MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Brno 2012
Hana Čelechovská
MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
Současné moţnosti genových terapií Bakalářská práce
Hana Čelechovská
VEDOUCÍ PRÁCE: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Hana Čelechovská Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Současné moţnosti genových terapií
Studijní program:
Biologie
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
41
Klíčová slova:
Genová terapie, transgen, vektor, adenovirus, retrovirus, adenoasociovaný virus, lentivirus, RNA interference, rakovina, cystická fibróza, ribozymy, sonoporace, etika, lipozomy, sebevraţedná genová terapie, elektroporace, Huntingtonova choroba, protismyslové oligonukleotidy, hemofilie, roztroušená skleróza.
Bibliographic Entry Author:
Hana Čelechovská Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Current status of gene therapies
Degree Programme: Biology Field of Study:
Molecular biology and genetics
Supervisor:
prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
41
Keywords:
Gene therapy, transgene, vector, adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, lentivirus, RNA interference, cancer, cystic fibrosis, ribozymes, sonoporation, ethic, liposomes, suicide gene therapy, electroporation, Huntington´s disease, antisense oligonucleotides, hemophilia, multiple sclerosis.
Abstrakt Začátek práce je věnován historii genové terapie. Dále se práce zmiňuje o moţnostech přenosu genu do buněk a jeho působení uvnitř buňky. Jsou zde popsány některé z moţných aplikací pro léčbu geneticky podmíněných onemocnění. Na posledních stranách se práce zabývá etickými aspekty genové terapie.
Abstract Start of thesis is devoted to the history of gene therapy. Furthermore the thesis alludes to the possibilities of gene transfer into cells and its effect imide the cell. It describes some possible applications for the treatment of genetic diseases. On the last pages, it deals with ethical aspects of gene therapy.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli prof. RNDr. Janu Šmardovi, CSc. za cenné rady a pomoc při vypracování bakalářské práce.
OBSAH SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ............................................................................ 10 1.
ÚVOD............................................................................................................................. 11
2.
HISTORIE ...................................................................................................................... 12
3.
VEKTORY GENOVÉ TERAPIE .................................................................................. 14
3.1.
VIROVÉ VEKTORY ..................................................................................................... 14
3.1.1. ADENOVIRY ................................................................................................................ 14 3.1.2. ADENOASOCIOVANÉ VIRY (AAV) ......................................................................... 15 3.1.3. RETROVIRY ................................................................................................................. 16 3.1.4. LENTIVIRY ................................................................................................................... 17 3.2.
NEVIROVÉ VEKTORY................................................................................................ 17
3.2.1. LIPOZOMY ................................................................................................................... 18 3.2.2. ELEKTROPORACE ...................................................................................................... 18 3.2.3. SONOPORACE ............................................................................................................. 19 4.
TERAPEUTICKÉ PRINCIPY GENOVÉ TERAPIE .................................................... 20
4.1.
PROTISMYSLOVÉ OLIGONUKLEOTITY (ASOs – antisense oligonucleotides) ..... 20
4.2.
RIBOZYMY ................................................................................................................... 21
4.3.
RNA INTERFERENCE (RNAi) .................................................................................... 22
4.3.1. siRNA ............................................................................................................................. 22 4.3.2. mikroRNA (miRNA) ...................................................................................................... 22 4.4.
“SEBEVRAŢEDNÁ“ GENOVÁ TERAPIE (Suicide gene therapy) ............................ 24
5.
TERAPEUTICKÉ VYUŢITÍ GENOVÉ TERAPIE ...................................................... 25
5.1.
VROZENÉ MONOGENETICKÉ NEMOCI ................................................................. 25
5.1.1. HEMOFILIE ................................................................................................................... 25 5.1.2. CYSTICKÁ FIBRÓZA .................................................................................................. 26 5.1.3. HUNTINGTONOVA CHOROBA................................................................................. 27 5.2.
NEMOCI ZÍSKANÉ BĚHEM ŢIVOTA ....................................................................... 28
5.2.1. RAKOVINA ................................................................................................................... 28 5.2.2. ROZTROUŠENÁ SKLERÓZA ..................................................................................... 29 6.
ETICKÉ ASPEKTY GENOVÉ TERAPIE .................................................................... 30
7.
ZÁVĚR ........................................................................................................................... 32 LITERATURA ............................................................................................................... 33
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK AAV ................................................................. adenoasociované viry ASOs................................................................. protismyslové oligonukleotidy CF ..................................................................... Cystická fibróza cPPT ................................................................. centrální polypurinová oblast CTS ................................................................... centrální terminační sekvence ds....................................................................... dvouřetězcová FIX .................................................................... koagulační faktor IX GCV .................................................................. ganciclovir HD .................................................................... Huntingtonova choroba HSV-tk .............................................................. tymidin kináza z Herpes virus simplex pre-miRNA ....................................................... prekurzor miRNA RISC ................................................................. umlčovací komplex indukovaný RNA RNAi................................................................. RNA interference ss ....................................................................... jednořetězcová
1. ÚVOD Genová terapie je druh experimentální léčby, spočívající ve vnesení standardní kopie genu do buňky za účelem potlačení mutantní verze genu. Původním účelem genové terapie byla léčba dědičných onemocnění, aţ později bylo zjištěno, ţe vnesením genů do buněk lze pomoci pacientům při léčbě získaných nemocí. Takto vnesený gen se nazývá transgen a buňce se říká transgenní. Podle cílené buňky se rozdělují dva typy genové terapie, a to na: somatickou a gametickou. Somatická genová terapie nahrazuje geny ve všech tělních buňkách kromě pohlavních. Tato terapie je vnímána jako běţná a příliš se neliší od konvenčního způsobu léčby. Výsledkem je oprava genů v negametických buňkách, avšak v gametických buňkách defektní geny stále zůstávají, a proto je moţný jejich přenos do dalších generací. Zatímco gametická genová terapie zasahuje pouze do gamet a ovlivňuje tak genom pohlavních buněk a tím i další generace těchto jedinců. V současné době probíhá výzkum na myších, ale na lidských subjektech je z morálních a etických důvodů zakázán.
11
2. HISTORIE Genová terapie se objevuje počátkem sedmdesátých let minulého století, jakoţto slibná cesta k léčbě mnohých geneticky podmíněných nemocí, které do té doby šlo jen těţko léčit. Z počátku ovšem nebyly úspěchy příliš veliké a většina pokusů zaloţených na přenosech genů prostřednictvím virových vektorů selhala. V osmdesátých letech minulého století se vědci zaměřili na léčbu talasémie pomocí genu kódující betaglobin. Byly provedeny pokusy na myších gametách, do kterých byl vloţen lidský gen pro betaglobin (Costantini et al., 1986). Vnesený gen exprimoval funkční beta hemoglobin, jenţ vedl k potlačení onemocnění. První klinický pokus o genovou terapii u člověka byl proveden 14. září 1990 v National Institute of Health (Blaese et al., 1995). Jednalo se o čtyřletou dívku s poškozenou adenozindeaminázou způsobující těţkou kombinovanou imunodeficienci (ADA‾ SCID). Dívce byly odebrány T-lymfocyty, které byly ex vivo vystaveny působení retrovirů s genem pro adenozindeaminázu. Po devíti aţ dvanácti denní kultivaci byly tyto buňky vráceny zpět do krevního řečiště. Výsledný efekt byl pouze dočasný, ale i přesto uspokojující. Stejné metodě byli podrobeni pacienti s imunodeficiencí vázanou na X (X-SCID), avšak u čtyř z devíti úspěšných pokusů, se během pozdějších let projevilo lymfoproliferativní onemocnění (Hacein-Bey-Abina et al., 2003; Hacein-Bey-Abina et al., 2008). Ve všech případech šlo o onemocnění vzniklé v důsledku pouţití retrovirového vektoru. Pomocí chemoterapie se u tří pacientů podařilo onemocnění zvrátit. Na přelomu století dochází k útlumu ve výzkumu v oblasti genové terapie, a to v důsledku úmrtí 18-ti letého chlapce Jesse Gelsingra (Raper et al., 2003). Ten podstoupil léčbu defektu ornithin transcarbamylázy pomocí adenovirálního vektoru nesoucího gen pro ornithin transcarbamylázu. Den po aplikaci došlo ke zhoršení stavu pacienta, který upadl do kómatu a 98 hodin po začátku léčby zemřel z důvodu selhání funkce několika orgánů, způsobené anoxií. V důsledku toho bylo pozastaveno několik klinických studií aţ do doby přehodnocení etických a procesních postupů (Zallen, 2000). Po špatných zkušenostech s virovými vektory se pozornost vědců obrací na jiné moţnosti přenosu genetické informace za pouţití nevirových vektorů. V roce 2003 tým vědců z Kalifornské univerzity přichází s moţností vyuţití lipozomů (Zhang et al., 2003), jakoţto vektorů schopných pronikat přes hematoencefalitickou bariéru, pro niţ byly viry příliš velké. Od roku 2006 se pozornost vědců odvrací od geneticky podmíněných nemocí k nemocím získaným, a to převáţně k rakovině. Jeden z prvních úspěchů zaznamenali vědci 12
z National Institute of Health (Morgan et al., 2006), kterým se podařilo u dvou pacientů úspěšně léčit metastázující melanom. V květnu téhoţ roku se podařilo potlačit imunitní odpověď vyuţitím přirozené schopnosti mikroRNA k potlačení exprese terapeutických genů v buňkách imunitního systému (Brown et al., 2006). V důsledku toho byla prodlouţena délka exprese transgenu. Ke konci roku 2006 Levine et al. (2006) přináší výsledky léčby HIV pomocí protismyslové genové terapie, za vyuţití lentivirového vektoru. V první fázi klinického výzkumu se léčba prováděla na pěti dobrovolnících s chronickým HIV. Na konci léčby bylo zjištěno, ţe u čtyř pacientů došlo k nárůstu nebo stagnaci počtu CD4+ T-lymfocitů. U všech pacientů byla zvýšená nebo stabilní imunitní reakce. Jednalo se o první vyuţití lentivirového vektoru v klinické léčbě. V květnu roku 2008 byla uskutečněna léčba Leberovy vrozené slepoty (Leber´s congenital amaurosis) pomocí adenoasociovaných virů (Maguire et al., 2008). Jedná se o skupinu dědičných onemocnění, která se poprvé projevují jiţ v dětství. Léčba však měla pouze krátkodobý účinek a pacientům se nepodařilo úplně zrak navrátit. Koncem roku 2009 byla publikována zpráva o léčbě adrenoleukodystrofie vázané na X (X-linked adrenoleukodaystrophy), která způsobuje závaţné demyelinizující poškození mozku (Cartier et al., 2009). Pacientům byly odebrány hematopoetické kmenové buňky, které byly ex vivo vystaveny působení lentivirálnímu vektoru nesoucímu příslušný gen a po kultivaci navráceny zpět. Po 16 měsících bylo u pacientů pozorováno zastavení progresivní demyelinizace mozku. V loňském roce byla publikována zpráva o vytvoření nového vektoru z lidského 21. chromozomu (Kazuki et al., 2011), tzv. umělý lidský chromozom (human artificial chromosome), který má značné výhody oproti ostatním doposud pouţívaným vektorům. Jeho dosavadní vyuţití bylo ve vytváření pluripotentních kmenových buněk z buněk fibroblastů, a to pouze na pokusných zvířatech. Vědci se však domnívají, ţe do budoucna by nemusel mít vliv jen na genovou terapii, ale svoje uplatnění by našel i v transgnezi zvířat.
13
3. VEKTORY GENOVÉ TERAPIE Přenos cizorodé DNA do buňky a její začlenění do hostitelského genomu nastává jen za určitých podmínek, protoţe je omezuje velikost/náboj DNA a enzymatické/mechanické bariéry buňky. Proto je nutné optimalizovat způsoby překonávání těchto překáţek a zajistit tak, aby se DNA i RNA dostaly na místo určení. Metody přenosu nukleových kyselin do buněk lze rozdělit, na metody virové a metody nevirové. Oba způsoby zahrnují široké spektrum postupů. Kaţdý jednotlivý postup má svoje výhody i nevýhody.
3.1. VIROVÉ VEKTORY Virové vektory jsou odvozené od virů, kterým byly odstraněny strukturní geny slouţící k šíření infekce. Virové vektory obsahují silné promotory, které pomáhají k vysoké hladině exprese transgenu. DNA virové vektory mohou dokonce nést tkáňově-specifické promotory, které znemoţňují expresi transgenu v jiné neţ cílové tkáni.
3.1.1. ADENOVIRY Adenoviry jsou neobalené, dsDNA viry, které napadají široké spektrum lidských buněk, bez ohledu na jejich buněčný cyklus. Do buňky se virus dostává přes specifický receptor. Uniká endozomům a infiltruje se do jádra. Svoji DNA ovšem nezačleňuje do jaderné DNA hostitele, pouze setrvává v jádře a přepisuje svoji genetickou informaci. Proto postupem času můţe být tato informace odstraněna, nebo ztracena. U člověka bylo izolováno více neţ 51 různých serotypů, které se rozdělují, na základě sekvenční podobnosti a schopnosti aglutinace v krevních buňkách, do šesti skupin (A-F). Pro genovou terapii se vyuţívají serotypy 2 a 5 ze skupiny C. Existují dvě generace adenovirálních vektorů, jeţ se od sebe odlišují deletovanými oblastmi v genomu. V první generaci chybí geny v oblasti E1, které slouţí jako aktivátory promotorů všech virových genů. Jejich replikace je tedy znemoţněna. Delece způsobuje nosnou kapacitu vektoru asi 5,1 kb (Bett et al., 1993). V některých případech byly deletovány geny i z oblasti E3 (obr. 1), čímţ se klonovací kapacita zvýšila aţ na 8,3 kb (Bett et al, 1994). Druhá generace adenovirových vektorů má kromě deletované oblasti E1/E3 i deleci v oblastech E2 a E4 (obr. 1). Geny v těchto oblastech zajišťují replikaci virového genomu.
14
Odstranění těchto genů omezuje replikaci viru a i imunitní rekci. Současně zvětšují klonovací kapacitu vektoru. Nevýhodou tohoto postupu je jejich nákladná a obtíţná příprava.
Obr. 1: Rozložení genů u první a druhé generace adenovirových vektorů. Bílé oblasti označují delece. ITR – koncové obrácené repetice, Ψ – sbalovací signál, ΔE1 – ΔE4 – oblasti deletovaných genů (McConnell a Imperiale, 2004; upraveno)
Obě generace adenovirových vektorů mají značnou transfekční schopnost, i kdyţ jen krátkodobou. Po několika týdnech je ve většině tkání hladina produktu transgenu nedetekovatelná (Wilson, 1996). Při opakovaném pouţívání vektoru je jeho nevýhodou stimulace imunitní a prozánětlvé odpovědi (Chirmule et al., 1999), vedoucí aţ ke zničení transgenní buňky (Yang et al., 1994). Z toho důvodu není vyuţití těchto vektorů vhodné pro dlouhodobější léčbu chronických onemocnění. Je však ideální pro přímé usmrcení buněk, většinu imunoterapeutických strategií a pro některá akutní onemocnění. 3.1.2. ADENOASOCIOVANÉ VIRY (AAV) AAV jsou obalené, ssDNA viry patřící do čeledi parvoviridae. Za normálních okolností potřebují pomocný virus (Janik et al., 1981), aby mohly napadat buňky. Poprvé byly objeveny jako kontaminanty při onemocněních vyvolaných adenoviry. Doposud však nebyla popsána nemoc, která by byla vyvolána AVV, coţ z něj dělá vhodného kandidáta pro genovou terapii. Podobně jako adenoviry, i AAV mohou napadat všechny typy buněk bez ohledu na fázi jejich buněčného cyklu (Miao et al., 2000). Na rozdíl od nich mají schopnost se specificky vmezeřit do hostitelského genomu a tak zvýšit moţnost trvalé exprese transgenu (Samulski et al., 1991). AAV divokého typu se specificky začleňuje do 19. lidského chromozomu. Tím dochází ke sníţení moţnosti náhodné inzerce do DNA a vzniku neţádoucích mutací.
15
Genom AAV má velikost 4,7 kb a je sloţen z koncových obrácených repeticí a u genu rep, který je nezbytný pro replikaci a cap, kódující strukturní proteiny. Na 5´ konci se nachází Ψ sbalovací signál. Po odstranění genů má vektor kapacitu pouze 4,5 kb, coţ je jeho největší nevýhodou. Ani jeho příprava není jednoduchá, protoţe vyţaduje přítomnost pomocného viru, nejčastěji adenoviru (Janik et al., 1981). Vzhledem k tomu, ţe vektor byl zbaven kódujících sekvencí, nevyvolává imunitní ani zánětlivou odpověď organismu a je velmi pravděpodobné, ţe by mohl být v budoucnu vyuţíván k léčbě mnohých onemocnění.
3.1.3. RETROVIRY Retroviry jsou obalené ssRNA viry, které za pomocí reverzní transkriptázy přepisují svoji RNA do DNA a následně ji vmezeřují do hostitelského genomu. Schopnost retrovirů začleňovat cizorodou DNA do jádra buňky byla popsána v roce 1981 (Wei et al., 1981). Tato schopnost je vyuţívána u vektorů pro dlouhodobou expresi přenášeného genu v hostitelských buňkách, i kdyţ postupem času dochází k jejímu poklesu vlivem metylace DNA v okolí promotoru (Kuriyama et al., 1998). Vzhledem k tomu, ţe retroviry nemají schopnost pronikat přímo do jádra buňky, je nutné, aby v době transfekce byly cílené buňky proliferující (Miller et al., 1990). Z toho důvodu je vyuţití vektoru in vivo značně omezené. Při pouţití in vitro je potřeba, před jejich vystavení vektoru, stimulovat buňky k proliferaci.
Obr. 2: Schéma struktury retrovirového vektoru. LTR – dlouhé terminální repetice, Ψ – sbalovací signál (O´Connor a Crystal, 2006; upraveno)
Retrovirus má velikost genomu mezi 7 aţ 10 kb. Je sloţen z pravé a levé dlouhé koncové repetice, genů rev, gag, pol a různých regulačních genů potřebných pro jeho ţivot. Retrovirový vektor je zbaven veškerých genů kódujících proteiny, které jsou nahrazeny transgenem (obr. 2), jehoţ velikost můţe být aţ 8 kb. 16
Dlouho se předpokládalo, ţe retroviry začleňují svou genetickou informaci do genomu hostitele náhodně. V roce 2003 však bylo zjištěno (Laufs et al., 2003), ţe existují místa s inzerční preferencí. U člověka se jedná o chromozomy 17 a 19, a některé úseky na chromozomech 6, 13 a 16. Přes zjištění, ţe se retroviry v rámci hostitelského genomu nezačleňují zcela náhodně, existuje riziko, ţe při jejich pouţití můţe dojít k vzniku nádorového onemocnění (Li et al., 2002).
3.1.4. LENTIVIRY Patří do čeledi Retroviridae. Tato skupina zahrnuje viry, které způsobují chronické a progresivní onemocnění. Napadají makrofágy a terminálně diferenciované buňky. Mají všechny vlastnosti retrovirů, a dále i schopnost pronikat do neproliferujících buněk (Lewis a Emerman, 1994). Lentivirové vektory jsou navrţeny jako viry neschopné replikace, které jsou odvozené z viru HIV nebo jiných lentivirů, převáţně ne lidských. Svůj proteinový obal mají tvořený z proteinů viru vezikulární stomatitidy (Naldini et al., 1996), proto neaktivují imunitní odpověď. Z toho důvodu je jejich výroba velice sloţitá a pracná. Genom lentivirů je tvořen ssRNA o velikosti 9 - 10 kb a má stejnou sekvenční strukturou jako retroviry. Navíc obsahuje centrální polypurinovou oblast (cPPT) a centrální terminační sekvenci (CTS), které jsou cis-aktivní a umoţňují přenos provirové DNA do jádra. Při vytváření vektoru jsou odstraněny všechny protein kódující geny, kromě cPPT a CTS, a nahrazeny expresní kazetou nesoucí transgen, která můţe mít velikost aţ 8 kb. Na zvířecích modelech byla transgenní exprese in vivo detekována ještě šest měsíců po přenosu (Naldini et al. 1996). Jednou z moţných, a dnes jiţ velmi studovanou aplikaci, je vyuţití lentivirového vektoru při léčbě HIV pozitivních pacientů (Wang et al., 2009).
3.2. NEVIROVÉ VEKTORY Nevirové vektory mají značné výhody proti virovým vektorům, které vyplývají z jejich jednodušší přípravy ve velkých mnoţstvích a s minimální imunitní odpovědi, kterou u organismu vyvolávají. Na druhé straně mají velmi nízkou účinnost transfekce a exprese transgenu. V posledních letech však dochází k posunu v před, a tak se začínají některé nevirové metody vyrovnávat virovým.
17
3.2.1. LIPOZOMY Lipozomy jsou uměle vytvořené nosiče, které mohou dodávat různé exogenní látky do buňky. Mají fosfolipidovou strukturu, s charakteristickou hydrofilní a hydrofobní částí, obklopující malé mnoţství vodního roztoku. V tomto roztoku bývá rozpuštěná transfekovaná nukleová kyselina. Vzhledem k tomu je velikost přenášené nukleové kyseliny neomezená. Při kontaktu s cílenou buňkou, lipozom interaguje s buněčnou membránou, a tím umoţní vstup nukleové kyselině do buňky (Connor et al., 1984). Lipozomy mají mnohé výhody proti virovým vektorům. Jelikoţ jsou tvořeny pouze z biologických lipidů, jejich toxicita je nízká. Na svém povrchu nemají ţádné antigenní struktury, a proto nebyla pozorována imunitní odpověď. A samozřejmě nedochází ani k jejich proliferaci uvnitř buňky. Volné lipozomy jsou rychle vychytávány a likvidovány makrofágy (Dűzgűneş a Nir, 1999), coţ komplikuje zavedení této metody in vivo. Tomuto problému by se dalo předcházet moţnými povrchovými modifikacemi lipozomů (Li a Huang, 2006). I kdyţ se lipozomům úspěšně podaří přenést nukleovou kyselinu do buňky, jen malé mnoţství se jí dostane do jádra a ještě menší mnoţství se začlení do jaderného genomu (Smith, 2003). Lipozomy jsou velmi důleţitými činiteli transportu DNA/RNA do buněk a to převáţně v genové terapii in vivo. Vývoj směřuje ke zlepšení schopnosti lipozomů unikat makrofágům, začleňování se do tkání, a ke zvýšení účinnosti začleňovat exogenní nukleovou kyselinu do jádra hostitelské buňky.
3.2.2. ELEKTROPORACE Změna propustnosti buněčné membrány po pouţití elektrického pole je známa jiţ od šedesátých let minulého století (Al-Dosari a Gao, 2009). Ovšem první pokusy pro přenos genů pomocí elektroporace byla prokázána aţ v osmdesátých létech minulého století (Neumann et al., 1982). Podstatou elektroporace je působení krátkého elektrického impulsu o vysokém napětí na buňky. Impuls v plazmatické membráně vyvolá tvorbu dočasných pórů, jimiţ do buňky proniká transgenní DNA/RNA. Účinnost metody významně ovlivňuje síla aplikovaného
elektrického
pole,
délka
elektrického
impulsu,
teplota,
konformace
a koncentrace nukleových kyselin a iontové sloţení média. Jednou z moţných cílových buněk jsou koţní epitely (Heller et al., 2010). V současné době, zatím jen na zvířecích modelech, se vyuţívá k navození angiogeneze pro hojení ran a k DNA vakcinaci kůţe. Další moţností vyuţití, kde jiţ došlo k prvním klinickým testům, je léčba melanomů (Heller et al., 2011). 18
3.2.3. SONOPORACE Ultrazvuk můţe přechodně změnit strukturu buněčných membrán, a tak umoţnit lepší absorpci nízko- i vysokomolekulárních látek do buňky. Tento jev se nazývá sonoporace. Sonoporace vyuţívá akustické kavitace mikrobublin, ke zvýšení transfekce (Greenleaf et al., 1998). Částice, které nesou transgen, vlivem ultrazvuku oscilují, zvětšují svůj objem, aţ nakonec prasknou. Jejich zničení zvyšuje intenzitu akustického pole, coţ přispívá k vyšší permeabilitě membrány. Při vyuţití ultrazvuku dochází k mimotělní stimulaci, která zajišťuje výhodný přístup k místům i hluboko v těle, kam se elektroporační metody jen těţko dostávají. Ultrazvuk se vyuţívá
pro
vstup
nukleové
kyseliny
do
buňky
samotný
nebo
v kombinaci
s mikrobublinami (Li et al., 2009). Pro dosaţení stejných výsledků při vyuţití samotného ultrazvuku bez mikrobublin je třeba jeho vyšší frekvence, neţ při pouţití ultrazvuku s mikrobublinami. Sonoporace je rychle se rozvíjející odvětví v genové terapii s velmi uspokojivými výsledky preklinických testů.
19
4. TERAPEUTICKÉ PRINCIPY GENOVÉ TERAPIE Po úspěšném přesunu nukleové kyseliny do buňky, můţe být její informace vyuţita rozmanitým způsobem. Záleţí jen na typu nukleové kyseliny a na místě jejího působení. Na následujících stránkách jsou uvedeny nejdůleţitější postupy vyuţití působení DNA či RNA na expresi genů.
4.1. PROTISMYSLOVÉ OLIGONUKLEOTIDY (ASOs – antisense oligonucleotides) Hlavní strategie ASOs je ve vyuţití ssDNA, o délce 18 aţ 30 bází, které jsou určeny k cílené degradaci komplementární mRNA. Cílem tohoto procesu je znemoţnit expresi mRNA kódující protein. ASOs jsou navrţeny tak, aby mohly hybridizovat se specifickou oblastí cílové mRNA (obr. 3). Proces vede ke vzniku stabilního komplexu DNA-RNA, který je následně štěpen RNázou H (Dash et al., 1987). Degradovaná mRNA pak nemůţe být podrobena translaci. ASOs jsou opět volné a schopné vázat se na další kopie cílené mRNA a celý proces se opakuje.
Obr. 3: Mechanismus působení protismyslových oligonukleotidů (O´Connor a Crystal, 2006; upraveno)
20
ASOs jsou v buňce snadno degradovány endo- a exonukleázami ještě předtím, neţ se mohou navázat na odpovídající mRNA. Jedna z moţností jak předcházet zničení ASOs je vyuţití chemických modifikací cukr-fosfátové kostry, například metodou záměny fosfátu za thiofosfát se sírou na nespojovacím místě (Matzura a Eckstein, 1968). Strategie ASOs v léčbě onemocnění spočívá v cíleném sníţení hladiny mutantního proteinu, coţ příznivě ovlivňuje fenotyp. Protoţe ASOs se trvale do genomu buněk nezačleňují, k docílení poţadovaného efektu je nutné opakování léčby. V současné době jsou ASOs ve fázi klinických testů, výzkum se zabývá léčbou hypercholesterolémie, nádoru mozku, rakoviny a astmatu (Watts a Corey, 2012).
4.2. RIBOZYMY Ribozymy jsou RNA enzymy s 3D strukturou, které katalyticky štěpí cukr-fosfátovou kostru cílové mRNA. Katalytická aktivita u RNA byla poprvé popsána v osmdesátých létech (Guerrier-Takada et al., 1983; Zaug a Cech, 1986). Jejím objevením se vyvrátila teorie, ţe jedinými katalyzátory v buňce jsou proteiny. I kdyţ se většina ribozymů vyskytuje v buňkách zřídka, představují důleţité enzymatické reakce, které jsou nezbytné pro její ţivot.
Obr. 4: Působení ribozymů (Mulhbacher et al., 2010; upraveno)
Dlouho se předpokládalo, ţe ribozymy potřebují pro svoji enzymatickou aktivitu některý z dvojmocných iontů, nejčastěji Mg2+. Tento předpoklad se potvrdil u skupiny intronů I (Stahley a Strobel, 2005). Tato teorie se ovšem nedá zobecnit pro všechny ribozymy. Byla prokázána existence ribozymů, které nepotřebují ke své aktivaci dvojmocný iont (Murray et al., 1998). Ribozymy se skládají ze dvou samostatných ramen okolo katalytického jádra, jehoţ aktivita je dána trojrozměrnou strukturou ribozymu. Ribozym se naváţe na cílenou molekulu 21
mRNA a vytvoří s ní komplex. mRNA je enzymaticky rozštěpena, komplex se rozpadá a ribozym je opět volný a můţe se znovu vázat na další cílovou mRNA (obr. 4). Vyuţití ribozymů reprezentuje slibnou strategii pro nové terapeutické přístupy v léčbě lidských onemocnění. Jejich vyuţití je široké, od mnohých heterogenních onemocnění, přes rakovinu aţ po virová onemocnění. Byly provedeny i první klinické testy v léčbě solidních nádorů pomocí syntetického ribozymu Angiozyme (Weng et al., 2005). Lék byl pacienty dobře snášen a měl pouze minimální toxické účinky.
4.3. RNA INTERFERENCE (RNAi) RNAi je evolučně velmi konzervovaný způsob umlčení
genové exprese.
U primitivních organizmů chrání buňky před napadením virem a současně reguluje genovou expresi během vývoje organismu. Jedná se o malé molekuly, velikosti asi 21 aţ 28 nukleotidů. Rozlišujeme základní dva typy: siRNA (small interfering RNA) a mikroRNA. Obě mají mírně odlišnou cestu zrání a jiný mechanismus působení, ale vţdy inhibují translaci.
4.3.1. siRNA siRNA je původem exogenní, nejčastěji z replikující se virové RNA, nebo z shRNA, která je do buňky zavedena z terapeutických důvodů. siRNA je schopná specificky štěpit cílenou mRNA nejenom v cytoplazmě, ale její aktivita byla zjištěna i v jádře (Robb et al., 2005). Molekuly siRNA vznikají štěpením dlouhé dsRNA pomocí enzymu DICER s 3´ přesahem dvou aţ třech nukleotidů. Následně kaţdá vstupuje do ribonukleotidové částice, kde je rozpletena, smyslové vlákno je odstraněno a protismyslové vlákno tvoří umlčovací komplex indukovaný RNA (RISC). RISC v cytoplasmě vyhledává cílovou mRNA a dokonale se s ní spáruje. Na základě toho spojení je mRNA rozštěpena a RISC uvolněn, aby mohl interagovat s další mRNA (viz obr. 5).
4.3.2. mikroRNA (miRNA) miRNA je vysoce konzervovaná nekódující RNA, běţně se vyskytuje v buňce a hraje důleţitou roli v regulaci buněčných funkcí. Porucha regulace pomocí miRNA má vliv na široké mnoţství lidských onemocnění (Lu et al., 2008).
22
Obr. 5: Porovnání působení siRNA (vlevo) a miRNA (vpravo)(Jinek a Doubna, 2009; upraveno)
miRNA je nejprve v jádře přepsána RNA polymerázou II do pri-miRNA, která se skládá do vlásenky (Cai et al, 2004; Lee et al., 2004). Ta vstupuje do komplexu s endonukleázou Drosha-DGCR8 a vzniká 70 nukleotidový prekurzor miRNA (pre-miRNA) (Lee et al., 2003). Ten pomocí exportního proteinu Exportin 5, který specificky rozeznává strukturu pre-miRNA, přechází z jádra do cytoplasmy (Yi, et al., 2003). Tam je pre-miRNA pomocí enzymu Dicer štěpena na asi 21 nukleotidový duplex miRNA. Ten vstupuje do ribonukleotidové částice, kde je smyslové vlákno odstraněno a druhé tvoří RISC. miRNA 23
není zcela homologní k cílené mRNA, RISC se páruje nedokonale, a proto nedochází ke štěpení a degradaci mRNA, ale pouze k inhibici proteosyntézy (obr. 5). RNAi do budoucna můţe umoţnit nový způsob léčby infekcí, rakoviny, neurodegenerativních a jiných onemocnění. I kdyţ se RNAi velmi vyuţívá v preklinické fázi, pouze malé mnoţství přešlo do první fáze klinických testů (Wang et al., 2011). Jedná se především o léčbu solidních nádorů. Ve všech případech je léčba pacienty dobře snášena a doposud nebyly hlášeny ţádné toxické účinky.
4.4. “SEBEVRAŢEDNÁ“ GENOVÁ TERAPIE (Suicide gen therapy) Základní myšlenka je zaloţena na metabolické změně nitrobuněčných netoxických látek v toxické, a to pomocí enzymů, které se běţně v buňce nevyskytují. Tyto enzymy se získávají z virů, bakterií a hub, jeţ mají odlišné metabolické dráhy neţ buňky savčí. Enzymy jsou v transfekovaných buňkách nadměrně exprimovány a toxicita reakčních produktů je pak neslučitelná se ţivotem buňky a vyvolává její smrt apoptózou. V současné době je jedním z nejvíce zkoumaných sebevraţedných genů gen kódující tymidin kinázu z Herpes virus simplex (HSV-tk). Jako substrát zde slouţí ganciclovir (GCV), který je analogem guanosinu. HSV-tk fosforyluje GCV za vzniku monofosfátové formy GCV. Ta je dále fosforylována endogenními kinázami (Miller a Miler, 1980), za vzniku nejprve difosfátové a posléze trifosfátové formy GCV. Tento metabolit je ze všech metabolitů GCV nejtoxičtější (Elion et al., 1977). Začleňuje se do DNA a inhibuje DNA polymerázu α (Mar et al., 1985). Jedna z nejsilnějších stránek této metody je tzv. efekt přihlíţejícího (bystander effect). Ten spočívá v přenosu toxické látky z transgenní buňky do buněk sousedních, které nebyly ovlivněny exogenní DNA. Tyto látky jsou přenášeny buď pomocí apoptotických váčků (Freeman et al, 1993), které vznikají v buňce, nebo přes buněčná mezerová spojení (gap junctions) (Tanaka et al, 2001). Proto není potřeba vektorem zasáhnout velké mnoţství buněk, stačí pouze část cílené skupiny a toxin se dál bude šířit do okolí zasaţené buňky. Sebevraţedná genová terapie patří mezi první postupy genové terapie, které byly aplikovány v klinické fázi (Morgan, 2012). V současné době probíhá několik klinických studií, které se věnují léčbě nádorových onemocnění.
24
5. TERAPEUTICKÉ VYUŢITÍ GENOVÉ TERAPIE Od prvního vyuţití genové terapie v klinické praxi v roce 1990, vzrůstá zájem o tento způsob léčby. V minulosti se genová terapie věnovala léčbě monogenetických onemocnění, náhradou defektního homologního genu, nebo potlačením exprese mutantní verze genu. S postupným odhalováním vztahu mezi genetickou informací a prostředím, molekulárními dráhami a mechanismem patogeneze, se vyuţití genové terapie rozšířilo i na nemoci získané.
5.1. VROZENÉ MONOGENETICKÉ NEMOCI V přibliţně 25 000 genech lidského genomu existuje více neţ 1 800 mutací, které způsobují monogenetická dědičná onemocnění (O´Connor a Crystal, 2006). Před zavedením genové terapie byla některá z těchto onemocnění léčena pouze symptomaticky a některá nebylo moţno léčit vůbec, coţ způsobovalo vysokou mortalitu dětí. I kdyţ se v současné době genová terapie nachází stále na začátku, jiţ nyní nabízí obrovský potenciál.
5.1.1. HEMOFILIE Hemofilie je vrozená
krvácivá choroba způsobena
nedostatkem
některého
z koagulačních faktorů. Jedná se o monogenní onemocnění s relativně jednoduchou a dobře prozkoumanou patogenezí. Jde o recesivní gonozomální onemocnění vázané na chromozom X. Rozdělujeme různé typy, podle toho, ve kterém z koagulačních faktorů chyba nastala. Nejčastější poruchy jsou v koagulačním faktoru VIII – jedná se o typ A, a v koagulačním faktoru IX (FIX) – typ B. Existují poruchy i v jiných faktorech, i kdyţ ne s takovou četností. Nemoci byly popsány na ţivočišných modelech, avšak doposud nebyl popsán výskyt hemofilie u primátů, proto chybí velmi důleţitý model blízce příbuzný člověku. Nároky na úroveň exprese daného genu, nejsou nijak vysoké, naopak, bylo zjištěno, ţe u nejtěţších forem stačí jen malé avšak dlouhodobé zvýšení exprese chybějícího faktoru (Nilsson et al., 1992). Současná léčba spočívá ve zvýšení hladiny chybějícího koagulačního faktoru na dobu nutnou k zástavě nebo prevenci krvácení. Chybějící faktory byly z počátku dodávány z plazmy získané od dárců, ovšem nízká hladina proteinů v krvi, vedla k vytvoření účinnějších metod. Byly vytvořeny koncentráty odvozené z plazmy, které jsou velmi účinné, ovšem pro svoji vysokou cenu jsou zároveň nedostupné pro pacienty z rozvojových zemí.
25
V současné době výzkum léčby Hemofilie B vyuţívá vektor AAV serotypu 2 s transgenním genem pro FIX. Přestoţe prošel prvním a druhým klinickým testem, prokazuje pouze krátkodobou expresi FIX (Manno et al., 2006). Ta je způsobena reakcí CD8+ T-lymfocytů proti transgenním hepatocytům (Mingozzi et al., 2007). Koncem roku 2011 byla publikována zpráva o úspěšné dlouhodobé expresi FIX v játrech (Nathwani et al., 2011). Pomocí vektoru AAV serotypu 8, byl do periférní krve šesti pacientů vnesen gen pro FIX, a následně začleněn do hepatocytů. Výhodou serotypu 8 proti serotypu 2 je niţší imunitní reakce a silný tropismus k játrům. Exprese genu FIX vzrostla o dvě aţ jedenáct procent a byla dostatečná pro zlepšení krvácivosti. Byla pozorována mírná imunitní reakce, kterou se podařilo potlačit pomocí glukokortikoidů, aniţ by měla vliv na expresi transgenu. Pro široké vyuţití této metody je třeba ještě dořešit otázku dávkování, přesto do budoucna představuje značný potenciál v léčbě Hemofilie B. 5.1.2. CYSTICKÁ FIBRÓZA Cystická fibróza (CF) je jedním z nejčastějších dědičných onemocnění v EU s incidencí jednoho případu na dva aţ tři tisíce novorozenců. Jedná se o autozomálně recesivní onemocnění postihující nejčastěji dýchací soustavu méně pak trávicí. Četnost heterozygotů v bělošské populaci se pohybuje kolem jednoho na dvacet pět dominantních homozygotů. Jednoduchým diagnostickým znakem je slaný pot, jenţ je způsobený mutací v genu kódující CFTR. Pacienti s touto chorobou se doţívají v průměru věku 35 let. Pro CF je charakteristické hromadění hlenu v plicích, slinivce břišní a játrech s následným selháním těchto orgánů. Častým a opakovaným jevem je i infekce dýchacího systému. Gen kódující CFTR, který způsobuje onemocnění, se nachází na dlouhém raménku chromozomu 7. Tento gen je exprimovaný v epitelu plic, slinivky, střev, rozmnoţovacích orgánů a ve slinných a potních ţlázách. Protein CFTR vytváří v membránách buněk iontové kanály, jeţ regulují příjem a výdej vody a solí. U pacientů s CF je tento gen defektní, proto dochází ke hromadění solí uvnitř epiteliálních buněk a k tvorbě hlenu na povrchu buněk. Tím vznikají ideální podmínky pro mnoţení patogenních mikroorganismů. Předpokladem léčby CF pomocí genové terapie bylo, ţe stačí přenést funkční gen do postiţené buňky a ten potlačí mutantní verzi genu. Bylo zjištěno (Ramalho et al., 2002), ţe ke správné funkci proteinu je nutná pouze 5% exprese genu kódujícího CFTR. Není podstatná nízká úroveň exprese genu, ale její dlouhodobost. Proto se vhodnými vektory pro přenos genu jeví AAV a lentiviry, kteří jsou schopni začleňovat svoji DNA/RNA do genomu hostitelské buňky. 26
Výsledky současných klinických testů ukazují, ţe léčba CF není dostatečně efektivní (Conese et al. 2011). CF postihuje mnoho orgánů v těle a zároveň podporuje vznik bakteriálních infekčních onemocnění. Z těchto důvodů je léčba velmi obtíţná, zvláště v případech, kdy se nemoc uţ plně projevila. Proto je potřeba začít s léčbou v co moţná nejniţší věku pacienta (Jaffé et al., 2006) nebo přímo jiţ in utero (Conese et al., 2011). Jiţ proběhlo mnoho příznivých testů in utero na zvířatech, které potvrdily proveditelnost této metody. Bohuţel klinické testy jsou stále ještě v nedohlednu. Kromě zjevných etických problémů, je třeba vyřešit další problémy s pojené s přenosem do vyvíjejícího se plodu.
5.1.3. HUNTINGTONOVA CHOROBA Huntingtonova choroba (HD) je autozomálně dominantní neurodegenerativní onemocnění. Charakteristickými projevy jsou motorické dysfunkce, psychické poruchy, demence a ztráta váhy. HD je celosvětovým onemocněním všech ras a etnických skupin (Kremer et al., 1994) s četností výskytu pět aţ deset pacientů na sto tisíc jedinců. Nástup onemocnění je mezi 30. a 50. rokem ţivota a smrt přichází do 15 let. V současné době je HD nevyléčitelná a nejčastější příčina úmrtí je pneumonie, následovaná sebevraţdou (Roos, 2010). Gen huntingtin, který způsobuje HD, se nachází na krátkém raménku chromozomu 4. Tento gen se přepisuje v různých typech buněk. Podstatou onemocnění je zmnoţení trinukleotidové sekvence CAG. Tato sekvence je u divokého typu zmnoţena 7 aţ 34krát, ale mutantní verze můţe obsahovat více neţ 100 kopií tohoto tripletu. Tato repetice ovlivňuje strukturní konformaci přepisovaného proteinu, jeţ mu dává nové vlastnosti. Doposud však nebyla zjištěna molekulární funkce tohoto proteinu. Velmi atraktivním terapeutickým způsobem léčby se jeví přímé zaměření na mutantní gen huntingtin. Předpokládá se, ţe sníţením exprese mutantního proteinu se sníţí i jeho aberantní interakce v buňce a tím i neurotoxicita, kterou způsobuje. Tato hypotéza byla potvrzena v preklinických testech modelů myší, kdy byla progrese onemocnění pozastavena (Yamamoto et al, 2000; Díaz-Hernández et al., 2005). V současné době se terapeutické strategie zaměřují na aplikaci RNAi a ASOs, které jsou selektivně zaměřeny na degradaci mRNA genu huntingtin. Studie se zaměřují na sníţení exprese mutantní verze genu. Bezpečnost těchto postupů však musí být, s ohledem na neznámou funkci proteinu a vlivu na buňku při dlouhodobém sníţení jeho exprese, dále zkoumána.
27
5.2. NEMOCI ZÍSKANÉ BĚHEM ŢIVOTA Ne všechna onemocnění jsou geneticky podmíněná. Existují i onemocněné, která si můţeme během svého ţivota způsobit sami. Ať uţ se jedná o nesprávnou ţivotosprávu - špatná strava a nedostatek pohybu, či neuváţený a příliš promiskuitní sexuální ţivot, nebo se jedná o pouhou náhodu.
5.2.1. RAKOVINA Rakovina je skupina onemocnění, při níţ dochází k nekontrolované proliferaci buněk, způsobené mutacemi genů řídících např. buněčný cyklus, apoptózu, opravy DNA, atd. Podle povahy růstu nádoru rozdělujeme dva typy: benigní a maligní nádory. Benigní nádory nepřerůstají do okolních tkání, zatím co maligní nádory se rozšiřují i do okolních tkání a mohou vytvářet metastázy. Genová terapie se zabývá převáţně maligními nádory. Zájem o léčbu rakoviny pomocí genové terapie stále stoupá. V lednu roku 2012 se věnovalo léčbě rakoviny pomocí genové terapie více neţ 64 % všech klinických testů, které v té době probíhaly (http://www.wiley.com//legacy/wileychi/genmed/clinical/). Existují tři hlavní strategie pro léčbu maligních nádorů pomocí genové terapie. První přístup se věnuje léčbě pomocí onkolytických virů. Metoda spočívá ve vnesení specifických genů do maligních nádorů. V současné době je v této souvislosti nejvíce zkoumaným genem nádorový supresor p53, který se pomocí rekombinantních virových vektorů začleňuje do nádorových buněk (Dobrikova et al., 2008). Na podzim roku 2003 byl schválen první lék, zaloţený na rekombinantním adenoviru nesoucí gen p53 (Pearson et al., 2004). Další moţností v této oblasti výzkumu je vyuţití RNAi a cíleným vyřazení mutantních verzí genu. Druhou velmi vyuţívanou metodou je sebevraţedná genová terapie (viz kapitola 4.4.). Poslední strategie je známá pod názvem genově podmíněná imunoterapie. Jedná se o přístup podporující imunitní reakci zasaţeného organismu proti nádorovým buňkám. V současné době se v tomto směru studují dendritické buňky. Těm je prezentován nádorový antigen ex vivo, nebo jsou přímo fúzovány s nádorovými buňkami a následně vráceny do organismu, čím zvyšují imunitní odpověď. Přestoţe tyto metody zaznamenaly uspokojivé výsledky pro léčbu rakoviny, není moţné takové komplexní onemocnění léčit pouze jedinou metodou. Nejlepším přístupem léčení rakoviny se jeví kombinovaná léčba. Jako příklad je moţné uvést studii (Landen Jr.
28
et al., 2005), která při kombinaci klasické chemoterapie a RNAi dosáhla u rakoviny vaječníků 90% zmenšení nádoru, neţ při pouţití samotné RNAi. 5.2.2. ROZTROUŠENÁ SKLERÓZA Roztroušená skleróza je autoimunitní, neurodegenerativní onemocnění centrálního nervového systému. Ten je napadán buňkami imunitního systému, které způsobují demyelinizaci jeho buněk. Postihuje populaci ve věku od 20. do 40. roků a její výskyt je častější u ţen neţ u muţů, a to přibliţně v poměru 1:2 (Debouverie et al., 2008). Jako největší autoantigen onemocnění byl určen základní myelinový protein, který je rozeznáván T-lymfocyty (Skarika et al., 2009), které aktivují imunitní reakci. Moţné sníţení specifické odpovědi na tento protein, můţe mít pozitivní léčebný efekt. První klinickou studii ke zmírnění autoimunitní odpovědi provedl Bar-Or et al. (2007), který vyuţil vektor BHT-3009. Jedná se o DNA vakcínu, která obsahuje gen pro základní myelinový protein. Tato studie prokázala bezpečnost a efektivitu vektoru BHT-3009 pro zvýšení antigen specifické tolerance k myelinovým proteinům u pacientů s roztroušenou sklerózou. Bylo pozorováno sníţení CD4+ T-lymfocytů, reagujících na myelin, z periferní krve a sníţení myelin specifických protilátek z mozkomíšního moku. Druhá fáze klinických pokusů (Garren et al., 2008) potvrdila předchozí výsledky, a navíc zaznamenala i pokles vzniku lézí. K výraznému sníţení myelin specifických protilátek došlo u pacientů, jimţ bylo podáno 0,5 mg BHT-3009. Zatím co u pacientů, kterým bylo podáno placebo či 1,5 mg BHT-3009, nebyly pozorovány změny. První a druhá klinická fáze vyuţití vektoru BHT-3009, prokázala jeho bezpečnost, dobrou snášenlivost pacienty a účinné navození imunitní tolerance k autoantigenu (Bar-Or et al., 2007; Garren et al., 2008). Celkové zmírnění poškození mozku po aplikaci vektoru BHT-3009 se ukazuje jako slibná cesta léčby roztroušené sklerózy.
29
6. ETICKÉ ASPEKTY GENOVÉ TERAPIE Genová terapie je nový a slibný přístup, který otvírá nové směry léčby lidských nemocí. Navzdory širokým léčivým moţnostem, které byly prokázány na zvířecích modelech, jsou pokusy na lidech uţ od počátku předmětem bouřlivých diskusí. Vlna nespokojenosti vzrostla po dvou případech úmrtí, které byly přímo zapříčiněny genovou terapií (Hacein-Bey-Abina et al, 2008; Raper et al, 2003). Jako kaţdý nový způsob léčby, tak i genová terapie podléhá pravidlům, jeţ jsou sepsány v Norimberském kodexu (1947) a Helsinské deklaraci (1964). Ty přesně stanovují etické aspekty při pokusech s lidskými subjekty a pravidla, která musí být při těchto pokusech dodrţena. Ovšem nejsou to jediná omezení, kterými se klinické testy genové terapie řídí. Kaţdý nově vzniklý protokol je nejprve přezkoumán komisí příslušné instituce a potom i národními komisemi. Aby byl protokol schválen, musí splňovat následující poţadavky: (1) přenášený gen musí být dobře charakterizován a klonován, (2) pouţitý vektor pro vnesení genu musí být účinný, (3) musí být řádně prozkoumána a minimalizována rizika pro pacienty plynoucí, z pouţití tohoto způsobu léčby, (4) nemoc nelze léčit jiným způsobem, (5) musí existovat výsledky z jiných studií, ať uţ na zvířecích modelech či lidských buňkách, které opravňují očekávat úspěch navrţené genové terapie. Protokol nebude schválen, pokud nesplní výše uvedené podmínky, které jsou přísnější od úmrtí Jesse Gelsingera (Raper et al., 2003), které způsobila silná imunitní reakce na pouţitý adenovirový vektor. Mezi největší rizika somatické genové terapie patří moţnost vzniku silné imunitní odpovědi na antigeny, které jsou přítomné na vektoru. Další riziko je moţnost vzniku mutací vyplývající z integrace transgenů. Současně je téţ somatická genová terapie spojená s rizikem přenosu na další osoby, ať uţ se jedná o přenos horizontální – pomocí infekce, či vertikální – a to nechtěným začleněním transgeního vektoru do pohlavních buněk. Pokud by však mohlo dojít k přenosu na jinou osobu, je třeba znovu přezkoumat celý postup léčby pacienta a v případě nutnosti jej změnit, či úplně zamítnout. Zatím co u somatické genové terapie jde hlavně o dosaţení co největší bezpečnosti pro pacienta a okolí, gametická genová terapie vyvolává obavy z nechtěné změny genetického kódu, která by se přenášela na další generace. Zde je však nutné si uvědomit, ţe na pohlavní buňky má vliv nejenom genová terapie, ale i jiné faktory, které jsou dnes jiţ běţně uţívané. Do podvědomí většiny lidí se genová terapie dostává pomocí televizní obrazovky. Postavy sci-fi seriálů a filmů jsou pomocí genové terapie měněny ve zcela nového jedince, bez terapeutického důvodu. To vyvolává otázku, zda jednou nebude moţné tuto změnu 30
provést i v realitě? Budeme si moci změnit barvu očí nebo pleti, či dokonce zasahovat i do inteligence a fyzické zdatnosti jedinců a tvořit tak “superlidi“? Je proto nutné, stanovit za jakých okolností bude moţno pouţít genovou terapii. Neměl by přijít okamţik, kdy se genová terapie změní v komerci, jako je tomu dnes u plastické chirurgie. Kromě výše uvedených etických aspektů bude v budoucnu hrát důleţitou roli i finanční stránka související s aplikací genové terapie, která je mnohem draţší neţ tradiční způsoby léčby. Je otázkou, kdo bude tento způsob léčby hradit? Pacient, či pojišťovna? Bude tento způsob léčby dostupný pro všechny? Nebo si jej budou moci dovolit pouze bohatí a zbytek populace bude nadále léčen současnými metodami? Kdo o tom všem bude rozhodovat? Proto a vše další je nutné si uvědomit, ţe genová terapie je pouze nástroj, který v rukou lidí můţe vést jak ku prospěchu, tak i ke zkáze.
31
7. ZÁVĚR Genová terapie je stále spíše jen experimentální metodou s příslibem do budoucna, neţ v praxi běţně vyuţívaným postupem. Doposud zatím nikdo nebyl pomocí genové terapie “vyléčen“ z genetické nemoci. V současné době se výzkum zaměřuje především na léčbu nemocí, které jsou způsobeny mutací určitých genů, neţ na komplexnější onemocnění způsobené zmnoţením či nedostatkem částí či celých chromozomů. Potenciální dostupnost genové terapie sebou přináší nejrůznější etické otázky, na které je třeba odpovědět. Je zřejmé, ţe je nutné ustanovit normy a zásady pro širší vyuţití genové terapie. Nemalým problémem pro širší vyuţití je i cenová nákladnost léčby. Závěrem je však moţné konstatovat, ţe i přes všechny současné nesnáze, potíţe a problémy lze uvaţovat o genové terapii jako o perspektivním konceptu budoucí moderní medicíny.
32
LITERATURA 1.
Al-Dosari, M.S. a Gao, X. 2009. Nonviral gene delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS journal. 11(4): 671-681. [Online]. DOI: 10.1208/s12248-009-9143-y.
2.
Bar-Or, A., Vollmet, T., Antel, J., Arnold, D.L., Borner, C.A., Campagnolo, D., Gianettoni, J., Jalili, F., Kuchuck, N., Lapierre, Y., Niino, M., Oger, J., Price, M., Rhodes, S., Robinson, W.H., Shi, F.D., Utz, P.J., Valone, F., Weiner, L., Steinman, L., Garren, H. 2007. Induction of antigen-specific tolerance in multiple sclerosis after immunization with DNA encoding myelin basic protein in a randomized, placebocontrolled phase ½ trial. Archive of neurology. 64(10): 1407-1415.
3.
Bett, A.J., Prevec, L., Graham, F.L. 1993. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors. Journal of virology. 67(10): 5911-5921.
4.
Bett, A.J., Haddara, W., Prevec, L., Graham, F.L. 1994. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertion or deletion in early regions 1 and 3. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 91: 8802-8806.
5.
Blaese, R.M., Culver, K.W., Miller, A.D., Carter, C.S., Fleisher, T., Clerici, M., Shearer, G., Chang, L., Chiang, Y., Tolstoshev, P., Greenblatt, J.J., Rosenberg, S.A., Klein, H., Berger, M., Mullen, C.A., Ramsey, W.J., Muul, L., Morgan, R.A., Anderson, W.F. 1995. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA SCID: Initial trial results after 4 years. Science. 270: 475-480.
6.
Brown, B.D., Venneri, M.A., Zingale, A., Sergi Sergi, S., Naldini L. 2006. Endogenous microRNA regulativ suppresses transgene expression in hematopoietic lineages and enables stable gene transfer. Nature medicine. 12(5): 585-591.
7.
Cai, X., Hagedorn, C.H., Cullen, B.R. 2004. Human microRNAs are propossed from capped, polyadenalated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10(12): 1957-1966.
8.
Cartier, N., Hacein-Bey-Abina, S., Bartholomae, C.C., Veres, G., Schmidt, M., Kutschera, I., Vidaud, M., Abel, U., Dal-Cortivo, L., Caccavelli, L., Mahlaoui, N., Kiermer, V., Mittelstaedt, D., Bellesme, C., Lahlou, N., Lefrère, F., Blanche, S., Audit, M., Payen, E., Leboulch, P., l´Homme, B., Bougnères, P., von Kalle, C., Fischer, A., Cavazzana-Calvo, M., Aubourg, P. 2009. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326: 818823. 33
9.
Conese, M., Ascenzioni, F., Boyd, A.C., Coutelle, C., de Fino, I., de Smedt, S., Rejman, J., Rosenecker, J., Schindelhauer, D., Scholte, B.J. 2011. Gene and cell therapy for cystic fibrosis: from bench to bedside. Journal of cystic fibrosis. 10 (Supplement 2): S114-S128.
10.
Connor, J., Yatvin, M.B., Huang, L. 1984. pH-sensitive liposomes: Acidinduced liposome fusion. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 81: 1715-1718.
11.
Costantini, F., Chada, K., Magram, J. 1986. Correction of murine β-thalessemia by gene transfer into the germ line. Science. 233(4769): 1192-1194.
12.
Dash, P., Lotan, I., Knapp, M., Kandel, E.R., Goelet, P. 1987. Selective elimination of mRNA in vivo: complementary oligodeoxynucleotides promote RNA degradation by an RNase H-like aktivity. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 84: 7896-7900.
13.
Debouverie, M., Pittion-Vouyovitch, S., Luis, S., Guillemin, F. 2008. Natural history of multiple sclerosis in a population-based cohort. European journal of neurology. 15: 916-921. Díaz-Hernández, M., Torres-Peraza, J., Salvatori-Abarca, A., Morán, M.A.,
14.
Gómez-Ramos, P., Alberch, J., Lucas, J.J. 2005. Full motor recorvery despote striatal neuron loss and formativ of irreversible amyloid-like inductions in a conditional mouse model of Huntington´s disease. The journal of neuroscience. 25(42): 97739781. 15.
Dobrikova, E.Y., Broadt, T., Poiley-Nelson, J., Yang, X., Soman, G., Giardina, S., Harris, R., Gromeier, M. 2008. Recombinant oncolytic poliovirus eliminates glioma in vivo without genetic adaptation to a pathogenic phenotype. Molecular therapy. 16(11): 1865-1872.
16.
Dűzgűneş, N. a Nir, S. 1999. Mechanisms and kinetics of liposome-cell interactions. Advanced drug delivery reviews. 40: 3-18.
17.
Elion, G.B., Furman, P.A., Fyfe, J.A., de Miranda, P., Beauchamp, L., Schaeffer, H.J. 1977. Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2hydroxyethoxymethyl)guanine. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 74(12): 5716-5720.
18.
Freeman, S.M., Abboud, C.N., Whartenby, K.A., Packman, C.H., Koeplin, D.S., Moolten, F.L., Abraham, G.N. 1993. The “bystander effect“: tumor regression
34
when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Research. 53(21): 5274-5283. Garren, H., Robinson, W.H., Krasulová, E., Havrdová, E., Nadj, C., Selmaj, K.,
19.
Losy, J., Nadj, I., Radue, E.W., Kidd, B.A., Gianettoni, J., Tersini, K., Utz, P.J., Valone, F., Steinman, L., BHT-3009 study group. 2008. Phase 2 trial of a DNA valine encoding myelin basic protein for multiple sclerosis. Annals of neurology. 63: 611620. 20.
Gene therapy clinical trials worldwide. In: Journal of gene medicine [online]. 2012
[cit.
2012-04-19].
Dostupné
z:
http://www.wiley.com//legacy/wileychi/genmed/clinical/ 21.
Greenleaf, W.J., Bolander, M.E., Sarkar, G., Goldring, M.B., Greenleaf, J.F. 1998. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in medicine and biology. 24(4): 587-595.
22.
Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N., Altmann, S. 1983. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell. 35: 849857.
23.
Hacein-Bey-Abina, S., von Kalle, C., Schmidt, M., Mccormack, M.P., Wulffraat, N., Leboulch, P., Lim, A., Osborne, O.S., Pawliuk, R., Morillon, E., Sorensen, R., Foster, P., Cohen, J.I., de Saint Basile, C., Alexander, I., Wintergerst, U., Frebourg, T., Aurias, A., Stoppa-Lyonnet, D. 2003. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302: 415-419.
24.
Hacein-Bay-Abina, S., Garrgue, A., Wang, G.P., Soulier, J., Lim, A., Morillon, E., Clappier, E., Caccavelli, L., Delabesse, E., Beldjord, K., Asnafi, V., Maclntyre, E., Dal Cortivo, L., Radford, I., Brousse, N., Sigaux, F., Moshous, D., Hauer, J., Borkhardt, A., Belohradsky, B.H., Wintergerst, U., Velez, M.C., Leiva, L., Sorensen, R., Wulffraat, N., Blanche, S., Bushman, F.D., Fischer, A., Cavazzana-Calvo, M. 2008. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The journal of clinical investigation. 118(9): 3132-3143.
25.
Heller, R., Cruz, Y., Heller, L.C., Gilbert, R.A., Jaroszeski, M.J. 2010. Electrically mediated delivery of plasmid DNA to the skin, usiong a multielectrode array. Human gene therapy. 21: 357-362.
26.
Heller, R., Shirley, S., Guo, S., Donate, A., Heller, L. 2011. Electroporation based gene therapy – from the bench to the bedside. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2011: 736-738. 35
27.
Chirmule, N., Propert, K.J., Magosin, S.A., Qian, Y., Wilson, J.M. 1999. Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humus. Gene therapy. 6: 1574-1583. Jaffé, A., Prasad, S.A., Larcher, V., Haat, S. 2006. Gene therapy for children
28.
with cystic fibrosis – who has tha right to choose?. Journal of medici ethics. 32(6): 361-364. 29.
Janik, J.E., Huston, M.M., Rose, J.A. 1981. Locations of adenovirus genes required for the replication of adenovirus-associated virus. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 78(3): 1925-1929.
30.
Jinek, M., Doudna, J.A. 2009. A free-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference. Nature. 457: 405-412.
31.
Kazuki, Y., Hoshiya, H., Takiguchi, M., Abe, S., Iida, Y, Osaki, M., Katoh, M., Hiratsuka, M., Shirayoshi, Y., Hiramatsu, K., Ueno, E., Kajitani, N., Yoshino, T., Kazuki, K., Ishihara, C., Takehara, S., Tsuji, S., Ejima, F., Toyoda, A., Sakaki, Y., Larionov, V., Kouprina, N., Oshimura, M. 2011. Refined human artificial chromosome vectors for gene therapy and animal transgenesis. Gene therapy. 18: 384393.
32.
Kremer, B., Goldberg, P., Andrew, S.E., Theilmann, J., Telenius, H., Zeisler, J., Squitieri, F., Lin, B., Bassett, A., Almqvist, E., Bird, T.D., Hayden, M.R. 1994. A worldwide study of the Huntington´s disease mutation. The sensitivity and specificity of measuring CAG repeats. The New England journal of medicine. 330(20): 1401-1406.
33.
Kuriyama, S., Sakamoto, T., Kikukawa, M., Nakatani, T., Toyokawa, Y., Tsujinoue, H., Ikenaka, K., Fukui, H., Tsujii, T. 1998. Expression of a retrovirally transduced gene under control of an internal housekeeping gene promoter does not persist due to methylation and is restored partially by 5-azacytidine treatment. Gene therapy. 5: 1299-1305.
34.
Landen Jr., C.N., Chavez-Reyes, A., Bucana, C., Schmandt, R., Deavers, M.T., Lopez-Berestein, G., Sood, A.K. 2005. Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer Research. 65(15): 6910-6918.
35.
Laufs, S., Gentner, B., Nagy, K.Z., Jauch, A., Benner, A., Naundorf, S., Kuehlcke, K., Schiedlmeier, B., Ho, A.D., Zeller, W.J., Fruehauf, S. 2003. Retroviral
36
vector integration occurs in preferred genomic targets of human bone marrowrepopulating cells. Blood. 101(6): 2191-2198. 36.
Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Rådmark, O., Kim, S., Kim, V.N. 2003. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature. 425: 415-419.
37.
Lee, Y., Kim, M., Han, J., Yeom, K.H., Lee, S., Beak, S.H., Kim, V.N. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. The EMBO journal. 23: 4051-4060.
38.
Levine, B.L., Humeau, L.M., Boyer, J., MacGregor, R.R., Rebello, T., Lu, X., Binder, G.K., Slepushkin, V., Lemaile, F., Mascola, J.R., Bushman, F.D., Drupulic, B., June, C.H. 2006. Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 103(46): 17372-17379.
39.
Lewis, P.F. a Emerman M. 1994. Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for Human immunideficiency virus. Journal of virology. 68(1): 510-516.
40.
Li, S.H. a Huang, L. 2006. Surface-modified LPD nanoparticles for tumor targeting. Annals of the New York academy of science. 1082: 1-8.
41.
Li, Y.S., Davison, E., Reid, C.N., McHale, A.P. 2009. Optimising ultrasoundmediated gene transfer (sonoporation) in vitro and prolonged expression of a transgene in vivo: Potencial applications for gene therapy of cancer. Cancer letters. 273: 62-69.
42.
Li, Z., Dűllmann, J., Schiedlmeier, B., SchmidtM., von Kalle, C., Meyer, J., Forster, M., Stocking, C., Wahlers, A., Frank, O., Ostertag, W., Kűhlcke, K., Eckert, H.G., Fehse, B., Baum, C. 2002. Murine leukemia induced by retroviral gene marking. Science. 296(5567): 497.
43.
Lu, M., Zhang, Q., Denq, M., Miao, J. Guo, Y., Gao, W., Cui, Q. 2008. An analysis of human microRNA and disease associations. PLoS One 3(10). [online]. DOI:10.1371/journal.pone.0003420.
44.
Maguire, A.M., Simonelli, F., Pierce, E.A., Pugh Jr, E.N., Mingozzi, F., Bennicelli, J., Banfi, S., Marshall, K.A., Testa, F., Surace, E.M., Rossi, S., Lyubarsky, A., Arruda, V.R., Konkle, B., Stone, E., Sun, J., Jacobs, J., dell´Osso, L., Hertle, R., Ma, J.X., Redmond, T.M., Zhu, X., Hauck, B., Zelenaia, O., Shindler, K.S., Maquire M.G., Wright, J.F., Volpe, N.J., McDonnell, J.W., Auricchio, A., High, K.A., Bennett,
37
J. 2008. Safety and efficacy of gene transfer for Leber´s congenital amaurosis. The New England journal of medicine. 358(21): 2240-2248. 45.
Manno, C.S., Pierce, G.F., Arruda, V.R., Glader, B., Raqni, M., Rasco, J.J., Ozelo, M.C., Hoots, K., Blatt, P., Konkle, B., Dake, M., Kaze, R., Razavi, M., Zajko, A., Zehnder, J., Rustaqi, P.K., Nakai, H., Chew, A., Leopard, D., Wright, J.F., Lessard, R.R., Sommer, J.M., Tigges, M., Sabatino, D., Luk, A., Jiang, H., Mingozzi, F., Couto, L., Ertl, H.C., High, K.A., Kay, M.A. 2006. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nature medicine. 12(3): 342-347.
46.
Mar, E.C., Chiou, J.F., Cheng, Y.C., Huang, E.S. 1985. Inhibition of cellular DNA polymerase α and human cytomegalovirus-induced DNA polymerase by the trifosphates
of
9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine
and
9-(1,3,dihydroxy-2-
propoxymethyl)guanine. Journal of virology. 53(3): 776-780. 47.
Matzura, H., Eckstein, F. 1968. A polyribonucleotide containing alternativ → P = O and →P = S linkages. European Journal of biochemistry. 3: 448-452.
48.
McConnell, M.J. a Imperiale, M.J. 2004. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Human gene therapy. 15: 1022-1033.
49.
Miao, C.H., Nakai, H., Thompson, A.R., Storm, T.A., Chiu, W., Snyder, R.O., Kay, M.A. 2000. Nonrandom transduction of recombinant adeno-associated virus vectors in mouse hepatocytes in vivo: cell cycling does not influence hepatocyte transduction. Journal of virology. 74(8): 9793-3803.
50.
Miller, D.G., Adam, M.A., Miller, A.D. 1990. Gene transfer by retrovirus vector occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and cellular biology. 10(8): 4239-4242.
51.
Miller,
W.H.
a
Miller,
R.L.
1980.
Phosporylation
of
acyclovir
(acycloguanosine) monophosphate by GMP kinase. Journal of biological chemismy. 255(15): 7204-7207. 52.
Mingozzi, F., Maus, M.V., Hui, D.J., Sabatino, D.E., Murphy, S.L., Rasko, J.E., Raqni, M.V., Manno, C.S., Sommer, J., Jianq, H., Pierce, G.F., Ertl, H.C., Hiqh, K.A. 2007. CD8(+) T-cell responses to adenoassociated virus capsid in humans. Nature medicine. 13(4): 419-422.
53.
Morgan, R.A., Dudley, M.E., Wunderlich, J.R., Hughes, M.S., Yang, J.C., Sherry, R.M., Royal, R.E., Topalian, S.L., Kammula, U.S., Restifo, N.P., Zheng, Z., Nahvi, A., de Vries C.R., Rogerst-Freezer, L.J., Mavroukakis, S.A., Rosemberg, S.A. 38
2006. Cancer regretion in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314(5796): 126-129. 54.
Morgan, R.A. 2012. Live and let die: A new suicide gene therapy moves to the clinic. Molecular therapy. 20(1): 11-13.
55.
Mulhbacher,
J.,
St-Pierre,
P.,
Lafontaine,
D.A.
2010.
Therapeutic
applicationsof ribozymes and riboswitches. Current opinion in pharmacology. 10: 551-556. 56.
Murray, J.B., Seyhan, A.A., Walter, N.G., Burke, J.M., Scott, W.G. 1998. The hammerhead, hairpin and VS ribozymes are catalytically proficient in monovalent cations alone. Chemistry & Biology. 5(10): 548-595.
57.
Naldini, L., Blőmer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F.H., Verma, I.M., Trono, D. 1996. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272: 263-267.
58.
Nathwani, A.C., Tuddenham, E.G., Rangarajan, S., Rosales, C., McIntrost, J., Linch, D.C., Chowdary, P., Riddell, A., Pie, A.J., Harrington, C., O´Beirne, J., Smithh, K., Pasi, J., Glader, B., Rustaqi, P., Nq, C.Y., Kay, M.A., Zhou, J., Spece, Y., Monton, C.L., Allay, J., Coleman, J., Sleep, S., Cunningham, J.M., Srivastava, D., Basner-Tschakarjan, E., Mingozzi, F., High K.A., Gray, J.T., Reiss, U.M., Neinhuis, A.W., Davidoff, A.M. 2011. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England journal of medicine. 365(25): 2357-2365.
59.
Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P.H. 1982. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1(7): 841-845.
60.
Nilsson, I.M., Berntorp, E., Lofqvist, T., Pettersson, H. 1992. Twenty-five years´ experience of prophylactic treatment in severe haemophilia A and B. Journal of internal medicine. 232: 25-32. In Habart, D. 2006. Nové obrazy v léčbě hemofilie – rekombinační a transgenní koncentráty, genová léčba a modifikované koagulační faktory. Časopis českých lékařů. 145(2): 104-111.
61.
O´Connor, T.P. a Crystal, R.G. 2006. Genetic medicine: treatment strategies for hereditary disorders. Nature reviews genetics. 7: 261-276.
62.
Pearson, S., Jia, H., Kandachi, K. 2004. China approves first gene therapy. Nature biotechnology. 22(1): 3-4.
63.
Ramalho, A.S., Beck, S., Meyer, M., Penque, D., Cutting, G.R., Amaral, M.D. 2002. Five percent of normal cystic fibrosis transmembrane conductance regulator 39
mRNA ameliorates the severity of pulmonary disease in cystic fibrosis. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27: 619-627. 64.
Raper, C.N., Lee, F.S., Wivel, N.A., Bagg, A., Gao, G.P., Wilson, J.M., Batshaw, M.L. 2003. Fatal systematic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Molecular genetics and metabolism. 80(1-2): 148-158.
65.
Robb, G.B., Brown, K.M., Khurana, J., Rana, T.M. 2005. Specific and potent RNAi in the nukleus of human cells. Nature structural & molecular biology. 12(2): 133-137.
66.
Roos, R.A. 2010 Hungtington´s disease: a clinical review. Orphanet journal of rare diseases. 5: 40. [online]. Doi:10.1186/1750-1172-5-40.
67.
Samulski, R.J., Zhu, X., Xiao, X., Brook, J.D., Housman, D.E., Epstein, N., Hunter, L.A. 1991. Targeted integration of adeno-associated virus (AAV) into human chromosome 19. The EMBO Journal. 10: 3941-3950.
68.
Skarika, M., Wang, T., McCadden, E., Kardian, D., Calabresi, P.A., Small, D., Whartenby, K.A. 2009. Signal transduction inhibition of APCs diminidhes Th17 and Th1 responses in experimental autoimmune encefalomyelitis. The Journal of imunology. 182: 4192-4199.
69.
Smith, K.R. 2003. Gene therapy: Theoretical and bioethical concepts. Archives of medical research. 34: 247-268.
70.
Stahley, M.R., a Strobel, S.A. 2005. Structural evidence for a two-metal-ion mechanism of group I intron splicing. Science. 309: 1587-1590.
71.
Tanaka, T., Yamasaki, H., Mensil M. 2001. Induction of a bystander effect in HeLa cells by using a bigenic vector carving viral thymidine kinase and connexin32 genes. Molecular carcinogenesis. 30: 176-180.
72.
Wang, G.P., Levine, B.L., Binder, G.K., Berry, C.C., Malani, N., McGarrity, G., Tebas, P., June, C.H., Bushman, F.D. 2009. Analysis of lentiviral vector integration in HIV+ study subjects receiving autologous infusions of gene modified CD4+ T cells. Molecular therapy. 17(5): 844-850.
73.
Wang, Z., Rao, D.D., Senzer, N., Nemunaitis, J. 2011. RNA Interference and cancer therapy.
74.
Watts, J.K. a Corey, D.R. 2012. Silencing disease genes in the laboratory and the clinic. Journal of patology. 226: 365-379.
40
75.
Wei, C.M., Gibson, M., Spear, P.G., Scolnick, E.M. 1981. Construction and isolation of a transmissible retrovirus containing the src gene of Harvey murine sarcoma virus and the tymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1. Journal of virology. 39: 935-944.
76.
Weng, D.E., Masci, P.A., Radka, S.F., Jackson, T.E., Weiss, P.A., Ganapathi, R., Elson, P.J., Capra, W.B., Parker, V.P., Lockridge, J.A., Cowens, J.W., Usman, N., Borden, E.C. 2005. A phase I clinical trial of a ribozome-based angiogenesis inhibitor targeting vascular endothelial growth factor receptor-1 for patients with refraktory solid tumors. Molecular cancer therapeutics. 4(6): 948-955.
77.
Wilson, J.M. 1996. Adenoviruses as gene-delivery vehicles. The New England journal of medicine. 334: 1185-1187.
78.
Yamamoto, A., Lucas, J.J., Hen, R. 2000. Reversal of neuropatology and motor dysfunction in a conditional model of Huntington´s disease. Cell. 101: 57-66. Yang, Y., Nunes, F.A., Berencsi, K., Furth, E.E., Gőnczől, Wilson, J.M. 1994.
79.
Cellular imunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceeding of the national academy of science of the United Stades of America. 91:4407-4411. 80.
Yi, R., Qin, Y., Macara, I.G., Cullen, B.R. 2003. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short naivin RNAs. Gene & development. 17: 3011-3016.
81.
Zallen, D.T. 2000. US gene therapy in crisis. Trends in genetics. 16(6): 272275.
82.
Zaug, A.J. a Cech, T.R. 1986. The intervening sequence RNA of Tetrahymena is an enzyme. Science. 231:470-475.
83.
Zhang, Y., Calon, F., Zhu, C., Boado, R.J., Pardridge, W.M. 2003. Intravenous nonviral gene therapy causes normalization of striatal tyrosine hydroxylace and reversal of motor impairment in experimental parkinsonism. Human gene therapy. 14: 1-12.
41