MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Brno 2014

Petra Macigová

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

VZÁCNÉ MIKRODELEČNÍ SYNDROMY DETEKOVANÉ POMOCÍ MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÝCH METOD Bakalářská práce

Petra Macigová

Brno 2014

VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Hana Filková

G

Bibliografický záznam Autor:

Petra Macigová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Vzácné mikrodeleční syndromy detekované pomocí molekulárně cytogenetických metod

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce:

Mgr. Hana Filková

Akademický rok:

2014

Počet stran:

49

Klíčová slova:

Mentální retardace; mikrodeleční syndrom; klinická genetika; array-CGH; FISH; MLPA

Bibliographic Entry Author:

Petra Macigová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Rare microdeletion syndromes detected by molecular cytogenetic methods

Degree Programme: Experimental Biology Field of Study:

Molecular Biology and Genetics

Supervisor:

Mgr. Hana Filková

Academic Year:

2014

Number of Pages:

49

Keywords:

Mental retardation; microdeletion syndrome; genetics in medicine; array-CGH; FISH; MLPA

Abstrakt Tato práce se zabývá mikrodelečními syndromy a možnostmi jejich detekce. Úvodní část práce ve stručnosti shrnuje současné možnosti klinické genetiky při odhalování těchto aberací, přičemž se detailněji věnuje konkrétním metodám používaným na Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno. Je zde popsán princip, na kterém jednotlivé metody fungují, jejich výhody a omezení. V hlavní části práce jsou rozebrány konkrétní mikrodeleční syndromy, které byly vybrány na základě konzultace s vedoucí bakalářské práce. Závěrečná část přibližuje roli prenatálního vyšetření na tyto genetické abnormality a přináší ukázku použití světových databází při interpretaci popsaných delecí.

Abstract This thesis is focused on the microdeletion syndromes and the possibilities of their detection. The opening part of the thesis briefly summarises current possibilities of genetics in medicine for detecting these aberrations with detailed description of particular methods used by Department of Medical Genetics at University Hospital Brno. The principles of the methods are described, as well as their advantages and limitations. In the main body of this thesis, there are analysed particular microdeletion syndromes, which were chosen pursuant to agreement with the supervisor of the thesis. The final part mentions the role of prenatal testing for these genetic abnormalities and shows the use of world databases for interpretation of described deletions.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala své vedoucí bakalářské práce, Mgr. Haně Filkové, za odborné vedení, cenné komentáře a připomínky, poskytnutou literaturu a energii, kterou mi věnovala při zpracování tématu.

Obsah 1.

Úvod ................................................................................................................................. 12

2.

Metody pro detekci mikrodelečních syndromů ................................................................ 13 2.1.

2.1.1.

Princip FISH ....................................................................................................... 13

2.1.2.

Výhody a limitace FISH ..................................................................................... 15

2.2.

MLPA ........................................................................................................................ 15

2.2.1.

Princip metody MLPA ....................................................................................... 15

2.2.2.

Výhody a limitace metody MLPA ..................................................................... 17

2.3.

3.

FISH ........................................................................................................................... 13

Array-CGH ................................................................................................................ 17

2.3.1.

Princip array-CGH.............................................................................................. 17

2.3.2.

Výhody a limitace array-CGH............................................................................ 19

Vybrané mikrodeleční syndromy ..................................................................................... 20 3.1.

Mikrodeleční syndrom 1p36 (Slavotinek syndrom) .................................................. 20

3.1.1.

Základní charakteristika ..................................................................................... 20

3.1.2.

Klinické projevy ................................................................................................. 21

3.1.3.

Příčiny vzniku postižení ..................................................................................... 22

3.2.

Mikrodeleční syndrom 2q33.1 ................................................................................... 23

3.2.1.

Základní charakteristika ..................................................................................... 23

3.2.2.

Klinické projevy ................................................................................................. 24

3.2.2.1. 3.2.3.

Příčiny vzniku postižení ..................................................................................... 24

3.2.3.1. 3.3.

Vliv SATB2 na vznik rozštěpu patra ........................................................... 25

Mikrodeleční syndrom 5q14.3 ................................................................................... 26

3.3.1.

Základní charakteristika ..................................................................................... 26

3.3.2.

Klinické projevy ................................................................................................. 26

3.3.3.

Příčina vzniku postižení ..................................................................................... 27

3.3.3.1. 3.4.

4.

Robinova sekvence...................................................................................... 24

Gen MEF2C ................................................................................................ 28

Mikrodeleční syndrom 15q24 .................................................................................... 29

3.4.1.

Základní charakteristika ..................................................................................... 29

3.4.2.

Klinické projevy ................................................................................................. 30

3.4.3.

Mechanismus vzniku delece ............................................................................... 31

3.4.4.

Příčiny vzniku postižení ..................................................................................... 32

Současné možnosti prenatální detekce mikrodelečních syndromů .................................. 33

5.

Cytogenetické databáze .................................................................................................... 34 5.1.

DECIPHER ................................................................................................................ 34

5.2.

ECARUCA ................................................................................................................ 35

5.3.

ISCA .......................................................................................................................... 35

5.4.

OMIM ........................................................................................................................ 36

6.

Závěr ................................................................................................................................. 38

7.

Literatura .......................................................................................................................... 39

Seznam použitých zkratek array-CGH

array-comparative genomic hybridization; komparativní genomová hybridizace na mikročipu

AS

Angelmanův syndrom

BA1

brachial arch 1; první žaberní oblouk

BAC

bacterial artificial chromosome; umělý bakteriální chromozom

BP1

breakpoint 1; zlomový bod č. 1

BP2

breakpoint 2; zlomový bod č. 2

BP3

breakpoint 3; zlomový bod č. 3

cDNA

complementary DNA; komplementární DNA

CGH

comparative genomic hybridization; komparativní genomová hybridizace

CNV

copy number variation; změna v počtu kopií genů

CPLX3

complexin 3; gen pro komplexin 3 (lokus 15q24.1)

Cy3

cyanine dye 3; od cyaninu odvozené barvivo 3

Cy5

cyanine dye 5; od cyaninu odvozené barvivo 5

CYP11A1

cytochrome P450, Family 11, Subfamily A, Polypeptide 1; gen kódující protein ze skupiny cytochromů 450 (lokus 15q24.1)

EGF

epidermal growth factor; epidermální růstový faktor

FISH

fluorescence in situ hybridization; fluorescenční in situ hybridizace

FNP

frontonasal process; frontonasální výrůstek

GABRD

gamma-aminobutyric acid A receptor delta; gen kódující delta podjednotku receptoru kyseliny gama-aminomáselné (lokus 1p36.33)

GLS

glutaminase; gen kódující mitochondriální glutaminázu (lokus 2q32.2)

HOXA2

homeobox A2; gen kódující transkripční faktor (lokus 7p15.2)

ISCN

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature; Mezinárodní systém pro lidskou cytogenetickou nomenklaturu

KCNAB

voltage-gated K+ channel beta subunit; gen kódující iontové kanály pro draslík (lokus 1p36.31)

LCR

low copy repeats; krátké segmentové duplikace

LCR15q24A LCR15q24B LCR15q24C LCR15q24D LCR15q24E

jednotlivé zlomové body v lokusu 15q24

MASS1

G protein-coupled receptor 98; gen kódující receptor spojený s G proteinem (lokus 5q14.3)

MEF2

myocyte enhancer factor; rodina transkripčních faktorů

MEF2C

myocyte enhancer factor 2C; gen kódující faktor podporující myocyty (lokus 5q14.3)

MLPA

multiplex ligation-dependent probe amplification

MMP23B

matrix metallopeptidase 23B; gen kódující proteiny z rodiny matrix metalopeptidáz (lokus 1p36.33)

MRI

magnetic resonance imaging; magnetická rezonance

MYO1B

myosin IB, gen kódující myozin (lokus 2q32.3)

NCBI

National Center for Biotechnology Information; Národní centrum pro biotechnologické informace

PAC

P1-derived artificial chromosome; umělý P1-odvozený chromozom

PCR

polymerase chain reaction; polymerázová řetězová reakce

PH

periventricular heterotopia; periventrikulární heterotopie

PWS

Prader-Williho syndrom

RS

Robin sequence; Robinova sekvence

SATB2

SATB homeobox 2; gen pro protein vázající se na DNA (lokus 2q33.1)

SATB2

Special AT-rich sequence-binding protein 2; protein vázající se na sekvence DNA bohaté na adenin a tymin

SEMA7A

semaphorin 7A; gen pro semaforin 7A (lokus 15q24.1)

SIN3A

SIN3 transcription regulator family member A; gen kódující transkripční regulátor (lokus 15q24.2)

SNP

single nucleotide polymorphisms; jednonukleotidové polymorfismy

STRA6

stimulated by retinoic acid 6; gen kódující protein zapojený do metabolismu retinolu (lokus 15q24.1)

TMEFF2

transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2; gen pro transmembránový protein (lokus 2q32.3)

VWA1

von Willebrandt factor A domain containing 1; gen kódující doménu pro von Willebrandtův faktor (lokus 1p36.33)

YAC

yeast artificial chromosome; umělý kvasinkový chromozom

1. Úvod Mentální retardace různé závažnosti postihuje přibližně 2-3 % populace (Leonard a Wen, 2002). Nejčastější identifikovanou příčinou jejího vzniku jsou nejrůznější genetické abnormality, přičemž se uvádí (Stankiewicz a Beaudet, 2007), že jimi lze vysvětlit 40-60 % případů mentální retardace a opožděného vývoje. Vznik a následný prudký vývoj molekulárně cytogenetických metod analýzy lidského genomu výrazně napomohly k odhalení řady do té doby neznámých genetických odchylek, které jsou příčinou tohoto postižení. Významnou a rychle rostoucí skupinou těchto abnormalit jsou právě mikrodeleční syndromy. Pod pojmem mikrodeleční syndrom se rozumí absence úseku chromozomu, která je pro svou malou velikost nezachytitelná konvenčními cytogenetickými metodami (Nussbaum et al., 2004). Zatímco některé mikrodeleční syndromy, které byly identifikovány na základě charakteristických fenotypových rysů, jako například Prader-Williho nebo Angelmanův syndrom, jsou již dobře známé a poměrně snadno rozpoznatelné, zde vybrané syndromy byly objeveny v průběhu několika posledních let, vesměs pomocí komparativní genomové hybridizace na mikročipu. Dalším společným znakem zvolených syndromů je jejich dopad na vznik mentální retardace a vzácný výskyt, který je činí pro vyšetřujícího lékaře obtížněji rozpoznatelnými. V souvislosti s rychle se zvětšujícím počtem nalezených mikrodelecí bylo potřeba vytvořit celosvětové databáze, které slouží ke sdílení nalezených abnormalit a jsou nezbytným pomocníkem při vyhodnocování role delece na vznik postižení (de Leeuw et al., 2012). V současné době existuje těchto databází celá řada a vzájemně se liší mírou přístupnosti veřejnosti či konkrétní oblastí svého zájmu. Hlavním cílem této bakalářské práce je základní charakteristika metod, které jsou pro detekci mikrodelecí používány, včetně jejich hlavního přínosu, a naopak limitací jejich využití. Dále se zaměřuji na čtyři vybrané mikrodeleční syndromy, které splňují výše uvedená kritéria. Opomenuta není také možnost prenatální detekce mikrodelečních syndromů, ačkoliv ta je kvůli jejich vzácné povaze stále velmi omezená. V závěru práce přináším stručný přehled databází, které jsou používány při hodnocení cytogenetických nálezů.

12

2. Metody pro detekci mikrodelečních syndromů Během posledních let došlo k prudkému rozvoji diagnostických nástrojů používaných pro detekci chromozomových aberací. Nově zapojené metody umožňují rychlejší a přesnější detekci přítomných abnormalit. Snižující se finanční náklady navíc napomohly zavedení těchto metod do klinické praxe. V ní dnes patří při odhalování mikrodelecí mezi nejpoužívanější fluorescenční in situ hybridizace (FISH, fluorescence in situ hybridization), dále metoda známá pod názvem multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) a komparativní genomová hybridizace na mikročipu (array-CGH, array-comparative genomic hybridization).

2.1. FISH FISH se řadí mezi přímé zobrazovací metody, jelikož umožňuje zobrazit pozici daného genu nebo úseku genomu přímo na konkrétním chromozomu (Nussbaum et al., 2004). Tuto techniku lze využít na metafázních i interfázních buňkách a umožňuje rychlou a snadnou detekci daného chromozomového úseku. Používání fluorescenčních barviv namísto předchozího radioaktivního značení sond a zvyšující se dostupnost fluorescenčních mikroskopů značně napomohly širokému používání metody, která dnes patří k základním požadavkům při klinické diagnostice chromozomových aberací.

2.1.1. Princip FISH Základem techniky FISH je denaturace a následná kohybridizace testované DNA a fluorescenčně značené sondy přímo na podložním sklíčku – odtud název in situ, neboli na místě (Speicher et al., 2010). Sondou je fluorescenčně značená krátká sekvence DNA, která je denaturována společně s testovaným vzorkem. Komplementarita bází po skončení denaturace umožní hybridizaci sondy k vybranému úseku testované DNA (Obr. 1). Přebytečná a nespecificky navázaná sonda je poté odmyta. Používané sondy se dělí do několika typů. K detekci mikrodelecí se využívají sondy genově specifické nebo lokus-specifické. Ty umožňují vyšetřit absenci konkrétního genu jak na metafázních chromozomech, tak i v interfázních buňkách. Pro určení počtu daného chromozomu nebo ověření přítomnosti telomer se používají sondy pro repetitivní sekvence, jež hybridizují k DNA v oblasti centromer, telomer, nebo heterochromatinu. Poslední skupinou jsou celochromozomové sondy, které se používají k barvení celých chromozomů nebo jejich jednotlivých ramének během metafáze, a slouží například k určení původu 13

markerových

chromozomů.

Ke

značení

sond

se

běžně

používají

fluorochromy

SpectrumOrange, SpectrumGreen či SpectrumRed.

Obrázek 1: Princip FISH (http://chewyueming.wix.com/fish-technique; upraveno). Použitá sonda je nejprve označena patřičnými fluorochromy, poté je spolu s testovaným vzorkem denaturována a hybridizována. V důsledku komplementarity bází se hybridizuje k předem známému úseku, jehož přítomnost je poté zjištěna během vyhodnocení signálů za použití fluorescenčního mikroskopu. Potvrzení delece je provedeno odečítáním signálů při použití fluorescenčního mikroskopu. Při identifikaci mikrodelecí se standardně používá jedna kontrolní sonda na daném chromozomu a druhá sonda pro specifickou oblast téhož chromozomu, na jejíž deleci je podezření. Přítomnost kontrolní sondy zajišťuje, že případně zjištěná delece specifické oblasti nebude zapříčiněna nepřítomností celého chromozomu, na němž se daný region nachází, ale absence specifického signálu bude skutečně důsledkem mikrodelece vyšetřované oblasti (Obr. 2; de Ravel et al., 2007).

Obrázek 2: Odečítání signálů při FISH (de Ravel et al., 2007; upraveno). Na dvou snímcích jsou porovnány vzorky, z nichž jeden (a) je bez patologie, zatímco u druhého (b) byla takto 14

potvrzena mikrodelece. Přítomnost vyšetřovaného chromozomu č. 22 je ověřena kontrolní sondou (zelená barva), konkrétní oblast, která v případě mikrodelece chybí, je značená červeně. Na druhém snímku (b) je možné pozorovat jeden chromozom bez delece a druhý bez červeného signálu, tedy s delecí.

2.1.2. Výhody a limitace FISH Na rozdíl od dalších zmíněných metod umožňuje FISH kromě delecí a duplikací zachytit také balancované přestavby (Nussbaum et al., 2004). Je proto možné s jejím využitím detekovat inzerce a translokace, které by při použití jiných metod unikly zachycení. Zásadní omezení pro použití této metody spočívá v maximálním možném rozlišení, kterého je možno dosáhnout. V případě metafázních nebo prometafázních chromozomů, na kterých je FISH při detekci mikrodelecí použita, se rozlišovací schopnost udává 100 kb. Další nevýhodou je potřeba znát předem pozici, ve které se hledaná mikrodelece nachází. Proto se FISH používá spíše k ověření delecí, které byly objeveny při array-CGH nebo MLPA analýze, popřípadě při podezření na konkrétní známý mikrodeleční syndrom. Další důležitou podmínkou pro úspěšné potvrzení delece za použití FISH je existence fluorescenčně značené sondy pro vyšetřovanou oblast genomu. Tento problém je již dnes překonán, jelikož je možné díky znalosti sekvence celého genomu vyrobit sondu pro kterýkoliv lokus.

2.2. MLPA MLPA je další z metod, která je používána pro měření změn v počtu kopií genů (CNV, copy number variation). Je založena na porovnávání množství specificky navázaných sond, které jsou následně amplifikovány během polymerázové řetězové reakce (PCR, polymerase chain reaction) pomocí jediného páru univerzálních primerů (Speicher et al., 2010). Tato metoda je velmi citlivá a jedná se o rychlou alternativu k mnohonásobné PCR. Může být využita při posuzování CNV v izolované DNA ze vzorků krve, choriových klků a tkání uchovávaných v parafínu (Schouten et al., 2002).

2.2.1. Princip metody MLPA Při použití metody MLPA je testovaná genomová DNA hybridizována v roztoku k sadě sond (Janssen et al., 2005). Každá z těchto sond má dvě části. První část sestává ze specifické cílové sekvence o délce 20-30 nukleotidů, která je připojena k sekvenci fluorescenčně značeného univerzálního primeru. Tato část sondy může být vytvořena 15

synteticky. Druhá část obsahuje taktéž na jednom konci specifickou cílovou sekvenci, jejíž délka je 25-43 nukleotidů, a na konci druhém se opět nachází univerzální primer. Tato druhá část má ovšem variabilní délku, která je dána náhodně dlouhým fragmentem mezi cílovou sekvencí a primerem. Tento fragment o délce 19-370 nukleotidů je nezbytný k vytvoření odlišných velikostí výsledných sond, což umožní jejich odlišení během následné elektroforézy. Větší část sondy je získávána klonováním cílové specifické sekvence do vektoru odvozeného z bakteriofága M13, který již obsahuje fragment s variabilní délkou. Obě části sondy jsou navrženy tak, aby se jejich cílové specifické sekvence vázaly u zdravého jedince na sousedící úseky DNA a mohly být poté spojeny ligázou (Speicher et al., 2010). Po ligaci je vytvořena jediná souvislá sonda, která je obklopena univerzálními primery. Ty umožňují amplifikaci při PCR, zatímco sondy, jejichž části nebyly ligázou spojeny, nemohou být amplifikovány, a tudíž není potřeba přebytečné sondy odmýt. Po amplifikaci je zjištěné množství sondy, u které byla ligace úspěšná, přímo úměrné počtu kopií cílové sekvence. Intenzita fluorescence je pro jednotlivé sondy vyhodnocena softwarem, který umožní jejich znázornění do grafu. Relativní výška vrcholu, která je v grafu vynesena pro každou použitou sondu, poté indikuje deleci nebo naopak duplikaci cílové sekvence (Obr. 3; Schouten et al., 2002).

Obrázek 3: Princip analýzy pomocí metody MLPA (Schouten et al., 2002; upraveno). Zjednodušené schéma znázorňuje kroky během detekce delece metodou MLPA. Sonda se 16

skládá ze dvou částí, po jejich hybridizaci následuje spojení obou částí ligací. Zde jsou znázorněny sondy pro dvě různá místa, které se odlišují délkou vmezeřeného fragmentu. Ten je důležitý pro jejich rozlišení během následné elektroforézy produktů amplifikace.

2.2.2. Výhody a limitace metody MLPA Metoda MLPA umožňuje zaznamenat delece a duplikace, které jsou menšího rozsahu a unikly by proto identifikaci při FISH. V současné době je její hlavní výhodou možnost analyzovat velké množství vzorků najednou. Velkým přínosem je taktéž velmi nízký požadavek na množství DNA, které je pro úspěšné vyšetření potřeba pouze 20 ng. Při použití této metody je hlavní omezení v nutnosti znát cílové místo očekávané delece. Použité sondy během jedné reakce nepokrývají rovnoměrně celý genom, ale najednou lze vyšetřovat maximálně 40 různých lokusů. Pokud se tedy delece, která zapříčinila postižení, nenachází v oblasti pokryté použitými sondami, unikne zachycení touto metodou. Není rovněž možné zaznamenat balancované přestavby, jako například inverze a translokace. Výsledky z MLPA analýzy mohou být také ovlivněny výskytem jednonukleotidových polymorfismů (SNP, single nucleotide polymorphisms). Malá velikost specifické sekvence sondy (20-30 nukleotidů) znamená, že nedokonalé párování ve vazebném místě může zcela zabránit hybridizaci sondy. V důsledku toho nedojde k ligační reakci, a tudíž ani k detekci sondy, což vede k chybné interpretaci a vyhodnocení dané oblasti jako regionu s delecí, přestože došlo pouze k záměně v jediné bázi.

2.3. Array-CGH Nahrazení metafázních chromozomů při konvenční komparativní genomové hybridizaci (CGH, comparative genomic hybridization) za mikročip s uspořádanou sadou definovaných cílových sekvencí umožnilo vznik metody array-CGH (Pollack et al., 1999). Tato technika pro detekci CNV se postupně stává základním a rutinním diagnostickým nástrojem v klinické genetice. Možnost automatizace, vysoké efektivity, reprodukovatelnosti výsledků a přesného zmapování aberací je významným příslibem pro další rozvoj této metody do budoucna. V současné době jsou dostupné mikročipy pro celogenomový screening i pro detailní analýzu vybraných úseků genomu.

2.3.1. Princip array-CGH Při detekci mikrodelecí za použití array-CGH je nejprve shodné množství testované a kontrolní DNA označeno odlišnými fluorescenčními barvami (Solinas-Toldo et al., 1997). 17

Mezi nejpoužívanější patří zelené od cyaninu odvozené barvivo 3 (Cy3, cyanine dye 3) pro označení testovaného vzorku a červené od cyaninu odvozené barvivo 5 (Cy5, cyanine dye 5), jímž je označen kontrolní vzorek. Takto označená DNA je poté společně hybridizována na mikročipu sestávajícího z cílových sekvencí lidského genomu. Použité sekvence mohou být přítomny ve formě umělých kvasinkových chromozomů (YAC, yeast artificial chromosome), umělých P1-odvozených chromozomů (PAC, P1-derived artificial chromosome), umělých bakteriálních chromozomů (BAC, bacterial

artificial

chromosome), jako komplementární DNA geny (cDNA, complementary DNA) nebo mohou být použity oligonukleotidy. Po skončení hybridizace je mikročip nasnímán speciálním scannerem a software vyhodnotí intenzitu fluorescence červeného a zeleného fluorochromu v jednotlivých pozicích mikročipu. Sekvence, v nichž je intenzita signálů obou barev shodná, jsou vyhodnoceny jako regiony bez změny množství DNA. Změna poměru intenzit mezi Cy3 a Cy5 pak indikuje ztrátu nebo naopak zisk daného úseku testované DNA. Zjednodušené schéma této metody je uvedeno níže (Obr. 4; Shinawi a Cheung, 2008). Takto zjištěné změny mohou být ověřeny dalšími cytogenetickými a molekulárními metody, například výše zmíněnou metafázní či interfázní FISH, PCR nebo metodou MLPA.

Obrázek 4: Zjednodušené schéma metody array-CGH (Shinawi a Cheung, 2008; upraveno). (a) Rozdílně označený testovaný a kontrolní vzorek jsou spolu hybridizovány na sekvence 18

umístěné na mikročipu a poté jsou nasnímány scannerem. (b) Ukázka laserového scanneru používaného při array-CGH. (c) Obrázek vzniklý po nasnímání mikročipu. (d) Výsledkem je array profil, zde se zobrazenou delecí v oblasti chromozomu č. 17.

2.3.2. Výhody a limitace array-CGH Hlavním přínosem array-CGH je výrazné zlepšení rozlišovací schopnosti v porovnání s klasickou CGH (Solinas-Toldo et al., 1997). Ta je tím vyšší, čím větší počet kratších fragmentů je použit k pokrytí celého genomu (Pinkel et al., 1998). S používáním stále většího množství fragmentů je teoreticky možné dosáhnout rozlišení až na úrovni jednotlivých nukleotidů. Zvyšující se rozlišení také umožňuje určit přesněji polohu zlomových bodů. Z dalších výhod je možné jmenovat zjištění CNV v rámci celého genomu během jediné hybridizační reakce. Je tedy možné identifikovat mikrodeleci, jež je příčinou postižení, bez potřeby znát předem její umístění. Stejně jako ostatní techniky používané v klinické diagnostice, také metoda array-CGH má určité limitace. Touto metodou není možné identifikovat balancované přestavby, jakými jsou například translokace a inverze. Jelikož je pomocí array-CGH možné detekovat pouze CNV relativně ke zbytku DNA v testovaném vzorku, není možné takto zjistit ani polyploidii.

19

3. Vybrané mikrodeleční syndromy Mikrodeleční syndrom je definován jako delece části chromozomu, jejíž malý rozsah znemožňuje detekci prostřednictvím konvenčních cytogenetických metod. Cytogenetický základ rozpoznaných syndromů může být identifikován několika způsoby (Stankiewicz a Beaudet, 2007). Kromě tradičního přístupu, spočívajícího v porovnání chromozomových abnormalit u pacientů s podobnými rysy, se v posledních letech díky rozvoji metody arrayCGH stále více uplatňují techniky molekulárního screeningu. S jejich zlepšujícím se rozlišením se zvyšuje možnost určit přesně velikost delece a odhalit konkrétní deletované geny. To umožňuje provést lepší korelaci mezi zjištěnou aberací a klinickými projevy postižených pacientů. Většinou jsou nalezené delece individuální a jedinečné pro konkrétního pacienta, nevyskytují se opakovaně, a nejedná se tedy o syndromy (Speicher et al., 2010). Nicméně pomocí array-CGH bylo v nedávné době identifikováno několik nových mikrodelecí, které vznikají opakovaně ve stejné oblasti genomu, jsou charakteristické svými fenotypovými projevy, a je proto možné v těchto případech hovořit o mikrodelečních syndromech.

3.1. Mikrodeleční syndrom 1p36 (Slavotinek syndrom) 3.1.1. Základní charakteristika Četnost výskytu tohoto syndromu byla původně odhadnuta na 1 : 10 000 (Shapira et al., 1997). Později se ukázalo (Shaffer a Lupski, 2000), že minimálně 50 % případů nebylo původní genetickou analýzou odhaleno, a proto byla frekvence výskytu nově stanovena na 1 : 5000. Tím se mikrodeleční syndrom 1p36 stal jednou z nejčastějších doposud popsaných terminálních mikrodelecí. Někteří autoři uvádějí (Gajecka et al., 2007), že delece se vyskytuje se stejnou četností u žen i mužů. Jiní naopak tvrdí (Heilstedt et al., 2003), že její výskyt je častější u žen. Tato nesrovnalost je pravděpodobně způsobená malým počtem doposud zdokumentovaných případů. Jednotné jsou závěry studií v tom (Wu et al., 1999; Heilstedt et al., 2003; Giannikou et al., 2012), že u většiny pacientů (65 %) je chromozom s delecí mateřského původu. To může být způsobeno větší predispozicí ke zlomům v této oblasti během gametogeneze u žen (Wu et al., 1999), nebo může tato převaha odrážet systematické zkreslení způsobené větším přežitím plodů, které nesou deleci maternálního původu. Velikost deletovaného úseku je značně variabilní (Heilstedt et al., 2003) a může dosahovat od 1.5 kb až do velikosti přesahující 10.5 kb. Různá velikost delece souvisí s tím, 20

že u tohoto syndromu nebyl popsán jednotný zlomový bod a není ani zcela objasněn mechanismus vzniku zlomových bodů na rozdílných místech u různých pacientů. Z kohorty 80 postižených lidí (Wu et al., 1999) byla získána pozice 35 zlomových bodů, přičemž bylo zjištěno, že delece na chromozomu paternálního původu jsou výrazně větší. V 75 % případů zasahují oblast větší než 5 Mb, zatímco delece maternálního původu byly v 62,5 % případů menší než 5 Mb. Ačkoliv byl tento syndrom popsán původně jako terminální delece (Shapira et al., 1997; Wu et al., 1999), byla asi u 10 % případů zjištěna delece intersticiální (Heilstedt et al., 2003). V těchto případech k jejímu odhalení nestačí použití subtelomerových sond při metodě FISH, ale je nezbytné použít doplňkové sondy pro intersticiální oblasti. Kromě klasické delece je navíc v 17 % případů absence této oblasti způsobená vznikem derivovaného chromozomu č. 1 při nahrazení koncové části 1p jiným chromozomem.

3.1.2. Klinické projevy První rozsáhlejší studie, která detailně popsala mikrodeleční syndrom 1p36 (Shapira et al., 1997), umožnila vymezit fenotypové rysy u 14 pacientů, z nichž 13 mělo deleci 1p36 jako jedinou chromozomovou aberaci. Na tento výzkum bylo navázáno v roce 1999 (Wu et al., 1999), kdy bylo diagnostikováno dalších 16 pacientů. Výše uvedené výzkumy umožnily identifikovat prevalenci jednotlivých fenotypových znaků. Mezi nejčastější se řadí středně těžká až těžká mentální retardace a opožděný psychomotorický vývoj, které byly pozorovány u téměř 100 % popsaných případů. Dále jsou to velká čelní fontanela, hypotonie, opožděný růst během postnatálního období, vystupující brada, problémy se zrakem, epileptické záchvaty, široký kořen nosu, klinodaktylie (zakřivení malíčku směrem k ostatním prstům), nízko posazené uši a jejich asymetrie, problematické chování, ztluštělý ušní hlemýžď a hluboko zasazené oči (Obr. 5; Battaglia et al., 2008). Původně byl za příčinu vysoké fenotypové variability považován rodičovský původ chromozomu s delecí (Keppler-Noreuil et al., 1995). V tomto případě by byl rozdíl ve fenotypových projevech způsoben efektem imprintingu genů v dané oblasti. Následně bylo zjištěno (Shapira et al., 1997), že na výslednou úroveň postižení nemá rodičovský původ chromozomu žádný vliv. Důvodem odlišností projevů u jednotlivých pacientů je pravděpodobně rozdíl ve velikosti delece (Wu et al., 1999), ztráta rozdílných, na sebe přiléhajících genů či odmaskování konkrétní recesivní alely na příslušném úseku homologního chromozomu. Dále je také zvažován poziční efekt (Giannikou et al., 2012). Při něm je genová exprese ovlivněna umístěním genu vzhledem k ostatním genům a jeho pozicí 21

na chromozomu, a tedy delece určité oblasti může ovlivnit expresi vzdálenějších genů. Kromě toho může mikrodeleční syndrom 1p36 vykazovat variabilní expresivitu a neúplnou penetranci, což může být zapříčiněno epigenetickými vlivy nebo různými modifikačními faktory.

Obrázek 5: Fenotyp pacientky s delecí 1p36 (Battaglia et al., 2008; upraveno). (a) Je možné všimnout si mikrobrachycefalie (malá a široká hlava), rovného obočí, širokého a plochého kořene nosu, prodlouženého filtra a hypotonického obličeje. Dále je zobrazena (b), (c) brachydaktylie prstů a klinodaktylie malíčku.

3.1.3. Příčiny vzniku postižení Porovnáním fenotypu a genotypu bylo umožněno přiřadit konkrétní fenotypové rysy ke specifickým deletovaným intervalům na chromozomu (Giannikou et al., 2012). To vedlo k mnohem užšímu vymezení regionu, ve kterém se vyskytují geny, jejichž absence vede k pozorovaným znakům. Většina pacientů vykazuje větší množství popsaných projevů bez ohledu na to, jak proximálně delece zasahuje (Wu et al., 1999). Z toho bylo vyvozeno, že většina genů vztahujících se k charakteristickému fenotypu je umístěna na distální části chromozomu. Pro vnik epilepsie je zvažována významná role dvou deletovaných genů. Jsou jimi gen pro delta podjednotku receptoru kyseliny gama-aminomáselné (GABRD, gammaaminobutyric acid A receptor delta), jehož delece byla popsána u pacienta s častými záchvaty (Giannikou et al., 2012), a gen kódující iontové kanály pro draslík (KCNAB, voltage-gated K+ channel beta subunit). Tyto kanály jsou zapojeny do regulace uvolňování neurotransmiterů, srdečního tepu, excitability neuronů a kontrakcí hladkého svalstva. Ačkoliv může být absence tohoto genu rizikovým faktorem pro vznik epilepsie, nebyla jeho haploinsuficience u pacientů s epileptickými záchvaty prokázána. To značí, že delece KCNAB není jediným faktorem, který je za vznik epilepsie zodpovědný. 22

Mezi další významné geny v této oblasti patří gen, který kóduje enzymy z rodiny matrix metalopeptidáz (MMP23B, matrix metallopeptidase 23B) (Gajecka et al., 2007). Ty jsou zapojeny do chemického rozkladu extracelulární matrix a remodelace kostí. Byla také postulována jejich role v regulaci uzavírání lebečních švů. U pacientů s delecí distální oblasti chromozomu č. 1, která tento gen obsahuje, ale nebyl zaznamenán předčasný srůst lebečních švů. Na základě těchto nálezů bylo usouzeno, že samotná delece genu MMP23B není dostatečná ke vzniku kraniosynostózy. Z dalších genů, k jejichž deleci u tohoto syndromu dochází, se jeví jako významný gen pro doménu von Willebrandtova faktoru (VWA1, von Willebrandt factor A domain containing 1). Ten souvisí se strukturou a funkcí chrupavek a předpokládá se (Fitzgerald et al., 2002), že jeho delece je významným faktorem pro vzniku abnormalit kostry a chrupavek. Toto tvrzení je podpořeno skutečností, že mnoho pacientů s delecí 1p36 je postiženo malformacemi skeletu.

3.2. Mikrodeleční syndrom 2q33.1 3.2.1. Základní charakteristika Delece v regionu 2q33.1 je nejčastější intersticiální delecí postihující dlouhé rameno chromozomu č. 2. Ve většině popsaných případů (Young et al., 1983; Miyazaki et al., 1988; Van Buggenhout et al., 2005; Mencarelli et al., 2007) dochází ke vzniku delece de novo. V případech, kdy tato delece vznikla jako důsledek nebalancované komplexní translokace (Houdayer et al., 2001), byla naopak nebalancovaná sestava chromozomů zděděna od jednoho z rodičů, který byl nositelem balancované translokace. Z dostupných údajů (Van Buggenhout et al., 2005) není možné kvůli malému počtu případů objektivně zhodnotit, zda je častější maternální, nebo paternální původ postiženého chromozomu. Mezi jednotlivými autory se značně liší údaje o velikosti zjištěné delece, což může být způsobeno rozlišením metody, která byla pro detekci deletovaného úseku použita. Nejmenší zjištěná velikost (Urquhart et al., 2009) byla stanovena na 4.83 Mb v oblasti 2q33.1. Zde byla pro určení submikroskopických změn použita metoda array-CGH. Takto přesné určení umožňuje bližší korelaci mezi popsaným fenotypem a konkrétním deletovaným regionem, což je významné z hlediska porozumění roli různých genů ve vývoji. Za účelem bližšího studia zasažených genů byl vytvořen myší model této delece (Britanova et al., 2006). Jednalo se o první myší model pro studium známých lidských haploinsuficientních genových lokusů spojených s rozštěpem patra. To umožnilo identifikaci 23

konkrétních genů, jejichž absence je podstatná pro vznik charakteristických projevů tohoto syndromu.

3.2.2. Klinické projevy Mezi nejčastější znaky, kterými se tento syndrom vyznačuje (Van Buggenhout et al., 2005), patří rozštěp patra nebo vysoké patro, prenatální a postnatální růstová retardace, výrazný obličejový dysmorfismus, řídké vlasy, mikrognatie (malá ustupující brada), makroglosie (chorobně zvětšený jazyk), dakryocystitida (zánět slzného vaku), přetrvávající problémy s přijímáním potravy a tříselná kýla. Časté jsou také specifické poruchy chování, z nichž je možné jmenovat hyperaktivitu, chaotické chování, šťastnou povahu s náhlými záchvaty agrese a úzkosti, problémy se spánkem a sebemrzačení. Další autoři (Young et al., 1983; Miyazaki et al., 1988; Brewer et al., 1999; Mencarelli et al., 2007; de Ravel et al., 2009) zmiňují mikrocefalii, hypotonii, abnormální dencii, nízko posazené uši, úzké a dolů směřující oční štěrbiny, velmi tenký horní ret a zobákovitý nos. Časté jsou také abnormality genitálu u mužů, z nichž je možné jmenovat neúplné skrotum nebo širokou špičku penisu. Ačkoliv je popsaná mikrocefalie jedním z častých znaků, který se vyskytuje u lidí s touto delecí, byl zaznamenán případ dívky (Urquhart et al., 2009), u níž mikrocefalie nebyla přítomná. Vzhledem k menší velikosti deletovaného úseku bylo usouzeno, že geny, jejichž absence vede k tomuto fenotypu, leží mimo oblast chybějící v tomto konkrétním případu. 3.2.2.1. Robinova sekvence U některých postižených (Houdayer et al., 2001; Van Buggenhout et al., 2005) byly přítomné kraniocefální deformace označeny jako Robinova sekvence (RS, Robin sequence). RS je charakterizována jako rozštěp patra a mikrognatie, jejichž důsledkem vzniká glossoptóza, což je stav, kdy dochází k posunu jazyka dolů nebo k jeho zatažení (Jakobsen et al., 2006). Uvádí se, že vznik RS je spojen s abnormalitami na chromozomech č. 2, 11 a 17. RS může být přítomna jako izolovaný znak, a v tomto případě nese označení nesyndromatická, nebo se vyskytuje v přítomnosti dalších abnormálních nálezů. Její konkrétní projevy jsou často patogeneticky a fenotypově variabilní (Cohen, 1999).

3.2.3. Příčiny vzniku postižení Jedním z kandidátních genů na vznik onemocnění je gen pro transmembránový protein (TMEFF2, transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2) (Horie et al., 2000). K jeho expresi dochází převážně v mozku v oblasti kalózního tělesa 24

a hipokampu a vzniklý transmembránový protein je členem rodiny epidermálních růstových faktorů (EGF, epidermal growth factor). Byl zkoumán vliv tohoto proteinu na přežívání neuronů in vitro, přičemž bylo zjištěno, že v případě kortikálních neuronů je tento vliv zanedbatelný, ale dochází ke zvýšení přežívání neuronů v hipokampu a mezencefalu. K dalším genům, jejichž vliv na vznik popsaných projevů se zvažuje (Mencarelli et al., 2007), patří gen kódující mitochondriální glutaminázu (GLS, glutaminase), který má vliv na poruchy chování, a gen pro myozin (MYO1B, myosin IB), jenž je důležitý pro vývoj nervového systému a jeho správnou funkci. V posledních letech je pozornost zaměřená především na gen, jenž kóduje protein vázající se na DNA (SATB2, SATB homeobox 2). Předpokládá se také (Britanova et al., 2005), že SATB2 reprezentuje novou skupinu transkripčních regulátorů, které na úrovni chromatinu kontrolují diferenciaci neuronů do různých podtypů. 3.2.3.1. Vliv SATB2 na vznik rozštěpu patra SATB2 je považován za klíčový regulační faktor vývoje čelisti a patra (Britanova et al., 2006), jelikož kontroluje přežívání buněk ve vyvíjejících se oblastech, v nichž je exprimován. Jeho expresí vzniká protein vázající se na sekvence DNA bohaté na adenin a tymin (SATB2, Special AT-rich sequence-binding protein 2), který během skeletogeneze potlačuje expresi genu kódujícího transkripční faktor (HOXA2, homeobox A2), a naopak aktivuje některé geny specifické pro osteoblasty (Dobreva et al., 2006). To naznačuje, že SATB2 má úlohu jako molekulární uzel v transkripční síti regulující skeletogenezi. Absence funkčního SATB2 vede ke zvýšení apoptózy ve vysoce lokalizovaných oblastech kraniocefálního mezenchymu (Britanova et al., 2006). Byl proto zkoumán vliv nefunkční alely SATB2 na tvorbu lebky u myší (Britanova et al., 2006). V tomto výzkumu byla prokázána exprese SATB2 ve vyvíjejících se primordiích čelistí a během doplňujícího modelování mezenchymu ve spojení prvního žaberního oblouku (BA1, brachial arch 1) a mediálního frontonasálního výrůstku (FNP, frontonasal process). Myši SATB2+/- vykazovaly během fetálního a neonatálního stádia vývoje projevy brzkého nástupu kraniocefální dysmorfie, která je fenotypově velmi podobná té, jež je popsána u pacientů s delecí či translokací 2q33. Jednalo se o mírnou mikrocefalii, malá ústa, mikrognatii, variabilní hypodoncii řezáků a/nebo adoncii a rozštěp patra. V rozporu s tímto zjištěním je tvrzení (Dobreva et al., 2006), že odchylky od normálního fenotypu se projevily pouze u embryí SATB2-/-, nikoliv u jedinců SATB2+/-. Myší embrya SATB2-/- měla mnohonásobné kraniocefální defekty (Britanova et al., 2006; Dobreva et al., 2006), které zahrnovaly výrazné zdeformování mandibuly, zkrácení 25

nosních a maxilárních kostí, malformace jazyka a rozštěp patra. Postižení těchto jedinců bylo závažnější než u myší SATB2+/-. Význam tohoto genu na vznik rozštěpu patra a obličejových abnormalit byl potvrzen objevením de novo bodové mutace (Leoyklang et al., 2007) v exonu č. 6, která způsobila dokonce závažnější malformace, než jaké byly popsány u pacientů s haploinsuficiencí SATB2 způsobenou delecí úseku 2q32-33. Také u jedinců s translokací, při které se zlomový bod nacházel v regionu 2q32 (Brewer et al., 1999) došlo k narušení genu, což vyústilo v podobný klinický obraz jako u pacientů s klasickou delecí.

3.3. Mikrodeleční syndrom 5q14.3 3.3.1. Základní charakteristika Poprvé byla pomocí array-CGH absence úseku q14.3 pátého chromozomu zaznamenána v roce 2009 (Cardoso et al., 2009). Tehdy byla u tří nepříbuzných dětí odhalena delece o velikosti 6.3 Mb až 17 Mb. Prozatím nejmenší zjištěná delece dosahovala velikosti 140 kb (Nowakowska et al., 2010), naopak v případě nejrozsáhlejší delece měl chybějící úsek velikost 21 Mb (Tonk et al., 2011). Z porovnání všech doposud popsaných pacientů vyplývá, že tato delece se vždy vyskytovala de novo. Riziko opakování pro sourozence bylo stanoveno na 1 % (Zweier a Rauch, 2011) kvůli možnému mozaicismu v zárodečných buňkách jednoho z rodičů, ačkoliv rekurence u sourozenců postižených osob nebyla zaznamenána. Analýzou velikostí delecí a jejich zlomových bodů bylo potvrzeno (Le Meur et al., 2010), že nedochází k opakovanému výskytu shodných zlomových bodů. Z toho vyplývá, že tato přestavba není důsledkem nerovnoměrného crossing-overu nebo nehomologního spojení konců zlomů DNA. Přesný mechanismus vzniku delece zatím není znám.

3.3.2. Klinické projevy Tento syndrom je ve většině případů (Cardoso et al., 2009; Engels et al., 2009; Nowakowska et al., 2010; Zweier et al., 2010; Carr et al., 2011; Toral-López et al., 2012; Hotz et al., 2013; Sakai et al., 2013) spojen s těžkou mentální retardací, opožděným psychomotorickým vývojem, neschopností samostatné chůze a lehkým obličejovým dysmorfismem. Obličejové rysy zahrnují vysoké a široké čelo, hypertelorismus, vysoce klenuté obočí, plochý a zanořený kořen nosu a ploché a dlouhé filtrum. Z neurologických projevů je možné jmenovat epilepsii, febrilní křeče, poruchy autistického spektra a absenci 26

řeči. U tří postižených dětí byla zjištěna (Cardoso et al., 2009) periventrikulární heterotopie (PH, periventricular heterotopia), která ovšem nebyla zaznamenána v žádné následující studii. Při porovnání fenotypu a genotypu všech dosud popsaných případů se zjistilo (Zweier a Rauch, 2011), že jedinci s menšími delecemi nebo bodovými mutacemi v této oblasti mají větší šanci zvládnout samostatnou chůzi, jejich postižení je méně závažně a snižuje se riziko vzniku epilepsie. V rozporu s tímto závěrem je ovšem případ postižené dívky (Tonk et al., 2011), u které byla zjištěna zatím největší delece. I přesto, že chybějící úsek dosahuje velikosti 21 Mb, byla u této pacientky popsána pouze mírná mentální retardace a lehce opožděný motorický vývoj. Příčiny této nesrovnalosti dosud nebyly uspokojivě vysvětleny, ačkoliv se spekuluje o možném somatickém mozaicismu (Hotz et al., 2013), při kterém by delecí byly zasaženy pouze některé buňky. U některých pacientů byla provedena magnetická rezonance mozku (MRI, magnetic resonance imaging), která odhalila abnormality (Le Meur et al., 2010; Shimojima et al., 2012; Toral-López et al., 2012; Hotz et al., 2013), jako například agenezi kalózního tělesa, zvětšené laterální mozkové komory, redukovanou velikost čelního laloku a zmenšený objem bílé hmoty mozkové. Žádná ze zjištěných abnormalit se ale nezdá být specifická pro tento syndrom a zvažuje se (Novara et al., 2010), že se spíše jedná o sekundární důsledky epilepsie.

3.3.3. Příčina vzniku postižení Při prvním detailním popisu této mikrodelece byla velikost minimálního kritického regionu stanovena na 5.8 Mb (Cardoso et al., 2009). Vzhledem k příliš velkému rozsahu bylo obtížné určit, zda existuje hlavní gen, jehož absence by byla příčinou popsaných klinických projevů. Sekvenací bylo odhaleno, že ve společné deletované oblasti leží 14 genů, z nich 13 je ve vysoké míře exprimováno v mozku ve fetálním období a v některých specifických oblastech i v dospělosti. Porovnáním velikostí všech delecí se dospělo k závěru (Sakai et al., 2013), že největší význam v této oblasti má gen, který kóduje faktor podporující myocyty (MEF2C, myocyte enhancer factor 2C), jelikož byl deletován ve většině případů. Je pravděpodobné, že jeho haploinsuficience je zodpovědná za vznik těžké mentální retardace, hypotonie a epilepsie. Z dalších genů v této oblasti je významný lidský gen pro receptor spojený s G proteinem (MASS1, G protein-coupled receptor 98), který je spojován s febrilními křečemi (Nakayama et al., 2002). Jeho význam byl podpořen objevením nonsense mutace u rodiny s febrilními křečemi, přičemž u nikoho ze zdravých kontrol se tato mutace nevyskytovala. 27

Z pozorování vyplývá, že unikátní anomálie, které nejsou společné všem postiženým, se vyskytují pouze u pacientů, u kterých byly delecí kromě MEF2C postiženy i další geny. To podporuje jeho klíčový význam pro vznik pozorovaného fenotypu. 3.3.3.1. Gen MEF2C Gen MEF2C kóduje transkripční faktor, jenž reguluje vývoj svalů a kardiovaskulární vývoj a kontroluje vývoj kostí (Arnold et al., 2007). Jeho genový produkt patří do rodiny transkripčních faktorů MEF2 (Verzi et al., 2007), která má čtyři členy, a právě gen MEF2C je během vývoje exprimován jako první. Při výzkumu na myším modelu se navíc ukázalo, že tento gen má významnou roli v učení a paměti (Barbosa et al., 2008), jelikož zvyšuje plasticitu nervového systému. Do popředí zájmu se tento gen dostal poté, co byly popsány případy pacientů (Le Meur et al., 2010; Novara et al., 2010; Nowakowska et al., 2010), u nichž se jednalo o jediný gen zasažený delecí (Obr. 6; Hotz et al., 2013). Názor, že haploinsuficience MEF2C je příčinou pozorovaného fenotypu, byl podpořen objevením de novo mutace MEF2C u pacientů s mentální retardací (Zweier et al., 2010).

Obrázek 6: Velikost a pozice deletovaného úseku u vybraných pacientů (Hotz et al., 2013; upraveno). Z obrázku je patrné, že společným genem deletovaným u většiny pacientů je gen MEF2C, přičemž u některých se jedná o jediný chybějící gen. V případech, kdy MEF2C není delecí zasažen, je vzniklé postižení vysvětlováno pozičním efektem. 28

Pro potvrzení hypotézy, že se jedná o klíčový gen, byla jeho exprese měřena u dvou nově popsaných pacientů (Hotz et al., 2013). Naměřené hodnoty byly porovnány s dvěma zdravými kontrolami podobného věku, přičemž u obou pacientů byly na přibližně poloviční úrovni ve srovnání s kontrolami. Tím se potvrdila haploinsuficience tohoto genu. Zajímavostí je, že u některých pacientů není tento gen deletován (Cardoso et al., 2009; Engels et al., 2009; Shimojima et al., 2012). Jelikož v těchto případech neměl žádný z chybějících genů přímou korelaci s fenotypem a neurologické a dysmorfické rysy jsou shodné s pacienty, u nichž byla absence MEF2C potvrzena, je jediným možným vysvětlením vzniku postižení poziční efekt.

3.4. Mikrodeleční syndrom 15q24 3.4.1. Základní charakteristika S výjimkou mikrodelece zasahující oblast 15q11-q13, která vede ke vzniku PraderWilliho syndromu (PWS) nebo Angelmanova syndromu (AS), jsou delece na chromozomu č. 15 relativně vzácné (Cushman et al., 2005). Intersticiální mikrodelece regionu 15q24 byla poprvé detailně popsána v roce 2007 (Sharp et al., 2007) na skupině čtyř pacientů. Vzhledem k její submikroskopické velikosti byla nalezena za použití array-CGH a následně ověřena metodou FISH. Nalezení dalších osob s touto mikrodelecí (Klopocki et al., 2008; Andrieux et al., 2009; El-Hattab et al., 2009; Van Esch et al., 2009; Brun et al., 2012) umožnilo vymezit minimální kritický region o velikosti přibližně 1.75 Mb, jehož absence je klíčová pro vznik postižení. Tento minimální region je velmi bohatý na geny (Sharp et al., 2007), což může značně ztížit výběr specifického kandidátního genu, jenž by byl zodpovědný za klinické projevy pacientů. Výše uvedené studie prokázaly vznik delece de novo, pouze v jednom případě (ElHattab et al., 2009) nebylo možné kvůli absenci vzorku od otce vyloučit dědičný charakter mikrodelece. V případech, kdy byl zjišťován rodičovský původ postiženého chromozomu (Sharp et al., 2007) bylo zjištěno, že delece je vždy maternálního původu. Vzhledem k velmi malému počtu takto vyšetřovaných delecí je možné, že se jedná pouze o náhodu, ovšem výsledky nevylučují ani možnost genového imprintingu. Zatím ale není v této oblasti znám gen, který by mohl imprintingu podléhat.

29

3.4.2. Klinické projevy I přesto, že byla tato mikrodelece popsána teprve nedávno, jsou její projevy již velmi dobře zdokumentovány (Sharp et al., 2007). Bylo zjištěno, že i přes odlišnou velikost delece sdílí většina pacientů podobné znaky. Ve většině případů se jedná o prenatální a postnatální růstovou retardaci, mikrocefalii, abnormality prstů, ztrátu pojivové tkáně, opožděný psychomotorický vývoj, mírnou až těžkou mentální retardaci a charakteristické rysy v obličeji. Z obličejových rysů je možné jmenovat vysokou přední vlasovou linii, široké obočí, hypertelorismus, šikmo dolů směřující oční štěrbiny, široký kořen nosu, dlouhé a hladké filtrum či plný horní ret. S přibývajícím počtem zaznamenaných případů (Klopocki et al., 2008; Andrieux et al., 2009; Van Esch et al., 2009; Brun et al., 2012) se objevily další znaky, jejichž příčinou je s největší pravděpodobností tato delece. Jedná se o brániční a tříselnou kýlu, skoliózu, genitální anomálie u mužů, omezený vývoj řeči s problémy s artikulací, hyperaktivní a chaotické chování doprovázené výbuchy agrese, strabismus a velkou mandibulu. Objevení dalších pacientů s delecí v regionu 15q24 a přesné určení rozsahu delece prostřednictvím array-CGH umožnilo provést korelaci fenotypu a genotypu. Z takto získaných údajů vyplynulo (Andrieux et al., 2009), že u jedinců s menší delecí se některé výše popsané znaky nenachází. Konkrétně je možné zmínit pacienta s výrazně menší delecí, u něhož nebyla na rozdíl od ostatních přítomna hypospadie (vyústění močové trubice mimo žalud penisu). Na základě toho je možné předpokládat, že za vznik této genitální abnormality je zodpovědná oblast o velikosti přibližně 490 kb, ve které se nachází gen pro transkripční faktor (SIN3A, SIN3 transcription regulator family member A). Ten je významně exprimován v lidských varlatech a jeho nepřítomnost může být příčinou vzniku genitálních malformací. Ve stejné studii byl popsán také pacient s výrazně větší delecí, u kterého byl zaznamenán oboustranný kolobom duhovky a anorektální malformace. Jelikož byla v případě tohoto jedince pozice delece určená na úsek 15q23q24.2, jsou tyto poruchy dávány do souvislosti s úsekem 15q23. Dále bylo zjištěno (Sharp et al., 2007; Van Esch et al., 2009), že pacienti s vrozenou brániční kýlou mají oproti ostatním rozsáhlejší deleci, která zasahuje více k centromeře chromozomu a zasahuje téměř celý pruh 15q24.1. To naznačuje, že gen, jehož absence je zodpovědná za vznik kongenitální brániční kýly, leží v deletovaném regionu sdíleném pacienty z těchto dvou studií.

30

3.4.3. Mechanismus vzniku delece Za použití array-CGH bylo zjištěno (Sharp et al., 2007), že jednotliví pacienti často sdílí zlomové body delece. Nejprve došlo k identifikaci proximálního zlomového bodu, označeného jako zlomový bod č. 1 (BP1, breakpoint 1), distálního zlomového bodu, nazvaného zlomový bod č. 3 (BP3, breakpoint 3) a alternativního zlomového bodu, jenž nese označení zlomový bod č. 2 (BP2, breakpoint 2). Bližší popsání struktury úseku 15q24 (Sharp et al., 2006) umožnilo umístit polohu těchto zlomových bodů do oblastí krátkých segmentových duplikací (LCR, low copy repeats) s 95% sekvenční identitou. Tento poznatek naznačuje, že pravděpodobným mechanismem vzniku mikrodelece 15q24 je nerovnoměrný crossing-over. Během něj dochází k homologické rekombinaci mezi rozdílnými oblastmi LCR, čímž vzniká delece nebo duplikace oblasti, která se mezi zúčastněnými LCR nachází (Obr. 7; Bailey a Eichler, 2006). Později byly objeveny další dvě oblasti s vysokou sekvenční identitou (El-Hattab et al., 2009). Celkově je tedy zatím známo pět oblastí LCR, v nichž se nacházejí zlomové body pro tuto deleci. Ty byly v závislosti na jejich pořadí od centromery označeny LCR15q24A, LCR15q24B (BP1), LCR15q24C, LCR15q24D (BP2) a LCR15q24E (BP3). Zajímavostí je, že homologní podjednotky lokalizované v LCR15q24A a LCR15q24C jsou v přímé orientaci, zatímco podjednotky patřící do LCR15q24B a LCR15q24E mají orientaci opačnou. LCR15q24D má komplexní strukturu, ve které je většina podjednotek orientována shodně s LCR15q24A a LCR15q24C a pouze dvě malé podjednotky jsou orientovány shodně s LCR15q24B a LCR15q24E.

Obrázek 7: Nerovnoměrný crossing over (Bailey a Eichler, 2006; upraveno). Gen, k jehož deleci nebo duplikaci dochází (tmavě modrá), je při tomto procesu ohraničen oblastmi LCR s vysokou sekvenční identitou (žlutá a růžová). Pokud se párují vzájemně si neodpovídající LCR, dojde na jednom chromozomu ke ztrátě úseku mezi nimi, na druhém naopak k jeho zdvojení. Vzhledem k povaze mikrodelece 15q24 a výskytu zlomových bodů ve stejných pozicích byla předpovězena existence mikroduplikace této oblasti (Sharp et al., 2007). Ta 31

byla později skutečně popsána na dvou jedincích (Kiholm Lund et al., 2008; El-Hattab et al., 2009), u kterých byly pozorovány projevy podobné těm, které jsou charakteristické pro mikrodeleci 15q24. Tato podobnost podporuje názor, že mikroduplikace 15q24 může být skutečně zodpovědná za pozorovaný patologický fenotyp a pravděpodobně reprezentuje klinický syndrom s minimálním kritickým regionem o velikosti 1.33 Mb. Pro potvrzení, nebo zamítnutí této hypotézy je ovšem potřeba najít a vyšetřit více pacientů s podobnou duplikací.

3.4.4. Příčiny vzniku postižení V minimálním kritickém regionu o velikosti přibližně 1.75 Mb mezi LCR15q24B (BP1) a LCR15q24D (BP2) bylo identifikováno několik genů, jejichž absence může vysvětlit vznik jednotlivých projevů. Gen kódující protein zapojený do metabolismu retinolu (STRA6, stimulated by retinoic acid 6) je, jak již název napovídá, zapojen do dráhy kyseliny retinové (Pasutto et al., 2007) a porucha jeho funkce je spojena například s alveolární kapilární dysplazií. V případě genu kódující protein ze skupiny cytochromů 450 (CYP11A1, cytochrome P450, Family 11, Subfamily A, Polypeptide 1) bylo navrženo (Klopocki et al., 2008), že jeho haploinsuficience může vést k abnormalitám genitálií. Z dalších genů, které mají souvislost s nervovým systémem, a jejich ztráta může způsobit opožděný mentální vývoj, je možné jmenovat geny pro semaforin 7A (SEMA7A, semaphorin 7A) a komplexin 3 (CPLX3, complexin 3). Produkt genu CPLX3 funguje jako pozitivní regulátor uvolňování neurotransmiterů v hipokampálních neuronech (Reim et al., 2005). Semaforin 7A, který je kódovaný genem SEMA7A (Pasterkamp et al., 2003), působí pozitivně na růst axonů centrálních a periferních neuronů a je vyžadován pro správné propojení neuronů během embryonálního vývoje.

32

4. Současné možnosti prenatální detekce mikrodelečních syndromů Dlouhá léta byly za zlatý standard pro prenatální diagnostiku považovány pruhovací metody (Rickman et al., 2005). Zajišťovaly spolehlivá data při analýze lidského karyotypu a bylo možné takto současně posoudit výskyt chromozomových přestaveb v rámci celého genomu. Jejich velkou nevýhodou je ovšem pro potřeby odhalení mikrodelecí zcela nedostačující rozlišení, požadavek na vyhodnocení zkušeným genetikem a v neposlední řadě časová náročnost. Ta je dána potřebou získat dělící se buňky, kvůli čemuž trvá celý proces přibližně 14 dní. Pro účely prenatální diagnostiky bylo žádoucí tento čas výrazně zkrátit, zejména s ohledem na budoucí rodiče. Proto je úsilí směřováno k používání metod, které jsou schopné odhalit tyto odchylky bez kultivovaných buněk, v rámci celého genomu a s požadovanou přesností (Rickman et al., 2006). Dalším nezanedbatelným požadavkem je zkrácení doby vyšetření, a to v ideálním případě na 24-48 hodin. Jako ideální se k tomuto použití jeví metoda array-CGH. Vzhledem k tomu, že velká část CNV je neznámé etiologie, nebo je známo, že se jedná o běžný polymorfismus, není vhodné používat v prenatální diagnostice mikročipy s velkou hustotou sond v celém genomu (Bui et al., 2011). Namísto toho jsou volené takové mikročipy, kde je vysoká hustota sekvencí v oblastech se známými mikrodelečními syndromy a již s menší hustotou jsou cílové sekvence rozmístěny rovnoměrně ve zbytku genomu. V případě příliš vysoké citlivosti analýzy by totiž byly odhaleny odchylky, které nemají na zdraví a vývoj dítěte žádný vliv a jejich špatná interpretace by vedla pouze k vyššímu tlaku na rodiče nenarozeného dítěte. K posouzení, zda se array-CGH stane první volbou při prenatálních vyšetřeních, bude zapotřebí provést významnější studie, které odhalí případné slabiny nebo naopak výhody oproti dnes používaným postupům (Van den Veyver et al., 2009). Je také nutno zvážit, zda by měly takovéto vyšetření podstupovat všechny těhotné ženy, nebo pouze rizikové skupiny, jako je tomu u vyšetření používaných v současné době. Do rizikové skupiny jsou řazeny těhotné ženy vyššího věku, s abnormálním ultrazvukovým nebo sérologickým nálezem, s potvrzenou genetickou zátěží v rodině a také ty, u kterých již v minulosti došlo k samovolnému potratu nebo narození postiženého dítěte.

33

5. Cytogenetické databáze V důsledku zvyšování rozlišovací schopnosti používaných diagnostických metod a možnosti celogenomového screeningu došlo k zaznamenání chromozomových přestaveb, tedy i mikrodelecí, o velikostech, které předtím nebylo možné postihnout. Jelikož je mnoho aberací nalezených během cytogenetického vyšetření nově objevených nebo velmi vzácných, je jejich klinická interpretace velmi problematická (de Leeuw et al., 2012). Při posuzování nalezených změn u pacientů s mentální retardací, opožděným vývojem, dysmorfickými rysy či kongenitálními anomáliemi jsou často nalezeny mikrodelece, u nichž není jisté, zda se jedná o patogenní nález, nebo benigní polymorfismus (Rooney Riggs et al., 2013). Pro rozhodnutí, zda má objevená změna vliv na vznik postižení, je nutné porovnat charakteristické rysy daného pacienta s dalšími, kteří sdílí shodnou či podobnou deleci dané oblasti. Sporadický výskyt většiny zachycených delecí ale značně omezuje schopnost jednotlivých pracovišť provést toto porovnání a správně interpretovat nalezené odchylky. Pro vyřešení tohoto problému bylo nutné vytvořit celosvětové cytogenetické databáze, které popisují a katalogizují korelace mezi genotypem a fenotypem jednotlivých pacientů majících identické nebo alespoň podobné mikrodelece. Porovnáním dat z celého světa je pak možné nejen určit roli nalezené aberace na fenotyp pacienta, ale také lépe porozumět úloze jednotlivých genů během vývoje. Nejrozšířenějšími databázemi jsou v současné době DECIPHER, ECARUCA, ISCA a OMIM.

5.1. DECIPHER Vznik databáze DECIPHER se datuje do roku 2004 (Firth et al., 2009) a jedná se o online databázi mikroskopických abnormalit, která je přístupná zcela zdarma, a k dispozici je na adrese decipher.sanger.ac.uk. Jejím cílem je zajistit klinické a výzkumné nástroje pro interpretaci dat z cytogenetických analýz. Dále umožňuje posoudit, zda je nalezená odchylka běžnou variantou genomu, nebo se jedná o patologický nález. Spojením této databáze s genomovým prohlížečem Ensembl bylo využito dostupných genomových map k určení genů zahrnutých ve specifických mikrodelecích či jiných přestavbách. Dalším přínosem se stala spolupráce s klinickými genetiky a molekulárními cytogenetiky z jednotlivých zapojených center, což velmi urychlilo proces popisu nových syndromů a funkcí genů. DECIPHER umožňuje podle zadaných kritérií nalézt překryv s již známým syndromem, a také upozorní, zdali byla vyhledávaná aberace již dříve zaznamenána. Pokud ano, je 34

schopen porovnat fenotypy jednotlivých pacientů. To přináší velký pokrok, jelikož většina klinických genetiků se většinou setkala jen s malým počtem dobře rozpoznatelných syndromů, které jsou známy z doby před nástupem array-CGH, zatímco takto mohou u pacienta správně rozpoznat syndrom, který jim byl do té doby neznámý. Dále je databází při zadání oblasti mikrodelece vytvořen seznam genů v dané oblasti, přičemž je nabídnut přímý odkaz na literaturu týkající se klinicky významných genů. To umožňuje rozhodnout, do jaké míry může mít absence daného genu vliv na rozvoj popsaného fenotypu.

5.2. ECARUCA Databáze ECARUCA byla založena v roce 2003 za účelem zlepšení kvality a množství dostupných dat z cytogenetických vyšetření (Vulto-van Silfhout et al., 2013). V současné době je v této databázi obsaženo více než 4800 popsaných případů pacientů nesoucích více než 6600 genetických aberací, přičemž delece představují největší část popsaných abnormalit. Všechna zde uložená data musí splňovat platná pravidla Mezinárodního systému pro lidskou cytogenetickou nomenklaturu (ISCN, An International System for Human Cytogenetic Nomenclature). ECARUCA se zaměřuje na sběr pouze takových genetických odchylek, které jsou považovány za příčinu popsaného fenotypu postižených jedinců, nevyskytují se v ní tedy běžné polymorfismy bez vlivu na zdraví. Hlavním cílem je zlepšit znalosti o vzácných chromozomových přestavbách jak z hlediska medicínského, tak pro potřeby výzkumu (Feenstra et al., 2006). Dále je zahrnuta diagnostická interpretace vzácných chromozomových aberací, poskytování poradenství zasaženým rodinám a naznačení příčin vzniku postižení u nově objevených genetických poruch, včetně identifikace vlastních zapojených genů. Webové stránky databáze, které se nachází na adrese http://www.ecaruca.net, jsou rozděleny do dvou částí. První z nich je volně dostupná, zatímco druhá je vyhrazena pouze pro registrované uživatele a umožňuje získat detailní klinické a cytogenetické informace jednotlivých pacientů. Potřebné údaje je zde možné vyhledávat nejen na základě klinických projevů, ale i podle zasažené oblasti genomu.

5.3. ISCA Databáze ISCA vznikla jako konsorcium více než 150 diagnostických laboratoří z celého světa. Jejím hlavním cílem je sdílení informací týkajících se CNV (Kaminsky et al., 2011). Stále se zvětšující počet zapojených laboratoří významnou měrou přispívá k rychlému 35

růstu množství dat v databázi, která se v současné době nachází na adrese www.iccg.org. Tím je umožněno získat velké množství informací při efektivním využití nákladů, navíc jsou data veřejně přístupná přes Národní centrum pro biotechnologické informace (NCBI, National Center for Biotechnology Information). Přístup k velkému množství dat od jedinců s abnormálním fenotypem vede k rozvíjení objektivních vědeckých analýz při předpovídání CNV, které budou mít dopad na vývoj jedince. Díky tomu je následně možné vytvářet celogenomové mapy, které pomohou určit geny citlivé na dávku, jenž budou tedy ovlivňovány haploinsuficiencí, a naopak ukáží, které oblasti jsou ke změně genové dávky tolerantní.

5.4. OMIM Databáze OMIM nabízí ucelený a spolehlivý přehled lidských genů a fenotypů. Její vznik je spojen s rokem 1966, kdy byla poprvé publikována v knižní podobě jako katalog znaků a nemocí s mendelovským typem dědičnosti (Hamosh et al., 2005). Online verze byla vytvořena v roce 1985, veřejnosti je přístupná od roku 1995 přes NCBI. V současné době je databáze dostupná na adrese http://www.omim.org. Informace zde mohou být vyhledávány na základě přístupového čísla, názvu genu, označení poruchy nebo pomocí klíčových slov (Obr. 8). Přístupové číslo, které je přidělené každému záznamu, je šesticiferné a první číslice udává, zda se jedná o dědičnost autosomální, X či Y vázanou nebo mitochondriální. Dále jsou záznamy tříděny do kategorií podle toho, jestli obsahují informace o genech, fenotypech, nebo obojím, což je rozlišeno přidáním znaků *, # a + před přístupové číslo. Znak % je vyhrazen pro ty záznamy, u kterých je potvrzená mendelovská dědičnost, ale jejichž molekulární základ není dosud znám. V případě, že není uveden žádný znak, se jedná o popis fenotypu, pro který nebyla prokázána mendelovská dědičnost, ačkoliv na ni může být podezření. Exponenciálně rostoucí počet záznamů v databázi reflektuje tempo vývoje a množství nových informací na poli klinické genetiky (Amberger et al., 2011). V dubnu 2014 bylo v databázi 22 302 záznamů, které se týkaly více než 14 500 genů a 7 000 různých poruch. Každý měsíc je vytvořeno přibližně 70 nových záznamů a 700 již existujících je doplněno o aktuální informace (Amberger et al., 2009)

36

Obrázek 8: Náhled do záznamu v databázi OMIM (http://www.omim.org/entry/613406; upraveno). Nahoře je vyhledávací pole, které umožňuje prohledávat databázi pomocí klíčových slov, přístupových čísel, názvů genů nebo nemocí. Vyhledaná genetická porucha je zobrazena se svým přístupovým číslem, znak # pak značí, že je zde popsán fenotyp i zahrnuté geny. Přes odkazy u klinických projevů je umožněn přístup k původním článkům, z nichž jsou informace o fenotypu získány.

37

6. Závěr Od svého vzniku na počátku 90. let prošly metody pro analýzu lidského genomu prudkým rozvojem, přičemž v posledních letech směřuje jejich vývoj k automatizaci a co nejlepšímu uspokojení potřeb uživatele. Za tímto účelem vznikají různé obměny array-CGH, z nichž některé se zaměřují na co nejlepší pokrytí celého genomu, jiné naopak cílí na konkrétní chromozomy či jejich vybrané oblasti. Pro svou nezastupitelnou úlohu při objasňování příčin mentální retardace, opožděného vývoje a vrozených malformací jsou nyní tyto metody nepostradatelnou součástí klinických vyšetření a dá se očekávat jejich neustálý vývoj, zvyšování rozlišovacích schopností a v neposlední řadě také snižování finančních nákladů na jednotlivá vyšetření. Je velmi pravděpodobné, že se v blízké budoucnosti stanou rutinní záležitostí při zjišťování příčin do té doby nevysvětlených mentálních retardací. Své místo jistě najdou i při prenatálních vyšetřeních plodu u rizikových skupin matek a spekuluje se, že by mohly zcela nahradit konvenční cytogenetické metody. Velké množství takto získaných dat postupně vedlo k vytvoření cytogenetických databází, jejichž význam s objevováním stále dalších genetických aberací neustále roste. Právě tyto databáze velkou měrou přispívají k objasnění souvislostí mezi postižením pacientů a neobvyklými nálezy v jejich genomu. Dá se očekávat, že do nich bude postupem času přispívat stále více laboratoří, což povede k většímu množství dostupných informací sloužících pro správné zhodnocení klinických nálezů jednotlivých pacientů. Tato znalost povahy postižení, získaná právě srovnáním s již existujícími případy, umožní individuální péči o pacienta s možností predikce jeho dalšího vývoje, čímž by bylo možné dosáhnout zvýšení kvality života takto handicapovaných jedinců.

38

7. Literatura Amberger J., Bocchini C., Scott A. F., Hamosh A. 2009. McKusick’s Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM®). Nucleic Acids Res. 37: 793-796. Amberger J., Bocchini C., Hamosh A. 2011. A new face and new challenges for Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM®). Hum. Mutat. 32: 564-567. Andrieux J., Dubourg C., Rio M., Attie-Bitach T., Delaby E., Mathieu M., Journel H., Copin H., Blondeel E., Doco-Fenzy M., Landais E., Delobel B., Odent S., ManouvrierHanu S., Holder-Espinasse M. 2009. Genotype-phenotype correlation in four 15q24 deleted patients identified by array-CGH. Am. J. Med. Genet. A 149(A): 2813-2819. Arnold M. A., Kim Y., Czubryt M. P., Phan D., McAnally J., Qi X., Shelton J. M., Richardson J. A., Bassel-Duby R., Olson E. N. 2007. MEF2C transcription factor controls chondrocyte hypertrophy and bone development. Dev. Cell 12: 377-389. Bailey J. A., Eichler E. E. 2006. Primate segmental duplications: crucibles of evolution, diverstiy and disease. Nat. Rev. Genet. 7: 552-564. Barbosa A. C., Kim M.-S., Ertunc M., Adachi M., Nelson E. D., McAnally J., Richardson J. A., Kavalali E. T., Monteggia L. M., Bassel-Duby R., Olson E. N. 2008. MEF2C, a transcription factor that facilitates learning and memory by negative regulation of synapse numbers and function. P. Natl. Acad. Sci. USA 105 (27): 9391-9396. Battaglia A., Hoyme H. E., Dallapiccola B., Zackai E., Hudgins L., McDonald-McGinn D., Bahi-Buisson N., Romano C., Williams C. A., Braley L. L., Zuberi S. M., Carey J. C. 2008. Further delineation of deletion 1p36 syndrome in 60 patients: A recognizable phenotype and common cause of developmental delay and mental retardation. Pediatrics 121: 404-410. Brewer C. M., Leek J. P., Green A. J., Holloway S., Bonthron D. T., Markham A. F., FitzPatrick D. R. 1999. A locus for isolated cleft palate, located on human chromosome 2q32. Am. J. Hum. Genet. 65: 387-396. 39

Britanova O., Akopov S., Lukyanov S., Gruss P., Tarabykin V. 2005. Novel transcription factor Satb2 interacts with matrix attachment region DNA elements in a tissue-specific manner and demonstrates cell-type-dependent expression in the developing mouse CNS. Eur. J. Neurosci. 21: 658-668. Britanova O., Depew M. J., Schwark M., Thomas B. L., Miletich I., Sharpe P., Tarabykin V. 2006. Satb2 haploinsufficiency phenocopies 2q32-q33 deletions, whereas loss suggests a fundamental role in the coordination of jaw development. Am. J. Hum. Genet. 79: 668-678. Brun A., Cailley D., Toutain J., Bouron J., Arveiler B., Lacombe D., Goizet C., Rooryck C. 2012. 1.5 Mb microdeletion in 15q24 in a patient with mild OAVS phenotype. Eur. J. Med. Genet. 55: 135-139. Bui T.-H., Vetro A., Zuffardi O., Shaffer L. G. 2011. Current controversies in prenatal diagnosis 3: is conventional chromosome analysis necessary in the post-array CGH era? Prenat. Diagn. 31: 235-243. Cardoso C., Boys A., Parrini E., Mignon-Ravix C., McMahon J. M., Khantate S., Bertini E., Pallesi E., Missirian C., Zuffardi O., Novara F., Villard L., Giglio S., Chabrol B., Slater H. R., Moncla A., Scheffer I. E., Guerrini R. 2009. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology 72: 784-792. Carr C. W., Zimmerman H. H., Martin C. L., Vikkula M., Byrd A. C., Abdul-Rahman O. A. 2011. 5q14.3 neurocutaneous syndrome: a novel continguous gene syndrome caused by simultaneous deletion of RASA1 and MEF2C. Am. J. Med. Genet. A 155A: 1640-1645. Cohen M. M. 1999. Robin sequences and complexes: Casual heterogeneity and pathogenetic/phenotypic variability. Am. J. Med. Genet. 84: 311-315. Cushman L. J., Torres-Martinez W., Cherry A. M., Manning M. A., Abdul-Rahman O., Anderson C. E., Punnett H. H., Thurston V. C., Sweeney D., Vance G. H. 2005. A report

40

of three patients with an interstitial deletion of chromosome 15q24. Am. J. Med. Genet. A 137A: 65-71. de Leeuw N., Dijkhuizen T., Hehir-Kwa J. Y., Carter N. P., Feuk L., Firth H. V., Kuhn R. M., Ledbetter D. H., Martin C. L., van Ravenswaaij-Arts C. M. A., Scherer S. W., Shams S., Van Vooren S., Sijmons R., Swertz M., Hastings R. 2012. Diagnostic interpretation of array data using public databases and internet sources. Hum. Mutat. 33: 930940. de Ravel T. J. L., Devriendt K., Fryns J.-P., Vermeesch J. R. 2007. What’s new in karyotyping? The move towards array comparative genomic hybridization (CGH). Eur. J. Pediart. 166: 637-643. de Ravel T. J. L., Balikova I., Thiry P., Vermeesch J. R., Frijns J.-P. 2009. Another patient with a de novo deletion further delineates the 2q33.1 microdeletion syndrome. Eur. J. Med. Genet. 52: 120-122. Dobreva G., Chahrour M., Dautzenberg M., Chirivella L., Kanzler B., Fariñas I., Karsenty G., Grosschedl R. 2006. SATB2 is a multifunctional determinant of craniofacial patterning and osteoblast differentiation. Cell 125: 971-986. El-Hattab A. W., Smolarek T. A., Walker M. E., Schorry E. K., Immken L. L., Patel G., Abbott M.-A., Lanpher B. C., Ou Z., Kang S.-H. L., Patel A., Scaglia F., Lupski J. R., Cheung S. W., Stankiewicz P. 2009. Redefined genomic architecture in 15q24 directed by patient deletion/duplication breakpoint mapping. Hum. Genet. 126: 589-602. Engels H., Wohlleber E., Zink A., Hoyer J., Ludwig K. U., Brockschmidt F. F., Wieczorek D., Moog U., Hellmann-Mersch B., Weber R. G., Willatt L., KreiβNachtsheim M., Firth H. V., Rauch A. 2009. A novel microdeletion syndrome involving 5q14.3-q15: clinical and molecular cytogenetic characterization of three patients. Eur. J. Hum. Genet. 17: 1592-1599. Feenstra I., Fang J., Koolen D. A., Siezen A., Evans C., Winter R. M., Lees M. M., Riegel M., de Vries B. B. A., Van Ravenswaaij C. M. A., Schinzel A. 2006. European 41

Cytogeneticists Association Register of Unbalanced Chromosome Aberrations (ECARUCA); an online database for rare chromosome abnormalities. Eur. J. Med. Genet. 49: 279-291. Firth H. V., Richards S. M., Bevan A. P., Clayton S., Corpas M., Rajan D., Van Vooren S., Moreau Y., Pettett R. M., Carter N. P. 2009. DECIPHER: Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources. Am. J. Hum. Genet. 84: 524-533. Fitzgerald J., Ting S. T., Bateman J. F. 2002. WARP is a new member of the von Willebrand factor A-domain superfamily of extracellular matrix proteins. FEBS Lett. 517: 6166. Gajecka M., Mackay K. L., Shaffer L. G. 2007. Monosomy 1p36 deletion syndrome. Am. J. Med. Genet. C 145C: 346-356. Giannikou K., Fryssira H., Oikonomakis V., Syrmou A., Kosma K., Tzetis M., KitsiouTzeli S., Kanavakis E. 2012 Further delineation of novel 1p36 rearrangements by array-CGH analysis: Narrowing the breakpoints and clarifying the “extended“ phenotype. Gene 506: 360368. Hamosh A., Scott A. F., Amberger J. S., Bocchini C. A., McKusick V. A. 2005. Online Mnedelian Inheritance in Man (OMIM), a knowledgebase of human genes and genetic disorders. Nucleic Acids Res. 33: 514-517. Heilstedt H. A., Ballif B. C., Howard L. A., Lewis R. A., Stal S., Kashork C. D., Bacino C. A., Shapira S. K., Shaffer L. G. 2003. Physical map of 1p36, placement of breakpoints in monosomy 1p36, and clinical characterization of the syndrome. Am. J. Hum. Genet. 72: 1200-1212. Horie M., Mitsumoto Y., Kyushiki H., Kanemoto N., Watanabe A., Taniguchi Y., Nishino N., Okamoto T., Kondo M., Mori T., Noguchi K., Nakamura Y., Takahashi E., Tanigami A. 2000. Identification and characterization of TMEFF2, a novel survival factor for hippocampal and mesencephalic neurons. Genomics 67: 146-152.

42

Hotz A., Hellenbroich Y., Sperner J., Linder-Lucht M., Tacke U., Walter C., Caliebe A., Nagel I., Saunders D. E., Wolff G., Martin P., Morris-Rosendahl D. J. 2013. Microdeletion 5q14.3 and anomalies of brain development. Am. J. Med. Genet. A 161A: 2124-2133. Houdayer C., Portnoï M.-F., Vialard F., Soupre V., Crumière C., Taillemite J.-L., Couderc R., Vazquez M.-P., Bahuau M. 2001. Pierre Robin sequence and interstitial deletion 2q32.3-q33.2. Am. J. Med. Genet. 102: 219-226. Jakobsen L. P., Knudsen M. A., Lespinasse J., Ayuso C. G., Ramos C., Fryns J.-P., Bugge M., Tommerup N. 2006. The genetic basis of the Pierre Robin sequence. Cleft PalateCran. J. 43: 155-159. Janssen B., Hartmann C., Scholz V., Jauch A., Zschocke J. 2005. MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics 6: 29-35. Kaminsky E. B., Kaul V., Paschall J., Church D. M., Bunke B., Kunig D., Moreno-DeLuca D., Moreo-De-Luca A., Mulle J. G., Warren S. T., Richard G., Compton J. G., Fuller A. E., Gliem T. J., Huang S., Collinson M. N., Beal S. J., Ackley T., Pickering D. L., Golden D. M., Aston E., Whitby H., Shetty S., Rossi M. R., Rudd M. K., South S. T., Brothman A. R., Sanger W. G., Iyer R. K., Crolla J. A., Thorland E. C., Aradhya S., Ledbetter D. H., Martin C. L. 2011. An evidence-based approach to establish the functional and clinical significance of copy number variants in intellectual and developmental disabilities. Genet. Med. 13: 777-784. Keppler-Noreuil K. M., Carrol A. J., Finley W. H., Rutledge S. L. 1995. Chromosome 1p terminal deletion: report of new findings and confirmation of two characteristic phenotypes. J. Med. Genet. 32: 619-622. Kiholm Lund A.-B., Hove H. D., Kirchhoff M. 2008. A 15q24 microduplication, reciprocal to the recently described 15q24 microdeletion, in a boy sharing clinical features with 15q24 microdeletion syndrome patients. Eur. J. Med. Genet. 51: 520-526.

43

Klopocki E., Graul-Neumann L. M., Grieben U., Tönnies H., Ropers H.-H., Horn D., Mundlos S., Ullmann R. 2008. A further case of the recurrent 15q24 microdeletion syndrome, detected by array CGH. Eur. J. Pediatr. 167: 903-908. Le Meur N., Holder-Espinasse M., Jaillard S., Goldenberg A., Joriot S., Amati-Bonneau P., Guichet A., Barth M., Charollais A., Journel H., Auvin S., Boucher C., Kerckaert J.P., David V., Manouvrier-Hanu S., Saugier-Veber P., Frébourg T., Dubourg C., Andrieux J., Bonneau D. 2010. MEF2C haploinsufficiency caused by either microdeletion of the 5q14.3 region or mutation is responsible for severe mental retardation with stereotypic movements, epilepsy and/or cerebral malformations. J. Med. Genet. 47: 22-29. Leonard H., Wen X. 2002. The epidemiology of mental retardation: Challenges and opportunities in the new millennium. Men. Retard. Dev. D. R. 8: 117-134. Leoyklang P., Suphapeetiporn K., Siriwan P., Desudchit T., Chaowanapanja P., Gahl W. A., Shotelersuk V. 2007. Heterozygous nonsence mutation SATB2 associated wiith cleft palate, osteoporosis, and cognitive defects. Hum, Mutat. 28 (7): 732-738. Mencarelli M. A., Caselli R., Pescucci C., Hayek G., Zappella M., Renieri A., Mari F. 2007. Clinical and molecular characterization of a patient with a 2q31.2-32.3 deletion idetified by array-CGH. Am. J. Med. Genet. A 143A: 858-865. Miyazaki K., Yamanaka T., Ogasawara N. 1988. Interstitial deletion 2q32.1→q34 in a child with half normal activity of ribulose 5-phosphate 3-epimerase (RPE). J. Med. Genet. 25: 850-851. Nakayama J., Fu Y.-H., Clark A. M., Nakahara S., Hamano K., Iwasaki N., Matsui A., Arinami T., Ptáček L. J. 2002. A nonsense mutation of the MASS1 gene in a family with febrile and afebrile seizures. Ann. Neurol. 52: 654-657. Novara F., Beri S., Giorda R., Ortibus E., Nageshappa S., Darra F., Bernardina B., Zuffardi O., Van Esch H. 2010. Refining the phenotype associated with MEF2C haploinsufficiency. Clin. Genet. 78: 471-477.

44

Nowakowska B. A., Obersztyn E., Szymańska K., Bekiesińska-Figatowska M., Xia Z., Ricks C. B., Bocian E., Stockton D. W., Szczałuba K., Nawara M., Patel A., Scott D. A., Cheung S. W., Bohan T. P., Stankiewicz P. 2010. Severe mental retardation, seizures, and hypotonia due to deletions of MEF2C. Am. J. Med. Genet. B 153B: 1042-1051. Nussbaum R., McInnes R. R., Willard H. F. 2004. Thompson & Thompson Klinická genetika. Praha, Triton. Pasterkamp R. J., Peschon J. J., Spriggs M. K., Kolodkin A. L. 2003. Semaphorin 7A promotes axon outgrowth through integrins and MAPKs. Nature 424: 398-405. Pasutto F., Sticht H., Hammersen G., Gillessen-Kaesbach G., FitzPatrick D. R., Nürnberg G., Brasch F., Schirmer-Zimmermann H., Tolmie J. L., Chitayat D., Houge G., Fernández-Martínez L., Keating S., Mortier G., Hennekam R. C. M., von der Wense A., Slavotinek A., Meinecke P., Bitoun P., Becker C., Nürnberg P., Reis A., Rauch A. 2007. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malfotmations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am. J. Hum. Genet. 80: 550-560. Pinkel D., Segraves R., Sudar D., Clark S., Poole I., Kowbel D., Collins C., Kuo W.-L., Chen C., Zhai Y., Dairkee S. H., Ljung B.-M., Gray J. W., Albertson D. G. 1998. High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat. Genet. 20: 207-211. Pollack J. R., Perou C. M., Alizadeh A. A., Eisen M. B., Pergamenschikov A., Williams C. F., Jeffrey S. S., Botstein D., Brown P. O. 1999. Genome-wide analysis of DNA copynumber changes using cDNA microarrays. Nat. Genet. 23: 41-46. Reim K., Wegmeyer H., Brandstätter J. H., Xue M., Rosenmund C., Dresbach T., Hofmann K., Brose N. 2005. Structurally and functionally unique complexins at retinal ribbon synapses. J. Cell. Biol. 169: 669-680. Rickman L., Fiegler H., Carter N. P., Bobrow M. 2005. Prenatal diagnosis by array-CGH. Eur. J. Med. Genet. 48: 232-240. 45

Rickman L., Fiegler H., Shaw-Smith C., Cirigliano V., Voglino G., Ng B. L., Scott C., Whittaker J., Adinolfi M., Carter N. P., Bobrow M. 2006. Prenatal detection of unbalanced chromosomal rearrangements by array CGH. J. Med. Genet. 43: 353-361. Rooney Riggs E., Wain K. E., Riethmaier D., Savage M., Smith-Packard B., Kaminsky E. B., Rehm H. L., Lese Martin C., Ledbetter D. H., Faucett W. A. 2013. Towards a universal clinical genomics database: The 2012 International Standards for Cytogenomic Arrays consortium meeting. Hum. Mutat. 34: 915-919. Sakai Y., Ohkubo K., Matsushita Y., Akamine S., Ishizaki Y., Torisu H., Ihara K., Sanefuji M., Kim M.-S., Lee K.-U., Shaw C. A., Lim J., Nakabeppu Y., Hara T. 2013. Neuroendocrine phenotypes in a boy with 5q14 deletion syndrome implicate the regulatory roles of myocyte-specific enhancer factor 2C in the postnatal hypothalamus. Eur. J. Med. Genet. 56: 475-483. Schouten J. P., McElgunn C. J., Waaijer R., Zwijnenburg D., Diepvens F., Pals G. 2002. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 30: 57-69. Shaffer L. G., Lupski J. R. 2000. Molecular mechanisms for constitutional chromosomal rearrangements in humans. Annu. Rev. Genet. 34: 297-329. Shapira S. K., McCaskill C., Northrup H., Spikes A. S., Elder F. F. B., Sutton V. R., Korenberg, J. R., Greenberg F., Shaffer L. G. 1997. Chromosome 1p36 deletions: The clinical phenotype and molecular characterization of a common newly delineated syndrome. Am. J. Hum. Genet. 61: 642-650. Sharp A. J., Hansen S., Selzer R. R., Cheng Z., Regan R., Hurst J. A., Stewart H., Price S. M., Blair E., Hennekam R. C., FitzPatrick C. A., Segraves R., Richmond T. A., Guiver C., Albertson D. G., Pinkel D., Eis P. S., Schwartz S., Knight S. J. L., Eichler E. E. 2006. Discovery of previously unidentified genomic disorders from the duplication architecture of the human genome. Nat. Genet. 38: 1038-1042.

46

Sharp A. J., Selzer R. R., Veltman J. A., Gimelli S., Gimelli, G., Striano P., Coppola A., Regan R., Price S. M., Knoers N. V., Eis P. S., Brunner H. G., Hennekam R. C., Knight S. J. L., de Vries B. B. A., Zuffardi O., Eichler E. E. 2007. Characterization of a recurrent 15q24 microdeletion syndrome. Hum. Mol. Genet. 16: 567-572. Shimojima K., Okumura A., Mori H., Abe S., Ikeno M., Shimizu T., Yamamoto T. 2012. De novo microdeletion of 5q14.3 excluding MEF2C in a patient with infantile spasms, microcephaly, and agenesis of the corpus callosum. Am. J. Med. Genet. A 158A: 2272-2276. Shinawi M., Cheung S. W. 2008. The array CGH and its clinical applications. Drug Discov. Today 13: 760-770. Solinas-Toldo S., Lampel S., Stilgenbauer S., Nickolenko J., Benner A., Döhner H., Cremer T., Lichter P. 1997. Matrix-based comparative genomic hybridization: Biochips to screen for genomic imbalances. Gene Chromosome Canc. 20: 399-407. Speicher M. R., Antonarakis S. E., Motulsky A. G. 2010. Vogel and Motulsky’s Human Genetics. Heildeberg, Springer. Stankiewicz P., Beaudet A. L. 2007. Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation. Curr. Opin. Genet. Dev. 17: 182-192. Tonk V., Hong Kyhm J., Gibson C. E., Wilson G. N. 2011. Interstitial deletion 5q14.3q21.3 with MEF2C haploinsufficiency and mild phenotype: When more is less. Am. J. Med. Genet. A 155A: 1437-1441. Toral-López J., Buentello-Volante B., Balderas-Minor M. M., Amezcue-Herrera C., Valdes-Miranda J. M., González-Huerta L. M., Gudiño M., Cuevas-Covarrubias S. A., Zenteno J, C. 2012. An intellectually disabled patient with the 5q14.3q15 microdeletion syndrome associated with an apparently de novo t(2;5)(q13;q14). Am. J. Med. Genet. A 158A: 942-946.

47

Urquhart J., Black G. C. M., Clayton-Smith J. 2009. 4.5 Mb microdeletion in chromosome band 2q33.1 associated with learning disability and cleft palate. Eur. J. Med. Genet. 52: 454457. Van Buggenhout G., Van Ravenswaaij-Arts C., Maas N., Thoelen R., Vogels A., Smeets D., Salden I., Matthijs G., Fryns J.-P., Vermeesch J. R. 2005. The del(2)(q32.2q33) deletion syndrome defined by clinical and molecular characterization of four patients. Eur. J. Med. Genet. 48: 276-289. Van den Veyver I. B., Patel A., Shaw C. A., Pursley A. N., Kang S.-H. L., Simovich M. J., Ward P. A., Darilek S., Johnson A., Neill S. E., Bi W., White L. D., Eng C. M., Lupski J. R., Cheung S. W., Beaudet A. L. 2009. Clinical use of array comparative genomic hybridization (aCGH) for prenatal diagnosis in 300 cases. Prenat. Diagn. 29: 29-39. Van Esch H., Backx L., Pijkels E., Fryns J.-P. 2009. Congenital diaphragmatic hernia is part of the new 15q24 microdeletion syndrome. Eur. J. Med. Genet. 52: 153-156. Verzi M. P., Agarwal P., Brown C., McCulley D. J., Schwarz J. J., Black B. L. 2007. The transcription factor MEF2C is required for craniofacial development. Dev. Cell 12: 645-652. Vulto-van Silfhout A. T., van Ravenswaaij C. M. A., Hehir-Kwa J. Y., Verwiel E. T. P., Dirks R., van Vooren S., Schinzel A., de Vries B. B. A., de Leeuw N. 2013. An update on ECARUCA, the European Cytogeneticists Association Register of Unbalanced Chromosome Aberrations. Eur. J. Med. Genet. 56: 471-474. Wu Y.-Q., Heilstedt H. A., Bedell J. A., May K. M., Starkey D. E., McPherson J. D., Shapira S. K., Shaffer L. G. 1999. Molecular refinement of the 1p36 deletion syndrome reveals size diversity and a preponderance of maternally derived deletions. Hum. Mol. Genet. 8: 313-321. Young R. S., Shapiro S. D., Hansen K. L., Hine L. K., Rainosek D. E., Guerra F. A. 1983. Deletion 2q: two new cases with karyotypes 46,XY,del(2)(q31q33) and 46,XX,del(2)(q36). J. Med. Genet. 20: 199-202.

48

Zweier M., Gregor A., Zweier C., Engels H., Sticht H., Wohlleber E., Bijlsma E. K., Holder S. E., Zenker M., Rossier E., Grasshoff U., Johnson D. S., Robertson L., Firth H. V., Kraus C., Ekici A. B., Reis A., Rauch A. 2010. Mutations in MEF2C from the 5q14.3q15 microdeletion syndrome region are a frequent cause of severe mental retardation and diminish MECP2 and CDKL5 expression. Hum. Mutat. 31: 722-733. Zweier M., Rauch A. 2011. The MEF2C-related and 5q14.3q15 microdeletion syndrome. Mol. Syndromol. 2: 164-170.

49