směsi s vodou nebo methanolem) a teploty absorpčního rozpouštědla na celkovou účinnost SFE. Bylo zjištěno, že výtěžnost SFE extrakce je silně závislá na druhu pevné matrice (písek, skleněné kuličky, půda) a jejich vlastnostech (obsah organického uhlíku). Kvantitativní extrakce (87-102 %) většiny PA(N)H z artificiální půdy bylo dosaženo při teplotě 150 °C, tlaku 35 MPa po dobu 60 minut po přídavku 600 µl směsi acetonitrilu a vody v poměru 1:1. Nízká návratnost ftalazinu (37 %); akridinu (57 %) a 1,7-fenanthrolinu (42 %) je s největší pravděpodobností způsobena matricovými efekty. Odstíněním negativního vlivu matrice, tj. provedením extrakce PA(N)H ze skleněných kuliček za analogických podmínek, byla ověřena funkčnost záchytu (15 ml dichlormethanu, teplota vyhřívání 30 °C) i dostatečná rozpustnost cílových analytů v superkritickém médiu a v HPLC chromatogramu nebyly identifikovány žádné degradační produkty. Kontrola stability PA(N)H během extrakčního procesu byla doplněna ověřením stability analytů v SFE-extraktu po dobu 48 hodin. Během sledovaného časového intervalu nebyl zaznamenán výrazný koncentrační úbytek PA(N)H (< 5 %).
69
Hledání optimálních extrakčních podmínek je interaktivní proces a některé kroky musí být v jeho průběhu opakovány. Dosažení optimální extrakční výtěžnosti pro všechny kombinace analyt-půda je proto z časového a praktického hlediska velice náročné. Vybraný soubor látek se navíc značně liší svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi v rámci skupin PAH a PANH i jednotlivých kongenerů.
Optimalizovaná SFE metoda byla dále využita ke stanovení koncentračních změn analytů ve vzorcích, které prošly procesem stárnutí (angl. aging). Během laboratorního experimentu byl zkoumán vliv doby (0-150 dnů) , která uplynula od kontaminace vzorku skladovaného ve tmě při 20 °C, na výtěžnost superkritické fluidní extrakce. Pokles extrakční výtěžnosti byl zaznamenán u skupiny PANH zejména v první pětině sledovaného období. Nejvyšší koncentrační úbytek byl pozorován u akridinu, ftalazinu, 1,7-fenanthrolinu a 6-methylchinolinu (< 50 %), u skupiny PAH u anthracenu (20 %). Na základě výsledků optimalizace a studie stárnutí lze předpokládat, že se jedná o látky, které silně interagují s aktivními místy půdní matrice. Vlivem stárnutí pak dochází k jejich pevnějšímu zabudování do matrice (angl. sequestration), které se projeví snížením extrahovaného množství. Pro správné vyhodnocení efektů stárnutí a detailní pochopení mechanismu sorpce a desorpce jsou však nezbytné další komplexy chemických (studium vlivu obsahu organické hmoty, vlhkosti, pH na výtěžnost polutantů), ale také toxikologických experimentů, zahrnujících vyhodnocení toxicity SFE extraktů a biodostupnosti vybraných analytů terestrickým rostlinám a živočichům.
70
10 LITERATURA Alexander, M. (1995): Critical review: How toxic are toxic chemicals in soil? Environmental Science and Technology, 29, 2713-2717 Ashraf-Khorassani, M.; Houck, R. K.; Levy, J. M. (1992): Cryogenically cooled adsorbent trap for off-line supercritical fluid extraction. Journal of Chromatographic Science, 30, 361-366 Bartle, K.D., Clifford, A.A., Jafar, S.A., Shilstone, G.F. (1991): Solubilities of solids and liquids of low volatility in supercritical carbon dioxide. J. Phys. Chem. Ref. Data, 20, 713-756 Björklund, E.; Bøwadt, S.; Mathiasson, L.; Hawthorne, S. (1999): Determining PCB sorption/desorption behaviour on sediments using selective supercritical fluid extraction. 1. Desorption from historically contaminated samples. Environmental Science & Technology, 33, 2193-2203 Bleeker, E. A. J., Admiraal, W., Buckert-de Jong, M. C., Vand der Geest, H. G., Kraak, M. H. S., Van Vlaardingen, P., De Voogt, P., Wind, E. (1996): NPAHs in dutch marine and freshwater sediments and toxic, mutagenic and teratogenic effects on aquatic vertebrates. Report ARISE. University of Amsterdam, Amsterdam, Netherlands. Bleeker, E. A. J., Van der Geest, H. G., Kraak, M. H. S., De Voogt, P., Admiraal, W. (1998): Comparative ecotoxicity of NPAHs to larvae of the midge Chironomus riparius. Aquatic Toxicology, 41, 51-62. Bleeker, E. A. J., Van der Geest, H. G., Klamer, H. J. C., De Voogt, P., Wind, E., Kraak, M. H. S. (1999): Toxic and genotoxic effects of azaarenes: isomers and metabolites. Polycyclic Aromatic Compounds, 13, 191. Bleeker, E. A. J., Noor, L., Kraak, M. H. S., De Voogt, P., Admiraal, W. (2001): Comparative metabolism of phenanthridin by carp (Cyprinus carpio) and midge larvae (Chironomus riparius). Environmental Pollution, 112, 11-17 Bleeker, E. A. J., Wiegman, S., De Voogt, P., Kraak, M., Leslie, H. A., De Haas, E., Admiraal, W. (2002): Toxicity of azaarenes. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 173, 39-83.
71
Blumer, M., Dorsey, T., Sass, J. (1997): Azaarenes in recent marine sediments. Science 195, 283-285. Bodzek, D., Janoszka, B., Dobosz, C., Warzecha, L., Bodzek, M. (1997): Determination of polycyclic aromatic compounds and heavy metals in sludges from biological sewage treatment plants. Journal of Chromatography A, 774, 177-192 Brumley W.C., Brownrigg C. M., Brilis G.M. (1991) Characterization of nitrogen-containing aromatic compounds in soil and sediment by capillary gas chromatography-mass spectrometry after fractionation Journal of Chromatography A, 558,223-233 Brunelli, C.; Zhao, Y.; Brown, M.; Sandra, P. (2008): Development of a supercritical fluid chromatography high-resolution separation method suitable for pharmaceuticals using cyanopropyl silica. Journal of Chromatography A, 1185, 263–272 Burford, M. D.; Hawthorne, S. B.; Miller, D. J. (1993): Extraction rates of spiked versus native PAHs from heterogeneous environmental samples using supercritical fluid extraction and sonication in methylene chloride. Analytical Chemistry, 65, 1497-1505 Camel, V., Tambuté, A., Caude, M. (1993): Analytical-scale supercritical fluid extraction: a promising technique for the determination of pollutants in environmental matrices. Journal of Chromatography, 642, 263-281 Carlsson, H., Östman, C. (1997): Clean-up and analysis of carbazole and acridine type polycyclic aromatic nitrogen heterocyclics in complex sample matrices. Journal of Chromatography A, 790, 73-82 Carroll, K. M., Harkness, M. R., Bracco, A. A., Balcarcel, R. R. (1994): Application of permeant/polymer diffusional model to the desorption of polychlorinated biphenyls from Hudson river sediments. Environmental Science and Technology, 28, 253-258 Cazenave-Gassiot, A.; Boughtflower; R., Caldwell, J.; Coxhead, R.; Laure Hitzel, L.; Lane, S.; Oakley, P.; Holyoak, C.; Pullen, F.; Langley, G. J. (2008): Prediction of retention for sulphonamides in supercritical fluid chromatography. Journal of Chromatography A, 1189, 254– 265
72
Chen, H., Preston, M. R. (1997): Gas/particle partitioning behaviour of azaarenes in an urban atmosphere. Environmental Pollution, 97, 169-174 Chen, H., Preston, M. R. (2004): Measurement of semi-volatile azaarenes in airborne particulate and vapour phases, Analytica Chimica Acta, 501, 71-78 Chung, N., Alexander, M. (1998): Differences in sequestration and bioavailability of organic compounds aged in dissimilar soils. Environmental Science and Technology, 32, 855-860 Chou W.; Yang, K. (2008): Effect of various chelating agents on supercritical carbon dioxide extraction of indium(III) ions from acidic aqueous solution. Journal of Hazardous Materials, 154, 498-505 Combs, M. T.; Ashraf-Khorassani, M.; Taylor, L. T. (1997): Packed column supercritical fluid chromatography-mass spectroscopy: A review. Journal of Chromatography A, 785, 85-100 Cooney, J. D., Gehrs, C. W. (1984): Effects of temperature, feeding and acridine on development and mortality of eggs and naupllii of Diaptomus clavipes. Aquat. Toxicol. 5, 197-209. Cornelissen, G., Elmquist, M., Groth, I., Gustafsson, Ö. (2004): Effects of sorbate planarity on environmental black carbon sorption. Environmental Science and Technology, 38, 3574-3580. Cousins, I. T., Jones, K. C. (1998): Air-soil exchange of semi-volatile organic compounds (SOCs) in the UK. Environmental Pollution, 102, 105-118 Cousins, I. T., Mackay, D., Jones, K. C. (1999): Measuring and modelling the vertical distribution of semivolatile organic compounds in soils. II: Model development. Chemosphere, 39, 2519-2534 Cushman, R. M., McKamey, M. I. (1981): A Chironomus tentens bioassay for testing synthetic fuel products and effluents, with data on acridine and quinoline. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 26, 601-605. Dachs, J., Fernández, I., Bayona, M. (1997): Combined experimental design and information theory for the optimization of supercritical fluid extraction of organic priority pollutants from sediment. Analytica Chimica Acta, 351, 377-385
73
Dachs, J., Eisenreich, S. J. (2000): Adsorption onto aerosol soot carbon dominates gas-particle partitioning of polycyclic aromatic hydrocarbons, Environmental Science and Technology, 34, 3690-3697. Dean, J. R., Xiong, G. (2000): Extraction of organic pollutants from environmental matrices: selection of extraction techniques. Trends in analytical chemistry, 19, 553-563 Deutsch-Wezel, R. P., Brune, H., Grimmer, G. (1983): Experimental study on the carcinogenity of five nitrogen containing polycyclic aromatic compounds directly injected into rat lungs. Cancer Letters, 20, 97-101. Dijkman, N. A., Van Vlaardingen, P. L. A., Admiraal, W. A. (1997): Biological variation in sensitivity to N-heterocyclic PAHs, effect of acridine on seven species of micro-algae. Environmental Pollution, 95, 121-125 Drake, B.; Smith, R. (1990): Measurement of static dielectric constants of supercritical fluid solvents and cosolvents. Journal of Supercritical Fluids, 3, 162 Edwards, C. A.; Beck, S. D.; Lichtenstein, E. P. (1957): Bioassay of aldrin and lindane in soil. Journal of Economic Entomology, 50, 622-626 Ehlers, G. A. C., Loibner, A. P. (2006): Linking organic pollutant (bio)availability with geosorbent properties and biomimetic methodology: A review of geosorbent characterisation and (bio)availability prediction. Environmental Pollution, 141, 494-512 Elsner, M., Zwank, L., Hunkeler, D., Schwarzenbach, R. P. (2005): A new concept linking observable stable isotope fractionation to transformation pathways of organic pollutants. Environmental Science and Technology, 39, 6896-6916. Feldmannová, M., Hilscherová, K., Maršálek, B., Bláha, L. (2006): Effects of N-heterocyclic polyaromatic hydrocarbons on survival, reproduction and biochemical parameters in Daphnia magna. Environmental Toxicology, 21, 425-431 Furlong, E. T., Carpenter, R. (1982): Azaarenes in puget sound sediments. Geochim. Cosmochim, Acta 46, 1385-1396.
74
Gissel-Nielsen, G., Nielsen, T. (1996): Phytotoxicity of acridine, an important representative of a group of tar and creosote contaminants, N-PAC compounds. Polycyclic Aromat. Comp., 8, 243249 IARC, Chemical, Environmental and Experimental Data (1983), IARC/WHO, 32, 123. Klouda, P. (2002): Fyzikální chemie. Nakladatelství Pavel Klouda, druhé, upravené a doplněné vydání, Ostrava Hallgren, P., Westbom, R., Nilsson, T., Sporring, S., Björklund, E. (2006): Measuring bioavailability of polychlorinated biphenyls in soil to earthworms using selective supercritical fluid extraction. Chemosphere, 63, 1532-1538 Hawthorne, S. B., Miller, D. J., Burford, M. D., Langenfeld, J. J., Eckert-Tilotta, S., Louie, P. K. (1993): Factors controlling quantitative supercritical fluid extraction of environmental samples. Journal of Chromatography, 642, 301-317 Hawthorne, S. B., Grabanski, C. B. (2000): Correlating selective supercritical fluid extraction with bioremediation behaviour of PAHs in a field treatment plot. Environmental Science and Technology, 34, 4103-4110 Hawthorne, S. B., Grabanski, C. B., Martin, E., Miller, D. J. (2000): Comparison of Soxhlet extraction, pressurized liquid extraction, supercritical fluid extraction for environmental solids: recovery, selectivity and effects on sample matrix. Journal of Chromatography A, 892, 421-433 Hawthorne, S. B., Poppendick, D. G., Grabanski, C. B., Loehr, R. C. (2001): PAH release during water desorption, supercritical carbon dioxide extraction, and field bioremediation. Environmental Science and Technology, 35, 4577-4583 Helweg, C., Nielsen, T., Hansen, P. E. (1997): Determination of octanol-water partition coefficients of polar polycyclic aromatic compounds (N-PAC) by high performance liquid chromatography, Chemosphere, 34, 1673-1684. Helweg, C. (1997): Methods for determination of environmentally important physical and chemical properties of polar polycyclic organic material (diploma thesis). Roskilde University Institute of Life Sciences and Chemistry
75
Holoubek, I., Korinek, P., Seda, Z., Schneiderova, E., Holoubkova, I., Pacl, A., Triska, J., Cudlin, P., Caslavsky, J. (2000): The use of mosses and pine needles to detect persistent organic pollutants at local and regional scales. Environ. Pollut., 109, 283-292. Holoubek, I. (koordinátor, projekt manager), Adamec, V., Bartoš, M., Černá, M., Čupr, P., Bláha, K., Demnerová, K., Drápal, J., Hajšlová, J., Holoubková, I., Jech, L., Klánová, J., Kocourek, V., Kohoutek, J., Kužílek, V., Machálek, P., Matějů, V., Matoušek, J., Matoušek, M., Mejstřík, V., Novák, J., Ocelka, T., Pekárek, V., Petira, K. Provazník, O., Punčochář, M., Rieder, M., Ruprich, J., Sáňka, M., Tomaniová, M., Vácha, R., Volka, K., Zbíral, J.: Úvodní národní inventura persistentních organických polutantů v České republice. Projekt GF/CEH/01/003 (2003): Enabling activities to facilitate early action on the implementation of the Stockholm convention on persistent organic pollutants (POPs) in the Czech republic. TOCOEN, s.r.o., Brno v zastoupení Konsorcia RECETOX - TOCOEN & Associates, TOCOEN REPORT No. 249 Hüsers, N., Kleiböhmer, W. (1995): Studies on trapping efficiencies of various collection devices for off-line supercritical fluid extraction. Journal of Chromatography A, 697, 107-114 Jaffé, R., Diaz, D., Furton, K. G., Lafargue, E. (2000): High temperature carbon dioxide extractions of geological samples: effects and contributions from sample matrix. Applied Geochemistry, 15, 79-89. Johnsen, A. R., Karlson, U. (2007): Diffuse PAH contamination of surface soils: environmental occurrence, bioavailability, and microbial degradation (Mini-review), Appl. Microbiol. Biotechnol., 76, 533-543. Kamata, K., Motohashi, N., Meyer, R., Yamamoto, Y. (1992): Determination of 7methylbenz[c]acridines by capillary gas chromatography with electron-capture detection. Journal of Chromatography A, 596, 233-239 Kan, A. T., Fu, G., Tompson, M. B. (1994): Adsorption/Desorption hysteresis in organic pollutant and soil/sediment interaction Kraak, M. H. S., Ainscough, C., Fernández, A., Van Vlardingen, P. L. A., De Voogt, P., Admiraal, W. A. (1997a). Short term and chronic exposure of zebra mussel (Dreissena polymorpha) to acridine: effects and metabolism. Aquatic. Toxicol. 37, 9-20
76
Krauss, M., Wilcke, W. (2002): Sorption strength of persistent organic pollutants in particle-size fractions of urban soils. Soil Sci. Soc. Am. J., 66, 430-437 Kollist-Siigur, K., Nielsen, T., Grøn, Ch., Hansen, P. E., Helweg, Ch., Jonassen, K. E. N., Jørgensen, O., Kirso, U. (2001): Sorption of polycyclic aromatic compounds to humic and fulvic acid HPLC column materials. J. Environ. Qual., 30, 526-537 Kočí, K. (2001): Extrakce a stanovení polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů (PANH) (diplomová práce). Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, Brno Kočí, K.; Petrovská, H.; Šimek, Z.; Varaďová, E., Syslová, A. (2007): Extraction of polycyclic aromatic nitrogen heterocycles from spiked soil samples. Intern. J. Environ. Anal. Chem., 87, 111-123 Langenfeld, J. J., Burford, M. D., Hawthorne, S. B., Miller, D. J. (1992): Effects of collection solvent parameters and extraction cell geometry on supercritical fluid extraction efficiencies. Journal of chromatography A, 594, 297-307 Later, D.W. (1985): Nitrogen containing polycyclic aromatic compounds in coal-derived materials in Handbook of polycyclic aromatic hydrocarbons 2. ed. Bjørseth A. and Ramlahl T., Marcel Dekker Inc. New York and Basel; in Helweg (1997) Lee, H.; Peart, T. E. (1994): Optimization of supercritical carbon dioxide extraction for polychlorinated biphenyls and chlorinated benzenes from sediments. Journal of Chromatography A, 663, 87-95 Lojková, L., Vejrosta, J. (1998): Extrakce iontů kovů a organokovových sloučenin nadkritickou tekutinou. Chemické listy, 92, 988-997 Lojková, L., Sedláková, J., Kubáň, V. (2005a): A solvent recirculation trapping device for supercritical fluid extraction of polyaromatic hydrocarbons. J. Sep. Science, 28, 1188-1194 Lojková, L., Sedláková, J., Kubáň, V. (2005b): A two-step supercritical fluid extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons from roadside soil samples. J. Sep. Science, 28, 2067-2075 Lopez-Avila, V., Young, R., Tehrani, J., Damian, J., Hawthorne, S., Dankers, J., van der Heiden, C. (1994): Mini-round robin study of a supercritical fluid extraction method for polynuclear
77
aromatic hydrocarbons in soils with dichlormethane as a static modifier. Journal of Chromatography A, 672, 167-175 Luthy, R. G., Aiken, G. R., Brusseau, M. L., Cunningham, S. D., Gschwend, P. M., Pignatello, J. J., Reinhard, M., Traina, S. J., Weber, W. J., Westall, J. C. (1997): Critical Review: Sequestration of hydrophobic organic contaminants by geosorbents. Environmental Science and Technology, 31, 3341-3347 Al-Jabari, M. (2002): Kinetics models of supercritical fluid extraction. J. Sep. Sci., 25, 477-489 McGuffin, V. L., Howerton, S. B., Xiaoping, L. (2005): Thermodynamic and kinetic characterization of nitrogen-containing polycyclic aromatic hydrocarbons in reversed-phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1073, 63-73 Meyer, S., Steinhart, H. (2000): Effects of heterocyclic PANHs (N, S, O) on the biodegradation of typical tar oil PAHs in soil/compost mixture. Chemosphere, 40, 359-367. Miège, C., Dugay, J., Hennion, M. C. (2003): Optimization, validation and comparison of various extraction techniques for the trace determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludges by liquid chromatography coupled to diode-array and fluorescence detection. Journal of Chromatography A, 995, 87-97 Miller, D. J.; Hawthorne, S. B.; McNally, M. E. P. (1993): Solventless collection of analytes by rapid depressurization after static supercritical fluid extraction. Analytical Chemistry, 65, 10381042 Montero-Vásquez, R., Cota-Galán, J., Roselló-Segado, A., Gonzáles-Vila, F. J. (2003): Kinetics of the extraction of pyrene using carbon dioxide in dense phase. Chemosphere, 53, 789-793 Mototashi, N., Meyer, R., Molnár, J., Párkányi, C., Fang, X.. (1995): Chromatographic determination of benz[c]acridines and related compounds in airborne carcinogens. Journal of Chromatography A, 710, 117-128. Mundt, M., Hollender, J. (2005): Simultaneous determination of NSO-heterocycles, homocycles and their metabolites in groundwater of tar oil contaminated sites using LC with diode array UV and fluorescence detection. Journal of Chromatography A, 1065, 211-218
78
Nam, K., Alexander, M. (1998): Role of nanoporosity and hydrofobicity in sequestration and bioavailability: Tests with model solids. Environmental Science and Technology, 32, 71-74 Newsted, J. L., Giesy, J. P. (1987): Predictive models for photoinduced acute toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons to Daphnia magna, Strauss (Cladocera, crustacea). Environ. Toxicol. Chem., , 445-461. Nilsson, T., Bøwadt, S., Björklund, E. (2002): Development of a simple selective SFE method for the determination of desorption behaviour of PCBs in two Swedish sediments. Chemosphere, 46, 469-476 Nilsson, T., Sporring, S., Björklund, E. (2003): Selective supercritical fluid extraction to estimate the fraction of PCB that is bioavailable to a benthic organism in a naturally contaminated sediment. Chemosphere, 53, 1049-1052. Nilsson, T., Björklund, E. (2005): Selective supercritical fluid extraction as a tool for determining the PCB fraction accessible for uptake by chironomid larvae in a limnic sediment. Chemosphere, 60, 141-146 Nilsson, T., Häkkinen, J., Larsson, P, Björklund, E. (2006): Selective supercritical fluid extraction to identify aged sediment-bound PCBs available for uptake be eel. Environmental Pollution, 140, 87-94 Nito, S., Ishizaki, S. (1997): Identification of azaarenes and other basic compounds in fly ash from municipal waste incinerator by gas chromatography and mass spectrometry. Chemosphere, 35, 1755-1772 Northcott, G. L., Jones, K. C. (2003): Organic compounds in the environment: Validation of procedures to quantify nonextractable polycyclic aromatic hydrocarbons residues in soil. Journal of Environmental Quality, 32, 571-582 OECD (1984): Test no. 207. Earthworm, acute toxicity tests. OECD Guidelines for the testing of chemicals, Organisation for Economic Co-operation and Development Osborne, P. J., Preston, M., Chen, H. (1997): Azaarenes in sediments, suspended particles and aerosol associated with River Mersey estuary. Marine Chemistry, 58, 78-83.
79
Ostrá, E. (2000): Stanovení polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů v půdách (diplomová práce). Vysoké učení technické v Brně, Fakulta Chemická, Brno Paton, G. I., Killham, K., Weitz, H. J., Semple, K. T. (2005): Biological tools for the assessment of contaminated land: applied soil ecotoxicology. Soil Use and Management, 21, 487-499 Peper, S.; Johannsen, M.; Brunner, G. (2007): Preparative chromatography with supercritical fluids. Comparison of simulated moving bed and batch processes. Journal of Chromatography A, 1176, 246–253 Petrovská, H. (2004): Extrakce polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů z půd (diplomová práce). Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, Brno Pignatello, J. J. Xing, B. (1996): Mechanisms of slow sorption of organic chemicals to natural particles. Environmental Science and Technology, 30, 1-11 Pokorný, E., Střalková, R., Podešvová, J. (2001): Půdní humus, vybrané kapitoly z metodiky. Obilnářské listy, 6, 108-120 Porter, N. L.; Rynaski, A. F.; Campbell, E. R.; Saunders, M.; Richter, B. E.; Swanson, J. T.; Nielsen, R. B.; Murphy, B. J. (1992): Studies of linear restrictors and analyte collection via solvent trapping after supercritical fluid extraction. Journal of Chromatographic Science, 30, 367-73 Reid, B. J., Prausnitz, J. M., Poling, B. E. (1987): The properties of gases and liquids. McGraw Hill Book Co.,New York, NY, 741 Reid, B. J., Stokes, J. D., Jones, K. C., Semple, K. T. (2004): Influence of hydroxypropyl-βcyclodextrin on the extraction and biodegradation of phenanthrene in soil. Environ. Toxicol. Chem., 23, 550-556 Rivera, L., Curto, M. J. C., Pais, P., Galceran, M. T., Puignou, L. (1996): Solid-phase extraction for the selective isolation of polycyclic aromatic hydrocarbons, azaarenes and heterocyclic aromatic amines in charcoal-grilled meat. Journal of Chromatography A, 731, 85. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (2003): Environmental Chemistry, second ed. John Wiley and Sons, New Jersey
80
Scott, W. & Dean, J. R. (2003): Selective extraction of persistent organic pollutants from environmental matrices. J. Environ. Monit., 5, 724-731 Seixtas, G. M., Andon, P. G., Hollingshead, P. G., Thilly, W. G. (1982): The azaarenes as mutagens for Salmonella typhimurium. Mutat. Res., 120, 201. Shinohara R, Kido A, Okamoto Y, Takeshita R (1983) Determination of trace azaarenes in water by
gas
chromatography
and
gas
chromatography–mass
spectrometry.
Journal
of
Chromatography A, 256, 81–91 Simonich, S. L., Hites, R. A. (1994): Importance of vegetation in removing polycyclic aromatic hydrocarbons from atmosphere. Nature, 370, 49-51 Southwort, G. R., Beauchamp, J. J., Schmieder, P. K. (1978): Bioaccumulation potential and acute toxicity of synthetic fuels effluents in freshwater biota: Azaarenes. Environmental Science and Technology, 12, 1062-1066. Spack, L.; Alvarez, C.; Martins, J. M. F.; Tarradellas, J. (1998): Comparison of supercritical fluid extraction (SFE), Soxhlet and shaking methods for pendimethalin extraction from soils: effect of soil properties and water content. Journal of Contaminant Hydrology, 33, 171-185 Sporring, S.; Bøwadt, S.; Svensmark, B.; Björklund, E. (2005): Comprehensive comparison of classic Soxhlet extraction with Soxtec extraction, ultrasonication extraction, supercritical fluid extraction, microwave assisted extraction and accelerated solvent extraction for the determination of polychlorinated biphenyls in soil. Journal of Chromatography A, 1090, 1-9 Storzyk, M., Warzecha, L., Janoszka, B., Bodzek, D. (2000): HPLC determination of azaarenes in environmental organic extracts. Acta Chromatographica, 10, 132-145. Storzyk, M., Warzecha, L., Janoszka, B., Bodzek, D. (2002): Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons, azaarenes, and aminoazaarenes in meat samples by solid-phase extraction (SPE) and HPLC. Acta Chromatographica, 12, 104-121. Stroud, J. L.; Paton, G. I., Semple K. T. Linking chemical extraction to microbial degradation of 14C-hexadecane in soil. Environmental Pollution, In Press, Corrected Proof [on line] (dostupný z http://www.sciencedirect.com)
81
Székely, E. Group of Supercritical Fluid Extraction, Budapest University of Technology and Economics, Faculty of Chemical Engineering, Department of Chemical Engineering (dostupný z http://sunny.vemt.bme.hu/sfe/angol/supercritical.html) Szolar, O. H. J., Rost, H., Hirmann, D., Hasinger, M., Braun, R., Loibner, A. (2004): Sequential supercritical fluid extraction (SSFE) for estimating the availability of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons in historically polluted soils. Journal of Environmental Quality, 33, 80-88 Škarek, M., Čupr, P., Réblová, K., Damborský, J., Maršálek, B., Holoubek, I.: Assessment of toxic and genotoxic effects of N-heterocyclic polyaromatic hydrocarbons with miniaturized in vitro screening [on line] (dostupný z www.recetox.muni.cz) Švábenský, R., Kočí, K., Šimek, Z. (2007): The study of properties of HPLC determination of polycyclic aromatic nitrogen heterocycles. Intern. J. Environ. Anal. Chem., 87, 337-349. Tang, J., Liste, H., Alexander, M. (2002): Chemical assays of availability to earthworms of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Chemosphere, 48, 35-42. Tollbäck, P., Carlsson, H., Östman, C. (2000): Coupled LC-GC-NPD for determination of carbazole-type PANH and its application to personal exposure measurement. J. High. Resol. Chromatogr., 23, 131-137 Tučková, M. (2007): Distribuce polycyklických aromatických dusíkatých heterocyklů v systému půda-vzduch (diplomová práce). Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta Turner, Ch., Eskilsson, C. S., Björklund, E. (2002): Collection in analytical-scale supercritical fluid extraction (Review). Journal of Chromatography A, 947, 1-22 Van Genderen, J., Noij, T. H. M., Van Leerdam, J. A. (1994): Inventory and toxicological evaluation of organic micropollutans. Report RIWA, Amsterdam, Netherlands Van Vlaardingen, P. L. A., Steinhoff, W. J., De Voogt, P., Admiraal. W. A. (1996): Propertytoxicity relationship of azaarenes to the green algae Scenedesmus acuminatus. Environmental Toxicology and Chemistry, 15, 2035-2042
82
Vejrosta, J.; Planeta, J.; Mikešová, M.; Ansorgová, A.; Karásek, P.; Fanta J.; Janda, V. (1994): Solute collection after off-line supercritical fluid extraction into a moving liquid layer. Journal of Chromatography A, 685, 113-119 Villeneuve, M. S., Anderegg, R. J. (1998): Analytical supercritical fluid chromatography using fully automated column and modifier selection valves for the rapid development of chiral separations. Journal of Chromatography A, 826, 217–225 Wakeham, S. G. (1979): Azaarenes in recent lake sediments. Environmental Science and Technology, 13 (9), 1118-1123 Wright, C. W., Later, D. W, Wilson, B. W. (1985). Cooperative chemical analysis of commercial creosotes and solvent refined coal-II materials by high resolution gas chromatography. Journal of High Resolution. Chromatography, 8, 283–289 Yamauchi, T., Handa, T. (1987): Characterization of aza-heterocyclic hydrocarbons in urban atmospheric particulate matter. Environmental Science and Technology, 21, 1177-1181 Warshawsky, D. (1992). Environmental sources, carcinogenicity, mutagenicity, metabolism and DNA-binding of nitrogen and sulphur heterocyclic aromatics. Environmental Carcinogens and Ecotoxicological Reviews , 10, 1—71. Yanqun, Z.; Wayne, A. P.; Shuhong, Z. (2008): Chiral separation of selected proline derivatives using a polysaccharide-type stationary phase by supercritical fluid chromatography and comparison with high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1189, 245–253 Young, T. M., Weber, W. J. (1997): Equilibrium and rate study of analyte-matrix interactions in supercritical fluid extraction. Analytical Chemistry, 69, 1612-1619 Yukata, O., Yoshiteru, T. (1983): Separation of azaarenes by polyamide thin-layer chromatography and the relationship between their basicity and Rf values. Journal of Chromatography, 254, 35-44. Zhou, M.; Trubey, R. K.; Keil, Z. O.; Sparks, D. L (1997): Study of the effects of environmental variables and supercritical fluid extraction parameters on the extractability of pesticides residues
83
from soils using a multivariate optimization scheme. Environmental Science & Technology, 31, 1934-1939 Zougagh, M., Valcárcel, M., Ríos, A. (2004): Supercritical fluid extraction: a critical review of it analytical usefulness. Trends in Analytical Chemistry, 23, 399-405 http://esc.syrres.com/~ESC/kowexpdb.htm, model C log P, Environmental Science Centre of Syracuse Research Corporation
84
11 PŘÍLOHY Tabulka 1P. Příklady SFE environmentálních vzorků [Camel et al. 1993] Off-line spojení Záchyt analytu/Analýza
Reference
GC
Hawthorne et al. 1989
Adsorbent
Analyt
Vzduch
Polyuretanová pěna
Vzduch
Polyimid 109
Adsorpce/GC
Výfukové plyny
Tenax
Alkyny a aromatické CO2 uhlovodíky Organické CO2 sloučeniny Alkany, benzeny, CO2 PAH, oxy-PAH
Automobilové výpary
Skleněný filtr
PAH
CO2
Rozpouštědlo/GC
Hawthorne & Miller 1986
Fenol
CO2, CO2-CH3OH
Rozpouštědlo/GC
Roop et al. 1989; Hawthorne et al. 1992
Rozpouštědlo/HPLC
Bartle et al. 1990
Voda Odpadní vody Odpadní vody ze zplyňování uhlí Černouhelný dehet Půda a sedimenty
Polyuretanová pěna Skleněné kuličky
Rostlinná tkáň
Raymer & Pellizzari 1991 GC
Lineární CO2, CO2-CH3OH, N2O alkylbenzensulfonáty Fenolové a dusíkaté CO2 aromáty
Hawthorne et al. 1990
GC
Wright et al. 1987
CO2
PAH
CO2, CO2-CH3OH, N2O, N2O-CH3OH
Rozpouštědlo/GC
GC
Pesticidy
CO2, CO2-CH3OH, CH3OH
Rozpouštědlo, adsorpce/GC, HPLC
GC, PSFC
Rozpouštědlo, adsorpce/GC
GC
Explosiva Polychlorované dioxiny Uhlovodíky n-alkany, PAH Alkany, PAH
CO2, CO2-CH3OH, CO2toluen, N2O, CHClF2 CO2 CO2, CO2-CH3OH, N2O, N2O-CH3OH CO2, SF6 CO2 CO2, N2O, N2O-CH3OH, C4H1O
Pesticidy
CO2
Herbicidy
CO2-CH3OH, CO2-C2H5OH
Rozpouštědlo/HPLC
Frazier 1990; Levy et al. 1990; Myer et al. 1992 Wong et al. 1991; Lopez-Avila et al. 1990 Schnatz & Chesler 1986; Andersen 1989 Engelhardt et al. 1991
Rozpouštědlo/GC
Onuska & Terry 1989
Rozpouštědlo/GC, SFC Rozpouštědlo/GC
GC
Rozpouštědlo, adsorpce/GC
GC
Myer et al. 1992 Hawthorne & Miller 1986 Lancas e al. 1990; Saito et al. 1990 Hooper & King 1991; Schipke et al. 1991
PSFC, CSFC
Wheeler & McNally 1989
Rozpouštědlo, adsorpce/GC, PSFC
85
Hawthorne at al. 1989
GC
PAH
PCB
Horniny Kaly Částice městského prachu
Extrakční směs
On-line spojení
Matrice
Tabulka 2P. Příklady sekvenční extrakce SFE Parametry extrakce Matrice
Analyt/extrakční směs
Sediment PCB/CO2
Zastoupení analytu ve frakci (%)
Frakce
1 2 3 4 Sediment PCB/CO2 1 2 3 4 Půda PAH/CO2 1 2 3 4 PAH/CO2-5%MetOH 5 Půda PAH 1 2 3 4
Reference Délka (min) 60 60 60 60 60 60 60 60 48 48 48 48 45 30, 60 30, 60 30, 60 30, 60
Teplota (°C) 40 40 100 150 40 40 100 150 40 60 60 120 120 50 50 100 150
Tlak (bar) 120 400 400 400 120 400 400 400
Hustota Vzorek 1 (g/ml) 58 11 22 9 43-48 10-14 24-30 13-17 0,25 0,25 0,63 0,63 0,63
Vzorek 2 65 11 14 10 72-89 3-10 4-16 3-7
Vzorek 3
Vzorek 4 Vzorek 5 Nilsson et al. 2002
24-49 12-17 25-44 7-17
46-70 7-26 15-19 5-10
68-81 5-18 8-11 5-7
Björklund et al. 1999
Szolar et al. 2004
120 400 400 400
Hawthorne et al. 2000
Tabulka 3P . Příklady selektivní SFE extrakce a biologického stanovení biodostupné frakce analytu Matrice
Sediment Sediment Sediment Půda Půda
Analyt/extrakční médium PCB/CO2 PCB/CO2 PCB/CO2 PCB/CO2 PAU/CO2
Podíl extrahovaného analytu (%)
Parametry extrakce Délka(min) 60 60 120 60 60
Teplota (°C) 40 40 40 50 50
Tlak (bar) 120 400 368 350 120
86
50 54 60 70 66
Podíl biodostupného analytu (%) 40 60 65 75 64
Reference
Nilsson et al. 2003 Nilsson & Björklund 2005 Nilsson et al. 2006 Hallgren et al. 2006 Hawthorne et al. 2001
Tabulka 4P. Přehled chemických a biologických studií [Ehlers & Loibner 2006] Reference/ analyt Kelsey et al. 1997/ atrazin, fenanthren Chung & Alexandr 1998/ atrazin, fenanthren Tang & Alexander 1999/ anthracen, fluoranthen, pyren
Fyzikálně-chemická metoda methanol/voda (9:1/1:1), n-butanol
Biologická metoda
Geosorbent
E. fetida příjem, biodegradace
Laboratorní
ethanol (90, 71%)
Biodegradace
Laboratorní
butanol, propanol, ethyl acetát
E. fetida příjem, biodegradace, příjem rostlinami
Laboratorní
E. fetida příjem
Reálné; laboratorní
E. fetida příjem
Laboratorní
L. terrestris příjem
Reálné, laboratorní
tetrahydrofuran (25%), C18 membrány tetrahydrofuran (25%), Tang et al. 2002/ PAH ethanol (95%), C18 membrány Krauss & Wilcke 2001/ PAH, PCB C18 membrány Tang et al. 1999/ DDT, DDE, DDD
Macrae & Hall 1998/ PAH Cornelissen et al. 1997, 1998, 2001; Van Noort et al. 2003/ PCB, PAH, chlorbenzeny Ten Hulsher et al. 2003/ PCB, PAH, DDE, DDD, chlorbenzeny Morrison et al. 2000/ DDT, DDE, DDD, dieldrin Van der Wal et al. 2004/ PCB, HCB, dieldrin, telodrin Leslie et al. 2002/ chlorované uhlovodíky
Polyethylen, Tenax TA
Reálné; laboratorní
Tenax TA
Bioremediace
Reálné, laboratorní
Tenax TA
Limnodrilus sp., L. rubellus příjem
Laboratorní
Tenax TA
E. fetida příjem
Reálné, laboratorní
polydimethylsiloxan-vlákno
E. andrei, A. caliginosa příjem
Reálné
polydimethylsiloxan-vlákno
C. riparus příjem
V roztoku
Biodegradace
Reálné
Biodegradace
Laboratorní
Reid et al. 1999, 2000, 2004/ PAH
Tenax TA, Hydropropyl-βcyklodextrin, Triton X-100 Hydroxypropyl-β-cyklodextrin
Cuypers et al. 2000/ PAH
Oxidace (persulfát), Tenax TA
Biodegradace
Reálné
Nilsson et al. 2002, 2003/ PCB
CO2
C. pallidivitatis příjem
Reálné
Hawthorne & Grabanski 2000, Hawthorne et al. 2002/ PAH
CO2, XAD-2
Bioremediace
Reálné
Loibner et al. 1997, 2000/ PAH
CO2
Szolar et al. 2004/ PAH
CO2
Cuypers et al. 2002/ PAH
Biodegradace, Vibrio fisheri toxicita Biodegradace, Vibrio fisheri toxicita
87
Reálné, laboratorní Reálné, laboratorní
Frakce/ typ biodostupnosti Volně dostupná, rychlá desorpce/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Volně dostupná/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Volně dostupná, rychlá desorpce/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Volně dostupná/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Volně dostupná, rychlá desorpce/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Rychlá desorpce => pomalá desorpce/ degradace, akumulace, vyluhování, toxicita
Tabulka 5P. Obsah PANH stanovený v environmentálních a jiných matricích Vzduch [ng/m3] Helweg 1997
Voda [ng/l] Shinohara et al. 1983
benzochinoliny 0,22 chinolin 2,23 isochinolin 24 methylchinoliny 5,5
chinolin isochinolin akridin dibenz[c,h]akridin dibenz[a,h]akridin dibenz[a,j]akridin
Půda [µg/g] Brumley et al. 1991 22 1,3 9,5 0,66 3,1 4,1
chinolin isochinolin benzo[h]chinolin azafluoren akridin fenanthridin karbazol benzokarbazol
Sediment [ng/g] Warshawsky 1992 0,62 0,70 20,50 6,84 30,80 1,94 34,80 2,01
benz[a]akridin benzo[a]karbazol dibenzakridiny dibenzokarbazoly Sediment [µg/kg) Brumley et al. 1991 akridin methylakridin azapyren karbazol methylkarbazol
Kreosot [mg/g] Wright et al. 1985 870 1100 550 1000
chinolin isochinolin benzo[h]chinolin akridin fenanthridin karbazol 43,7 methylakridin 6,0 12,0 463,0 61,5
20,3 6,77 11,6 22,2 27,8 38,9 8,93
Černouhelný dehet [µg/g] Helweg 1997 chinolin isochinolin 4-azafluoren benzo[h]chinolin akridin fenanthridin 2-azapyren benz[a]akridin azabenzopyreny
147 55 40 36 35 134 4 29 18
Tabulka 6P.Příklady extrakcí PANH z různých typů matric
RP-HPLC - UV/VIS 85%
Kočí 2001
RP-HPLC - UV/VIS 76%
Kočí et al. 2007
ACN + MetOH (80:20)
Parametry extrakce 18 h 2 × 20 min, 30 -150 °C, 7 - 40 MPa 15 min, 100 °C, 15 MPa 20 h
RP-HPLC - UV/VIS 62%
Kočí et al. 2007
ACN + MetOH (80:20)
40 + 20 min,
RP-HPLC - UV/VIS 74%
Kočí et al. 2007
Matrice
Analyt
Extrakce Rozpouštědlo
Aerosol
azaareny
Soxhlet
DCM
Půda
PANH
SFE
CO2/ voda + ACN (1:1)
Půda
PANH
ASE
ACN + MetOH (80:20)
Půda
PANH
Půda
PANH
Soxhlet Soxhlet Warm Soxhlet
DCM + n-heptan (2101) 7,5 h
Půda
HeteroPAH PANH azaareny
Půda Sediment Suspendované azaareny částice Aerosol azaareny Maso pečené azaareny
Analýza
Výtěžnost
GC - MS
Environmentální Reference koncentrace > 2 - 16,6 µg m-3 Chen & Preston 1997
Soxhlet Soxhlet
ACN + MetOH (80:20) DCM
18 h
GC - FID, HPLC DAD RP-HPLC –UV/FLD GC - FID, NP, MS
Soxhlet
DCM
18 h
GC - FID, NP, MS
128-2451 ng g-1
Osborne et al. 1997
Soxhlet SPE
DCM
18 h
GC - FID, NP, MS
1 > 9 ng m-3
Osborne et al. 1997 Rivera et al. 1996
88
Meyer & Steinhart 2000 -1
5-185 ng g 2-364 ng g-1
Švábenský et al. 2007 Osborne et al. 1997
Tabulka 7P. Doplněk k Tabulce 14 (sloupec V) a Tabulce 16: Hodnoty směrodatných odchylek ze tří opakování I chinolin 6-methylchinolin ftalazin karbazol akridin fenanthridin benzo[h]chinolin fenazin 1,7-fenanthrolin naftalen fluoren anthracen fenanthren fluoranthen benz[a]anthracen
II 6,33 1,61 9,29 2,23 1,10 9,63 2,76 3,97 1,12 5,05 4,96 8,43 3,76 0,76 1,43
9,02 11,85 14,62 0,62 17,20 8,03 5,47 4,78 10,11 0,67 0,62 2,91 7,48 5,61 3,32
III 2,29 2,51 13,56 7,23 19,43 4,36 3,32 2,56 12,56 5,65 4,40 5,88 7,58 2,00 7,35
IV 2,68 1,03 12,04 5,79 15,22 7,46 3,80 4,15 17,37 4,83 2,52 8,33 3,82 0,79 4,13
V 5,57 7,01 15,40 2,21 14,11 9,05 5,54 2,31 11,15 2,75 1,45 6,65 2,78 0,24 4,35
89
VI 6,45 6,67 11,09 8,05 14,21 12,02 7,45 4,71 13,25 5,11 3,40 7,26 8,39 4,87 5,10
Tabulka 8P. Výtěžnost PA(N)H z půdních matric různými extrakčními postupy Analyt chinolin 6-methylchinolin ftalazin karbazol akridin fenanthridin benzo[h]chinolin fenazin 1,7-fenanthrolin naftalen fluoren anthracen fenanthren fluoranthen benz[a]anthracen celkový průměr průměr PANH průměr PAH
Soxhlet Warm [Tučková 2007]* Skleněné kuličky (%) 102,0 99,8 106,4 101,3 100,3 101,1 100,6 98,6 98,4 84,9 101,0 94,4 112,6 99,3 102,2 100,2 100,9 99,1
Soxhlet Warm [Tučková 2007] Soxhlet Warm [Petrovská 2004] ASE [Petrovská 2004] SFE [Ostrá 2000]
Soxhlet Warm [Tučková 2007]* Půda (%) 90,0 92,1 89,0 97,5 43,6 91,2 97,0 97,2 81,6 80,5 98,4 87,6 102,6 93,3 96,5 89,2 86,6 93,2
Soxhlet Warm [Petrovská 2004]** Půda (%) 68,6 87,4
ASE [Petrovská 2004]** Půda (%) 78,0 87,5
92,5 74,5 98,7 75,2
89,6 77,8 88,3 85,5
60 minut; 100 °C nebo 150 °C; 15 MPa; methanol/acetonitril (8:2) 60 minut; 140 ml methanol/acetonitril (8:2) 15 minut; 100 °C; 15 MPa; methanol/acetonitril (8:2) 2 × 20 minut ; 150 °C; 40 MPa; 200 µl voda/acetonitril (1:1)
* Parametry půdy: Cox 2,59 %; pH (H2O) 5.6; 48 % písek, 27 % prach, 25 % jíl ** Parametry půdy: Cox 3 %, pH (H2O) 6.9, 40 % jíl, 32 % písek, 28 % prach
90
SFE [Ostrá 2000]** Půda (%) 98,0
72,0 97,0
Obrázky 1P. Časové závislosti změny koncentrace PA(N)H v půdě o různém pH [Tučková 2007]
91
92
