MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Brno 2013
Gabriela Pavlasová
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
ÚČINKY METOTREXÁTU NA LINIE DERIVOVANÉ ZE SOLIDNÍCH NÁDORŮ DĚTSKÉHO VĚKU Diplomová práce
Gabriela Pavlasová
VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Brno 2013
Bibliografický záznam Autor:
Bc. Gabriela Pavlasová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Účinky metotrexátu na linie derivované ze solidních nádorů dětského věku
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
87
Klíčová slova:
Metotrexát; antifolát; folátový metabolismus; leukovorin; rezistence; meduloblastom; osteosarkom
Bibliographic Entry Author:
Bc. Gabriela Pavlasová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Effects of methotrexate on cell lines derived from solid tumors of the children's age
Degree Programme: Experimental biology Field of Study:
Molecular biology and genetics
Supervisor:
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
87
Keywords:
Methotrexate; antifolate; folate metabolism; leucovorin; resistance; medulloblastoma; osteosarcoma
Abstrakt Metotrexát (MTX), analog kyseliny listové, je používaný v léčbě hematologických malignit i solidních nádorů. Jeho protinádorový potenciál spočívá zejména v inhibici enzymu dihydrofolát reduktáza (DHFR), který je nezbytný
pro
biosyntézu
purinových
a
pyrimidinových
prekurzorů.
Limitujícími faktory MTX jsou však častá rezistence a toxicita. Proto je onkologickým pacientům podáván vysokodávkový (HD) MTX a jako protektivum leukovorin (LV). Nicméně i přes to, že je MTX v praxi využíván již více než 60 let, nebyly dosud stále ustanoveny obecně platné léčebné postupy, jako je velikost dávky a načasování podání MTX a LV. Cílem předkládané práce bylo zaměřit se na studium účinku MTX na buněčné linie derivované ze solidních nádorů dětského věku: meduloblastomu (sbírková linie Daoy a pacientská linie MBL-02) a osteosarkomu (sbírková linie Saos-2 a pacientská linie OSA-08). Výsledky prokázaly, že MTX významně inhibuje proliferační aktivitu linie Daoy a Saos-2, zastavuje jejich buněčný cyklus a indukuje apoptózu. Přitom nebyl pozorován rozdíl v rozmezí 1 – 40µM MTX. Ovlivnění účinku MTX prostřednictvím LV bylo zaznamenáno pouze v případě nejnižší koncentrace MTX (0,1 μM), kdy LV částečně potlačil toxické působení MTX. U pacientských linií MBL-02 a OSA-08 nebyl pozorován žádný vliv MTX a LV na proliferaci a viabilitu. Analýza exprese vybraných genů spojených s rezistencí k MTX ukázala, že MTX ovlivňuje jejich expresi v závislosti na buněčné linii. Ačkoliv se účinek MTX na jednotlivé linie lišil, výsledky na sbírkových liniích ukazují, že MTX v řádově nižších koncentracích má in vitro stejné účinky, které navíc nejsou ovlivněny působením LV.
Abstract Methotrexate (MTX) is an analogue of folic acid used in the treatment of haematological malignancies and various solid tumours. It acts by binding and inhibiting dihydrofolate reductase (DHFR), a key enzyme required for biosynthesis of purine and pyrimidine precursors. However, limiting factors of MTX are resistance and toxicity. Due to resistance, cancer patients are given high dose (HD) MTX followed by leucovorin (LV) to prevent side effects of MTX. Although MTX has been used as a folate metabolism antagonist in anticancer therapy for more than 60 years, there is no agreement in terms of dosing and scheduling of MTX and LV. The main aim of this work was a detailed study of the effects of MTX on selected cell lines derived from solid tumours of the children's age: medulloblastoma (Daoy cell line purchased from ATCC collection and MBL-02 cell line derived from patient´s tissue) and osteosarcoma (Saos-2 cell line purchased from ATCC collection and OSA-08 cell line derived from patient´s tissue). Results demonstrated that MTX significantly inhibits Daoy and Saos-2 proliferation, arrests their cell cycle and induces the apoptosis. No difference was observed in the range of 1 – 40µM MTX. Moreover, only the lowest concentration of MTX (0,1 µM) was influenced by LV that partially inhibited MTX cytotoxicity. Neither MTX nor LV had an effect on MBL-02 and OSA-08. Finally, the analysis of selected genes associated with MTX resistance showed that MTX affects their expression depending on the cell line. Despite the fact that there are some differences among effects of MTX on cell lines, results observed on Daoy and Saos-2 cell lines demonstrate that several orders lower concentration of MTX has in vitro the same effects and is not influenced by LV.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli RNDr. Jakubu Neradilovi, Ph.D. za cenné rady a čas, který mi věnoval při řešení mé diplomové práce, a rovněž celému kolektivu Laboratoře nádorové biologie za vytvoření příjemné atmosféry. Tato diplomová práce vznikla s finanční podporou grantu rektora MU (MUNI/C/0803/2011), Evropského fondu pro regionální rozvoj a státního rozpočtu České republiky (RECAMO; CZ 1.05/2.1.00/03.0101).
OBSAH 1.
ÚVOD DO PROBLEMATIKY ...................................................................................... 15 1.1.
METOTREXÁT ........................................................................................................ 15
1.1.1.
Historie ............................................................................................................... 15
1.1.2.
Transport a metabolismus................................................................................... 16
1.1.3.
Protinádorové účinky.......................................................................................... 17
1.1.3.1.
MTX jako inhibitor syntézy DNA .............................................................. 18
1.1.3.2.
MTX jako inhibitor metylace biomolekul ................................................... 19
1.1.3.3.
MTX jako inhibitor glyoxalázového systému ............................................. 20
1.1.3.4.
MTX jako inhibitor histondeacetyláz .......................................................... 22
1.1.4.
1.1.4.1.
Zhoršený transport MTX přes plazmatickou membránu ............................ 23
1.1.4.2.
Zvýšený transport MTX z buňky ................................................................ 23
1.1.4.3.
Nadměrná exprese a mutace cílových enzymů ........................................... 24
1.1.4.4.
Snížená polyglutamylace MTX ................................................................... 25
1.1.4.5.
Další příčiny rezistence buněk k MTX ....................................................... 25
1.1.5. 1.2.
Rezistence buněk k MTX ................................................................................... 22
Nežádoucí účinky MTX a podpůrná léčba ......................................................... 25
SOLIDNÍ NÁDORY DĚTSKÉHO VĚKU ............................................................... 27
1.2.1.
Meduloblastom ................................................................................................... 27
1.2.2.
Osteosarkom ....................................................................................................... 29
2.
CÍLE PRÁCE .................................................................................................................. 31
3.
MATERIÁL A METODY .............................................................................................. 32 3.1.
BUNĚČNÉ KULTURY ............................................................................................ 32
3.1.1.
Buněčné linie ...................................................................................................... 32
3.1.2.
Kultivační podmínky .......................................................................................... 32
3.2.
USPOŘÁDÁNÍ EXPERIMENTŮ ............................................................................ 33
3.3.
HODNOCENÍ BUNĚČNÉ MORFOLOGIE ............................................................. 34
3.4.
MTT TEST ................................................................................................................ 34
3.5.
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE PRO ANALÝZU BUNĚČNÉHO CYKLU .......... 35
3.6.
IMUNODETEKCE A KVANTIFIKACE APOPTÓZY ........................................... 36
4.
5.
3.7.
RT-PCR ..................................................................................................................... 37
3.8.
STATISTIKA ............................................................................................................ 39
VÝSLEDKY..................................................................................................................... 40 4.1.
HODNOCENÍ ZMĚN V MORFOLOGII BUNĚK ................................................... 40
4.2.
HODNOCENÍ PROLIFERACE A VIABILITY BUNĚK ........................................ 45
4.3.
ZMĚNY V BUNĚČNÉM CYKLU PO PŮSOBENÍ MTX....................................... 47
4.4.
INDUKCE APOPTÓZY PŮSOBENÍM MTX.......................................................... 53
4.5.
VLIV LEUKOVORINU NA PŮSOBENÍ MTX ....................................................... 56
4.6.
EXPRESE GENŮ SPOJENÝCH S REZISTENCÍ K MTX ..................................... 62
DISKUZE ......................................................................................................................... 68 5.1.
ÚČINKY MTX NA SBÍRKOVÉ BUNĚČNÉ LINIE ............................................... 68
5.1.1.
Změny v morfologii a proliferaci ....................................................................... 69
5.1.2.
Změny v průběhu buněčného cyklu ................................................................... 69
5.1.3.
Změny v indukci apoptózy ................................................................................. 70
5.1.4.
Souhrn analýzy účinků MTX na sbírkové linie .................................................. 71
5.2.
OVLIVĚNÍ ÚČINKU MTX PROSTŘEDNICTVÍM LEUKOVORINU ................. 72
5.3.
EXPRESE GENŮ SPOJENÝCH S REZISTENCÍ K MTX ..................................... 73
5.3.1.
RFC1................................................................................................................... 73
5.3.2.
Cílové enzymy MTX .......................................................................................... 73
5.3.3.
Polyglutamylační enzymy .................................................................................. 74
6.
ZÁVĚR ............................................................................................................................. 75
7.
SUMMARY...................................................................................................................... 76
8.
LITERATURA ................................................................................................................ 77
SEZNAM ZKRATEK 10-formylTHF
10-formyltetrahydrofolát
5,10-metenylTHF
5,10-metenyltetrahydrofolát
5,10-metylenTHF
5,10-metylentetrahydrofolát
5-formylTHF
5-formyltetrahydrofolát
5-metylTHF
5-metyltetrahydrofolát
7-OH-MTX
7-hydroxymetotrexát
ABC
ATP-vazebná kazeta (ATP-binding cassette)
AICAR
5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleosid (5-aminoimidazole-4carboxamide ribonucleoside)
ALL
akutní lymfoblastická leukémie
AML
akutní myeloidní leukémie
ATIC
AICAR transformyláza
BCRP
protein rezistence karcinomu prsu (breast cancer resistance protein)
BER
bázová excizní reparace
BSA
bovinní sérový albumin
CNS
centrální nervová soustava
DHF
dihydrofolát
DHFR
dihydrofolát reduktáza
DMEM
Dulbecco´s modified Eagles medium
DMSO
dimetylsulfoxid
dTDP
deoxytymidindifosfát (deoxythymidine diphosphate)
dTMP
tymidylát = deoxytymidinmonofosfát (deoxythymidine monophosphate)
dTTP
deoxytymidintrifosfát (deoxythymidine triphosphate)
dUDP
deoxyuridindifosfát (deoxyuridine diphosphate)
dUMP
deoxyuridinmonofosfát (deoxyuridine monophosphate)
dUTP
deoxyuridintrifosfát (deoxyuridine triphosphate)
dUTPáza
deoxyuridintrifosfát nukleotid hydroláza
FCS
fetální telecí sérum (fetal calf serum)
FPGH
folylpolyglutamát hydroláza
FPGS
folylpolyglutamát syntáza
FR
folátový receptor
GAR
glycinamid ribonukleosid
GART
GAR transformyláza
GLO1
gen kódující enzym glyoxalázu 1
GSH
glutation
HDAC
histon deacetyláza
HDACi
inhibitor histon deacetylázy
HD-MTX
vysokodávkový metotrexát (high-dose methotrexate)
HR
vysoké riziko (high risk)
HSP90AB1
provozní (housekeeping) gen (heat shock protein 90kDa alpha, class B, member 1)
ICMT
isoprenylcystein-karboxyl metyltransferáza (isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase)
LD-MTX
nízkodávkový metotrexát (low-dose methotrexate)
LV
leukovorin
MAT
metionin S-adenosyl transferáza
MRP
protein mnoholékové rezistence (multidrug resistance-associated protein)
MTT
3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid
MTX
metotrexát
MTX-Glun
polyglutamylovaný metotrexát, kde n značí počet glutamátových jednotek
NEAA
neesenciální aminokyseliny (nonessential amino acids)
NHL
nehodgkinský lymfom
p53
tumorsupresorový protein 53
PBS
fosfátový pufr (phosphate buffered saline)
PCFT
folátový transportér spřažený s transportem H+ (proton-coupled folate transporter)
PI
propidium jodid (propidium iodide)
pRb
retinoblastomový protein
RFC1
přenašeč pro redukované foláty (reduced folate carrier)
RT-PCR
reverzně-transkripční polymerázová řetězová reakce (reverse transcription polymerase chain reaction)
SAH
S-adenosyl homocystein
SAM
S-adenosyl metionin
SR
standardní riziko (standart risk)
THF
tetrahydrofolát
TK
tymidin kináza
TMPK
tymidylát kináza (thymidine monophosphate kinase)
TS
tymidylát syntáza
TYMS
gen kódující tymidylát syntázu
1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY 1.1. METOTREXÁT Metotrexát (MTX, 4-amino-10-metylpteroylglutamová kyselina), dříve znám jako ametopterin, je nejznámější a v praxi stále nejpoužívanější chemoterapeutikum ze skupiny antifolátů (Klener, 2002). Antifoláty jsou strukturní analogy folátů, donorů jednouhlíkatých zbytků, které jsou nezbytné pro celou řadu vnitrobuněčných procesů jako syntéza purinů a tymidylátu (dTMP) pro replikaci DNA, syntéza metioninu pro metylaci biomolekul nebo degradace serinu na glycin (Stover, 2010).
1.1.1.
Historie
Počátek využívání antifolátů v léčbě nádorových onemocnění sahá až do 40. let 20. století, kdy Farber et al. (1948) oznámil dosažení kompletní remise u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) léčených aminopterinem. O rok později byl aminopterin nahrazen MTX, který vykazoval menší toxické účinky (Farber, 1949). V 50. letech Li et al. (1956) prokázal dobré účinky MTX i u pacientů s choriokarcinomem - poprvé tak byl u člověka vyléčen solidní nádor s metastázami pomocí chemoterapie. Od 60. let byly testovány léčebné protokoly kombinující různá chemoterapeutika včetně MTX, např. pro léčbu Hodgkinových lymfomů (Moxley et al., 1967) nebo karcinomu prsu (Canellos et al., 1974). Výsledky byly velmi povzbudivé. Další pozitivní účinky MTX byly pozorovány při léčbě pacientů trpících osteosarkomem, u nichž Frei et al. (1975) zjistil, že použití vysokých dávek MTX společně s leukovorinem podstatně snižuje riziko recidivity onemocnění. Od 80. let se vědci snažili navrhnout a syntetizovat nové antifoláty, které by měly méně vedlejších účinků a jimiž by se překonala častá rezistence k MTX. Mezi tyto antifoláty nové generace patří pemetrexed, raltitrexed, edatrexát, pralatrexát či nolatrexed (Klener et Klener, 2010). I přes to však MTX stále zůstává důležitou součástí léčebných protokolů u dětské ALL (profylaxe leukémie v centrální nervové soustavě (CNS)) i solidních nádorů, jako jsou karcinom prsu, karcinom močového měchýře, malobuněčný karcinom plic, osteosarkom, choriokarcinom, nádory hlavy a krku či nehodgkinské lymfomy (NHL). Kromě toho je MTX používán také k léčbě autoimunitních onemocnění typu revmatoidní artritidy či psoriázy (Bartyik et al., 2004).
15
1.1.2.
Transport a metabolismus
MTX patří mezi hydrofilní antifoláty, což znamená, že za fyziologických podmínek nemůže volně procházet plazmatickou membránou (Assaraf, 2007). Do buněk je transportován třemi způsoby: pomocí přenašeče pro redukované foláty (RFC1, SLC19A1), folátového receptoru (FR) nebo folátového transportéru spraženého s transportem H+ (PCFT, SLC46A1), o jejichž vazebná místa soupeří s foláty (obr. 1, Visentin et al., 2012). Rychlost transportu závisí na mimobuněčné koncentraci MTX a folátů a také na jejich afinitě k příslušným přenašečům a receptorům (Mauritz et al., 2008). PCFT funguje nejlépe v kyselém prostředí, zejména při pH 4,5 – 5,5 (Qiu et al., 2006; Qiu et al., 2007). FR má nejvyšší afinitu pro kyselinu listovou, zatímco RFC1 má vyšší afinitu pro redukované foláty a MTX v porovnání s kyselinou listovou a jedná se tedy o hlavní transportní mechanismus pro MTX (Westerhof et al., 1995; Mauritz et al., 2008). Kromě těchto specifických folátových transportérů byly popsány také mechanismy zapojené do přenosu MTX z buňky do vnějšího prostředí. Patří mezi ně proteiny mnoholékové rezistence (MRP; Bakos et al., 2000; Zeng et al., 2001; Chen et al., 2002; Wielinga et al., 2005) nebo protein rezistence karcinomu prsu (BCRP; Chen et al., 2003).
Obr. 1 Transportní mechanismy MTX. Přenašeče RFC1 a PCFT jsou schopny obousměrného přenosu MTX proti elektrochemickému gradientu. RFC1 využívá antiport s organickými fosfáty, PCFT +
symport s H . FR přenáší MTX do buňky endocytózou, kdy se na následném exportu z endozomu podílí i PCFT. MRP a BCRP využívají energii uvolněnou z hydrolýzy ATP k přenosu MTX z cytosolu do mimobuněčného prostoru. (Visentin et al., 2012; upraveno)
+
H MTX
PCFT
MTX
RFC1
Organické fosfáty +
FR
H MTX PCFT
MRP, BCRP MIMOBUNĚČNÝ PROSTOR
ATP
16
CYTOSOL
Jakmile je MTX přenesen do cytosolu buňky, dochází k jeho chemické modifikaci, kdy jsou ke glutamové skupině MTX γ-peptidickou vazbou připojovány další glutamátové zbytky (Assaraf, 2007). Reakci katalyzuje enzym folylpolyglutamát syntáza (FPGS) a obvykle bývá tímto způsobem přidáno 2 – 7 glutamátových zbytků. Polyglutamylace MTX má za následek jeho zadržování uvnitř buňky a následné zvýšení vnitrobuněčné koncentrace (Jolivet et al., 1982). Důvodem je, že polyglutamylovaný MTX (MTX-Glun) není substrátem výše zmíněných transportních mechanismů (Zeng et al., 2001; Chen et al., 2002; Wielinga et al., 2005). Dále bylo zjištěno, že MTX-Glun disociuje z vazby s cílovými enzymy pomaleji než MTX (Jolivet et Chabner, 1983), popř. k nim má vyšší afinitu (Allegra et al., 1985a; Allegra et al., 1985b), což vede k silnější inhibici těchto enzymů. MTX-Glun je degradován v lysozomech působením enzymu folylpolyglutamát hydroláza (FPGH; Marshall et al., 2005).
1.1.3.
Protinádorové účinky
MTX stejně jako většina ostatních antifolátů může teoreticky působit různým způsobem (Klener et Klener, 2010). Jedná se o již zmiňovanou kompetici s foláty o transport do buňky a dále také o inhibici folátových koenzymů nebo inhibici reakcí katalyzovaných folátovými koenzymy (obr. 2, Neradil et al., 2012). Nedávné studie však ukazují, že kromě folátového metabolismu ovlivňuje MTX i další buněčné procesy.
Obr. 2 Schéma působení MTX na folátový metabolismus. Toto schéma zobrazuje 3 hlavní biochemické dráhy závislé na dostatečném množství folátů: metylace biomolekul (červená oblast), syntéza dTMP (modrá oblast) a syntéza purinů (zelená oblast). Hvězdička označuje místo působení MTX. Zkratky viz seznam zkratek. (Neradil et al., 2012; upraveno)
17
1.1.3.1.
MTX jako inhibitor syntézy DNA
Klíčovým cílem MTX je enzym dihydrofolát reduktáza (DHFR), která katalyzuje přeměnu
kyseliny
listové
(folát),
resp.
dihydrolistové
(dihydrofolát,
DHF)
na
tetrahydrolistovou (tetrahydrofolát, THF; Klener et Klener, 2010). Teprve takto redukovaná forma folátu je schopna fungovat jako přenašeč jednouhlíkatých zbytků nezbytných pro de novo syntézu stavebních kamenů DNA, tj. purinů a pyrimidinů. Dlouho se předpokládalo, že hlavním mechanismem působení MTX je vyčerpání vnitrobuněčné zásoby redukovaných folátů po inhibici DHFR, v důsledku čehož dochází k zastavení syntézy purinů a pyrimidinů. In vitro studie provedená na buněčné linii karcinomu prsu potvrdila, že působení MTX vede ke snížení de novo syntézy purinů a pyrimidinů až o 80 % oproti kontrole (Allegra et al., 1986). Dále se dle očekávání výrazně zvýšila koncentrace DHF a snížila koncentrace redukovaných folátů jako 5-metylTHF či 5-formylTHF. Nicméně hladina 10-formylTHF, substrátu potřebného pro syntézu purinů de novo, zůstala zachována na 80 %. Ke stejným výsledkům dospěl i Baram et al. (1986) po aplikaci MTX na myeloidní prekurzory purifikované ze zdravé lidské kostní dřeně. Inhibice de novo syntézy purinů tak nemůže být výsledkem nedostatku 10-formylTHF, ale příčinou je akumulace DHF uvnitř buněk. DHF je polyglutamylován a následně stejně jako MTX-Glun funguje jako přímý inhibitor 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleosid transformylázy (ATIC), enzymu nezbytného pro de novo syntézu purinů (Allegra et al., 1985b; Allegra et al., 1987). Stejně tak syntéza dTMP pro tvorbu pyrimidinových nukleotidů není inhibována primárně nedostatkem redukovaných folátů (Bunni et al., 1988; Chu et al., 1990). Hlavním enzymem této biosyntetické dráhy je tymidylát syntáza (TS), která konvertuje deoxyuridinmonofosfát (dUMP) na dTMP s využitím 5,10-metylenTHF jakožto donoru metylové skupiny. Chu et al. (1990) popsal, že po vystavení nádorových i nenádorových buněk MTX byla hladina 5,10-metylenTHF ze 40 – 60 % zachována, přestože syntéza dTMP byla snížena na méně než 20 %. Rovněž byla pozorována zvýšená koncentrace DHF, který byl popsán jako inhibitor TS, a jako přímý inhibitor TS funguje i samotný MTX-Glun (Allegra et al., 1985a). Inhibice de novo syntézy dTMP je tedy multifaktoriální proces, který se skládá z částečného nedostatku substrátu a přímé enzymatické inhibice prostřednictvím DHF a MTX-Glun. Snížená biosyntéza dTMP pak vede k tzv. tymidylátovému stresu (Berger et al., 2008). Ten je spojen s nedostatkem deoxytymidintrifosfátu (dTTP), zvýšenou vnitrobuněčnou koncentrací dUMP a následným začleňováním uracilu do DNA (obr. 3). Uracil je odstraňován procesem bázové excizní reparace (BER), kdy vznikají abazická místa. Do těch se za normálních okolností začlení tymin, ale z důvodu nedostatku dTTP se místo toho začleňuje 18
další uracil, který je následně opět odstraňován (Curtin et al., 1991). Abazická místa jsou křehká a zlomy DNA vznikající při této bezvýsledné reparaci jsou klastogenní, ústí v genomovou nestabilitu a následnou buněčnou smrt (angl. „thymineless death“). Zvýšená inkorporace uracilu do DNA a poškozená BER byla pozorována, např. u pacientů s ALL léčených MTX a 6-merkaptopurinem (Stanczyk et al., 2012). I když následné procesy vedoucí ke smrti buněk ještě nebyly zcela objasněny, předpokládá se propojení BER a procesu homologní rekombinace, jelikož bylo zjištěno, že inhibice TS indukuje výměnu sesterských chromatid, proces typický pro homologní rekombinaci (Li et al., 2005). Bylo také potvrzeno, že inhibicí TS dochází k aktivaci signalizačních drah vedoucích k homologní rekombinaci (Yang et al., 2008a).
Obr. 3 Zjednodušené schéma metabolismu dUMP a dTMP vedoucí k syntéze DNA. dTMP vzniká de novo z dUMP působením enzymu TS a z tymidinu za katalýzy tymidin kinázy (TK). Tymidylát kináza (TMPK) pak zprostředkovává reakci, při níž je dTMP fosforylován na dTDP a dTTP. Za normálních podmínek se do DNA začleňuje dTTP a pouze v malém množství také dUTP. Důvodem je, že většina vytvořeného dUTP je enzymem dUTPázou převáděna zpět na dUMP. Při inhibici TS se však nemůže tvořit dTMP a vzrůstá koncentrace dUTP. Při vysoké koncentraci dUTP je enzym dUTPáza přehlcen a nestačí katalyzovat přeměnu dUTP na dUMP. DNA polymeráza tak využívá pro syntézu DNA dUTP místo dTTP. (Berger et al., 2008; upraveno)
1.1.3.2.
MTX jako inhibitor metylace biomolekul
Kromě inhibice syntézy nukleotidů je léčba MTX spojena také se snižující se metylací některých biomolekul (Kishi et al., 2000; Winter-Vann et al., 2003; Hanafy et al., 2011). Pro metylaci je jako zdroj metylové skupiny využíván S-adenosyl metionin (SAM; Stover, 2010). 19
Při této reakci vzniká S-adenosyl homocystein (SAH) a z něj homocystein. Homocystein je následně remetylován na metionin, k čemuž je využita metylová skupina z 5-metylTHF. V buňkách, které jsou vystaveny působení MTX je však nedostatek 5-methylTHF z důvodu inhibice DHFR (Allegra et al., 1986). MTX je navíc také přímým inhibitorem enzymu metionin S-adenosyl transferáza (MAT), který katalyzuje přeměnu metioninu na SAM (Wang et Chiang, 2012). To vede ke snížené metylaci biomolekul. Metylace je velmi častou chemickou modifikací DNA. Obvykle se vyskytuje v oblasti CpG ostrůvků a bývá spojována s transkripčním umlčováním genů. Předpokládá se, že metylace je mechanismus využívaný v nádorových buňkách k potlačení exprese tumor supresorových genů (Esteller, 2002). MTX je schopný snížit stupeň metylace DNA u nádorových buněk, což bylo prokázáno experimenty in vitro i in vivo (Hanafy et al., 2011). Léčba pomocí MTX by tak mohla vést k reaktivaci epigeneticky umlčených genů a k navození normální genové exprese. Kromě DNA patří mezi molekuly, u nichž byla zjištěna hypometylace vyvolaná MTX, i protein Ras (Winter-Vann et al., 2003). Jedná se o protein lokalizovaný na vnitřní straně plazmatické membrány, který je součástí celé řady signálních drah řídících, např. růst, proliferaci a diferenciaci buněk (Klener et Klener, 2010). Aby byla zajištěna správná funkce Ras proteinu, je nezbytné jeho napojení na plazmatickou membránu a následná modifikace zahrnující i metylaci enzymem isoprenylcystein-karboxyl metyltransferázou (ICMT; WinterVann et al., 2003). U buněk ovlivněných MTX bylo prokázáno, že SAH inhibuje ICMT, což vede k hypometylaci, následně i k abnormální lokalizaci proteinu Ras (z plazmatické membrány se dostává do cytoplazmy) a k poškození Ras-signalizace. Překvapivé bylo zjištění, že buňky ICMT-/ICMT- jsou rezistentní k MTX. Tato rezistence byla plně překonána dodáním ICMT. Zdá se tedy, že ICMT je další klíčový cíl MTX.
1.1.3.3.
MTX jako inhibitor glyoxalázového systému
Další potenciální protinádorový účinek MTX spočívá v blokování glyoxalázového cyklu (obr. 4; Bartyik et al., 2004). Tento cyklus slouží k metabolismu metylglyoxalu, který vzniká, např. jako vedlejší produkt při glykolýze (Thornalley et Rabbani, 2011). Systém využívá dva enzymy, glyoxalázu 1 a glyoxalázu 2, a katalytické množství redukovaného glutationu (GSH). Konečným produktem je D-laktát. Fyziologická koncentrace metylglyoxalu uvnitř buňky je 1 – 2 µM a slouží především pro glykosylaci proteinů, nukleotidů a fosfolipidů (Thornalley et Rabbani, 2011). Bez účinného metabolismu metylglyoxalu však dochází k jeho nahromadění do koncentrace, která zastavuje 20
buněčný růst a navozuje apoptózu (Kang et al., 1996). Cytotoxická koncentrace je v rozmezí 200 µM – 1 mM (Thornalley et Rabbani, 2011). Buňky a tkáně s vysokou glykolytickou aktivitou, jako jsou buňky nádorové, musí mít proto vysokou účinnost detoxifikace metylglyoxalu. Pro přežití je kritická především aktivita glyoxalázy 1. Nadměrná exprese genu GLO1 kódujícího glyoxalázu 1 nebo zvýšená aktivita tohoto enzymu byla popsána jako marker mnohých nádorů (Thornalley et Rabbani, 2011). U některých typů solidních nádorů byla zjištěna také amplifikace genu GLO1 (Santarius et al., 2010). Nedávná studia ukázala, že MTX působí mimo jiné i jako inhibitor glyoxalázy 1 in vitro (Bartyik et al., 2004). To bylo nepřímo potvrzeno nálezem výrazného poklesu hladiny D-laktátu v krevní plazmě dětí s ALL léčených MTX. Tato aktivita MTX pravděpodobně přispívá k jeho protinádorovým, ale také k nežádoucím vedlejším účinkům, a to zejména u pacientů s metabolickými poruchami jako diabetes mellitus nebo deficit triózafosfát izomerázy, které jsou doprovázeny zvýšenou tvorbou metylglyoxalu.
Obr. 4 Schéma glyoxalázového cyklu. Glyoxalázový systém je hlavním mechanismem degradace metylglyoxalu. Prvním krokem je neenzymatická reverzibilní reakce metylglyoxalu s GSH, kdy vzniká hemithioacetal. Ten je přeměněn enzymem glyoxalázou 1 na S-D-laktoylglutation a nakonec probíhá hydrolýza katalyzovaná glyoxalázou 2 za vzniku GSH a D-laktátu. (Bartyik et al., 2004; upraveno)
Metylglyoxal GSH Hemithioacetal Glyoxaláza 1
S-D-laktoylglutation Glyoxaláza 2 D-laktát
21
1.1.3.4.
MTX jako inhibitor histondeacetyláz
Stejně jako metylace také acetylace a deacetylace histonů hraje významnou roli v regulaci genové exprese. Acetylace je spojována s transkripčně aktivním, deacetylace katalyzovaná histon deacetylázou (HDAC) s transkripčně inaktivním stavem chromatinu. Nadměrná exprese HDAC byla prokázána u některých nádorů (Song et al., 2005; Hayashi et al., 2010) a použití inhibitorů HDAC (HDACi) u těchto typů nádorů se proto jeví jako vhodná protinádorová strategie. Na základě počítačového modelování bylo předpovězeno možné působení MTX jako HDACi (Yang et al., 2010). To bylo potvrzeno také experimenty in vitro, kdy MTX inhiboval aktivitu HDAC a zvyšoval acetylaci histonu H3 u různých buněčných linií. Dále bylo zjištěno, že MTX inhibuje aktivitu HDAC a expresi metyltransferázy EZH2, což vede ke zvýšené produkci E-kadherinu a k následnému snížení schopnosti nádorových buněk metastázovat (Huang et al., 2011). Zvýšená acetylace působením MTX byla pozorována také u proteinu p53 (Huang et al., 2011). Acetylace Lys373/382 a fosforylace Ser15 a Ser392 indukovaná působením MTX vedla ke stabilizaci a zvýšení transkripční aktivity p53. Stabilizovaný p53 řídí expresi cílových genů, což nakonec vede ke snížení viability buněk a k apoptóze. Zatím však není jasný mechanismus zvýšené acetylace p53, protože aplikace HDACi k indukci acetylace nevedla.
1.1.4.
Rezistence buněk k MTX
Stejně jako u jiných chemoterapeutik se při aplikaci MTX setkáváme s několika problémy. Jedním z nich je omezení účinnosti MTX způsobené rezistencí nádorových buněk k MTX (Klener et Klener, 2010). Rezistence může být dvojího typu. První je přirozená rezistence, která se vyskytuje nezávisle na přítomnosti daného léčiva. Mnohem častější je však získaná rezistence, která se objevuje až po vystavení buněk vlivu chemoterapeutika. Do dnešní doby byla popsána celá řada molekulárních mechanismů MTX rezistence (tab. 1), které se velmi často vzájemně doplňují.
22
Tab. 1 Hlavní mechanismy rezistence nádorových buněk k MTX.
Nadměrná exprese genů pro DHFR či TS a mutace snižující afinitu enzymů k MTX
Zhoršený příjem MTX způsobený ztrátou funkce RFC1
Zvýšený výdej MTX v důsledku nadměrné tvorby ABC-transportních proteinů
Snížená schopnost zadržovat MTX uvnitř buňky z důvodu poruchy funkce FPGS nebo zvýšené aktivity FPGH (tj. snížený poměr FPGS/FPGH)
Zvýšený obsah folátových kofaktorů uvnitř buňky
Zvýšený metabolismus MTX na 7-hydroxymetotrexát (7-OH-MTX)
1.1.4.1.
Zhoršený transport MTX přes plazmatickou membránu
MTX je primárně transportován přes plazmatickou membránu prostřednictvím RFC1 (Westerhof et al., 1995) a poškození tohoto transportu je považováno za nejčastější příčinu vzniku rezistence k MTX (Assaraf, 2007). Snížená exprese genu RFC1 byla prokázána u pacientů s osteosarkomem majících špatnou odpověď na léčbu MTX (Guo et al., 1999; Sowers et al. 2011), u pacientů s karcinomem prsu (Yang et al., 2008b), ALL (Gorlick et al., 1997), ovariálním karcinomem (Siu et al., 2012) nebo některých NHL (Sen et al., 2008). Příčiny snížené exprese RFC1 jsou různé. Může se jednat o transkripční umlčení genu RFC1 způsobené ztrátou funkce příslušných transkripčních faktorů (Kaufman et al., 2006) či metylací promotoru (Yang et al., 2008b; Siu et al., 2012). Kaufman et al. (2006) popsal také ztrátu celé alely genu RFC1, pravděpodobně v důsledku genomových přestaveb. Dále mohou být přítomny i inaktivační mutace (Kaufman et al., 2006) či mutace vedoucí k poškození translokační aktivity RFC1 nebo ke změně afinity k (anti)folátům (Jansen et al., 1998).
1.1.4.2.
Zvýšený transport MTX z buňky
Kromě zhoršeného transportu do buněk může být za rezistenci k MTX zodpovědné také jeho urychlené vypuzování z buněk do vnějšího prostředí. Ten zajišťují proteiny z rodiny ABC (ATP-binding cassette) jako MRP1-5 (Bakos et al., 2000; Zeng et al., 2001; Chen et al., 2002; Wielinga et al., 2005) nebo BCRP (Chen et al., 2003). Některé z těchto proteinů jsou schopny přenášet i MTX se dvěma či třemi glutamátovými zbytky, např. MRP5 přenáší MTX-Glu2 a BCRP MTX-Glu2-3. MTX s větším počtem glutamátových zbytků však již není substrátem těchto transportérů (Chen et al., 2003; Wielinga et al., 2005). Navíc ABC transportéry mají k MTX velmi nízkou afinitu (Wielinga et al., 2005) a mnohé z těchto transportérů přenáší kromě MTX také kyselinu listovou a redukované foláty, čímž se snižuje 23
vnitrobuněčná koncentrace folátů, které soutěží s MTX o vazebná místa enzymů (Zeng et al., 2001; Chen et al., 2002; Wielinga et al., 2005). Tato fakta tak hovoří proti tomu, že by ABC transportéry měly klinický význam při vzniku rezistence k MTX. Výjimkou je použití vysokodávkového (HD) MTX, kdy je dosaženo vysoké hladiny MTX v plazmě. V takovém případě mohou mít ABC-transportní proteiny významnou úlohu při transportu MTX z buněk.
1.1.4.3.
Nadměrná exprese a mutace cílových enzymů
Další příčinou rezistence nádorových buněk k MTX je zvýšená exprese cílových enzymů folátového metabolismu. V takovém případě je v buňce exprimováno nadměrné množství DHFR nebo TS a je proto zapotřebí dosáhnout daleko větší vnitrobuněčná koncentrace MTX k vyvázání těchto enzymů (Assaraf, 2007). Zvýšená exprese genu DHFR byla identifikována jako příčina získané rezistence u pacientů s ALL, akutní myeloidní leukémií (AML; Rots et al., 2000) nebo pacientů s osteosarkomem, u nichž byl po terapii MTX zaznamenán nárůst exprese DHFR o více než 50 % (Guo et al., 1999). Dále bylo zvýšené množství enzymu DHFR nalezeno, např. u linie kolorektálního karcinomu (Morales et al., 2009). Tato získaná rezistence k MTX vzniká velmi často amplifikací genu DHFR, která může být přechodná nebo stabilní (Morales et al., 2009). Další možnou příčinou je změna regulace translace mRNA kódující DHFR. Bylo zjištěno, že protein DHFR je schopen vázat vlastní mRNA a tato interakce vede k translačnímu umlčení DHFR (Chu et al., 1993). Předpokládá se, že DHFR tímto způsobem reguluje vlastní expresi. Po navázání MTX do vazebného místa DHFR se však mění konformace tohoto enzymu, který tak již nemůže vázat svou mRNA. Výsledkem je zvýšená hladina volné mRNA kódující DHFR, která se překládá za vzniku funkčního enzymu. V nedávné studii byly identifikovány také mutace DHFR zabraňující tvorbě komplexu DHFR s vlastní mRNA (Skacel et al., 2005). U těchto mutantů nebyla hladina DHFR působením MTX ovlivněna. Stejný princip negativní autoregulace byl zjištěn také u enzymu TS (Chu et al., 1991). Další příčinou rezistence buněk k MTX mohou být mutace v DHFR, které snižují afinitu enzymu k MTX (Volpato et al., 2007; Fossati et al., 2008). Nicméně žádné takové mutace nebyly dosud pozorovány in vivo u pacientů léčených MTX (Assaraf, 2007). Byly však identifikovány polymorfismy v promotoru DHFR, které vedou ke zvýšené expresi genu a následně horší odpovědi pacientů na léčbu MTX (Dulucq et al., 2008).
24
1.1.4.4. Jako
příčina
Snížená polyglutamylace MTX rezistence
k MTX
byla
popsána
také
snížená
schopnost
jeho
polyglutamylace. Ta byla jako příčina získané rezistence prokázána u dětí s AML, u nichž byl pozorován nižší stupeň polyglutamylace a které vykazovaly horší odpověď na léčbu MTX ve srovnání s dětmi s ALL (Rots et al., 1999). Také u pacientů se sarkomy měkkých tkání byla rezistence k MTX spojena se sníženou polyglutamylací (Li et al., 1992). Proces polyglutamylace ovlivňují enzymy FPGS a FPGH, přičemž důležitý je poměr těchto dvou enzymů (Rots et al., 1999). Příčinou nízké aktivity FPGS jsou posttranskripční změny vedoucí ke snížené translaci mRNA kódující FPGS (Liani et al., 2003). Jednou z možností je špatný sestřih, který způsobuje vznik předčasného terminačního kodonu a tvorbu nefunkčního enzymu (Stark et al., 2009). Zvýšená aktivita FPGH byla zjištěna u sarkomových linií rezistentních k MTX (Li et al., 1992) i pacientů s AML (Rots et al., 1999). Na druhou stranu transfekce lidských buněčných linií cDNA pro FPGH, která vedla k 15 – 90násobnému navýšení aktivity FPGH, k navození rezistence k MTX nestačila (Cole et al., 2001). Někteří autoři proto navrhují, že nikoliv zvýšená aktivita tohoto enzymu, ale usnadněný transport MTX do lysozomů má hlavní podíl na vzniku rezistence k MTX (Marshall et al., 2005).
1.1.4.5.
Další příčiny rezistence buněk k MTX
Kromě již zmíněných mechanismů rezistence byly na modelu buněčných linií objeveny i další možné příčiny rezistence k MTX (Assaraf, 2007). Jedná se, např. o absenci funkční ICMT (Winter-Vann et al., 2003), zvýšený metabolismus MTX na 7-OH-MTX (Fotoohi et al., 2004) nebo nedostatečnou funkci Rb proteinu (pRB; Li et al., 1995). pRb je znám jako negativní regulátor buněčného cyklu, který váže transkripční faktory rodiny E2F. V buňkách s nefunkčním pRB, je zvýšená hladina volného E2F, který pak řídí transkripci cílových genů. Mezi ně patří i DHFR, RFC1 a TYMS (Sowers et al., 2003). Spojitost mezi nedostatkem funkčního Rb proteinu a rezistencí k MTX byla prokázána u lidských sarkomových buněčných linií (Li et al., 1995), ale zatím nejsou známa žádná klinická data.
1.1.5.
Nežádoucí účinky MTX a podpůrná léčba
Druhou významnou komplikací, se kterou se setkáváme při léčbě pomocí MTX, jsou jeho nežádoucí vedlejší účinky. MTX stejně jako jiná konvenční chemoterapeutika působí negativně i na rychle se dělící nenádorové buňky. Typickými vedlejšími projevy jsou proto myelosuprese, mukozitida či pneumotoxicita, tzv. metotrexátová plíce (Klener, 2002). Výskyt 25
a intenzita těchto nežádoucích účinků závisí na dávce MTX, na délce jeho expozice a celkovém stavu pacienta. Toxicita souvisí s častým výskytem rezistence k MTX, kdy se proto, aby byla rezistence překonána, podává pacientům HD-MTX (1 – 10 g/m2; Klener, 2002). Tyto vysoké dávky způsobí, že je MTX schopný pronikat do buněk i prostou difúzí či vyvazuje i abnormálně zvýšené množství cílových enzymů. Toxické projevy MTX nelze zrušit zvýšeným příjmem kyseliny listové, ale pouze pomocí redukovaných
folátů
(Klener,
2002).
V současnosti
je
jako
protektivum
v léčbě
onkologických pacientů nejpoužívanější leukovorin (LV). LV (kyselina foliniová, citrovorum faktor) je schopný potlačit inhibici DHFR vyvolanou MTX a chránit tak nenádorové, rychle se dělící buňky před účinkem MTX (Klener et Klener, 2010). Protože se jedná o redukovaný folát, využívá pro transport do buněk stejné cesty jako MTX. Zatímco do nádorových buněk s porušenými transportními mechanismy se LV nedostane, do netransformovaných buněk, se zachovanou transportní schopností, proniká i v nízkých koncentracích a ruší v nich účinek MTX. Tato terapie bývá označována jako zabezpečovací (angl. „leucovorin rescue“). LV je pacientům podáván s určitou časovou prodlevou po aplikaci MTX (Klener et Klener, 2010). Schémata jsou různá, liší se v závislosti na typu onemocnění, dávce MTX ale rozdíly jsou i na jednotlivých pracovištích. Např. na Klinice dětské onkologie FN Brno se uplatňuje schéma, podle něhož je LV podáván s odstupem 42 hodin od aplikace MTX. Následně je LV aplikován v určitých časových intervalech, dokud není plazmatická koncentrace MTX snížena pod 0,1 µM. Kromě používání HD-MTX s LV jsou možné i další přístupy. Robert Capizzi přišel s postupem léčby ALL, který spočívá v podávání nízkých, postupně se zvyšujících dávek MTX a následné aplikaci enzymu L-asparaginázy (Bertino, 2009). Princip tohoto léčebného postupu je založen na skutečnosti, že nádorové buňky, na rozdíl od nenádorových, nejsou schopny syntetizovat aminokyselinu L-asparagin a závisí tak na její mimobuněčné zásobě. Po přidání L-asparaginázy je tato zásoba volného asparaginu zničena, což vede k hladovění a smrti nádorových buněk. Nově ukončená randomizovaná studie u dětí s ALL ukazuje, že HD-MTX v kombinaci LV vykazuje lepší výsledky a nižší toxicitu než tzv. Capizzi MTX (Larsen et al., 2011). Na druhou stranu autoři review, které komentuje data z více než 40 studií, poukazují na fakt, že HD-MTX vede pouze k minimálnímu zlepšení v léčbě ALL (Clarke et al., 2003). Někteří autoři navíc přichází s názorem, že použití HD-MTX v kombinaci s vysokými, popř. předčasnými dávkami LV je spojeno s větším rizikem relapsu (Štěrba et al., 2006a; Skärby et 26
al., 2006). Nicméně i přes to, že klinický přínos vysokých dávek MTX je problematický, zůstává HD-MTX klíčovou součástí protokolů pro léčbu ALL a NHL s vysokým stupněm malignity, stejně jako solidních nádorů typu osteosarkomu či choriokarcinomu (Klener, 2002).
1.2. SOLIDNÍ NÁDORY DĚTSKÉHO VĚKU Nádorová onemocnění se u dětí vyskytují poměrně vzácně, přesto jsou však druhou nejčastější příčinou jejich úmrtí, ihned po úrazech (Siegel et al., 2012). Asi 30 % všech nádorů dětského věku tvoří nádory solidní (Kline et Sevier, 2003). Mezi nejčastější typy patří tumory mozku (meduloblastom, astrocytomy aj.), neuroblastom, rabdomyosarkom, Wilmsův tumor a osteosarkom. Solidní nádory dětí se liší od solidních nádorů dospělých, a to histogenetickým původem, biologickým chováním, odpovědí na léčbu či prognózou (Klener, 2002). Typickým znakem solidních nádorů dětského věku je mezodermální či neuroektodermální původ, rychlý růst a bohatá vaskularizace, ale také vysoká kurabilita. Při protinádorové terapii je však třeba brát ohled na to, že zdravé tkáně dětí jsou zranitelnější a léčba může mít trvalé následky. Experimentální
část
diplomové
práce
se
zabývá
meduloblastomovými
a
osteosarkomovými liniemi, proto je o těchto typech nádorů podrobně pojednáno v následujících kapitolách.
1.2.1.
Meduloblastom
Meduloblastom je embryonální neuroektodermální nádor mozečku (Zitterbart et al., 2010). Jedná se o nejčastější zhoubný nádor mozku u dětí, tvoří asi 15 – 20 % všech primárních nádorů CNS. Incidence je 0,2 – 0,6 onemocnění na 100 000 dětí. V České republice tak ročně onemocní meduloblastomem 10 – 12 dětí. Meduloblastom je nejčastěji diagnostikován mezi 1. a 9. rokem života (Massimino et al., 2011) o něco častěji u chlapců než u dívek (1,2 – 2,0 : 1). Kromě ionizujícího záření a některých vzácných genetických syndromů nebyly kauzální příčiny vzniku meduloblastomu ještě definovány. Byla však prokázána souvislost mezi rozvojem meduloblastomu a vyšší porodní váhou novorozence (Harder et al., 2008), virovým onemocněním matky během těhotenství (Fear et al., 2001), nedostatkem sociálního kontaktu novorozence v prvním roce života (Harding et al., 2009), maternálním příjmem N-nitroso 27
sloučenin v potravě v době těhotenství (Pogoda et al., 2009) a vrozenými kognitivními poruchami novorozenců (Partap et al., 2011). Klinické projevy vyplývají z postižení mozečkových funkcí, např. ataxie či porucha koordinace pohybů (Zitterbart et al., 2010). Typický je také syndrom intrakraniální hypertenze a s ním spojená bolest hlavy, zvracení a ztráta zraku. U kojenců a batolat se meduloblastom projevuje celkovým neprospíváním, poruchou psychomotorického vývoje, makrocefalií aj. Pacienti s meduloblastomem se v závislosti na věku, velikosti reziduálního tumoru a přítomnosti metastáz řadí do dvou prognosticky odlišných skupin (obr. 5; Massimino et al., 2011; Zitterbart et al., 2010). Pacient standardního rizika (SR) je dítě starší 3 let, bez metastáz, bez rezidua tumoru nebo s reziduem o velikosti menším než 1,5 cm2. Onkologičtí pacienti nesplňující tato kritéria spadají automaticky do druhé skupiny, tj. vysokého rizika (HR, high risk). Léčebný postup pro pacienty SR zahrnuje primární resekci tumoru, adjuvantní radioterapii a opakované cykly adjuvantní chemoterapie (Zitterbart et al., 2010). Pro HR meduloblastom je
předepisována
operace
tumoru
s adjuvantní
radioterapií,
současně
probíhající
radiosenzitivující chemoterapií a adjuvantní chemoterapií. Studie ukazují povzbudivé výsledky zejména při použití vysokodávkové chemoterapie zahrnující i MTX (Dhodapkar et al., 2002; Chi et al., 2004). Celkové pětileté přežití činí 70 – 80 % u SR a 30 – 70 % u HR meduloblastomu (Zitterbart et al., 2010). U dětí mladších 3 let je omezeno použití radioterapie z důvodu nezralosti CNS. Snahou je vyhnout se nebo oddálit radioterapii užíváním různých protokolů chemoterapie. Výsledky však nejsou uspokojivé. Celkové pětileté přežití je pouze 25 – 40 %.
28
Obr. 5 Řazení pacientů do prognostických skupin na základě rizikových faktorů a s tím související postup léčby (Massimino et al., 2011; upraveno).
Stáří ≥ 3 roky
Pacienti standardního rizika (SR) • bez metastáz
Stáří < 3 roky
Pacienti vysokého rizika (HR) Pacienti vysokého rizika (HR)
• metastázy
• reziduální tumor < 1,5
cm2
• reziduální tumor > 1,5
cm2
primární resekce
primární resekce + adjuvantní radioterapie + adjuvantní chemoterapie
+ adjuvantní radioterapie a konkomitantní chemoterapie
primární resekce + adjuvantní chemoterapie
+ adjuvantní chemoterapie
Další charakteristikou meduloblastomu je jeho vysoká agresivita a tendence metastazovat (Zitterbart et al., 2010). Nádorové buňky je obvykle možné nalézt v likvoru či v měkkých plenách mozkových a vzácně, zejména v pozdních stádiích onemocnění, i mimo CNS, nejčastěji v kostech, kostní dřeni, mízních uzlinách, játrech a plicích. Léčebné postupy u těchto pacientů jsou omezené a pětileté celkové přežití není větší než 10 %. Takoví pacienti jsou proto vhodní kandidáti pro nové léčebné přístupy jako metronomická chemoterapie nebo diferenciační léčba (Štěrba et al., 2006b; Choi et al., 2008).
1.2.2.
Osteosarkom
Osteosarkom je maligní nádor kostí mezenchymálního původu (Mottl et al., 2011). Jedná se o nejčastější zhoubný nádor skeletu, tvoří asi 35 % všech primárních nádorů kostí. Incidence osteosarkomu v populaci je 0,2 – 3 onemocnění na 100 000 dětí (Ritter et Bielack, 2010; Mottl et al., 2011). Objevuje se nejčastěji v druhé dekádě života, kdy je spojen s akcelerovaným růstem dospívajících jedinců. U adolescentů (15 až 19 let) je tedy incidence vyšší, cca. 0,8 – 11 / 100 000. V této věkové skupině se opět vyskytuje o něco častěji u chlapců než dívek (1,4 : 1). 29
Stejně jako u meduloblastomu, ani u osteosarkomu není jasná příčina vzniku (Ritter et Bielack, 2010; Mottl et al., 2011; Fletcher et al., 2013). Zvýšené riziko výskytu je u pacientů s některými nádorovými syndromy jako Li-Fraumeni, hereditární retinoblastom nebo Rothmund-Thomson syndrom. Dále se osteosarkom vyvíjí v důsledku působení ionizačního záření nebo jako sekundární malignita v místě ozařování. A v neposlední řadě se osteosarkom vyskytuje častěji u jedinců, kteří trpí určitou nemocí kostí, jakou je Pagetova choroba nebo mnohočetné hereditární osteochondromy (Fletcher et al., 2013). Osteosarkom se může vyvinout v jakékoliv kosti, ale nejčastěji postihuje metafýzy dlouhých kostí, tj. femur, humerus a tibie (Ritter et Bielack, 2010; Mottl et al., 2011). Klinické projevy osteosarkomu zahrnují bolest v místě nádoru a následný otok, popř. omezený pohyb kloubu (Ritter et Bielack, 2010; Mottl et al., 2011; Fletcher et al., 2013). Pouze výjimečně se jako první příznak objeví zlomenina kosti. Protože jsou tyto symptomy (tj. bolest a otok) u dětí a dospívajících poměrně snadno přehlédnutelné, asi 15 % pacientů má již v době diagnózy přítomné metastázy. Jedná se především o metastázy plicní, ale mohou se vyskytovat i v mozku, jiných částech skeletu či lymfatických uzlinách. Na základě toho se rozlišuje lokalizovaný a metastatický osteosarkom (Fletcher et al., 2013). Až do 70. letech byl osteosarkom léčen pouze chirurgicky (Carrle et Bielack, 2006). Prognóza však byla žalostná. Teprve se zavedením chemoterapie došlo k výraznému zlepšení. Současná léčba osteosarkomu spočívá v neoadjuvantní chemoterapii, následné resekci tumoru a adjuvantní chemoterapii (Carrle et Bielack, 2006; Ritter et Bielack, 2010; Mottl et al., 2011). Nejúčinnějšími cytostatiky v léčbě osteosarkomu jsou cisplatina, doxorubicin, ifosfamid a HD-MTX. Dlouhodobé přežití u lokalizovaného onemocnění je v současnosti 70 %, nicméně léčba pacientů s metastatickým onemocněním či relapsem nebyla dosud dostatečně vyřešena a dlouhodobé přežití dosahuje méně než 20 % postižených jedinců (Fletcher et al., 2013).
30
2. CÍLE PRÁCE Hlavním cílem této diplomové práce je analyzovat působení MTX, jakožto inhibitoru syntézy nukleových kyselin, in vitro na buněčné linie derivované ze solidních nádorů dětského věku. Byly vybrány meduloblastomové a osteosarkomové buněčné linie, u nichž byly stanoveny následující dílčí cíle:
provést hodnocení účinku MTX pozorováním morfologických změn buněk,
analyzovat změny v proliferační aktivitě a viabilitě ovlivněných buněčných linií pomocí MTT testu,
pomocí průtokové cytometrie detekovat změny v buněčném cyklu navozené působením MTX,
imunofluorescenčním barvením aktivované kaspázy-3 detekovat apoptózu vyvolanou MTX a kvantifikovat ji následnou průtokovou cytometrií,
pomocí reverzně-transkripční polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) analyzovat expresi genů spojených s rezistencí k MTX.
Dalším cílem je rovněž porovnat působení nízkodávkového (LD) MTX a HD-MTX v kombinaci s LV a bez něj.
31
3. MATERIÁL A METODY 3.1. BUNĚČNÉ KULTURY Pro práci byly použity jak sbírkové buněčné linie, tak i linie derivované naší laboratoří z nádorové tkáně pacientů Kliniky dětské onkologie FN Brno (dále jen pacientské linie).
3.1.1.
Buněčné linie
Meduloblastomové buněčné linie: Buněčná linie Daoy (ATCC HTB-186TM) je sbírková linie derivovaná v roce 1985 z meduloblastomu čtyřletého chlapce. Jedná se o adherentní linii, buňky jsou hypertetraploidní s polygonální morfologií. Pacient byl léčen dibutyryl-cAMP. Buněčná linie MBL-02 je pacientská linie derivovaná v roce 2006 z nádorové tkáně sedmileté dívky, u níž byl diagnostikován lokalizovaný desmoplastický meduloblastom. Jedná se o adherentní buňky.
Osteosarkomové buněčné linie: Buněčná linie Saos-2 (ATCC HTB-85TM) je sbírková adherentní linie derivovaná z osteosarkomu jedenáctileté dívky. Buňky jsou hypotriploidní a mají epiteliální charakter. Pacientka byla léčena MTX, adriamycinem, vinkristinem, cytoxanem a aramycinem-C. Buněčná linie OSA-08 je pacientská adherentní linie derivovaná v roce 2009 z nádorové tkáně jedenáctiletého chlapce s diagnózou osteoblastického osteosarkomu.
3.1.2.
Kultivační podmínky
Linie Daoy byla kultivována v médiu DMEM (Dulbecco´s modified Eagles medium) s nízkým obsahem glukózy (1 g/l) s přídavkem 10 % fetálního telecího séra (FCS), 1 % neesenciálních aminokyselin (NEAA), 2 mM glutaminu, 100 μg/ml streptomycinu a 100 IU/ml penicilinu (vše PAA Laboratories). Linie Saos-2 byla také kultivována v médiu DMEM 32
obohaceném o 10 % FCS, 2 mM glutaminu, 100 μg/ml streptomycinu a 100 IU/ml penicilinu. Ke kultivaci pacientských linií MBL-02 a OSA-08 bylo použito médium DMEM s přídavkem 20 % FCS, 2
mM
glutaminu,
100
μg/ml
streptomycinu a 100 IU/ml
penicilinu. Kultivace všech linií probíhala za standardních podmínek při 37 °C v atmosféře s 5% obsahem CO2. Linie byly pasážovány 1 – 2krát týdně při pokrytí 70 až 80 % plochy kultivační nádoby.
3.2. USPOŘÁDÁNÍ EXPERIMENTŮ Zásobní roztok MTX (Sigma-Aldrich) o koncentraci 20 mM byl připraven rozpuštěním v 1M NaOH (Sigma-Aldrich). Tento roztok byl uchováván při -20 °C bez přístupu světla. Buňky všech výše zmíněných buněčných linií byly ovlivněny 0,1µM, 1µM, 10µM a 40µM MTX 24 hodin po nasazení. Pro dosažení pracovních koncentrací byl zásobní roztok MTX ředěn v příslušném kompletním kultivačním médiu až krátce před použitím. Kontrolní varianta zůstala neovlivněna, přičemž u ní bylo vyměněno médium za čerstvé ve stejnou dobu, jako byl přidán k ostatním variantám MTX. Následně již probíhala kultivace u všech variant stejně – 1, 3 nebo 6 dní. Po této době bylo analyzováno působení MTX na buněčné linie (obr. 6).
Obr. 6 Znázornění časového uspořádání experimentů. Černá pole značí dny, ve kterých se pracovalo s buňkami, bílá pole dny, ve kterých se s buňkami nemanipulovalo. Mezi jednotlivými poli je časový úsek 24 hodin. Pod označení „analýza buněk“ spadá sledování morfologie buněk, vyhodnocení MTT testu, fixace buněk pro analýzu buněčného cyklu na průtokovém cytometru nebo fixace buněk pro imunodetekci apoptózy.
Nasazení buněk
Den 0: Přidání MTX
Den 1: Analýza buněk
Den 3: Analýza buněk
Den 6: Analýza buněk
Pro porovnání účinků LD-MTX a HD-MTX v kombinaci s LV (Sigma-Aldrich) byly buňky nasazeny do standardního kultivačního média. Po 24 hodinách byly buňky ovlivněny 33
výše definovanými koncentracemi MTX, který byl pro tyto účely ředěn v kompletním médiu DMEM bez obsahu folátu (Sigma-Aldrich). Také u kontrolní varianty bylo médium vyměněno za bezfolátové médium. Po 42 hodinách od přidání MTX, což je doba používaná na Klinice dětské onkologie FN Brno, byl k buňkám přidán LV v koncentracích 10 nM a 100 nM. Zásobní roztok LV byl připraven v den aplikace rozpuštěním v ultračisté vodě a ředěn na pracovní koncentrace v příslušném bezfolátovém médiu. Kultivace probíhala 3 a 6 dní od ovlivnění buněk MTX (obr. 7).
Obr. 7 Znázornění časového uspořádání experimentu s LV v bezfolátovém médiu. Černá pole značí dny, ve kterých se pracovalo s buňkami, bílá pole dny, ve kterých se s buňkami nemanipulovalo. Mezi jednotlivými poli je časový úsek 24 hodin. Výjimkou je 4. pole, které je od pole 2 vzdáleno z časového hlediska 42 hodin. Označení „analýza buněk“ značí vyhodnocení MTT testu. 42 hodin
Nasazení buněk
Den 0: Přidání MTX
Den 3: Analýza buněk
Přidání LV
Den 6: Analýza buněk
3.3. HODNOCENÍ BUNĚČNÉ MORFOLOGIE Analýza morfologických změn se prováděla u buněk vysazených na Petriho misky (Ø 6 cm; TPP) v objemu 4 ml o koncentraci 3x104 buněk/ml. Buňky ovlivněné MTX výše definovaným způsobem byly sledovány v průběhu dne 1, 3 a 6 invertovaným světelným mikroskopem Olympus CKX41. Fotografie byly pořizovány fotoaparátem Olympus SP-350 (vše Olympus).
3.4. MTT TEST MTT test je metoda sloužící k analýze proliferace a viability buněk, např. po ovlivnění určitým chemickým či jiným činidlem. Tento test je založen na přeměně žluté tetrazoliové
34
soli MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) na modrý krystalický formazan v závislosti na aktivitě mitochondriálních dehydrogenáz. Buňky všech buněčných linií byly nasazeny do 96-ti jamkových mikrotitračních destiček (TPP) v objemu 200 µl na jamku o koncentraci 1x104 buněk/ml. Po 24 hodinách byl k buňkám přidán MTX. Po 1, 3 a 6 dnech působení MTX, resp. 3 a 6 dnech u experimentu s LV, bylo kultivační médium vyměněno za 200 µl čerstvého média s obsahem MTT (SigmaAldrich) o koncentraci 455 µg/ml. Buňky byly ponechány 3 hodiny v termostatu při 37 °C. Poté byl vzniklý formazan rozpuštěn v 200 µl dimetylsulfoxidu (DMSO; Sigma-Aldrich). Vyhodnocení se provádělo spektrofotometricky na Sunrise Absorbance Readeru (Tecan) v programu Kim32 při vlnové délce 570 nm.
3.5. PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE PRO ANALÝZU BUNĚČNÉHO CYKLU Buňky linie Daoy a Saos-2 byly vysazeny na Petriho misky (Ø 6 cm) v objemu 4 ml o koncentraci 3x104 buněk/ml. Po 24 hodinách byl k buňkám přidán MTX a následná kultivace probíhala 1, 3 a 6 dní. V uvedených intervalech byla posbírána média se suspenzními buňkami a adherentní část populace byla trypsinizována 1 ml 100% trypsinu (PAA Laboratories) a následným ponecháním 5 minut v termostatu při 37 °C. Z buněk plovoucích i adherovaných byla vytvořena buněčná suspenze, která byla promyta v PBS a fixována 70% etanolem (Analytika). Vzorky byly krátce vortexovány a následně skladovány při -20 °C (30 minut a více). Pro značení DNA propidium jodidem (PI) byl využit Vindelův roztok (tab. 2) uchovávaný při 4 °C bez přístupu světla.
Tab. 2 Složení Vindelova roztoku (Robinson et al., 1993). Všechny složky od Sigma-Aldrich. 1 M TRIS (pH 8)
1 ml
RNáza
7 mg
NaCl
60 mg
PI
5 mg
Doplněno destilovanou vodou do 100 ml.
35
Fixované buňky byly promyty PBS a barveny Vindelovým roztokem v objemu 0,5 ml, 30 minut při 37 °C. Analýza buněčného cyklu byla prováděna na průtokovém cytometru BD FACSVerse™ v programu BD FACSuite (vše BD Biosciences) a histogramy byly vytvořeny na základě 10 000 změřených buněk.
3.6. IMUNODETEKCE A KVANTIFIKACE APOPTÓZY Buňky linie Daoy a Saos-2 byly vysazeny na Petriho misky (Ø 10 cm) v množství 10 ml o koncentraci 1x105 buněk/ml pro analýzu apoptózy po 1 dni, resp. 5x104 pro analýzu po 3 dnech působení MTX. Ovlivnění MTX probíhalo výše definovaným způsobem (obr. 6). Po 1 a 3 dnech od přidání MTX byly plovoucí i adherované buňky sklizeny do buněčné suspenze (postup shodný jako u analýzy buněčného cyklu). Následně byly buňky 2krát promyty v PBS a poté fixovány 30 minut v 1 ml 3% paraformaldehydu (Sigma-Aldrich) připraveném rozpuštěním v PBS. Poté byly buňky permeabilizovány 1 minutu v 0,2% tritonu TX-100 (Sigma-Aldrich) ředěném v PBS, 2krát promyty v PBS a blokovány po dobu 10 minut v 0,5 ml bovinního sérového albuminu (BSA; Sigma-Aldrich) o koncentraci 2 % vzniklém rozpuštěním v PBS. Po blokaci následovala inkubace s primární protilátkou proti aktivované kaspáze-3 (tab. 3). Inkubace buněk probíhala 60 minut při 37 °C ve 100 µl primární protilátky. Poté byly buňky 2krát promyty v PBS a inkubovány 45 minut ve 100 µl sekundární protilátky (tab. 3) při 37 °C. Nakonec byly buňky opět 2krát promyty v PBS. Kvantifikace apoptózy probíhala na průtokovém cytometru BD FACSVerse™. Analýza histogramu každého vzorku byla prováděna na 10 000 změřených buňkách v programu BD FACSuite™. Pro ověření metody detekce aktivní kaspázy byly stejným způsobem barveny také adherentní buňky rostoucí na sklíčcích. Po inkubaci se sekundární protilátkou byla navíc jádra buněk značena sondou specificky se vázající na DNA (tab. 3). Hodnocení se provádělo na fluorescenčním mikroskopu Olympus BX51 vybaveném kamerou Olympus DP72 a mikrofotografie byly upraveny v programu Cell^P (vše Olympus).
36
Tab. 3 Seznam protilátek využitých pro analýzu apoptózy. Protilátka
Typ
Ředění
Výrobce
Anti Cleaved Casp-3 (Asp175) mAb
primární
1 : 250
Cell Signaling Technology
sekundární
1 : 300
Life Technologies
1 : 1000
Life Technologies
Alexa Fluor ® 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Hoechst 33342
barvení DNA
3.7. RT-PCR Pro analýzu exprese genů spojených s rezistencí k MTX byly buňky všech buněčných linií ovlivněny MTX o koncentraci 0,1 µM. Po 3 a 6 dnech působení MTX byly buňky převedeny do buněčné suspenze, z níž byla izolována RNA. Kromě toho byly buňky linie Daoy a Saos-2 dlouhodobě kultivovány v nízké koncentraci MTX (0,1 µM) s cílem analyzovat možné navození rezistence těchto buněk k MTX. Buňky byly vysazeny do kultivačních lahví (75 cm2) a po 24 hodinách bylo kultivační médium zaměněno za 0,1µM MTX. Následně byl vždy po 7 dnech roztok MTX vyměněn. Pokud buňky během kultivace porostly více jak 80 % plochy kultivační nádoby, byly pasážovány. Po 28 dnech byla z buněk izolována RNA. Celková RNA byla z buněk izolována pomocí kitu GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich). Její koncentrace a čistota byla zjištěna spektrofotometricky na přístroji NanoPhotometr IMPLEN (Implen). Dále se pracovalo pouze s nekontaminovanou RNA (A260/A280 = 1,8 – 2,1). RNA se uchovávala při -70 °C. Následoval přepis izolované RNA do cDNA, kdy byla celková RNA smíchána s PCR vodou, 20 µl 5x koncentrovaného M-MLV pufru, 10 µl M-MLV reverzní transkriptázy (25 U/µl), 10 µl 100nM DTT, 5 µl 10mM dNTP (vše Top-Bio) a 2,5 µl oligo-dT18 o koncentraci 0,4 µg/µl (Qiagen). Použitá koncentrace celkové RNA byla u všech vzorků konstantní, tj. 25 ng/µl. Reakční složky byly promíchány a inkubovány 60 minut při 37 °C. Po inkubaci byly vzorky cDNA uchovávány při -20 °C. PCR byla prováděna v celkovém objemu 25 µl. 5 µl cDNA bylo smícháno s PCR vodou, 12,5 µl PPP master mixu, 0,5 µl PCR enhanceru (vše Top-Bio) a 0,5 µl příslušných primerů o 37
koncentraci 25 µM. Sekvence primerů pro geny spojené s MTX rezistencí byly převzaty z práce Rots et al. (2000) a jsou společně se sekvencí primerů pro provozní (housekeeping) gen HSP90AB1 a s velikostí PCR produktů uvedeny v tabulce 4. Průběh PCR u jednotlivých genů je uveden v tabulce 5.
Tab. 4 Sekvence primerů a velikosti RT-PCR produktů. Gen RFC1
DHFR
TYMS
FPGS
FPGH
HSP90AB1
Sekvence primerů (5´ → 3´)
Velikost produktu
GCG GGC TTC GTG AAG ATC
330 bp
CTG GAA CTG CTT GCG GAC CAG AAC ATG GGC ATC GGC AAG AAC G AAA CAG AAC TGC CAC CAA CTA TCC A CGG GAG ACA TGG GCC TCG GT GCA TCC AGC CCA ACC CCT AA CAC TGG GAC GAA GGG GAA
328 bp
353 bp
322 bp
GTC ATA AGC CCC GCC AAT AAA GTA CTT GGA GTC TGC AGG TGC TGC AAT TGA CCT CCA GTG AAG TTC A CGC ATG AAG GAG ACA CAG AA TCC CAT CAA ATT CCT TGA GC
327 bp
169 bp
Tab. 5 Průběh PCR. HSP90AB1
RFC1, FPGS
DHFR, TYMS, FPGH
Úvodní denaturace
94 °C / 4 min
94 °C / 7 min
94 °C / 7 min
Denaturace
94 °C / 30 s
94 °C / 1 min
94 °C / 1 min
Hybridizace
60 °C / 30 s
58 °C / 1 min
58 °C / 1 min
Elongace
72 °C / 1 min
72 °C / 1 min
72 °C / 1 min
Závěrečná syntéza
72 °C / 5 min
72 °C / 5 min
72 °C / 5 min
4 °C / 30 min
4 °C / 30 min
4 °C / 30 min
30
30
25
Celkový počet cyklů
Produkty RT-PCR byly separovány gelovou elektroforézou na 2% agarózovém gelu (Serva) obsahujícím 12 µl Midori Green (NIPPON Genetics EUROPE GmbH). Elektroforéza 38
probíhala 45 minut při 100 V. Gely byly analyzovány dokumentační přístrojem FluorChem™ HD2 (Proteinsimple) a výsledky byly graficky zpracovány v programu ImageJ (U. S. National Institutes of Health, http://imagej.nih.gov/ij/).
3.8. STATISTIKA Statistická analýza byla prováděna v programu Statistika 10 MR1 (StatSoft). Pro zjištění statistické významnosti v případě MTT testu cytotoxicity byl použit Mann-Whitney test. Data byla spojena ze 3 nezávislých experimentů u sbírkových linií a 2 nezávislých experimetů u pacientských linií a byla vyjádřena jako průměr ± SD.
39
6. ZÁVĚR ÚČINKY METOTREXÁTU NA LINIE DERIVOVANÉ ZE SOLIDNÍCH NÁDORŮ DĚTSKÉHO VĚKU Nádorová onemocnění jsou druhou nejčastější příčinou úmrtí dětí a asi 30 % všech nádorů dětského věku tvoří nádory solidní. Metotrexát (MTX), analog kyseliny listové, se používá v léčbě různých typů solidních nádorů. Z důvodu časté rezistence musí být pacientům podáván vysokodávkový (HD) MTX, který bývá spojen se závažnou toxicitou. Nedílnou součástí léčebných protokolů je proto protektivum leukovorin (LV). Cílem předkládané diplomové práce bylo analyzovat působení MTX na vybrané buněčné linie derivované z dětských solidních nádorů (meduloblastomová linie Daoy a MBL-02 a osteosarkomová linie Saos-2 a OSA-08). Snahou bylo analyzovat cytostatické, resp. cytotoxické působení MTX, srovnat působení nízkodávkového (LD) MTX a HD-MTX v kombinaci s LV a porovnat expresi vybraných genů spojených s rezistencí k MTX před a po působení MTX. Použit byl MTX o koncentraci 0,1 – 40 µM, což je rozmezí vyskytující se v krevní plazmě onkologických pacientů léčených MTX. Vliv MTX na buněčnou proliferaci, buněčný cyklus a indukci apoptózy byl zkoumán na liniích Daoy a Saos-2. Bylo zjištěno, že MTX působí výrazně cytotoxicky na obě buněčné linie, zastavuje jejich buněčný cyklus (Daoy v G1 fázi, Saos-2 v S fázi) a indukuje apoptózu doprovázenou aktivací kaspázy-3. Přitom nebyl pozorován rozdíl v účinku 1 – 40µM MTX. Vliv LV na účinek MTX byl sledován u všech vybraných buněčných linií. U linie Daoy a Saos-2 snižoval LV cytotoxický efekt pouze u nejnižší koncentrace MTX (0,1 µM). U linie MBL-02 a OSA-08 nebyl pozorován žádný vliv MTX ani LV, pravděpodobně v důsledku jejich nízkého proliferačního indexu. Dále bylo zjištěno, že MTX ovlivňuje expresi genů spojených s rezistencí k MTX. Tyto změny byly většinou liniově specifické. Pozorováno bylo snížení exprese genu RFC1 kódující přenašeč pro MTX u linie Saos-2 a u většiny linií byla krátkodobě zvýšená exprese genů pro enzymy folátového metabolismu, které jsou cílem MTX. Ačkoliv na pacientských liniích MBL-02 a OSA-08 nebyly pozorovány žádné účinky MTX, výsledky na liniích Daoy a Saos-2 jsou pro klinickou praxi povzbudivé. Významné je především zjištění, že MTX v řádově nižších koncentracích má in vitro stejný účinek, který není ovlivněn působením LV. To by mohlo mít pozitivní dopad na léčbu dětských onkologických pacientů. 75
7. SUMMARY EFFECTS OF METHOTREXATE ON CELL LINES DERIVED FROM SOLID TUMORS OF THE CHILDREN’S AGE
Cancer is the second most common cause of death among children and solid tumors make up about 30 % of all paediatric cancers. Methotrexate (MTX), a folic acid analogue, is used in the treatment of various solid tumours. As high dose (HD) MTX is administered to overcome frequent cellular drug resistance, leucovorin (LV) as an antidote is a critical component in treatment protocols. The aim of this study was to analyse effects of MTX on selected cell lines derived from paediatric solid tumors (medulloblastoma cell lines Daoy and MBL-02 and osteosarcoma cell lines Saos-2 and OSA-08). The goal was to analyse cytostatic or cytotoxic effect of MTX, to compare low dose (LD) MTX with HD-MTX in a combination with LV and to analyse the expression of genes associated with MTX resistance. 0,1 – 40µM MTX was used, representing typical concentrations in plasma after MTX treatment in cancer patients. The effect of MTX on the cell proliferation, cell cycle and induction of apoptosis was examined in cell lines Daoy and Saos-2. It was observed that MTX had a significant cytotoxic effect on both cell lines. Moreover, MTX arrested the cell cycle (Daoy in G1 phase, Saos-2 in S phase) and induced the caspase-3 mediated apoptosis. There was no difference in the range of 1 – 40µM MTX. The influence of LV on MTX action was studied in all cell lines and only the effect of the lowest concentration of MTX (0,1 µM) was suppressed by LV in Daoy and Saos-2. No effect of either MTX or LV was observed in MBL-02 and OSA-08, probably because of their low proliferation index. Finally, it was found out that MTX affected the expression of genes associated with MTX resistance. These changes were mostly cell line specific. It is worth mentioning that the expression of RFC1, coding MTX transporter, was decreased in Saos-2. On the contrary the expression of genes coding target folate enzymes of MTX was transiently increased in almost all cell lines following MTX treatment. Although there was no effect of MTX on MBL-02 and OSA-08, results observed on Daoy and Saos-2 cell lines might be clinically promising as several orders lower concentration of MTX had in vitro the same effect and was not influenced by LV. That could have a positive impact on the treatment of children’s cancer. 76
8. LITERATURA Allegra C. J., Drake J. C., Jolivet J., Chabner B. A. (1985b) Inhibition of phosphoribosylaminoimidazolecarboxamid
transformylase
by
methotrexate
and
dihydrofolic acid polyglutamates. Proc Natl Acad Sci U S A. 82(15): 4881–4885. Allegra C. J., Fine R. L., Drake J. C., Chabner B. A. (1986) The effect of methotrexate on intracellular folate pools in human MCF-7 breast cancer cell: Evidence for direct inhibition of purine synthesis. J Biol Chem. 261(14): 6478–6485. Allegra C. J., Hoang K., Yeh G. C., Drake J. C., Baram J. (1987) Evidence of direct inhibition of de novo purine synthesis in human MCF-7 breast cells as a principal mode of metabolic inhibition by methotrexate. J Biol Chem. 262(28): 13520–13526. Allegra C. J., Chabner B. A., Drake J. C., Lutz R., Rodbard D., Jolivet J. (1985a) Enhanced inhibition of thymidylate synthase by methotrexate polyglutamates. J Biol Chem. 260(17): 9720–9726. Assaraf Y. G. (2007) Molecular basis of antifolate resistance. Cancer Metastasis Rev. 26(1): 153–181. Assaraf Y. G., Ifergan I., Kadry W. N., Pinter R. Y. (2006) Computer modelling of antifolate inhibition of folate metabolism using hybrid functional petri nets. J Theor Biol. 240(4): 637–47. Bakos E., Evers R., Sinkó E., Váradi A., Borst P., Sarkadi B. (2000) Interactions of the human multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2 with organic anions. Mol Pharmacol. 57(4): 760–768. Baram J., Allegra C. J., Fine R. L., Chabner B. A. (1986) Effect of methotrexate on intracellular folate pools in purified myeloid precursor cells from normal humane bone marrow. J Clin Invest. 79(3): 692–697. Bartyik K., Turi S., Orosz F., Karg E. (2004) Methotrexate inhibits the glyoxalase systém in vivo in children with acute lymphoid leukaemia. Eur J Cancer. 40(15): 2287–2292. Belloc F., Belaud-Rotureau M. A., Lavignolle V., Bascans E., Braz-Pereira E., Durrieu F., Lacombe F. (2000) Flow cytometry detection of caspase 3 activation in preapoptotic leukemic cells. Cytometry. 40(2): 151–160. Berger S. H., Pittman D. L., Wyatt M. D. (2008) Uracil in DNA: consequences for carcinogenesis and chemotherapy. Biochem Pharmacol. 76(6): 697–706. Bertino J. R. (2009) Cancer research: from folate antagonism to molecular targets. Best Pract Res Clin Haematol. 22(4): 577–582. 77
Bunni M., Doig M. T., Donato H., Kesavan V., Priest D. G. (1988) Role of methylenetetrahydrofolate depletion in methotrexate-mediated intracellular thymidylate synthesis inhibition in cultured L1210 cells. Cancer Res. 48(12): 3398–3404. Canellos G. P., DeVita V. T., Gold G. L., Chabner B. A., Schein P. S., Young R. C. (1974) Cyclical combination chemotherapy in the treatment of advanced breast carcinoma. Br Med J. 1(5901): 218–220. Carrle D., Bielack S. S. (2006) Current strategies of chemotherapy in osteosarcoma. Int Orthop. 30(6): 445–451. Clarke M., Gaynon P., Hann I., Harrison G., Masera G., Peto R., Richards S. (2003) CNS-directed therapy for childhood acute lymphoblastic leukemia: Childhood ALL Collaborative Group overview of 43 randomized trials. J Clin Oncol. 21(9): 1798–1809. Cole P. D., Kamen B. A., Gorlick R., Banerjee D., Smith A. K., Magill E., Bertino J. R. (2001) Effects of overexpression of gamma-glutamyl hydrolase on methotrexate metabolism and resistance. Cancer Res. 61(11): 4599–4604. Curtin N. J., Harris A. L., Aherne G. W. (1991) Mechanism of cell death following thymidylate synthase inhibition: 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate accumulation, DNA damage, and growth inhibition following exposure to CB3717 and dipyridamole. Cancer Res. 51(9): 2346–2352. Dhodapkar K., Dunkel I. J., Gardner S., Sapp M., Thoron L., Finlay J. (2002) Preliminary results of dose intensive pre-irradiation chemotherapy in patients older than 10 years of age with high risk medulloblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumors. Med Pediatr Oncol. 38(1): 47–48. Dulucq S., St-Onge G., Gagné V., Ansari M., Sinnett D., Labuda D., Moghrabi A., Krajinovic M. (2008) DNA variants in the dihydrofolate reductase gene and outcome in childhood ALL. Blood. 111(7): 3692–3700. Duran N., Allahverdyev A. M., Cetiner S. (2001) Flow cytometric analysis of the effects of methotrexate and vepesid on the HEp-2 cell cycle. Turk J Med Sci. 31:187–192. Esteller M. (2002) CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene. 21(35): 5427–5440. Farber S. (1949) Some observations on the effect of folic acid antagonists on acute leukemia and other forms of incurable cancer. Blood. 4(2): 160-167. Farber S., Diamond L. K., Mercer R. D., Sylvester R. F., Wolff J. A. (1948) Temporary remissions in acute leukemia in children produced by folic acid antagonist…aminopterin. N Engl J Med. 238(23): 787–793. 78
Fear N. T., Roman E., Ansell P., Bull D. (2001) Malignant neoplasms of the brain during childhood: the role of prenatal and neonatal factors (United Kingdom). Cancer Causes Control. 12(5): 443–449. Fletcher C. D. M., Bridge J. A., Hogendoorn P. C. W., Mertens F. (2013) WHO classification of tumours of soft tissue and bone. 4. vydání. Lyon: International Agency for Research on Cancer (IARC). Fossati E., Volpato J. P., Poulin L., Guerrero V., Dugas D. A., Pelletier J. N. (2008) 2-tier bacterial and in vitro selection of active and methotrexate-resistant variants of human dihydrofolate reductase. J Biomol Screen. 13(6): 504–514. Fotoohi K., Jansen G., Assaraf Y. G., Rothem L., Stark M., Kathmann I., Gregorczyk J., Peters G. J., Albertioni F. (2004) Disparate mechanisms of antifolate resistance provoked by methotrexate and its metabolite 7-hydroxymethotrexate in leukemia cells: implications for efficacy of methotrexate therapy. Blood. 104(13): 4194–4201. Frei E., Jaffe N., Tattersall M. H. N. Pitman, S. Parker L. (1975) New approaches to cancer chemotherapy with methotrexate. N Engl J Med. 292(16): 846–851. Giono L. E., Manfredi J. J. (2006) The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle checkpoints. J Cell Physiol. 209(1): 13–20. Gorlick R., Goker E., Trippett T., Steinherz P., Elisseyeff Y., Mazumdar M., Flintoff W. F., Bertino J. R. (1997) Defective transport is a common mechanism of acquired methotrexate resistance in acute lymphocytic leukemia and is associated with decreased reduced folate carrier expression. Blood. 89(3): 1013–1018. Guo W., Healey J. H., Meyers P. A., Ladanyi M., Huvos A. G., Bertino J. R., Gorlick R. (1999) Mechanisms of methotrexate resistance in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 5(3): 621–627. Hanafy S., Salem T., El-Aziz A., EL-Fiky B., Shokair M. (2011) Influence of anticancer drugs on DNA methylation in liver of female mice. Am J Mol Biol. 1(2): 62–69. doi: 10.4236/ajmb.2011.12008. Harder T., Plagemann A., Harder A. (2008) Birth weight and subsequent risk of childhood primary brain tumors: A Meta-analysis. Am J Epidemiol. 168(4): 366–373. Harding N. J., Birch J. M., Hepworth S. J., McKinney P. A. (2009) Infectious exposure in the first year of life and risk of central nervous system tumors in children: analysis of day care, social contact, and overcrowding. Cancer Causes Control. 20(2): 129–136. Hattangadi D. K., DeMasters G. A., Walker T. D., Jones K. R., Di X., Newsham I. F., Gewirtz D. A. (2004) Influence of p53 and caspase 3 activity on cell death and senescence 79
in response to methotrexate in the breast tumor cell. Biochem Pharmacol. 68(9): 1699– 1708. Hayashi A., Horiuchi A., Kikuchi N., Hayashi T., Fuseya C., Suzuki A., Konishi I., Shiozawa T. (2010) Type-specific roles of histone deacetylase (HDAC) overexpression in ovarian carcinoma: HDAC1 enhances cell proliferation and HDAC3 stimulates cell migration with downregulation of E-cadherin. Int J Cancer. 127(6): 1332–1346. Huang W. Y., Yang P. M., Chang Y. F., Marquez V. E., Chen, C. C. (2011) Methotrexate induces apoptosis through p53/p21-dependent pathway and increases E-cadherin expression through downregulation of HDAC/EZH2. Biochem Pharmacol. 81(4): 510– 517. Chen Z. S., Lee K., Walther S., Raftogianis R. B., Kuwano M., Zeng H., Kruh G. D. (2002) Analysis of methotrexate and folate transport by multidrug resistance protein 4 (ABCC4): MRP4 is a component of the methotrexate efflux system. Cancer Res. 62(11): 3144–3150. Chen Z. S., Robey R. W., Belinsky M. G., Shchaveleva I., Ren X. Q., Sugimoto Y., Ross D. D., Bates S. E., Kruh G. D. (2003) Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 63(14): 4048–4054. Chi S. N., Gardner S. L., Levy A. S., Knopp E. A., Miller D. C., Wisoff J. H., Weiner H. L., Finlay J. L. (2004) Feasibility and response to induction chemotherapy intensified with high-dose methotrexate for young children with newly diagnosed high-risk disseminated medulloblastoma. J Clin Oncol. 22(24): 4881–4887. Choi L. M., Rood B., Kamani N., La Fond D., Packer R. J., Santi M. R., MacDonald T. J. (2008) Feasibility of metronomic maintenance chemotherapy following high-dose chemotherapy for malignant central nervous system tumors. Pediatr Blood Cancer. 50(5): 970–975. Chu E., Drake J. C., Boarman D., Baram J., Allegra C. J. (1990) Mechanism of thymidylate synthase inhibition by methotrexate in human neoplastic cell lines and normal human myeloid progenitor cells. J Biol Chem. 265(15): 8470–8478. Chu E., Koeller D. M., Casey J. L., Drake J. C., Chabner B. A., Elwood P. C., Zinn S., Allegra C. J. (1991) Autoregulation of human thymidylate synthase messenger RNA translation by thymidylate synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 88(20): 8977-8981.
80
Chu E., Takimoto C. H., Voeller D., Grem J. L., Allegra C. J. (1993) Specific binding of human dihydrofolate reductase protein to dihydrofolate reductase messenger RNA in vitro. Biochemistry. 32(18): 4756–4760. Jansen G., Mauritz R., Drori S., Sprecher H., Kathmann I., Bunni M., Priest D. G., Noordhuis P., Schornagel J. H., Pinedo H. M., Peters G. J., Assaraf Y. G. (1998) A structurally altered human reduced folate carrier with increased folic acid transport mediates a novel mechanism of antifolate resistance. J Biol Chem. 273(46): 30189–30198. Jolivet J., Chabner B. A. (1983) Intracellular pharmacokinetics of methotrexate polyglutamates in human breast cancer cells: selective retention and less dissociable binding of 4-NH2-10-CH3-pteroylglutamate4 and 4-NH2-10-CH3-pteroylglutamate5 to dihydrofolate reductase. J Clin Invest. 72(3): 773–778. Jolivet J., Schilsky R. L., Bailey B. D., Drake J. C., Chabner B. A. (1982) Synthesis, retention, and biological activity of methotrexate polyglutamates in cultured human breast cancer cells. J Clin Invest. 70(2): 351–360. Kang Y., Edwards L. G., Thornalley P. J. (1996) Effect of methylglyoxal on human leukaemia 60 cell growth: modification of DNA, G1 growth arrest and induction of apoptosis. Leuk Res. 20(5): 397–405. Kaufman Y., Ifergan I., Rothem L., Jansen G., Assaraf Y. G. (2006) Coexistence of multiple mechanisms of PT523 resistance in human leukemia cells harboring 3 reduced folate carrier alleles: transcriptional silencing, inactivating mutations, and allele loss. Blood. 107(8): 3288–3294. Kishi T., Tanaka Y., Ueda K. (2000) Evidence for hypomethylation in two children with acute lymphoblastic leukemia and leukoencephalopathy. Cancer. 89(4): 925–931. Klener P., Klener P. jr. (2010) Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii. 1. vydání. Praha: Grada. Klener, P. (2002) Klinická onkologie. 1. vydání. Praha: Galén. Kline N. E., Sevier N. (2003) Solid tumors in children. J Pediatr Nurs. 18(2): 96–102. Koizumi S., Ueno Y., Ohno I., Ichihara T., Tamaru Y., Matsukawa H. (1990) Reversal of methotrexate cytotoxicity to human bone marrow cells and leukemic K562 cells by leucovorin: methotrexate polyglutamates formation as a possible important factor. Jpn J Cancer Res. 81(11): 1162–1167. Larsen E. C., Salzer W. L., Devidas M., Nachman J. B., Raetz E. A., Loh M. L., Heerema N. A., Carroll A. J., Gastier-Foster J. M., Borowitz M. J., Wood B. L., Willman C. L., Winick N. J., Hunger S. P., Carroll W. L. (2011) Comparison of 81
highdose methotrexate (HD-MTX) with Capizzi methotrexate plus asparaginase (CMTX/ASNase) in children and young adults with high-risk acute lymphoblastic leukemia (HR-ALL): a report from the Children's Oncology Group Study AALL0232. J Clin Oncol. 29(suppl): Abst. 3. Li L., Connor E. E., Berger S. H., Wyatt M. D. (2005) Determination of apoptosis, uracil incorporation, DNA strand breaks, and sister chromatid exchanges under condition of thymidylate deprivation in a model of BER deficiency. Biochem Pharmacol. 70(10): 1458– 1468. Li W. W., Lin J. T., Tong W. P., Trippett T. M., Brennan M. F., Bertino J. R. (1992) Mechanisms of natural resistance to antifolates in human soft tissue sarcomas. Cancer Res. 52(6): 1434–1438. Li W., Fan J., Hochhauser D., Banerjee D., Zielinski Z., Almasan A., Yin Y., Kelly R., Wahl G. M., Bertino J. R. (1995) Lack of functional retinoblastoma protein mediates increased resistance to antimetabolites in human sarcoma cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 92(22): 10436–10440. Li, M. C., Hertz, R., Spencer, D. B. (1956) The effect of methotrexate therapy upon choriocarcinoma and chorioadenoma. Proc Soc Exp Biol Med. 93(2): 361–366. Liani E., Rothem L., Bunni M. A., Smith C. A., Jansen G., Assaraf Y. G. (2003) Loss of folylpoly-gamma-glutamate synthetase activity is a dominant mechanism of resistance to polyglutamylation-dependent novel antifolates in multiple human leukemia sublines. Int J Cancer. 103(5): 587–599. Marshall L. A., Rhee M. S., Hofmann L., Khodjakov A., Schneider E. (2005) Increased lysosomal uptake of methotrexate-polyglutamates in two methotrexate-resistant cell lines with distinct mechanisms of resistance. Biochem Pharmacol. 71(1-2): 203–213. Massimino M., Giangaspero F., Garrè M. L., Gandola L., Poggi G., Biassoni V., Gatta G., Rutkowski S. (2011) Childhood medulloblastoma. Crit Rev Oncol Hematol. 79(1): 65–83. Mauritz R., Peters G. J., Kathmann I., Teshale H., Noordhuis P., Comijn E. M., Pinedo H. M., Jansen G. (2008) Dynamics of antifolate transport via the reduced folate carrier and the membrane folate receptor in murine leukaemia cells in vitro and in vivo. Cancer Chemother Pharmacol. 62(6): 937–948. Morales C., Ribas M., Aiza G., Peinado M. A. (2009) Genetic determinants of methotrexate responsiveness and resistance in colon cancer cells. Oncogene. 24(45): 6842–6847.
82
Mottl H., Kruseová J., Schovanec J. (2011) Osteosarkom: současné možnosti diagnostiky a léčby. Onkologie. 5(2): 96–98. Moxley J. H., DeVita V. T., Brace K., Frei E. (1967) Intensive combination chemotherapy and X-irradiation in Hodgkin’s disease. Cancer Res. 27(7): 1258–1263. Nakajima A., Hakoda M., Yamanaka H., Kamatani N., Kashiwazaki S. (1996) Divergent effects of methotrexate on the clonal growth of T and B lymphocytes and synovial adherent cells from patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 55(4): 237–242. Neradil J., Pavlasová G., Veselská R. (2012) New mechanisms for an old drug; DHFR- and non-DHFR-mediated effects of methotrexate in cancer cells. Klin Onkol. 25(Suppl 2): 2S87–2S92. Nilubol N., Zhang L., Shen M., Zhang Y. Q., He M., Austin C. P., Kebebew E. (2012) Four clinically utilized drugs were identified and validated for treatment of adrenocortical cancer using quantitative high-throughput screening. J Transl Med. 10: 198. doi: 10.1186/1479-5876-10-198. Partap S., MacLean J., Von Behren J., Reynolds P., Fisher P. G. (2011) Birth anomalies and obstetric history as risks for childhood tumors of the central nervous system. Pediatrics. 128(3): e652–e657. Pogoda J. M., Preston-Martin S., Howe G., Lubin F., Mueller B. A., Holly E. A., Filippini G., Peris-Bonet R., McCredie, M. R., Cordier S., Choi W. (2009) An international case-control study of maternal diet during pregnancy and childhood brain tumor risk: a histology-specific analysis by food group. Ann Epidemiol. 19(3): 148–160. Qiu A., Jansen M., Sakaris A., Min S. H., Chattopadhyay S., Tsai E., Sandoval C., Zhao R., Akabas M. H., Goldman I. D. (2006) Identification of an intestinal folate transporter and the molecular basis for hereditary folate malabsorption. Cell. 127(5): 917–928. Qiu A., Min S. H., Jansen M., Malhotra U., Tsai E., Cabelof D. C., Matherly L. H., Zhao R., Akabas M. H., Goldman I. D. (2007) Rodent intestinal folate transporters (SLC46A1): secondary structure, functional properties, and response to dietary folate restriction. Am J Physiol Cell Physiol. 293(5): C1669–C1678. Ritter J., Bielack S. S. (2010) Osteosarcoma. Ann Oncol. 21 (S7): vii320–vii325. Robinson J. P., Darzynkiewicz Z., Dean P., Dressler L., Tanke H., Wheeless L. (1993) Handbook of flowcytometry methods. New York, NY: Wiley-Liss. Rots M. G., Pieters R., Peters G. J., Noordhuis P., van Zantwijk C. H., Kaspers G. J., Hählen K., Creutzig U., Veerman A. J., Jansen G. (1999) Role of folylpolyglutamate
83
synthetase and folylpolyglutamate hydrolase in methotrexate accumulation and polyglutamylation in childhood leukemia. Blood. 93(5): 1677–1683. Rots M. G., Willey J. C., Jansen G., van Zantwijk C. H., Noordhuis P., DeMuth, J. P., Kuiper E., Veerman A. J., Pieters R., Peters G. J. (2000) mRNA expression levels of methotrexate resistance-related proteins in childhood leukemia as determined by a standardized competitive template-based RT-PCR method. Leukemia. 14(12): 2166–2175. Santarius T., Bignell G. R., Greenman C. D., Widaa S., Chen L., Mahoney C. L., Butler A., Edkins S., Waris S., Thornalley P. J., Futreal P. A., Stratton M. R. (2010) GLO1 – A novel amplified gene in human cancer. Gene Chromosomes Cancer. 49(8): 711–725. Sen H. N., Chan C. C., Byrnes G., Fariss R. N., Nussenblatt R. B., Buggage R. R. (2008) Intravitreal methotrexate resistance in a patient with primary intraocular lymphoma. Ocul Immunol Inflamm. 16(1): 29–33. Serra M., Reverter-Branchat G., Maurici D., Benini S., Shen J. N., Chano T., Hattinger C. M., Manara M. C., Pasello M., Scotlandi K., Picci P. (2004) Analysis of dihydrofolate reductase and reduced folate carrier gene status in relation to methotrexate resistance in osteosarcoma cells. Ann Oncol. 15(1): 151–160. Siegel R., Naishadham D., Jemal A. (2012) Cancer statistics 2012. CA Cancer J Clin. 62(1): 10–29. Siu M. K., Kong D. S., Chan H. Y., Wong E. S., Ip P. P., Jiang L., Ngan H. Y., Le X. F., Cheun A. N. (2012) Paradoxical impact of two folate receptors, FRa and RFC, in ovarian cancer: Effect on cell proliferation, invasion and clinical outcome. PLoS ONE. 7(11): e47201. doi:10.1371/journal.pone.0047201 Skacel N., Menon L. G., Mishra P. J., Peters R., Banerjee D., Bertino J. R., Abali E. E. (2005) Identification of amino acids required for the functional up-regulation of human dihydrofolate reductase protein in response to antifolate treatment. J Biol Chem. 280(24): 22721–22731. Skärby T. V., Anderson H., Heldrup J., Kanerva J. A., Seidel H., Schmiegelow K. (2006) High leucovorin doses during high-dose methotrexate treatment may reduce the cure rate in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 20(11): 1955–1962. Song J., Noh J. H., Lee J. H., Eun J. W., Ahn Y. M., Kim S. Y., Lee S. H., Park W. S., Yoo N. J., Lee J. Y., Nam S. W. (2005) Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer. APMIS. 113(4): 264–268. Sowers R., Toguchida J., Qin J., Meyers P. A., Healey J. H., Huvos A., Banerjee D., Bertino J. R., Gorlick R. (2003) mRNA expression levels of E2F transcription factors 84
correlate with dihydrofolate reductase, reduced folate carrier, and thymidylate synthase mRNA expression in osteosarcoma. Mol Cancer Ther. 2(6): 535–541. Sowers R., Wenzel B. D., Richardson C., Meyers P. A., Healey J. H., Levy A. S., Gorlick R. (2011) Impairment of methotrexate transport is common in osteosarcoma tumor samples. Sarcoma. vol. 2011, Article ID 834170, 5 pages. doi:10.1155/2011/834170 Stanczyk M., Sliwinski T., Trelinska J., Cuchra M., Markiewicz L., Dziki L., Bieniek A., Bielecka-Kowalska A., Kowalski M., Pastorczak A., Szemraj J., Mlynarski W., Majsterek I. (2012) Role of base-excision repair in the treatment of childhood acute lymphoblastic leukaemia with 6-mercaptopurine and high doses of methotrexate. Mutat Res. 741(1-2): 13–21. Stark M., Wichman C., Avivi I., Assaraf Y. G. (2009) Aberrant splicing of folylpolyglutamate synthetase as a novel mechanism of antifolate resistance in leukemia. Blood. 113(18): 4362–4369. Stover, J. P. (2010) Folate biochemical pathways and their regulation. In: Folate in health and disease. 2. vydání. Boca Raton, FL: CRC Press, Taylor & Francis Group. 49–74. Šmardová J., Pavlová S., Svitáková M., Grochová D., Ravčuková B. (2005) Analysis of p53 status in human cell lines using a functional assay in yeast: detection of new non-sense p53 mutation in codon 124. Oncol Rep. 14(4): 901–907. Štěrba J., Dušek L., Demlová R., Valík D. (2006a) Pretreatment plasma folate modulates the pharmacodynamic effect of high-dose methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin lymphoma: "folate overrescue" concept revisited. Clin Chem. 52(4): 692–700. Štěrba J., Valík D., Mendelová D., Gregorová V., Růžičková P. (2009) Vysokodávkovaný metothrexát v dětské onkologii - back to bench from bedside for a while? [abstrakt] XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro sestry a laboranty. 16. – 18. 4. 2009. Brno. Číslo abstraktu: 213. Štěrba J., Valík D., Múdrý P., Kepák T. Pavelka Z., Bajčiová V., Zitterbart K., Kadlecová V., Mazánek P. (2006b) Combined biodifferentiating and antiangiogenic oral metronomic therapy is feasible and effective in relapsed solid tumors in children: singlecenter pilot study. Onkologie. 29(7): 308–313. Thornalley P. J., Rabbani N. (2011) Glyoxalase in tumourigenesis and multidrug resistance. Semin Cell Dev Biol. 22(3): 318–325. Visentin M., Zhao R., Goldman I. D. (2012) The Antifolates. Hematol Oncol Clin N. 26(3): 629–648. 85
Volpato J. P., Fossati E., Pelletier J. N. (2007) Increasing methotrexate resistance by combination of active-site mutations in human dihydrofolate reductase. J Mol Biol. 373(3): 599–611. Wang Y. C., Chiang, E. P. (2012) Low-dose methotrexate inhibits methionine Sadenosyltransferase in vitro and in vivo. Mol Med. 18(1): 423–432. Westerhof G. R., Rijnboutt S., Schornagel J. H., Pinedo H. M., Peters G. J., Jansen G. (1995) Functional activity of the reduced folate carrier in KB, MA104, and IGROV-I cells expressing folate-binding protein. Cancer Res. 55(17): 3795–3802. Wielinga P., Hooijberg J. H., Gunnarsdottir S., Kathmann I., Reid G., Zelcer N., van der Born K., de Haas M., van der Heijden I., Kaspers G., Wijnholds J., Jansen G., Peters G., Borst P. (2005) The Human multidrug resistance potein MRP5 transports folates and can mediate cellular resistance against antifolates. Cancer Res. 65(10) 4425– 4430. Winter-Vann A. M., Kamen B. A., Bergo M. O., Young S. G., Melnyk S., James S. J., Casey P. J. (2003) Targeting Ras signaling through inhibition of carboxyl methylation: an unexpected property of methotrexate. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(11): 6529–6534. Wlodkowic D., Telford W., Skommer J., Darzynkiewicz Z. (2011) Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death. Methods Cell Biol. 103: 55–98. doi: 10.1016/B978-0-12-385493-3.00004-8. Yang P. M., Lin J. H., Huang W. Y., Lin Y. C., Yeh S. H., Chen C. C. (2010) Inhibition of histone deacetylase activity is a novel function of the antifolate drug methotrexate. Biochem Biophys Res Commun. 391(3): 1396–1399. Yang R., Li W. W., Hoang B. H., Kim H., Banerjee D., Kheradpour A., Healey J. H., Meyers P. A., Bertino J. R., Gorlick R. (2008b) Quantitative correlation between promoter methylation and messenger RNA levels of the reduced folate carrier. BMC Cancer. 8: 124. doi: 10.1186/1471-2407-8-124. Yang Z., Waldman A. S., Wyatt M. D. (2008a) DNA damage and homologous recombination signaling induced by thymidylate deprivation. Biochem Pharmacol. 76(8): 987–996. Yoon S. A., Choi J. R., Kim J. O., Shin J. Y., Zhang X., Kang J. H. (2010) Influence of reduced folate carrier and dihydrofolate reductase genes on methotrexate-induced cytotoxicity. Cancer Res Treat. 42(3): 163–171. doi: 10.4143/crt.2010.42.3.163.
86
Zeng H., Chen Z. S., Belinsky M. G., Rea P. A., Kruh G. D. (2001) Transport of methotrexate (MTX) and folates by multidrug resistance protein (MRP) 3 and MRP1: Effect of polyglutamylation on MTX transport. Cancer Res. 61(19): 7225–7232. Zitterbart K., Pavelka Z., Zitterbartová J. (2010) Meduloblastom: nejčastější zhoubný nádor mozku u dětí. Onkologie. 4(4): 256–259.
87
