MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta DISERTAČNÍ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

DISERTAČNÍ PRÁCE

Lukáš FOJT

Brno 2007

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

Lukáš FOJT Působení elektromagnetických polí na biologické systémy

Disertační práce

Školitel: prof. RNDr. Vladimír Vetterl, DrSc.

Brno 2007

1

Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Lukáš Fojt

Název disertační práce: Působení elektromagnetických polí na biologické systémy

Název disertační práce anglicky: Effect of electromagnetic fields on biological systems

Studijní program: Fyzika

Studijní obor (směr), kombinace oborů: Biofyzika

Školitel: prof. RNDr. Vladimír Vetterl, DrSc.

Rok obhajoby: 2007

Klíčová slova v češtině: elektromagnetická pole, nízkofrekvenční magnetické pole, bakterie, kvasinky, AFM, elektrochemie

Klíčová slova v angličtině: electromagnetic fields, low frequency magnetic field, bacteria, yeasts, AFM, electrochemistry

2

© Lukáš Fojt, Masarykova univerzita, 2007

3

Rád bych poděkoval svému vedoucímu prof. RNDr. Vladimíru Vetterlovi, DrSc., za pomoc při vypracování této disertační práce. Děkuji svým spolupracovníkům Mgr. Luďkovi Strašákovi, Ph.D., za cenné rady v oblasti působení magnetických polí na organismy, a Mgr. Stanislavu Hasoňovi, Ph.D., za cenné rady v oblasti elektrochemie. Dále děkuji též všem pracovníkům naší laboratoře za to, že to se mnou při mé prácí vydrželi.

4

Abstrakt Elektromagnetická pole jsou všudypřítomnou součástí našeho životního prostředí. Ta přirozeného původu, jako například zemské geomagnetické pole, nás provázejí od počátku věků. Od dob průmyslové revoluce začíná člověk ve větší míře vytvářet elektromagnetická pole umělého původu. Jedná se zejména o používání a distribuci elektrické (a s ní úzce spjaté magnetické) energie. Již na počátku minulého století začalo vědce zajímat, jak tato uměle vytvářená elektromagnetická pole mohou interagovat s biologickými objekty. První studie se zabývaly zejména působením nízkofrekvenčních magnetických polí, posléze se do ohniska zájmů vědců dostala i pole vysokofrekvenční. Významným impulzem pro rozvoj těchto studií bylo rozšíření bezdrátových technologií. Z daného faktu – všeobecného rozšíření umělých elektromagnetických polí – tedy vyplývá nutnost prozkoumat jejich interakci s živými organismy. Jedná se zejména o upřesnění maximálních přípustných limitů expozice těmto polím. Výsledky dodnes uskutečněných studií jsou značně rozporuplné, od negativních až po pozitivní biologické účinky zkoumaných polí. Proto jsme se rozhodli prozkoumat působení 50 Hz magnetického pole na různé biologické objekty – jednalo se o bakterie, kvasinky a tkáňové kultury. Základním postupem bylo určování viability zkoumaných organismů po přísně definované expozici magnetickému poli. Vyhodnocení proběhlo zejména použitím počítání CFU – colony forming units (buněk schopných tvořit kolonie) – a měření absorbance buněčných kultur. Naše výsledky vykazují pro všechny použité bakteriální kmeny a kvasinky signifikantní pokles počtu buněk po expozici (jedná se o 20 – 40% pokles vůči kontrolní kultuře). Tento pokles je navíc pro různé bakteriální kmeny různý. Tyčinkovité bakterie jsou magnetickým polem ovlivněny více (dochází k vyššímu poklesu počtu bakterií) než bakterie kulovitého tvaru. Dále bylo k vyhodnocování efektů magnetického pole využito měření metabolické aktivity bakterií. Metabolická aktivita byla sledována buď za použití tetrazoliového testu a následného měření absorbance, nebo pomocí elektrochemických metod. Získané výsledky naznačují, že metabolická aktivita celé kultury poklesla. Tento pokles ovšem koresponduje s poklesem počtu buněk v kultuře. Další použitou metodou bylo AFM – mikroskopie atomových sil – pro určení strukturních efektů pole na bakterie. Tyto pokusy jsme provedli se zástupci tyčkovitých (E. coli) a kulovitých (P. denitrificans) bakterií. Ani po 48 minutové expozici magnetickým polem jsme nezaznamenali žádné signifikantní změny v morfologii bakterií . Nakonec byly provedeny pokusy na mnohobuněčných eukaryotických tkáňových kulturách. Zde jsme určovali stupeň kondenzace chromatinu, vliv na mitochondrie a strukturu cytoskeletu po chronické expozici magnetickému poli. Tkáňové kultury nebyly magnetickým polem významně ovlivněny, případné změny byly na samé hranici statistické významnosti.

5

Abstract Electromagnetic fields are ubiquitous part of the environment. The natural ones, such as the Earth’s magnetic field, guide us since creation of mankind. But since the time of the industrial revolution man has begun to produce artificial electromagnetic fields in much higher amount than ever before. It is caused mainly by electric energy (and closely connected magnetic energy) distribution. Nowadays, we are not able to imagine our lives without electricity. As early as on the beginning of the 20th century the electromagnetic fields and their impact on living organisms have become the subject of interest of many scientists. The first studies were done using low-frequency magnetic fields. Development and spreading of wireless technologies – radars, radio transmitters, later cell phones and wi-fi devices – play an important role for expansion of studies concerning with biological effects of electromagnetic field. This fact – ubiquitous spreading of electromagnetic fields – implies the necessity of such studies. The question is to specify the maximal exposure limits to these fields. The results from studies published up to now are a considerably controversial, varying from negative to positive biological effect of the studied fields. Supported by this fact, we decided to study the effects of 50 Hz magnetic fields on living organisms. These organisms were bacteria, yeasts and cell cultures. It was fundamental to distinguish the viability of used organisms after strictly defined magnetic field exposure. For evaluating purposes CFU (colony forming units) method and absorbance measuring were used. We found that all of the used bacterial strains and yeast are affected by the magnetic field exposure. Magnetic field killed about 20 – 40% of cells (compared to the control ones), and the effect is strain-dependent. The rod-like bacteria were affected around two times more then the spherical ones. We have also measured enzymatic activity of bacterial cultures. The activity was estimated using tetrazolium test or electrochemical reduction of durochinone. Our results show, that the bacterial enzymatic activity was probably not affected by the magnetic field exposure. We found certain decrease of metabolic activity of the culture, but it was possibly due to decrease of the number of cells in the culture. To measure the bacterial morphology (exposed to magnetic field), AFM (Atomic Force Microscopy) was used. For these experiments, we chose two bacterial cell types: rod-like (E. coli) and spherical (P. denitrificans). No changes in bacterial morphology were found using AFM technique. And finally, we carried out experiments with eukaryotic cell cultures. We estimated the degree of chromatin condensation, and the effects of magnetic fields to mitochondria and cytoskeleton. Cell cultures were slightly affected by magnetic field exposure. Observed effects were on the border of significance. 6

Obsah Abstrakt ...................................................................................................................................... 5 Abstract ...................................................................................................................................... 6 Obsah.......................................................................................................................................... 7 1. Úvod ....................................................................................................................................... 9 1.1. Elektromagnetická pole a jejich základní vlastnosti ....................................................... 9 1.1.1. Střídavá elektromagnetická pole ............................................................................ 12 1.2. Nízkofrekvenční elektromagnetická pole...................................................................... 13 1.2.1. Generování elektromagnetických polí o nízkých frekvencích ............................... 15 1.3. Elektromagnetická pole v blízkosti živých organismů ................................................. 15 1.4. Působení elektromagnetických polí na organismy – literární přehled .......................... 17 1.4.1. Epidemiologické studie .......................................................................................... 17 1.4.2. Experimentální práce.............................................................................................. 18 1.4.2.1. DNA, RNA, exprese a transkripce genů ......................................................... 19 1.4.2.2. Enzymatická aktivita a transport iontů............................................................ 20 1.4.2.3. Mikroorganismy, tkáňové kultury, proliferace a viabilita............................... 21 1.4.2.4. Ostatní zkoumané objekty ............................................................................... 23 1.4.3. Souhrnné a rešeršní publikace................................................................................ 24 1.5. Možné teoretické modely působení elektromagnetických polí..................................... 25 1.5.1. Electroconformational coupling (elektrokonformační párování)........................... 25 1.5.2. Oscillatory activation barrier (oscilační aktivace aktivační bariéry)...................... 26 1.5.3. Ion activation model (model aktivace iontů).......................................................... 26 1.5.4. Zeeman three state coulombic model (Zemanův jev) ............................................ 26 1.5.5. Larmor precession (Larmorova precese)................................................................ 26 1.5.6. Cyclotron resonance (cyklotronová rezonance) ..................................................... 27 1.5.7. Parametric resonance (parametrická rezonance).................................................... 27 1.5.8. Polarization force (polarizační síla) ....................................................................... 28 1.5.9. Cell array impedance (impedance seskupení buněk) ............................................. 28 1.5.10. Free radicals (volné radikály)............................................................................... 28 1.5.11. Parametric amplification (parametrická amplifikace).......................................... 29 1.5.12. Free ions (volné ionty) ......................................................................................... 30 1.6. Používané organismy .................................................................................................... 30 1.6.1. Bakterie .................................................................................................................. 30 1.6.1.1. Růst bakterií .................................................................................................... 30 1.6.1.2. Působení vnějších faktorů na bakterie............................................................. 32 1.6.1.3. Denitrifikační proces ....................................................................................... 33 1.6.2. Kvasinky................................................................................................................. 33 1.6.3. Tkáňové kultury ..................................................................................................... 34 1.7. Elektrochemické metody............................................................................................... 34 1.7.1. Cyklická voltametrie .............................................................................................. 35 1.8. AFM (mikroskopie atomárních sil)............................................................................... 35 2. Materiál a metody................................................................................................................. 37 2.1. Magnetické pole ............................................................................................................ 37 2.2. Použité organismy a kultivační média .......................................................................... 38 2.2.1. Bakterie .................................................................................................................. 38 2.2.2. Kvasinky................................................................................................................. 41 2.2.3. Tkáňové kultury ..................................................................................................... 42 2.3. Metody .......................................................................................................................... 42 2.3.1. Určování počtu bakterií a kvasinek ........................................................................ 42 2.3.1.1. Počítání CFU ................................................................................................... 43 7

2.3.1.2. Spektrofotometrie............................................................................................ 43 2.3.2. Určováni metabolické aktivity bakterií .................................................................. 43 2.3.2.1. Tetrazoliový test .............................................................................................. 43 2.3.2.2. Elektrochemické stanovení metabolické aktivity............................................ 44 2.3.3. Práce s tkáňovými kulturami.................................................................................. 45 2.3.3.1. Detekce F-aktinu ............................................................................................. 45 2.3.3.2. Barvení mitochondrií v živých buňkách ......................................................... 45 2.3.3.3. Fluorescence in situ hybridization (FISH) ...................................................... 45 2.3.3.4. Snímání vzorků, zpracování dat ...................................................................... 45 2.4. AFM analýza morfologie bakterií ................................................................................. 46 2.5. Statistické zpracování dat.............................................................................................. 46 3. Výsledky a diskuse............................................................................................................... 48 3.1. Bakterie ......................................................................................................................... 48 3.1.1. Viabilita bakterií..................................................................................................... 48 3.1.2. Metabolická aktivita bakterií.................................................................................. 51 3.1.3. Bakteriální morfologie ........................................................................................... 52 3.2. Kvasinky........................................................................................................................ 54 3.3. Tkáňové kultury ............................................................................................................ 54 4. Závěr..................................................................................................................................... 56 Seznam použité literatury......................................................................................................... 57 Seznam publikací ..................................................................................................................... 71 Přílohy ...................................................................................................................................... 72

8

1. Úvod

1.1. Elektromagnetická pole a jejich základní vlastnosti V poslední

době

došlo

ke značnému

rozšíření

výskytu

a

četnosti

umělých

elektromagnetických polí. Tento fakt nás vede k nutnosti prozkoumat, zda a jak mohou tato pole interagovat s biologickými objekty. Je důležité zjistit, jakým způsobem tato pole biologické objekty ovlivňují. Tato zjištění mohou pak posloužit k stanovení základních limitů pro expozici lidské populace těmto polím, aby nedocházelo k zbytečným negativním efektům na zdraví. Je tedy nutné elektromagnetická pole charakterizovat.

Pro popis elektromagnetického pole se zavádějí čtyři základní vektorové veličiny (označeny tučně): 1. vektor intenzity elektrického pole E [V.m-1], 2. vektor magnetické indukce B [C.m-2], 3. vektor elektrické indukce D [A.m-1], 4. vektor intenzity magnetického pole H [T].

V klasické elektrodynamice jsou tyto vektory - spolu s dalšími dvěma veličinami, proudovou hustotou j elektrických nábojů a objemovou hustotou volného elektrického náboje ρ - vázány Maxwellovými rovnicemi, na nichž je založena celá stavba klasické teorie elektromagnetismu.

Maxwellovy rovnice: ∂B , ∂t ∂D rotH = j + , ∂t divD = ρ, divB = 0, rotE = −

9

kde:

 ∂ ∂ ∂  + + div =  , ∂y ∂z   ∂x ∂ ∂ ∂ ∂ ∂   ∂ − , − , − . rot =  ∂z ∂z ∂x ∂x ∂y   ∂y

V materiálových prostředích s definovanou permitivitou ε, permeabilitou µ a měrnou vodivostí σ platí vztahy: D = εE, B , µ j = σE,

H =

přičemž pro elektricky a magneticky izotropní materiály jsou veličiny ε, µ a σ skaláry, pro materiály anizotropní představují tenzory. Poslední vztah je Ohmův zákon v diferenciálním tvaru.

Elektromagnetická pole je možno podle jejich časového průběhu rozdělit na:

a) statická E či B se s časem nemění.

b) pulzní Složka (nebo složky) vektoru elektrického a magnetického pole osciluje mezi nulovou a určitou hodnotou Emax nebo Bmax. c) sinusoidní Vektory magnetického nebo elektrického pole se mění podle vztahů: B = Bm.sin ωt, E = E m.sin ωt,

10

kde Em, Bm, jsou amplitudy elektrického a magnetického pole – maximální dosažené hodnoty v celém cyklu – a ω = 2πf je úhlová frekvence. Velikost pole může být charakterizována pomocí velikosti efektivních hodnot indukcí a intenzit (Bef, Eef,…), které odpovídají střední hodnotě polí v každé půlperiodě. Mezi amplitudou a efektivní hodnotou je vztah:

Bef =

Bm 2

Je-li T – perioda – dobou trvání jednoho cyklu, je potom f – frekvence – rovna:

f =

1 T

d) a jiná Pole vzniklá superpozicí polí zmíněných výše.

Pro naše experimenty bylo zvoleno magnetické sinusoidní pole. Je totiž jedním z nejrozšířenějších, protože je to pole utvářené (z valné většiny) průchodem elektrického proudu vodiči a hlavně spotřebiči ze síťového rozvodu. Tento proud má sinusoidní charakteristiku o frekvenci 50 Hz. Frekvence f (a tedy i vlnová délka λ) je důležitou charakteristikou daného pole:

λ =

v 2πv = f ω

kde v je rychlost vlnění, která je závislá na prostředí. Ve vakuu je to rychlost světla (c = 3.108 m.s-1). Při přechodu vlnění z jednoho prostředí do druhého je významnou veličinou hloubka průniku vlnění δ. Je to vzdálenost, ve které velikost pole poklesne na e-1 ( = 0,368) počáteční hodnoty. Pro její velikost platí u dobrých vodičů:

δ =

2 = ωµσ

1 πfµσ

11

Je vidět, že frekvence elektromagnetických polí hraje v jejich vlastnostech velice podstatnou roli.

1.1.1. Střídavá elektromagnetická pole Sinusoidní pole jsou obecně popsána těmito rovnicemi: B = Bm. cos ωt, rotE = −

∂B , ∂t

pro f ≠ f(t): E = Bm.sin ωt.

český název

frekvence [Hz]

extrémně dlouhé vlny 30 - 300

vlnová délka [m]

anglické označení

107 - 106

Extremely Low Frequency (ELF) Voice Frequency (VF) Very Low Frequency (VLF)

telefonní pásmo

(0,3 - 3).103

106 - 105

velmi dlouhé vlny

(3 - 30).103

105 - 104

dlouhé vlny (DV)

(30 - 300).103

104 - 103

Low Frequency (LF)

střední vlny (SV)

(0,3 - 3).106

103 - 102

Medium Frequency (MF)

krátké vlny (KV)

(3 - 30).106

100 - 10

High Frequency (HF)

velmi krátké vlny (VKV) ultra krátké vlny (UKV)

(30 - 300).106

10 - 1

(0,3 - 3).109

1 - 0,1

Mikrovlny

(3 - 30).109

10-1 - 10-2

Mikrovlny

(30 - 300).109

10-2 - 10-3

infračervené záření

1010 - 1014

10-3 - 10-6

Infra Red (IR)

viditelné záření

1014

(800 - 400).10-9

Visible (VIS)

ultrafialové záření

1014 - 1016

(400 - 10).10-9

Ultra Violet (UV)

roentgenovo záření

1016 - 1019

(10 - 0,1).10-9

X-Rays

gama záření

1019 - 1024

10-10 - 10-14

Gamma Rays

Very High Frequency (VHF) Ultra High Frequency (UHF) Super High Frequency (SHF) Extremely High Frequency (EHF)

Tab. 1. Elektromagnetické spektrum dle IEEE (Institute of electrical and electronic engineers). 12

Elektromagnetická nestatická pole můžeme rozlišovat nejen podle jejich časového průběhu, ale také podle jiných kritérií, jako je například jejich vlnová délka (resp. frekvence). V tabulce uvedené výše (tab. 1) je dané roztřídění provedeno.

1.2. Nízkofrekvenční elektromagnetická pole Nízkofrekvenční elektromagnetická pole jsou nejrozšířenějším typem uměle vzniklých polí vůbec.

Frekvence

50 Hz

300 Hz

1000 Hz

Perioda

0,02 s

0,00333 s

0,001 s

vlnová délka ve vakuu

6000 km

1000 km

300 km

hloubka průniku

225 m

90 m

50 m

(pro tkáně σ ~ 10-1 S.m-1) Tab. 2. Vlastnosti elektromagnetických polí o nízkých frekvencích

Z tabulky 2 vyplývá, že nízkofrekvenční pole (ELF pole) mají vlnovou délku výrazně vyšší, než jsou rozměry exponovaných objektů (pokud jsou rozměry objektů přibližně stejné jako vlnová délka záření, dochází k absorpci energie záření). Stejně tak jsou charakteristická i velkou hloubkou průniku. Nízkofrekvenční pole přenášejí minimum energie (energie kvanta E = h.f, h = 6,63.10-34 J.s-1 – Planckova konstanta, tedy E je řádově rovna ~ 10-31 J). Oproti energii tepelného šumu, jež se pohybuje řádově v hodnotách kT (kde k = 1,38.10-23 J.K-1 – Boltzmannova konstanta, T – absolutní teplota, a to je pro laboratorní teploty ~ 10-21 J) je energie elektromagnetického kvanta zanedbatelná. Podobně je tomu i při srovnání s energií chemických vazeb, jež se pohybuje v hodnotách jednoho elektronvoltu ~ 1,6.10-19 J. S živými organismy interagují ELF pole nepárově, to znamená, jako by působilo magnetické a elektrické pole nezávisle na sobě, každé zvlášť [1]. Díky tomuto charakteru nízkofrekvenčních polí a jejich nízkým energiím můžeme u nich používat názvu elektrická a magnetická pole.

Nejčastějším zdrojem těchto polí je činnost člověka. Uvádíme zde tabulku, kde jsou přibližné hodnoty velikosti magnetické indukce:

13

nízkonapěťové elektrické vedení

0,04 µT (*)

domácnost – průměrná hodnota

0,1 µT

osobní počítač

0,1 µT (*)

barevná televize - 30 cm

0,7 µT

elektrický holící strojek - 15 cm

10 µT

domácnost s elektrickým topením

12 µT

vysokonapěťové elektrické vedení

30 µT

motorový generátor el. proudu

18 µT (*)

elektrický adaptér síťového napětí

25 µT (*) 50 µT

fén - 15 cm lékařské přístroje

1000-16000 µT

Tab. 3. Velikosti magnetické indukce pro dané zdroje

Údaje označené hvězdičkou jsou naměřeny pomocí měřiče magnetické indukce BMM-3000 Environmentor (Švédsko), ostatní pocházejí z [2]. Stručný přehled hodnot magnetických indukcí naměřených v městské hromadné dopravě je možné vidět v tab. 4.

Interval Počet změřených Maximum Medián Průměr spolehlivosti dat [nT] [nT] [nT] [nT] tramvaj stání 3012 1160 50 77,6 3,2 tramvaj jízda 9588 7230 80 145,1 5,5 trolejbus stání 1030 2230 220 319,6 20,4 trolejbus jízda 3339 3230 230 318,2 12,0 metro stání 2269 90 2 6,4 0,5 metro jízda 7867 8170 20 80,1 5,4 Tab. 4. Hodnoty magnetické indukce pro prostředky městské hromadné dopravy. Data byla naměřena pro metro v Praze, trolejbusy v Brně a pro tramvaje v Brně a Ostravě. Minimální hodnota B byla 0. Data pocházejí z [3, 4]. Expoziční limity magnetickým polem o frekvenci 50 Hz (60 Hz) pro lidskou populaci již byly stanoveny. Liší se pouze stanoviska jednotlivých institucí a států. Zde v tabulce 5 uvádíme tyto hodnoty uváděné ICNRIP komisí (International Comission for Non-Ionizing Radiation Protection) a Evropskou Unií.

14

ICNRIP kritéria

EU kritéria

[mT]

[mT]

1. 8-hodinová expozice

0,5

1,6

2. Krátkodobá expozice

5

3. Končetiny

25

25

1. 8-hodinová expozice

0,1

0,64

2. Krátkodobá expozice

1

Pracovníci profesně vystavení magn. polím

Ostatní

3. Končetiny

25

Tab. 5. Limitní hodnoty B pro expozici magnetickým polem [5].

1.2.1. Generování elektromagnetických polí o nízkých frekvencích Pro účely výzkumu interakcí daných polí s biologickými objekty se setkáváme s těmito třemi metodami jejich vytváření:

A. Přímo generovaná pole jsou vytvářena inertními elektrodami vnořenými do biologického prostředí.

B. Kapacitně vytvořená pole tvoří sinusoidní vlny aplikované přes dielektricky stíněné elektrody, které jsou umístěny na vnější straně nádoby se vzorkem.

C. Indukčně vytvořená pole jsou pole vytvořená cívkami – Helmholtzovy cívky, solenoidy, válcové cívky a další.

1.3. Elektromagnetická pole v blízkosti živých organismů A. Nízkofrekvenční elektrické pole na rozhraní tkáň-vzduch Při průchodu vlnění ze vzduchu (prostředí 1, ε1 ~ 10-11 F.m-1, σ1 ~ 10-13 S.m-1) do tkáně (prostředí 2, ε2 ~ 10-5 F.m-1, σ1 ~ 10-1 S.m-1) dojde ke změnám ve vektoru elektrické indukce. 15

Použitím zákona zachování energie můžeme dojít k poměru mezi velikostí elektrického pole vně tkáně (E1) a uvnitř (E2) (50 Hz pole):

E2 ≈ 3.10−8 E1 Siločáry elektrického pole jsou prakticky kolmé k povrchu těla. Tkáň výrazně mění vlastnosti tohoto pole. Vnější elektrické pole v těle indukuje proud, jehož směr je rovnoběžný se směrem elektrického pole. Velikost indukovaného proudu má potom proudovou hustotu rovnou j = σ .E

B. Nízkofrekvenční magnetické pole na rozhraní tkáň-vzduch Vlastnosti magnetického pole v daném prostředí jsou dány magnetickou permeabilitou této látky. V případě rozhraní tkáň-vzduch se situace velice zjednodušuje. Tkáň má totiž přibližně stejnou permeabilitu jako vzduch, čili asi µ ≈ 4π.10-7 H.m-1. Vnější magnetické pole, stejně jako elektrické, bude v těle indukovat proud. Ten bude pro magnetické pole rotovat v záporném smyslu kolem vektoru magnetické indukce (což vyplývá z Faradayova zákona).

Velikost indukce

Velikost indukce

Indukovaná proudová

pro trup [mT]

pro hlavu [mT]

hustota [mA.m-2]

>60

>250

>1000

účinek

extrasystoly, ventrikulární fibrilace

6-60

25-250

100-1000

změny v excitabilitě nervového systému

0,6-6

2,5-25

10-100

možný vliv na nervový systém a na srůstání kostí

0,06-0,6

0,25-2,5

1-10

minimální efekty

Tab. 6. Možné efekty magnetických polí o různých indukcích na člověka [1].

16

1.4. Působení elektromagnetických polí na organismy – literární přehled V literatuře

nacházíme

velké

množství

prací

zabývajících

se

tematikou

vlivu

elektromagnetických polí na organismy. První práce s touto tématikou byla publikována již začátkem minulého století [6]. Elektromagnetická pole je možné z hlediska posuzování jejich bioefektů rozdělit několika způsoby. Jedná se buď o pole statická nebo pulzní. Pulzní pole jsou

dále

členěna

podle

jejich

frekvence.

Nejčastěji

zkoumanými

poli

jsou

(elektro)magnetické 50 Hz (v zámoří 60 Hz) pole (ELF EMF – extremely low frequency electromagnetic field – extrémně nízkofrekvenční (ELF) elektromagnetické pole (EMF)). Dalšími významnými poli jsou pole mikrovlnná, a to při frekvencích (či v jejich blízkosti): 900, 1800, 1900 MHz (jsou to frekvence, na kterých pracují mobilní telefony druhé generace). Dále se zkoumají účinky polí o frekvenci 2450 MHz jakožto průmyslové frekvence (tzn. frekvence používaná např. u mikrovlnných trub, vysoušecích pecí apod.). V poslední době se však začínají používat i jiné frekvence v mikrovlnném pásmu, a to pro rozšiřující se wi-fi sítě, mobilní telefony třetí generace a jiná bezdrátová zařízení. Pro tuto práci jsou nejvýznamnější studie v pásmu ELF EMF pro magnetická pole.

1.4.1. Epidemiologické studie Epidemiologické studie se z větší míry zabývají zvýšeným rizikem vzniku různých druhů rakovinného bujení. Studie jsou zaměřovány jak na pracovníky, kteří při vykonávání své profese přicházejí ve větší míře do styku s EMF, tak na ostatní obyvatelstvo. Nejčastěji sledovaným rizikovým faktorem je bydliště poblíž vysokonapěťového elektrického vedení. Velká pozornost je zejména věnována zvýšeným rizikům vzniku rakoviny pro děti. První epidemiologickou studií, která dávala v souvislost EMF a vznik rakoviny, byla studie úmrtí dětí na rakovinu z roku 1979 [7]. Bylo zjištěno, že u dětí žijících v domácnostech, kde jsou vystaveny vysokým hodnotám expozice EMF, je riziko vzniku leukémie a lymfomů dvakrát až třikrát vyšší. V následujících letech bylo provedeno množství dalších studií, z nichž některé tuto teorii potvrzovaly [8-12] a některé zvýšené riziko výskytu rakovinného bujení nepotvrzovaly [12-17]. Výsledky mnohých z těchto studií byly nicméně založeny pouze na malém počtu nemocných dětí exponovaných vysokými hodnotami EMF. Dalším problémem bylo stanovení expozice. Souhrnem lze tedy vyvodit, že zvýšené riziko vzniku leukémie u dětí vystavených vyšším hodnotám EMF není těmito studiemi zatím jasně

17

potvrzeno ani vyvráceno. Shrnutí studií zabývajících se touto tematikou je možné nalézt v [18]. Samozřejmě existuje i celá řada dalších studií pojednávajících o možném vlivu elektromagnetických polí na lidský organizmus nejen u dětí. Studie zkoumající možné zvýšení rizika vzniku leukémie u dospělých po expozici ELF EMF jsou shrnuty v [19]. I další práce [20] nacházejí možnou spojitost mezi ELF EMF a zvýšeným rizikem výskytu leukémie u dospělých. Dalším příkladem studia vlivu ELF EMF je práce [21] , kde vědci dochází k závěru, že expozice magnetickému poli nezvyšuje riziko vzniku rakovinu prsu u žen, naopak studie [22] přichází se zjištěním, že expozice EMF ELF toto riziko zvyšuje. Nesignifikantní zvýšení rizika pro výskyt rakoviny mozku je zjištěno v [23]. Skupina McElroyové nezjistila zvýšené riziko vzniku rakoviny endometria při používání elektrických deček a matrací [24]. Studovaným efektem nejsou jen různé druhy rakovinného bujení. Za příklad mohou sloužit studie, vyvozující možný efekt ELF EMF při vzniku Alzheimerovy choroby [25, 26]. Pro mikrovlnné pásmo je zaznamenán vzrůst počtu postižených některým druhem rakovinného bujení u operátorů vojenských radarů [27]. Bylo zjištěno mírné zvýšení výskytu rakovin u osob, sloužících v U. S. Army [28], stejně tak jako mírné zvýšení výskytu mozkových nádorů u amerických letců [29]. Souhrn epidemiologických studií pro mikrovlnné pásmo můžeme nalézt v [30]. Je nutné podotknout, že zjištěný efekt u určitých profesí nemusí být nutně způsoben vlivem elektromagnetických polí, ale může se jednat o jiný, opomíjený faktor (např. chemikálie používané elektrikáři). Některým studiím je též vytýkána metodika shromažďování dat a jejich následné analýzy [29]. Epidemiologické studie naznačily, že ELF EMF mohou být člověku nebezpečné. Nejednotnost jejich výsledků způsobila, že účinky ELF EMF začaly být lépe a podrobněji studovány na molekulární a buněčné úrovni.

1.4.2. Experimentální práce Experimentální práce, narozdíl od epidemiologických, studují efekty přesně definovaných polí na pokusné organismy. Výzkum v tomto oboru prošel vývojem od studií, kde byly používány velmi vysoké hodnoty magnetických indukcí B (pro magnetická pole) nebo výkonu P (pro mikrovlnná pole) s minimální dozimetrií, až po dnešní stav, kdy je většina studií prováděna pro hodnoty B i P vyskytujícím se v okolním prostředí. Samozřejmostí je 18

také přísná a přesná dozimetrie, což by mělo umožnit opakování pokusů v na sobě nezávislých laboratořích (čehož není pro výzkum v rámci EMF vždy dosaženo). Pro mikrovlnná pole je velmi zásadním problémem určení, zda se dané efekty projevily jen díky přítomnosti pole nebo jako vedlejší efekt absorpce záření - zvýšení teploty zkoumaného objektu. Pokud se teplota zvýší a zároveň nemůžeme vyloučit, že sledovaný efekt je ovlivněn změnou teploty, hovoříme o termálních efektech polí. Pokud se teplota nezmění nebo jsou efekty dané jejím zvýšením dostatečně popsány, a přesto nejsou plně vysvětleny, hovoříme o netermálním působení polí. V rámci pásma ELF je působení takřka vždy netermální. Experimentální práce lze rozdělit podle efektu, který je v nich studován.

1.4.2.1. DNA, RNA, exprese a transkripce genů Změny v expresi genů (způsobené expozicí EMF) jsou považovány za jednu z možných příčin vzniku rakovinného bujení (pozorovaného v různých epidemiologických studiích, viz. 1.4.1.) [31]. Zprvu se předpokládalo, že geny ovlivněné EMF jsou normálně exprimované geny pro růst a diferenciaci [32]. Později bylo však zjištěno, že ovlivněna je i transkripce genů řídících buněčnou proliferaci [33]. Jedná se velmi často o pozorování změn v expresi a transkripci protoonkogenů c-fos, c-jun a c-myc, studie [33-35] zaznamenávají jejich zvýšenou transkripci, a to až 2,5x pro c-fos. Oproti tomu [36, 37] žádnou změnu po expozici ELF EMF pro tyto protoonkogeny neuvádějí. Asi nejintenzívnější studií exprese genů v lidských buňkách byla provedena Goodmanovou a Hendersonem. Ve svých pracích zjistili zvýšení transkripce c-myc,

β-actinu a histonu H2B v lidských buňkách HL60 [38-40]. [41] podává zjištění o dvoj- až trojnásobném zvýšení hladiny mRNA. Jednalo se o expozice ELF EMF s velikostí magnetické indukce nepřesahující 1,1 mT. Zajímavé potom je, že žádná z opakovaných studií [42-45] tyto závěry nepotvrdila, i když postup byl stejný jako u originálních studií a [45] byla vykonána přímo v laboratoři Goodmanové a Hendersona. Novější studie [46] zaznamenává pro vyšší hodnoty B (2,3 mT, 6 hodin, 50 Hz) zvýšenou expresi c-jun, p21 a egr-1 mRNA v pluripotentních embryonálních buňkách s nedostatkem p53 (v normálních buňkách nebyly zaznamenány žádné změny). Pro nižší hodnoty expozice a delší expoziční časy nebyly žádné efekty pozorovány. Vliv na hladinu protoonkogenní mRNA (myc, jun, fos) po expozici signálem mobilních telefonů byl zjišťován v [47]. Po expozici došlo k cca dvojnásobnému statisticky signifikantnímu zvýšení hladiny fos.

19

Co se týče vlivu EMF na DNA, je nejvíce studovanou oblastí vznik jejího poškození po expozici EMF. Existuje mnoho studií, kde je popisován vznik jedno- a dvouřetězcových zlomů po expozici 50 Hz magnetickým polem. B nepřesahovala 1 mT, maximální doba expozice byla 24 hodin [48-50]. Existují ale také studie, které vznik zlomů DNA po expozici ELF EMF nepopisují [51]. Pro samotnou DNA je situace podobná také u mikrovlnných polí. Všechny následující studie jsou v rámci frekvencí 800 - 2450 MHz. Možné efekty jsou z energetického hlediska svými autory posuzovány jako netermální. Existují práce, které potvrzují poškození DNA či RNA [52, 53], ale i takové, které ji zamítají [54, 55]. Někteří autoři uvádějí dokonce snížení poškození DNA vůči kontrole [52]. Lai a Singh naznačují možnosti zvýšení počtu jednoa dvouřetězcových zlomů DNA v mozcích krys po expozici 2450 MHz polem [56, 57]. Tyto výsledky jsou však napadeny v práci [58], kde nebyl pozorován žádný efekt. Autoři se domnívají, že efekt v pracích [56, 57] je způsoben nesprávným usmrcením (hypoxie CO2) krys, které samo o sobě produkuje sledované zlomy DNA. Zlomy v DNA po expozici mikrovlnným polem byly ale také nalezeny v pracích [59, 60], opět zde existuje recentní práce, ve které není vznik zlomů DNA pozorován [61].

1.4.2.2. Enzymatická aktivita a transport iontů Mezi nejstudovanější enzymy, co se týče vlivu EMF na jejich aktivitu, patří ornithin dekarboxyláza (ODC, důležitý enzym, regulující syntézu DNA. Zvýšení jeho aktivity doprovází promoční fázi nádorového bujení) a různé iontové pumpy, obzvláště ATPázy. Pro ODC ovlivněnou jak magnetickým, tak mikrovlnným polem bylo zjištěno zvýšení aktivity u různých pokusných objektů [61-67]. A stejně jako pro většinu ostatních zkoumaných efektů EMF i zde existují studie, které žádné ovlivnění ODC po expozici EMF pro různé experimentální objekty nepotvrzují [35, 68-71]. ATPázy hrají v buňce důležitou roli . Jejich úkolem je aktivní (tzn. za spotřeby energie, v tomto případě ATP) transmembránový transport různých iontů. Tímto způsobem buňka reguluje své pochody, přenáší se tak nervové vzruchy. Proto změnou vlastností těchto enzymů může dojít k dalekosáhlým důsledkům uvnitř studovaného objektu. Zvýšenou aktivitu ATPáz (jmenovitě Na/K) po expozici magnetickým polem pozoruje Tsong [72] a Blank [73-75]. V [76, 77] nebyl zjištěn žádný efekt ELF EMF na Ca/Mg-ATPázy. V literatuře nacházíme také práce zabývající se jinými enzymy. Jde například o zvýšení aktivity cytochrom oxidázy po expozici ELF EMF [78], zvýšení aktivity cAMP-dependentní

20

proteinkinázy A [79], zvýšení aktivity proteinkinázy C [80], snížení aktivity adenylátkinázy [81]. Expozice 50 Hz magnetickým polem neovlivnila hladinu melatoninu samiček krys [82] ani denitrifikační aktivitu bakterií P. denitrificans [83]. Mikrovlnné záření emitované komerčními mobilními telefony vyvolalo změny ve struktuře a kinetice acetylcholinesterázy [84]. Z hlediska transportu iontů patří k nejsledovanějším Ca2+. Je to dáno tím, že koncentrační gradinet Ca2+ je obrovský (koncentrace volného Ca2+ v buňce je cca 10-4 mmol, vně buňky 1,5 mmol) a celková elektrochemická síla ženoucí jej do buňky převyšuje i Na+. Po otevření vápníkových kanálů dochází k vniku Ca2+ do cytoplazmy a spouští se celá řada dějů, jako např. svalový stah, exocytóza mediátoru na synapsi, sekrece hormonů, aktivace enzymů aj. [85]. První studie vlivu ELF EMF se zaměřily na výtok Ca2+ z mozku. Zaznamenané efekty byly pro všechny studie ve stejném frekvenčním i amplitudovém okně, lišily se pouze zvýšením [86] či snížením toku Ca2+ [87, 88]. Další studie zjišťovaly efekt ELF EMF na tok Ca2+ v lymfocytech [89-92] a makrofázích [93]. Všechny tyto práce zaznamenaly stimulaci vápníkového toku. Studie na lidských erytrocytech, kde byly k expozici použity jak mikrovlny, tak nízkofrekvenční magnetické pole, nezaznamenávají žádnou změnu pro použité magnetické pole, pro pole mikrovlnné je dokonce zaznamenán pokles výtoku Ca2+ iontů [77]. Granfield [94] nezjistil žádné změny v toku vápníku v leukemických lymfocytech při expozici mikrovlnným polem. Novější studie [95] pozoruje zvýšení počtu napěťově řízených Ca2+ kanálů po expozici 50 Hz magnetickým polem, a tím i následné zvýšení toku vápníkových iontů. Studie [96] si zase všímá oscilací vápníku v Langerhansových ostrůvcích po expozici 50 Hz a statického magnetického pole. Nebyl zjištěn žádný efekt. V organismech však existují i jiné ionty, než je vápník. Všimli si toho i někteří vědci, a tak se rozhodli prozkoumat efekty EMF i pro ně. Tak například [97] si všímá Na a K kanálů a tím i toku Na+ a K+ iontů. Dochází zde k ovlivnění kinetiky těchto kanálů v modelu obřího axonu chobotnice. Zvýšení toku těchto iontů po expozici ELF EMF je pozorováno i v [98, 99].

1.4.2.3. Mikroorganismy, tkáňové kultury, proliferace a viabilita Mikroorganismy patří k užitečným modelovým systémům pro zkoumání vlivu vnějšího prostředí, tedy i EMF [100]. Jejich vnitřní pochody jsou již dostatečně známy a mnohdy je již dekódována i jejich genetická struktura. Vnitřní stavba mikroorganismů je relativně jednoduchá, stejně jako práce s nimi a nároky na kultivaci. Z těchto důvodů je tedy zřejmé, že

21

bakterie a kvasinky neunikly pozornosti vědců ani při zkoumání efektů elektromagnetických polí. Studie [101] porovnává pokles počtu bakterií E. coli vystavením mikrovlnnému záření (2450 MHz) a působení tepla. Teplota dosažená oběma metodami byla stejná. Nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi těmito dvěma způsoby inaktivace bakterií. Podobný výsledek, kde jsou různé bakteriální kmeny exponovány 2450 Hz poli, je zjištěn v [102]. Bakterie jsou zabity pouze tehdy, pokud obsahují vodu. Lyofilizované a sušené (živé) bakterie usmrceny nebyly. Baktericidní efekt pro vysokovýkonné mikrovlnné pole je zaznamenán v [103, 104]. Články [105-107] si všímají možnosti využití mikrovln k sterilizaci různých nástrojů. V další práci [108] je pozorován konformační stav genomu E. coli po expozici 51,62 - 51,84 GHz a 41,25 41,50 GHz poli metodou AVTD (anomalous viscosity time dependencies). Bylo zjištěno, že výkonová hustota 1 µW.cm-2 způsobí blokaci reparačního systému indukovaného radiací. Studie [109] určila stejnou metodou rezonanční frekvenci pro E. coli 51,755 GHz. Netermální efekt milimetrových vln na růst kvasinek je popsán Grundlerem [110]. Je zaznamenána jak inhibice růstu, tak promoce růstu kvasinek v závislosti na použité frekvenci pole. Změny v růstu lidských tkáňových epitelových buněk po expozici GSM signálem zaznamenala Kwee [111]. V práci [112] pak upřesňuje, že sledované efekty na proliferaci buněk jsou netermálního charakteru. Souhrnné informace o mikrovlnných polích a mikroorganismech podávají práce [113, 114]. Nutno podotknout, že o termálních efektech jsou zmínky hlavně v literatuře starší 20 let. Studie s ELF EMF zaznamenaly pro různé bakteriální kmeny, zejména E. coli, jak stimulaci růstu [100, 115], jeho inhibici [116, 118, 119] i růst beze změn [120, 121]. Del Re pozoruje rozdílné efekty různých typů použitých magnetických polí na viabilitu E. coli [122]. V [123, 124] je zkoumán efekt silného (řádově jednotky Tesla) statického magnetického pole na růst bakterií E. coli. Bylo zjištěno, že efekt pole je závislý na stádiu růstu bakterií a vlastnostech kultivačního média, kde se bakterie právě nacházejí. Podobné výsledky jsou i při použití jiných bakteriálních kmenů [125]. Práce [126] popisuje pro podobné magnetické pole za specifických kultivačních podmínek výrazné zvýšení počtu bakterií. Oproti tomu [127] nenaznamenává žádné zvýšení počtu bakterií Paramecium caudatum po expozici statickým magnetickým polem 4,3 T, dochází pouze ke zmenšení exponovaných kolonií a k časové prodlevě pro dosažení maximálního počtu bakterií. Podobný výsledek byl dosažen i s bakteriemi Leptospira interrogans serovar canicola [128]. Efekty statických magnetických polí byly studovány též na tkáňových kulturách [129], kde nám autoři ukazují přehled morfologických efektů těchto polí. Byla sledována i morfologie gliových buněk po expozici 22

ELF EMF [130], nebyly však pozorovány žádné změny oproti kontrolní skupině. ELF EMF způsobilo sníženou proliferaci u lymfocytů [131, 132], dvakrát zvýšenou pro fibroblasty [133] a zvýšenou pro prsní rakovinné buňky [134]. Mezi buňky, u kterých byla pozorována stimulace proliferace patří dále rakovinné buňky HL 60 [135, 136], epidermální buňky myší JB6 [137], nebo červené krvinky [138]. Inhibici bylo naopak možno pozorovat u lidských amniotických buněk [69] nebo u myších kostních buněk [139].

Častým experimentálním objektem jsou též kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Byla pozorována jak inhibice jejich růstu po expozici ELF EMF [140], tak nárůst proliferace [141]. V práci [142] byl zjištěn efekt na expresi genů u S. cerevisiae, [143] žádné změny v expresi genů nepozoruje. Kvasinky byly zkoumány i po ovlivnění statickým magnetickým polem [144] (zjištěn minimální rozdíl v proliferaci, ale takřka 37% nárůst v produkci CO2). Při použití jak statického, tak 50 Hz magnetického pole nebyla zjištěna žádná změna v proliferaci

S. cerevisiae [145].

1.4.2.4. Ostatní zkoumané objekty V odborné literatuře se můžeme setkat se studiemi, zabývajícími se efekty EMF na různé biologické objekty. V předchozích podkapitolách jsem uvedl nejstudovanější biologické systémy, v této kapitole je nastíněna i další studovaná problematika. Hematoencefalická bariéra (tzv. BBB, blood-brain barrier) ochraňuje savčí mozky před potenciálně nebezpečnými složkami. Propustnost této bariéry v krysích mozcích byla pro různé molekuly zkoumána zejména po expozici mikrovlnnému poli. Práce [148] nalézá pro vyšší hodnoty SAR (Specific Absorbtion Rate, charakterizuje množství energie pohlcené určitou hmotou za daný čas) (240 W.kg-1) její zvýšenou propustnost, v publikaci [149] jde o zvýšenou propustnost BBB pro albumin a fibrinogen (SAR = 2 W.kg-1) . Toto je potvrzeno v pracích [150, 151]. Studie pro SAR = 0,2 a 6 W.kg-1 již zvýšenou propustnost krysích mozků nepozoruje [152]. Ve studii [153] je použit in vitro model působení mikrovln na propustnost BBB, která je také pozorována. Po úpravě experimentálních parametrů tak, aby se více blížily reálné BBB, již zvýšená propustnost pozorována není [154]. Autoři studie [155] se domnívají, že expozice mikrovlnným polem za vyloučení termálních efektů působí zvýšenou indukci proteinu hsp70 (hsp proteiny pomáhají udržet konformaci buněčných proteinů v průběhu period stresu). Studie [156] potvrzuje zvýšení indukce hsp70 proteinů (tzn. zvýšení ochrany buňky) po ovlivnění jak RF (radiofrekvenční pole), tak ELF pro 20 min. expozice, pro dlouhodobé expozice se snižuje ochrana vůči UV záření. To

23

potvrdila pro RF pole i studie [157]. V [158] se dozvídáme, že expozice 60 Hz polem indukuje produkci hsp70 ve stejné míře jako jiné stresory. Zvýšení indukce hsp16 po expozici ELF EMF popisuje [159], zvýšení počtu hsp potvrzuje i [160]. Oproti tomu [161] ani [162] nezaznamenávají žádné změny v počtu hsp po expozici jak ELF EMF, tak mikrovlnami. Pokusnými objekty při výzkumu efektů ELF byli i lidé. Jednalo se zejména o studie ovlivnění vnímání, spánku a mozkové činnosti. Bylo zjištěno, že GSM signál ovlivňuje pomalé mozkové potenciály, ale nebylo zjištěno žádné ovlivnění lidského vnímání jako celku [163], naopak studie [164] popisuje ovlivnění pozornosti u lidí po expozici GSM signálem. Bylo zjištěno ovlivnění mozkové aktivity během spánku [165] a ovlivnění činnosti mozku během poslechového úkolu [166] při expozici GSM signálem. Studie [167] nenachází žádné ovlivnění sluchu po 30 minutové expozici 800 MHz signálem mobilních telefonů. [168] nenachází žádné efekty 50 Hz magnetických polí na lidské vnímání. Souhrny studií věnujícím se tomuto tématu můžeme nalézt v [169, 170]. V literatuře je možné najít mnoho dalších studií, zabývajících se vlivem EMF na biologické objekty. Je tím například zjištění o vlivu 0,4 T nehomogenního rotačního pole na kosti krys [171], dále 50 Hz 1 mT magnetického pole na lidskou motoriku [172] – bylo zjištěno, že magnetické pole snižuje úroveň třesu prstů, studie [173] nachází ovlivnění – zmenšení – krysích varlat po expozici mikrovlnným 900 MHz polem. Pro úplnost nyní uvedeme i aplikace EMF polí v medicíně. Nízkofrekvenční pulzní elektromagnetická pole se využívají pro léčbu fraktur kostí [174, 175], statické magnetické pole je nezbytnou součástí vyšetření při magnetické rezonanci. Dokonce se uvažuje o použití EMF při genové terapii [176-178]. Nejznámější medicínskou aplikací pro mikrovlnné pole je jeho použití při odstraňování nádorů. Na toto téma existuje mnoho odborných prací, jako např. [179-182]. Jednou z prvních studií na toto téma byla práce Webba v časopise Science [183], kde je popsána odlišná absorbce mikrovlnného záření normálními a rakovinnými buňkami. Nemá smysl zde zaznamenávat všechny provedené práce, výsledky jsou, jak bylo prezentováno doposud, dokonale rozporuplné na všech úrovních. Další informace je možné získat ze souhrnných a rešeršních publikací, uvedených v následující kapitole.

1.4.3. Souhrnné a rešeršní publikace Přehledné práce pro ELF EMF a statická magnetická pole jsou tyto [1, 100, 184-192]. V těchto publikacích se můžeme seznámit i s tzv. "window" efektem. Ten nastává, pokud je

24

nějaký efekt pole pozorován jen pro určité frekvence či výkony. Působení mikrovlnných polí na organismy je shrnuto v [192-200].

1.5. Možné teoretické modely působení elektromagnetických polí Existuje mnoho teorií, snažících se vysvětlit působení elektromagnetických polí na biologické struktury. Jejich základní přehled uvedl ve svém článku Berg [100]:

Model

Autoři

Electroconformational coupling

R. Astumian, T. Tsong

Oscillatory activation barrier

V. Markin, T. Tsong

Ion activation model

M. Blank, L. Soo

Zeeman three state coulombic

A. Chiabrera, B. Bianco

Larmor precession

D. Edmonds

Cyclotron resonance

A. Liboff, B. McLeod

Parametric resonance

V. Lednew, J. Blanchard, C. Blackman

Polarization force

K. McLeod

Cell array impedance

A. Pilla

Free radicals

J. Walleczek, C. Timmel

Parametric amplification

J. Pokorný

Free Ions

D.J. Panagopoulos

Tab. 7. Modely možného působení elektromagnetických polí na organismy

1.5.1. Electroconformational coupling (elektrokonformační párování) Jedná se o model působení střídavého elektrického pole na konformační změny membránových

enzymů, a to hlavně iontových pump závislých na štěpení ATP. Toto

působení může mít i vliv na kinetiku reakcí [201]. S touto teorií souhlasí i výsledky několika prací [202, 203]. Všechny výsledky byly získány působením polí o vysokých frekvencích. Pro ELF oblast je tato teorie nevhodná, protože se potýká s problémem termálního elektrického šumu – indukovaný proud vnějším polem je asi 20x menší než proud vzniklý v cytoplazmě v důsledku tepelné fluktuace hustoty náboje. Význam tepelného šumu roste s klesající velikostí daných objektů.

25

1.5.2. Oscillatory activation barrier (oscilační aktivace aktivační bariéry) Tato teorie se snaží vysvětlit efekty elektromagnetických polí poklesem aktivační bariéry pro produkty disociace enzymů vlivem slabého střídavého pole s malou amplitudou. Produkty disociace enzymů jsou potom snáze aktivovány, což může způsobit změny v chemickobiologických reakcích v buňce [204].

1.5.3. Ion activation model (model aktivace iontů) Uvažuje změny iontových poměrů na membráně (pozornost je věnována hlavně ATPázám). Aktivita těchto enzymů je závislá na počtu navázaných iontů (může růst, ale i klesat), které elektromagnetické pole ovlivňuje [74]. Pro pole o nízkých frekvencích je tu opět komplikace s termálním elektrickým šumem.

1.5.4. Zeeman three state coulombic model (Zemanův jev) V magnetickém poli dochází k rozštěpení energiových hladin tripletového stavu (viz. podkapitola J), přičemž energiový posun je lineární funkcí B – tento děj nazýváme Zeemanův jev. Může pak dojít k více možnostem přeskoků v energiových hladinách (což má uplatnění např. v teorii volných radikálů). V elektrickém poli se obdobně štěpí energiové hladiny elektronů – Starkův jev. Předpokládá se, že sinusoidní elektromagnetické pole vyvolá Starkův-Zeemanův jev a dojde tak k narušení vazby ligand-receptor a k následným biologickým reakcím [205].

1.5.5. Larmor precession (Larmorova precese) Nabitá částice vykonává v magnetickém poli precesní pohyb s poloměrem r. Tento děj se nazývá Larmorova precese. Pro náboj q o hmotnosti m je úhlová rychlost precese ωL =

qB . m

Pokud je Larmorovská precese v zemském magnetickém poli zkombinována s aplikací střídavého externího magnetického pole rovnoběžného s polem stacionárním, energie interakcí vazeb iont-protein (udržující tento komplex v nativní podobě) může být pozměněna [206, 207]. Může dojít též ke změně vazebných úhlů [208]. Problémem ale je, že například

26

kumulace 1/10 energie spojené se slabou iontovou vazbou (0,1 eV) při aplikaci 0,1 mT externího magnetického pole by trvala 7 let [209].

1.5.6. Cyclotron resonance (cyklotronová rezonance) Předpokládá působení statického a střídavého magnetického pole zároveň [210-212]. Částice pohybující se ve statickém poli po kruhové dráze (díky Lorentzově síle F = q ( v × B ) ) může díky určitému působení periodické síly přijmout energii a přejít na energeticky vyšší orbital s větším poloměrem – dojde k rezonanci. Periodická síla musí splňovat tuto podmínku: ω =

eB , kde e – elementární náboj, B – velikost magnetické indukce statického pole, m – m

hmotnost elektronu, ω – cyklotronová frekvence (tedy i frekvence, jakou musí mít periodická síla). Může pak dojít ke zvýšené pohyblivosti iontů blízko receptorů či iontových kanálů. Cyklotronové frekvence jsou pro ionty v živém organismu v oblasti ELF (např. Ca2+ – 38,4 Hz), a tak může být vysvětlen vliv elektromagnetických polí i existence frekvenčního okna. I tato teorie má však vady [213-215]: 1. Předpoklad, že se ionty (v buňkách či membránových kanálech) budou chovat jako ve vakuu, není realistický. 2. Cyklotronový rádius pro Ca2+ v Zemském geomagnetickém poli (50 µT) je větší než 1 m. 3. Výsledná síla, působená oscilujícím magnetickým polem, otáčí svůj směr každý půlcyklus, v průměru se tedy blíží nule. 4. Ionty prochází iontovými kanály po krátký čas (1 µs), rezonance při 50 Hz se tedy zdá být nemožnou. Jak je z předchozích bodů zřejmé, z teoretického hlediska tento model působení magnetických polí neobstojí. Podobně experimentální práce nenašly rezonanční odezvu v měřených systémech [216-220].

1.5.7. Parametric resonance (parametrická rezonance) Jde opět o společné působení střídavého a statického pole, roli zde hraje i jejich vzájemná orientace. Biologický efekt se projevuje opět jen v určitých oknech - jde o efekt rezonance. Proteiny působením tepelné energie oscilují mezi několika konfiguračními stavy, přičemž každý stav ovlivňuje jejich funkci jinak. Protein s iontem může být považován za naladěný

27

oscilátor. Interakce vnějšího pole s iontem uvnitř proteinové dutiny mohou vyvolat změny ve struktuře reakčního místa enzymu a ke změně biochemické aktivity [221, 222]. Uvažuje se zde o působení na iont Ca2+ v komplexu s kalmodulinem.

1.5.8. Polarization force (polarizační síla) Vlivem nehomogenit elektrických a magnetických vlastností buněčného povrchu vzniká na buněčném povrchu gradient aplikovaného pole, díky němuž se mění polarizační síly. To se projeví změněnou vlastností buněčného povrchu a následnou změnou fyziologických vlastností buňky [223].

1.5.9. Cell array impedance (impedance seskupení buněk) Pokud se buňky seřadí do řady, může dojít k hyperbolickému zesílení efektu elektromagnetického pole (efekt elektromagnetického pole na samotnou buňku je minimální, protože je rušen termálním šumem). Roste-li počet buněk v řadě, stává se řada čím dál víc nízkofrekvenčním filtrem, produkujícím transmembránové napětí pouze u nízkých frekvencí. Model také naznačuje závislost efektů na zbytkovém membránovém potenciálu tkáně cílových buněk, působení magnetických polí může být vzhledem ke zbytkovému potenciálu buňky selektivní. Tato vlastnost může například vysvětlit, proč magnetické pole podporuje srůstání poškozené tkáně, zatímco na zdravou tkáň nepůsobí [224-226].

1.5.10. Free radicals (volné radikály) Pojmem radikál rozumíme produkt homolytického štěpení molekul (tj. oba radikály si ponechají po jednom elektronu z původního elektronového páru tvořícího kovalentní vazbu). Radikály mohou být v S (singletovém) nebo T (tripletovém) stavu. Závisí to na tom, jestli vznikly z molekuly v S-stavu (tzn. orientace elektronů je antiparalelní, což je nejobvyklejší a energeticky nejvýhodnější stav) nebo T-stavu (elektrony jsou v paralelní konfiguraci, tento stav vzniká z S-stavu interkombinační konverzí). Po rozštěpení molekuly může dojít buď k následné reakci dvou radikálů a ke vzniku uzavřeného podvojného radikálového páru (charakteristické pro radikály v S-stavu), kdy pravděpodobnost opětovného setkání dvou současně vzniklých radikálů v roztoku s normální viskozitou klesá na 10% původní hodnoty

28

již za 10-10 s, nebo k úniku z místa vzniku do okolního prostředí, kde mohou dále reagovat. Dochází ke vzniku únikového produktu (charakteristické pro T-stav radikálu). Tyto volné radikály jsou extrémně reaktivní. Vytrhují atomy z cizích molekul, adují se na dvojné vazby. Každá reakce produkuje sekundární radikály. Jejich radikálové centrum je aktivní do té doby, dokud se nepotkají s jiným radikálem a za vzniku kovalentní vazby neukonči svou existenci (což bývá řádově 10-3 s v roztoku s normální viskozitou). Vnější magnetické pole způsobuje rozštěpení energiových hladin T-stavu na stav základní (T0), stav s vyšší (T1) a konečně stav s nižší energií (T-1), než je energie původní (v závislosti na velikosti magnetické indukce). Bez přítomnosti magnetického pole jsou všechny tři energiové hladiny totožné (degenerované). Tento efekt se nazývá Zeemanův jev. Pokud se může elektron z S-stavu transformovat do všech tří možností T-stavu, 75% produktů homolytického štěpení uniká. Možnosti ovlivnění magnetickým polem tedy jsou: - přílišné rozštěpení T-stavu, které už umožňuje jen přechod do T0 stavu - uniká jen 50% radikálů, - pokud jsou S a T stav od sebe příliš vzdáleny, může magnetické pole přiblížit T hladinu natolik, aby byl přeskok realizovatelný, a tím se zvýší i počet únikových produktů. Na výsledném počtu únikových produktů a době života závisejí další biochemické reakce [227-233]. V tomto modelu se jedná sice o magnetické pole stacionární, ale i pro oblast ELF můžeme považovat toto pole za stacionární, protože maximální doba délky života radikálů je v něm

řádově menší než frekvence ELF polí.

1.5.11. Parametric amplification (parametrická amplifikace) Živé buňky mohou vibrovat a vytvářet tak elektromagnetické vlny (Fröhlichova koherenční vibrace). Elektromagnetické pole může způsobit časově závislou změnu orientace (rotace) polárních molekul v blízkosti buněk a může je přitahovat. Přitahované molekuly se pohybují s buňkami a koeficient tření buněčného pohybu může záviset na generovaném elektromagnetickém poli. To potom může reagovat s povrchovými náboji různých materiálů. Tyto procesy mohou být významné v adherenci (např. leukocytů) k povrchu různých materiálů [234, 235]. Autoři této teorie se zabývají též vnitřními elektromagnetickými poli a jejich působením uvnitř buňky. Jedná se zejména o mikrotubuly [236-239]. 29

1.5.12. Free ions (volné ionty) Oscilující externí elektrické pole vyvíjí oscilační sílu na každý volný iont (na obou stranách všech

plazmatických

membrán),

který

dokáže

putovat

skrz

membránu

pomocí

transmembránových proteinů (kanálové proteiny). Externí oscilační síla způsobí nucené vibrace každého volného iontu. Pokud tato vibrace překročí určitou limitní mez, může iont dát špatný signál pro elektricky (dokonce i mechanicky) sensitivní transportní transmembránové proteiny. Takto může být narušena elektrochemická rovnováha a tím i funkce celé buňky [184, 240]. Stejný model je možné použít i pro oscilující magnetická pole. Tento model je velmi podobný modelu aktivce iontů (kapitola 1.5.3.), kde se posuzuje vliv polí na ionty na membránách.

1.6. Používané organismy

1.6.1. Bakterie Bakterie jsou jednobuněčné prokaryotické organismy (říše Procaryotae, oddělení Bacteria). Rozmnožují se příčným dělením, některé i pučením. Až na několik málo vyjímek jsou buňky bakterií ohraničeny pevnou buněčnou stěnou, která se vyznačuje stálým tvarem a jako hlavní pevnou složku obsahuje peptidoglykan. Většinou se zkoumají celé soubory bakterií – bakteriální populace. Po naočkování izolovaně rostoucích buněk na pevnou živnou půdu vznikne za příznivých podmínek z každé takové bakterie postupným dělením jedna kolonie. Kolonie je tedy buněčným klonem. Za konstantních podmínek je vzhled bakteriálních kolonií stálý a charakteristický pro daný bakteriální druh.

1.6.1.1. Růst bakterií Pokud jsou bakterie ve vhodných podmínkách, narůstají jejich buňky do určité velikosti a pak se rozdělí. Souhrn těchto procesů je často označován jako růstový cyklus. V každém prostředí se množí bakterie tak dlouho, dokud zde nacházejí podmínky potřebné k dělení buněk (tj. živiny, vodu, odpovídající teplotu, parciální tlak kyslíku, pH... ). Spolu s prostředím, ve kterém rostou, tvoří bakterie ucelený systém – kulturu, která může být buď uzavřená (kultivace statická - bakterie rostou v prostředí, jehož vlastnosti a složení se mění v závislosti na životní činnosti bakteriálních buněk), nebo otevřená (kultivace kontinuální). 30

Odrazem změn v prostředí statické kultivace je nepravidelný, fázovitý charakter množení bakterií. Sled jednotlivých fází množení v závislosti na kultivační době se nazývá růstová křivka bakterií. Její fáze jsou [241]:

1. Lag fáze. Je to období, kdy se bakterie přizpůsobují novému prostředí. Nedochází prakticky k jejich množení, nezřídka je pozorován pokles jejich počtu (odumírají starší a méně životaschopné buňky). Je to fáze přípravy na následující dělení.

2. Fáze zrychleného růstu. Buňky jsou již plně přizpůsobeny prostředí, začínají se rychle množit. V této fázi zvýšeného metabolismu jsou bakterie citlivější na vliv faktorů prostředí.

3. Fáze logaritmického (exponenciálního) růstu. Je charakterizována intenzivním množením bakteriálních buněk, jejichž počet narůstá v čase geometrickou řadou.

4. Fáze zpomaleného růstu. Vyznačuje se postupným zbrzděním procesů množení i metabolismu. Děje se tak díky změnám, ke kterým dochází v prostředí v důsledku vyčerpání živin a hromadění toxických produktů metabolismu.

5. Fáze stacionární. Je období, kdy počet buněk odumřelých je roven počtu buněk vzniklých dělením. Celkové množství buněk v kultuře dosahuje v této fázi maxima.

6. Fáze poklesu (zrychleného odumírání). Úbytek buněk nabývá stále větší převahy nad přírůstkem.

Na obrázku 1 je znázorněna ideální růstová křivka. Čísla nad časovou osou korespondují s jednotlivými výše popsanými fázemi růstové křivky.

31

log počtu bakterií 1

2

3

4

5

6

2 .5

0

čas

Obr. 1. Růstová křivka bakterií. Čísla nad časovou osou korespondují s jednotlivými popsanými fázemi růstové křivky. Hodnoty na ose čas i nejvyšší počet bakterií jsou závislé na druhu prostředí, bakterií atd. Pro bakterie Staphylococcus aureus je trvání celého cyklu zhruba 15 hodin a log(nmax) ~ 8 (maximální počet bakterií v 1 ml suspenze).

1.6.1.2. Působení vnějších faktorů na bakterie Může být pozitivní a negativní. Negativní účinky jsou bakteriostatické (tj. bakterie se nedělí, je jich v kultuře stále konstantní počet, po odstranění určitého vnějšího vlivu jsou schopny pokračovat ve svém přirozeném vývoji) a baktericidní (zároveň dochází ke ztrátě životaschopnosti buněk, zastavení jejich růstu a současně k jejich odumírání). Toto může být způsobeno zejména následujícími ději: - poškozením buněčné stěny - narušením permeability cytoplazmatické membrány - změnou struktury a vlastností cytoplazmy - inhibicí enzymové aktivity - zastavením procesů biosyntézy - zastavením replikace DNA - zastavením exprese genů. Ze škodlivých vnějších faktorů je možno vyjmenovat extrémní teplotu a tlak, různé druhy záření, rozmanité chemické látky, pH, specifické účinky antibiotik...

32

1.6.1.3. Denitrifikační proces Denitrifikace je proces, kde je nitrát redukován přes nitrit a oxid dusíku až na plynný dusík. S tímto procesem je asociována enzymatická kaskáda reduktáz v respiračním řetězci

P. denitrificans (viz obr. 2). Tento proces získáváni energie je v činnosti pouze za anaerobních podmínek. Rozhodli jsem se sledovat denitrifikaci pomocí elektrochemické metody redukce elektronového mediátoru durochinonu. Nitrát reduktáza je nejdůležitější elektronový akceptor pro durochinon (v dýchacím řetězci P. denitrificans je přirozeným elektronovým mediátorem ubichinon, durochinon má ale schopnost volně prostupovat skrz bakteriální membránu a vyšší schopnost odevzdat elektrony než nativní ubichinon, který je jím

tedy

nahrazen).

Po

odevzdání

elektronů

dýchacímu

řetězci

je

durochinon

elektrokatalyticky redukován na durohydrochinon na povrchu elektrody. Elektroda je tedy schopná pomocí redukce durochinou zaznamenávat metabolickou aktivitu bakterií P.

denitrificans.

Obr. 2. Dýchací řetězec P. denitrificans. cyt. – cytochrom, UQ – ubichinon, DQ – durochinon.

1.6.2. Kvasinky Kvasinka je jednobuněčným houbovým mikroorganismem, pro který je zejména charakteristický způsob dělení, tzv. pučení. Kvasinky vykazují velkou tvarovou, velikostní či barevnou diverzitu. Obvykle jsou kulaté nebo oválné, ale vyskytují se i druhy, které mají buňky charakteristického citronovitého, vajíčkovitého, lahvovitého či vláknitého tvaru. Dokonce mezi samotnými buňkami jednoho kmene lze nalézt morfologické a barevné heterogenity. To je zapříčiněno změnami fyzikálních a chemických podmínek v prostředí. V našich pokusech jsem pracovali s kvasinkami Saccharomyces cerevisiae.

33

S. cerevisiae jsou již od historických dob možná nejdůležitějšími kvasinkami (díky jejich užívání v pekařství a pivovarnictví). Patří k nejstudovanějším eukaryotickým modelovým organismům, podobně jako je E. coli modelem prokaryotickým. Zapříčiňuje nejběžnější typ fermentace. S. cerevisiae jsou obecně elipsoidní, v průměru od 5-10 µm na delší ose, a od 1-7

µm na kratší ose. Velikost buňky se zvětšuje s věkem.

1.6.3. Tkáňové kultury Pro studováni tkáňových kultur jsme používali plicní karcinom. Tyto buňky jsou triploidní. Jejich výběr byl motivován faktem, že jsou eukaryotickými kompartmenty vyšších organismů. Pro naši studii je významný způsob uspořádání chromatinu v jádře těchto buněk. Vyšší řád v uspořádání chromatinu hraje významnou roli v regulaci jaderných procesů. Chromatin se skládá ze dvou odlišných typů, a to transkripčně aktivního euchromatinu nacházejícího se spíše v jaderném centru a heterochromatinu, který je možné nalézt na okrajích jádra (dvě citace). Chromatin je v jádře rozdělen do diskrétních domén. Dalším významným objektem je pozice aktivních či neaktivních genů v rámci chromozomálních teritorií [242, 243].

1.7. Elektrochemické metody Elektrochemie je obor chemie, který zkoumá procesy probíhající na rozhraní elektrod a elektrolytu. Pomocí elektrochemie můžou být zkoumány různé děje, kde dochází k přenosu elektronů (Faradayické děje) nebo ke změně kapacity elektrické dvojvrstvy v blízkosti elektrody. Pro měření je důležité vodivé médium (elektrolyt), v němž k pozorovaným dějům dochází. Nejčastější způsob měření je v tzv. tříelektrodovém zapojení. První elektrodou je elektroda referenční (kterou bývá obvykle Ag/AgCl či kalomelová elektroda). Tato elektroda slouží k udržování stabilního a dobře charakterizovaného potenciálu. Je ponořena do stejného elektrolytu, v jakém se nachází měřená látka. S tímto elektrolytem je spojena solným můstkem, který umožňuje difuzi jontů. Druhá, tzv. pomocná elektroda, se používá pro aplikaci potenciálu (či proudu, záleží na metodě) v měřeném systému. Bývá nejčastěji vyrobena z inertních materiálů, aby se zamezilo jejímu rozpouštění (nejčastěji platinový drát). Třetí a nejdůležitější elektrodou je v tříelektrodovém zapojení elektroda pracovní. Na této elektrodě je měřena odezva systému. Tato elektroda může být takřka z jakéhokoliv vodivého materiálu. Daný typ elektrody je vhodné vybrat podle požadavků daných analyzovanou látkou

34

či procesem. Nejčastějším typem pracovní elektrody je rtuťová kapka (má ideální povrch a vlastnosti). 1.7.1. Cyklická voltametrie Cyklická voltametrie (CV) je nejdéle a zřejmě i nejběžněji používaná voltametrická metoda (tj. systému je vnucován potenciál a zaznamenáván procházející proud). Principem této metody je vkládání lineárně se v čase měnícího potenciálu ve tvaru trojúhelníku na pracovní elektrodu. Výsledným záznamem je cyklický voltamogram, který je závislostí proudu protékajícího mezi pracovní a pomocnou elektrodou na vkládaném potenciálu. Tato metoda je také označována jako metoda prvního výběru při studiu neznámých systémů a slouží k bližší charakterizaci průběhu sledovaných elektrodových dějů.

1.8. AFM (mikroskopie atomárních sil) Mikroskopie atomárních sil (Atomic Force Microscopy) je mikroskopická technika používaná k trojrozměrnému zobrazování povrchů. Principem metody je pohyb ohebného raménka (pomocí precizního piezzo posuvu), na kterém je upevněn hrot s co nejmenším poloměrem (jeho velikost může být i jen 2 nm) nad snímaným vzorkem. Při tomto pohybu hrot kopíruje povrch vzorku v horizontálním směru, v jednotlivých řadách po sobě. Pokud se na vzorku vyskytnou nerovnosti, hrot se v tomto místě vychýlí a následně dojde k ohybu raménka, na kterém je hrot upevněn. Na tomto raménku je umístěna reflexní plocha, na niž dopadá laserový paprsek. Odraz tohoto paprsku je zaznamenáván na kvadratním detektrou (fotodiodě). Při změně polohy raménka dojde tedy i k vychýlení laserového paprsku a tím k zaznamenání vertikální změny polohy hrotu. Každé souřadnici je přiřazena hodnota polohy. Výsledný obraz je pak složením těchto údajů dohromady a vygenerováním 3D struktury povrchu snímaného vzorku. Existují různé způsoby pohybu hrotu nad vzorkem. Prvním z nich je výše zmíněný, kdy je hrot v kontaktu se vzorkem a kopíruje jeho povrch. Přitom je poloha detektoru fixní a dochází k vychylování ohebného raménka, na kterém je upevněn hrot. Dále je možné použít metodu, která je ke hrotu šetrnější – fixní nastaveni ohybu raménka a posun detektoru. Výhodou je možnost sledovat drsnější vzorky, nevýhodou je větší časová náročnost. Předchozí dva typy měření jsou nazývány kontaktní – dochází ke kontaktu hrotu se vzorkem. Pro povrchy, kde není možný pohyb hrotu na vzorku (například příliš viskózní povrchy) se používá modu

35

bezkontaktního. Zde se hrot pohybuje v blízké vzdálenosti od vzorku. Vzorek a hrot na sebe vzájemně působí van der Waalsovými silami. Hrot osciluje a měří se posun fáze, amplitudy nebo rezonanční frekvence ohybného držáku hrotu. Nerovnosti se tedy opět projeví vychýlením hrotu z rovnovážné polohy. AFM je poslední dobou také využíváno pro zobrazování biologických struktur. Největší výhodou oproti metodám s podobným nebo i vyšším rozlišením (jako je například elektronová mikroskopie) je možnost sledovat organismy v jejich přirozeném prostředí a živé. Ukazuje se, že pomocí AFM je možné sledovat jak DNA, tak různé buněčné kompartmenty a celé buňky.

36

2. Materiál a metody

2.1. Magnetické pole Použité magnetické pole bylo vytvářené válcovou cívkou a mělo frekvenci 50 Hz. Hlavní charakteristikou pole pro náš typ experimentů je amplituda magnetické indukce Bm závisející na proudu, který cívkou protéká, a na pozici uvnitř cívky. K měření Bm jsme využili induktivní metodu, při níž se měří efektivní hodnota napětí Uef indukovaného na měřicí cívce. Z něho se vypočte Bm jako [244] :

Bm =

Uef 1 N.S 4,44.f

kde: N ... počet závitů měřící cívky S ... plocha průřezu této cívky f ... frekvence budícího signálu

Pro měření parametrů magnetického pole do 2 mT byl použit měřič magnetické indukce Environmentor BMM-3000. Tento přístroj měří magnetické pole třemi ortogonálně umístěnými cívkami a ukazuje velikost efektivní hodnoty magnetické indukce Bef. Pro přepočet na amplitudu je nutno použít vztahu:

Bm = Bef 2

Použitá válcová cívka bylo vyrobena pro Biofyzikální ústav AV ČR Ústavem přístrojové techniky AV ČR v Brně. Má následující charakteristiky:

Poloměr 117,5 mm Vnitřní poloměr 102,5 mm Délka 210 mm Hmotnost 5,7 kg Počet závitů 880 Průměr drátu 1 mm Rezistance 14 Ω Indukčnost 131 mH Tab. 8. Charakteristiky válcové cívky 37

Cívka byla napájena z regulačního autotransformátoru (síťová frekvence, maximální proud IefMax = 1,9 A). Generované pole tak mohlo dosáhnout magnetickou indukci maximálně Bm = 10 mT. Teplota uvnitř cívky byla udržována na laboratorní úrovni chlazením vzduchovým proudem a kontrolována rtuťovým teploměrem. Laboratorní teplota byla okolo 22 °C. Vzorek byl umístěn na nevodivém stojanu uvnitř cívky v místě největšího a nejhomogennějšího magnetického pole. Nehomogenity pro danou velikost Petriho misek (průměr do 10 cm)

Bm [mT]

v žádném měření nepřesahovaly 10% z maximální hodnoty pole (obr. 3).

1.9 A

10 8

1.5 A

6

1.0 A

4 0.5 A 2 0 0

20

40

60

80

100

r [mm]

Obr. 3. Válcová cívka a průběh magnetické indukce uvnitř válcové cívky (poloměr 110 mm) v závislosti na vzdálenosti od její osy (r) pro různé budící proudy. Proud 1,9 A odpovídá Bm 10 mT, 1,5 A odpovídá 7,2 mT, 1,0 A odpovídá 5 mT a 0,5 A odpovídá 2,3 mT.

2.2. Použité organismy a kultivační média

2.2.1. Bakterie I. Escherichia coli gram negativní, kmen K12 Row, genotyp 58-161 metB1rpsL 1+ Fdef P.Fredericq, Biologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno.

II. Leclercia adecarboxylata gram negativní, sbírkové číslo 2177, Biologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno.

38

III. Staphylococcus aureus gram pozitivní, sbírkové číslo FA 812, Česká sbírka mikroorganismů, Brno.

Obr. 4. Elektronmikroskopická fotografie bakterie Staphylococcus aureus preparovaná mrazovým lámáním. Stěna na vrcholu odlomena, pod ní je patrna plazmatická membrána. Velikost bakterií je cca 0,7 µm. Vlevo je kmen W, vpravo kmen 209P (foto Jan Šmarda). Pro předchozí tři bakteriální kmeny bylo použito následovných kultivačních médií:

•

Tekutá živná půda: TY bujon, složení: 1 l destilované vody 8 g trypton (OXOID) 5 g yeast extract (OXOID) 5 g NaCl (Sigma-Aldrich)

•

Pevná živná půda: živný agar č. 2, 40 g / l (Imuna Šarišské Michaľany)

Kultivace probíhala v termostatu při t = 37 oC.

IV. Paracoccus denitrificans gram pozitivní, sbírkové číslo CCM 982 (NCIB 8944), Česká sbírka mikroorganismů, Brno.

Živné půdy:

•

Tekutá živná půda: bujon, složení: 1 l destilované vody o výsledném pH = 7,3 5,90 g C4H6O4 (kyselina jantarová)

39

4,54 g KH2PO4 2,36 g Na2HPO4 1,78 g NH4Cl 1,12 g KNO3 0,28 g MgSO4.7H2O 0,14 g Na2MoO4.2H2O 1,12 mg C6H5FeO7 (citronan železitý) (vše Sigma-Aldrich)

•

Pevná živná půda: agar, složení: 1 l destilované vody o výsledném pH = 7,3 15 g živný agar č. 1 10 g trypton 5 g yeast extract (vše OXOID) 5 g NaCl (Sigma-Aldrich)

Kultivace probíhala v termostatu při t = 30 oC.

Obr. 5. AFM snímek P. denitrificans, kontaktní mod

V.-VI. Sphingomonas paucimobilis, Rhodococcus erythropolis gram pozitivní, Česká sbírka mikroorganismů, Brno.

40

Živné půdy:

•

Tekutá živná půda: bujon pro mykobakterie 1 l destilované vody o výsledném pH = 7,3: 2,5 g Na2HPO4.12H2O 2 g yeast extract 2 g trypton (oba OXOID) 2 g protease pepton No. 3 1,5 g C6H5Na3O7.2H2O (citrát sodný) 1 g KH2PO4 0,6 g MgSO4.7H2O 0,5 g Tween 80 50 ml glycerol (zbytek Sigma-Aldrich)

Kultivace probíhala v termostatu při t = 30 oC.

2.2.2. Kvasinky Byl použit tetraploidní kmen α/A kvasinky Saccharomyces cerevisiae CCY 21-4-59 (sbírka kvasinek, Chemický Ústav Slovenské Akademie Věd, Bratislava).

Živné půdy:

•

Tekutá živná půda: bujon pro kvasinky, složení: 1 l destilovaná voda 20 g malt extract broth (OXOID) 20 g D-glukóza (Lachema Brno)

•

Pevná živná půda: agar, složení: 1 l destilovaná voda 20 g malt extract broth (OXOID) 20 g D-Glukóza (Lachema Brno) 10 g živný agar č. 2 (Imuna Šarišské Michaľany)

Kultivace probíhala v termostatu při t = 30 oC.

41

Obr. 6 . Elektronmikroskopický snímek S. cerevisiae (velké objekty) a E. coli (podlouhlé tyčinky). Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Image:EColi-Scerevisiae.jpg, 17.11.2006.

2.2.3. Tkáňové kultury Pro naše pokusy byla použita adenokarcinomová buněčná linie A549 (Evropská sbírka živočišných tkáňových kultur, ECACC, Porton Down, Salisbury, UK).

Živná půda: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) (PAN, Germany) s přídavkem 10% plodového telecího séra (PAN) a antibiotik (penicilin a streptomycin). Kultivace probíhala v termostatu při t = 37 oC ve zvlhčené atmosféře s 5% přídavkem CO2.

2.3. Metody

2.3.1. Určování počtu bakterií a kvasinek

42

Pro vyhodnocení viability exponovaných kultur je zapotřebí zjistit počet jedinců před a po expozici. V našich pokusech jsem použili dvě metody určování koncentrace buněčných kultur: počítání CFU a spektrofotometrii.

2.3.1.1. Počítání CFU CFU – colony forming units – volně přeloženo buňky schopné tvořit kolonie. Význam CFU spočívá v možnosti, relativně přesně (asi s 5% chybou) určit počet jedinců, kteří jsou schopni se v danou chvíli v kultivačním médiu dále dělit. Buněčná kultura se naředí tak, aby na Petriho miskách o poloměru 90 mm bylo ve výsledku 20-600 jedinců (je tedy nutné předem alespoň řádově znát počet přítomných buněk nebo provést pokusy za použití více různých

ředění). Naředěné kultury se poté vysejí na agarové plotny. Zde po 24 hodinové inkubaci vzniknou z jednotlivých buněk viditelné – a tudíž i počitatelné – kolonie. Počet kolonií pak odpovídá počtu jednotlivců v době vysetí. Je nutné podotknout, že tuto metodu je možné pro zjišťování absolutního počtu jedinců použít pouze pro buňky, které netvoří řetízky, hrozny a podobné struktury, kde je v jednom útvaru spojeno více buněk. Pro účely poměrové, kdy je stejný počet řetízků či jiných struktur jak v kontrolní, tak v pracovní kultuře, je tento efekt zanedbatelný.

2.3.1.2. Spektrofotometrie Použití spektrofotometru umožňuje rychlejší vyhodnocování pokusů. Jeho výhoda je v menší experimentální náročnosti a v možnosti okamžitě vyhodnocovat výsledky. Výsledkem měření je absorbance bakteriálních kultur. Z kalibračních měření, kdy jsou určitým absorbancím roztoků přiřazeny hodnoty počtu buněk (získaných pomocí počítání CFU), se pak určí počet buněk v kultuře. Nevýhodou měření absorbancí je možnost jejího použití. Toto se vymezuje pouze na dynamické studie, jako například růstové křivky anebo dynamiky růstu, kde je pokles sledován v rostoucí kultuře. Námi použitý spektrofotometr totiž z principu neumí rozlišit mrtvé buňky od živých.

2.3.2. Určováni metabolické aktivity bakterií 2.3.2.1. Tetrazoliový test

43

Tetrazolium se díky metabolickým pochodům v organismech redukuje na formazan. Jak je zřejmé z obr. 10, dojde přitom k barevné změně roztoku, a to tím větší, čím vyšší je metabolická aktivita bakteriální kultury. (Kvantifikace může být provedena měřením absorbance vzorku při vhodné vlnové délce 490 nm, pro aktivnější kulturu je absorbance vyšší). Tento test byl proveden u bakterií E. coli a S. aureus.

Obr. 7. Redukce tetrazolia na formazan

2.3.2.2. Elektrochemické stanovení metabolické aktivity Cyklickou voltametrii jsme využili pro stanovení denitrifikační

aktivity bakterií

P. denitrificans. Detekce proběhla pomocí elektronového mediátoru durochinonu, který transportoval elektrony z elektrody do respiračního řetězce bakterií, kde byly využity pro redukci KNO3. Detekovaly se tedy změny v signálu poskytovaném durochinonem. V ustáleném stavu, bez přítomnosti redukované látky, je durochinon redukován a následně oxidován elektrochemicky. Po přídavku redukované látky již durochinon odevzdá elektrony respiračnímu řetězci bakterie, a je tudíž vychýlen z rovnováhy. Tuto změnu poté detekujeme pomocí cyklických voltamogramů. Pro naše měření jsme použili tři typy pevných uhlíkových elektrod (pracovní elektrody), a to: skelnou uhlíkovou elektrodu, uhlíkovou elektrodu tvořenou tuhou o průměru 0,5 mm, a nakonec pyrolytickou uhlíkovou elektrodu s bazální orientací. První dvě elektrody byly pro měření připravováni broušením částicemi až do průměru 1 µm, povrch pyrolytické elektrody byl obnovován pomocí adhezivní pásky. Tyto elektrody byly posléze modifikovány známým počtem bakterií. Bakterie byly na povrch elektrody upevněny pomocí dialyzační membrány. Takto připravená elektroda poté sloužila k detekci enzymatické aktivity bakterií P. denitrificans.

44

2.3.3. Práce s tkáňovými kulturami 2.3.3.1. Detekce F-aktinu K permeabilizaci buněk A549 byl použit 0.1% Triton X-100 v PBS. Pro fluorescenční detekci F-aktinu byl použit fluoresceinisothiokyanat (FITC) - konjugovaný s Phalloidinem (1 g/ml, Sigma). Jako kontrastní barvivo byl použit Vectashield (Vector Laboratories, CA) obsahující TO-PRO-3 (Molecular Probes, Invitrogene, USA).

2.3.3.2. Barvení mitochondrií v živých buňkách MitoTracker (Moleculare Probes, Invitrogene, USA) byl přidán do kultury v čerstvém živném médiu. Jádra byla zviditelněna použitím TO-PRO-3 (Molecular Probes). Jako ukotvovací médium byl použit Vectashield (Vector Laboratiories, Burlingame, CA).

2.3.3.3. Fluorescence in situ hybridization (FISH) Buňky rostlé na sklíčcích v monovrstvách byly fixovány v 4% (w/v) paraformaldehydu (Sigma) v PBS. Poté byly permeabilizovány. Následovně byla sklíčka zmražena tekutým dusíkem a proběhla DNA denaturace v 50% (v/v) formamidu v 2 × SSC při 75 °C. Pro hybridizaci byla použita digoxigeninem značená DNA sonda (centromera 8) (Oncor, Gaithersburg, MD).

2.3.3.4. Snímání vzorků, zpracování dat Snímky obarvených buněčných jader byly získány konfokálním systémem. Tento systém se skládá z argon kryptonového laseru (Innova 70, Coherent) s akusticko-optickým laditelným filtrem (AOTF, Brimrose) pro výběr vlnové délky. Konfokální jednotka (QLC 100, VisiTech International) byla spojena s epifluorescenčním mikroskopem LEICA DMRXA s vertikálním piezzoposuvem (Physic Instruments). Skenovací systém byl řízen softwarem FISH 2.0 [245]. K záznamu obrazu byla použita plně programovatelná CoolSnap CCD kamera (Photometrix, Tuscon, AZ). Zvětšení objektivu bylo 100x. Získané snímky byly analyzovány pomocí software FISH 2.0. Signifikance rozdílů mezi distribucemi genetických elementů byla počítána pomocí MannWhitney U-testu pro p ≤ 0,05.

45

2.4. AFM analýza morfologie bakterií AFM snímkování bylo provedeno na AFM hlavě Explorer (Veeco, Santa Barbara, USA) v kontaktním modu. Ke zpracování výsledků byl použit program Gwyddion. Pro snímkování AFM jsme vybrali dva zástupce bakteriálních kmenů – tyčkovitého tvaru (E.

coli) a kulovitého (P. denitrificans). Bakterie byly exponovány magnetickým polem dvojím způsobem: 1. Expozice bakterií na agarových plotnách a poté jejich přenesení na podložní mikroskopické sklíčko pro AFM analýzu. Kontrolní kultura byla snímkována ze stejné misky před expozicí. 2. Expozice bakterií na podložním mikroskopickém sklíčku. Bakterie byly nejdříve nasnímány. Poté, bez vynětí z držáku vzorků pro AFM, byly exponovány. Tímto způsobem bylo možné nasnímkovat stejné bakterie před a po expozici magnetickým polem. Výsledkem byly snímky, na kterých jsme provedli odečet vertikálních a poté horizontálních změn.

2.5. Statistické zpracování dat Většina výsledků je reprezentována formou poměrů, a to poměrem hodnot sledovaných veličin exponovaných kultur ku hodnotám kultur kontrolních. Pro růstové křivky, dynamiky růstu, práce s tkáňovými kulturami a určování morfologických změn jsou data prezentována v jiné formě. Pro naše měření předpokládáme diskrétní Studentovo rozložení dat. Chybu datového souboru pak získáme jako:

n

∑ ( x-x )

2

i

SD =

i=1

n ( n-1)

kde: SD – standard deviation - standardní chyba,

x – aritmetický průměr, n – počet měření.

46

Interval spolehlivosti je nastaven s hladinou pravděpodobnosti 95%. Tam, kde to bylo možné, je proveden oboustranný, nepárový, dvouvzorkový t-test:

t=

x1 -x2 s12 s22 + n1 n2

kde: t – testovací statistika, s – směrodatná odchylka ( s2 = n.(SD)2), dané indexy jsou pro dva různé soubory srovnávaných dat.

Počet stupňů volnosti daného t-testu je (n1-1)+(n2-1). Jako statisticky významné jsem zvolil t pro p = 0,05 a menší. (p je pravděpodobnost, s jakou mohu přijmout shodu dvou testovaných souborů dat). Jelikož pokusy nebyly statisticky plánovány, ale šlo o prvotní studii, nedává nám t-test jasnou odpověď, zda nějaký statisticky významný rozdíl existuje, je spíše jen vodítkem při posuzování výsledků. Při určování CFU byly považovány za směrodatné jen ty agarové plotny, na kterých vyrostlo 20-800 kolonií. Při nižším počtu ztrácela data na objektivnosti, při vyšším nebylo možné kolonie spočítat bez větší experimentální chyby.

47

3. Výsledky a diskuse

3.1. Bakterie

Zabýval jsem se studiem vlivu 50 Hz magnetického pole o různých hodnotách magnetické indukce a expozičních časech na šest bakteriálních kmenů. Detaily těchto studií jsou obsahem následujících kapitol.

3.1.1. Viabilita bakterií Viabilitu bakterií jsme zjišťovali dvěma základními postupy, počítáním CFU a měřením absorbance bakteriálních kultur. Měření CFU byla provedena pro tyto bakteriální kmeny:

E. coli, L. adecarboxylata, S. aureus a P. denitrificans. Výsledky měření jsou prezentovány jako poměr mezi kulturou exponovanou ku kultuře kontrolní (tedy jako relativní číslo). Důvodem volby tohoto typu prezentace výsledků je možnost srovnání jednotlivě provedených pokusů. I když je postup práce při každém experimentu shodný, absolutní počet bakterií kolísá. Poměr, který je vždy pro kontrolní kulturu 1, tak tvoří ideální formu prezentace výsledků. Měřili jsme závislosti pro expozice magnetickým 50 Hz polem. Nejvíce informativní jsou dvě závislosti. První je závislost relativního počtu CFU na velikosti magnetické indukce (viz obr. 8) , druhou je závislost relativního počtu CFU na době trvání expozice (viz obr. 9). Pro všechny druhy získaných závislostí byly provedeny i t-testy. Jejich výsledky naznačily statisticky signifikantní rozdíly mezi exponovanými kulturami oproti kontrole, v mnohých případech i vůči kulturám exponovaným po kratší dobu či pro expozici s menší Bm. Podrobnosti je možné naleznout v [83, 118, 119, 246]. Pro expoziční časy delší než 24 minut dochází k efektu nasycení, kdy již při dvojnásobné době expozice (48 minut) nedochází k významnější změně v relativním počtu CFU. Změřené závislosti vykazují evidentní pokles v relativním počtu CFU po expozici magnetickému poli. K tomuto poklesu dochází již po 3 minutách v 10 mT magnetickém poli a též po 12 minutách v poli o Bm = 2,7 mT. Z naměřených závislostí můžeme usuzovat, že snížení počtu bakterií (vyjádřených pomocí relativního počtu CFU) je dáno uhynutím daného počtu bakterií po expozici magnetickým polem. Tento efekt se nazývá efektem baktericidním.

48

Pro baktericidní (ne bakteriostatický) efekt hovoří i další typy pokusů provedené s těmito

n(Bm)/n(0)

bakteriálními kmeny. S. aureus P. denitrificans E. coli L. adecarboxylata

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

2.7

5.6

7.9

10 Bm [mT]

n(t)/n(0)

Obr. 8. Závislost relativního počtu CFU na velikost magnetické indukce. Expoziční čas byl fixní, a to 12 minut

1.4

S. aureus P. denitrificans E. coli L. adecarboxylata

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

3

6

12

t [min]

24

Obr. 9. Závislost relativního počtu CFU na délce expozice. Velikost magnetické indukce byla fixní, a to 10 mT. 49

Na růstových křivkách dochází k poklesu v počtu CFU v tekuté živné půdě okamžitě po expozici, a to jak v okamžiku inokulace kultury, tak v době expozice 4 hodiny po inokulaci (v tuto dobu jsou bakerie v lag fázi svého růstu a tedy i nejcitlivější k vnějším faktorům). Expozice byly provedeny po dobu 24 minut magnetickým polem o Bm = 10 mT. Pokles je trvalý a je možné jej zaznamenat i 10 hodin po expozici magnetickému poli. Tyto výsledky potvrzují i pokusy s dynamikou růstu (expozice trvá 1 hodinu, kultura je sledována každých 6 minut ještě další hodinu po vypnutí magnetického pole). I tyto pokusy ukazují na

ODexp/ODcontr

baktericidní efekt magnetického pole.

E.coli S.aureus S.paucimobilis

1.2

L.adecarboxylata P.denitrificans R.erythropolis

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1

3

5

T [hod]

7

Obr. 10. Závislost relativního poměru absorbancí na stáří bakteriální kultury po expozici 10 mT magnetickým polem po 24 minut v čase T = 0. Ze závislostí je možné vysledovat také zajímavý fakt. Pokles v relativním počtu CFU je vyšší u bakterií E. coli a L. adecarboxylata, než u bakterií S. aureus a P. denitrificans. Přitom je dobré připomenout, že první skupina bakterií jsou gram negativní tyčinky, druhá gram pozitivní koky (sférické bakterie). Je tedy možné spekulovat, že menší účinek magnetického pole na sférické bakterie může být zapříčiněn tvarem buněk. Jedno z možných vysvětlení je tvarové ovlivnění magnetickým polem indukovaných proudů. Tuto domněnku budou ale muset potvrdit další pokusy. Jako další způsob detekce viability bakteriálních kultur po ovlivnění magnetickým polem jsme použili relativní poměr absorbancí. Význam tohoto čísla je stejný jako relativní poměr

50

CFU. Výsledky těchto pokusů je možné nalézt v (). Shrnutí nejvýznamnějších výsledků je znázorněno na obr. 10. Opět zde můžeme pozorovat významnou změnu v relativním poměru absorbancí po expozici magnetickým polem. Jak je vidět, tato změna se projevuje i po následné kultivaci exponovaných vzorků. Zkoumané bakterie byly doplněny o dva další gram pozitivní sférické bakteriální kmeny. I spektrofotometrické výsledky potvrzují naše předchozí zjištění, zde je působení magnetického pole kmenově a tvarově závislé. Viabilitou bakterií se zabývají přílohy č. 1., 2., 5. a 7.

3.1.2. Metabolická aktivita bakterií

Metabolickou aktivitu jsme sledovali pro tři bakteriální kmeny. Pro E.coli a S. aureus jsme provedli tetrazoliový test. Tento test byl proveden na kulturách starých 12 hodin. Po expozici magnetickému poli jsme zaznamenali pokles v metabolické aktivitě bakterií. Tento pokles byl ale pokusy zkoumajícími počet CFU stejně starých bakteriálních kultur po vystavení magnetickému poli vysvětlen poklesem počtu buněk, který odpovídal poklesu metabolické aktivity. Tento výsledek jsme získali pro oba použité bakteriální kmeny. Domníváme se tedy, že metabolická aktivita nebyla nijak ovlivněna. Metabolickou aktivitu bakterií P. denitrifacans jsme zjišťovali za použití elektrochemické metody redukce durochinonu. Při použití této metody bylo zprvu nutné zajistit optimální podmínky pro získání co největšího signálu. Bylo tedy nutné optimalizovat podmínky měření, jako je koncentrace durochinonu (při příliš vysoké koncentraci dochází k efektu nasycení a posléze i pomalému snížení signálu), dále koncentrace bakteriálních buněk na povrchu elektrody (pokud by bylo bakterií málo, signál by se nezměnil, při vysoké povrchové koncentraci by buňky zamezovaly přístupu durochinonu z roztoku na samotný povrch elektrody). Dalším a podstatným parametrem byla koncentrace KNO3 jako finálního elektronového akceptoru. S takto získanými údaji jsme provedli 24 minutovou expozici 10 mT magnetickému poli. Došlo zde k cca 20% snížení výšky píku, které bylo pozorováno pro všechny tři typy použitých uhlíkových elektrod. Vzorový voltamogram, kde je znázorněn způsob detekce enzymatické aktivity, je možné vidět na obr. 11. Tento úbytek je opět v korelaci s úbytkem počtu buněk po expozici magnetickým polem o stejných parametrech [83].

51

-2

j [mA cm ]

60 30 0 -30 -60 -90 -900

3

1 2 -500

-100

300

700 E [mV]

Obr. 11. Cyklický voltamogram durochinonu na bakteriemi modifikované skelné uhlíkové elektrodě. Základním elektrolytem bylo PBS. Scan rate = 500 mV.s-1 1. křivka pro 0,5 mM durochinon v PBS, ustálený stav před přídavkem KNO3 2. ustálený stav po přídavku 1 mM KNO3 3. situace po 24 min expozici 10 mT 50 Hz magnetickému poli. Naše výsledky naznačují, že metabolická aktivita všech zkoumaných bakterií nebyla expozicí magnetickým polem ovlivněna. Zdá se tedy, že baktericidní působení magnetických polí není způsobeno nedostatečnou či zmenšenou metabolickou aktivitou ovlivněných bakterií. Metabolická aktivita bakterií je předmětem zkoumání v příloze č. 2.

3.1.3. Bakteriální morfologie Studium bakteriální morfologie po ovlivnění magnetickým polem bylo motivováno našimi předchozími výsledky. Pro pokusy jsme tedy zvolili po jednom ze zástupců gram negativních tyčkovitých bakterií (E. coli) a gram pozitivní skupiny (P. denitrificans). Oba bakteriální kmeny byly podrobeny 48 minutové expozici 10 mT magnetickým polem. Ke snímání bakterií jsme využili techniky AFM, která umožňuje získat 3D zobrazení povrchu živých bakterií. Ani pro oba typy provedených experimentů, ani pro oba bakteriální druhy jsme po expozici magnetickým polem nezaznamenali žádné významné změny v bakteriální morfologii. Na obr. 12. a 13. je možné vidět bakterie E. coli v nízkém rozlišení před a po expozici magnetickému poli. Změny zachycené na korelovaných snímcích (tj. snímcích, kde jsou porovnávány stejné bakterie na stejných pozicích před a po expozici) je možné vysvětlit driftem AFM snímací hlavy.

52

Obr. 12. AFM snímek bakterií E. coli před 48 minutovou expozicí magnetickým polem (Bm = 10 mT, f = 50 Hz).

Obr. 13. AFM snímek bakterií E. coli po 48 minutové expozicí magnetickým polem (Bm = 10 mT, f = 50 Hz). Bakteriální morfologoie je zkoumáná v příloze č. 6. 53

3.2. Kvasinky

U kvasinek jsme zjišťovali viabilitu pomocí obou metod, a to jak počítání CFU, tak spektrofotometricky. Naše výsledky [142] ukazují, že i zde došlo k poklesu počtu buněk v kultuře po expozici magnetickým polem. Při studování růstových křivek jsme zjistili, že ta

část kvasinek, která přežila počáteční ovlivnění magnetickým polem, nadále pokračuje ve svém růstu (obr. 14).

OD, 570nm

Příloha č. 4 je souhrnem poznatků o působení ELF EMF na kvasinky S. cerevisiae.

1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0

2

4

6

8

10 T [hod]

Obr. 14. Růstová křivka S. cerevisiae po ovlivnění 10 mT magnetickým polem na v T = 0 hod, ■ – kontrolní kultura, ● – kultura exponovaná 12 minut, X – kultura exponovaná 24 minut.

3.3. Tkáňové kultury Buněčná linie A549 byla exponována po 96 hodin 2 mT magnetickému poli uvnitř termostatu. Bylo pozorována reorganizace F-aktinových filamentů, což může být následek apoptických

54

procesů (použitím DAPI bylo zjištěno 6,2 % apoptických buněk v magnetickým polem ovlivněné kultuře). Toto potvrzuje také fakt, že okolo 10 % buněk se oddělilo ode dna Petriho kultivačních misek, což je u kultury rostoucí v monovrstvě známka buněčné smrti. Dále jsme sledovali změny v pozici centromery chromosomu 8, u které nedošlo k žádné změně. Další změna po expozici magnetickému poli, patrně opět spjatá s apoptickými změnami, byla kondenzace chromatinu (rozdíl v poloměru buněčného jádra). Příklad snímku z fluorescenčního konfokálního mikroskopu je uveden na obr. 15. Tyto výsledky jsou prezentovány v příloze č. 3.

Obr. 15. Snímky z fluorescenčního konfokálního mikroskopu. Magnetická expozice proběhla 96 hodin, Bm = 10 mT. Zelená barva jsou F-aktinová vlákna, modře jsou nabarvena jádra.

55

4. Závěr Tato práce přináší široký přehled o působení magnetických polí o nízkých frekvencích na různé živé organismy. Používali jsme jak prokaryotických buněk (bakterií), tak jednobuněčných eukaryotických (kvasinky) až po mnohobuněčné eukaryotické tkáňové kultury. Ukázali jsme, že bakterie a kvasinky jsou magnetickými poli značně ovlivněny. Dochází zde k statisticky významnému poklesu buněk po expozici magnetickému poli. I když intenzity použitého magnetického pole jsou vysoko nad úrovní limitů expozice ICNRIP a v našem okolí se s nimi můžeme setkat jen občas, je důležité zjistit, zda mají magnetická pole vůbec nějaký vliv na živé organismy. Také je vhodné pole o vysokých intenzitách používat například v případech, kdy jde o ozřejmění efektů, které způsobují. Otázkou také zůstává chronická expozice magnetickým polím, která je laboratorně těžce napodobitelná. Naše výsledky mohou vnést částečně poznání, jakým způsobem magnetické pole na živé organismy působí. V našich dalších pokusech se zaměřujeme na opakované působení polí na bakteriální kultury. Těmito pokusy bychom chtěli zjistit, jestli následující bakteriální generace budou expozici těmto polím více odolné než generace rodičovské, což naše předběžné výsledky s bakteriemi

E. coli naznačují. Při těchto pokusech jsme narazili též na zajímavý fakt, a to že při použití kmene s poruchou rekombinace (DH10B) nedochází k postupnému získávání rezistence vůči magnetickému poli. Tyto výsledky mohou naznačovat, že vliv magnetických polí záleží i na genetické vybavenosti stejného bakteriálního druhu. Doufáme proto, že se nám podaří i tyto otázky vlivu elektromagnetických polí na organismy v průběhu času vyřešit.

56

Seznam použité literatury [1]

T. S. Tenforde, Biological interactions of extremely-low frequency electric and magnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 25, 1–17, 1991.

[2]

M. Grandolfo, Extremely low frequency electromagnetic fields: environmental exposure levels, epidemiological studies and risk assessment, Bioelectrochem. Bioenerg. 30, 239–252, 1993.

[3]

J. Novák, Organismy v magnetických polích, Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, 2002.

[4]

J. Novák, L. Strašák, L. Fojt, V. Vetterl, Magnetic Fields in public transportation in Czech Republic, Biological Effects of EMFs 4th International Workshop, Proceedings, vol. II, Pages 1193-1195, Crete, Grece, 16-20 Oct., 2006.

[5]

P. Stavroulakis, Biological Effects of Electromagnetic Fields, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 779, 2003.

[6]

D. Rotkovská, Vliv mikrovlnného záření na krvetvorbu a radiační odolnost RTG ozářených myší, Kandidátská disertační práce. Biofysikální ústav ČSAV, Brno, 1978.

[7]

N. Wertheimer, E. Leeper, Electrical wiring configurations and childhood cancer, Am. J. Epidemiol. 109, 273–384, 1979.

[8]

J. H. Olsen, A. Nielsen, G. Schulgen, Residence near high voltage facilities and risk of cancer in children. Br. Med. J. 307, 891–894, 1993.

[9]

L. Tomenius, 50-Hz electromagentic environment and the incidence of childhood tumours in Stockholm county, Bioelectromagnetics 7(2), 191-207, 1986.

[10] D. A. Savitz, H. Wachtel, F. A. Barnes, E. M. John, J. G. Tvrdik, Case control study of hildhood cancer and exposure to 60 Hz magnetic fields, Am. J. Epidemiol. 128, 21–38, 1988. [11] S. J. London, Exposure to residential electric and magnetic fields and risk of childhood leukaemia. Am. J. Epidemiol. 134, 923–937, 1991. [12] M. Feychting, A. Ahlbom, Magnetic fields and cancer in children residing near Swedish highvoltage power lines, Am. J. Epidemiol. 138, 467–481, 1993. [13] J. H. A. M. Youngson, A. D. Clayden, A. Myers, R. A. A. Cartwright, A Case/control study of adult haematological malignancies in relation to overhead powerlines, Br. J. Cancer 63, 977–985, 1991. [14] S. Greenland, L. Kheifets, L. E. Zafanella, G. W. Kalton, Leukemia attributable to residential magnetic fields: Results from analyses allowing for study biases, Risk Analysis 26(2), 471482, 2006. [15] M.S. Linet, E. E. Hatch, R. A. Kleinerman, L. L. Robison, W. T. Kaune, D. R. Friedman, R. K. Severson, C. M. Haines, C. T. Hartsock, S. Niwa, S. Wacholder, R. E. Tarone, Residential exposure to magnetic fields and acute lymphoblastic leukemia in children, New Engl. J. Med. 337, 1–7, 1997. [16] R. K. Severson, R. G. Stevens, W. T. Kaune, D. B. Thomas, L. Heuser, S. Davis, L. E. Sever, Acute non lymphocytic leukemia and residential exposure to power frequency magnetic fields, Am. J. Epidemiol. 128, 10–20, 1988. [17] P. K. Verksalo, E. Pukala, M. Y. Hongisto, J. E. Valjus, P. J. Järvinen, K. V. Heikkilä, M. Koskenvuo, Risk of cancer in Finnish children living close to power lines, Br. Med. J. 307, 895–899, 1993.

57

[18] L. Kheifets, R. Shimkhada, Childhood leukemia and EMF: Review of the epidemiologic evidence, Bioelectromagnetics, 26(S7), S51–S59, 2005. [19] M. Feychting, Occupational exposure to electromagnetic fields and adult leukaemia: a review of the epidemiological evidence, Radiat. Environ. Biophys. 35, 237-242, 1996. [20] E. V. Willet, P. A. McKinney, N. T. Fear, R. A. Cartwright, E. Roman, Occupational exposure to electromagnetic fields and acute leukaemia: analysis of a case-control study, Occup. Enciron. Med. 60, 577-583, 2003. [21] S. Davis, D. K. Mirick, R. G. Stevens, Residental Magnetic Fields and the Risk of Breast Cancer, Am. J. Epidemiol. 155(5), 446–454, 2002. [22] E. R. Schoenfeld, E. S. O`Leary, K. Henderson, R. Grimson, G. C. Kabat, S. Ahnn, W. T. Kaune, M. D. Gammon, M. C. Leske, Electromagnetic Fields and Breast Cancer on Long Island: A Case-Control Study, Am. J. Epidemiol. 158(1), 47–58, 2003. [23] P. J. Villeneuve, D. A. Angew, K. C. Johnson, Y. Mao, Brain cancer occupational exposure to magnetic fields among men: results from a Canadian population-based cas-control study, Int. J. Epidemiol. 31, 210217, 2002. [24] J. A. McElroy, P. A. Newcomb, A. Trentham-Dietz, J. M. Hampton, M. S. Kanarek, P. L. Remington, Endometrila Cancer Incidence in Relation to Electric Blanket Use, Am. J. Epidemiol. 156(3), 262-267, 2002. [25] M. Feychting, F. Jonsson, N. L. Pedersen, A. Ahlbom, Occupational Magnetic Field Exposure and Neurodegenerative Disease, Epidemiology, 14, 413–419, 2003. [26] N. Hakansson, P. Gustavsson, C. Johansen, B. Floderus, Neurodegenerative Diseases in Welders and Other Workers Exposed to High Levels of Magnetic Fields, Epidemiology, 14, 420–426, 2003. [27] S. Szmigielsky, Cancer morbidity in subjects occupationally exposed to high-frequency (radiofrequency and microwave) electromagnetic radiation, Sci. Total Environ. 180, 9–17, 1996. [28] C. D. Robinette, C. Silverman, S. Jablon, Effects upon health of occupational exposure to microwave radiation, Am. J. Epidemiol. 112, 39–53, 1980. [29] J. K. Grayson, Radiation exposure, socioeconomic status, and brain tumor risk in U.S. Air Force: A nested case-control study, Am. J. Epidemiol. 143, 480–486, 1980. [30] A. Ahlbom, A. Green, L. Kheifets, D. Savitz, A. Swerdlow, Epidemiology of health effects of radiofrequency exposure, Environ. Health Persp. 112(17), 1741–1754, 2004. [31] K. Nie, A. Micic-Vasovic, A. S. Henderson, Molecular and Cellular Response to EMF Exposure: A Review of Studies of EMF an the Relationship to Signal Transduction, in: P. Stavroulakis, Biological Effects of Electromagnetic Fields, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 477–493, 2003. [32] R. Goodman, A. Shirley-Henderson, Transcription and translation in cells exposed to extremely low frequency electromagnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 25(3), 335–355, 1991. [33] J. L. Phillips, W. Haggren, W. J. Thomas, T. Ishida-Jones, W. R. Adey, Magnetic field-induced changes in specific gene transcription, Biochim. Biophys. Acta 1132(2), 140–144, 1992. [34] R. P. Liburdy, D. E. Callahan, J. Harland, E. Dunham, T. R. Sloma, P. Yaswen, Experimental evidence for 60 Hz magnetic fields operating through the signal transduction cascade. Effects on calcium influx and c-MYC mRNA induction, FEBS Lett. 334, 301–308, 1993. [35] E. K. Balcer-Kubiczek, X. F. Zhang, G. H. Harrison, W. A. McCready, Z. M. Shi, L. H. Han, J. M. Abraham, L. L. Ampey, S. J. Meltzer, M. C. Jacobs, C. C. Davis, Rodent cell transformation and

58

immediate early gene expression following 60-Hz magnetic field exposure, Environm. Health Persp. 104, 1188–1198, 1996. [36] H. Desjobert, J. Hillion, M. Adolphe, G. Averlant, J. Nafziger, Effects of 50 Hz magnetic fields on C-myc transcript levels in nonsynchronized and synchronized human cells, Bioelectromagnetics 16(5), 277-283, 1995. [37] B. M. Reipert, D. Allan, T. M. Dexter, Exposureto extremely low frequency magnetic fields has no effect on growth rate or clonogenic potential of multipotential haemopoietic progenitor cells, Growth Factors 13, 205–217, 1996. [38] R. Goodman, L. X. Wei, J. C. Xu, A. Henderson, Exposure of human cells to low-frequency electromagnetic fields results in quantitative changes in transcripts, Biochim. Biophys.Acta 1009, 219–220, 1989. [39] R. Goodman, A. Shirley-Henderson, Transcription and translation in cells exposed to extremely low frequency electromagnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 25, 335–355, 1991. [40] L. X. Wei, R. Goodman, A. Henderson, Changes in level of c-myc and histone H2B following exposure of cells to low-frequency sinusoidal electromagnetic fields: evidence for a window effect, Bioelectromagnetics 11(4), 269–272, 1990. [41] R. Goodman, L. X. Wei, J. Bumann, A. Shirley-Henderson, Exposure to electric and magnetic (EM) fields increases transcripts in HL-60 cells: does adaptation to EM fields occur? Bioelectrochem. Bioenerg. 29, 185–192, 1992. [42] A. Lacy-Hulbert, R. C. Wilkins, T. R. Hesketh, J. C. Metcalfe, Cancer risk and electromagnetic fields. Nature 375, 23, 1995. [43] A. Lacy-Hulbert, R. C. Wilkins, T. R. Hesketh, J. C. Metcalfe, No effect of 60 Hz electromagnetic fields on MYC or b-actin expression in human leukemic cells, Radiat. Res. 144, 8–17, 1995. [44] J. D. Saffer, S. J. Thurston, Cancer risk and electromagnetic fields, Nature 375, 22–23, 1995. [45] J. D. Saffer, S. J. Thurston, Short exposures to 60 Hz magnetic fields do not alter MYC expression in HL60 or Daudi cells, Radiat. Res. 144, 18–25, 1995. [46] J. Czyz, T. Nikolova, J. Schuderer, N. Kuster, A. M. Wobus, Non-thermal effects of power-line magnetic fields (50 Hz) on gene expression levels of pluripotent embryonic stem cells-the role of tumor suppressor p53, Mutat. Res. 557, 63–74, 2004. [47] P. C. Goswami, L. D. Albee, A. J. Parsian, J. D. Baty, E. G. Moros, W. F. Pickard, J. L. R. Roti, C. R. Hunt, Proto-oncogene mRNA Levels and Activities of Multiple Transcription Factors in C3H 10T½ Murine Embryonic Fibroblasts Exposed to 835.62 and 847.74 MHz Cellular Phone Communication Frequency Radiation, Radiat. Res. 151, 300–309, 1999. [48] S. Ivancsits, E. Diem, A. Pilger, H. W. Rüdiger, O. Jahn, Induction of DNA strand breaks by intermittent exposure to extremely-low-frequency electromagnetic fields in human diploid fibroblasts, Mutat. Res. 519, 1–13, 2002. [49] S. Ivancsits, E. Diem, O. Jahn, H. W. Rüdiger, Age-related effects on induction of DNA strand breaks by intermittent exposure to electromagnetic fields, Mech. Ageing Dev. 124, 847–850, 2003. [50] S. Ivancsits, E. Diem, O. Jahn, H. W. Rüdiger, Intermittent extremely low frequency electromagnetic fields cause DNA damage in a dose-dependent way, Int Arch Occup Environ Health 76, 431–436, 2003. [51] J. P. McNamee, P. V. Bellier, J. R. N. McLean, L. Marro, G. B. Gajda, A. Thansadote, DNA damage and apoptosis in the immature mouse cerebellum after acute exposure to a 1 mT, 60 Hz magnetic filed, Mutat. Res. 513, 121–-133, 2002.

59

[52] J. L. Phillips, O. Ivaschuk, T. Ishida-Jones, R. A. Jones, M. Campbell-Beachler, W. Haggren, DNA damage in molt-4 T-lymphoblastoid cells exposed to cellular telephone radiofrequency fields in vitro, Bioelectrochem. Bioenerg. 45, 103–110, 1998. [53] S. Sarkar, S. Ali, J. Behari, Effect of low power microwave on the mouse genome: A direct DNA analysis, Mutation Research 320, 141–-147, 1994. [54] M. L. Meltz, K. A. Walker, Radifrequency (microwave) radiation exposure of mammalian cells during UV-induced DNA repair synthesis, Radiat. Res. 110, 255–266, 1987. [55] J. P. McNamee, P. V. Bellier, G. B. Gajda, S. M. Miller, E. P. Lemay, B. F. Lavallée, L. Marro, A. Thansandote, DNA damage and micronucleus induction in human lekocytes after acute in vitro exposure to a 1,9 GHz continous-wave radiofrequency field, Radiat. Res. 158, 523–533, 2002. [56] H. Lai, N. P. Singh, Acute low-intensity microwave exposure increases DNA sigle-strand breaks in rat brain cells, Bioelectromagnetics 16(3), 207–210, 1995. [57] H. Lai, N. P. Singh, Single- and double-strand DNA breaks in rat brain cells after acute exposure to radiofrequency electromagnetic radiation, J. Radiat. Biol. 69(4), 513–521, 1996. [58] R. S. Malyapa, E. W. Ahern, C. Bi, W. L. Straube, M. LaRegina, W. F. Pickard, W. F. R. Roti, DNA damage in rat brain cells after in vivo exposure to 2450 MHz electromagnetic radiation and various methods of euthanasia, Radiat. Res. 149, 637–645, 1998. [59] E. Diem, C. Schwarz, F. Adlkofer, O. Jahn, H. W. Rüdiger, Non-thermal DNA breakage by mobile-phone radiation (1800 MHz) in human fibroblasts and in transformed GFSH-R17 rat granulosa cells in vitro, Mutat. Res. 583, 178–183, 2005. [60] R. Paulraj, J. Behari, Single strand DNA breaks in rat brain cells exposed to microwave radiation Mutat. Res. 596, 76–80, 2006. [61] N. Sakuma, Y. Komatsubara, H. Takeda, H. Hirose, M. Sekijima, T. Nojima, J. Miyakoshi, DNA Strand Breaks Are Not Induced in Human Cells Exposed to 2.1425 GHz Band CW and W-CDMA Modulated Radiofrequency Fields Allocated to Mobile Radio Base Stations, Bioelectromagnetics 27(1), 51–57, 2006. [62] C. V. Byus, S. E. Pieper, W. R. Adey, The effects of low-energy 60-Hz environmental fields upon the growth-related enzyme ornithine decarboxylase, Carcinogenesis 8, 1385–1389, 1987. [63] T. A. Litovitz, D. Krause, J. M. Mullins, Effect of coherence time of the applied magnetic field on ornithine decarboxylase activity, Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 862–865, 1991. [64] T. A. Litovitz, D. Krause, C. J. Montrose, J. M. Mullins, Temporally incoherent magnetic fields mitigate the response of biological systems to temporally coherent magnetic fields, Bioelectromagnetics 15(5), 399–409, 1994. [65] T. A. Litovitz, D. Krause, M. Penafiel, E. C. Elson, J. M. Mullins, The role of coherence time in the effect of microwaves on ornithine decarboxylase activity, Bioelectromagnetics 14(5), 395–403, 1993. [66] L. M. Penafiel, T. Litovitz, D. Krauze, A. Desta, J. M. Mullins, Role of modulation on the effect of microwaves on ornithine decarboxylase activity in L929 cells, Bioelectromagnetics 18(2), 132–141, 1997. [67] J. M. Mullins, T. A. Litovitz, M. Penafiel, A. Desta, D. Krause, Intermittent noise affects EMF-induced ODC activity, Bioelectrochem. Bioenerg. 44, 237–242, 1998. [68] M. Azadniv, C. M. Klinge, R. Gelein, E. L. Carstensen, C. Cox, A. A. Brayman, M. W. Miller, A test of the hypothesis that a 60-Hz magnetic field affects ornithine decarboxylase activity in mouse L929 cells in vitro, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214, 627–631, 1995.

60

[69] S. Galt, J. Wahlström, Y. Hammenius, D. Holmquist, T. Johannesson, Study of effects of 50Hz magnetic field on chromosome aberrations and the growth related enzyme ODC in human amniotic cells, Bioelectrochem. Bioenerg. 36, 1–8, 1995. [70] A. Höytö, A. P. Sihvonen, L. Alhonen, J. Juutilainen, J. Naarala, Modest increase in temperature affects ODC activity in L929 cells: low-level radiofrequency radiation does not, Radiat Environ Biophys, 45(3), 231–235, 2006. [71] A. B. Desta, R. D. Owen, L. W. Cress, Non-thermal Exposure to Radiofrequency Energy from Digital Wireless Phines does not Affect Ornithine Decarboxylase Activity in L929 Cells, Radiat. Res. 160, 488– 491, 2003. [72] T. Y. Tsong, Molecular recognition and processing of periodic signals in cells: study of activation of membrane ATPases by alternating electric fields, Biochim. Biophys. Acta 1113, 53–70, 1992. [73] M. Blank, NaK-ATPase function in alternating electric fields. FASEB J. 6, 2434–2438, 1992. [74] M. Blank, L. Soo, Frequency dependence of Na, K-ATPase function in magnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 42, 231–234, 1997. [75] M. Blank, L. Soo, The effects of alternating currents on Na,K-ATPase function, Bioelectrochem. Bioenerg. 22, 313-322, 1989. [76] T. D. Xie, Y. D. Chen, P. Marszalek, T. Y. Tsong, Fluctuation-driven directional flow in biochemicall cycle: further study of electric activation of Na,K pumps, Biophys. J. 72, 2496–2502, 1997. [77] R. Glaser, M. Michalsky, R. Schramek, Is the Ca2+ transport of human erythrocytes influenced by ELF and MF-electromagnetic fields? Bioelectrochem. Bioenerg. 47, 311–318, 1998. [78] M. Blank, L. Soo, Enhancement of cytochrome oxidase activity in 60 Hz magnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 45, 253–259, 1998. [79] S. Thumm, M. Löschinger, S. Glock, H. Hämmerle, H. P. Rodemann, Induction of cAMP-dependent protein kinase A activity in human skin fibroblasts and rat osteoblasts by extremely low-frequency electromagnetic fields, Radiat. Environ. Biophys. 38, 195–199, 1999. [80] D. Richard, S. Lange, T. Viergutz, R. Kriehuber, D. G. Weiss, M. Simkó, Influence of 50 Hz electromagnetic fields in combination with a tumour promoting phorbol ester on protein kinase C and cell cycle in human cells, Mol. Cell. Biochem. 232, 133–141, 2002. [81] S. Ravera, E. Repaci, A. Morelli, I. M. Pepe, R. Botter, D. Beruto, Electromagnetic field of extremely low frequency decreased adenylate kinase activity in retinal rod outer segment membranes, Bioeletrochemistry 63, 317–320, 2004. [82] M. Fedrowitz, J. Westermann, W. Löscher, Magnetic Field Exposure Increases Cell Proliferation but Does Not Affect Melatonin Levels in the Mammary Gland of Female Sprague Dawley Rats, Cancer Res. 62, 1356–1363, 2002. [83] L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, Effect of electromagnetic fields on the denitrification activity of Paracoccus denitrificans, Bioelectrochemistry In press, Available online 5 April 2006. [84] M. Barteri, A. Pala, S. Rotella, Structural and kinetci effects of mobile phone microwaves on acetylcholinesterase activity, Biophys. Chem. 113, 245–253, 2005. [85] M. Vácha, V. Bičík, R. Petrásek, V. Šimek, Srovnávací fyziologie živočichů, Přírodovědecká fakulta MU Brno, 2002. [86] S. M. Bawin, W. R. Adey, Sensitivity of calcium binding in cerebral tissue to weak environmental fields oscillating at low frequency, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1999–2003, 1976.

61

[87] C. F. Blackman, S. G. Benane, L. S. Kinney, D. E. House, W. T. Joines, Effects of ELF fields on calcium ion efflux from brain tissue in vitro, Radiat. Res. 92, 510–520, 1982. [88] C. F. Blackman, S. G. Benane, J. R. Rabinowitz, D. E. House, W. T. Joines, A role for the magnetic field in the radiation induced efflux of calcium ions from brain tissue in vitro, Bioelectromagnetics 6(4), 327– 337, 1985. [89] E. Lindström, P. Lindström, A. Berglund, K. H. Mild, E. Lundgren, Intracellular calcium oscillations induced in a T-cell line by a weak 50 Hz magnetic field, J. Cell. Physiol. 156, 395–398, 1993. [90] E. Lindström, K. H. Mild, E. Lundgren, Analysis of the T cell activation signaling pathway during ELF magnetic field exposure, p56(lck) and [Ca2+](i)-measurements, Bioelectrochem. Bioenerg. 46, 129–137, 1998. [91] J. Walleczek, Electromagnetic field effects on cells of the immune system: the role of calcium signaling, FASEB J. 6, 3177–3185, 1992. [92] E. Barbier, B. Dufy, B. Veyret, Stimulation of Ca2+ influx in rat pituitary cells under exposure to a 50 Hz magnetic field, Bioelectromagnetics 17(4), 303–311, 1996. [93] G. P. Cai, J. M. Liu, G. Chen, N. M. Zhao, Ca2+ flux as a response of peritoneal exudative macrophages to weak alternating electric fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 40, 15–19, 1996. [94] C. C. Cranfield, A. W. Wood, V. Anderson, K. G. Menezes, Effect of mobile phone type signals on calcium levels within human leukaemie T-cells (Jurkat cells), Int. J. Radiat. Biol. 77(12), 1207–1217, 2001. [95] C. Grassi, M. D’Ascenzo, A. Torsello, G. Martinotti, F. Wolf, A. Cittadini, G. B. Azzena, Effects of 50 Hz electromagnetic fields on voltage-gated Ca2+ channels and their role in modulation of neuroendocrine cell proliferation and death, Cell Calcium 35, 307–315, 2004. [96] F. Madeca, B. Billaudela, R. Charlet de Sauvagea, P. Sartorb, B. Veyreta, Effects of ELF and static magnetic fields on calcium oscillations in islets of Langerhans, Bioelectrochemistry 60, 73–80, 2003. [97] L. Morgado-Valle, L. Verdugo-Díaz, D. E. García, C. Morales-Orozco, R. Drucker-Colín, The role of voltage gated Ca2+ channels in neurite growth of cultured chromaffin cells induced by extremely lowfrequency (ELF) magnetic field stimulation, Cell Tissue Res. 291, 217–230, 1998. [98] R. Cassia-Moura, I. M. Xavier, Is it possible to induce ion channel memory control ? Bioelectrochem. Bioenerg. 42, 193–195, 1997. [99] P. Höjevik, S. Galt, J. Sandblom, Y. Hamnerius, Ca2+ Ion Transport Through Patch-Clamped Cells Exposed to Magnetic Fields, Bioelectromagnetics 16(1), 33–40, 1995. [100] H. Berg, Problems of weak electromagnetic field effects in cell biology. Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 355–360, 1999. [101] S. A. Goldblith, D. I. C. Wang, Effect of microwaves on Escherichia coli and bacillus subtilis. J. Appl. Microbiol. 15(6), 1371–1375, 1967. [102] G. R. Vela, J. F. Wu, Mechanism of lethal action of 2450-MHz radiation on microorganisms, Appl. Environ. Microbiol. 37(3), 550–553, 1979. [103] L. Najdovski, A. Z. Dragaš, V. Kotnik, The killing activity of microwaves on some non-sporogenic and sporogenic medically important bacterial strains. J. Hosp. Infect. 19, 239–247, 1991. [104] M. Kozempel, O. J. Scullen, R. Cook, R. Whiting, Preliminary Investigation using a Batch Flow Process to Determine Bacteria Destruction by Microwave Energy at Low Temperature, Lebensm. Wiss. u. Technol. 30, 691–696, 1997.

62

[105] C. B. A. Yeo, I. A. Watson, D. E. S. Stewart-Tull, V. H. H. Koh, Heat transfer of Staphylococcus aureus on stainless steel with microwave radiation, J. Appl. Microbiol. 87, 396–401, 1991. [106] Q. Wu, Effect of high-power microwave on idicator bacteria for sterilization, IEEE Trans. Biomed. Eng. 43(7), 752–754, 1996. [107] S. Rosaspina, G. Salvatorelli, D. Anzanel, The bactericidal effect of microwaves on Mycobacterium bovis dried on scalpel blades, J. Hosp. Infect. 26, 45–50, 1994. [108] Y. Belyaev, Y. D. Alipov, V. S. Shcheglov, V. N. Lystsov, Resonance effect of microwaves on the genome conformational state of E.coli cells, Z. Naturforsch. 47c, 621–627, 1992. [109] Y. Belyaev, V. S. Shcheglov, Y. D. Alipov, V.A. Polunin, Resonance effect of millimetr waves in the power range from 10-9 to 3.10-3 W/cm2 on Escherichia coli cells at different concentrations, Bioelectromagnetics 17(4), 312–321, 1996. [110] W. Grundler, Nonthermal Effects of Millimetr waves on Yeast Growth, Z. Naturforsch. 33c, 15–22, 1978. [111] S. Kwee, P. Raskmark, Changes in cell proliferation due to environmental non-ionizing radiation. 2. Microwave radiation, Bioelectrochem. Bioenerg. 44, 251–255, 1998. [112] S. Velizarov, P. Raskmark, S. Kwee, The effects of radiofrequency fields on cell proliferation are nonthermal, Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 177–180, 1999. [113] J. R. Chipley, Effect of microwave irradiation on microorganisms, Adv. Appl. Microbiol. 26, 129–145, 1980. [114] M. Dardalhon, D. Averbeck, A. J. Berteaud, Studies on possible genetic effects of microwaves in procaryiotic and eucaryotic cells, Radiat. Environ. Biophys. 20, 37–51, 1981. [115] I. V. Babushkina, V. B. Borodulin, N. A. Shmetkova, V. V. Morrison, A. D. Usanov, A. V. Skripal, D. A. Usanov, The influence of alternating magnetic field on Escherichia coli bacteriial cells, Pharm. Chem. J. 39(8), 398–400, 2005. [116] C. Ramon, M. Ayaz M, D. D. Streeter Jr., Inhibition of Growth Rate of Escherichia coli Induced by Extremely Low-Frequency Weak Magnetic Fields, Bioelectromagnetics 2(3),285–289, 1981. [117] L. Strašák, V. Vetterl, J. Šmarda, Effects of low-frequency magnetic fields on bacteria Escherichia coli, Bioelectrochemistry 55(1-2), 161–164, 2002. [118] L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, J. Šmarda, Comparison of the low-frequency magnetic field effects on bacteria Escherichia coli, Leclercia adecarboxylata and Staphylococcus aureus, Bioelectrochemistry 63(1-2), 337–341, 2004. [119] L. Strašák, V. Vetterl, and L. Fojt, Effects of 50Hz Magnetic Fields on the Viability of Different Bacterial Strains, Electromagn. Biol. Med. 24(3), 293–300, 2005. [120] R. S. Mittenzwey, W. Mei, Effects of extremely low-frequency electromagnetic fields on bacteria - the question of a co-stressing factor, Bioelectrochem. Bioenerg. 40, 21–27, 1996. [121] B. Del Re, F. Garoia, P. Mesirca, C. Agostini, F. Bersani, G. Giorgi, Extremely low frequency magnetic fields affect transposition activity in Escherichia coli, Radiat. Environ. Biophys. 42, 113–118, 2003. [122] B. Del Re, F. Bersani, C. Agostini, P. Mesirca, G. Giorgi, Various effects on transposition activity and survival of Escherichia coli cells due to different ELF-MF signals, Radiat. Environ. Biophys. 43, 265– 270, 2004. [123] K. Tsuchyia, K. Nakamura, K. Okuno, T. Ano, M. Shoda, Effect of Homogeneous and Inhomogeneous High Magnetic Fields on the Growth of Escherichia coli, J. Ferment. Bioeng. 81(4), 343–346, 1996.

63

[124] M. Kohno, M. Yamazaki, I. Kimura, M. Wada, Effect of static magnetic fields on bacteria: Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli, Pathophysiology 7, 143–148. 2000. [125] K. Okuno, T. Ano, M. Shoda, Effect of super high magnetic field on the growth of Escherichia coli, Biotechnol. Lett. 13(10), 745–750, 2001. [126] S. Horiuchi, Y. Ishizaki, K. Okuno, T. Ano, M. Shoda, Drastic high magnetic field effect on suppression of Escherichia coli death, Bioelectrochemistry 53, 149–153, 2001. [127] K. B. Elahee, D. Poinapen, Effects of Static Magnetic Fields on Growth of Paramecium caudatum, Bioelectromagnetics 27, 26–34, 2006. [128] W. Triampo, G. Doungchawee, D. Triampo, J. Wong-Ekkabut, D. I. Tang, Effects of Static Magnetic Field on Growth of Leptospire, Leptospira interrogans serovar canicola: Immunoreactivity and Cell Division, J. Biosci. Bioeng. 98(3), 182–186, 2004. [129] L. Dini, L. Abbro, Bioeffects of moderate-intensity static magnetic fields on cell cultures, Micron 36, 195–217, 2005. [130] W. Sontag D. Kalka, No effect of pulsed electromagnetic fields on PC12 and HL-60 cells, Radiat. Environ. Biophys. 45, 63–71, 2006. [131] J. Sabo, L. Mirossay, L. Horovcak, M. Sarissky, A. Mirossay, J. Mojzis, Effects of static magnetic field on human leukemic cell line HL-60, Bioelectrochemistry 56(1-2), 227-231, 2002. [132] G. Bodegaa, I. Forcadaa, I. Suáreza, B. Fernández, Acute and chronic effects of exposure to a 1-mT magnetic field on the cytoskeleton, stress proteins, and proliferation of astroglial cells in culture, Environ. Res. 98, 355–362, 2005. [133] M. Rosenthal, G. Obe, Effect of 50 Hz electromagnetic fields on proliferation and on chromosomal alterations in human peripheral lymphocytes untreated or pre-treated with chemical mutagens, Mutat. Res. 210, 329–335, 1989. [134] P. Conti, G. E. Gigante, M. G. Cifone, E. Alesse, G. Ianni, M. Reale, P. U. Angeletti, Reduced mitogenic stimulation of human lymphocytes by extremely low frequency electromagnetic fields, FEBS Lett 162, 156–160, 1983. [135] C. D. Cain, D. L. Thomas, W. R. Adey, 60 Hz magnetic field acts as co-promoter in focus formation of C3H/10T1/2 cells, Carcinogenesis 14, 955–960, 1993. [136] R. P. Liburdy, T. R. Sloma, R. Sokolic, P. Yaswen, ELF magnetic fields, breast cancer, and melatonin: 60 Hz fields block melatonin’s oncostatic action on ER/ breast cancer cell proliferation, J. Pineal Res. 14, 89–97, 1993. [137] J. Schimmelpfeng, H. Dertinger, Action of a 50 Hz magnetic field on proliferation of cells in culture, Bioelectromagetics 18, 177–183, 1997. [138] J. Schimmelpfeng, Cyclic AMP-levels of retinoic acid primed HL-60 cells in serum-free medium influenced by a 50 Hz magnetic field alone and as co-factor to prostaglandin E-2, Bioelectrochem. Bioenerg,43, 55–59, 1997. [139] R. W. West, W. G. Hinson, D. B. Lyle, M. J. Swicord, Enhancement of anchorage-independent growth in JB6 cells exposed to 60 Hertz magnetic fields, Bioelectrochem. Bioenerg. 34, 39–43, 1994. [140] C. Aldinucci, G. P. Pessina, Electromagnetic fields enhance the release of both interferon gamma and interleukin-6 by peripheral blood mononuclear cells after phytohaemagglutinin stimulation, Bioelectrochem. Bioenerg. 44, 243–249, 1998. [141] V. Jurášková, V. Vetterl, O. Chramosta, Effect of cadmium and 50 Hz electric and magnetic fields on bone marrow and tumour cells, Bioelectrochem. Bioenerg. 39, 119–123, 1996.

64

[142] J. Novák, L. Strašák, L. Fojt, I. Slaninová, V. Vetterl, Effects of low-frequency magnetic fields on the viability of yeast Saccharomyces cerevisiae, Bioelectrochemistry, In Press, Available online 18 April 2006. [143] M. Mehedintu, H. Berg, Proliferation response of yeast Saccharomyces cerevisiae on electromagnetic field parameters, Bioelectrochem.Bioenerg. 43, 67–70, 1997. [144] D. R. Weisbrot, O. Khorkova, H. Lin, A. S: Henderson, R. Goodman, The effect of low frequency electric and magnetic fields on gene expression in Saccharomyces cerevisiae, Bioelectrochem.Bioenerg. 31, 167– 177, 1993. [145] S. Nakasono, C. Laramee, H. Saiki, K. J. McLEod, Effect of Power-Frequency Magnetic Fields on Genome-Scale Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae, Radiat. Res. 160, 25–37, 2003. [146] M. A. da Motta, J. B. F. Muniz, A. Schuler, M. da Motta, Static Magnetic Fields Enhancement of Saccharomyces cerevisae Ethanolic Fermentation, Biotechnol. Prog. 20, 393–396, 2004. [147] M. J. Ruiz-Gómez, M. I. Prieto-Barciab, E. Ristori-Bogajoc, M. Martínez-Morillo, Static and 50 Hz magnetic fields of 0.35 and 2.45 mT have no effect on the growth of Saccharomyces cerevisiae, Bioelectrochemistry 64, 151–155, 2004. [148] J. C. Lin, M. F. Lin, Microwave hypertermia-iduced blood-brain barrier alterations, Radiat. Res. 89, 77– 87, 1982. [149] L. G. Salford, A. Brun, J. L. Eberhardt, B. R. R. Persson, Permeability of the blood-brain barrier iduced by 915 MHz electromagnetic radiation, continuos wave and modulated at 8, 16, 50 and 200 Hz, Bioelectrochem.Bioenerg. 30, 293–301, 1993. [150] B. R. R. Persson, L. G. Salford, A. Brun, Blood-brain barrier permeability in rats exposed to electromagnetic fields used in wireless communication. Wireless Networks 3, 455–461, 1997. [151] L. G. Salford, A. Brun, K. Sturesson, J. L. Eberhardt, B. R. R. Persson, Permeability of the blood-brain barrier induced by 915 MHz electromagnetic radiation, continuos wave and modulated at 8, 16, 50 and 200 Hz, Microscopy Research and techniques 27, 535-542, 1994. [152] M. Kuribayashi, J. Q. Wang, O. Fujiwara, Y. Doi, K. Nabae, S. Tamano, T. Ogiso, M. Asamoto, T. Shirai, Lack of effects of 1439 MHz electromagnetic near field exposure on the blood-brain barrier in immature and young rats, Bioelectromagetics 26(7), 578–588, 2005. [153] A. Schirmacher, S. Winters, S. Fischer, J. Goeke, H. J. Galla, U. Kullnick, E. B. Ringelstein, F. Stogbauer, Electromagnetic fields (1.8 GHz) increase the permeability to sucrose of the blood-brain barrier in vitro, Bioelectromagetics 21(5), 338–345, 2000. [154] H. Franke, E. B. Ringelstein, F. Stogbauer, Electromagnetic fields (GSM 1800) do not alter blood-brain barrier permeability to sucrose in models in vitro with high barrier tightness, Bioelectromagetics 26(7), 529–535, 2005. [155] F. Tian, T. Nakahar, K. Wake, M. Taki, J. Miyakoshi, Exposure to 2.45 GHz electromagnetic fields induces hsp70 at a high SAR of more than 20 W/kg but not at 5 W/kg in human glioma MO54 cells. Int. J. Radiat. Biol. 78(5), 433–440, 2002. [156] A. L. Di Carlo, M. T. Hargis, L. M. Penafiel, T. A. Litovitz, Short-term magnetic field exposures (60 Hz) induce protection against ultraviolet radiation damage, Int. J. Radit. Biol. 75(12), 1541–1549, 1999. [157] A. L. Di Carlo, N. White, F. Guo, P. Garett, T. Litovitz T, Chronic electromagnetic field exposure decreases hsp70 levels and lowers cytoprotection, J. Cell. Biochem. 84(3), 447–454, 2002. [158] H. Lin, M. Opler, M. Head, M. Blank, R. Goodman, Electromagnetic field exposure induces rapid, transitory heat shock factor activation in human cells, J. Cell. Biochem. 66, 482–488, 1997.

65

[159] T. Miyakawa, S. Yamada, S. Harada, T. Ishimori, H. Yamamoto, R. Hosono, Exposure of Caenorhabditis elegans to extremely low frequency high magnetic fields induces stress responses, Bioelectromagetics 22(5), 333–339, 2001. [160] B. Del Re, F. Bersani, P. Mesirca, G. Giorgi, Synthesis of DnaK and GroEL in Escherichia coli cells exposed to different magnetic field signals, Bioelectrochemistry 69(1), 99–103, 2006. [161] K. I. Kang, I. Bouhouche, D. Fortin, E. E. Baulieu, M. G. Catelli, Luciferase activity and synthesis of Hsp70 and Hsp90 are insensitive to 50Hz electromagnetic fields, Life Sci. 63(6), 489–497, 1998. [162] J. S. Lee, T. Q. Huang, J. J. Lee, J. K. Pack, J. J. Jang, J. S. Seo, Subchronic exposure of hsp70.1-deficient mice to radiofrequency radiation, Int. J. Radit. Biol. 81(10), 781–792, 2005. [163] G. Freude, P. Ullsperger, S. Eggert, I. Ruppe, Microwaves emitted by cellular phones affect human slow brain potentials, Eur. J. Appl. Physiol. 81, 18-27, 2000. [164] T. M. C. Lee, P. K. Lam, L. T. S. Yee, C. C. H. Chan, The effect of the duration of exposure to the electromagnetic field emitted by mobile phones on human attention, Cog. Neurosci. Neuropsychol. 14(10), 1361–1364, 2003. [165] D. L. Hamblin, A. W. Wood, Effects of mobile phone emissions on human brain activity and sleep variables, Int. J. Radit. Biol. 78(8), 659–669, 2002. [166] D. L. Hamblin, A. W. Wood, R. J. Croft, C. Stough, Examining the effects of electromagnetic fields emitted by GSM mobile phones on human event-related potentials and performance during an auditory task, Clin. Neurophysiol. 115, 171–178, 2004. [167] N. Arai, H. Enomoto, S. Okabe, K. Yuasa, Y. Kamimura, Y. Ugawa, Thirty minutes mobile phone use has no short-terma adverse effects on central auditory pathways, Clin. Neurophysiol. 114, 1390–1394, 2003. [168] Y. Kurokawa, H. Nitta, H. Imai, M. Kabuto, No influence of short-term exposure to 50-Hz magnetic fields on cognitive performance function in human, Int. Arch. Occup. Environ. Health. 76, 437–442, 2003. [169] U. Frick, J. Rehm, P. Eichhammer, Risk perception, somatization, and self report of complaints related to electromagnetic fields – A randomized survey study, Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 353–360, 2002. [170] K. Mann, J. Röschke, Sleep under exposure to high-frequency electromagnetic fields, Sleep Med. Rev. 8, 95–107, 2004. [171] X. Zhang, Y. Xue, Y. Zhang, Effects of 0.4 T Rotating Magnetic Field Exposure on Density, Strength, Calcium and Metabolismof Rat Thigh Bones, Bioelectromagnetics 27(1), 1-9, 2006. [172] A. Legros, P. Gaillot, A. Beuter, Transient effect of low-intensity magnetic field on human motor control, Med. Eng. Phys. 28(8), 827–836, 2006. [173] M. Ozguner, A. Koyu, G. Cesur, M. Ural, F. Ozguner, A. Gokcimen, N. Delibas, Biological and morphological effects on the reproductive organ of rats after exposure to electromagnetic field, Saudi Med. J. 26(3), 405–410, 2005. [174] F. Pezzeti, M. De Matyek, A. Causo, R. Cadossi, P. Zucchini, F. Carinci, G. C. Traina, V. Sollazo, Effect of Pulsed Electromagnetic Fields on Human Chondrocytes: An In Vitro Study, Calcif. Tissue Int. 65, 396– 401, 1999. [175] C. T. Brighton, Advanced Clinical applications of Electromagnetic field effects: bone and cartillage. In: C. T. Brighton, S. R. Pollack, Electromagnetics in Biology and Medicine, San Francisco Press, San Francisco, 293–308, 1991. [176] M. Blank, R. Goodman, Biomedical Applications of Electromagnetic Fields, in: P. Stavroulakis, Biological Effects of Electromagnetic Fields, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 494–502, 2003.

66

[177] H. Lin, M. Blank, R. Goodman, Field-responsive domain in the human HSP70 promoter, J. Cell. Biochem. 75, 170–176, 1999. [178] H. Lin, M. Blank, R. Goodman, Regulating Genes with Electromagnetic Response Elements, J. Cell. Biochem. 81, 143–148, 2001. [179] B. J. Wood, J. R. Ramkaransingh, T. Fojo, M. M. Walther, S. K. Libutti, Percutaneous Tumor Ablation with Radiofrequency, Cancer 94(2), 443–451, 2002. [180] B. J. Wood, J. Grippo, C. P. Pavlovich, Percutaneous radio frequency ablation for hematuria, J. Urol. 166, 2303–2304, 2001. [181] T. Hiraki, J. Sakurai, T. Tsuda, H. Gobara, Y. Sano, T. Mukai, S. Hase, T. Iguchi, H. Fujiwara, H. Date, S. Kanazawa, Risk factors for local progression after percutaneous radiofrequency ablation of lung tumors Evaluation based on a preliminary review of 342 tumors, Cancer 107(12), 2873–2880, 2006. [182] T. D. Yan, J. King, A. Sjarif, D. Glenn, K. Steinke, D. L. Morris, Percutaneous radiofrequency ablation of pulmonary metastases from colorectal carcinoma: Prognostic determinants for survival, Ann. Surg. Oncol. 13(11), 1529–1537, 2006. [183] S. J. Webb, A. D. Booth, Mocrowave Absorption by Normal and Tumor Cells, Science 174, 72–74, 1971. [184] D. J. Panagopoulos, A. Karabarbounis, L. H. Margaritas, Mechanism for action of electromagnetic fields on cells, Biochem. Byophis. Res. Comm. 298, 95–101, 2002. [185] H. Berg, Possibilities and problems of low frequency weak electromagnetic fields in cell biology, Bioelectrochem. Bioenerg. 38, 153–159, 1995. [186] J. L. Phillips, Effects of electromagnetic field exposure on gene transcription, J. Cell. Biochem. 51, 381– 386, 1993. [187] C. Polk, Physical mechanism for biological effects of low field intensity ELF magnetic fields, In: Biological Effects of Magnetic and Electromagnetic Fields, Plenum Press, New York, 63–83, 1996. [188] P. A. Valberg, R. Kavet, C. N. Raffety, Can Low-Level 50/60 Hz Electric and Magnetic Fields Cause Biological Effects, Radiat. Res. 148, 2–21, 1997. [189] A. Lacy-Hulbert, J. C. Metcalfe, R. Hesketh, Biological responses to electromagnetic fields, FASEB J. 12, 395–420, 1998. [190] J. Miyakoshi, The review of cellular effects of a static magnetic field, Sci. Tech. Adv. Mat. 7, 305–307, 2006. [191] J. Juutilainen, S. Lang, T. Rytömaa, Possible Cocarcinogenic Effect of ELF Electromagnetic Fields May Require Repeated Long-term Interaction With Known Carcinogenic Factors, Bioelectromagnetics 21, 122–128, 2000. [192] R. D. Saunders, Z. J. Sienkiewicz, C. I. Kowalczuk, Biological effects of electromagnetic fields and radiation, J. Radiat. Prot. 11(1), 27–42, 1991. [193] I. Y. Belyaev, Some biophysical aspects of the genetic effect of low-intensity millimetr waves, Bioelectrochem. Bioenerg. 27, 11–18, 1992. [194] ICNIRP Statement: Helth issues related to the use of hand-held radiotelephones and base transmitters, Health Phys. 70(4), 587–593, 1996. [195] M. I. Masley, B. F. Habbick B.F, W. O. Spitzer, M. A. Stuchly, Are wireless phone safe? Can. J. Pub. Helath 90, 325–329, 1999.

67

[196] L. Verschaeve, A. Maes, Genetic, carcinogenic and teratogenic effects of radiofrequency fields, Mutat. Res. 410, 141–165, 1998. [197] D. Brusick, R. Albertini, D. McRee, D. Peterson, G. Williams, P. Hanawalt, J. Preston, Genotoxicity of radiofrequency radiation, Environ. Mol. Mutagen. 32, 1–16, 1998. [198] J. E. Moulder, L. S. Erdreich, R. S. Malyapa, J. Meritt, W. F. Pickard, Vijyalaxmi, Cell Phones and Cancer: What Is the Evidence for a Connection, Radiat. Res. 151, 513–531, 1999. [199] K. H. Mild, L. Hardell, M. Kundi, M. Mattsson, Mobile telephones and cancer: Is there really no evidence of an association? Int. J. Mol. Med. 12, 67–72, 2003. [200] M. Dardalhon, D. Averbeck, A. J. Bertaud, Studies on Possible Genetic Effects of Microwaves in Procaryotic and Eucaryotic Cells, Radiat. Environ. Biiophys. 20, 37–51, 1981. [201] T. Y. Tsong, R. D. Astumian, Electroconformational coupling: how membrane-bound ATPase transduces energy from dynamic electric fields, Ann. Rev. Physiol. 50, 273–290, 1998. [202] V. M. Koldayev, Y. V. Shchepin, Effects of electromagnetic radiation on embryos of sea-urchins, Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 161–164, 1997. [203] D. Astumian, H. Berg, Direct electric field effect and sequental proceses in biosystems, Bioelectrochem. Bioenerg. 25, 455-462, 1991. [204] T. Y. Tsong, Molecular recognition and processing of periodic signals in cells - study of activation of membrane ATPases by alternating electric-fields, Biochem. Biophys. Acta 1113(1), 53–70, 1992. [205] D. B. Lyle, X. Wang, R. D. Ayotte, A. R. Sheppard, W. R. Adey, Calcium uptake by leukemic and normal T-lymphocytes exposed to low frequency magnetic fields, Bioelectromagnetics 12, 145–156, 1991. [206] D. T. Edmonds, Larmor precession as a mechanism for the detection of static and alternating magnetic fields, Biochem. Bioenerg. 30, 3–12, 1993. [207] J. Male, Biological effects of magnetic fields: A possible mechanism? Biologist 39(3), 87–89, 1992. [208] A. A. Pilla, D. J. Muehsam, M. S. Markov, A Dynamical Systems/Larmor Precession Model for Weak Magnetic Field Bioeffects: Ion Binding and Orientation of Bound Water Molecules, Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 241–252, 1997. [209] C. Polk, Dosimetry of extremely-low-frequency magnetic fields, Bioelectromagnetics Suppl. 1, 209–235, 1992. [210] A. R. Liboff, Cyclotron resonance in membrane transport, In: Interactions between Electromagnetic Fields and Cells, Plenum Press, New York, 281–296, 1985. [211] S. D. Smith, B. R. McLeod, A. R. Liboff, K. Cooksey, Calcium cyclotron resonance and diatom mobility, Bioelectromagnetics 8, 215–227, 1987. [212] A. R. Liboff, R. J. Rozek, M. L. Sherman, B. R. McLeod, S. D. Smith, Ca2+ -45 cyclotron resonance in human lymphocytes, J. Bioelectr. 6, 13–22, 1987. [213] R. K. Adair, Constrains on biological effects of weak extremely-low-frequency electromagnetic fields, Phys. Rev. A 43, 1039–1048, 1991. [214] J. Sandweiss, On the cyclotron resonance model of ion transport, Bioelectromagnetics 11, 203–205, 1990. [215] B. Halle, On the cyclotron resonance mechanism for magnetic field effects on transmembrane conductivity, Bioelectromagnetics 9, 381–385, 1988.

68

[216] W. C. Parkinson, C. T. Hanks, Search for cyclotron resonance in cells in vitro, Bioelectromagnetics 10, 129–145, 1989. [217] S. Galt, J. Sanblom, Y. Hamnerius, P. Höjevik, E. Saalman, B. Nordén, Experimental search for combined AC and DC combined magnetic field effects on ion channels, Bioelectromagnetics 14, 315–312, 1994. [218] A. W. Prasad, M. W. Miller, C. Cox, E. L. Carstensen, H. Hoops, A. A. Brayman, A test of the influence of cyclotron resonance exposures on diatom mobility, Health. Phys. 66, 305–312, 1994. [219] A. W. Prasad, M. W. Miller, E. L. Carstensen, C. Cox, M. Azadniv, A. A. Brayman, Failure to reproduce increased calcium uptake in human lymphocytec at purported cyclotron resonance exposure conditions, Radiat. Environ. Biophys. 30, 305–320, 1991. [220] W. C. Parkinson, G. L. Sulik, Diatom response to extremely low-frequency magnetic fields, Radiat. Res. 130, 319–330, 1992. [221] V. V. Lednev, Possible mechanism for the effect of weak magnetic fields on biological systems, Bioelectromagnetics 12, 71–75, 1991. [222] M. G. Yost, R. P. Liburdy, Time-varying and static magnetic fields act in combination to alter calcium signal transduction in the lymphocytes, FEBS Lett. 296, 117–122, 1992.

[223] C. F. Blackman, J. P. Blanchard, S. G. Benane, D. E. House, Empirical test of an ion parametric resonance model for magnetic field interactions with PC-12 cells, Bioelectromagnetis 15, 239–260, 1994. [224] R. J. Fitzsimmons, J. T. Ryaby, F. P. Magee, D. J. Baylink, Combined magnetic fields increased net calcium flux in bone cells, Calcif. Tissue Int. 55, 376–380, 1994. [225] B. R. McLeod, S. D. Smith, A. R. Liboff, Calcium and potassium cyclotron resonance curves and harmonics in diatoms, J. Bioel. 6, 153–168, 1987. [226] M. S. Cooper, Gap Junctions Increase the Sensitivity of Tissue Cells to Exogenous Electric Fields, J. Theor. Biol. 111, 123-130, 1984. [227] C. Eichwald, J. Walleczek, Model for magnetic field effect on radical pair recombination in enyzme kinetics, Biophys. J. 71, 623–631, 1996. [228] B. Brocklehurst, K. A. McLauchlan, Free radical mechanism for thge effects of environmental electromagnetic fields on biological systems, Int. J. Radita. Biol. 69(1), 3–24, 1996. [229] M. Zmyslony, E. Rajkowska, P. Mamrot, P. Politanski, J. Jajte, The effect of weak 50 Hz magnetic fields on the number of free oxygen radicals in rat lymphocytes in vitro, Bioelectromagnetis 25(8), 607–612, 2004. [230] J. Frahm, M. Lantow, M. Lupke, D. G. Weiss, M. Simko, Alteration in cellular functions in mouse macrophages after exposure to 50 Hz magnetic fields, J. Cell. Biochem. 99(1), 168–177, 2006. [231] J. Rollwitz, M. Lupke, M. Simko, Fifty-hertz magnetic fields induce free radical formation in mouse bone marrow-derived promonocytes and macrophages, Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 1674(3), 231–238, 2004. [232] A. Simko, C. Hartwig, A. Lantow, A. Lupke, M. O. Mattsson, Q. Rahman, J. Rollwitz, Hsp70 expression and free radical release after exposure to non-thermal radio-frequency electromagnetic fields and ultrafine particles in human Mono Mac 6 cells, Toxicol. Lett. 161(1), 73–82, 2006. [233] K. A. McLauchlan, Are environmental magnetic fields dangerous? Phys. World 5(1), 41–45, 1992. [234] J. Pokorný, A. Jandová, J. Kobílková, K. Heyberger, T. Hraba, Fröhlich electromagnetic radiation from human leukocytes: implications for leukocyte adherence inhibition test, J. Theor. Biol. 102, 295–305, 1993.

69

[235] A. Jandová, L. Mhamdi, M. Nedbalová, A. Cocek, S. Trojan, A. Dohnalová, J. Pokorný, Effects of magnetic field 0.1 and 0.05 mT on leukocyte adherence inhibition, Electromagn. Biol. Med. 24(3), 283– 292, 2005. [236] J. Pokorný, Excitation of vibrations in microtubules in living cells, Bioelectrochemistry 63(1–2), 321–326, 2004. [237] J. Pokorný, J. Hašek, F. Jelínek, Endogenous electric field and organization of living matter, Electromagn. Biol. Med. 24(3), 185–197, 2005. [238] J. Pokorný, J. Hašek, F. Jelínek, Electromagnetic field of microtubules: Effects on transfer of mass particles and electrons, J. Biol. Phys. 31(3–4), 501–514, 2005. [239] J. Pokorný, Conditions for coherent vibrations in the cytoskeleton, Bioelectrochem. Bioenerg. 48(2), 267– 271, 1999. [240] D. Panagopoulos, L. H. Margaritis, Theoretical Consideration for the Biological Effects of Electromagnetic Fields, in: P. Stavroulakis, Biological Effects of Electromagnetic Fields, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 5–75, 2003. [241] S. Rosypal, K. Hoďák, T. Martinec, M. Kocur, Obecná bakteriologie, Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1981. [242] E. V. Volpi, E. Chevret, T. Jones, R. Vatcheva, J. Williamson, S. Beck, R. D. Campbell, M. Goldsworthy, S. H. Powis, J. Ragoussis, J. Trowsdale, D. Sheer, Large-scale chromatin organization of the major histocompatibility complex and other regions of human chromosome 6 and its response to interferon in interphase nuclei, J. Cell Sci. 113, 1565–1576, 2000. [243] N. L. Mahy, P. E. Perry, W. A. Bickmore, Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH, J. Cell Biol. 159, 753–763, 2002. [244] L. Strašák, Vliv nízkofrekvenčních magnetických polí na bakterie. Disertační práce. Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, 2002. [245] M. Kozubek, S. Kozubek, E. Lukášová, A. Marečková, E. Bártová, M. Skalníková, High-resolution cytometry of FISH dots in interphase cell nuclei, Cytometry 36, 279–293, 1999. [246] L. Strašák, L. Fojt, V. Vetterl, J. Šmarda, Effect of the low-frequency magnetic fields on the living organisms, Biological effects of EMFs, 3rd international workshop, editor: P. Kostarakis, Proceedings, Pages 944–949, Kos, Greece, 4-8 October, 2004.

70

Seznam publikací 1. L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, J. Šmarda, Comparison of the low-frequency magnetic field effects on bacteria Escherichia coli, Leclercia adecarboxylata and Staphylococcus aureus, Bioelectrochemistry 63(1-2), 337-341, 2004. 2. S. Hasoň, F. Jelen, L. Fojt, V. Vetterl, Determination of picogram quantities of oligodeoxynucleotides by stripping voltammetry at mercury modified graphite electrode surfaces, Journal of Electroanalytical Chemistry 577(2), 263-272, 2005. 3. L. Strašák, L. Fojt, V. Vetterl, J. Šmarda, Effect of the low-frequency magnetic fields on the living organisms, Biological effects of EMFs, 3rd international workshop, editor: P. Kostarakis, Proceedings, Pages 944-949, Kos, Greece, 4-8 October, 2004. 4. L. Strašák, L. Fojt, Vliv elektromagnetických polí na bakterie, Universitas, 4, 3-8, 2003. 5. L. Fojt, S. Hasoň, Sensitive determination of oligodeoxynucleotides by anodic adsorptive stripping voltammetry at surface-roughened glassy carbon electrode in the presence of copper, Journal of Electroanalytical Chemistry, 586(1), 136-143, 2006. 6. J. Kroupová, E. Bártová, L. Fojt, L. Strašák, S. Kozubek, V. Vetterl, Low-frequency magnetic field effect on cytoskeleton and chromatin, Bioelectrochemistry, In press, Available online 7 April 2006. 7. L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, Effect of electromagnetic fields on the denitrification activity of Paracoccus denitrificans, Bioelectrochemistry,In press, Available online 5 April 2006. 8. J. Novák, L. Strašák, L. Fojt, I. Slaninová, V. Vetterl, Effects of low-frequency magnetic fields on the viability of yeast Saccharomyces cerevisiae, Bioelectrochemistry, In Press, Available online 18 April 2006. 9. L. Strašák, V. Vetterl, and L. Fojt, Effects of 50Hz Magnetic Fields on the Viability of Different Bacterial Strains, Electromagnetic Biology and Medicine 24(3), 293300, 2005. 10. L. Fojt, P. Klapetek, L. Strašák, V. Vetterl, 50 HZ Magnetic field effect on the morphology of bacteria, Biological Effects of EMFs 4th International Workshop, Proceedings, vol. II, Pages 897-899, Crete, Grece, 16-20 Oct., 2006. 11. L. Strašák, L. Fojt, J. Novák, F. Vožeh, Effect of RF electromagnetic fields on microorganisms, Biological Effects of EMFs 4th International Workshop, Proceedings, vol. II, Pages 1189-1192, Crete, Grece, 16-20 Oct., 2006. 12. J. Novák, L. Strašák, L. Fojt, V. Vetterl, Magnetic Fields in public transportation in Czech Republic, Biological Effects of EMFs 4th International Workshop, Proceedings, vol. II, Pages 1193-1195, Crete, Grece, 16-20 Oct., 2006. 71

Přílohy Příloha 1 L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, J. Šmarda, Comparison of the low-frequency magnetic field effects on bacteria Escherichia coli, Leclercia adecarboxylata and Staphylococcus aureus, Bioelectrochemistry 63(1-2), 337-341, 2004. Příloha 2 L. Fojt, L. Strašák, V. Vetterl, Effect of electromagnetic fields on the denitrification activity of Paracoccus denitrificans, Bioelectrochemistry, In press. Příloha 3 J. Kroupová, E. Bártová, L. Fojt, L. Strašák, S. Kozubek, V. Vetterl, Low-frequency magnetic field effect on cytoskeleton and chromatin, Bioelectrochemistry, In press. Příloha 4 J. Novák, L. Strašák, L. Fojt, I. Slaninová, V. Vetterl, Effects of low-frequency magnetic fields on the viability of yeast Saccharomyces cerevisiae, Bioelectrochemistry, In Press. Příloha 5 L. Strašák, V. Vetterl, and L. Fojt, Effects of 50Hz Magnetic Fields on the Viability of Different Bacterial Strains, Electromagnetic Biology and Medicine 24(3), 293300, 2005. Příloha 6 L. Fojt, P. Klapetek, L. Strašák, V. Vetterl, 50 Hz magnetic field effect on the morphology of bacteria, Manuscript in preparation Příloha 7 L. Strašák, L. Fojt, V. Vetterl, J. Šmarda, Effect of the low-frequency magnetic fields on the living organisms, Biological effects of EMFs, 3rd international workshop, editor: P. Kostarakis, Proceedings, Pages 944-949, Kos, Greece, 4-8 October, 2004. Příloha 8 L. Strašák, L. Fojt, Vliv elektromagnetických polí na bakterie, Universitas, 4, 3-8, 2003.

72

Příloha 1

Lukáš Fojt, Luděk Strašák, Vladimír Vetterl and Jan Šmarda Comparison of the low-frequency magnetic field effects on bacteria Escherichia coli, Leclercia adecarboxylata and Staphylococcus aureus Bioelectrochemistry, 63(1-2), 2004, 337-34. IF = 1.558

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 50%.

Souhlas spoluautorů:

Luděk Strašák

Vladimír Vetterl

Jan Šmarda

73

Příloha 2

Lukáš Fojt, Luděk Strašák, Vladimír Vetterl Effect of electromagnetic fields on the denitrification activity of Paracoccus denitrificans Bioelectrochemistry, In Press. IF = 1.558

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 80%.

Souhlas spoluautorů:

Luděk Strašák

Vladimír Vetterl

74

Příloha 3

Jana Kroupová, Eva Bártová, Lukáš Fojt, Luděk Strašák, Stanislav Kozubek and Vladimír Vetterl Low-frequency magnetic field effect on cytoskeleton and chromatin Bioelectrochemistry, In Press. IF = 1.558

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 20%.

Souhlas spoluautorů:

Jana Kroupová

Eva Bártová

Luděk Strašák

Stanislav Kozubek

Vladimír Vetterl

75

Příloha 4

Jan Novák, Luděk Strašák, Lukáš Fojt, Iva Slaninová and Vladimír Vetterl Effects of low-frequency magnetic fields on the viability of yeast Saccharomyces cerevisiae Bioelectrochemistry, In Press. IF = 1.558

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 20%.

Souhlas spoluautorů:

Jan Novák

Luděk Strašák

Iva Slaninová

Vladimír Vetterl

76

Příloha 5

Strašák L, Vetterl V, Fojt L Effects of 50 Hz magnetic fields on the viability of different bacterial strains Electromagnetic Biology and Medicine 24(3), 2005, 293-300 IF = 0.649

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 30%.

Souhlas spoluautorů:

Luděk Strašák

Vladimír Vetterl

77

Příloha 6

Lukáš Fojt, Petr Klapetek, Luděk Strašák, Vladimír Vetterl 50 Hz magnetic field effect on the morphology of bacteria Manuscript in preparation (will be submitted to Ultramicroscopy)

78

Příloha 7

Strašák L, Fojt L, Vetterl V, Šmarda J Effect of the low-frequency magnetic fields on the living organisms Biological effects of EMFs, 3rd international workshop, editor: P. Kostarakis, Kos, Greece, 4 -8 October, 2004, Proceedings, Pages 944-949 Článek ve sborníku.

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 20%.

Souhlas spoluautorů:

Luděk Strašák

Vladimír Vetterl

Jan Šmarda

79

Příloha 8

Luděk Strašák, Lukáš Fojt Vliv elektromagnetických polí na bakterie Universitas, 4, 2003, 3-8

Prohlašuji, že můj podíl na této publikaci je 40%.

Souhlas spoluautorů:

Luděk Strašák

80