MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Druhová determinace streptokoků molekulárně-biologickými metodami u pacientů s infekční endokarditidou Diplomová práce
Tereza Kubasová
Vedoucí práce: MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Bc. Tereza Kubasová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Druhová determinace streptokoků molekulárně-biologickými metodami u pacientů s infekční endokarditidou
Studijní program:
Biologie
Studijní obor:
Obecná biologie (Směr: Mikrobiologie)
Vedoucí práce:
MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
92
Klíčová slova:
streptokoky, 16S rDNA, infekční endokarditida, PCR, sekvenování
Bibliographic Entry Author:
Bc. Tereza Kubasová Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology
Title of Thesis:
Molecular identification of streptococci in patients with infective endocarditis
Degree programme:
Biology
Field of Study:
General biology (Specialization: Microbiology)
Supervisor:
MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
92
Keyword:
streptococci, 16S rDNA, infective endocarditis, PCR, sequencing
Abstrakt Infekční endokarditida (IE) je vzácné, život ohrožující infekční onemocnění endokardu. Ačkoliv jsou streptokoky druhou nejčastější příčinou IE, standardní metody druhové identifikace streptokoků a jejich nutričních variant nejsou dostačující. Výskyt streptokokových IE může být navíc v důsledku antibiotické terapie standardními kultivačními metodami podhodnocen. Spektrum deklarovaných druhů streptokoků způsobujících IE v České republice proto může být zkreslené. Vhodnou alternativou stanovení etiologie IE se jeví molekulárně-biologické metody, které umožňují přímý záchyt DNA patogenního agens bez nutnosti jeho kultivace. Cílem této diplomové práce bylo nalezení vhodné variabilní oblasti genu 16S rDNA, která by umožnila druhové rozlišení klinicky významných streptokoků. V práci byly porovnány sekvence tohoto genu u 32 druhů streptokoků a jim příbuzných bakterií. Jako nejvhodnější oblasti pro druhové rozlišení byly prokázány variabilní oblasti V2-V6. Vybrané oblasti byly následně využity při sekvenační analýze klinických vzorků pacientů s podezřením na streptokokovou IE, za účelem stanovení druhového zastoupení streptokoků. Nejčastěji byly identifikovány viridující streptokoky (56 %), především skupiny S. mitis a S. sanguinis, a streptokoky skupiny S. bovis (13 %). Navíc byly srovnány výsledky PCR a kultivačních metod. Výsledky hemokultur a kultivace z chirurgického materiálu se shodovaly s PCR v 53 % a 24 % případů. Tyto výsledky potvrdily význam PCR pro bližší identifikaci streptokoků a také pro detekci agens u kultivačně negativních případů, s čímž souvisí i lepší zmapování epidemiologie IE.
Abstract Infective endocarditis (IE) is an uncommon, life-threatening infective disease of the endocardium. Although streptococci are among the most common causes of IE, standard methods of species identification of streptococci and their nutritional variants are not sufficient. The incidence of streptococcal IE may also be underestimated due to false negative results of culture tests in patients under antibiotic therapy. Therefore the epidemiology of streptococcal IE in the Czech Republic may be inaccurate/incomplete. PCR-based methods seem a suitable alternative to determine the etiology of IE. The aim of the study was to find a variable region of 16S rDNA, suitable for distinguishing streptococci to species level. In this study, 32 16S rDNA sequences of reference streptococcal strains were compared. The most suitable regions for their determination were variable regions V2-V6. The chosen regions were used to assess the species representation of streptococci in patients with suspected streptococcal IE. Viridans streptococci (56 %), mainly S. mitis group and S. sanguinis group, and S. bovis group (13 %) were identified most frequently. In addition, results of PCR and standard culture were compared. Blood culture and tissue culture agreed with PCR in 53 % and 24 % of IE cases, respectively. We showed that PCR is a usefull tool for identification of streptococci especially in culture-negative cases enabling better undestanding on IE epidemiology.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu MUDr. Tomáši Freibergerovi, Ph.D. za cenné rady a praktické připomínky. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Barboře Mališové, Ph.D. za odborné vedení při práci v laboratoři, rady a pomoc při sepisování diplomové práce. Děkuji také všem pracovníkům Genetické laboratoře CKTCH za vytvoření příjemného pracovního prostředí.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou citovány.
V Brně dne 14. 5. 2012
……………………. Tereza Kubasová
Obsah Seznam použitých zkratek ................................................................................................ 11 1. Úvod ........................................................................................................................ 12 1.1. Infekční endokarditida ...................................................................................... 12 1.1.1. Epidemiologie a incidence ......................................................................... 12 1.1.2. Diagnostická kritéria IE ............................................................................ 13 1.1.3. Patogeneze IE ............................................................................................. 15 1.1.3.1. Přechodná bakteriémie...................................................................... 15 1.1.3.2. Průběh kolonizace chlopenního endotelu ........................................ 15 1.1.4. Etiologie ...................................................................................................... 17 1.2. Streptokoky ........................................................................................................ 19 1.2.1. Identifikace streptokoků pomocí fenotypových metod .......................... 19 1.2.2. Klinicky významné streptokoky a jim příbuzné druhy.......................... 21 1.2.2.1. Beta-hemolytické streptokoky .......................................................... 21 1.2.2.1.1. Streptococcus pyogenes.................................................................... 22 1.2.2.1.2. Streptococcus agalactiae.................................................................. 23 1.2.2.1.3. Streptococcus dysgalactiae .............................................................. 23 1.2.2.1.4. Streptococcus equi............................................................................ 24 1.2.2.2. Non-beta-hemolytické streptokoky .................................................. 25 1.2.2.2.1. Streptococcus pneumoniae .............................................................. 25 1.2.2.2.2. Skupina Streptococcus bovis ........................................................... 27 1.2.2.2.3. Viridující streptokoky .................................................................... 27 1.2.2.2.4. Skupina Streptococcus anginosus................................................... 29 1.2.2.3. Nutriční varianty streptokoků .......................................................... 30 1.2.2.3.1. Abiotrophia a Granulicatella........................................................... 30 1.2.2.4. Další grampozitivní koky .................................................................. 31 1.2.2.4.1. Rod Gemella..................................................................................... 31 1.2.2.4.2. Rod Globicatella .............................................................................. 31 1.2.2.4.3. Rod Facklamia................................................................................. 31 1.2.3. Streptokoky jako původci IE .................................................................... 32 1.3. Mikrobiologická diagnostika IE ....................................................................... 33 1.3.1. Konvenční mikrobiologická diagnostika IE ............................................ 33 1.3.1.1. Hemokultury ...................................................................................... 33 1.3.1.2. Kultivace z chirurgického materiálu................................................ 34 1.3.1.3. Sérologie.............................................................................................. 35 1.3.2. Molekulárně-biologická diagnostika IE................................................... 35 1.3.2.1. Polymerázová řetězová reakce a sekvenace .................................... 35 2. Cíle práce ................................................................................................................ 39 3. Materiál a metody .................................................................................................. 40 3.1. Přístroje .............................................................................................................. 40 3.2. Sbírkové kmeny streptokoků ............................................................................ 41 3.3. Klinické kmeny streptokoků............................................................................. 41 3.4. Klinická data ...................................................................................................... 42 3.5. Metody detekce a identifikace mikroorganismů ............................................. 42 3.5.1. Izolace bakteriální DNA z pevné půdy..................................................... 42 3.5.2. Izolace DNA z chirurgického materiálu .................................................. 42 3.5.3. PCR cílená na gen 16S rDNA.................................................................... 43
9
3.5.4. Detekce produktu PCR reakce ................................................................. 43 3.5.5. Sekvenování ................................................................................................ 44 3.5.6. Vyhodnocení sekvencí................................................................................ 45 4. Výsledky.................................................................................................................. 46 4.1. Vytvoření databáze sekvencí genu 16S rDNA ................................................. 46 4.1.1. Výběr vhodné oblasti pro druhové rozlišení streptokoků...................... 47 4.2. Identifikace streptokoků u pacientů s podezřením na IE .............................. 50 4.2.1. Identifikace agens pomocí PCR................................................................ 51 4.2.2. Kultivační metody ...................................................................................... 52 4.2.2.1. Výsledky hemokultivace a kultivace z chirurgického materiálu ... 53 4.2.3. Klinické údaje............................................................................................. 54 4.2.4. Srovnání kultivačních metod a PCR ........................................................ 55 4.2.5. Srovnání výsledku hemokultur a kultivace ............................................. 56 5. Diskuze .................................................................................................................... 57 5.1. Variabilní oblasti vhodné pro druhové rozlišení streptokoků....................... 57 5.2. Identifikace streptokoků v klinickém materiálu ............................................. 59 5.2.1. Etiologie u pacientů s podezřením na IE ................................................. 59 5.2.2. Stanovení diagnózy a klinické projevy IE ............................................... 59 5.2.3. Význam PCR pro identifikaci streptokoků ............................................. 60 5.2.4. Druhové zastoupení streptokoků u pacientů s IE ................................... 62 5.3. Srovnání databází sekvencí mikroorganismů ................................................. 62 6. Závěr ....................................................................................................................... 64 7. Literatura................................................................................................................ 66 PŘÍLOHY........................................................................................................................... 81
10
Seznam použitých zkratek CKTCH
Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie
DNA
deoxyribonukleová kyselina
HACEK
Haemophillus sp., Actinobacillus sp., Cardiobacterium sp., Eikenella sp., Kingella sp.
IE
infekční endokarditida
NVE
infekční endokarditida probíhající na nativní chlopni
NVS
nutriční varianty streptokoků
PCR
polymerázová řetězová reakce
PVE
infekční endokarditida probíhající na prostetické chlopni
rDNA
ribozomální deoxyribonukleová kyselina
TFA
tkáňový faktor
11
1. Úvod Infekční endokarditida (IE) je život ohrožující onemocnění spojované s vysokou úmrtností. Ačkoliv se epidemiologie IE v posledních letech podstatně změnila, incidence IE za posledních 30 let zůstává stejná. Zásluhou dostupnější a kvalitnější lékařské péče se snižuje počet pacientů s revmatickým onemocněním srdce a naopak se zvyšuje věk populace a počet invazivních zákroků. IE se vyznačuje různými klinickými projevy. Právě tento fakt představuje významný problém v celkové diagnostice IE. Z pohledu diagnostiky onemocnění se IE nachází na křižovatce několika lékařských oborů zahrnujících například kardiologii, kardiochirurgii, neurologii, infektologii či obory zabývající se intenzivní péčí (Habib a kol. 2009). 1.1. Infekční endokarditida Infekční endokarditida je bakteriální nebo houbová infekce vnitřní výstelky srdce (endokardu). Zánětlivý proces probíhá především na srdečních chlopních, může však být postižen i nástěnný endokard nebo chlopenní protézy. IE se řadí mezi systémová onemocnění, jelikož infekční ložisko (tzv. vegetace) se může uvolnit do krevního řečiště a diseminovat do tenkých kapilár mozku, sleziny aj. (Moreillon a Que 2004, Beneš a kol. 2007). IE postihuje přednostně mechanicky nebo zánětlivě poškozené nativní chlopně (NVE, native valve endocarditis) a chlopenní protézy (PVE, prosthetic valve endocarditis). Infekcí je nejčastěji zasažena levá část srdce (aortální a/nebo mitrální chlopně), pravá část srdce bývá postižena vzácněji, většinou ve spojení s intravenózní narkomanií a nitrožilními katétry (Que a Morreillon 2011). Průběh onemocnění závisí na typu IE (NVE, PVE), etiologii a způsobu získání infekce (komunitní, nozokomiální). Zpravidla závažnější průběh a prognózu mají nozokomiální IE způsobené stafylokoky. Příkladem může být časná PVE, která se objevuje během prvního roku po operaci (Beneš a kol. 2007, Que a Moreillon 2011).
1.1.1. Epidemiologie a incidence Během posledních 30 let se celkový výskyt IE pohybuje mezi 2–6 případy na 100000 obyvatel za rok a mortalita mezi 10–30 % v závislosti na původci a typu IE. Tento stav není zapříčiněný nedostatečným pokrokem v medicíně, ale vývojem
12
epidemiologických znaků a rizikových faktorů IE. Před zavedením širokospektrých antibiotik bylo hlavním rizikovým faktorem vzniku IE chronické revmatické postižení srdce. V rozvinutých zemích se ovšem objevily nové rizikové skupiny, a to pacienti s umělými chlopněmi, zavedenými nitrožilními katétry, podstupující hemodialýzu či intravenózní narkomani. S prodlužující se průměrnou délkou života populace se zvyšuje také riziko vzniku degenerativního onemocnění chlopní (Cabell a kol. 2002, Habib a kol. 2009, Que a Moreillon 2011). S větším počtem invazivních zákroků zase stoupá riziko vzniku bakteriémie, která může vyústit v nozokomiální endokarditidu (Mouly a kol. 2002, Fernández-Hidalgo a kol. 2008).
1.1.2. Diagnostická kritéria IE Pro stanovení konečné diagnózy onemocnění a možnost statistického zpracování souboru klinických dat u pacientů s IE byla definována klinická diagnostická kritéria IE (Von Reyn a kol. 1981, Durack a kol. 1994). Dlouhou dobu byla tato diagnostická kritéria založena především na výsledcích kultivace etiologického agens, histopatologickém vyšetření chirurgicky odstraněné vegetace a některých ne zcela specifických klinických projevech (Von Reyn a kol. 1981). V roce 1994 Durack a kol. přiřadili k již zavedeným diagnostickým kritériím výsledky echokardiografického zobrazení srdce a další klinické a laboratorní údaje. V současnosti se určení diagnózy u pacientů s podezřením na IE opírá o tzv. modifikovaná Duke kritéria, která zahrnují celkový klinický obraz a výsledky laboratorního a echokardiografického vyšetření (viz Tab. 1). Rozlišují se kritéria patologická a klinická (hlavní a vedlejší). Podle naplnění jednotlivých kritérií lze určit pravděpodobnost diagnózy IE. Pacient s alespoň jedním patologickým kritériem nebo dvěma hlavními klinickými kritérii nebo jedním hlavním a třemi vedlejšími či pěti vedlejšími klinickými kritérii je zařazen do kategorie prokázaná IE. Do kategorie možná IE jsou řazeni pacienti, kteří splní jedno hlavní a jedno vedlejší klinické kritérium nebo tři vedlejší klinická kritéria. Diagnóza IE může být na základě kritérií také vyloučena, zpravidla se u těchto pacientů jedná o pouhé kalcifikace na srdečních chlopních nebo uvolnění umělé chlopně z neinfekční příčiny (Li a kol. 2000).
13
Tab. 1: Modifikovaná Duke kritéria, upraveno podle Li a kol. 2000, Beneš a kol. 2007 PATOLOGICKÁ KRITÉRIA -
průkaz mikroorganismů kultivačně nebo histologicky ve vegetaci nebo ve vegetaci, která embolizovala, nebo v nitrosrdečního abscesu
-
průkaz patologických útvarů, např. vegetace nebo nitrosrdeční absces, přičemž histologické vyšetření potvrdí aktivní endokarditidu
KLINICKÁ KRITÉRIA Hlavní kritéria Pozitivní hemokultury -
nález typického mikroorganismu vyvolávajícího IE ve dvou různých hemokulturách
-
stálý nález mikroorganismu vyvolávajícího IE v hemokulturách o
stejný nález u nejméně 2 hemokultur odebraných v rozmezí 12 hodin a více
o stejný nález u 3 ze 4 nebo u většiny ze 4 či více odebraných hemokultur (mezi prvním a posledním odběrem musí být časový rozdíl větší než 1 hodina) Echokardiografické známky postižení endokardu -
vegetace
-
absces
-
nově vzniklá částečná dehiscence umělé chlopně
-
nově vzniklá valvulární regurgitace
Vedlejší kritéria Predispozice: onemocnění srdce, intravenozní narkomanie Horečka: vyšší než 38 °C Cévní příznaky: velké arteriální embolizace, septické plicní infarkty, mykotická aneurysmata, nitrolební krvácení, konjunktivální hemoragie, Janewayovy léze Imunologické příznaky: glomerulonefritida, Oslerovy uzlíky, Rothovy skvrny, pozitivní revmatoidní faktor Mikrobiologický nález: pozitivní hemokultivace nesplňující výše uvedená kritéria nebo sérologický nález aktivní infekce připouštějící IE Diagnostika IE Prokázaná IE
Možná IE
jedno z patologických kritérií nebo
1 hlavní a 1 vedlejší kritérium nebo
2 hlavní kritéria nebo
3 vedlejší kritéria
1 hlavní a 2 vedlejší nebo 5 vedlejších kritérií
14
1.1.3. Patogeneze IE Vznik endokarditidy zahrnuje komplexní interakce mezi hostitelem a patogenními mikroorganismy. Předpokladem pro rozvoj IE je kolonizace endokardu mikroorganismy schopnými se zde rozmnožovat. Endoteliální výstelka je za normálních okolností odolná vůči bakteriální či plísňové infekci, pouze některé vysoce virulentní organismy (např. Staphylococcus aureus) mají schopnost infikovat nepoškozenou srdeční chlopeň (Bashore a kol. 2006).
1.1.3.1.
Přechodná bakteriémie
Jedním z předpokladů vzniku endokarditidy je přítomnost bakterií v krvi. Význam bakteriémie byl prokázán při experimentech s pokusnými zvířaty s nebakteriální trombotickou endokarditidou vyvolanou experimentálně zavedeným katétrem. Z velkého množství orálních mikroorganismů cirkulujících v krvi po dentálním zákroku mohou vyvolat IE jen ty, které mají schopnost přichycení na poškozené chlopně (Moreillon a kol. 1988). K bakteriémii může dojít následkem diagnostických nebo terapeutických zásahů či zraněním. Mezi rizikové faktory patří zejména arteriální a žilní kanyly, katétry nebo umělá ventilace. Bakterie se do krve dostávají také při běžných činnostech (např. při žvýkaní či čištění zubů). Bakteriémie způsobená těmito činnostmi se označuje jako přechodná, protože bakterie jsou ve zdravém organismu rychle (v rámci minut) eliminovány retikoluendoteliálním systémem a jejich počet nepřesahuje 1-10 CFU/ml (Lockhart a lol. 2009). Bakteriémie představuje riziko vzniku IE v případě hemodynamické poruchy srdce nebo výskytu umělého srdečního materiálu. Nebezpečí přechodné bakteriémie spočívá v její opakovatelnosti. Tento fakt podporuje hypotézu, že kumulativní vystavení nízkému počtu bakterií představuje skutečné riziko pro vznik IE (Veloso a kol. 2011) a mohlo by vysvětlit, proč k většině případu IE dochází nezávisle na předchozím chirurgickém zákroku (Strom a kol. 1998).
1.1.3.2.
Průběh kolonizace chlopenního endotelu
Prvním krokem pro vznik endokarditidy je přichycení bakterií na cílové místo, kterým je zpravidla poškozený endotel. Poškození může být způsobeno prouděním krve v souvislosti s kongenitálním onemocněním srdce, prostetickou náhradou, elektrodami či katétrem. Další možností je poškození endotelu v důsledku zánětu, například u pacientů
15
s revmatickým zánětem endokardu nebo u starších pacientů s degenerativními chlopenními lézemi (Que a Moreillon 2011). V druhé fázi kolonizace dochází k ukotvení bakterií na chlopni a k růstu mikroorganismů s místním poškozením tkáně, popřípadě možným rozšířením do přilehlých tkání, či dokonce k hematogennímu rozsevu do jiných orgánů (ledvin, sleziny, mozku) (Moreillon a kol. 2002). Streptokoky, enterokoky, ale i stafylokoky přednostně kolonizují mechanicky poškozené srdeční chlopně (Crawford a Russel 1986). V místě poškození je nejdříve zahájen normální hojící proces, kdy nechráněné stromální buňky a extracelulární matrix vyvolají ukládání fibrinu a krevních destiček. K tomuto útvaru, tzv. nebakteriální trombotické vegetaci, se poté mohou bakterie vázat během přechodné bakteriémie (Moreillon a kol. 2002). Takto navázané bakterie přitahují monocyty a navozují tím tvorbu tkáňového faktoru (TFA) a cytokinů (Veltrop a kol. 2000). Mediátory zánětu následně aktivují koagulační kaskádu, přitahují a aktivují krevní destičky. Dochází k indukci okolní tkáně k produkci cytokinů, TFA a integrinů. Tento mechanismus podporuje růst vegetace, ve které jsou bakterie chráněny před obrannými mechanismy imunitního systému hostitele (Bancsi a kol. 1996). Patogeneze streptokokové a stafylokokové IE se však může výrazně lišit (Obr. 1). Zatímco streptokoky a většina dalších mikrobů vyžaduje k přichycení na endotel mechanické poškození srdeční tkáně, Staphylococcus aureus může napadat srdeční buňky bez předchozího mechanického poškození. V důsledku lokálního zánětu endoteliální buňky exprimují například integriny β rodiny, které jsou schopné vázat na endotelové buňky fibronektin. Fibronektin funguje jako vazebné místo pro cirkulující stafylokoky. Po adhezi dochází k pohlcení bakterie buňkami srdečního endotelu (Sinha a kol. 2000). V reakci na napadení produkují endoteliální buňky TFA a cytokiny, a tak dochází k rozšíření zánětu a růstu vegetace. Internalizované bakterie nakonec lyzují endotelové buňky pomocí proteinů, např. α hemolyzin (Moreillon a kol. 2002, Que a kol. 2005). Stafylokoková IE může v důsledku tohoto probíhat agresivněji, zatímco streptokoková probíhá spíše subakutně (Murdoch a kol. 2009).
16
Obr. 1: Bakteriální kolonizace endotelu, A) kolonizace mechanicky poškozeného endototelu streptokoky, B) kolonizace mechanicky nepoškozeného endotelu stafylokoky, převzato a upraveno podle Moreillon a Que 2004 1.1.4. Etiologie Za nejčastější původce IE byly považovány viridující streptokoky. Mnoho současných studií ovšem popisuje změnu v epidemiologii IE a za nejvíce frekventovaného původce tohoto onemocnění označuje stafylokoky (Fowler a kol. 2005, Castillo a kol. 2011). Tato změna souvisí s měnícími se rizikovými faktory vzniku IE (např. rostoucí výskyt invazivních zákroků, intravenózní narkomanie apod.), které jsou spojeny s bakteriémií způsobenou S. aureus nebo koaguláza negativními stafylokoky. Ústní (viridující) streptokoky, obsahující smíšenou skupinu organismů S. sanguinis, S. mitis, S. oralis, S. mutans a Gemella morbillorum, jsou převládajícím patogenem u komunitně získané IE (Hoen a kol. 2002, Habib a kol. 2009). Streptokoky skupiny S. bovis se vyskytují u starších pacientů a u pacientů s revmatickým onemocněním srdce (Durante-Mangoni a kol. 2008).
17
Naopak Staphylococcus aureus a koaguláza negativní stafylokoky (především S. epidermidis) se nacházejí častěji u pacientů s prostetickými chlopněmi, u nitrožilních uživatelů drog a také u pacientů podstupujících invazivní lékařské výkony (Fowler 2005, Prendergast 2006, Fernandez Guerrero a kol. 2009). Jako třetí nejčastější původce IE jsou udávány enterokoky, především E. faecalis a E. faecium, méně často pak E. durans (Hoen 2006, Brook 2008). U pacientů s negativními výsledky hemokultur se zpravidla při kultivaci z chirurgicky odstraněné chlopně setkáváme s nutričními variantami streptokoků (Abiotrophia a Granulicatella) a s kultivačně náročnými gramnegativními bakteriemi skupiny HACEK (Haemophilus sp., Actinobacillus sp., Cardiobacterium sp., Eikenella sp., Kingella sp.). Pomocí molekulárně-biologických metod byly u IE také detekovány nekultivovatelné či obtížně kultivovatelné patogeny jako například Bartonella spp. nebo Tropheryma whipplei, které jsou zodpovědné za kultivačně negativní IE častěji, než se očekávalo (Escher a kol. 2010, Fournier a kol. 2010). Studie Geißdörfera a kol. 2012 dokonce tvrdí, že Tropheryma whipplei se vyskytuje častěji než bakterie skupiny HACEK či Coxiella burnetii. IE mykotického původu je velice vzácná, avšak je spojená s vysokou mortalitou. Izolovány bývají především Candida spp. a Aspergillus spp. (Baddley a kol. 2008, Kalokhe a kol. 2010).
18
1.2.
Streptokoky Rod Streptococcus tvoří skupinu grampozitivních, fakultativně anaerobních,
kataláza negativních koků seskupujících se do dvojic nebo řetízků. Z taxonomického hlediska je rod Streptococcus zařazen do čeledi Streptococcaceae, řádu Lactobacillales, třídy Bacilli a kmenu Firmicutes (http://www.bacterio.cict.fr). První klasifikaci streptokoků provedl počátkem 20. století Shottmuller. Podle hemolytických vlastností kolonií na krevním agaru rozdělil kmeny na hemolytické a nehemolytické (Shottmuller 1903). Na počátku 30. let 20. století Rebecca Craighill Lancefieldová zavedla klasifikaci streptokoků založenou na přítomnosti a typu povrchového antigenu (tzv. polysacharid C) (Lancefield 1933). Dalším krokem k bližší identifikaci streptokoků bylo jejich rozdělení do čtyř skupin na pyogenní, viridující, mléčné a enterokoky. Toto dělení bylo založeno na typu hemolýzy, antigenní skupině a výsledku fenotypových testů (Sherman 1937). V 80. letech pak došlo k vyčlenění enterokoků a mléčných streptokoků do samostatných rodů Enterococcus (Schleifer a Kilpper-Balz 1984) a Lactococcus (Schleifer a kol. 1985). V nomenklatuře a taxonomii rodu Streptococcus došlo od této doby k řadě dalších změn. V současnosti je klasifikace streptokoků založena na několika diagnostických kriteriích: na typu hemolýzy na krevním agaru, na výsledcích biochemických testů, na antigenním složení buněčné stěny a s rozvojem molekulárně biologických metod také na fylogenetické analýze sekvence genu 16S rDNA (Facklam 2002).
1.2.1. Identifikace streptokoků pomocí fenotypových metod V diagnostických mikrobiologických laboratořích se k identifikaci streptokoků využívají především kultivační a biochemické metody. Odlišení streptokoků od jiných grampozitivních koků se provádí na základě katalázového testu a růstu na žluč-eskulinové půdě nebo půdě s 6 % NaCl. Pro klinické laboratoře i taxonomické účely je jedním z nejužitečnějších fenotypových znaků streptokoků růst kolonií na krevním agaru. Streptokoky se dle růstu na krevním agaru řadí do tří skupin: streptokoky s neúplnou hemolýzou
(alfa-hemolýza),
streptokoky
s úplnou
hemolýzou
(beta-hemolýza)
a nehemolytické streptokoky (gama-hemolýza). V závislosti na typu hemolýzy se používají k identifikaci další fenotypové testy (viz Schéma 1). Beta-hemolytické streptokoky lze dále členit dle typu antigenu (podle Lancefieldové) do skupin A–Z. Pro streptokoky s neúplnou
19
nebo žádnou hemolýzou se toto členění nevyužívá, jelikož mohou postrádat specifický polysacharid C. Kromě zástupců beta-hemolytických streptokoků produkujících pravidelně pouze jednu antigenní skupinu (S. pyogenes a S. agalactiae) a druhu S. pneumoniae je nutné pro identifikaci použít řadu biochemických testů, které jsou v současnosti obsaženy v komerčních soupravách (např. API 20 Strep, STREPTOtest).1 Přesná identifikace především nehemolytických streptokoků však bývá často problematická. Základním úskalím identifikace je velký počet druhů vzhledem k omezenému počtu biochemických testů, které lze analyzovat, variabilita fenotypových vlastností v rámci druhu a špatná reprodukovatelnost některých testů (Ruoff a kol. 2003).
Grampozitivní koky
+
Stafylokoky
Katalázový test
+
Žluč-eskulin, Slanetz-Bartley
Enterokoky
Krevní agar
α-hemolýza
β-hemolýza
γ-hemolýza Nehemolytické streptokoky
Optochinový test
+
PYR test
+
S. pneumoniae
Viridující streptokoky
-
CAMP test
+
S. pyogenes
Biochemické testy
S. agalactiae
NonA-nonB streptokoky
Další sérologické testy
Schéma 1: Schématické znázornění fenotypové identifikace streptokoků
1
Motlová J.: Kam spěje taxonomie rodů Streptococcus a Enterococcus. I. část. Zprávy CEM 2003, 12 (7)
20
U významných klinických diagnóz zasílají klinické laboratoře izolované kmeny streptokoků
pro
verifikaci
nebo
identifikaci
do
Národní
referenční
laboratoře
pro streptokoky a enterokoky2. V této laboratoři pracují se dvěma vybranými komerčními identifikačními soupravami pro druhovou identifikaci s určením sérologické skupiny a s dodatkovými testy zahrnujícími molekulárně-biologické metody. Jako velice užitečné se ukázalo zejména sekvenování genu 16S rDNA (Hoshino a kol. 2005).
1.2.2. Klinicky významné streptokoky a jim příbuzné druhy V následujících kapitolách budou představeny klinicky významné streptokoky. Kromě zástupců rodu Streptococcus zde budou zmíněny nutriční varianty streptokoků, tj. rody Abiothrophia a Granulicatella a streptokokům příbuzné rody Gemella sp. a Facklamia sp. Všichni uvedení zástupci byli nalezeni ve spojitosti s IE. U jednotlivých zástupců a jim příbuzných mikroorganismů je uvedeno spektrum onemocnění, která mohou způsobovat, a faktory virulence, jež mají na svědomí kolonizaci a růst bakterií v místě infekce a mohou tak hrát roli při vzniku IE. Faktory virulence jsou zmíněny v různém rozsahu, jelikož nejsou u všech druhů vždy dobře prostudovány.
1.2.2.1.
Beta-hemolytické streptokoky
Beta-hemolytické streptokoky se klasifikují na základě antigenních rozdílů buněčné stěny do skupin podle Lancefieldové. Ačkoliv největší význam v humánní medicíně mají streptokoky skupiny A a B, zvyšuje se v poslední počet případů onemocnění způsobených i ostatními skupinami, tzv. non-A, non-B streptokoky (Broyles a kol. 2009). V tabulce 2 jsou uvedeny biochemické reakce sloužící k identifikaci klinicky významných betahemolytických streptokoků. Tab. 2: Identifikace beta-hemolytických streptokoků, upraveno podle Facklam 2002 Skupina A B
Bac + -
PYR + -
Cam +
Vp -
Hip +
Arg + +
Esc v -
Str -
Sbl -
Tre n n
Rib n
S. pyogenes S. agalactiae S. dysgalactiae A,C,G,L + + v + + subsp. equisimilis S. equi C + v + + v n subsp.zooepidemicus A,C,G,F, Skupina S. + + + + n žádný anginosus a Zkratky: Bac – bacitracinový test; PYR – přítomnost pyrrolidonylarylamidázy; Cam – CAMP test; Vp Voges-proscauer test; Hip – hydrolýza hipurátu; Arg – deaminace argininu; Esc, Str – hydrolýza eskulinu, škrobu; Sbl, Tre, Rib – tvorba kyseliny ze sorbitolu, trehalózy, ribózy; + pozitivní reakce, - negativní reakce, v variabilní, n – nelze použít a Beta-hemolýzu vykazují pouze některé kmeny této skupiny 2
http://www.szu.cz/narodni-referencni-laborator-pro-streptokoky-a-enterokoky
21
1.2.2.1.1. Streptococcus pyogenes S. pyogenes patří mezi jednoho z nejdůležitějších bakteriálních patogenů. Způsobuje hnisavé infekce postihující sliznice, kůži i vnitřní vrstvy tkáně. S. pyogenes je nejčastějším původcem faryngitidy a tonsilitidy. Infekce mohou mít mírný až velmi těžký průběh. U disponovaných jedinců se mohou objevit vážné pozdní následky, revmatická horečka či akutní glomerulonefritida. Endokarditida způsobená S. pyogenes se vyskytuje poměrně vzácně, podíl je menší než 5 % ze všech dokumentovaných případů IE (Branch a kol. 2010). Popsány byly případy endokarditidy u dětí po infekci virem Varicella zoster a u intravenózních narkomanů, ale i u pacientů bez rizikových faktorů (Barg a kol. 1985, Tyrrel a kol. 2005, Branch a kol. 2010). Faktory virulence S. pyogenes se uplatňují v jednotlivých fázích patogeneze, tedy od adheze až po utlumení imunitního systému. Počáteční kontakt mezi S. pyogenes a hostitelskou buňkou je zprostředkován interakcí mezi bakteriálními adheziny a buněčnými receptory, jako jsou integriny, fibrinogenem (Sanford a kol. 1982), kolagenem (Visai a kol. 1995) a proteiny extracelulární matrix (Valentin-Weigand a kol. 1988). Hlavní faktor virulence představuje M protein. Tento povrchový antigen a jemu podobné proteiny umožňují interakci mezi patogenem a imunitním systémem hostitele (Pérez-Caballero a kol. 2004). M protein blokuje vazbu komplementu, čímž chrání streptokoka před fagocytózou (Carlsson a kol. 2005), a je také silným startovacím impulsem zánětlivé reakce, která může přispět k vážným pozdním následkům streptokokové infekce (Pahlman a kol. 2006). Roli při rozvoji infekce hrají také streptolyziny S a O (Nizet 2002) a superantigeny, které vazbou na MHC II receptory aktivují T-lymfocyty, což vede k nekontrolovanému uvolňování prozánětlivých cytokinů (Fraser a kol. 2000). Šíření patogena je zajištěno díky produkci lytických enzymů. Hostitelské tkáně jsou narušovány proteázami SpeB (Chiang Ni a Wu 2008), hyaluronidázou (Hynes a kol. 2000) a také vlastními proteázami aktivovanými prostřednictvím bakteriální streptokinázy (Bergman a Hamerschmit 2007). S. pyogenes se řadí do skupiny A podle Lancefieldové (GAS, group A streptococcus). Pouze vzácně mohou mít skupinu A další streptokoky (např. S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. anginosus, S. constellatus subsp. constellatus). Odlišení S. pyogenes od ostatních streptokoků je možné pomocí bacitracinového testu a PYR testu, které má S. pyogenes jako jediný beta-hemolytický streptokok pozitivní (Facklam 2002).
22
1.2.2.1.2. Streptococcus agalactiae S. agalactiae kolonizuje gastrointestinální a genitourinární trakt u 10–30 % zdravých jedinců (Manning a kol. 2004, Namavar Jahromi a kol. 2008). Jako patogen se nejčastěji spojuje s novorozeneckou meningitidou, sepsí a komplikacemi v šestinedělí (McDonald a Chambers 2000, Phares a kol. 2008). U dospělých jedinců, především u starších lidí, diabetiků, osob se srdečním onemocněním či imunusuprimovaných pacientů, může vyvolávat invazivní onemocnění (Phares a kol. 2008). Případy IE způsobené S. agalactiae představují pouze 1 % všech případů. Vyznačují se rychlým nástupem a agresivním průběhem onemocnění často vedoucím k srdečnímu selhání. Postiženi bývají starší pacienti s chronickým onemocněním srdce a popsán byl také případ IE vyvolané S. agalactiae po umělém přerušení těhotenství (Palys a kol. 2006, Ivanova Gregorieva 2010). Faktory virulence nejsou popsány tak dobře jako u S. pyogenes. S. agalactiae kóduje množství adhezinů zodpovědných za interakci s eukaryotickými buňkami. Mezi tyto adheziny se řadí proteiny vázající se na fibrin, fibrinogen (Schubert a kol. 2004) a laminin (Spellerberg a kol. 1999), Srr protein umožňující vazbu na keratin (Samen a kol. 2007), povrchové struktury podobné pilusu (Lauer a kol. 2005) a proteiny αC a jim podobné (Baron a kol. 2004). S. agalactiae produkuje také toxiny tvořící póry, hemolyzin a CAMP faktor (Nizet 2002, Lang a Palmer 2003), a látky zmírňující imunitní odpověď (Bohnsack a kol. 1997). U CAMP faktoru však zůstává role v patogenezi nejasná (Hensler a kol. 2008). S. agalactiae je jediným zástupcem antigenní skupiny B. Na krevním agaru vykazuje charakteristický růst, kdy jsou kolonie ohraničené jen úzkou zónou betahemolýzy. Tato reakce společně s průkazem antigenní skupiny B, hydrolýzou hippurátu a pozitivním CAMP testem slouží k přesné identifikaci S. agalactiae.
1.2.2.1.3. Streptococcus dysgalactiae Tento druh je rozdělen do dvou poddruhů, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae (SDSD) a Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (SDSE). První jmenovaný náleží do skupiny C podle Lancefieldové, neřadí se mezi beta-hemolytické druhy a dosud nebyl izolován z klinického materiálu (Vandamme 1996). SDSE je betahemolytický streptokok charakteristický tvorbou velkých kolonií, nejčastěji se řadí do skupiny C a G, vzácně A, L. Na rozdíl od SDSD se jedná o patogenní druh vyvolávající široké spektrum onemocnění, která se klinickým projevem podobají infekcím způsobeným S. pyogenes (Brandt a Spellerberg 2009). 23
SDSE způsobuje různá onemocnění, spektrum sahá od neškodných povrchových kožních infekcí až po život ohrožující streptokokový syndrom toxického šoku. SDSE způsobuje především infekce kůže a měkkých tkání (Broyles a kol. 2009). Závažné infekce často postihují injekční uživatele drog a starší imunosuprimované pacienty. Invazivní infekce
zahrnují
například
artritidy,
osteomyelitidy,
meningitidy,
endokarditidy,
puerperální septikémie, neonatální infekce a jiné (Brandt a Spellerberg 2009). IE vyvolaná SDSE se vyskytuje vzácně, popsáno bylo jen několik případů. Toto onemocnění má na rozdíl od IE způsobené viridujícími streptokoky většinou akutní nástup spojený s neurologickými a kardiologickými komplikacemi (Erdem a kol. 2003). U SDSE bylo objeveno několik podobných faktorů virulence jako u druhu S. pyogenes, což může vysvětlovat podobné spektrum onemocnění, které tyto druhy způsobují. Faktory virulence SDSE zahrnují adheziny, toxiny a další faktory důležité pro šíření lidskými tkáněmi a zasahování do imunitní odpovědi hostitele. Stejně jako u jiných streptokoků byly u SDSE popsány proteiny vázající se na fibronektin (Lindgren a kol. 1994) a prokázal se jejich význam při vazbě streptokoků na lidské fibroblasty (Kline a kol. 1996). Dále SDSE produkují proteiny vázající se na plazmin (Pancholi a Fischetti 1998). Kromě interakce s fibronektinem a plazminem se SDSE také specificky váže na lidský protein S vitronektin (Chhatwal a kol. 1987), čímž dochází k adhezi na epiteliální a endotelové buňky (Valentin-Weigant a kol. 1988). Podobně jako S. pyogenes kódují některé kmeny SDSE exotoxiny a superantigeny (Kalia a Bessen 2003, Igwe a kol. 2003), ovšem zatím nejsou k dispozici údaje o jejich funkci. Odolnost vůči fagocytóze u kmenů S. pyogenes je primárně zprostředkována M proteinem, který se také nachází u lidských izolátů SDSE a má tedy pravděpodobně podobnou úlohu (Schnitzler a kol. 1995).
1.2.2.1.4. Streptococcus equi Beta-hemolytický druh Streptococcus equi se řadí do skupiny C podle Lancefieldové a dělí se na dva poddruhy. Streptococcus equi subsp. equi patří mezi patogeny zvířat, především koní. Naopak Streptococcus equi subsp. zooepidemicus kromě onemocnění zvířat způsobuje také různě závažné infekce u lidí. Byly popsány případy meningitidy, zápalu plic, septické artritidy, zánětu ledvin a endokarditidy (MartinezLuengas a kol. 1982, Latorre a kol. 1993, Balter a kol. 2000). Přenos na člověka je spojován s kontaktem s koňmi a konzumací nepasterizovaného mléka (Barnham a kol. 1983, Kuusi a kol. 2006).
24
S. equi subsp. zooepidemicus má na svém povrchu antigenně proměnný protein (Szp), který stimuluje opsonizační ochranné protilátky a sdílí některé strukturální rysy s M proteinem druhu S. pyogenes. Ačkoli tento protein nemá významnou sekvenční homologii k M-proteinu, spekuluje se o jeho roli v obraně proti fagocytóze (Nicholson a kol. 2000). Dále se ukázalo, že S. equi produkuje superantigeny (Alber a kol. 2005) a proteiny vázající fibronektin (Lindmark a kol. 1996). O dalších faktorech ovlivňujících virulenci se toho ví málo. Předpokládá se však, že zde hraje roli horizontální genetická výměna se silně patogenním druhem S. pyogenes (Holden a kol. 2009).
1.2.2.2.
Non-beta-hemolytické streptokoky
Takto se označují streptokoky vyznačující se částečnou nebo žádnou hemolytickou aktivitou. Pro streptokoky, u kterých je pozorována částečná hemolýza, se používá označení viridující, a to z důvodu produkce zeleného zabarvení krevního agaru (dochází ke změně červeného krevního barviva na zelený verdoglobin). Členění dle antigenních skupin podle Lancefieldové se u většiny těchto streptokoků nepoužívá. Odlišovány bývají na základě biochemických testů. V tabulce 3 jsou uvedeny pouze druhy významné v klinické mikrobiologii.
Tab. 3: Identifikace non-beta-hemolytických streptokoků, upraveno podle Facklam 2002 Antigen Opt BS BE Na Pyr Esc Vp Man Mel Sbl Tre St Dx S. pneumoniae Pn + + v + v S. gallolyticus D + + + + + + + + S.pasteurianus D + + + + + S. infantarius D (v) v + + + Viridující A,C,G,F, v v v v v v v v streptokoky žádný Zkratky: Opt optochin, BS rozpustnost ve žluči, BE žluč-eskulin, Na růst na 6,5 % NaCl, Pyr přítomnost pyrrolidonylarylamidázy, Esc hydrolýza eskulinu, Vp Voges-proscauer test, Man, Mel, Sbl, Tre acidifikace mannitolu, melibiozy, sorbitolu a trehalózy, St hydrolýza škrobu, Dx produkce extracelulárního pylysacharidu , + pozitivní reakce, - negativní reakce, v variabilní
1.2.2.2.1. Streptococcus pneumoniae Streptococcus
pneumoniae
neboli
pneumokok
je
nejčastějším
původcem
komunitního zánětu plic/pneumonie, bakteriální meningitidy, bakteriémie a zánětu středního ucha. Rovněž se může podílet na zánětu vedlejších nosních dutin, septické artritidě, osteomyelitidě a peritonitidě (Ruoff a kol. 2003). Pneumokoková endokarditida je vzácné onemocnění. Větší počet případů byl pozorován pouze v populaci Inuitů na Aljašce a v Grónsku (Madsen a kol. 2009). V případě výskytu se jedná o akutní a závažné
25
onemocnění, které může být doprovázeno purulentní meningitidou, rychlým poškozením chlopně či srdečním selháním (Uemura a kol. 2001). Pneumokok má mnoho faktorů virulence. K nejdůležitějším patří polysacharidové pouzdro, které chrání bakterii před fagocytózou (Jonsson a kol. 1985). Pouzdro má zásadní význam pro kolonizaci, brání mechanickému odstranění hlenem (Nelson a kol. 2007), a může také omezit autolýzu a chránit buňku před účinkem antibiotik (van der Poll a Opal 2009). Důležitou roli má hemolytický enzym, pneumolyzin. Dříve se mělo za to, že se tento toxin uvolňuje jen při autolýze buňky (Berry a kol. 1989), ovšem nové studie ukázaly, že se pneumolyzin může uvolňovat i nezávisle na hlavním autolyzinu (Balachandran a kol. 2001). Jeho hlavní význam spočívá v jeho lytické aktivitě a schopnosti aktivace komplementu. Autolyzin, enzym štěpící buněčnou stěnu, zodpovídá za buněčnou autolýzu, při které dochází k uvolňování pneumolyzinu a jiných bakteriálních složek působících prozánětlivě (Berry a kol. 1989). Nezbytnou roli pro adhezi a kolonizaci hostitele mají povrchové proteiny (např. povrchový adhezin A, cholin vázající protein A) (Talkington a kol. 1996, Rosenow a kol. 1997). Pneumokokový povrchový protein zajišťuje plnou virulenci pneumokoka. Tento protein zasahuje do komplementového systému (Tu a kol. 1999) a váže se na laktoferin, který má významnou roli v obraně sliznic (Hammerschmidt a kol. 1999). Průnik pneumokoka do tkání zajišťují invaziny hyaluronidáza a neuraminidáza. Hyaluronidáza rozkládá kyselinu hyaluronovou, která je součástí pojivové tkáně. Neuraminidáza odštěpuje kyselinu N-acetylneuraminovou z různých molekul (glykolipidů, lipoproteinů), čímž poškozuje tkáně a odkrývá potenciální vazebná místa pro pneumokoka (Mitchell a Mitchell 2010). Studie Barocchi a kol. 2006 a Bagnoli a kol. 2008 prokázaly přítomnost pilusů, které zprostředkovávají vazbu na hostitelskou buňku a stimulují produkci prozánětlivých cytokinů. Podle fenotypových testů se pneumokok řadí do skupiny S. mitis. Na základě antigenní struktury pouzderného polysacharidu lze rozlišit okolo 90 sérotypů (Henrichsen 1995). V ideálním případě se S. pneumoniae identifikuje pomocí sérologických metod, popřípadě lze identifikaci provést na základě stanovení citlivosti k optochinu nebo rozpustnosti ve žluči (Facklam 2002).
26
1.2.2.2.2. Skupina Streptococcus bovis Skupina Streptococcus bovis/Streptococcus equinus je rozsáhlým bakteriálním komplexem zahrnujícím různé druhy izolované z klinického materiálu lidí i zvířat. Mezi lidské patogeny se řadí druhy Streptococcus gallolyticus (označován také S. bovis biotyp I) a Streptococcus infantarius (S. bovis biotyp II). Zástupci této skupiny bývají často spojováni s rakovinou tlustého střeva a konečníku, subakutními endokarditidami a izolováni byli také u pacientů s meningitidou (Gupta a kol. 2010, Sturt a kol. 2010). V mnoha studiích se potvrdil vztah mezi bakteriémií nebo endokarditidou způsobenou S. bovis (především S. gallolyticus subsp. gallolyticus) a nádory gastrointestinálního traktu (Corredoira a kol. 2008, Gupta a kol. 2010). Přesný mechanismus patogeneze S. bovis zůstává nejasný. Studie srovnávající různé genomy kmenů S. bovis naznačují, že jejich patogenita je velmi rozmanitá (Hinse a kol. 2011). Roli zde pravděpodobně hrají stejně jako u jiných streptokoků povrchové proteiny, které umožňují vazbu na receptory hostitelské buňky (Sillanpӓӓ a kol. 2008). Tyto většinou nehemolytické streptokoky se řadí do sérologické skupiny D a identifikace probíhá na základě reakcí uvedených v Tab. 3. 1.2.2.2.3. Viridující streptokoky Viridující streptokoky jsou rozmanitou skupinou organismů, jejíž zástupci mohou být jak komenzály, tak patogeny člověka. Taxonomická klasifikace těchto streptokoků není dobře definována a pro zjednodušení jsou rozděleni do několika skupin podle fenotypových vlastností: o skupina S. mutans o skupina S. mitis o skupina S. sanguinis o skupina S. salivarius o skupina S. anginosus (pro variabilitu v hemolýze uváděna i samostatně) Fenotypové testy ovšem vždy neumožňují přesnou identifikaci některých druhů této heterogenní skupiny (Brigante a kol. 2006). Většina druhů viridujících streptokoků tvoří součást běžné flóry dutiny ústní, nosohltanu, gastrointestinálního traktu a genitálního traktu žen. Zpravidla nejsou vnímány jako mikroorganismy s vysokým patogenním potenciálem, ale mohou způsobovat infekce spojené s významnou nemocností a úmrtností. Viridující streptokoky mohou vyvolat onemocnění u zdravých jedinců, ovšem nejčastěji se projevuje u predisponovaných
27
pacientů se sníženou imunitou nebo srdečními abnormalitami (Doern a Burnham 2010). Význam mají také u pacientů s leukémií, neutropenií a zhoubnými nádory (Paganini a kol. 2003). Viridující streptokoky jsou často spojovány s fokálními infekcemi odontogenního původu. Jedná se o infekce postihující různé orgánové systémy, které jsou vyvolány mikroorganismy obývajícími dutinu ústní. Fokální infekci předchází bakteriémie, která může vzniknout po zubním ošetření, orální infekci či z důvodu špatné ústní hygieny. Mezi nejběžnější fokální infekce způsobené viridujícími streptokoky patří bakteriální endokarditidy (Gendron a kol. 2000). Vzhledem k relativní avirulenci vyvolávají viridující streptokoky především subakutní IE, u níž je na rozdíl od akutní IE nástup onemocnění pomalý. Stejně jako u jiných původců IE dochází k poškození chlopní, ovšem komplikace, jako renální selhání či septický šok, se vyskytují méně často a prognóza onemocnění bývá příznivější než u akutní IE (López a kol. 2005). Viridující streptokoky se většinou řadí mezi organismy s nízkou virulencí a vážná onemocnění způsobují obvykle jen v případě poškození ústní sliznice u osob s narušenou imunitou. Mechanismus patogeneze není dosud zcela objasněn. Jako faktory virulence pravděpodobně mohou sloužit faktory, které streptokoky jako komenzálové využívají při kolonizaci sliznic (Mitchell 2011). Důležitou fází kolonizace i patogeneze je adheze streptokoků na tkáně pomocí adhezinů vázajících se na povrchové receptory hostitelských buněk. Popsány byly adheziny pro kolagen (Abranches a kol. 2011), fibronektin (Lowrance a kol. 1990), fibrinogen a fibrin (Burnette-Curley a kol. 1995). Dále byla zjištěna také schopnost aktivace lidského plasminogenu, která má význam pro diseminaci infekce, ačkoliv tato schopnost byla původně přisuzována pouze typickým patogenním druhům jako S. pneumoniae (Itzek a kol. 2010). Vliv na virulenci viridujících streptokoků může mít také přirozená schopnost genetické transformace, díky které může docházet k přenosu genů kódujících faktory virulence (Havarstein a kol. 1997). Tyto streptokoky se odlišují na základě biochemických testů, viz Tab. 4.
28
Tab. 4: Identifikace hlavních skupin viridujích streptokoků, upraveno podle Facklam 2002 Skupina mutans S. mutans S. sorbinus S. cricetus S. ratti Skupina salivarius S. salivarius S. vestibularis Skupin anginosus S. anginosus S. intermedius S. constellatus Skupina sanguinis S. sanguinis S. parasanguinis S. gordonii Skupina mitis S. mitis S. oralis S. cristatus S. infantis S. peroris
Arginin
Eskulin
Vogas-Proskauer
Mannitol
Sorbitol
Urea
+
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
-
-
+ v
+ v
-
-
v +
+ + +
+ + +
+ + +
-
-
-
+ + +
+ v +
-
-
v v
-
+ -
v -
-
-
v -
-
-
-
-
-
-
-
Pozn. + pozitivní reakce, - negativní reakce, v – variabilní
1.2.2.2.4. Skupina Streptococcus anginosus Tato skupina označována také jako S. milleri zahrnuje tři druhy: Streptococcus anginosus, Streptococcus intermedius a Streptococcus constellatus. Klasifikace těchto druhů není jednoduchá, jelikož jsou popsány kmeny alfa i beta-hemolytické. U některých kmenů lze identifikovat jeden ze skupinových antigenů F, C, G, nebo A. Skupina S. anginosus se nachází jako komenzál v ústní dutině, horních dýchacích cestách, gastrointestinálním traktu a ve vagině (Poole a Wilson 1979). Jako patogeny byly izolovány z hnisavých abscesů mozku, plic, zubů a jater (Nisbet a Thomas 2005, Maliyil a kol. 2011). Na rozdíl od jiných viridujících streptokoků není skupina S. anginosus běžně spojována s IE. V porovnání jednotlivých druhů této skupiny se častěji vyskytují případy IE způsobené S. anginosus, méně pak S. constellatus a S. intermedius (Woo a kol. 2004). Je zde několik patogenních faktorů: extracelulární enzymy, mezi které se řadí hyaluronidáza, DNáza, gelatináza a kolagenáza (Ruoff a Ferraro 1987), a imunosupresivní látky (Arala-Chaves a kol. 1979). Roli ve virulenci hraje i spolupráce s anaerobními bakteriemi, které mohou stimulovat jejich růst a potlačovat baktericidní aktivitu hostitele
29
(Shinzato a Saito 1994). Zkoumán je také patogenní potenciál opouzdřených zástupců skupiny S. anginosus (Kanamori a kol. 2004). Skupinu S. anginosus lze odlišit od dalších viridujících streptokoků na základě biochemických reakcí uvedených v Tab. 4. 1.2.2.3.
Nutriční varianty streptokoků
1.2.2.3.1. Abiotrophia a Granulicatella Nutriční varianty streptokoků (NVS) byly poprvé izolovány v roce 1961 u pacientů s endokartitidou a otitidou (Frenkel a Hirsch 1961). Jedná se o nutričně náročné mikroorganismy, které ke svému růstu vyžadují cystein nebo pyridoxal (vitamín B6). Na krevním agaru rostou v podobě tzv. satelitového fenoménu. Původně se řadily do druhů Streptococcus defectivus a Streptococcus adiacens. Na základě fylogenetické analýzy genu 16S rDNA byly později přeřazeny do nově vytvořeného rodu Abiotrophia, z kterého se následně vyčlenilo několik zástupců do rodu Granulicatella (Collins a Lawson 2000). Stejně jako orální streptokoky tvoří NVS součást normální bakteriální mikroflóry dutiny ústní (Aas a kol. 2005). Nejčastěji popisovanou infekcí způsobenou NVS je infekční endokarditida. Postiženy mohou být nativní chlopně i chlopenní náhrady (Jeng a kol. 2005). Průběh onemocnění se podobá IE způsobené viridujícími streptokoky, avšak léčba bývá složitější a častěji se vyskytují komplikace (např. embolizace) (Stein a Nelson 1987). Kromě endokarditid byly NVS izolovány i u jiných infekcí, například z mozkového abscesu, u konjuktivitidy, u poporodních sepsí, cirhózy nebo abscesů slinivky břišní (Barrios a Bump 1986, Biermann a kol. 1999). U některých z výše uvedených případů byly současně s NVS izolovány i další bakterie, takže patogenní role NVS není zcela prokazatelná. Studium mechanismu patogeneze NVS je teprve na počátku. Předmětem studia byla zatím schopnost NVS adherovat na extracelulární matrix hostitele. Schopnost adheze se lišila především mezi kmeny. Kmeny izolované od pacientů s infekční endokarditidou většinou vykazovaly schopnost silné vazby k fibronektinu, na rozdíl od kmenů izolovaných z ústní dutiny zdravých jedinců (Okada a kol. 2000, Senn a kol. 2006). Jednotlivé druhy NVS se odlišují na základě biochemických reakcí uvedených v Tab. 5.
30
Tab. 5: Biochemická identifikace NVS, upraveno podle Facklam 2002 Pul Suc Tag Tre Hip Arg α-Gal β-Glu β-Gal Abiotrophia defectiva + + V + + + Granulicatella adiacens + + + Granulicatella + para-adiacens Granulicatella elegans + + + Zkratky: Pul, Suc, Tag, Tre – produkce kyseliny z pululanu, sukrózy, tagatózy, trehalózy, Hip – hydrolýza hippurátu, Arg – deaminace argininu, α-Gal – produkce α-galaktozidázy, β-Glu – produkce βglukuronidázy, β-Gal – produkce β-galaktozidázy, + pozitivní reakce, - negativní reakce, v variabilní
1.2.2.4.
Další grampozitivní koky
1.2.2.4.1. Rod Gemella Rod Gemella původně zahrnoval pouze druh Gemella haemolysans (dříve Neisseria haemolysans) (Berger 1961), později zde byl přiřazen druh Gemella morbillorum, původně Streptococcus morbillorum (Kilpper-Baltz a Schleifer 1988). V současné době rod zahrnuje sedm druhů (http://www.bacterio.cict.fr/g/gemella.html). Tyto druhy se uplatňují jako komenzálové sliznic lidí i zvířat. Mohou ovšem vyvolávat vážné lokální i generalizované infekce lidí, zejména u imunokompromitovaných jedinců. Většinu případů infekcí způsobených druhy rodu Gemella tvoří endovaskulární infekce, zvláště endokarditidy. Většinou se jedná o subakutní onemocnění. Postiženy bývají především nativní chlopně. Popsány byly případy IE způsobené druhy G. morbillorum, G. haemolysans, G. bergeriae a G. sanguinis (La Scola a Raoult 1998, Elsayed a Zhang 2004, Hull 2010). 1.2.2.4.2. Rod Globicatella Rod Globicatella zahrnuje lidské kmeny původně řazené do rodu Streptococcus uberis. Patogenní role zástupců rodu Globicatella je známa jen částečně, kvůli potížím s identifikací. Kmeny G. sanguinis byly izolovány z hemokultur pacientů s bakteriémií, sepsí, meningitidou a endokarditidou (Shewmaker a kol. 2001, Lau a kol. 2006, HéryArnaud 2010). Ukázalo se také, že se mohou vyskytovat jako komenzálové v trávicím traktu (Héry-Arnaud 2010). 1.2.2.4.3. Rod Facklamia Rod popsaný v nedávné době především na základě genetické analýzy není příliš dobře prostudován. Zástupci rodu Facklamia byli získáni z různých zdrojů. Čtyři ze šesti dosud popsaných druhů (F. hominis, F. ignova, F. languida, F. sourekii) byly izolovány z klinického materiálu (zejména z krve od pacientů s bakterémií a sepsí a hnisu odebraných z abscesů) a do druhu F. sourekii byly navíc přeřazeny humanní izoláty z druhu Str. acidominimus (Collins a kol. 1997, Collins a kol. 1999, Lawson 1999, 31
LaClaire a Facklam 2000). Přirozený výskyt druhů rodu Facklamia není objasněn, ale předpokládá se, že by se mohly vyskytovat především v genitourinárním traktu žen (LaClaire a Facklam a kol. 2000). 1.2.3. Streptokoky jako původci IE Četnost výskytu jednotlivých streptokoků jako původců IE se značně liší (Tab. 6). Také průběh onemocnění závisí na daném druhu streptokoka. Subakutní IE, tedy IE s pomalejším průběhem, jsou způsobeny běžnými neinvazivními patogeny, tj. především viridujícími streptokoky (až 60 % subakutních IE). Ty současně patří mezi nejčastější původce streptokokové IE. V posledních letech se zvyšuje počet případů IE způsobených zástupci skupiny S. bovis, a to především poddruhem S. gallolyticus subsp. gallolyticus (Hoen a kol. 2002). S. bovis způsobuje IE spíše u starších pacientů a často bývá postiženo více chlopní (Durante-Mangoni a kol. 2008, Correidoira a kol. 2008). Méně často může být subakutní IE vyvolána NVS, ovšem má těžší průběh, než je tomu u viridujících streptokoků, a ačkoliv vegetace bývá srovnatelně menší, tak běžně v těchto případech dochází k embolizaci a až u 41 % případů k recidivě (Stein a Nelson 1987). Běžné patogeny S. pyogenes, S. agalactiae a S. pneumoniae vyvolávají celou řadu různých onemocnění. S IE jsou tyto patogeny spojovány jen zřídka, ovšem v případě jejich výskytu je průběh IE velmi závažný. Většinou jsou postiženi pacienti s přidruženým onemocněním (např. diabetes) (Ivanova Georgieva a kol. 2010). Vývoj onemocnění bývá většinou rychlý a agresivní. Obvykle nejsou nalézány typické příznaky IE, což komplikuje a oddaluje stanovení diagnózy a zahájení léčby. Kromě toho se často objevují komplikace jako např. srdeční selhání či cévní mozková příhoda. Mortalita IE způsobená těmito druhy streptokoků se pohybuje okolo 40 % (Uemura a kol. 2001, Ivanova Georgieva a kol. 2010). Tab. 6: Zastoupení jednotlivých skupin streptokoků jako původců IE Hoen a kol. 2002 Muňoz a kol. 2012 n= 196
n= 47
Viridující streptokoky
33 % (64)
53 % (25)
Skupina S. bovis
50 % (98)
17 % (8)
S. agalactiae
8 % (16)
13 % (6)
S. dysgalactiae subsp. equisimilis
2 % (4)
-
S. pneumoniae
2 % (4)
4 % (2)
S. pyogenes
1 % (2)
2 % (1)
4 % (8)
11 % (5)
a
Ostatní
n – celkový počet streptokoků, a – NVS, Gemella sp.
32
1.3.
Mikrobiologická diagnostika IE Rychlé určení diagnózy má pro pacienty s IE klíčový význam pro včasné zahájení
cílené léčby a prognózu onemocnění. Velká rozmanitost symptomů a nedostatečná senzitivita a specificita používaných metod má za následek pozdě nebo nepřesně stanovenou diagnózu. Důležitou úlohu pro určení diagnózy a následnou léčbu hraje především identifikace etiologického agens pomocí kultivačních metod z krve, popřípadě lze využít excidované části chlopně, emboly nebo hnis z metastatických abscesů (Beneš a kol. 2007). V případě chirurgického zákroku, kdy dojde k odstranění a náhradě infikované chlopně, může být diagnóza IE potvrzena histologickým vyšetřením chlopně. Pomocí této metody lze posoudit, zda se jedná o akutní, subakutní nebo v minulosti prodělanou IE (Greub a kol. 2005). Metoda ovšem neumožňuje přesnou identifikaci agens, což může představovat problém při výběru optimální antibiotické léčby, která by měla být co nejkonkrétnější a nejúčinnější, a to nejen z důvodů měnící se epidemiologie a zvyšujícímu se počtu rezistentních kmenů, ale také kvůli tomu, že nedostatečná léčba s sebou nese riziko recidivy nebo reinfekce po výměně srdeční chlopně se špatnou prognózou (David a kol. 2007, Musci a kol. 2010). Z těchto důvodů se kromě kultivačních metod stále častěji začínají v rutinní diagnostice uplatňovat molekulárně biologické metody. 1.3.1. Konvenční mikrobiologická diagnostika IE Z mikrobiologických metod se k diagnostice IE používají především kultivačně závislé metody. Důležitou součástí diagnostiky IE je odběr hemokultur, jenž se řadí mezi hlavní diagnostická kritéria a má významnou roli pro prokázání diagnózy IE (Li a kol. 2000). Avšak u podstatné části případů IE (2,5–31 %) kultivační metody selhávají a infekční agens zůstává nediagnostikováno. V mnoha kritických případech totiž bývá zahájena empirická léčba antibiotiky před určením diagnózy nebo ještě dříve, než je u pacienta uvažováno o možnosti IE (Koegelenberg a kol. 2004). Dalším důvodem selhání kultivace může být přítomnost náročného nebo dosud nekultivovaného organismu (Houpikian a Raoult 2005, Fournier a kol. 2010).
1.3.1.1.
Hemokultury
Bakteriémie je jedním z typických rysů IE a kultivace etiologického agens z krve (hemokultivace) představuje jeden ze základních kroků diagnostiky tohoto onemocnění.
33
Odběr hemokultur umožňuje jak identifikaci agens, tak i testování antimikrobiální citlivosti patogena. Při podezření na IE se odebírají tři sady hemokultur (zahrnují vzorek pro aerobní i anaerobní kultivaci) v několika časových intervalech, nejlépe před zavedením antibiotické terapie (Habib a kol. 2009). Hemokultury odebrané až po zahájení léčby antibiotiky mají značně sníženou citlivost (Koegelenberg a kol. 2004). Pro inkubaci a vyhodnocení růstu v hemokulturách se nyní používají automatizované systémy (např. Bactec, Bact/Alert). Doba kultivace běžných patogenů při použití těchto systémů nepřesahuje 5–6 dnů (Wilson a kol. 1993). Běžným problémem diagnostiky pomocí hemokultur je vysoký záchyt falešně pozitivních výsledků a s tím spojená nedostatečná specificita. Především detekce potencionálně patogenních zástupců kožní mikroflóry (koaguláza negativní stafylokoky) může být obtížně interpretovatelná. V těchto případech může s rozhodnutím pomoci poměr počtu pozitivních ze všech odebraných hemokultur (Habib a kol. 2009). Vzhledem k tomu, že IE je typická nízkou bakteriémií (Brouqui a Raoult 2006), slouží ke zvýšení citlivosti metody prodloužení doby kultivace, což ovšem zvyšuje pravděpodobnost kontaminace. Doporučuje se tedy namísto prodloužení doby kultivace spíše doplnění vyšetření jinými přístupy detekce etiologického agens (Baron a kol. 2005). 1.3.1.2.
Kultivace z chirurgického materiálu
Chirurgické odstranění infikovaného ložiska je nutné asi u 30 % pacientů s aktivní IE a 20-40 % pacientů po vyléčené infekci podstoupí náhradu chlopně. Chirurgický materiál, respektive vegetace, často obsahuje velké množství bakterií, proto je cenným materiálem pro detekci agens (Habib a kol. 2009). I tato metoda má ovšem omezenou citlivost a specificitu. Odstranění chlopně bývá prováděno většinou u pacientů s již zahájenou antibiotickou léčbou, která tak představuje jeden z hlavních důvodů falešně negativních výsledků kultivace (Renzulli a kol. 2000, Muňoz a kol. 2008). Také skutečnost, že bakterie jsou uvnitř vegetací uloženy v organizovaných společenstvech, tzv. mikrobiálním biofilmu, může vést k metabolicky méně aktivní, ale životaschopné populaci bakterií, která však není pomocí kultivačních metod detekována, jelikož v in vitro podmínkách nelze vždy navodit vhodné podmínky pro růst (Moter a kol. 2010). Roli může hrát také schopnost některých patogenů (např. S. aureus) přežívat intracelulárně, tj. uvnitř buněk endokardu, kde mají všechny dostupné živiny, ovšem na kultivačním médiu nemusí růst vůbec nebo v atypických koloniích (např.
34
small colony variants of Staphylococcus aureus), což znesnadňuje jejich identifikaci (Melter a Radojevič 2010).
1.3.1.3.
Sérologie
Sérologické metody se ukázaly být velice užitečné při diagnostice kultivačně negativních případů IE spojených s výskytem Coxiella spp., Bartonella spp. a Aspergillus spp. (Raoult a kol. 2005). Sérologický průkaz druhu Coxiella spp. je již součástí hlavních diagnostických Duke kritérií (Li a kol. 2000). Interpretace výsledků sérologických vyšetření může být v některých případech problematická. Při průkazu protilátek některých mikroorganismů může docházet ke zkřížené reaktivitě, například mezi druhy rodu Coxiella a Bartonella nebo Chlamydia a Bartonella (Maurin a kol. 1997, Graham a kol. 2000). I přes tyto obtíže může zavedení automatizovaných systémů v rutinní diagnostice pro kultivačně negativní případy vést k podstatnému zlepšení diagnostických postupů (Gouriet a kol. 2008).
1.3.2. Molekulárně-biologická diagnostika IE V klinické mikrobiologii se stále častěji využívají molekulárně-biologické metody. Použití těchto metod zejména v případě kultivačně negativních výsledků podstatně zlepšuje a urychluje diagnostiku nejen náročných, pomalu rostoucích a nekultivovatelných mikroorganismů, ale i běžných původců IE streptokoků a stafylokoků (Fournier 2010, Žaloudíková a kol. 2012). Techniky amplifikace nukleových kyselin mají teoreticky detekční limit mezi 1 až 10 mikroorganismy na reakci. Ovšem klinická senzitivita je podstatně nižší a obtížně stanovitelná. Kritickými body jsou zejména způsob extrakce DNA (záleží na technice a buněčné stěně bakterií), poměr bakteriální a eukaryotické DNA v klinickém vzorku, délka a množství amplifikovaného fragmentu a přítomnost inhibitorů Taq polymerázy (např. hemoglobin, cytostatika, heparin aj.). Při molekulárně-biologické analýze je nutné pracovat v přísně sterilních podmínkách, aby se eliminovala přítomnost kontaminujících agens v prostředí, které mohou být amplifikovány stejně jako kauzální agens (Moter a kol. 2010).
1.3.2.1.
Polymerázová řetězová reakce a sekvenace
Nejrozšířenější molekulárně-biologickou metodou využívanou v diagnostice je polymerázová řetězová reakce (PCR). Tato metoda slouží k rychlému a snadnému namnožení úseků DNA in vitro. Základní princip PCR se zakládá na cyklickém opakování 35
tří kroků: denaturace dvouřetězcové DNA, napojení primerů na specifická místa a syntézy nových vláken (Mullis 1990). PCR může být specifická, tedy cílená na konkrétní gen kódující například specifický protein či faktor virulence hledaného mikroorganismu, nebo naopak širokospektrá cílená na gen, který se vyskytuje u skupiny mikroorganismů, např. bakterií, hub aj. Velmi užitečným a často využívaným cílovým místem amplifikace DNA bakterií je gen 16S rDNA. Tento gen se může u bakterií nacházet ve více kopiích (1–7) a skládá se z konzervativních a variabilních oblastí (Obr. 2). Konzervativní oblasti se u bakterií téměř neliší, a jsou proto vazebným místem univerzálních primerů. Naopak variabilní oblasti se využívají jako cílová místa pro rodově či druhově specifické primery (Madico a Rice 2008).
Obr. 2: Složení genu 16S rDNA; šedě – variabilní oblasti, zeleně – konzervativní oblasti, převzato z http://www.alimetrics.net/en/index.php/dna-sequence-analysis, 18. 4. 2012 Kromě genu 16S rDNA byly úspěšně použity pro detekci bakterií v klinických vzorcích další geny, například gen kódující β podjednotku RNA polymerázy (rpoB) nebo gen pro superoxid dismutázu (sodA) (Poyart a kol. 1998, Drancourt a kol. 2004), ovšem díky velkému množství sekvencí v databázích patří gen 16S rDNA mezi nejvyužívanější. Pro identifikaci mikroorganismů následuje po amplifikaci pomocí univerzálních primerů sekvenace daného úseku DNA. V současné době se téměř veškeré DNA sekvenování v těchto situacích provádí pomocí Sangerovy enzymatické metody (Sanger a kol. 1977). Tato metoda využívá vlastností tzv. dideoxynukleotidů, těmto nukleotidům chybí na 3´konci OH-skupina, což brání napojování dalších nukleotidů (Obr. 3).
Obr. 3: A) Struktura deoxynukleotidu a dideoxynukleotidu, B) Ukončení prodlužování řetězce začleněním dideoxynukleotidu postrádajícího 3´OH skupinu, upraveno podle http://9e.devbio.com/article.php?ch=2&id=32, 18. 4. 2012 36
Sekvenační reakce probíhá na stejném principu jako PCR, kdy dochází k amplifikaci templátové DNA pomocí polymerázy a primerů, ale kromě normálních deoxynukleotidů jsou přítomny dideoxynukleotidy. Jednotlivé dideoxynukleotidy se označují čtyřmi různými fluorescenčními značkami (dle typu nukleotidu), což umožňuje provedení polymerázové reakce v jedné zkumavce. Podstatou je pak cyklosekvenační reakce, během které dochází k náhodnému začleňování dideoxynukleotidů. Po jejich začlenění končí elongace daného fragmentu, díky čemuž vznikají různě dlouhé fragmenty DNA. Rozdělení a detekce produktů cyklosekvenační reakce probíhá pomocí kapilární elektroforézy, na jejímž konci je laserový detektor napojený na počítač. Kratší fragmenty putují kapilárou rychleji a dlouhé pomaleji. Podle pořadí jednotlivých signálů se poté automaticky vyhodnocuje sekvence DNA (Smith a kol. 1986, Prober a kol. 1987). Získané sekvence se následně porovnávají s referenčními sekvencemi ve veřejně dostupných databázích. Shoda mezi analyzovanou a referenční sekvencí větší než 97 % umožňuje určení do rodu, nad 99 % pak zařazení do druhu (Drancourt a kol. 2000). Největší a široce používanou databází sekvencí DNA (prokaryotní i eukaryotní) je databáze
GenBank
využívající
pro srovnání
sekvencí
program
BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Z této databáze vycházejí i další veřejné databáze jako SepsiTest či 16Spath DB. Databáze SepsiTest obsahuje pouze sekvence genů 16S rDNA a 18S rDNA. Pro porovnání sekvencí tato databáze vyžaduje minimální délku 200 bp analyzované sekvence. Na rozdíl od GenBank se výsledek zobrazí pouze v případě shody vyšší než 97 % (http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html). V databázi 16Spath DB jsou přítomny pouze sekvence 16S rDNA klinicky významných mikroorganismů (http://147.8.74.24/16SpathDB/identifyBy16S_M.php ). Senzitivita a široká možnost využití řadí PCR mezi vhodné metody pro rutinní diagnostiku. Jak bylo uvedeno již výše, nejčastěji využívaným cílovým genem je 16S rDNA. Tento gen je používán také v laboratoři školitele, kde se pro detekci patogenů přímo z klinického materiálu využívá širokospektrá PCR s následnou sekvenační reakcí (viz Schéma 2). PCR je cílená na variabilní oblasti V8 a V9 genu 16S rDNA. Tato oblast dokáže dobře rozlišit řadu mikrobů, včetně vzácných či atypických druhů (Kolek a kol. 2007, Vaněrková a kol. 2010). Pro druhovou identifikaci a klasifikaci streptokoků však oblast V8–V9 není optimální, a je tedy nutné zaměřit se v případě potřeby druhového rozlišení na jinou oblast, popřípadě jiný gen.
37
Izolace DNAz chirurgického materiálu
Širokospektrá PCR (V8–V9 16S rDNA)
Elektroforéza
Izolace PCR produktu (371 bp) z gelu
Cyklosekvenační reakce Přečištění produktu
Sekvenační analýza
Vložení sekvence ve formátu FASTA do databází sekvencí
Identifikace patogena po úroveň druhu
Schéma 2: Postup detekce patogenní DNA v chirurgickém materiálu (Genetické laboratoři CKTCH, Brno)
38
2. Cíle práce o Nalezení vhodné oblasti genu 16S rDNA pro druhové rozlišení klinicky významných streptokoků o Srovnání efektivity veřejně dostupných databází (GeneBank, 16Spath DB, SepsiTest Blast) v identifikaci streptokoků o Druhová identifikace izolátů z chlopní u pacientů s IE streptokokového původu a určení distribuce jednotlivých druhů streptokoků u tohoto souboru o Srovnání výsledků PCR s výsledky hemokultur a kultivace z operačního materiálu
39
3. Materiál a metody 3.1. Přístroje Během práce byly použity přístroje uvedené v tabulce 7. Tab. 7: Použité přístroje Amplifikátor T3000 Thermocycler
BioTech
Centrifuga Eppendorf 5418
Eppendorf
Centrifuga MR23i
Jouan
Elektroforetická vana HU13
KRD
Sekvenátor ABI PRISM® 3100
Life Technologies
Minitřepačka IKA® MS3 digital
Schoeller
Tiskárna Thermoprinter Sony
Trigon-Plus
Vyhřívaná třepačka Thermomixer Comfort
Eppendorf
Vortex IKA® MS1 Minishaker
Sigma-Aldrich
UV transluminátor TVR312A
Syngene
UV komora BioLink BLX-365
Syngene
Dokumentační systém Gbox HRbio
Trigon-Plus
Zdroj napětí PowerPac 300
Biorad
40
3.2. Sbírkové kmeny streptokoků Pro vytvoření knihovny pro 16S rDNA bylo vybráno 32 referenčních kmenů streptokoků, které jsou uvedeny v tabulce 8.
Tab. 8: Seznam referenčních kmenů Druh Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus constelatus subsp.constellatus Streptococcus cristatus Streptococcus equi subsp.zooepidemicus Streptococcus gordonii Streptococcus infantarius subsp.infantarius Streptococcus infantis Streptococcus intermedius Streptococcus intermedius Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus parasanguinis Streptococcus peroris Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptococcus thermophilus Streptococcus uberis Streptooccus vestibularis Abiotrophia defectiva Granulicatella elegans Granulicatella adiacens Facklamia hominis Facklamia ignava Facklamia languida Facklamia sourekii Globicatela sanguinis Gemella haemolysans Gemella morbillorum
CCM CCM 6187 CCM 7437T CCM 7445T
ATCC ATCC 12395 ATCC 27824
CCM 7551T CCM 7316 CCM 7439T CCM 7548T CCM 7373T CCM 4044 CCM 7444T CCM 7411T CCM 7409T CCM 7412T CCM 7441T CCM 7374T CCM 4501 CCM 4425 CCM 4046T CCM 4047T CCM 4616 CCM 7438T CCM 4672T CCM 4945T CCM 4671T CCM 4931T CCM 4932 T CCM 4946 T CCM 4933 CCM 4548 T CCM 4041 CCM 4942T
ATCC 51100 ATCC 35195 ATCC 10558 ATCC BAA-102 ATCC 700779 ATCC 49456 ATCC 25175 ATCC 35037 ATCC 15912 ATCC 700780 ATCC 49619 ATCC 7073 ATCC 10556 ATCC 19258 ATCC 49176 ATCC 49175 ATCC 51173 ATCC 27824
3.3. Klinické kmeny streptokoků V období listopad 2003 až prosinec 2011 bylo do Genetické laboratoře CKTCH přijato 332 vzorků od pacientů s podezřením na infekční endokarditidu především z CKTCH Brno, ale i z dalších kardiochirurgických klinik a center v Praze, Hradci Králové, Ostravě a Olomouci. Do testovaného souboru bylo zařazeno 81 pacientů, u nichž byl v uvedeném období pomocí molekulárně-biologických metod detekován
41
Streptococcus sp. nebo streptokokům příbuzné rody. K dispozici pro analýzy byla DNA izolovaná z peroperačně odebraného materiálu (částí vegetací, chlopní nebo prostetického materiálu) uchovaná při -18 °C. nebo přímo tento materiál skladovaný při -18 °C.
3.4. Klinická data Klinické údaje společně s výsledky hemokultivací a kultivací z chirurgického materiálu byly získány od lékařů ze spolupracujích kardiochirurgických center, v nichž byli pacienti chirurgicky ošetřeni, a příslušných mikrobiologických laboratoří. Hemokultury byly v případě nálezu koaguláza negativního stafylokoka považovány za pozitivní pouze tehdy, pokud splňovaly modifikovaná Duke kritéria, naproti tomu nález koaguláza negativního stafylokoka při kultivaci z chlopně byl posuzován jako pozitivní při každém záchytu.
3.5. Metody detekce a identifikace mikroorganismů 3.5.1. Izolace bakteriální DNA z pevné půdy Izolace bakteriální DNA byla provedena metodou tepelné lyze. Bakteriální kultura byla odebrána kličkou a přenesena do 100 µl AE pufru (Qiagen, Německo). Takto připravená suspenze byla inkubována 15 minut při 95 °C. Následně byla suspenze centrifugována 15 minut při 7500 rpm. Do čisté zkumavky (1,5 ml) bylo přepipetováno 50–100 µl supernatantu, tedy templát pro PCR reakci.
3.5.2. Izolace DNA z chirurgického materiálu Chirurgický materiál pacientů s IE byl zpracováván za sterilních podmínek. Pomocí sterilního skalpelu a pinzety byly z materiálu odebrány dva vzorky tkáně o velikosti cca 3x3 mm. Vzorky byly rozdrceny a vloženy do sterilní zkumavky (2 ml). Ke vzorku byl přidán lyzační pufr LBQ a enzymy pro narušení buněčné stěny bakterií: lysozym (180 mg/l, Sigma, Německo), lysostaphin (1,8 mg/ml, Sigma, Německo), lytikáza (5 U/µl, Sigma, Německo). Vzorek byl inkubován po dobu 30 minut při 37 °C. Poté následovala centrifugace (30 s/10000 rpm) a izolace DNA pomocí komerční soupravy QIAmp Blood Mini Kit (Qiagen, Německo) dle návodu výrobce: o ke vzorku přidat 20 µl proteinázy K a 200 µl AL pufru, promíchat o inkubovat 30 minut při 56 °C a poté 15 minut při 95 °C, centrifugace (30 s při 10000 rpm) o ke vzorku přidat 200 µl 96 % etanolu, centrifugace 42
o 650 µl lyzátu přepipetovat do kolonky a centrifugace (1 minutu při 10000 rpm) o kolonku přenést do čisté sběrné zkumavky a přidat 500 µl AW1 pufru, centrifugace (1 minutu při 10000 rpm) o slít supernatant a vrátit kolonku do stejné sběrné zkumavky o do kolonky přidat 500 µl AW2 pufru, centrifugace (4 minuty při 14000 rpm) o kolonku umístit do čisté sběrné zkumavky, centrifugace 4 minuty při 10000 rpm o kolonku umístit do čisté 1,5 ml zkumavky a přidat 50 µl AE pufru o inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě, centrifugace (1 minutu při 10000 rpm) o odstranit kolonku. Takto izolovaná DNA byla uchovávána při -20 °C.
3.5.3. PCR cílená na gen 16S rDNA DNA izolovaná z bakteriálních kultur a chirurgického materiálu byla použita jako templát pro PCR cílenou na gen 16S rDNA. Ke 30 µl PCR směsi bylo přidáno 5 µl templátové DNA, přičemž DNA izolovaná z bakteriálních kultur byla nejdříve naředěna v poměru 1:9. PCR směs obsahovala: 1x HotStartTaq Master Mix (Qiagen, Německo), jehož součástí je 1,5 mM MgCl2, 0,5 µM přímého a zpětného primeru (UNBC1 a UNB2b, Tab. 12) a 0,5 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich, Německo). Amplifikační podmínky jsou uvedeny v tabulce 9. Tab. 9: Amplifikační program PCR cílené na 16S rDNA Teplota 95 °C 95 °C 62 °C 72 °C 72 °C
Čas 15 min 10 s 30 s 90 s 10 min
Počet cyklů 1 35 1
3.5.4. Detekce produktu PCR reakce Produkt PCR reakce byl detekován pomocí gelové elektroforézy. Elektroforéza byla provedena na 2 % agarózovém gelu (Serva, Německo) s etidiumbromidem při 95 V po dobu 35 min. Vizualizace produktů proběhla na UV transluminátoru. Pro další analýzu byl produkt PCR extrahován z gelu a přečištěn pomocí komerční soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen, Německo).
43
3.5.5. Sekvenování Produkt PCR cílené na gen 16S rDNA byl použit jako templát do cyklosekvenační reakce. Sekvenační PCR byla provedena s komerční sadou Big Dye Terminator 1.1/3.1 Ready Reaction cycle Sequencing Kit (Life technologies, USA). Složení sekvenační PCR směsi je uvedeno v tabulce 10 a podmínky nastavení PCR v tabulce 11. Množství DNA použité pro PCR a počet cyklů závisel na síle bandu (koncentraci DNA). U sbírkových kmenů byl gen 16S rDNA sekvenován celý pomocí primerů UNBC1, V5F, V5R a UNB2b (Žaloudíková a kol. 2012) (Tab. 12). U izolátů z klinických vzorků byla sekvenována pouze vybraná oblast. Produkt sekvenační reakce byl přečištěn pomocí soupravy BigDye X-terminator Kit (Life technologies, USA). Sekvenační analýza fragmentů o délce cca 500 bp byla provedena na čtyřkapilárním sekvenátoru ABI Avant 3100 ((Life technologies, USA). Sekvence jednotlivých fragmentů byly složeny pomocí nástroje ClustalW (SDSC Biology Workbench, http://workbench.sdsc.edu).
Tab. 10: Složení cyklosekvenační PCR Složky směsi BigDyeTerminator kit 1.1 nebo 3.1 Sekvenační pufr BigDye Primer H2O DNA Celkový objem Tab. 11: Podmínky cyklosekvenační PCR Teplota 96 °C 96 °C 50 °C 60 °C 12 °C
Čas 1 min 10 s 5s 2 min 2 min
Objem (µl) 2 1,5 0,5 0–5,5 0,5–6 10
Počet cyklů 1 25–30* 1
* počet cyklů se řídí množstvím produktu PCR
Tab. 12: Primery použité pro sekvenační PCR Primer Sekvence 5´ TGAAGAGTTTGATCATGGCTCAG 3´ UNBC1 5´ GCCGCAAGGTTAAAACTCAA 3´ V5F 5´ AGGCCAGGTAAGGTTCTTCG 3´ V5R 5´ AGGAGGTGATCCAGCCGCA 3´ UNB2b
44
3.5.6. Vyhodnocení sekvencí a) sbírkové kmeny Složené sekvence byly vloženy a srovnány s referenčními sekvencemi ve třech veřejně dostupných databázích: o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o SepsiTest Blast (http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html) o 16SpathDB (http://147.8.74.24/16SpathDB/identifyBy16S_M.php).
Vzájemné porovnání sekvencí bylo provedeno pomocí programu MEGA5 (dostupný online http://www.megasoftware.net/).
b) klinické vzorky Výsledné sekvence byly srovnány s námi vytvořenou databází sbírkových kmenů streptokoků a třemi veřejnými databázemi (viz výše).
45
4. Výsledky 4.1. Vytvoření databáze sekvencí genu 16S rDNA DNA získaná izolací ze suspenzí sbírkových kmenů streptokoků a jim příbuzných bakterií byla amplifikována pomocí PCR cílené na gen 16S rDNA. Produkt o velikosti přibližně 1500 bp byl poté použit pro sekvenační reakci. Pro každý z 32 sbírkových kmenů byly sekvenační reakcí získány 4 úseky genu 16S rDNA zahrnující variabilní oblasti V1-V9. Tyto úseky byly následně složeny. Sekvenace celé variabilní oblasti V1 nebyla úspěšná u všech kmenů. Pro analýzy tak byly použity sekvence od pozice 117 po pozici 1500. Jako velikostní standard pro porovnání délek byla použita sekvence genu 16S
rDNA
S.
vestibularis
ATCC
49124
(AY188353)
o
délce
1538
bp
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY188353). Všechny sekvence sbírkových kmenů byly srovnány ve třech veřejně dostupných databázích. Shoda mezi referenčními a testovanými sekvencemi pro zařazení do druhu musela být vyšší než 99 % (Drancourt a kol. 2000). Většina kmenů byla identifikována ve všech třech databázích. Pouze kmen S. uberis nebyl identifikován pomocí databáze 16Spath DB a kmen S. infantarius subsp. infantarius byl v této databázi identifikován jako S. equinus (bovis). Globicatella sanguinis byla v databází SepsiTest označena jako Globicatela sulfidifaciens (Tab. 13). Po porovnání s referenčními sekvencemi se 30 kmenů shodovalo se sbírkovým zařazením. Výjimku tvořil druh Streptococcus intermedius CCM 4044, který prokázal nejvyšší shodu s druhem S. anginosus, a to u všech použitých referenčních databází. Shoda kmene S. intermedius CCM 4044 s kmeny S. anginosus v databázích, ale také s námi sekvenovaným S. anginosus CCM 7437, činila více než 99 %, zatímco shoda s jinými kmeny S. intermedius dosahovala pouze 97 % (Tab. 14). Z tohoto důvodu poskytla Česká sbírka mikroorganismů typový kmen S. intermedius CCM 7444. Sekvence tohoto kmene byla v databázích označena jako S. intermedius se 100 % shodou.
46
Tab. 13: Porovnání sekvencí sbírkových kmenů s referenčními sekvencemi v databázích GenBank
SepsiTest
16Spath DB % 99,93 99,42 99,93 99,86 99,86 99,86 * 99,85
A/R % % Streptococcus agalactiae 1384/1384 100 100,00 Streptococcus anginosus 1383/1383 100 99,60 Streptococcus constelatus subsp.constellatus 1383/1383 100 99,90 Streptococcus cristatus 1383/1385 99 99,90 Streptococcus equi subsp.zooepidemicus 1383/1384 99 99,00 Streptococcus gordonii 1383/1385 99 99,90 Streptococcus infantarius subsp.infantarius 1384/1384 100 99,90 Streptococcus infantis 1376/1377 99 99,90 Streptococcus intermedius CCM 4044 viz Tab. 14 Streptococcus intermedius CCM 7444 1383/1383 100 100 100 Streptococcus mitis 1381/1384 100 99,70 99,78 Streptococcus mutans 1384/1384 99 100,00 100,00 Streptococcus oralis 1380/1380 100 100,00 100,00 Streptococcus parasanguinis 1383/1383 100 99,90 100,00 Streptococcus peroris 1315/1315 99 100,00 100,00 Streptococcus pneumoniae 1383/1383 100 99,80 99,86 Streptococcus pyogenes 1384/1384 100 100,00 99,85 Streptococcus salivarius 1381/1383 99 99,90 99,86 Streptococcus sanguinis 1381/1384 99 99,90 99,93 Streptococcus thermophilus 1383/1382 100 100,00 99,93 Streptococcus uberis 1383/1384 99 99,90 N Streptooccus vestibularis 1382/1382 100 100,00 100,00 Abiotrophia defectiva 1380/1386 99 99,40 99,84 Granulicatella elegans 1378/1381 99 99,80 99,57 Granulicatella adiacens 1383/1388 99 99,50 99,92 Facklamia hominis 1374/1380 99 99,60 99,93 Facklamia ignava 1308/1309 99 99,90 99,92 Facklamia languida 1378/1385 99 99,60 99,86 Facklamia sourekii 1383/1383 100 100,00 100,00 Gemella haemolysans 1389/1390 99 99,90 99,93 Gemella morbillorum 1389/1390 99 99,90 99,86 Globicatela sanguinis 1382/1382 100 ** 99,38 A/R - poměr délky analyzované a referenční sekvence, % procento shody analyzované a referenční sekvence, N sekvence nebyla databází identifikována, * identifikován jako druh S. equinus (bovis) 99,6 %; ** identifikován jako druh Globicatella sulfidifaciens 99,5 %
Tab. 14: Srovnání S. intermedius CCM 4044 s referenčními sekvencemi v databázi
S.intermedius CCM 4044
GenBank S.anginosus S.intermedius 1383/1383 1353/1388 (100 %) (97 %)
SepsiTest S.anginosus S.intermedius 99,4 %
16Spath DB S.anginosus
S.intermedius
99,64 %
97,40 %
97,4 %
4.1.1. Výběr vhodné oblasti pro druhové rozlišení streptokoků Sekvence genu 16S rDNA byly vzájemně porovnány pomocí programu MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/). Poté byly vymezeny variabilní oblasti V2-V9 ohraničené nukleotidy 137-242 (V2), 433-497 (V3), 576-682 (V4), 822-879 (V5), 986-1043 (V6), 1117-1173 (V7), 1243-1294 (V8), 1435-1465 (V9) (viz Příloha 1).
47
Sekvence genu 16S rDNA se mezi jednotlivými druhy vyznačovaly poměrně nízkou variabilitou. Po porovnání variabilních oblastí představuje nejvhodnější oblast pro druhové rozlišení streptokoků oblast V2 (Obr. 8). Pro rozlišení NVS a druhů příbuzných streptokoků lze kromě oblasti V2 použít také oblast V3. Ani tyto oblasti však neumožňují rozlišení všech druhů. Pro rozlišení druhů skupiny S. anginosus je vhodnější využít variabilní oblasti V6 (Obr. 5). Vysoká podobnost sekvencí 16S rDNA (vyšší než 99 %) byla zjištěna u zástupců skupiny S. salivarius (S. salivarius, S. vestibularis, S. thermophilus) – ani jedna z variabilních oblastí genu neumožňuje jejich diferenciaci do jednotlivých druhů. Dále se nepodařilo odlišit druhy S. mitis a S. oralis. Zatímco nalézt vhodné místo pro rozlišení S. mitis a S. oralis se nepodařilo, S. pneumoniae lze identifikovat na základě přítomnosti guaninu a tyminu v pozicích 636 (oblast V4) a 815 (oblast V5) (Obr. 6). Ostatní zástupci skupiny S. mitis byli odlišitelní v oblasti V2 (Obr. 7).
1001
1055
S. anginosus
ATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGGAAGTTTCTTCGGAACATCGGTGAC
S. intermedius CCM4044
ATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGGAAGTTTCTTCGGAACATCGGTGAC
S. intermedius CCM7444
ATCCCGATGCCCGCTCTAGAGATAGAGCTTTACTTCGGTACATCGGTGAC
S. constellatus subsp. constellatus
ATCCCTCTGACCACTCTAGAGATAGAGTTTCCCTTCGGGGCAGAGGTGAC
Obr. 5: Rozlišení druhů skupiny S. anginosus v oblasti V6
Streptococcus pneumoniae
630 650 810 830 ATAGTAGGCTTTGGAAACTGT……………..CACGCTGTAAACGATGAGTGC
Streptococcus mitis
ATAGTACGCTTTGGAAACTGT……………..CACGCCGTAAACGATGAGTGC
Streptococcus oralis
ATAGTACGCTTTGGAAACTGT……………..CACGCCGTAAACGATGAGTGC
Obr. 6: Rozlišení druhů S. mitis/oralis od S. pneumoniae Streptococcus oralis
177 226 TAAGAGTAGATGTTGCATGACATTTACTTAAAAGGTGCAATTGCATCACT
Streptococcus mitis
TAAGAGTAGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGCAATTGCATCACT
Streptococcus cristatus
TAATATTGACTATTGCATGATAGTCAATTAAAAGGTGCAAATGCACCACT
Streptococcus infantis
TAACAGTAGATATCGCATGATAGCTGCTTGAAAGGTGCAATTGCACCACT
Streptococcus peroris
TAAGAGCAGTTGTTGCATGACAGCTGTTTAAAAGGTGCAATTGCACCACT
Obr. 7: Rozlišení zástupců skupiny S. mitis v oblasti V2
48
Obr. 8: Srovnání variabilní oblasti V2 u 32 sbírkových kmenů (pozice 117-242)
49
4.2. Identifikace streptokoků u pacientů s podezřením na IE V období listopad 2003–prosinec 2011 bylo v Genetické laboratoři CKTCH pomocí širokospektré PCR a sekvenování vyšetřeno 332 vzorků od chirurgicky ošetřených pacientů s podezřením na IE. Z tohoto souboru bylo 242 vzorků PCR pozitivních a 90 PCR negativních (viz Schéma 3).
Schéma 3: Výsledky PCR vyšetření z chirurgického materiálu u pacientů s podezřením na IE Největší zastoupení mezi PCR pozitivními vzorky měly stafylokoky (109), dále následovaly streptokoky a jim příbuzné druhy (81) a enterokoky (16). Ve skupině ostatní (30) byli pak zastoupeni především zástupci rodu Bartonella sp. (7). V šesti případech sekvenační analýza neumožnila identifikaci agens (Graf 1). Neidentifikováno 2% Enterokoky 7%
Ostatní 13% Streptokoky a jim příbuzné druhy 33%
Stafylokoky 45%
Graf 1: Zastoupení jednotlivých skupin mikroorganismů u PCR pozitivních pacientů Pozn. Ostatní (počet): Bartonella sp. (7), Tropheryma sp. (3), Pseudomonas sp. (3), Corynebacterium sp. (3) Haemophilus sp. (2), Cardiobacterium sp. (2), Actinobacillus sp. (2), Aerococcus sp. (1), Propionibacterium sp. (2), Lactococcus sp. (1), Proteus sp. (1), Parvimonas sp.(1) , Alcaligenaceae (1), Enterobacteriaceae (1).
50
4.2.1. Identifikace agens pomocí PCR Z 81 vzorků streptokoků bylo pomocí PCR detekováno 72 zástupců rodu Streptococcus a 9 příbuzných druhů. Pro retrospektivní sekvenační analýzu genu 16S rDNA bylo použito 79 vzorků. Dva pacienti byli ze souboru vyřazeni z důvodu nedostupnosti klinických údajů pro stanovení diagnózy IE pomocí Duke kritérií (Příloha 2). Druhové určení streptokoků jsem provedla sekvenační reakcí pomocí primerů V5F a V5R ohraničujících variabilní oblasti V2-V8. U 20/79 vzorků nebylo možné provést sekvenační analýzu těchto oblastí, jelikož již nebyl k dispozici chirurgický materiál ani DNA, popřípadě uchovaná DNA byla degradovaná. Pro tyto vzorky byly použity dřívější výsledky sekvenování oblastí V8 a V9, které ovšem neumožnily přesné druhové zařazení. Tyto kmeny proto byly zařazeny do druhové skupiny streptokoků, bez bližšího druhového dourčení. Druhová determinace zbývajících 59 kmenů streptokoků byla provedena pomocí sekvenování oblastí V2-V8 a následným srovnáním s třemi veřejnými databázemi (viz výše) a interní databází získanou sekvenováním V2-V9 16S rDNA všech sbírkových kmenů streptokoků a jejich nutričních variant. Takto bylo identifikováno 44/59 (75 %) kmenů, a to až po úroveň druhu (Tab. 15). Dalších dvanáct kmenů bylo identifikováno jako S. mitis/oralis a jeden jako S. salivarius/vestibularis, jelikož tyto druhy nelze pomocí genu 16S rDNA bezpečně odlišit. V jednom případě nebylo možné odlišit S. gordonii/S. sanguinis, a to z důvodu nízké koncetrace DNA, díky čemuž se nepodařilo získat dostatečně dlouhou sekvenci DNA zachycujícího oblast V2, ve které je možno tyto druhy rozlišit. Dále se vyskytl problém při druhovém rozlišení agens identifikovaného jako Gemella morbillorum/haemolysans, ačkoliv tyto druhy by měly být pomocí 16S rDNA dobře rozlišitelné. Sekvence tohoto agens se vyznačovala částečnou homologií s oběma druhy (viz Příloha 3). Spektrum druhů streptokoků u všech pacinetů (79) je znázorněno v Grafu 2.
51
1%
6%
3%
3% Viridující streptokoky
5%
Skupina Streptococcus bovis
1% 4%
8% 56%
13%
Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus pneumoniae Gemella sp Granulicatella sp. Facklamia sp. Streptococcus sp. Streptococcus/Enterococcus
Graf 2: Spektrum streptokokálních druhů u pacientů s podezřením na IE
Tab. 15: Seznam druhů streptokoků identifikovaných sekvenační analýzou oblasti V2-V8 Skupina Druh Počet Streptococcus mitis/oralis 12 Skupina S. mitis Streptococcus cristatus 2 Streptococcus pneumoniae 1 Streptococcus gordonii 4 Skupina S. sanguinis Streptococcus sanguinis 6 Streptococcus gordonii/sanguinis 1 Skupina S. mutans Streptococcus mutans 4 Skupina S. salivarius Streptococcus salivarius/vestibalaris 1 Streptococcus anginosus 5 Skupina S. anginosus Streptococcus constellatus 2 Streptococcus gallolyticus 7 Skupina S. bovis Streptococcus infantarius 1 Streptococcus agalactiae 5 Beta-hemolytické Streptococcus dysgalactiae 3 Gemella morbillorum 1 Gemella haemolysans 1 Gemella Gemella morbillorum/haemolysans 1 Gemella bergeri 1 NVS Granulicatella adiacens 1 59 Celkový počet druhů analyzovaných v oblasti V2-V8
4.2.2. Kultivační metody Výsledky kultivačních vyšetření byly získány z mikrobiologických laboratoří nemocnic, kde sídlí jednotlivá kardiochirurgická centra.
52
4.2.2.1.
Výsledky hemokultivace a kultivace z chirurgického materiálu
Hemokultury byly odebrány a vyhodnoceny pomocí modifikovaných Duke kritérií (Li a kol. 2000, Beneš a kol. 2007). Hemokultivační vyšetření bylo provedeno u 75/79 pacientů. Pozitivní výsledek hemokultivace byl pozorován u 42/79 (53 %) pacientů, negativní u 33/79 (42 %). U čtyř (5 %) pacientů nebyly hemokultury odebrány (Graf 3). Ve 19 případech bylo streptokokové agens identifikováno až na úroveň druhu. Nejpočetnější skupinu tvořily alfa-hemolytické streptokoky, avšak ve 14 případech nebyla provedena jejich bližší druhová identifikace. Ve čtyřech případech pak bylo určeno jiné agens než Streptococcus sp. (Tab. 16). 5%
53%
42%
Pozitivní Negativní Neodebrány
Graf 3: Poměr pozitivních a negativních výsledků hemokultivace
Kultivace z chirurgického materiálu byla provedena u 62/79 pacientů. Z toho v 19 (24 %) případech byla kultivace pozitivní (Graf 4). Pouze u 5 vzorků pak proběhla identifikace až na úroveň druhu. U 10/19 pozitivních záchytů byly detekovány stafylokoky (Tab. 16).
22%
24% Pozitivní Negativní Neprovedena
54%
Graf 4: Poměr pozitivních a negativních výsledků kultivace z chirurgického materiálu 53
Tab. 16: Identifikace klinických izolátu streptokoků fenotypovými testy Kultivace z chirurgického Mikroorganismus Hemokultury materiálu Alfa-hemolytické streptokoky 14 2 Gama-hemolytické streptokoky 1 S. anginosus 1 S. constellatus 1 S. intermedius 1 S. mitis 4 S. oralis 1 S. mitis/oralis 1 S. mitis/anginosus 1 S. mutans 2 1 S. salivarius 1 S. sanguinis 1 S. agalactiae 2 S. acidominimus 2 S. bovis 3 Gemella sp. 1 Gemella morbillorum 1 Granulicatella sp. 1 Streptococcus sp. 2 Jiné bakterie Enterococcus faecalis 1 Corynebacterium sp. a příbuzné 1 1 Staphylococcus aureus 2 1 Staphylococcus epidermidis 1 Staphylococcus hominis 1 StKN 7 G+ koky 1 Pozn. V tabulce jsou uvedeny výsledky konečné identifikace; StKN – koaguláza negativní stafylokoky
4.2.3. Klinické údaje Klinická data byla společně s výsledky hemokultur a kultivací z chirurgického materiálu získána u 79 pacientů. Na základě těchto údajů byla pomocí Duke kritérií (Li a kol. 2000, Beneš a kol. 2007) provedena diagnostika infekční endokarditidy. Diagnóza IE definovaná jako prokázaná byly určena u 59 (74 %) pacientů, jako možná u 18 (23,4 %) pacientů a ve dvou případech (2,6 %) pak jako vyloučená. Ze 79 pacientů bylo 57 mužů a 22 žen. Věk pacientů se pohyboval v rozmezí 19-82 let. Nejčastěji infekční proces probíhal na nativní chlopni (72/77). Naproti tomu prostetická IE byla zaznamenána pouze v 5/77 případů (Tab. 17). Embolizace (do plic, mozku, sleziny) se vyskytla u 4/77 (5 %) pacientů.
54
Tab. 17: Klinické údaje pacientů s IE
58 57/22
Diagnóza IE možná 57,5 13/5
Diagnóza IE prokázaná 59 42/17
Diagnóza vyloučená 51 0/2
72 5
17 1
55 4
-
Celkem Věk (medián) Muži/ženy Typ IE NVE PVE
NVE - IE probíhající na nativní chlopni, PVE – IE probíhající na prostetické chlopni
4.2.4. Srovnání kultivačních metod a PCR Výsledky konvenčních kultivačních metod byly srovnány s výsledky PCR. Ze 79 PCR pozitivních vzorků byly výsledky hemokultur pozitivní u 42 (53 %) a kultivační vyšetření chirurgického materiálu prokázalo pozitivní záchyt jen v 19 (24 %) případech (Graf 5). Dále byly srovnány výsledky konečné druhové identifikace klinických izolátů. Za shodnou identifikaci bylo považováno stejné určení rodu. Stejná identifikace na úroveň rodu jako u PCR byla zaznamenána pomocí hemokultur u 34/42 (81 %) případů. U 17 vzorků pak byla provedena identifikace po úroveň druhu jak při hemokultivaci, tak pomocí PCR, přičemž stejný druh byl identifikován u 9/17 (53 %) pacientů. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% PCR
Hemokultivace
Kultivace z chirurgického materiálu
Graf 5: Pozitivní záchyt agens pomocí PCR a kultivačních metod
55
Identifikace pomocí PCR a kultivace z chirurgického materiálu se shodovala v 7/19 (37 %) případů (Tab.18). Nejčastějším detekovaným agens pomocí kultivace byly stafylokoky (9/19).
Tab. 18: Porovnání výsledků PCR s kultivačními metodami Hemokultivace Kultivace 35/42 Shoda s PCR (rod) Shoda s PCR (druh) 9/17* 7/42 Neshoda s PCR
7/19 2/3* 12/19
*porovnány byly pouze vzorky, u kterých došlo k identifikaci na úrověň druhu oběma metodami
4.2.5. Srovnání výsledku hemokultur a kultivace Porovnány byly vzájemně také výsledky kultivačních metod před a po chirurgickém zákroku. Pozitivní záchyt pomocí obou metod byl zaznamenán v 8 (14 %) případech, negativní výsledek pak u 17 (29 %) pacientů (Tab. 19). Pouze 2/6 vzorků však byly shodně zařazeny do stejného rodu.
Tab. 19: Porovnání výsledků kultivačních metod Kultivace z Diagnóza IE Hemokultury materiálu prokázaná pozitivní pozitivní 8 pozitivní negativní 22 negativní pozitivní 9 negativní negativní 7
56
Diagnóza IE možná 0 2 1 10
5. Diskuze Streptokoky jsou společně se stafylokoky a enterokoky nejčastějšími původci IE. V posledních letech je pozorován pokles výskytu streptokokových endokarditid oproti stafylokokovým, které momentálně dominují. Tento trend může být způsoben také tím, že mnoho pacientů se streptokokovou IE se snadněji objeví v kategorii kultivačně negativních z důvodu předchozí antibiotické terapie, protože streptokoky jsou na rozdíl od stafylokoků velmi citlivé a jediná dávka antibiotik může zapříčinit negativní výsledky hemokultur (Beneš a kol. 2011). Tato situace může značně komplikovat epidemiologické studie týkající se IE. Přitom dobře zmapovaná epidemiologická situace má význam jak pro diagnostiku IE, tak pro preventivní opatření. Samotné určení streptokoků na úroveň druhu je důležité také z důvodu charakteristiky patogenního potenciálu jednotlivých druhů (především u non-beta-hemolytických streptokoků) a pro sledování antibiotické citlivosti. V první části práce jsem se věnovala možnosti druhového rozlišení streptokoků pomocí sekvenační analýzy genu 16S rDNA. Na základě porovnání sekvencí tohoto genu u referenčních kmenů streptokoků a jim přibuzných druhů bylo nalezeno dostatečně variabilní místo pro rozlišení většiny klinicky významných druhů. V druhé části práce pak byla vybraná oblast použita jako cílové místo sekvenační analýzy u klinických izolátů streptokoků od pacientů s IE, za účelem stanovení druhového zastoupení jednotlivých streptokoků jako původců IE. Získané údaje byly následně srovnány s výsledky konvenčních diagnostických metod IE.
5.1. Variabilní oblasti vhodné pro druhové rozlišení streptokoků Sekvenační analýza genu 16S rDNA je široce používanou metodou pro identifikaci a klasifikaci bakteriálních druhů a studium jejich fylogeneze. Bakteriální gen 16S rDNA obsahuje devět variabilních oblastí, které se vyznačují značnou sekvenční variabilitou mezi různými druhy bakterií a mohou být použity pro identifikaci druhů, jelikož jsou ohraničeny konzervativními oblastmi, které umožňují amplifikaci cílových sekvencí pomocí univerzálních nebo rodově či skupinově specifických primerů. Pro rutinní diagnostiku je však problematické sekvenovat celý gen 16S rDNA, jelikož je příliš dlouhý (1500 bp). V laboratoři školitele se proto v rutinní praxi k identifikaci bakterií v klinickém materiálu využívají pouze variabilní oblasti V8 a V9. Ačkoliv pro identifikaci různých etiologických agens z klinického materiálu u pacientů s odlišnými infekčními diagnózami je tato oblast vhodná, pro druhovou identifikaci
57
streptokoků oblast V8-V9 není optimální. V práci jsem proto provedla srovnání všech variabilních oblastí genu 16S rDNA u 32 druhů sbírkových streptokoků a jim příbuzných bakterií s cílem najít tu nejlépe rozlišující oblast. V mé práci se ukázala jako nejlépe rozlišující, a tím i nejvhodnější oblast pro diferenciaci většiny streptokoků variabilní oblast V2. NVS lze dobře rozlišit také v oblasti V3. Kromě odlišení streptokoků se oblast V2 společně s oblastí V3 jeví jako vhodná cílová oblast pro speciaci patogenních stafylokoků. Navíc se jedná o oblast vhodnou
pro
identifikaci
mikroorganismů
na úrověň
rodu
(s výjimkou
čeledi
Enterobacteriaceae) (Chakravorty a kol. 2007). Zatímco většinu streptokoků lze identifikovat na základě oblasti V2, pro skupinu S. anginosus představuje lepší rozlišující místo variabilní oblast V6. Obtíže, které se vyskytly při identifikaci S. intermedius CCM 4044, kdy na základě sekvenačních výsledků byl identifikován jako S. anginosus, dokazují problematickou identifikaci této skupiny na základě biochemických testů. Správnost výsledku sekvenační analýzy, která označila kmen S. intermedius CCM 4044 jako S. anginosus, podporuje skutečnost, že ve sbírce CIP (Collection of Institute Pasteur) je tento kmen zařazen jako druh S. anginosus. Jedním ze základních úskalí klinických i referenčních laboratoří, a to nejen v České republice, je především odlišení viridujících streptokoků (S. mitis, S. oralis) od netypovatelných nebo aberantních kmenů S. pneumoniae. Mikrobiologické laboratoře se při rozlišování S. mitis/S. oralis většinou spoléhají na biochemické testy, především na optochinový test, avšak díky výskytu optochin rezistentních pneumoků a také citlivých druhů skupiny S. mitis, může docházet k chybné identifikaci (Balsalobre a kol. 2006, Richter a kol. 2008). Problematické bývá i rozlišení těchto druhů na základě genu 16S rDNA, jelikož sdílejí vysokou podobnost (větší než 99 %). Obtížné rozlišení mezi druhy S. mitis, S. oralis a S. pneumoniae jsem potvrdila i v této práci. Detekovány byly pouze dvě pozice v oblastech V4 a V5 lišící se u S. pneumoniae a S. mitis/oralis. Přestože rozdíl spočívá pouze ve dvou bázích, umožňují tato místa navržení primerů specifické PCR pro druh S. pneumoniae (El Aila a kol. 2010). Sekvenací genu 16S rDNA se nepodařilo nalézt vhodnou rozlišovací oblast pro S. mitis a S. oralis stejně jako pro S. salivarius a S. vestibularis. Zatímco odlišení S. salivarius/vestibularis je významné spíše epidemiologicky, rozlišení S. mitis a S. oralis má poměrně důležitý klinický význam, protože některé studie ukázaly, že kmeny S. mitis jsou více odolné vůči penicilinu a fluorochinolonům (Han a kol. 2006). Pro odlišení těchto druhů je nutno využít jiný cílový gen. Alternativu by mohly představovat geny sodA 58
či rpob (Poyart a kol. 1998, Drancourt a kol. 2004), nevýhodou těchto genů však může být menší počet sekvencí v referenčních databázích. V současnosti je snaha o identifikaci mikroorganismů na základě co nejkratších úseků. Gen 16S rDNA sice neumožňuje rozlišení streptokoků pouze na základě jedné oblasti, avšak sekvenací pomocí primerů V5F a V5R a následným složením obou sekvencí jsme schopni pokrýt obě zvolené variabilní oblasti (V2 a V6).
5.2. Identifikace streptokoků v klinickém materiálu 5.2.1. Etiologie u pacientů s podezřením na IE V celém souboru vzorků byly nejčastěji detekovaným etiologickým agens stafylokoky (45 %) a streptokoky (33 %), následované enterokoky (7 %). Toto rozložení odpovídá současným poznatkům o epidemiologii IE v Evropě (Tab. 21), kdy ve vyspělých zemích převažují stafylokokové IE nad streptokokovými. Streptokoky ovšem stále zůstávají významným agens způsobujícím IE přibližně ve 34 % případů (Murdoch a kol. 2009). Tab. 20: Etiologie IE vzhledem k regionům Murdoch a kol. 2009 Severní Jižní Evropa Druh Amerika Amerika 58 % 30 % 45 % Stafylokoky 18 % 49 % 35 % Streptokoky 14 % 10 % 10 % Enterokoky 10 % 11 % 10 % Ostatní
Ostatní 44 % 35 % 11 % 9%
a
Naše výsledkyb 45 % 33 % 7% 13 %
a) Ostatní – Austrálie, asijské země, jižní Afrika b) nebyly zahrnuty neidentifikované vzorky (2 %)
5.2.2. Stanovení diagnózy a klinické projevy IE U pacientů zařazených do testovaného souboru z důvodu nálezu streptokoka či příbuzného druhu byla analyzována klinická data a pomocí Duke kritérií stanovena diagnóza IE. Přestože PCR není součástí Duke kritérií, výsledky PCR se v 72 % případů s konečnou diagnózou shodovaly (prokázaná IE u 57/79 pacientů). Ve dvou případech byla diagnóza IE označena jako vyloučená. U těchto pacientů však nebyly odebrány hemokultury, tudíž se pravděpodobně před chirurgickým zákrokem neuvažovalo o možnosti IE. Možná IE pak byla diagnostikována u 18 pacientů a pouze ve 4 případech byly pozitivní hemokultury. Tato fakta poukazují na omezenou senzitivitu a specificitu Duke kritérií, jež jsou založena především na kultivaci etiologického agens z krve nebo chirurgického materiálu a mohou tak výrazně ovlivnit stanovení konečné diagnózy. 59
Streptokoky napadají ve většině případů nativní chlopně (Lee a kol. 2011). V 94 % tomu tak bylo i v tomto souboru. PVE způsobená streptokoky je méně běžná. Většinou se jedná o PVE s pozdním nástupem, jejíž charakter je podobný endokarditidě postihující nativní chlopně (Lee a kol. 2011). Pouze u 5 % pacientů byla zaznamenána embolizace, což pravděpodobně souvisí s převahou viridujících streptokoků v testovaném souboru, jelikož u IE způsobených těmito streptokoky bývá nižší pravděpodobnost výskytu komplikací (López a kol. 2005).
5.2.3. Význam PCR pro identifikaci streptokoků Při srovnání kultivačních metod a PCR jsem v této práci prokázala nedostatečnou specifičnost fenotypové identifikace viridujících streptokoků. Zatímco sekvenováním oblasti V2-V8 genu 16S rDNA se podařilo zařadit do druhu 44 streptokoků a jim příbuzných mikroorganismů a u 15 byla identifikace zúžena pouze na dva druhy, pomocí fenotypových metod nebyla bližší identifikace ve většině případů provedena. Streptokoky tvoří velice pestrou skupinu grampozitivních mikroorganismů a jejich identifikace pomocí konvenčních identifikačních metod bývá značně komplikovaná. Mimo beta-hemolytické streptokoky, které jsou odlišitelné na základě antigenní skupiny, vyžaduje identifikace streptokoků celou řadu růstových a biochemických testů. Tradiční biochemické reakce mohou být variabilní a mohou se překrývat nejen mezi blízce příbuznými druhy. Kromě toho cílem klinických laboratoří bývá především zjištění citlivostí k antimikrobním látkám a samotné druhové určení není prioritou. Z těchto důvodů klinické laboratoře málokdy identifikují například viridující streptokoky až na úroveň druhu (Han a kol. 2006), což se ukázalo i u našeho souboru vzorků, kdy v případě pozitivních hemokultur bylo do druhu identifikováno pouze 19/42 vzorků. Rozdílná identifikace pomocí fenotypových metod a PCR byla zaznamenána jen u 7/42 případů, u kterých proběhla identifikace po úrověň rodu, a u 9/17 vzorků identifikovaných po úroveň druhu, z čehož zajímavé byly tři případy, ve kterých došlo k záměně druhů Gemella sp. a viridujích streptokoků. Ve dvou z těchto případů byl biochemicky identifikován alfa-hemolytický streptokok, avšak PCR určila tyto druhy jako Gemella morbillorum a Gemella morbillorum/haemolysans. Ve třetím případě se jednalo o opačnou situaci, kdy pomocí biochemických metod bylo agens označeno jako druh Gemella morbillorum, ovšem PCR prokázala viridujícího streptokoka. Tyto případy potvrzují obtížnost přesného druhového i rodového zařazení streptokoků na základě fenotypových testů. Obtížné určení Gemelly do druhu se vyskytlo také v případě 60
identifikace
jednoho
klinického
vzorku
sekvenační
analýzou.
Přestože
druhy
G. morbillorum a G. haemolysans jsou na základě 16S rDNA dobře odlišitelné, izolát vykazoval částečnou homologii s oběma druhy. U klinického izolátu mohlo pravděpodobně dojít k částečné výměně genetické informace mezi druhy. Schopnost přirozené transformace není například u orálních streptokoků neobvyklým jevem (Cvitkovitch 2001). Obtíže
spojené
s nedostatečnou
citlivostí
biochemických
metod
ovšem
nepředstavují jediný problém kultivačních metod. Zatímco hemokultury by měly být odebrány ještě před nasazením antibiotik, u pacientů podstupujících chirurgický zákrok bývá již léčba zahájena. Srovnáním preoperačních testů (hemokultury) s testy pooperačními (kultivace z chirurgického materiálu, PCR) se potvrdil významný vliv antibiotické terapie na senzitivitu a specificitu kultivačních metod. Patrné je to především u kultivace z chirurgického materiálu, která byla negativní v 54 % případů. Za falešně negativní výsledek pak můžeme považovat 37 % vzorků pacientů, u kterých byla IE prokázána. Tímto se také potvrdila důležitost odběru hemokultur před započetím antibiotické terapie. Jedním z běžných problémů kultivačních metod je také možnost kontaminace vzorku a získání falešně pozitivního výsledku. Riziko kontaminace se vyskytuje samozřejmě u všech metod a bývá obtížné rozlišit, zda se jedná o kontaminaci preanalytickou (kontaminace vzorku při odběru) nebo analytickou (kontaminace během testování). U hemokultur lze možnost kontaminace posoudit na základě počtu pozitivních a negativních výsledků jednotlivých odběrů. Při PCR se používá systém tzv. negativních kontrol. Navíc riziko falešně pozitivního určení streptokoků je nízké také proto, že kontaminace klinicky významnými streptokoky nebyla v laboratoři školitele dosud zaznamenána. Interpretace výsledků je tak komplikovaná především u kultivace z materiálu, kterou nelze provést opakovaně. Kultivace z chirurgického materiálu byla pozitivní pouze ve 24 % a z toho byly v 52 % případů izolovány koaguláza negativní stafylokoky a také Corynebacterium sp. Jelikož tyto výsledky nebyly potvrzeny ostatními metodami, jednalo se s největší pravděpodobností o kontaminaci. V této práci se identifikace patogena z chirurgického materiálu pomocí PCR ukázala jako spolehlivá technika. Pouze u 20 klinických vzorků nebyla provedena bližší druhová identifikace, jelikož gen 16S rDNA je poměrně dlouhý, a především u starších vzorků došlo pravděpodobně v důsledku dlouhodobého uchovávání k degradaci DNA a nebylo tedy možné sekvenovat vybranou oblast pro druhové rozlišení. Na druhou stranu se potvrzuje význam identifikace mikroorganismů na základě kratších úseků DNA, 61
mezi jejichž výhody patří zvýšená citlivost testů a právě použitelnost na archivních vzorcích (Marchetti a kol. 1998, Chakravorty a kol. 2006). Pro klinickou diagnostiku však tento fakt nepředstavuje problém. Řada studií již prokázala diagnostický význam PCR přímo z chirurgického materiálu, a to jak u kultivačně negativních případů, tak pro detekci patogenů u pacientů s probíhající antibiotickou léčbou (Breitkopf a kol. 2005, Greub a kol. 2005, Kotilainen 2006, Fournier a kol. 2010). Studováno bylo také použití komerčních PCR testů pro průkaz patogenní DNA přímo z krve – výsledky naznačují, že by tyto testy mohly v kombinaci s hemokulturami představovat cenný nástroj pro mikrobiologickou diagnostiku IE (Casalta a kol. 2009, Mencacci a kol. 2012).
5.2.4. Druhové zastoupení streptokoků u pacientů s IE V této práci bylo analyzováno celkem 79 klinických izolátů streptokoků, z čehož u 59 byla provedena identifikace po úroveň druhu. Z výsledků studie jednoznačně vyplývá převaha viridujících streptokoků (56 %), z nichž nejčastěji byli identifikováni zástupci skupiny S. mitis, především druhy S. mitis/oralis (12/59), které se ovšem nepodařilo vzájemně odlišit, a skupiny S. sanguinis (11/59). Druhou nejpočetnější skupinou byli zástupci skupiny S. bovis (13 %). Z této skupiny byly v 7 případech detekovány S. gallolyticus a v jednom S. infantarius. Z beta-hemolytických streptokoků byly detekovány druhy S. agalactiae (8 %) a S. dysgalactiae (4 %). Podobných výsledků bylo dosaženo i v dalších studiích, které využily pro druhovou identifikaci PCR a sekvenování (Simmons a kol. 2008, Muňoz a kol. 2012).
5.3. Srovnání databází sekvencí mikroorganismů Za účelem identifikace sbírkových streptokoků i klinických kmenů byly porovnávány tři veřejně dostupné databáze (GenBank, SepsiTest, 16Spath DB). Základní odlišností těchto databází je jejich velikost. GenBank je největší z těchto databází a obsahuje gen 16S rDNA různých druhů i kmenů streptokoků a jim příbuzných bakterií. Velké množství sekvencí je výhodou při identifikaci méně běžných patogenů, jelikož se zvyšuje pravděpodobnost, že v databázi bude obsažena sekvence daného druhu či kmene. Příkladem může být druh Globicatella sanguinis, který nebyl identifikován pomocí databáze SepsiTest, jelikož není v databázi obsažen. Stejně tomu bylo v případě S. uberis v databázi 16Spath DB. 62
Nevýhodou velkých databází je naopak obtížná kontrola nahrávaných sekvencí. Sekvence v databázi GenBank nejsou důkladně ověřovány a mohou tak být chybně označeny či nemusí být dostatečně kvalitní, což může vést k chybné identifikaci analyzovaných sekvencí. Riziko chybné identifikace je nižší u databází jako je např. SepsiTest, kde jsou všechny uvedené sekvence ověřené. Navíc se výsledek porovnání sekvencí zobrazí pouze v případě shody vyšší než 97 %, což je minimální hodnota vyžadována pro zařazení mikroorganismu do rodu. Databáze 16Spath obsahuje pouze sekvence genu 16S rDNA klinicky významných bakterií a byla také vytvořena za účelem zkvalitnění identifikace klinických izolátů. Při identifikaci klinických vzorků se výstupy z databází výrazně nelišily. Pouze izoláty identifikované databázemi GenBank a SepsiTest jako S. gallolyticus byly v databázi 16Spath DB označeny jako S. equinus (S. bovis). Nejedná se ovšem o zcela chybné určení, ale opět spíše o nižší počet sekvencí obsažených v databázi, jelikož S. gallolyticus je blízce příbuzný uvedenému druhu v databázi (Schlegel a kol. 2003). Na základě srovnání databází se ukázalo, že pro přesnou identifikaci klinických izolátu je vhodné používat více databází. Vhodnou kombinací se v této práci ukázalo použití databáze GenBank, díky které se zvýší pravděpodobnost při záchytu méně častých agens, s jednou ze zbylých dvou databází, ve kterých jsou obsaženy ověřené sekvence.
63
6. Závěr Diagnostika IE je v současnosti založena především na kultivačních metodách, ovšem ty mohou selhávat buď z důvodu antibiotické terapie, nebo z důvodu výskytu obtížně kultivovatelných agens. Pro tyto případy představují molekulárně-biologické metody alternativu pro detekci agens. Cílem této práce bylo druhové rozlišení streptokoků, které jsou častým původcem IE, pomocí sekvenace genu 16S rDNA u pacientů s podezřením na IE. V první části práce byla připravena databáze sekvencí genu 16S rDNA 32 sbírkových kmenů streptokoků. Sekvence byly následně porovnány za účelem výběru vhodného místa pro jejich druhové rozlišení. Na základě srovnání těchto sekvencí se jako nejvhodnější místo pro druhové rozlišení většiny streptokoků ukázala oblast V2. Výjimku tvořil S. pneumoniae a skupina S. anginosus. Zatímco zástupci skupiny S. anginosus byli dobře rozlišitelní ve variabilní oblasti V6, S. pneumoniae byl rozeznatelný od druhů S. mitis a S. oralis pouze na základě dvou nukleotidů v oblastech V4 a V5. Gen 16S rDNA není vhodný pro rozlišení druhů S. mitis/S. oralis a S. salivarius/S. vestibularis. Ve druhé části práce pak byly vybrané oblasti použity pro druhové rozlišení streptokoků u pacientů s podezřením na IE. Z celkového počtu 79 vzorků, u kterých byly pomocí PCR detekovány streptokoky, byla u 59 vzorků provedena sekvenační analýzy oblastí V2-V8. Získané sekvence byly následně identifikovány pomocí veřejně dostupných databází a námi připravené databáze sekvencí sbírkových kmenů. Výsledky hemokultivace a kultivace z chirurgického materiálu byly negativní ve 42 %, respektive v 54 % případů, u kterých PCR určila agens. U pozitivních kultivačních výsledků byla většina vzorků identifikována pouze na úroveň rodu, PCR se shodovala s hemokultivací v 81 % případů a ve 37 % případů s kultivací z chirurgického materiálu. Druhová identifikace byla provedena a shodovala se v 9/17 případů u PCR a hemokultivace a ve 2/3 případů u PCR a kultivace z chirurgického materiálu. Pomocí PCR a sekvenace bylo stanoveno zastoupení jednotlivých skupin streptokoků u pacientů s IE. Nejčastěji se vyskytovaly viridující streptokoky (56 %), následovaly streptokoky skupiny S. bovis (13 %), beta-hemolytické streptokoky (12 %), Gemella sp. (4 %), Granulicatella sp. (3 %), S. pneumoniae (1 %) a Facklamia sp. (1 %). Sekvenační analýza oblastí V2-V8 pak umožnila přesnou druhovou identifikaci 59 vzorků. Nejčastějšími původci IE byly viridující streptokoky skupiny S. mitis (14/59) a skupiny S. sanguinis (11/59).
64
Z uvedených výsledků vyplývá, že PCR cílená na gen 16S rDNA je velmi účinným diagnostickým nástrojem pro detekci a identifikaci streptokoků z chirurgického materiálu u pacientů s IE. Tato práce také ukázala význam PCR a sekvenování pro mapovaní epidemiologie streptokokové IE.
65
7.
Literatura
Aas J. A., Paster B. J., Stokes, L. N., Olsen I., Dewhirst F. E. (2005): Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43: 5721-5732. Abranches J., Miller J. H., Martinez A. R., Simpson-Haidaris P. J., Burne R. A., Lemos J. A. (2011): The collagen-binding protein Cnm is required for Streptococcus mutans adherence to and intracellular invasion of human coronary artery endothelial cells. Infect. Immun. 79: 22772284. Alber J., El-Sayed A., Estoepangestie S., Lämmler C., Zschöck M. (2005): Dissemination of the superantigen encoding genes seeL, seeM, szeL and szeM in Streptococcus equi subsp. equi and Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Vet. Microbiol. 109: 135-141. Arala-Chaves M. P., Higerd T. B., Porto M. T., Munoz J., Goust J. M., Fudenberg H. H., Loadholt C. B. (1979): Evidence for the synthesis and release of strongly immunosuppressive, noncytotoxic substances by Streptococcus intermedius. J. Clin. Incest. 64: 871-883. Baddley J. W., Benjamin D. K., Patel M., Miró J., Athan E., Barsic B., Bouza E., Clara L., Elliott T., Kanafani Z., Klein J., Lerakis S., Levine D., Spelman D., Rubinstein E., Tornos P., Morris A. J., Pappas P., Fowler V. G., Chu V. H., Cabell C, International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study Group (2008): Candida infective endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27: 519-529. Bagnoli F., Moschioni M., Donati C., Dimitrovska V., Ferlenghi I., Facciotti C., Muzzi A., Giusti F., Emolo C., Sinisi A., Hilleringmann M., Pansegrau W., Censini S., Rappuoli R., Covacci A., Masignani V., Barocchi M. A.(2008). A second pilus type in Streptococcus pneumoniae is prevalent in emerging serotypes and mediates adhesion to host cells. J. Bacteriol. 190: 5480-5492. Balachandran P., Hollingshead S. K., Paton J. C., Briles D. E. (2001): The autolytic enzyme LytA of Streptococcus pneumoniae is not responsible for releasing pneumolysin. J. Bacteriol. 183: 3108-3116. Balsalobre L., Hernández-Madrid A., Llull D., Martín-Galiano A.J., García E., Fenoll A., de la Campa A. G. (2006): Molecular characterization of disease-associated streptococci of the mitis group that are optochin susceptible. J. Clin. Mcrobiol. 44(11): 4163-4171. Balter S., Benin A., Pinto S. W., Teixeira L. M., Alvim G. G., Luna E., Jackson D., LaClaire L., Elliott J., Facklam R., Schuchat A. (2000): Epidemic nephritis in Nova Serrana, Brazil. Lancet 355: 1776-1780. Bancsi M. J., Veltrop M. H., Bertina R. M., Thompson J. (1996): Role of phagocytosis in activation of the coagulation system in Streptococcus sanguis endocarditis. Infect. Immun. 64: 5166-5170. Barg N. L., Kish M. A., Kauffman C. A., Supena R. B. (1985): Group A streptococcal bacteremia in intravenous drug abusers. Am. J. Med. 78: 569-574. Barnham M., Thornton T. J., Lange K. (1983): Nephritis caused by Streptococcus zooepidemicus (Lancefield group C). Lancet 1: 945-948.
66
Barocchi M. A., Ries J., Zogaj, X., Hemsley C., Albiger B., Kanth A., Dahlberg S., Fernebro J., Moschioni M., Masignani V., Hultenby K., Taddei A. R., Beiter K., Wartha F., von Euler A., Covacci A., Holden D. W., Normark S., Rappuoli R., Henriques-Normark B. (2006): A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 103: 2857-2862. Baron E. J., Scott J. D., Tompkins L. S. (2005): Prolonged incubation and extensive subculturing do not increase recovery of clinically significant microorganisms from standard automated blood cultures. Clin. Infect. Dis. 41: 1677-1680. Baron M. J., Bolduc G. R., Goldberg M. B., Aupérin T. C., Madoff L. C. (2004): Alpha C protein of group B Streptococcus binds host cell surface glycosaminoglycan and enters cells by an actin-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 279: 24714-24723. Barrios H., Bump C. M. (1986): Conjunctivitis caused by a nutritionally variant streptococcus. J. Clin. Microbiol. 23: 379-380. Bashore T.M., Cabell C., Fowler V. Jr. (2006): Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31(4): 274-352. Beneš J., Baloun R., Dzupová O. (2011): Endocarditis 2007: Results of a multicentric study on occurrence and characteristics of infective endocarditis. Vnitr. Lek. 57: 147-154. Beneš, J., Mokráček A., Gregor P. (2007): Infekční endokarditida. Doporučené postupy diagnostiky, léčby, dispenzarizace a profylaxe. Cor. Vasa 49, 157-171. Berger U. (1961): A proposed new genus of gram negative cocci: Gemella. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 11:17–19. Bergmann S., Hammerschmidt S. (2007): Fibrinolysis and host response in bacterial infections. Tromb. Haemost. 98: 512-520. Berry A. M., Lock R. A., Hansman D., Paton J. C. (1989): Contribution of autolysin to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 57: 2324-2330. Biermann C., Fries G., Jehnichen P., Bhakdi S., Husmann M. (1999): Isolation of Abiotrophia adiacens from a brain abscess which developed in a patient after neurosurgery. J. Clin. Microbiol. 37: 769-771. Bohnsack J. F., Widjaja K., Ghazizadeh S., Rubens C. E., Hillyard D. R., Parker C. J., Albertine K. H., Hill H. R. (1997): A role for C5 and C5a-ase in the acute neutrophil response to group B streptococcal infections. J. Infect. Dis. 175: 847-855. Branch J., Suganami Y., Kitagawa I., Stein G. H., Tanaka E. (2010): A rare case of group A streptococcal endocarditis with absence of valvular vegetation. Intern. Med. 49: 1657-1661. Brandt C. M., Spellerberg B. (2009): Human infections due to Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis. Clin. Infect. Dis. 49: 766-772. Breitkopf C., Hammel D., Scheld H. H., Peters G., Becker K. (2005): Impact of a molecular approach to improve the microbiological diagnosis of infective heart valve endocarditis. Circulation 111: 1415-1421.
67
Brigante G., Luzzaro F., Bettaccini A., Lombardi G., Meacci F., Pini B., Stefani S., Toniolo A. (2006): Use of the Phoenix automated system for identification of Streptococcus and Enterococcus spp. J. Clin. Microbiol. 44(9): 3263-3267. Brook I. (2008): Infective endocarditis caused by anaerobic bacteria. Arch. Cardiovasc. Dis. 101: 665-676. Brouqui P., Raoult D. (2006): New insight into the diagnosis of fastidious bacterial endocarditis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 47: 1-13. Broyles L. N., Van Beneden C., Beall B., Facklam R., Shewmaker P. L., Malpiedi P., Daily P., Reingold A., Farley M. M. (2009): Population-based study of invasive disease due to betahemolytic streptococci of groups other than A and B. Clin. Infect. Dis. 48: 706-712. Burnette-Curley D., Wells V., Viscount H., Munro C. L., Fenno J. C., Fives-Taylor P., Macrina F. L. (1995): FimA, a major virulence factor associated with Streptococcus parasanguis endocarditis. Infect. Immun. 63: 4669-4674. Cabell C. H., Jollis J. G., Peterson G. E., Corey G. R., Anderson D. J., Sexton D. J., Woods C. W., Reller L. B., Ryan T., Fowler V. G. (2002): Changing patient characteristics and the effect on mortality in endocarditis. Arch. Intern. Med. 162: 90-94. Carlsson F., Sandin C., Lindahl G. (2005): Human fibrinogen bound to Streptococcus pyogenes M protein inhibits complement deposition via the classical pathway. Mol. Microbiol. 56: 28-39. Casalta J. P., Gouriet F., Roux V., Thuny F., Habib G., Raoult D. (2009): Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28: 569-573. Castillo J. C., Anguita M. P., Ruiz M., Peña L., Santisteban M., Puentes M., Arizón J. M., Suárez de Lezo J. (2011): Changing epidemiology of native valve infective endocarditis. Rev. Esp. Cardiol. 64: 594-598. Collins M. D., Falsen E., Lemozy J., Akervall E., Sjödén B., Lawson P. A. (1997): Phenotypic and phylogenetic characterization of some Globicatella-like organisms from human sources: description of Facklamia hominis gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 880-882. Collins M. D., Hutson R. A., Falsen E., Sjödén B. (1999): Facklamia sourekii sp. nov., isolated from human sources. Int. J. Syst. Bacteriol. 49 Pt 2: 635-638. Collins M. D., Lawson P. A. (2000): The genus Abiotrophia (Kawamura et al.) is not monophyletic: proposal of Granulicatella gen. nov., Granulicatella adiacens comb. nov., Granulicatella elegans comb. nov., and Granulicatella balaenopterae comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.; 50: 365-369. Corredoira J., Alonso M. P., Coira A., Casariego E., Arias C., Alonso D., Pita J., Rodriguez A., López M. J., Varela J. (2008): Characteristics of Streptococcus bovis endocarditis and its differences with Streptococcus viridans endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27: 285-291.
68
Crawford I., Russell C. (1986): Comparative adhesion of seven species of streptococci isolated from the blood of patients with sub-acute bacterial endocarditis to fibrin-platelet clots in vitro. J. Appl. Bacteriol. 60: 127-133. Cvitkovitch D. G. (2001): Genetic competence and transformation in oral streptococci. Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 12(3): 217-243. David T. E., Gavra G., Feindel C. M., Regesta T., Armstrong S., Maganti M. D. (2007): Surgical treatment of active infective endocarditis: a continued challenge. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 133: 144-149. Doern C. D., Burnham C. A. (2010): It's not easy being green: the viridans group streptococci, with a focus on pediatric clinical manifestations. J. Clin. Microbiol. 48: 3829-3835. Drancourt M., Bollet C., Carlioz A., Martelin R., Gayral J. P., Raoult D. (2000): 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J. Clin. Microbiol. 38: 3623-3630. Drancourt M., Roux V., Fournier P. E., Raoult D. (2004): rpoB gene sequence-based identification of aerobic Gram-positive cocci of the genera Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia, and Granulicatella. J. Clin. Microbiol. 42: 497-504. Durack D. T., Lukes A. S., Bright D. K. (1994): New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings. Duke Endocarditis Service. Am. J. Med. 96: 200-209. Durante-Mangoni E., Bradley S., Selton-Suty C., Tripodi M. F., Barsic B., Bouza E., Cabell C. H., Ramos A I., Fowler V. J.r, Hoen B., Koneçny P., Moreno A., Murdoch D., Pappas P., Sexton D. J., Spelman D., Tattevin P., Miró J. M., van der Meer J. T., Utili R.; International Collaboration on Endocarditis Prospective Cohort Study Group (2008): Current features of infective endocarditis in elderly patients: results of the International Collaboration on Endocarditis Prospective Cohort Study. Arch. Intern. Med. 168(19): 2095-2103. El Aila N.A., Emler S., Kaijalainen T., De Baere T., Saerens B., Alkan E., Deschaght P., Verhelst R., Vaneechoutte M. (2010): The development of a 16S rRNA gene based PCR for the identification of Streptococcus pneumoniae and comparison with four other species specific PCR assays. BMC Infect. Dis. 10: 104. Elsayed S., Zhang K. (2004): Gemella bergeriae endocarditis diagnosed by sequencing of rRNA genes in heart valve tissue. J. Clin Microbiol.;42(10): 4897-4900. Erdem I., Goktas P., Demirtunc R., Erdem A. (2003): Infective endocarditis caused by group G streptococcus with multiple cerebral emboli. Acta Medica (Hradec Kralove). 46 (3): 125-127. Escher R., Roth S., Droz S., Egli K., Altwegg M., Täuber M. G. (2010): Endocarditis due to Tropheryma whipplei: rapid detection, limited genetic diversity, and long-term clinical outcome in a local experience. Clin. Microbiol. Infect. 16: 1213-1222. Facklam R. (2002): What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin. Microbiol. Rev. 15: 613-630.
69
Fernández Guerrero M. L., González López J. J., Goyenechea A., Fraile J., de Górgolas M. (2009): Endocarditis caused by Staphylococcus aureus: A reappraisal of the epidemiologic, clinical, and pathologic manifestations with analysis of factors determining outcome. Medicine (Baltimore) 88: 1-22. Fernández-Hidalgo N., Almirante B., Tornos P., Pigrau C., Sambola A., Igual A., Pahissa A. (2008): Contemporary epidemiology and prognosis of health care-associated infective endocarditis. Clin. Infect. Dis. 47: 1287-1297. Fournier P. E., Thuny F., Richet H., Lepidi H., Casalta J. P., Arzouni J. P., Maurin M., Célard M., Mainardi J.L., Caus T., Collart F., Habib G., Raoult D. (2010): Comprehensive diagnostic strategy for blood culture-negative endocarditis: a prospective study of 819 new cases. Clin. Infect. Dis. 51: 131-140. Fowler V. G., Miro J. M., Hoen B., Cabell C.H., Abrutyn E., Rubinstein E., Corey G.R., Spelman D., Bradley S.F., Barsic B., Pappas P.A., Anstrom K.J., Wray D., Fortes C.Q., Anguera I., Athan E., Jones P., van der Meer J.T., Elliott T.S., Levine D.P., Bayer A.S.; ICE Investigators (2005): Staphylococcus aureus endocarditis: a consequence of medical progress. JAMA 293: 3012-3021. Fraser J., Arcus V., Kong P., Baker E., Proft T. (2000): Superantigens - powerful modifiers of the immune system. Mol. Med. Today 6: 125-132. Frenkel A., Hirsch W. (1961): Spontaneous development of L forms of streptococci requiring secretions of other bacteria or sulphydryl compounds for normal growth. Nature 191: 728-730. Geißdörfer W., Moos V., Moter A., Loddenkemper C., Jansen A., Tandler R., Morguet A. J., Fenollar F., Raoult D., Bogdan C., Schneider T. (2012): High frequency of Tropheryma whipplei in culture-negative endocarditis. J. Clin. Microbiol. 50(2): 216-222. Gendron R., Grenier D., Maheu-Robert L. (2000): The oral cavity as a reservoir of bacterial pathogens for focal infections. Microbes. Infect. 2: 897-906. Gouriet F., Samson L., Delaage M., Mainardi J. L., Meconi S., Drancourt M., Raoult D. (2008): Multiplexed whole bacterial antigen microarray, a new format for the automation of serodiagnosis: the culture-negative endocarditis paradigm. Clin. Microbiol. Infect. 14: 11121118. Graham J. V., Baden L., Tsiodras S., Karchmer A. W. (2000): Q fever endocarditis associated with extensive serological cross-reactivity. Clin. Infect. Dis. 30: 609-610. Greub G., Lepidi H., Rovery C., Casalta J. P., Habib G., Collard F., Fournier P. E., Raoult D. (2005): Diagnosis of infectious endocarditis in patients undergoing valve surgery. Am. J. Med. 118: 230-238. Gupta A., Madani R., Mukhtar H. (2010): Streptococcus bovis endocarditis, a silent sign for colonic tumour. Colorectal. Dis. 12: 164-171.
70
Habib G., Hoen B., Tornos P., Thuny F., Prendergast B., Vilacosta I., Moreillon P., de Jesus Antunes M., Thilen U., Lekakis J., Lengyel M., Müller L., Naber C. K., Nihoyannopoulos P., Moritz A., Zamorano J. L., E. C. f. P. Guidelines (2009): Guidelines on the prevention, diagnosis, and treatment of infective endocarditis (new version 2009): the Task Force on the Prevention, Diagnosis, and Treatment of Infective Endocarditis of the European Society of Cardiology (ESC). Endorsed by the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) and the International Society of Chemotherapy (ISC) for Infection and Cancer. Eur. Heart. J. 30: 2369-2413. Hammerschmidt S., Bethe G., Remane P. H., Chhatwal G. S. (1999): Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin-binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 67: 1683-1687. Han X. Y., Kamana M., Rolston K. V. (2006): Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. J. Clin. Microbiol. 44: 160–165. Havarstein L.S., Hakenbeck R., Gaustad P. (1997): Natural competence in the genus Streptococcus: evidence that streptococci can change pherotype by interspecies recombinational exchanges. J. Bacteriol.;179(21): 6589-6594. Henrichsen J. (1995): Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33: 2759-2762. Hensler M. E., Quach D., Hsieh C. J., Doran K. S., Nizet V. (2008): CAMP factor is not essential for systemic virulence of Group B Streptococcus. Mikrob. Pathog. 44: 84-88. Héry-Arnaud G., Doloy A., Ansart S., Le Lay G., Le Flèche-Matéos A., Seizeur R., Garré M., Payan C. , Bouvet A. (2010): Globicatella sanguinis meningitis associated with human carriage. J. Clin. Microbiol. 48: 1491-1493. Hinse D., Vollmer T., Rückert C., Blom J., Kalinowski J., Knabbe C., Dreier J. (2011): Complete genome and comparative analysis of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus, an emerging pathogen of infective endocarditis. BMC Genomics 12: 400. Hoen B., Alla F., Selton-Suty C., Béguinot I, Bouvet A., Briançon S., Casalta J.P., Danchin N., Delahaye F., Etienne J., Le Moing V., Leport C., Mainardi J. L., Ruimy R., Vandenesch F., Association pour l'Etude et la Prévention de l'Endocardite Infectieuse (AEPEI) Study Group. (2002): Changing profile of infective endocarditis: results of a 1-year survey in France. JAMA 288: 75-81. Hoen B. (2006): Epidemiology and antibiotic treatment of infective endocarditis: an update. Heart 92: 1694-1700. Holden M. T., Heather Z., Paillot R., Steward K. F., Webb K., Ainslie F., Jourdan T., Bason N. C., Holroyd N. E., Mungall K., Quail M. A., Sanders M., Simmonds M., Willey D., Brooks K., Aanensen D.M., Spratt B. G., Jolley K. A., Maiden M. C., Kehoe M., Chanter N., Bentley S. D., Robinson C., Maskell D. J., Parkhill J., Waller A. S. (2009): Genomic evidence for the evolution of Streptococcus equi: host restriction, increased virulence, and genetic exchange with human pathogens. PLoS Pathog. 5 (3): e1000346.
71
Hoshino T., Fujiwara T., Kilian M. (2005): Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. J. Clin. Microbiol. 43(12): 6073-6085. Houpikian P., Raoult D. (2005): Blood culture-negative endocarditis in a reference center: etiologic diagnosis of 348 cases. Medicine (Baltimore) 84: 162-173. Hull J. E. (2010): Multisystem organ failure due to Gemella morbillorum native valve endocarditis. Mil. Med. 175: 923-925. Hynes W. L., Dixon A. R., Walton S. L., Aridgides L. J. (2000): The extracellular hyaluronidase gene (hylA) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiol. Lett. 184: 109-112. Chakravorty S., Helb D., Burday M., Connell N., Alland D. (2007): A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J. Microbiol. Methods. 69: 330-339. Chakravorty S., Pathak D., Dudeja M., Haldar S., Hanif M., Tyagi J. S. (2006): PCR amplification of shorter fragments from the devR (Rv3133c) gene significantly increases the sensitivity of tuberculosis diagnosis. FEMS Microbiol. Lett. 257: 306–311. Chhatwal G. S., Preissner K. T., Müller-Berghaus G., Blobel H. (1987): Specific binding of the human S protein (vitronectin) to streptococci, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. Infect. Immun. 55: 1878-1883. Chiang-Ni C., Wu J. J. (2008): Effects of streptococcal pyrogenic exotoxin B on pathogenesis of Streptococcus pyogenes. J. Formos. Med. Assoc. 107: 677-685. Igwe E. I., Shewmaker P. L., Facklam R. R., Farley M. M., van Beneden C., Beall B. (2003): Identification of superantigen genes speM, ssa, and smeZ in invasive strains of beta-hemolytic group C and G streptococci recovered from humans. FEMS Microbiol. Lett. 229: 259-264. Itzek A., Gillen C. M., Fulde M., Friedrichs C., Rodloff A. C., Chhatwal G. S., NitscheSchmitz D. P. (2010): Contribution of plasminogen activation towards the pathogenic potential of oral streptococci. PLoS One 5(11): e13826. Ivanova Georgieva R., García López M. V., Ruiz-Morales J., Martínez-Marcos F. J., Lomas J. M., Plata A., Noureddine M., Hidalgo-Tenorio C., Reguera J. M., De la Torre Lima J., Gálvez Aceval J., Márquez M., de Alarcón A., Andalusian Group for the Study of Cardiovascular Infections of the Andalusian Society of Infectious Diseases SAEI. (2010): Streptococcus agalactiae left-sided infective endocarditis. Analysis of 27 cases from a multicentric cohort. Journal of Infection 61: 54-59. Jeng A., Chen J., Katsivas T. (2005): Prosthetic valve endocarditis from Granulicatella adiacens (nutritionally variant streptococci). J. Infect. 51(3):e125-9. Jonsson S., Musher D. M., Chapman A., Goree A., Lawrence E. C. (1985): Phagocytosis and killing of common bacterial pathogens of the lung by human alveolar macrophages. J. Infect. Dis. 152: 4-13. Kalia A., Bessen D. E. (2003): Presence of streptococcal pyrogenic exotoxin A and C genes in human isolates of group G streptococci. FEMS Microbiol. Lett. 219: 291-295.
72
Kalokhe A. S., Rouphael N., El Chami M. F., Workowski K. A., Ganesh G., Jacob J. T. (2010): Aspergillus endocarditis: a review of the literature. Int. J. Infect. Dis., 14: e1040-1047. Kanamori S., Kusano N., Shinzato T., Saito A. (2004): The role of the capsule of the Streptococcus milleri group in its pathogenicity. J. Infect. Chemother. 10: 105-109. Kilpper-Bӓlz R., Schleifer K. H. (1988): Transfer of Streptococcus morbillorum to the genus Gemella as Gemella morbillorum, comb. nov. Int. J.Syst. Bacteriol. 38: 442–443. Kline J. B., Xu S., Bisno A. L., Collins C. M. (1996): Identification of a fibronectin-binding protein (GfbA) in pathogenic group G streptococci. Infect. Immun. 64: 2122-2129. Koegelenberg C. F., Doubell A. F., Orth H., Reuter H. (2004): Infective endocarditis: improving the diagnostic yield. Cardiovasc. J. S. Afr. 15: 14-20. Kolek M., Ţaloudíková B., Freiberger T., Brát R. (2007): Infekční endokarditida aortální a mitrální chlopně vyvolaná Tropheryma whipplei při nepřítomnosti gastrointestinálních projevů Whippleovy choroby. Klin. mikrobiol. inf. lék. 13(5):212-215. Kotilainen P., Heiro M., Jalava J., Rantakokko V., Nikoskelainen J., Nikkari S., RantakokkoJalava K. (2006): Aetiological diagnosis of infective endocarditis by direct amplification of rRNA genes from surgically removed valve tissue. An 11-year experience in a Finnish teaching hospital. Ann. Med. 38: 263-273. Kuusi M., Lahti E., Virolainen A., Hatakka M., Vuento R., Rantala L., Vuopio-Varkila J., Seuna E., Karppelin M., Hakkinen M., Takkinen J., Gindonis V., Siponen K., Huotari K.(2006): An outbreak of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus associated with consumption of fresh goat cheese. BMC Infect. Dis. 6: 36. LaClaire L., Facklam R. (2000): Antimicrobial susceptibilities and clinical sources of Facklamia species. Antimicrob. Agents. Chemother. 44: 2130-2132. Lancefield R. C. (1933): A serological differentiation of human and other groups of streptococci.. J. Exp. Med. 57: 571-595. Lang S., Palmer M. (2003): Characterization of Streptococcus agalactiae CAMP factor as a pore-forming toxin. J. Biol. Chem. 278: 38167-38173. La Scola B, Raoult D. (1998): Molecular identification of Gemella species from three patients with endocarditis. J. Clin. Microbiol. 36(4):866-871. Latorre M., Alvarez M., Fernández J. M., Berdonces P., Llanos A., Cisterna R. (1993): A case of meningitis due to "Streptococcus zooepidemicus". Clin. Infect. Dis. 17: 932-933. Lau S. K., Woo P. C., Li N. K., Teng J. L., Leung K. W., Ng K. H., Que T. L., Yuen K. Y. (2006): Globicatella bacteraemia identified by 16S ribosomal RNA gene sequencing. J. Clin. Pathol. 59: 303-307. Lauer P., Rinaudo C. D., Soriani M., Margarit I., Maione D., Rosini R., Taddei A. R., Mora M., Rappuoli R., Grandi G., Telford J. L. (2005): Genome analysis reveals pili in Group B Streptococcus. Science 309: 105.
73
Lawson P. A., Collins M. D., Falsen E., Sjöden B., Facklam R. R. (1999): Facklamia languida sp. nov., isolated from human clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 37: 1161-1164. Lee J. H., Burner K. D., Fealey M. E., Edwards W. D., Tazelaar H. D., Orszulak T. A., Wright A. J., Baddour L. M. (2011): Prosthetic valve endocarditis: clinicopathological correlates in 122 surgical specimens from 116 patients (1985-2004). Cardiovasc. Pathol. 20: 26-35. Li J. S., Sexton D. J., Mick N., Nettles R., Fowler V. G., Ryan T., Bashore T., Corey G. R. (2000): Proposed modifications to the Duke criteria for the diagnosis of infective endocarditis. Clin. Infect. Dis. 30: 633-638. Lindgren P. E., Signäs C., Rantamäki L., Lindberg M. (1994): A fibronectin-binding protein from Streptococcus equisimilis: characterization of the gene and identification of the binding domain. Vet. Microbiol. 41: 235-247. Lindmark H., Jacobsson K., Frykberg L., Guss B. (1996): Fibronectin-binding protein of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Infect. Immun. 64: 3993-3999. Lockhart P. B., Brennan M. T., Thornhill M., Michalowicz B. S., Noll J., Bahrani-Mougeot F. K., Sasser H. C. (2009): Poor oral hygiene as a risk factor for infective endocarditis-related bacteremia. J. Am. Dent. Assoc. 140(10): 1238-1244. Lowrance J. H., Baddour L. M., Simpson W. A. (1990): The role of fibronectin binding in the rat model of experimental endocarditis caused by Streptococcus sanguis. J. Clin. Incest. 86: 713. López J., San Román J. A., Revilla A., Vilacosta I., Luaces M., Sarriá C., Gómez I., FernándezAvilés F. (2005): Clinical, Echocardiographic and Prognostic Profile of Streptococcus viridans Left-Sided Endocarditis. Rev. Esp. Cardiol. 58: 153-158. Madico G. E., Rice P. A. (2008): 16S-Ribosomal DNA to diagnose culture-negative endocarditis. Curr. Infect. Dis. Rep. 10: 280-286. Madsen R. G., Ladefoged K., Kjaergaard J. J., Andersen P. S., Clemmesen C. (2009): Endocarditis in Greenland with special reference to endocarditis caused by Streptococcus pneumoniae. Int. J. Circumpolar Health. 68(4): 347-53. Maliyil J., Caire W., Nair R., Bridges D. (2011): Splenic abscess and multiple brain abscesses caused by Streptococcus intermedius in a young healthy man. Proc. (Bayl. Univ. Med. Cent.) 24: 195-199. Manning S. D., Neighbors K., Tallman P. A., Gillespie B., Marrs C. F., Borchardt S. M., Baker C. J., Pearlman M. D., Foxman B. (2004): Prevalence of group B Streptococcus colonization and potential for transmission by casual contact in healthy young men and women. Clin. Infect. Dis. 39: 380-388. Marchetti G., Gori A., Catozzi L., Vago L., Nebuloni M., Rossi M. C., Esposti A. D., Bandera A., Franzetti F. (1998): Evaluation of PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis from formalin-fixed, paraffinembedded tissues: comparison of four amplification assays. J. Clin. Microbiol. 36: 1512–1517.
74
Martinez-Luengas F., Inclan G. M., Pastor A., Montejo M., Barron J., Baroja A., Aguirre C. (1982): Endocarditis due to Streptococcus zooepidemicus. Can. Med. Assoc. J. 127: 13. Maurin M., Eb F., Etienne J., Raoult D. (1997): Serological cross-reactions between Bartonella and Chlamydia species: implications for diagnosis. J. Clin. Microbiol. 35: 2283-2287. McDonald H. M., Chambers H. M. (2000): Intrauterine infection and spontaneous midgestation abortion: is the spectrum of microorganisms similar to that in preterm labor? Infect Dis Obstet Gynecol 8: 220-227. Melter O., Radojevič B. (2010): Small colony variants of Staphylococcus aureus--review. Folia Microbiol. 55(6): 548-558. Mencacci A., Leli C., Montagna P., Carpaccia A., Meucci M., Bietolini C., Cenci E., Pasticci M. B., Bistoni F. (2012): Diagnosis of infective endocarditis: comparison of the LightCycler SeptiFast (Roche Diagnostics) real-time PCR with blood culture. J. Med. Microbiol., doi: 10.1099/jmm.0.040113-0. Mitchell J. (2011): Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Mol. Oral. Microbiol. 26: 89-98. Mitchell A. M., Mitchell T. J. (2010): Streptococcus pneumoniae: virulence factors and variation. Clin. Microbiol. 16(5):411-418. Moreillon P., Overholser C. D., Malinverni R., Bille J. , Glauser M. P. (1988): Predictors of endocarditis in isolates from cultures of blood following dental extractions in rats with periodontal disease. J. Infect. Dis. 157: 990-995. Moreillon P., Que Y. A., Bayer A. S. (2002): Pathogenesis of streptococcal and staphylococcal endocarditis. Infect. Dis. Clin. North Am. 16: 297-318. Moreillon P., Que Y. A. (2004): Infective endocarditis. Lancet. 363: 139-149. Moter A., Musci M., Schmiedel D. (2010): Molecular methods for diagnosis of infective endocarditis. Curr. Infect. Dis. Rep. 12: 244-252. Mouly S., Ruimy R., Launay O., Arnoult F., Brochet E., Trouillet J. L., Leport C., Wolff M. (2002): The changing clinical aspects of infective endocarditis: descriptive review of 90 episodes in a French teaching hospital and risk factors for death. J. Infect. 45: 246-256. Mullis K. B. (1990): Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 48: 579-582. Muñoz P., Bouza E., Marín M., Alcalá L., Rodríguez Créixems M., Valerio M., Pinto A., Hospital G. f. t. M. o. I. E. o. t. G. M. (2008): Heart valves should not be routinely cultured. J. Clin. Microbiol. 46: 2897-2901. Muñoz P., Giannella M., Scoti F., Predomingo M., Puga D., Pinto A., Roda J., Marin M., Bouza E.; Group for the Management of Infective Endocarditis of the Gregorio Marañón Hospital (GAME) (2012): Two weeks of postsurgical therapy may be enough for high-risk cases of endocarditis caused by Streptococcus viridans or Streptococcus bovis. Clin. Microbiol. Infect. 18(3): 293-299.
75
Murdoch D. R., Corey G. R., Hoen B., Miró J. M., Fowler V. G. Jr., Bayer A. S., Karchmer A. W., Olaison L., Pappas P. A., Moreillon P., Chambers S. T., Chu V. H., Falcó V., Holland D. J., Jones P., Klein J. L., Raymond N. J., Read K. M., Tripodi M. F., Utili R., Wang A., Woods C. W., Cabell C. H.; International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study (ICE-PCS) Investigators (2009): Clinical presentation, etiology, and outcome of infective endocarditis in the 21st century: the International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study. Arch. Intern. Med. 169(5): 463-473. Musci M., Weng Y., Hübler M., Amiri A., Pasic M., Kosky S., Stein J., Siniawski H., Hetzer R. (2010): Homograft aortic root replacement in native or prosthetic active infective endocarditis: twenty-year single-center experience. J. Terac. Cardiovasc. Surf. 139: 665-673. Namavar Jahromi B., Poorarian S., Poorbarfehee S. (2008): The prevalence and adverse effects of group B streptococcal colonization during pregnancy. Arch. Iran. Med. 11: 654-657. Nelson A. L., Roche A. M., Gould J. M., Chim K., Ratner A. J., Weiser J. N. (2007): Capsule enhances pneumococcal colonization by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75: 83-90. Nicholson M. L., Ferdinand L., Sampson J. S., Benin A., Balter S., Pinto S.W., Dowell S. F., Facklam R. R., Carlone G. M., Beall B. (2000): Analysis of immunoreactivity to a Streptococcus equi subsp. zooepidemicus M-like protein To confirm an outbreak of poststreptococcal glomerulonephritis, and sequences of M-like proteins from isolates obtained from different host species. J. Clin. Microbiol. 38: 4126-4130. Nisbet M., Thomas, M. (2005): Liver abscess associated with persistent Streptococcus anginosus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 41: 352-353, 403-355. Nizet V. (2002): Streptococcal beta-hemolysins: genetics and role in disease pathogenesis. Trends. Microbiol. 10: 575-580. Okada Y., Kitada K., Takagaki M., Ito H. O., Inoue M. (2000): Endocardiac infectivity and binding to extracellular matrix proteins of oral Abiotrophia species. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27: 257-261. Paganini H., Staffolani V., Zubizarreta P., Casimir L., Lopardo H., Luppino V. (2003): Viridans streptococci bacteraemia in children with fever and neutropenia: a case-control study of predisposing factors. Eur. J. Cancer. 39: 1284-1289. Påhlman L. I., Mörgelin M., Eckert J., Johansson L., Russell W., Riesbeck K., Soehnlein O., Lindbom L., Norrby-Teglund A., Schumann R. R., Björck L., Herwald H. (2006): Streptococcal M protein: a multipotent and powerful inducer of inflammation. J. Immunol. 177: 1221-1228. Palys E. E., Li J., Gaut P. L., Hardy W. D. (2006): Tricuspid valve endocarditis with Group B Streptococcus after an elective abortion: the need for new data. Infect. Dis. Obstet Gynecol. 2006: 43253. Pancholi V., Fischetti V. A. (1998): α-enolase, a novel strong plasmin(ogen) binding protein on the surface of pathogenic streptococci. J. Biol. Chem. 273: 14503-14515.
76
Pérez-Caballero D., García-Laorden I., Cortés G., Wessels M. R., de Córdoba S. R., Albertí S. (2004): Interaction between complement regulators and Streptococcus pyogenes: binding of C4b-binding protein and factor H/factor H-like protein 1 to M18 strains involves two different cell surface molecules. J. Immunol. 173: 6899-6904. Phares C. R., Lynfield R., Farley M. M., Mohle-Boetani J., Harrison L.H., Petit S., Craig A. S, Schaffner W., Zansky S. M., Gershman K., Stefonek K. R., Albanese B. A., Zell E. R., Schuchat A., Schrag S. J.; Active Bacterial Core surveillance/Emerging Infections Program Network (2008): Epidemiology of invasive group B streptococcal disease in the United States, 1999-2005. JAMA 299: 2056-2065. Poole P. M., Wilson G. (1979): Occurrence and cultural features of Streptococcus milleri in various body sites. J. Clin. Pathol. 32: 764-768. Poyart C., Quesne G., Coulon S., Berche P., Trieu-Cuot P. (1998): Identification of streptococci to species level by sequencing the gene encoding the manganese-dependent superoxide dismutase. J. Clin. Microbiol. 36: 41-47. Prendergast B. D. (2006): The changing face of infective endocarditis. Heart 92: 879-885. Prober J. M., Trainor G. L., Dam R. J., Hobbs F. W., Robertson C. W., Zagursky R. J., Cocuzza A. J., Jensen M. A., Baumeister K. (1987): A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science 238: 336-341. Que Y. A., Haefliger J. A., Piroth L., François P., Widmer E., Entenza J. M., Sinha B., Herrmann M., Francioli P., Vaudaux P., Moreillon P. (2005): Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. J. Exp. Med. 201: 1627-1635. Que Y. A., Moreillon P. (2011): Infective endocarditis. Nat. Rev. Cardiol. 8: 322-336. Raoult D., Casalta J. P., Richet H., Khan M., Bernit E., Rovery C., Branger S., Gouriet F., Imbert G., Bothello E., Collart F., Habib G. (2005): Contribution of systematic serological testing in diagnosis of infective endocarditis. J. Clin. Microbiol. 43: 5238-5242. Renzulli A., Carozza A., Marra C., Romano G. P., Ismeno G., De Feo M., Della Corte A., Cotrufo M. (2000): Are blood and valve cultures predictive for long-term outcome following surgery for infective endocarditis? Eur. J. Cardiothorac. Surf. 17: 228-233. Richter S. S., Heilmann K. P., Dohrn C. L., Riahi F., Beekmann S. E., Doern G. V. (2008): Accuracy of phenotypic methods for identification of Streptococcus pneumoniae isolates included in surveillance programs. J. Clin. Microbiol. 46: 2184–2188. Rosenow C., Ryan P., Weiser J. N., Johnson S., Fontan P., Ortqvist A., Masure H. R. (1997): Contribution of novel choline-binding proteins to adherence, colonization and immunogenicity of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 25: 819-829. Ruoff K. L., Ferraro M. J. (1987): Hydrolytic enzymes of “Streptococcus milleri.” J. Clin. Microbiol. 25: 1645-1647.
77
Ruoff K. L., Whiley R. A., Beighton D. (2003): Streptococcus. In: Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H. (eds.), Manual of clinical microbiology, 8th ed., 405–421. ASM Press, Washington, D.C. Samen U., Eikmanns B. J., Reinscheid D. J., Borges F. (2007): The surface protein Srr-1 of Streptococcus agalactiae binds human keratin 4 and promotes adherence to epithelial HEp-2 cells. Infect. Immun. 75: 5405-5414. Sanford B. A., Davison V. E., Ramsay M. A. (1982): Fibrinogen-mediated adherence of group A Streptococcus to influenza A virus-infected cell cultures. Infect. Immun. 38: 513-520. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467. Senn L., Entenza J. M., Prod'hom G. (2006): Adherence of Abiotrophia defectiva and Granulicatella species to fibronectin: is there a link with endovascular infections? FEMS Immunol. Med. Microbiol. 48: 215-217. Sherman J. M. (1937): The streptococci. Bacteriol. Rev. 1: 3-97. Shewmaker P. L., Steigerwalt A. G., Shealey L., Weyant R., Facklam R. R. (2001): DNA relatedness, phenotypic characteristics, and antimicrobial susceptibilities of Globicatella sanguinis strains. J. Clin. Microbiol. 39: 4052-4057. Shinzato T., Saito A. (1994): A mechanism of pathogenicity of "Streptococcus milleri group" in pulmonary infection: synergy with an anaerobe. J. Med. Microbiol. 40: 118-123. Shottmuller A. (1903): Die Artunterscheidung der fur den menschen Pathogen Streptokokken durch Blutagar. Munch. Med. Wochenschr. 50: 849-853. Schlegel L., Grimont F., Ageron E., Grimont P. A., Bouvet A. (2003): Reappraisal of the taxonomy of the Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex and related species: description of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus subsp. nov., S. gallolyticus subsp. macedonicus subsp. nov. and S. gallolyticus subsp. pasteurianus subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53(Pt 3):631-45. Schleifer K. H., Kilpper-Baltz R. (1984): Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the genus Enterococcus nom. rev as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 34: 31-34. Schleifer K. H., Kraus J., Dvorak C., Kilpper-Bälz R., Collins M. D., Fischer W. (1985): Transfer of Streptococcus lactis and Related Streptococci to the Genus Lactococcus gen. nov. Systematic and Applied Microbiology 6: 183-195. Schnitzler N., Podbielski A., Baumgarten G., Mignon M., Kaufhold A. (1995): M or M-like protein gene polymorphisms in human group G streptococci. J. Clin. Microbiol. 33: 356-363. Schubert A., Zakikhany K., Pietrocola G., Meinke A., Speziale P., Eikmanns B. J., Reinscheid D. J. (2004): The fibrinogen receptor FbsA promotes adherence of Streptococcus agalactiae to human epithelial cells. Infect. Immun. 72: 6197-6205.
78
Sillanpää J., Nallapareddy S. R., Singh K. V., Ferraro M. J., Murray B. E. (2008): Adherence characteristics of endocarditis-derived Streptococcus gallolyticus ssp. gallolyticus (Streptococcus bovis biotype I) isolates to host extracellular matrix proteins. FEMS Microbiol. Lett. 289: 104-109. Simmon K. E., Hall L., Woods C. W., Marco F., Miro J. M., Cabell C., Hoen B., Marin M., Utili R., Giannitsioti E., Doco-Lecompte T., Bradley S., Mirrett S., Tambic A., Ryan S., Gordon D., Jones P., Korman T., Wray D., Reller L.B., Tripodi M. F., Plesiat P., Morris A. J., Lang S., Murdoch D. R., Petti C. A.; International Collaboration on Endocarditis Microbiology Investigators (2008): Phylogenetic analysis of viridans group streptococci causing endocarditis. J. Clin. Microbiol. 46(9): 3087-3090. Sinha B., Francois P., Que Y. A., Hussain M., Heilmann C., Moreillon P., Lew D., Krause K. H., Peters G., Herrmann M. (2000): Heterologously expressed Staphylococcus aureus fibronectin-binding proteins are sufficient for invasion of host cells. Infect. Immun. 68: 68716878. Smith L. M., Sanders J. Z., Kaiser R. J., Hughes P., Dodd C., Connell C. R., Heiner C., Kent S. B., Hood L. E. (1986): Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321: 674-679. Spellerberg B., Rozdzinski E., Martin S., Weber-Heynemann J., Schnitzler N., Lütticken R., Podbielski A. (1999): Lmb, a protein with similarities to the LraI adhesin family, mediates attachment of Streptococcus agalactiae to human laminin. Infect. Immun. 67: 871-878. Stein D. S., Nelson K. E. (1987): Endocarditis due to nutritionally deficient streptococci: therapeutic dilemma. Rev. Infect. Dis. 9: 908-916. Strom B. L., Abrutyn E., Berlin J. A., Kinman J. L., Feldman R. S., Stolley P. D., Levison M. E., Korzeniowski O. M., Kaye D. (1998): Dental and cardiac risk factors for infective endocarditis. A population-based, case-control study. Ann. Intern. Med. 129: 761-769. Sturt A. S., Yang L., Sandhu K., Pei Z., Cassai N., Blaser M. J. (2010): Streptococcus gallolyticus subspecies pasteurianus (biotype II/2), a newly reported cause of adult meningitis. J. Clin. Microbiol. 48: 2247-2249. Talkington D. F., Brown B. G., Tharpe J. A., Koenig A., Russell H. (1996): Protection of mice against fatal pneumococcal challenge by immunization with pneumococcal surface adhesin A (PsaA). Mikrob. Pathog. 21: 17-22. Tyrrell G. J., Lovgren M., Kress B., Grimsrud K. (2005): Varicella-associated invasive group A streptococcal disease in Alberta, Canada 2000-2002. Clin Infect Dis 40: 1055-1057. Tu A. H., Fulgham R. L., McCrory M. A., Briles D. E., Szalai A. J. (1999): Pneumococcal surface protein A inhibits complement activation by Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 67: 4720-4724. Uemura L., Grassi N. C., Cazarin L. (2001): Pneumococcal endocarditis of subacute evolution. Arq Bras Cardiol 76: 319-322.
79
Valentin-Weigand P., Grulich-Henn J., Chhatwal G. S., Müller-Berghaus G., Blobel H., Preissner K. T. (1988): Mediation of adherence of streptococci to human endothelial cells by complement S protein (vitronectin). Infect. Immun. 56: 2851-2855. van der Poll T., Opal S. M. (2009): Pathogenesis, treatment, and prevention of pneumococcal pneumonia. Lancet. 374: 1543-1556. Vandamme P., Pot B., Falsen E., Kersters K. , Devriese L. A. (1996): Taxonomic study of lancefield streptococcal groups C, G, and L (Streptococcus dysgalactiae) and proposal of S. dysgalactiae subsp. equisimilis subsp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 774-781. Vaněrková M., Žaloudíková B., Němcová E., Juránková J., Pol J., Černý J., Němec P., Freiberger T. (2010): Detection of Cardiobacterium valvarum in a patient with aortic valve infective endocarditis by broad-range PCR. J. Med. Microbiol. 59(Pt2):231-234. Veloso T. R., Amiguet M., Rousson V., Giddey M., Vouillamoz J., Moreillon P., Entenza J. M. (2011): Induction of experimental endocarditis by continuous low-grade bacteremia mimicking spontaneous bacteremia in humans. Infect. Immun. 79(5): 2006-2011. Veltrop M. H., Bancsi M. J., Bertina R. M., Thompson J. (2000): Role of monocytes in experimental Staphylococcus aureus endocarditis. Infect. Immun. 68: 4818-4821. Visai L., Bozzini S., Raucci G., Toniolo A., Speziale P. (1995): Isolation and characterization of a novel collagen-binding protein from Streptococcus pyogenes strain 6414. J. Biol. Chem. 270: 347-353. Von Reyn C. F., Levy B. S., Arbeit R. D., Friedland G., Crumpacker C. S. (1981): Infective endocarditis: an analysis based on strict case definitions. Ann. Intern. Med. 94: 505-518. Wilson M. L., Mirrett S., Reller L. B., Weinstein M. P., Reimer L. G. (1993): Recovery of clinically important microorganisms from the BacT/Alert blood culture system does not require testing for seven days. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 16: 31-34. Woo P. C., Tse H., Chan K. M., Lau S. K., Fung A. M., Yip K. T., Tam D. M., Ng K. H., Que T. L., Yuen K. Y. (2004): "Streptococcus milleri" endocarditis caused by Streptococcus anginosus. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48(2):81-88. Žaloudíková B., Němcová E., Pol J., Sorm Z., Wurmová S., Novotná K., Vaněrková M., Holá V., Růžička F., Dušek L., Němec P., Freiberger T. (2012): Value of PCR in surgically treated patients with staphylococcal infective endocarditis: a 4-year retrospective study. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (6): 1187-1194. Internetové zdroje: http://www.bacterio.cict.fr, ke dni 30.4. 2012 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi , ke dni 30.4. 2012 http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html, ke dni 30.4. 2012 http://147.8.74.24/16SpathDB/identifyBy16S_M.php, ke dni 30. 4. 2012 http://www.megasoftware.net/, ke dni 30.4. 2012 http://workbench.sdsc.edu/, ke dni 30.4. 2012
80
PŘÍLOHY Příloha 1: Srovnání sekvencí referenčních kmenů (barevně vyznačeny variabilní oblasti V2-V9) a) variabilní oblast V2
81
b) konzervativní oblast
82
C) variabilní oblast V3, počátek variabilní oblasti V4
83
d) variabilní oblast V4
84
e) variabilní oblast V5
85
f) variabilní oblast V6
86
g) variabilní oblast V7
87
h) variabilní oblast V8
88
ch) variabilní oblast V9
89
Příloha 2: Výsledky PCR, kultivace a konečná diagnóza IE
90
Pokr. Výsledky PCR, kultivace a konečná diagnóza IE
91
Příloha 3: Porovnání druhů G. morbillorum a G. haemolysans s klinickým vzorkem Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
GGATAACAGTATTTCTCGCATGAGAGATATTTAAAAGTTGGTTATGCTAA GGATAACAGCATTAACTGCATGGTTGATGTTTAAAAGTTGGTTTTGCTAA GGATAACAGCATTAACTGCATGGTTGATGTTTGAAAGTTGGTTATGCTAA
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
CACTATGAGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCC CACTATGAGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCC CACTATGAGATGGCTTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCC
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
CACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG TACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG CACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT GGACTGAGACACGGCCCAGAACTCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGA CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGA CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGA
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
TTTCGGTTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAATGGATATGTAGTAACT TTTCGGTTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAATGATTGTGTAGTAACT ATTCGGTTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAATGGATATGTAGTAACT
Gemella morbillorum Gemella haemolysans Vzorek
ATACATGTAAGAGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC ATACACAGTAGAGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC ATACATGTACGAGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC
92
